CN108588111A

CN108588111A - 一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法

Info

Publication number: CN108588111A
Application number: CN201810364026.2A
Authority: CN
Inventors: 王荣; 左文峰; 卢英杰; 张磊; 杜恩岐
Original assignee: Wuhan Healthway Toread Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yangling Kairui Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明公开了一种制备猪源长效干扰素λ3的方法和应用，属于基因工程产品制备领域。包括编码猪源长效干扰素λ3基因的克隆，含猪源干扰素λ3基因和长效元件用不同Linker连接的真核表达载体的构建，用所述含不同Linker的猪源干扰素长效λ3基因的重组真核表达载体转化GS115，PCR扩增筛选阳性克隆子，接种阳性克隆子于含0.02%生物素的BMGY培养基，28℃200 rpm培养48小时后离心，弃去上清后用等体积含0.02%生物素的BMMY培养基重悬，并加入1%28℃200 rpm甲醇诱导培养，每隔24 h加入终浓度1%甲醇，培养96 h后取上清，制备不同连接Linker的蛋白表达。所述制备的猪源长效干扰素λ3具有更长的半衰期，较报道的普通干扰素λ3半衰期（4 h以内）提高10倍以上。

Description

一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法

技术领域：

本发明属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种制备猪源长效干扰素-λ3（ABD- IFNλ3）蛋白的方法和应用。背景技术：

干扰素（interferon， IFN）是一种广谱抗病毒剂，包括I型干扰素（IFNα、IFNβ）、II型干扰素（IFNγ等）、III型干扰素（IFNλs，包括IFNλ1、IFNλ2、IFNλ3），其并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。目前，国内外学者III型 IFN 生物学功能和抗病毒作用已经进行了深入的研究^[3-5]，结果表明，相比于I型和II型干扰素，III型干扰素IFNλ3可以有效的缓解仔猪腹泻的症状，降低病猪的死亡率。前期研究表明，原核表达III型猪干扰素均为包涵体形式，需要通过包涵体变性、复性的方法来制备IFNλ3，操作复杂且成本较高^[4,6]。采用酵母分泌表达的方式可获得可溶的，表达量的IFNλ3蛋白，但是干扰素半衰期短容易降解，目前已有研究的长效元件ABD能有效提高干扰素半衰期，延长干扰素作用时间^[2]。

由于干扰素表达过程中易发生断裂，因此用不同连接Linker将长效元件ABD与IFNλ3连接，能获得不影响表达量且蛋白断裂明显较少的表达菌株。

参考文献：

[1]Albumin Fusion of Interleukin-28B: Production andCharacterization ofIts Biological Activities and Protein Stability.（PLOS ONE，2013）

[2] Anti-serum albumin domain antibodies in the development of highlypotent, efficacious and long-acting interferon.（Protein Engineering, Design &Selection，2010）

[3] IFN-lambda preferably inhibits PEDV infection of porcine intestinal

epithelial cells compared with IFN-alpha.（Antiviral Research，2017）

[4] 猪Ⅲ型干扰素IFNλ1的克隆、表达和抗病毒活性研究。(华中农业大学硕士学位论文，2017）

[5]Short communication: antiviral activity of porcine IFN-λ3 againstporcine epidemic diarrhea virus in vitro.（Virus Genes，2016）

[6]长效干扰素研究进展。(中国生物工程杂志,2010）

发明内容：

为解决现有技术中干扰素表达存在的技术问题，本发明旨在提供一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：

一种在毕赤酵母GS115中表达猪源长效 IFNλ3的方法，具体步骤如下： 1）以合成的猪λ3干扰素基因及长效元件ABD为模板，分别用引物λ3-GS-F，λ3-R，ABD-F，ABD-GS-R扩增含GSLinker的目的片段； 2）利用引物 ABD-F和λ3-R 通过PCR技术扩增全长含GS Linker的猪源ABD-GS -IFNλ3基因全长，上游引物ABD-F: agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（SEQ ID No:3）；下游引物λ3-R: tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（SEQ ID No:2）；

3）将猪源ABD- IFNλ3 基因用T5克隆法克隆到酵母pPicZαA载体，获得重组载体pPicZαA-ABD-GS-IFNλ3，并转化毕赤酵母GS115，筛选重组酵母表达菌；

4）对3）中阳性克隆子进行诱导表达，筛选干扰素高表达菌株；

5）对4）高表达菌株进行诱导表达并纯化，验证不同Linker对长效干扰素表达的影响，进一步制备干扰素样品及活性检测；

6）对5）表达样品，在MDBK及VERO细胞水平上评价干扰素活力；

7）对5）表达样品采用细胞病变抑制法检测ABD-GS-IFNλ3在猪体内的半衰期；其中λ3-GS-F: ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（SEQ ID No:1）；λ3-R: tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（SEQ ID No:2）；ABD-F:agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（SEQ ID No:3）；ABD-GS-R:ccggaacctccaccaccagccttcaatatctcgtcct（SEQ ID No:4）。

一种重组酵母菌株pichia pastoris GS115 /pPICZαA-ABD-GS-IFNλ3的菌株保藏号为：CCTCC NO. M 2018195，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年4月11日。所述重组酵母菌株能够用于制备ABD-GS-IFNλ3。

本发明还请求保护ABD-GS-IFNλ3在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防病毒感染。所述药物为兽药，用于畜禽。优选的，所述药物用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 1）通过密码子优化实现ABD-IFNλ3的高效可溶表达。

2）ABD融合提高IFNλ3在猪体内的半衰期，有望提高IFNλ3的抗PEDV治疗效果。

3）通过Linker选择在不影响产量情况下，能减少蛋白断裂。

附图说明

图1：构建含有ABD-IFNλ3 基因的重组克隆载体的流程图。

图2：不同连接Linker长效干扰素表达检测为构建含有不同Linker的ABD-IFNλ3的SDS-PAGE 蛋白表达电泳图，其中 M ：蛋白 Markers ；+ ：阳性对照；-：阴性对照；1-3 ：GS连接Linker三个阳性克隆子表达上清；4-6 ：HL连接Linker三个阳性克隆子表达上清；7-9 ：RL连接Linker三个阳性克隆子表达上清。

图3：不同连接Linker长效干扰素WerternBolt表达检测是不同Linker的ABD-IFNλ3的 Western-blot 图，其中 M ：蛋白 Markers ；+ ：阳性对照；-：阴性对照；1-3 ：GS连接Linker三个阳性克隆子表达上清；4-6 ：HL连接Linker三个阳性克隆子表达上清；7-9 ：RL连接Linker三个阳性克隆子表达上清。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限此。实施例 1

猪源 IFNλ3 的制备方法，依次进行以下步骤：

实施例1：构建克隆载体

1）以合成的猪λ3干扰素基因为模板，用2×PrimeStart扩增，分别用λ3-GS-F:ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（SEQ ID No:1）、

λ3-HL-F：gctgctgctaaggaagctgctgctaaggctgttccagttccagaagcttt（SEQ ID No:5）、

λ3-RL-F：tgaaggctggtccaggtccagttccagttccagaagcttt（SEQ ID No:6）分别和λ3-R:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（SEQ ID No:2）进行扩增，反应条件：98℃，5分钟；98℃10秒；56℃，20秒；72℃ 20秒， 25个循环；最后72℃延伸5分钟；

2）以合成的长效元件ABD基因为模板，用2×PrimeStart扩增，分别用ABD-GS-R:ccggaacctccaccaccagccttcaatatctcgtcct（SEQ ID No:4）、ABD-HL-R：gcagcttccttagcagcagcttcagcagccttcaatatctcgtcct（SEQ ID No:7）、

ABD-RL-R：tggacctggaccagccttcaatatctcgtcct（SEQ ID No:8）分别和ABD-F: 5'agagaggctgaagctgaattcacCactatcgacgagtggttgctgaaa 3'（SEQ ID No:3）进行扩增，反应条件：98℃，5分钟；98℃10秒；56℃，20秒；72℃ 20秒， 25个循环；最后72℃延伸5分钟；

3）利用引物 ABD-F和λ3-R 通过PCR技术扩增全长含不同Linker的猪源ABD-IFNλ3基因全长，

上游引物ABD-F: 5' agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa 3'（SEQID No:3）；

下游引物λ3-R: 5' tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca3'（SEQ ID No:2）；

4）通过T5克隆将猪源ABD-IFNλ3 基因克隆入 pPicZαA 载体、进行测序鉴定，获得正确的重组载体pPicZαA-ABD-GS-IFNλ3，pPicZαA-ABD-HL-IFNλ3，pPicZαA-ABD-RL-IFNλ3。

2．构建表达菌株 1) 取87 μl重组质粒，加入10 μl 10×cutsmart buffer，3 μlPme I酶，37℃酶切3 h，反应结束后以1.0%琼脂糖凝胶于150 V电压进行电泳分析。若质粒完全酶切，则用胶回收纯化试剂盒回收重组质粒线性化产物。经1.0%琼脂凝胶电泳进行回收确认后，利用分光光度计在波长260 nm测定其OD值，换算回收DNA浓度；

2) 先将线性化质粒、电转杯、感受态细胞冰浴，20 μl线性化质粒加入80 μl感受态细胞后混匀后冰浴5分钟，随后转入1.0 mm电转杯中电转，电转电压为1.5V，电转后立即加入150 μl山梨醇，随后转入已加入500 μl YPD和500 μl山梨醇的培养基中，28℃静止培养40分钟，4000 rpm 离心1分钟，保留40 μl上清其余弃掉，用40 μl上清将沉淀混匀，将混均匀的菌体涂布含100μg/ml Zeocin抗性的 YPD平板，28℃静止培养72 h； 3) 挑选上述YPD平板上单菌落，用无菌牙签蘸取少量菌落，置PCR扩增体系中，扩增体系2×PrimeStart 5μl，上游引物λ3-F 0.4μl，下游引物λ3-R 0.4μl，模板1μl，灭菌ddH2O 3.2 μl。PCR反应参数：98℃预变性5分钟；98℃变性10秒，56℃退火20秒和72℃延伸20秒，共25个循环；72℃延伸10分钟。分析结果与预期大小相符则为阳性克隆； 4) 猪源 IFNλ3核苷酸序列如下（SEQ ID No:9）：gttccagttccagaagctttgagagctttgccaggtgctagaggttgtcacttggctcaattcaagtctttgtccccacaagccttgcaggcttttaagagagctaaggacgctttcgaagagtccttgttggaggactggaactgttcctccagaatcttcccaagatccagagacttgaagcagttgcaggtttgggaaagaccagttgctttggaagctgaggttgctttgaccttgtctgtcttgggttctttggctaactcttccttgcactcctctttggaccaaccattgcacaccttgagacacattcacgctcagttgcaagcttgtgttccagctcaacctatggctggtccaagaccaagaggtagattgcatcattggctgcacagattgcaagaggcccaaaagaaagagccacagtcttgtttggaggcttccgtcatgttcaacctgttcagattgctgacccgtgacttgaagtgtgttgcttctggtgacttgtgtgtt 5) 猪源 IFNλ3 氨基酸序列如下（SEQ ID No:14）： vvaragargchakssaakrakdasdwncssrrsrdkvwrvaavatsvgsansshssdhtrhhaacvamagrrgrhhwhrakkscasvmnrtrdkcvasgdcv。 6) 长效元件ABD核苷酸序列如下（SEQ ID No:10）：

actatcgacgagtggttgctgaaagaggctaaagagaaggccatcgaggaattgaagaaggctggtatcacttccgactactacttcgacttgatcaacaaggccaagaccgttgagggtgttaacgctttgaaggacgagatattgaaggct 7) 长效元件ABD氨基酸序列如下（SEQ ID No:15）：

tdwkakkakkagtsdyydnkaktvgvnakdka

8) Linker核苷酸序列如下：

GS: ggtggtggaggttccggtggtggaggttcc（SEQ ID No:11）

HL: gctgaagctgctgctaaggaagctgctgctaaggct（SEQ ID No:12）

RL: ggtccaggtccaggtcca（SEQ ID No:13） 9) Linker氨基酸序列如下：

GS: ggggsggggs（SEQ ID No:16）

HL:aeaaakeaaaka（SEQ ID No:17）

RL:gpgpgp（SEQ ID No:18）

3．重组蛋白的表达 1) 挑取单菌落接种于含50 μg/ml Zeocin的YPD培养基中，30℃振荡培养过夜。取10 ml接种至100 ml的BMGY，30℃振荡培养。当OD₆₀₀约为6时，3000转/分钟，离心5分钟收集菌体转接至100ml的BMMY培养基中，加入1ml的甲醇，开始诱导表达，每隔24h加1ml的甲醇诱导。诱导至120小时，8000转/分钟，离心20分钟收集上清，置4℃暂存。

2) 取100 μl上清加等体积2×凝胶上样缓冲液（1 M Tris-HCl，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0 ml，0.1%溴酚蓝1.0 ml，蒸馏水3.5 ml），煮沸5分钟，15%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止，检测蛋白表达情况。

实施例 2 ：本发明实施例 1 制备的猪源 IFNλ3 的活性检定

1．以 MDBK 细胞（ MDBK 牛肾细胞）/VSV（水泡性口腔炎病毒）模型检测实施例 1 制备的猪源长效IFNλ3 的活性。将抑制 50% 细胞病变（ CPE）的干扰素的最高稀释度定义为一个干扰素单位（ U）。活性检测结果表明，猪源 IFNλ3 的生物学活性为 2×10⁶U/mg。目前所有表达的 I、II 型干扰素都是以 MDBK 细胞 /VSV 来检测干扰素的表达活性，所以我们也先以该系统分析我们表达的ABD-IFNλ3 是否有生物活性，然后再分析抗其他病毒的活性，结果见表1；

表1：MDBK/VSV活性检测数据:

2．以 VERO 细胞/PEDV （CV777疫苗株）为模型检测实施例 1 制备的猪源长效IFNλ3的活性。将抑制 50% 细胞病变（CPE）的干扰素的最高稀释度定义为一个干扰素单位（U）。活性检测结果表明，猪源长效 IFNλ3 的生物学活性为 2.7×10⁶U/mg。结果见表2：

表2：PEDV/CV777活性检测数据:

实施例3：实施例1中制备的ABD-GS-IFNλ3猪源长效IFNλ3在猪体内的半衰期的测定

细胞病变抑制法测定猪源长效IFNλ3的血药浓度与时间关系，取六只体重相近的仔猪（雌雄各三只），分为肌肉注射2ml浓度为2mg/ml的猪源长效IFNλ3，之后分别在1h、2h、4h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h静脉采血，血样4℃，3500rpm低温离心10min分离血清，各时间点采的猪血清样品与-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中猪源长效IFNλ3的浓度，用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算参数。参数计算结果见表3。

表3猪源长效IFNλ3肌肉注射后血清中主要动力学参数

序列表

<110> 武汉中拓康明生物科技有限公司

<120> 一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> λ3-GS-F(pig)

<400> 1

ggtggtggag gttccggtgg tggaggttcc gttccagttc cagaagcttt gaga 54

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> λ3-R(pig)

<400> 2

tgtctaaggc tacaaactca atgatgatga tgatgatgaa cacacaagtc acca 54

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> ABD-F(pig)

<400> 3

agagaggctg aagctgaatt caccactatc gacgagtggt tgctgaaa 48

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> ABD-GS-R(pig)

<400> 4

ccggaacctc caccaccagc cttcaatatc tcgtcct 37

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> λ3-HL-F(pig)

<400> 5

gctgctgcta aggaagctgc tgctaaggct gttccagttc cagaagcttt 50

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> λ3-RL-F(pig)

<400> 6

tgaaggctgg tccaggtcca gttccagttc cagaagcttt 40

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> ABD-HL-R(pig)

<400> 7

gcagcttcct tagcagcagc ttcagcagcc ttcaatatct cgtcct 46

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> ABD-RL-R(pig)

<400> 8

tggacctgga ccagccttca atatctcgtc ct 32

<210> 9

<211> 516

<212> DNA

<213> 猪源 IFNλ3(pig)

<400> 9

gttccagttc cagaagcttt gagagctttg ccaggtgcta gaggttgtca cttggctcaa 60

ttcaagtctt tgtccccaca agccttgcag gcttttaaga gagctaagga cgctttcgaa 120

gagtccttgt tggaggactg gaactgttcc tccagaatct tcccaagatc cagagacttg 180

aagcagttgc aggtttggga aagaccagtt gctttggaag ctgaggttgc tttgaccttg 240

tctgtcttgg gttctttggc taactcttcc ttgcactcct ctttggacca accattgcac 300

accttgagac acattcacgc tcagttgcaa gcttgtgttc cagctcaacc tatggctggt 360

ccaagaccaa gaggtagatt gcatcattgg ctgcacagat tgcaagaggc ccaaaagaaa 420

gagccacagt cttgtttgga ggcttccgtc atgttcaacc tgttcagatt gctgacccgt 480

gacttgaagt gtgttgcttc tggtgacttg tgtgtt 516

<210> 10

<211> 153

<212> DNA

<213> 长效元件ABD(pig)

<400> 10

actatcgacg agtggttgct gaaagaggct aaagagaagg ccatcgagga attgaagaag 60

gctggtatca cttccgacta ctacttcgac ttgatcaaca aggccaagac cgttgagggt 120

gttaacgctt tgaaggacga gatattgaag gct 153

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> GS(pig)

<400> 11

ggtggtggag gttccggtgg tggaggttcc 30

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> HL(pig)

<400> 12

gctgaagctg ctgctaagga agctgctgct aaggct 36

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> RL(pig)

<400> 13

ggtccaggtc caggtcca 18

<210> 14

<211> 102

<212> PRT

<213> 猪源 IFNλ3 氨基酸(pig)

<400> 14

Val Val Ala Arg Ala Gly Ala Arg Gly Cys His Ala Lys Ser Ser Ala

1 5 10 15

Ala Lys Arg Ala Lys Asp Ala Ser Asp Trp Asn Cys Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Ser Arg Asp Lys Val Trp Arg Val Ala Ala Val Ala Thr Ser Val Gly

35 40 45

Ser Ala Asn Ser Ser His Ser Ser Asp His Thr Arg His His Ala Ala

50 55 60

Cys Val Ala Met Ala Gly Arg Arg Gly Arg His His Trp His Arg Ala

65 70 75 80

Lys Lys Ser Cys Ala Ser Val Met Asn Arg Thr Arg Asp Lys Cys Val

85 90 95

Ala Ser Gly Asp Cys Val

100

<210> 15

<211> 32

<212> PRT

<213> 长效元件ABD氨基酸(pig)

<400> 15

Thr Asp Trp Lys Ala Lys Lys Ala Lys Lys Ala Gly Thr Ser Asp Tyr

1 5 10 15

Tyr Asp Asn Lys Ala Lys Thr Val Gly Val Asn Ala Lys Asp Lys Ala

20 25 30

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> GS氨基酸(pig)

<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> HL氨基酸(pig)

<400> 17

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> RHL氨基酸(pig)

<400> 18

Gly Pro Gly Pro Gly Pro

1 5

Claims

1.一种在毕赤酵母GS115中表达猪源长效 IFNλ3的方法，具体步骤如下：

1）以合成的猪λ3干扰素基因及长效元件ABD为模板，分别用引物λ3-GS-F，λ3-R，ABD-F，ABD-GS-R扩增含GS Linker的目的片段；

2）利用引物 ABD-F和λ3-R 通过PCR技术扩增全长含GS Linker的猪源ABD-GS -IFNλ3基因全长，上游引物ABD-F,下游引物λ3-R；

6）对5）表达样品，在MDBK及VERO细胞水平上评价干扰素活力；

7）对5）表达样品采用细胞病变抑制法检测ABD-GS-IFNλ3在猪体内的半衰期。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中λ3-GS-F:ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（SEQ ID No:1）；λ3-R:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（SEQ ID No:2）；ABD-F:agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（SEQ ID No:3）；ABD-GS-R:ccggaacctccaccaccagccttcaatatctcgtcct（SEQ ID No:4）。

3.一种重组酵母菌株pichia pastoris GS115 /pPICZαA-ABD-GS-IFNλ3的菌株保藏号为：CCTCC NO. M 2018195，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年4月11日，所述重组酵母菌株能够用于制备权利要求1所述的ABD-GS-IFNλ3。

4.ABD-GS-IFNλ3在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防病毒感染。

5.根据权利要求5所述的应用，所述药物为兽药，用于畜禽，优选的，所述药物用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病。