CN108179151A

CN108179151A - 一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用

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Publication number: CN108179151A
Application number: CN201711444512.7A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 凌红丽; 魏波; 曲信芹; 刘晓婧; 孙亚磊; 蒋贻海; 王艳玲; 王宏华; 于春梅; 蒋皓静; 武利利
Original assignee: Qingdao National Engineering Technology Research Center Co Ltd; QINGDAO VLAND BIOLOGICAL Co Ltd
Current assignee: Qingdao National Engineering Technology Research Center Co Ltd; QINGDAO VLAND BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2018-06-19

Abstract

本发明提出一种重组猪α‑干扰素、其制备方法及其应用，属于基因工程领域，该重组猪α‑干扰素具有高抗病毒活性，可有效应用于畜禽病毒性传染病防控方面。该技术方案包括通过对猪α‑干扰素基因优化、RNA二级结构优化及某些常见内切酶位点消除后克隆至pET‑23b(+)载体上转化大肠杆菌进行诱导表达，经包涵体分离变性纯化复性后，获得重组猪α‑干扰素。本发明提供的重组猪α‑干扰素效价很高，抗病毒活性可达10¹⁰U/mg，能够有效应用在预防和治疗畜禽病毒性疾病方面。

Description

一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用。

背景技术

近来，病毒性传染病日益泛滥，已严重威胁我国畜牧业的持续发展。免疫抑制病及病毒抗原快速变异，常导致疫苗免疫失败，加之不断出现新的病毒病，目前还尚无成功的疫苗接种预防。另一方面，疫苗对疾病只有预防作用，治疗还有赖于抗生素的使用。而一些抗药性菌株的出现，给人类食品和健康带来极大的威胁，一些国家已命令禁止在养殖生产中应用某些抗生素和抗菌剂。因此，生产中迫切需要一种既有效又有利于环保的新方法来防控畜禽疾病。实践证明，干扰素作用一种广谱的抗病毒剂，在病毒性传染病的防控方面具有广阔的应用前景。

猪α-干扰素是动物在特定诱导剂如某种病毒作用下产生的一类具有广谱高效抗病毒作用的细胞因子，其作用机理是诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，从而减少病毒增殖。猪α-干扰素对猪的传染性胃肠炎、流行性腹泻、蓝耳病等均有一定疗效，但其在抑制病毒试验中使用α-干扰素时并没有发现在同样较高浓度使用其它动物型干扰素时所表现出的细胞毒性。因此，如何提供一种具有高活性的猪α-干扰素将是本领域目前需要研究的课题。

发明内容

本发明提出一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用，该重组猪α-干扰素具有高抗病毒活性，可有效应用于畜禽病毒性传染病防控方面。

为了达到上述目的，本发明的一方面提供了一种重组猪α-干扰素的制备方法，包括以下步骤：

选择GenBank登录号为28623的猪α-干扰素基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

翻译SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子进行优化，消除常规限制性内切酶酶切位点，并对其RNA二级结构进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列两端分别加入NdeI和EcoRI位点并克隆到pGEM-T easy载体中，挑取阳性克隆后进行测序鉴定，得到质粒pGEM-pigIFNa1；

利用NdeI和EcoRI限制性内切酶将质粒pGEM-pigIFNa1中的猪干扰素pigIFNa1切下，琼脂糖凝胶电泳回收523bp片段，克隆到预先以NdeI和EcoRI限制性内切酶酶切的氨苄青霉素抗性载体中，挑取阳性克隆进行测序鉴定，得到重组质粒pET23-pigIFNa1；

将重组质粒pET23-pigIFNa1转化感受态大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，收集表达菌体，经超声破碎后，得到包涵体，将所得包涵体洗涤、变性、复性，再经亲和层析纯化，得到重组猪α-干扰素。

作为优选，在得到优化后的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列之后，还包括将SEQID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比对的步骤，以及将SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列翻译为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，并将其与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对的步骤。

作为优选，其中，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对结果一致。

作为优选，洗涤步骤包括：将包涵体依次经1％Triton X-100及2M尿素重悬洗涤；变性步骤包括：将1g纯化的包涵体在40ml 7M盐酸胍溶液中完全变性，变性液中蛋白含量为8～10mg/ml；复性步骤包括：将变性蛋白溶液逐滴缓慢加入胱氨酸-半胱氨酸复性液中，使蛋白含量约为0.1mg/ml，4℃静置复性24-40小时。

本发明的另一方面提供了一种如上述任一项技术方案所述的制备方法制备得到的重组猪α-干扰素，采用MDBK-VSV系统检测其活性不低于10¹⁰U/mg。

本发明的再一方面提供了一种含有上述技术方案所述的重组猪α-干扰素的药物。

作为优选，所述药物为抗病毒、抗细胞增殖和增强免疫功能的药物。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

与传统表达干扰素的方法相比，本发明通过对猪α-干扰素基因进行改造、RNA二级结构优化及某些常见内切酶位点消除后克隆至pET-23b(+)(氨苄青霉素抗性)载体上转化大肠杆菌进行诱导表达，经包涵体分离变性纯化复性后，获得的重组猪α-干扰素效价很高，抗病毒活性可达10¹⁰U/mg。其内毒素含量极低，极大地提高了药物使用的安全性，为产品转化创造了先决条件，具有很好的市场潜力和较强的市场竞争力。重组猪α-干扰素具有很好的抗病毒作用，可以单独使用在预防和治疗猪病毒性疾病方面，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明所提供的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的比对图；

图2为本发明所提供的SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的比对图；

图3为本发明实施例所提供的重组质粒pET23-pigIFNa1转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后可见的约19kD目的蛋白，其中，M：蛋白Marker；1：未诱导全菌；2：诱导全菌；3：裂解上清；4：沉淀。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、选择猪α-干扰素基因序列

选择GenBank登录号为28623的猪α-干扰素基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。将该核苷酸翻译为氨基酸序列，具体如SEQ ID NO.2所示。

2、按照大肠杆菌密码子进行优化

将上述表达序列在DNAworks在线软件上按照大肠杆菌密码子进行优化，消除常规限制性内切酶酶切位点，并对其RNA二级结构进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，其中最后三位GAA为终止密码子，不表达蛋白。其中，常规限制性内切酶为本领域技术人员所熟知的限制性内切酶，如BamHI、EcoRI、NdeI、XhoI等。

3、优化后的序列确认

1)核苷酸序列比对

将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比对，结果为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列在某些位点上进行了优化，同时消除了常见的限制性内切酶酶切位点，如图1所示。

2)氨基酸序列比对

将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列翻译为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，其中1位M为启示密码子，并将其与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行比对。结果为SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对结果一致，确认无误，如图2所示。

4、基因合成

在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列两端分别加入NdeI和EcoRI位点并克隆到pGEM-T easy载体中，挑取阳性克隆后进行测序鉴定，得到质粒pGEM-pigIFNa1。

5、表达质粒的构建

利用NdeI和EcoRI限制性内切酶将质粒pGEM-pigIFNa1中的猪干扰素pigIFNa1切下，琼脂糖凝胶电泳回收523bp片段，克隆到预先以NdeI和EcoRI限制性内切酶酶切的氨苄青霉素抗性载体中，挑取阳性克隆进行测序鉴定，得到重组质粒pET23-pigIFNa1。

6、表达

将上述重组质粒pET23-pigIFNa1转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，可见约19kD表达蛋白(目的蛋白)，如图3所示，收集表达菌体，经超声破碎后，得到包涵体。具体的，表达菌体经破碎后，依次进行离心上清、沉淀，进行SDS-PAGE电泳，结果表达蛋白在沉淀中，表明该蛋白以包涵体形式表达。

7、包涵体变性、复性、纯化及效价测定

将得到的包涵体依次经1％Triton X-100及2M尿素重悬洗涤，经过洗涤的包涵体蛋白纯度达到80％以上。将1g纯化的包涵体在40ml 7M盐酸胍溶液中完全变性，变性液中蛋白含量为8～10mg/ml。进一步，采用胱氨酸-半胱氨酸氧化还原稀释法相结合进行复性，将变性蛋白溶液逐滴缓慢加入含有胱氨酸-半胱氨酸复性液中，使蛋白含量约为0.1mg/ml，4℃静置复性24-40小时。阴离子交换层析柱纯化后得到具有抗病毒活性的干扰素溶液，采用MDBK-VSV系统检测其效价不低于10¹⁰U/mg。

效价检测方法具体如下：

1)细胞制备：取生长良好的MDBK细胞，按常规方法消化，用10％FBS DMEM(含双抗)制备细胞悬液；对细胞进行计数，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml的悬液，然后加入到96孔细胞培养板上，100μl/孔，37℃，5％CO₂培养8-10h成单层细胞。

2)干扰素处理细胞：取待测干扰素样本用10％FBS DMEM进行10倍倍比稀释，将培养8-10h的单层细胞中的培养液弃掉，加入10倍倍比稀释的干扰素稀释液，每孔100μl，每个稀释度8孔；同时分别设8孔病毒阳性对照和8孔阴性对照，并在对照各孔中加入100μl 10％FBS DMEM(含双抗)，培养12-15h。

3)病毒感染取VSV病毒：用无血清DMEM稀释成终浓度为1000TCID50/ml；弃原细胞培养液，用无菌PBS洗2-3遍，100μl/孔；在阳性对照和干扰素处理细胞各孔中加入100μl病毒稀释液，在阴性对照孔中加入无血清DMEM(含双抗)培养基；培养24h，观察细胞病变情况。

4)结果判定：以能抑制50％细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，用Reed-Muench法计算干扰素效价，即能抑制50％细胞病变的稀释倍数。

实施例2

本发明实施例还提供了一种含有上述重组猪α-干扰素的药物。由于上述实施例提供的重组猪α-干扰素效价很高，抗病毒活性可达10⁹U/mg，且内毒素含量极低，为转化为药物创造了先决条件，极大地提高了药物使用的安全性，具有很好的市场潜力和较强的市场竞争力。该药物可为抗病毒、抗细胞增殖和增强免疫功能的药物，可以单独或联合使用在预防和治疗猪病毒性疾病方面，具有潜在的应用价值。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

青岛动保国家工程技术研究中心有限公司

<120> 一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 4

<211> 501

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg atcccctcat 120

gaggcttttg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180

ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg gaatgagagc 240

ctcctgcacc agttctacac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300

atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat ccgggctgtg 360

aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420

tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga tccttctctt cctccagaaa cctgcaagac 480

agactcagga agaaggagtg a 501

<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

20 25 30

Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser

65 70 75 80

Leu Leu His Gln Phe Tyr Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

100 105 110

Glu Glu Asp Ser Ile Arg Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val

130 135 140

Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp

145 150 155 160

Arg Leu Arg Lys Lys Glu

165

<210> 4

<211> 501

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtgcgatc tgccgcagac ccatagctta gcgcataccc gtgcgttacg tctgttggcg 60

cagatgcgtc gtattagccc gtttagctgc cttgatcatc gtcgtgattt tggcagcccg 120

catgaagcgt ttggcggcaa tcaggtgcag aaagcgcagg cgatggcgct ggtgcatgaa 180

atgcttcagc agacctttca actgtttagc accgaaggga gcgccgctgc gtggaatgaa 240

agcctgttgc atcagtttta taccggcctg gatcagcagt tacgtgatct ggaagcgtgc 300

gtgatgcagg aagcgggctt ggaaggcacc ccgctgctgg aagaagatag cattcgtgcg 360

gtacggaagt attttcatcg gctgaccctg tatctgcaag aaaaatctta tagcccctgt 420

gcctgggaaa ttgtgcgtgc ggaggtgatg cgtagcttta gctctagccg taatcttcag 480

gatcgtctgc gtaagaaaga a 501

<210> 4

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp

20 25 30

His Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln

35 40 45

Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln

50 55 60

Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu

65 70 75 80

Ser Leu Leu His Gln Phe Tyr Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp

85 90 95

Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu

100 105 110

Leu Glu Glu Asp Ser Ile Arg Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu

115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile

130 135 140

Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln

145 150 155 160

Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu

165

Claims

1.一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

选择GenBank登录号为28623的猪α-干扰素基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列两端分别加入NdeI和EcoRI位点并克隆到pGEM-Teasy载体中，挑取阳性克隆后进行测序鉴定，得到质粒pGEM-pigIFNa1；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在得到优化后的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列之后，还包括将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比对的步骤，以及将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列翻译为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，并将其与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对的步骤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对结果一致。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，洗涤步骤包括：将包涵体依次经1％Triton X-100及2M尿素重悬洗涤；变性步骤包括：将1g纯化的包涵体在40ml 7M盐酸胍溶液中完全变性，变性液中蛋白含量为8～10mg/ml；复性步骤包括：将变性蛋白溶液逐滴缓慢加入胱氨酸-半胱氨酸复性液中，使蛋白含量约为0.1mg/ml，4℃静置复性24-40小时。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的重组猪α-干扰素，其特征在于，采用MDBK-VSV系统检测其活性不低于10¹⁰U/mg。

6.一种含有如权利要求5所述的重组猪α-干扰素的药物。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物为抗病毒、抗细胞增殖和增强免疫功能的药物。