CN107893087A

CN107893087A - 一种重组猪λ3干扰素的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107893087A
Application number: CN201711089399.5A
Authority: CN
Inventors: 张志刚; 董剑辉; 潘玉
Original assignee: Beijing Bao Li Hua Kang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Bao Li Hua Kang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2018-04-10

Abstract

本发明根据λ3氨基酸序列，按照毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性进行优化，选择高表达密码子重新设计合成新的猪λ3干扰素核苷酸序列。成功地构建了重组酵母表达质粒pPIZαA‑IFN‑λ3，对重组菌株进行诱导表达，实现了猪λ3干扰素在毕赤酵母菌中高效表达，具有较高的生物学活性。通过本方法制备的重组猪λ3干扰素产品对于治疗仔猪的猪流行性腹泻病也具有明显的效果。

Description

一种重组猪λ3干扰素的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种重组猪λ3干扰素的制备方法及其应用。

背景技术

干扰素-λ(Interferon-λ,IFN-λ)是近年来发现的一类新型干扰素，其成员包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)，相对I型IFN和II型IFN具有更优的抗病毒、抑制肿瘤细胞生长以及具免疫调节功能等生物学活性。目前，I型干扰素已经用于治疗临床上多种疾病，如抗肿瘤和病毒性疾病。但是I型干扰素在临床治疗中会使病人产生发热、疲乏、食欲不振、情绪低落、白细胞减少、骨髓抑制和血压波动等不良反应。此外，I型和II型干扰素还有在体内活性不稳定，半衰期短等缺陷。

有研究表明猪的干扰素λ能够有效的抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等病毒的扩增。猪源的IFN-λ在大肠杆菌中表达可溶性较低，包涵体复性处理后得到的可溶性IFN-λ以及在哺乳动物细胞表达的IFN-λ都具有较好的抗病毒活性。有文献报道人的IFN-λ能够在毕赤酵母GS115中实现分泌表达，且具有较高的生物学活性，因此我们计划利用毕赤酵母来表达猪的IFN-λ。

由于原核表达猪IFN-λ可溶性低，需要通过包涵体变性、复性的方法来制备IFN-λ，操作复杂且成本较高，我们希望通过毕赤酵母中分泌表达猪的IFN-λ3，以较低的成本来制备猪IFN-λ3，并作为治疗猪流行性腹泻病毒病的药物使用。

发明内容

本发明的目的在于根据λ3氨基酸序列，按照毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性进行优化，选择高表达密码子重新设计合成新的猪λ3干扰素核苷酸序列，成功构建了重组酵母表达质粒pPIZαA-IFN-λ3，并对重组菌株进行诱导表达，实现了猪λ3干扰素在毕赤酵母菌中高效表达，具有较高的生物学活性。通过本方法制备的重组猪λ3干扰素产品能够用于治疗仔猪的猪流行性腹泻病。

有鉴于此，本发明提供一种重组猪λ3干扰素的制备方法，包括以下步骤：(1)根据λ3氨基酸序列，按毕赤酵母密码子偏嗜性进行优化，选择高表达密码子，人工合成猪λ3干扰素基因，构建重组质粒并进行鉴定；

(2)重组质粒线性化、回收后电转化到毕赤酵母细胞中，获得重组菌株；

(3)鉴定阳性重组子，对重组菌株进行诱导表达，筛选出最高效表达的菌株；(4)检测重组猪λ3干扰素的活性。

进一步地，所述的λ3氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述人工合成猪λ3干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，用于扩增λ3干扰素基因序列的上游引物IFN-λ3-F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；下游引物IFN-λ3-R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

进一步地，采用的表达载体是pPICZαA，重组质粒是pPIZαA-IFN-λ3。

上述方法获得的重组猪λ3干扰素在治疗猪流行性腹泻病毒病中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

①不需要通过包涵体变性、复性的方法来制备IFN-λ，操作简单且成本低。

②实现了IFN-λ3在毕赤酵母GS115中高效的分泌表达，IFN-λ3的含量达到了0.35mg/mL，且具有较高的生物学活性，比活达到了1.21×10⁶U/mg。

③将制备的重组猪λ3干扰素用于猪流行性腹泻病毒病治疗，使用2×10⁵U/头份的剂量进行肌肉注射，连用3天，对7～10日龄发病仔猪的治疗效果高达90％。

附图说明

图1两种优化后的基因序列构建菌株诱导表达上清的SDS-PAGE图。图中，M：预染蛋白质Marker；1、2：SEQ ID NO.5序列构建菌株表达的样品(1、2的上样量分别为10μl、1μl)；3、4：SEQ ID NO.2序列构建菌株表达的样品(3、4的上样量分别为10μl、1μl)。

图2重组毕赤酵母菌株诱导表达上清的SDS-PAGE图。图中，M：预染蛋白质Marker；1：0.4mg/mL标准蛋白样品；2：0.2mg/mL标准蛋白样品；3：0.1mg/mL标准蛋白样品；4：样品1；5：样品2。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1重组质粒的构建和鉴定

1、基因的合成与扩增

使用DNASTAR(Version 5.0)基因分析软件，参照GenBank上的猪IFN-λ3基因序列(GQ996936)及其所对应的氨基酸序列，依照毕赤酵母菌的密码子用法分析以及TaKaRa公司的酵母密码子表等，按照毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计合成新的猪λ3干扰素核苷酸序列，送大连宝生物工程有限公司重合成序列。

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，按照毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性将野生型的核苷酸序列(如SEQ ID NO.6所示)进行优化，重新设计合成两组新的猪λ3干扰素核苷酸序列：如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示，均为516bp。相应的扩增λ3干扰素基因序列的上下游引物分别为：IFN-λ3-F(SEQ ID NO.3)：TGAAGCTGAATTCACCGTTCCAGTTCCAGAAGCTTTGAGAGCT；IFN-λ3-R(SEQ ID NO.4)：

GGCCGGCTGGGCCACTCAAACACACAAGTCACCAGAAGCAACACA。PCR反应条件为：94℃3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；72℃ 10min。扩增出的目的片段大小为550bp。

2、重组表达质粒的构建

用PmlI酶对表达载体pPICZαA进行酶切，形成pPICZαA载体片段。将PCR扩增出的550bp的IFN-λ3基因片段用T5克隆的方法与pPICZαA载体片段进行连接，形成重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于含Zeocin(25μg/mL)的LB培养基平皿上进行培养。

3、重组质粒的鉴定

挑取可疑菌落，接种于含Zeocin(50μg/mL)低盐LB液体培养基中震荡培养过夜，从菌液中抽提质粒。以重组质粒DNA为模板，加入特异性引物(分别为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)用高保真酶进行PCR扩增，并电泳确定目的片段大小(约550bp)，同时将阳性PCR产物送大连宝生物工程有限公司进行序列测定比对。将序列完全正确重组质粒命名为pPIZαA-IFN-λ3。阳性克隆摇菌，加甘油冻存于-80℃冰箱备用。

实施例2重组毕赤酵母的构建和鉴定

1、重组质粒pPIZαA-IFN-λ3的线性化及回收

取含有质粒pPIZαA-IFN-λ3的甘油菌，接种于含Zeocin的LB液体培养基中200r/min振荡过夜培养，提取质粒pPIZαA-IFN-λ3。用PmlI酶对质粒pPIZαA-IFN-λ3及pPIZαA进行酶切线性化。电泳检测线性化完全后，进行目的基因的回收纯化。

2、重组质粒pPIZαA-IFN-λ3的电转化

将GS115感受态酵母细胞与分别线性化的重组质粒pPIZαA-IFN-λ3、质粒pPIZαA进行轻轻混匀。转入预冷的电转杯中冰浴5min。设定电转化参数为1500V。电转化后的转化物分别涂布于加有终浓度400ug/mL Zeocin的YPD平板，28℃温箱中培养。待平板上长出单菌落，挑单菌落分别接种到含Zeocin的YPD培养基，28℃摇床中200r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.0，停止培养并收取菌液。

3、毕赤酵母表达菌株的鉴定

将培养后的菌液各取1μL作为模版，加入特异性引物(分别为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4)进行PCR，电泳后挑选阳性克隆，保存阳性克隆甘油菌，冻存于-80℃冰箱备用。

实施例3重组毕赤酵母表达菌株的筛选

1、重组菌株的诱导表达

将含有重组质粒pPIZαA-IFN-λ3的毕赤酵母表达菌株接种于YPD培养基，200r/min28℃摇床培养24h。取培养24h的菌液按1：50接种于装有20mL BMGY培养液的250mL三角瓶中，200r/min30℃振动培养。当菌液OD₆₀₀＝2.0时，取适量菌液室温2000r/min离心5min，收获酵母细胞，接种于盛有25mL BMMY培养液250mL三角瓶中，最后使瓶中菌液OD₆₀₀＝1.0。每隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养。培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE分析或置于-80℃保存。

2、表达产物的检验

收集培养至96h样品，离心，对诱导表达产物上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，然后进行染色、脱色、灰度扫描，通过Image Lab软件系统来分析。使用两种优化后的基因序列构建的重组毕赤酵母菌株诱导表达的上清SDS-PAGE结果如图1所示，目的蛋白大小为22KDa，SEQID NO.2和NO.5序列表达样品的有效蛋白含量分别为68.35％和15.67％，前者是后者的4.36倍，由此可见使用优化后的SEQ ID NO.2序列构建的重组菌株的表达量明显优于优化后的SEQ ID NO.5序列。

将SEQ ID NO.2序列构建的重组毕赤酵母菌株不同阳性克隆的表达产物上清进行蛋白电泳检测，同时利用牛血清蛋白做定量对照，计算样品总蛋白含量及其总蛋白中猪λ3干扰素的有效含量，结果如图2所示，目的蛋白大小为22KDa。选取最高效表达的菌株，表达的蛋白样品(图2中的样品1)测定的结果为：总蛋白含量是0.46mg/mL，猪λ3干扰素的含量是0.35mg/mL，有效含量占样品总蛋白含量的76.09％。

3、IFN-λ3活性的测定

用微量细胞病变抑制法，以MDBK细胞(牛肾细胞)/VSV(水泡性口腔炎病毒)为基本检测系统。将抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最高稀释度定义为一个干扰素单位(U)。表达产物样品的活性检测结果为4.25×10⁵U/mL，比活为1.21×10⁶U/mg。

实施例4重组猪λ3干扰素治疗猪流行性腹泻病毒病的作用

用7～10日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒的抗原抗体均为阴性)30头，分为1～3组，每组10头，第1、2组为攻毒治疗组，第3组为攻毒不治疗对照组。分别对每头仔猪口服接种本单位保藏的猪流行性腹泻病毒强毒PEDV-KB2013-4株(微生物保藏号是CGMCCNo.12663；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国科学院微生物研究所；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。)2.0ml(病毒含量为10^5.0TCID₅₀/ml)。待观察到第1头仔猪出现腹泻症状后，对全部仔猪肌肉注射重组猪λ3干扰素进行治疗，第1、2组的治疗剂量分别为1×10⁵U/头、2×10⁵U/头，连用3天(第0、1、2天用药)，观察记录全部仔猪用药后每天仔猪的腹泻情况，连续观察至用药后7天。重组猪λ3干扰素治疗后每天仔猪的发病及死亡情况见表1和表2。

表1重组猪λ3干扰素治疗后每天仔猪的发病情况表

注：表中x/y表示发病头数/每组存活头数

表2重组猪λ3干扰素治疗后每天仔猪的死亡情况表

注：表中x/y表示死亡头数/每组总头数

从表1中可以看出，仔猪在PEDV强毒攻击出现发病症状后进行重组猪λ3干扰素治疗，第1组在注射后第2天时发病仔猪数量下降；第2组在注射后第1天发病数量就出现下降；而对照组则发病全部发病。第1组在停药后第2天还有3头未治愈，直至实验结束仍有腹泻症状，治愈率为60％；第2组在停药后第1天仔猪腹泻全部治愈，之后并未继续发病，治愈率为90％；对照组存活的仔猪全部有腹泻症状，直至实验结束。从表2的死亡率来看，第2组在使用重组猪λ3干扰素治疗后，未出现死亡情况，第1组在第4天死亡1头，而对照组从第2天开始出现死亡，直至实验结束死亡率为80％。

由此可见，本发明制备的重组猪λ3干扰素对仔猪的猪流行性腹泻病毒病有很好的治疗效果，使用2×10⁵U/头份的最佳治疗剂量进行肌肉注射，连用3天，对7～10日龄仔猪的治疗效果高达90％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京康宝利华生物科技有限公司

<120> 一种重组猪λ3干扰素的制备方法及其应用

<130> 2017-11-07

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工合成(λ3氨基酸序列)

<400> 1

Val Pro Val Pro Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Gly Ala Arg Gly Cys

1 5 10 15

His Leu Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Ala Leu Gln Ala Phe

20 25 30

Lys Arg Ala Lys Asp Ala Phe Glu Glu Ser Leu Leu Glu Asp Trp Asn

35 40 45

Cys Ser Ser Arg Ile Phe Pro Arg Ser Arg Asp Leu Lys Gln Leu Gln

50 55 60

Val Trp Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Val Ala Leu Thr Leu

65 70 75 80

Ser Val Leu Gly Ser Leu Ala Asn Ser Ser Leu His Ser Ser Leu Asp

85 90 95

Gln Pro Leu His Thr Leu Arg His Ile His Ala Gln Leu Gln Ala Cys

100 105 110

Val Pro Ala Gln Pro Met Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His

115 120 125

His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Gln Lys Lys Glu Pro Gln Ser

130 135 140

Cys Leu Glu Ala Ser Val Met Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg

145 150 155 160

Asp Leu Lys Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val

165 170

<210> 2

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成猪λ3干扰素基因的核苷酸序列)

<400> 2

gttccagttc cagaagcttt gagagctttg ccaggtgcta gaggttgtca cttggctcaa 60

ttcaagtctt tgtccccaca agccttgcag gcttttaaga gagctaagga cgctttcgaa 120

gagtccttgt tggaggactg gaactgttcc tccagaatct tcccaagatc cagagacttg 180

aagcagttgc aggtttggga aagaccagtt gctttggaag ctgaggttgc tttgaccttg 240

tctgtcttgg gttctttggc taactcttcc ttgcactcct ctttggacca accattgcac 300

accttgagac acattcacgc tcagttgcaa gcttgtgttc cagctcaacc tatggctggt 360

ccaagaccaa gaggtagatt gcatcattgg ctgcacagat tgcaagaggc ccaaaagaaa 420

gagccacagt cttgtttgga ggcttccgtc atgttcaacc tgttcagatt gctgacccgt 480

gacttgaagt gtgttgcttc tggtgacttg tgtgtt 516

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成(用于扩增λ3干扰素基因序列的上游引物IFN-λ3-F)

<400> 3

tgaagctgaa ttcaccgttc cagttccaga agctttgaga gct 43

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成(下游引物IFN-λ3-R)

<400> 4

ggccggctgg gccactcaaa cacacaagtc accagaagca acaca 45

<210> 5

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工合成(λ3干扰素基因的核苷酸序列（比较1）)

<400> 5

gttccagttc cagaagcttt gagagctttg ccaggtgcaa gaggttgcca cttggcccaa 60

ttcaagtctt tgtccccaca agccttgcag gcctttaaga gagctaagga cgctttcgaa 120

gagtccctct tggaggactg gaactgttcc tccagaatct tcccaagatc cagagacttg 180

aagcagttgc aggtttggga aagaccagtg gccttggaag ctgaggttgc tttgaccttg 240

tctgtcttgg gctccttggc taactcttcc ttgcactcct ctttggacca accattgcac 300

accttgcgcc acattcacgc tcagttgcaa gcttgtgttc cagctcaacc tatggcaggt 360

ccaaggcccc gaggtagatt gcatcattgg ctgcaccgat tgcaggaggc ccaaaagaaa 420

gagccccagt cttgtttgga ggcctccgtc atgttcaacc tcttccgatt cctgacccgg 480

gacttgaagt gtgttgcttc tggtgacttg tgtgtt 516

<210> 6

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工合成(λ3干扰素基因的核苷酸序列（比较2）)

<400> 6

gtgcctgtcc ctgaagccct cagggccctc ccaggagcaa ggggctgcca cttggcccag 60

ttcaagtctc tgtccccaca agcgctgcag gccttcaaga gggccaagga tgcctttgaa 120

gagtccctct tggaggactg gaactgcagc tcccgcatct tccccaggag cagggacctg 180

aagcagctgc aggtgtggga gcgccccgtg gccttggagg ccgaggtggc cctgaccctc 240

agcgtcctgg gctccttggc gaactcatcc ctgcacagca gcctggacca gccccttcac 300

acgctgcgcc acatccacgc ccagctccag gcctgtgtcc cagctcagcc catggcaggc 360

ccccggcccc ggggccgcct ccaccactgg ctgcaccggc tccaggaggc ccagaagaag 420

gagccccaga gctgcctgga agcctctgtc atgttcaacc tcttccgcct cctcacccgg 480

gacctgaaat gtgtcgccag tggagacctg tgtgtc 516

Claims

1.一种重组猪λ3干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据λ3氨基酸序列SEQ ID No.1，按毕赤酵母密码子偏嗜性进行优化，选择高表达密码子，人工合成猪λ3干扰素基因，如SEQ ID No.2所示，构建重组质粒并进行鉴定；

（2）重组质粒线性化、回收后电转化到毕赤酵母细胞中，获得重组菌株；

（3）鉴定阳性重组子，对重组菌株进行诱导表达；

（4）检测重组猪λ3干扰素的活性。

2.根据权利要求1所述的一种重组猪λ3干扰素的制备方法，其特征在于，用于扩增λ3干扰素基因序列的上游引物IFN-λ3-F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；下游引物IFN-λ3-R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的一种重组猪λ3干扰素的制备方法，其特征在于，采用的表达载体是pPICZαA，重组质粒是pPIZαA-IFN-λ3。

4.权利要求1~3任一项所述方法获得的重组猪λ3干扰素在制备用于治疗仔猪的猪流行性腹泻病药物中的应用。