CN106939042A

CN106939042A - 一种猪α干扰素及其应用

Info

Publication number: CN106939042A
Application number: CN201710045372.XA
Authority: CN
Inventors: 廖明; 孙俭波; 焦培荣; 古明珠; 白大勇; 孙超; 廖想; 吴斯宇; 崔进; 冯赛祥; 徐成刚
Original assignee: Beijing Lioson Biotechnology Co Ltd; South China Agricultural University
Current assignee: Beijing Lioson Biotechnology Co Ltd; South China Agricultural University
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2037-01-19
Also published as: CN106939042B

Abstract

本发明提供一种猪α干扰素及其应用，依据大肠杆菌原核表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子设计合成一种猪α干扰素，其氨基酸序列序列如SEQ ID NO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明制备猪α干扰素的方法简单，成本低，易于工业化生产，猪α干扰素表达量高，包涵体处理过程中变性彻底，复性蛋白得率高，本发明制得的猪α干扰素效价高，能够抑制100TCID₅₀的水泡性口炎病毒，比活性高达10⁸，具有较好的生物学活性功能，可用于制备预防和治疗猪的病毒感染类疾病和增强免疫功能的药物，具备广阔的市场应用前景。

Description

一种猪α干扰素及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体地，涉及一种猪α干扰素及其应用。

背景技术

近年来猪病毒性传染病日益泛滥，已严重地威胁着我国畜牧业的持续发展。免疫抑制病及病毒抗原快迅变异，常导致疫苗免疫失败；加之不断出现新的病毒病，目前还尚无成功的疫苗接种预防。另一方面，疫苗对疾病只有预防作用，治疗还有赖于抗生素的使用。而一些抗药性菌株的出现，给人类食品和健康带来极大的威胁，一些国家已明令禁止在养殖生产中应用某些抗生素和抗菌剂。因此，生产中迫切需要一种既有效又有利于环保的新方法来防控畜禽疾病。实践证明，干扰素作为一种广谱的抗病毒剂，在病毒性传染病的防控方面具有广阔的应用前景。

传统的生产方法：由中草药等诱生剂诱导产生干扰素，因纯化工艺复杂，产量少、作用缓和等诸多因素影响而极大限制了在临床和科研的应用。随着猪干扰素基因的克隆成功，对其重组产物的临床应用及作用机理的研究也随之展开。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大肠杆菌中表达了PoIFN-αl基因，得到了一个含189个氨基酸的前体蛋白，去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后，得到了具有完全天然PoIFN-αl生物学活性的产物，并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍。Pol JM等(1991)研究发现：rPoIFN-α1能够抑制伪狂犬病毒(PRV)强毒和中等毒力病毒在猪鼻腔黏膜组织stroma细胞层的增殖，PRV接种干扰素处理的猪成纤维细胞和猪肾细胞，病毒滴度明显下降。Horisberger MA(1992)比较了重组PoIFN-α(rPoIFN-α)和重组PoIFN-γ(rPoIFN-γ)在猪的细胞中抗病毒活性的区别，发现rPoIFN-α可大大降低猪水泡性口炎病毒(VSV)在猪PK-15上引起的病变，并能削弱猪水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在猪肾细胞中的复制。Jordan LT等(1994)发现rPoIFN-α对传染性胃肠炎病毒(TGEV)有很好的预防作用。Buddaert W(1998)对rPoIFN-α在体内、外对猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的抗病毒活性进行了研究，发现PRRSV在体内、外对rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明显抑制PRRSV的产量和感染细胞的数量。chinsangaram J.等(2001)人用大肠杆菌表达rPoIFN-α或rPolFN-α并分别进行了抗口蹄疫病毒(FMDV)实验，发现rPoIFN-α和rPoIFN-α抑制FMDV复制是在蛋白质翻译水平上的，主要是激活双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)作用的结果：在细胞中加入PKR抑制剂2-氨基嘌呤后，病毒的产量就会上升；而RNase L和PKR基因缺失的细胞在干扰素的作用下仍能感染FMDV，这充分说明了PKR在抑制病毒复制中起作用。

我国学者也对猪α干扰素进行了多项研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一种新的猪IFN-α基因并在大肠杆菌中进行了其成熟蛋白的单纯表达，表达产物具有较高的抗病毒活性。杜以军等利用猪IFN-α的成熟蛋白基因构建了重组腺病毒质粒pAd-PoIFN-α转染HEK-293A细胞，滴度为10⁷TCID₅₀/mL。RT-PCR证明目的基因在mRNA水平上可有效表达；在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性，从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。谢海燕等(2004)克隆了猪IFN-α基因，构建了原核表达载体，初步对其进行了原核表达研究；我国学者夏春等(2005)报道了用pQE30表达载体在大肠杆菌原核表达的rPoIFN-α在猪源细胞和非猪源细胞系上可显著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，证明了原核表达PoIFN-α的可行性及将基因工程原核表达的PoIFN-α真正用于生产实践中作为抗病毒制剂可行性。曹瑞兵等对猪IFN-α1基因进行了改造，在保留编码蛋白序列的同时，使用了大肠埃希菌的偏爱密码子，将合成的猪IFN-α1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中，实现了猪IFN-α1在大肠埃希菌中的高效表达，且重组猪IFN-α1具有较高的抗病毒活性，约为6.4×10⁶U/mg。

在猪α干扰素基因研究方面，2000年夏春等首次对猪干扰素α基因进行分子克隆与测序，克隆片段长668个核苷酸，编码186个氨基酸。其中，76～636位含有1个ORF，蛋白分子量为21.8Ku。除此之外，温纳相(2005)和彭贵青(2005)也对猪干扰素α的基因进行了分子克隆与测序，并检测其生物活性。

在表达方面，曹瑞兵(2004)和吴阳(2006)分别对猪α干扰素的基因进行了原核表达，表达量分别为17.3％和18％，表达产物均为融合蛋白。其中曹瑞兵用重组猪α干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后，细胞病变抑制法(CPE₅₀)测定结果表明，重组猪α干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)的感染。但以上技术均具有原基因密码子的表达量低、抗病毒活性低的缺陷。

发明内容

本发明的目的一种抗病毒活性高的猪α干扰素。

本发明的猪α干扰素含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明依据大肠杆菌密码子偏好性，经过密码子改造，获得了编码猪α干扰素的基因，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞均属于本发明的保护范围。

本发明提供一种含有所述猪α干扰素的药物。

具体地，该药物为抗病毒、抗肿瘤或增强免疫功能的药物。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的猪α干扰素在制备猪保健品或药物中的应用。

进一步地，本发明提供一种制备所述猪α干扰素的方法，包括以下步骤：

(1)合成SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，将目的基因克隆入pUC57，转化至大肠杆菌，取转化后的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定；

(2)鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体相连接，转化至大肠杆菌，涂布于含氨苄霉素的LB培养基平板进行过夜培养，取前述平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆质粒双酶切，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功；

(3)构建完成的重组表达菌于含氨苄霉素的LB培养基中进行扩增，放大培养，至细菌达到对数生长期，测细菌在600nm OD值在0.6～0.8时，加入IPTG，过夜诱导表达，收集细菌，鉴定重组蛋白；

(4)用超声破碎菌体后，得到包涵体，经过包涵体洗涤，变性，复性，再经亲和层析纯化蛋白。

其中，步骤(4)中超声破碎菌体后，得到包涵体的方法为：收集细菌，3000-8000rpm/min离心20-40min，弃上清，留沉淀，加入10-20倍体积超声缓冲液重悬菌体，超声裂解得到包涵体；所述超声缓冲液的配方为：50mMTris，50mMNacl，0.5mM EDTA，pH8.0；所述超声裂解条件为：功率：350-400W，工作3秒，间隔5秒，超声5-10min，重复3-4次。

其中，步骤(4)中变性是使用变性液处理包涵体，使蛋白变性后溶解于变性液中；所述变性液配方为50mMTris-Hcl，8M Urea，20mM DTT，pH10-12。优选地，变性液的pH为10-10.5。

现有技术中，常采用的变性液pH为8.3-8.5，本发明发现将pH值调为pH10-12时，蛋白变性更彻底，特别是pH在10-10.5能够达到最佳的变性效果。

与传统表达干扰素的方法相比，本发明通过研究制备猪α干扰素，采用一步亲和层析法，降低成本，提高了回收率，获得的猪α干扰素效价较高，在PK15-VSV体系中活性达10⁸，质量稳定，经鲎试剂检测本发明获得的终产品内毒素含量远低于药典要求，极大的提高药物使用的安全性，因此为产品转化创造了先决条件，具有很好的市场潜力和较强的市场竞争力，更易在规模化猪场中广泛推广应用。基因重组的猪α干扰素具有很好的抗病毒作用，可以单独使用治疗多种猪病毒性疾病；在市场上具有良好的应用前景。在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。本发明通过精心设计，对猪α干扰素进行了基因修饰和改造，经显示系统表明，密码子改造后所分泌蛋白猪α干扰素具有更好的抗病毒活性。

附图说明

图1是重组猪α干扰素蛋白表达SDS-PAGE电泳图，M为maker，泳道1为诱导表达前；泳道2为诱导表达后1h。

图2是重组猪α干扰素蛋白表达SDS-PAGE电泳图，M为maker，泳道1～4是分别挑选的4个克隆进行小试诱导表达。

图3是重组猪α干扰素蛋白可溶性鉴定图，M为maker；泳道1全菌；泳道2菌体破碎后的上清；泳道3菌体破碎后的沉淀，电泳结果显示目的蛋白为包涵体形式表达。

图4是包涵体变性裂解pH优化结果SDS-PAGE电泳图，M为maker；泳道1和4分别为变性液pH8.43时的上清和沉淀；泳道2和5分别为变性液pH9.2时的上清和沉淀；泳道3和6分别为变性液pH10.3时的上清和沉淀。

图5是目的蛋白纯化效果SDS-PAGE电泳图，M为maker；泳道1为待纯化样品；泳道2为纯化过程中的流穿液；泳道3为纯化后的目的蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1基因改造与猪干扰素α蛋白的表达

1、应用基因分析软件，参照NCBI GenBank上登载的猪干扰素α基因成熟肽核苷酸序列GenBank:AFK92985.1，根据大肠杆菌表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计新序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，送生物公司合成该序列。

全基因合成目的基因后，将目的基因克隆于pUC57，转化至大肠杆菌。取转化后的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均为阳性质粒进行目的基因测序。测序结果显示其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、构建表达载体鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET23b相连接，并进行转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyss，涂布于含氨苄霉素的LB培养基平板进行过夜培养，取前述平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆质粒双酶切，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功。

3、重组蛋白的表达分别挑取构建完成的重组表达菌于含氨苄霉素的100ug/ml的LB培养基中进行少量扩增，后分别在含氨苄霉素的100ug/ml的LB培养基中放大培养，至细菌达到对数生长期，测细菌在600nm OD值在0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，37度进行过夜诱导表达，收集细菌。

4、鉴定重组蛋白经过SDS-PAGE检测和western blot实验，证明蛋白无误。

5、纯化重组蛋白，得到粗制品IFN

目的基因的重组质粒pET23b转化大肠杆菌BL21(DE3)plyss，经IPTG诱导后，大肠杆菌pET23b/IFN菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在20KD左右有一条浓染的新增蛋白条带；经western blotting鉴定，此菌体蛋白为目的蛋白。结果见图1、图2。

5.1纯化重组蛋白是指用超声破碎重组蛋白后，得到包涵体，经过包涵体洗涤，变性，复性，再经亲和层析纯化蛋白。见图3。纯化重组蛋白得到粗制品IFN的具体步骤为：收集菌体，4℃，5000rpm/min离心30min，弃上清，留沉淀即为所得发酵菌体，10倍体积超声缓冲液(50mMTris，50mMNacl，0.5mM EDTA，pH8.0)将菌体重悬，超声裂解得到包涵体。功率：350-400W，工作3秒，间隔5秒，超声5-10min，重复3-4次，可取少量超声后液体涂板，检测超声裂解情况，12000rpm/min，4℃离心30min。

5.2包涵体洗涤：离心后的沉淀，加入洗涤液充分悬浮后离心弃去上清。用三种洗涤液依次洗涤，每次保证将离心后的包涵体充分悬浮，磁力搅拌30min后，12000rpm，4℃，20min进行离心。

洗涤1：50mMTris-HCl，0.5％TritonX-100，0.5MNaCl，pH8.0

洗涤2：50mMTris-HCl，2M Urea，1％巯基乙醇，2mM EDTA，0.15MNacl，pH8.0

洗涤3：50mMTris-Hcl，4M Urea，0.5MNacl，pH8.0

5.3包涵体裂解使用含8MUera的变性液处理包涵体，使蛋白变性后溶解于变性液中。变性液：50mMTris-Hcl，8M Urea，20mM DTT，pH10.3，另选pH为8.43和9.2的变性液做对比。菌泥量：变性液＝1：10(W：V)变性室温磁力搅拌4～6h即可，也可4℃过夜。12000rpm，4℃，20min离心，收集变性液上清，4℃保存。结果见图4。

5.4猪α干扰素复性：采用稀释性法，将变性液按1:20体积比稀释到复性液中，磁力搅拌5min后，转到4℃静置24h复性。

复性液配方：50mMTris-Hcl，0.15MNacl，0.4M L-Arg，1mM GSSG，5mM GSH，10％甘油，pH8.0，过夜透析后的复性液，过亲和柱，进行IFN纯化。

6、亲和层析层析过程中，缓冲液中添加300mM氯化钠，降低非特异性蛋白吸附，增加洗脱前的洗涤过程，先使用低浓度的咪唑洗去结合在镍柱上的蛋白，洗脱液中500mM咪唑浓度，洗脱并收集IFN峰。

平衡液：10mM PB，0.3M Nacl，20mM咪唑，pH8.0

洗脱液：10mM PB，0.3M Nacl，500mM咪唑，pH8.0

亲和层析收集的蛋白，经G25脱盐层析柱，将蛋白换液到PBS(pH8.5)缓冲液中。纯化效果见图5。

AKTA蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白，测定IFN效价和比活性。无菌分装，-70℃保存。纯化后重组猪αIFN效价及比活性测定：细胞病变抑制法，纯化后的猪αIFN在PK-15细胞上能够抑制100TCID₅₀的VSV病毒增殖。依据种属特异性特性选用PK15-VSV体系，活性高达10⁸。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学,北京利昂盛生物技术有限公司

<120> 一种猪α干扰素及其应用

<130> KHP161118551.9

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> 猪α干扰素

<400> 1

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp

20 25 30

His Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln

35 40 45

Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln

50 55 60

Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Asp

65 70 75 80

Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp

85 90 95

Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu

100 105 110

Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu

115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile

130 135 140

Ile Arg Ala Glu Val Met Arg Val Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln

145 150 155 160

Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu

165

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> 猪α干扰素

<400> 2

catatgtgtgacctgccgcaaacccactccctggcccatacccgtgctctgcgtctgctg 60

gcccaaatgcgtcgtattagtccgttctcgtgcctggatcatcgtcgcgactttggcagc 120

ccgcacgaagcattcggcggtaaccaggtccaaaaagctcaggcgatggccctggtgcat 180

gaaatgctgcagcaaacctttcaactgttcagtacggaaggctccgcggccgcatgggat 240

gactcactgctgcaccagttttgcaccggtctggatcagcaactgcgtgacctggaagca 300

tgtgttatgcaggaagctggcctggaaggtaccccgctgctggaagaagattcgattctg 360

gcggtccgtaaatattttcatcgcctgacgctgtatctgcaggaaaagagctactctccg 420

tgtgcgtgggaaattatccgtgccgaagtgatgcgcgttttcagttcaagtcgtaatctg 480

caagaccgcctgcgtaagaaagaacaccatcatcatcatcactgagaatt c 531

Claims

1.一种猪α干扰素，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述猪α干扰素的基因，其特征在于，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.含有权利要求1所述猪α干扰素的药物。

6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，其为抗病毒、抗肿瘤或增强免疫功能的药物。

7.权利要求1所述的猪α干扰素在制备猪保健品中的应用。

8.一种制备权利要求1所述猪α干扰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中超声破碎菌体后，得到包涵体的方法为：收集细菌，3000-8000rpm/min离心20-40min，弃上清，留沉淀，加入10-20倍体积超声缓冲液重悬菌体，超声裂解得到包涵体；所述超声缓冲液的配方为：50mMTris，50mMNacl，0.5mM EDTA，pH8.0；所述超声裂解条件为：功率：350-400W，工作3秒，间隔5秒，超声5-10min，重复3-4次。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤(4)中变性是使用变性液处理包涵体，使蛋白变性后溶解于变性液中；所述变性液配方为50mMTris-Hcl，8M Urea，20mM DTT，pH10-12。