CN114751991B - 一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白及其编码基因和应用。所述猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。同时本发明还提供了所述融合蛋白的编码基因、重组表达载体和表达其的宿主细胞。本发明提供的融合蛋白的细胞毒性小，兼具猪β防御素2和猪α干扰素双重生物学活性，且该融合蛋白的抗病毒活性和抑菌活性较高。

Description

一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
防御素是一类广泛分布于动植物中的小分子阳离子抗菌肽，其体外具有广谱的抗菌作用。猪β防御素2(porcineβ-defensin-2，PBD-2)是仅存在于猪中的天然防御素之一，在体外表现出很强的耐盐和热稳定性。猪β防御素2对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很好的抑制效果。与其他抗菌肽相比，猪β防御素2具有抗菌谱广、作用效果强的优点。但是猪β防御素2在体内表达量很低，通过生物提取的方式只能得到极少量的防御素。
猪干扰素(Porcine interferon)是被最早研究的动物干扰素之一，20世纪80年代就有关于猪干扰素的报道。在各种类型的干扰素当中，α干扰素的抗病毒作用最强，可以分为不同的亚型，目前已知有20余种亚型，它是一类具有广谱抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等多种作用的糖蛋白，被广泛应用于病毒性疾病的预防和治疗。研究证实猪α干扰素(PoIFN-α)可以有效治疗猪流行性腹泻、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病。
将防御素与干扰素融合表达可实现细菌性疾病与病毒性疾病等主要流行疾病的预防与治疗。基于此，研究人员通过原核表达系统成功获得了猪β防御素2与猪α干扰素的融合蛋白，但得到的重组融合蛋白的抑菌活性和抗病毒病活性并不显著，且细胞毒性高，其表达量也并不理想。因此，研究高表达量、高活性和细胞毒性小的猪β防御素2与猪α干扰素的融合蛋白，对于预防和治疗猪感染性疾病具有重要意义。
发明内容
针对常规基因工程技术得到的β防御素2与猪α干扰素的融合蛋白存在的上述问题，本发明提供融合蛋白及其编码基因和应用，该融合蛋白具有较高的抗病毒和抑菌活性，在特定的表达系统中具有极高的表达量和低细胞毒性。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白，具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
相对于现有技术，本发明提供的融合蛋白是通过一个重复的G4S将两个功能不同的蛋白连接并优化得到。该融合蛋白兼具猪β防御素2和猪α干扰素双重生物学活性，且该融合蛋白的抗病毒活性和抑菌活性较高。同时，该融合蛋白的细胞毒性较小，在体内和体外均能发挥抗菌和抗病毒活性。
本发明还提供了所述猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白在作为抗病毒药物中的应用。
本发明还提供了所述猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白在作为抑菌药物中的应用。
本发明还提供了编码所述猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白的基因，所述基因通过连接序列将猪β防御素2与猪α干扰素的基因序列连接后，对碱基进行优化得到；所述连接序列如SEQIDNO:2，所述基因的碱基序列如SEQIDNO:3。
利用上述连接序列(linker)可实现猪β防御素2和猪α干扰素进行串联表达，降低两者之间的空间位阻，在特定的表达系统中帮助融合蛋白各结构域形成正确的折叠，进而形成正确的空间构象，且对两种蛋白的活性实现了极大程度的保留。
本发明提供的上述基因可以准确编码出所述猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述的基因及其表达调控原件。
本发明还提供了所述重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
a、在所述基因的两端加上酶切位点和保护性碱基，得到修饰后的基因序列；
b、通过酶切连接的方法将所述修饰后的基因序列连接至目的质粒中，得到所述重组表达载体。
优选的，所述基因的两端分别加上EcoR I酶切位点和Not I酶切位点，所述修饰后的基因序如SEQIDNO:4；所述目的质粒为pPICZαA。
将本发明中编码所述猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白的基因连接酶切位点和保护性碱基后，连接至pPICZαA中，可以实现在赤壁酵母中准确和高效表达，提升融合蛋白的表达量。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述重组表达载体并表达所述融合蛋白的工程菌。
优选的，所述工程菌为毕赤酵母。
通过毕赤酵母表达系统获得的猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白，对细胞的损伤极小。即毕赤酵母表达系统表达的上述融合蛋白与原核表达系统相比，对细胞增殖影响较低。
进一步优选的，所述毕赤酵母为KM71H。
毕赤酵母选择KM71H，更加利于形成正确的猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白空间构象，提高其活性高，使其无论是抗病毒活性还是抑菌活性，较其他表达系统都得到了提高。
附图说明
图1是本发明实施例中的重组表达载体质粒的结构图；
图2是本发明实施例中的引物5'AOX1和3'AOX1扩增产物的凝胶电泳图，其中，M泳道：DL2000DNA，1-5泳道：引物5'AOX1和3'AOX1的扩增产物；
图3是本发明实施例中引物PBD-2+PoIFNα-F和PBD-2+PoIFNα-R扩增产物的凝胶电泳图，其中，M泳道：DL2000DNA，1-3泳道：引物PBD-2+PoIFNα-F和PBD-2+PoIFNα-R的扩增产物；
图4是本发明实施例中检测融合蛋白的Western Blot图，其中，M泳道：180KDamarker，1泳道：蛋白；
图5是本发明实施例中不同稀释浓度的融合蛋白对PK-15细胞的活性统计图；
图6是本发明实施例中不同稀释浓度的融合蛋白下PK-15细胞的形态图；
图7是本发明实施例中融合蛋白的溶血活性检测统计图；
图8是本发明实施例中不同浓度的融合蛋白对PK-15细胞的保护率统计图；
图9是本发明实施例中融合蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌试验图，其中，P：PBS，A：Amp，B：Kan，R：融合蛋白；
图10是本发明实施例中融合蛋白对大肠杆菌的抑菌试验图，其中，P：PBS，A：Amp，B：Kan，R：融合蛋白；
图11是本发明实施例中不同浓度的融合蛋白的抑菌活性统计图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
融合蛋白的获得
材料、方法和结果
1、材料
DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；
KM71H酵母菌株由河北农业大学生动物医学院兽用生物制品实验室保存；
水泡性口炎病毒(VSV)、猪肾细胞(PK-15)、牛肾细胞(MDBK)和幼龄仓鼠肾细胞(BHK)均由河北农业大学动物医学院兽用生物制品实验室保存；
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和大肠杆菌(ATCC 25922)购自北京保藏生物科技有限公司；
Anti-His MousemAb和Goat Anti-MouseIgG购自北京全式金生物技术有限公司；
基因和引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2、猪IFN-α与猪PBD-2基因的设计与合成
参照GenBank登录的猪PBD-2基因序列(登录号：NM-214442)与猪IFN-α基因序列(登录号：KF414740.1)，去除信号肽并对基因序列进行优化，两个基因之间用linker(SEQIDNO:2)连接，得到编码基因(SEQIDNO:3)。在编码基因的两端加上EcoR I和Not I酶切位点和保护性碱基，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，得到修饰后的基因序列(SEQIDNO:4)；
通过EcoR I和Not I酶对修饰后的基因序列和pPICZαA质粒分别进行双酶切，通过酶切连接的方式将上述编码基因连接至pPICZαA质粒中，得到重组表达载体，命名为pPICZαA-PBD-2+PoIFNα，该重组表达载体的图谱如图1所示。
3、pPICZαA-PBD-2+PoIFNα的转化以及融合蛋白的表达和纯化
3.1、pPICZαA-PBD-2+PoIFNα的转化
将pPICZαA-PBD-2+PoIFNα转载至大肠杆菌DH5α中，然后将DH5α菌液划线接种于LB固体培养基中，倒置培养12h。挑取单克隆菌落，置于500μL液体LB液体培养基中，37℃、200rpm培养6h进行活化。将活化后的菌液接种于液体LB培养基中，37℃、180rpm培养12h，得到培养菌液。上述所用LB中均含有25μg/mL的Zeocin。
3.2、酵母细胞的转化和阳性菌的筛选
从培养菌液中提取pPICZαA-PBD-2+PoIFNα质粒，用Sac I限制性内切酶进行单酶切线性化，酶切反应体系如下：10×L Buffer20μL，Sac I10μL，质粒pPICZαA-PBD-2+PoIFNα100μL(质粒浓度为150mg/mL)，ddH2O70μL；将上述体系充分混匀，37℃恒温水浴12h，然后用乙醇沉淀法对酶切产物进行浓缩，得到的浓酸产物即为线性化pPICZαA-PBD-2+PoIFNα。
将电转杯用75％的乙醇浸泡消毒，转移至冰上预冷。将10μL线性化pPICZαA-PBD-2+PoIFNα质粒加入到80μL的毕赤酵母KM71H感受态细胞中，吹吸混匀后转移到预冷的电转杯中，冰浴5min。电转仪调为真核模式，电击后加入1mL预冷的无菌山梨醇，混匀后28℃孵育2h，2500rpm离心2min，弃去上清，剩余细胞液混匀后涂于YPD固体培养基(含25μg/mL的Zeocin、50μg/mL的Kan和100μg/mL的Amp)中，28℃培养4d。挑取单菌落至YPD液体培养基中，28℃、220rpm培养1d，得到酵母菌液。取1mL酵母菌液至离心管中，收集菌体，PBS洗涤3次后加入50μL的灭菌水，采用煮-冻-煮法提取酵母基因组，用pPICZαA质粒的测序引物5'AOX1(SEQIDNO:5)和3'AOX1(SEQIDNO:6)以及PBD-2+PoIFNα-F(SEQIDNO:7)和PBD-2+PoIFNα-R(SEQIDNO:8)进行PCR鉴定。
其中，引物5'AOX1和3'AOX1用以鉴定质粒存在，PBD-2+PoIFNα-F和PBD-2+PoIFNα-R用以鉴定质粒中重组基因的存在。
引物5'AOX1和3'AOX1的鉴定结果如图2所示，说明提取的基因组中含有pPICZαA线性质粒；
引物PBD-2+PoIFNα-F和PBD-2+PoIFNα-R的鉴定结果如图3所示，说明pPICZαA线性质粒中含有重组基因。
基因组鉴定出含有pPICZαA线性质粒，且pPICZαA线性质粒中含有重组基因的毕赤酵母为阳性。
3.3融合蛋白的表达及纯化
将鉴定为阳性的重组酵母菌液接种至YPD液体培养基中，28℃、220rpm培养1d来活化菌种；然后按1％的接种量接种于25mL的BMGY培养基中，28℃、220rpm培养至菌体OD600＝4时离心，2500rpm离心5min弃去培养液，将菌体重悬在100mL的BMMY培养基中，然后在30℃、220rpm下培养，每隔24h补充1mL的纯甲醇，连续培养4d。培养得到的菌液12000rpm离心10min，弃去沉淀，收集上清，向上清中加入20mL的100％TCA，混匀后-20℃过夜，次日取出冷冻的上清液，12000rpm离心20min，收集蛋白沉淀，得到蛋白浓缩液。将得到的蛋白浓缩液放到透析袋中，将透析袋放到不含尿素的Binding Buffer中4℃透析12h除去残留的TCA。用His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，收集洗脱的蛋白液，并进行SDS-PAGE检测，使用NanoDrop2000测定蛋白浓度，经NanoDrop2000测定得到的蛋白的平均浓度为1.374mg/mL，说明该融合蛋白在上述表达系统中具有极高的表达量。
4、融合蛋白的Western Blot
以Anti-His MousemAb为一抗，按照1∶5000进行稀释，充分混匀后覆盖在PVDF膜上，室温孵育1h。以Goat Anti-MouseIgG作为二抗，按照1∶10000进行稀释，室温孵育1h。使用ECL显色。得到的Western Blot图如图4所示，为单一条带，蛋白大小正确，为25KDa，后经特异性抗体检测，确认得到的蛋白即为目的融合蛋白。
5、融合蛋白的抗增殖活性
用MTT法测定1.4得到的融合蛋白(rPBD-2+PoIFNα)作用于PK-15细胞后的活性。PK-15细胞在96孔细胞培养板生长至单层后，取300μL制备好的融合蛋白，用900μL含2％的FBS的DMEM营养液进行4倍倍比稀释，共稀释8个梯度，每个梯度8个重复孔，每孔100μL。同时设置蛋白阳性对照孔以及细胞阴性对照孔(control)。孵育16-24小时后不弃培养基，加入15μL的MTT(5mg/mL)，包裹锡纸避光，37℃培养4h。弃掉培养基，加入DMSO，100μL/孔，避光摇匀，15min内测定OD450。
对不同稀释浓度的融合蛋白对PK-15细胞的活性进行统计，统计结果如图5所示；
对不同稀释浓度的融合蛋白对PK-15细胞的形态的影响进行显微观察，观察结果如图6所示。
可见，在融合蛋白的稀释度到4-4及以上时，其对PK-15细胞的损伤与对照组没有差异。即在融合蛋白的稀释度为4-4时，80％以上的细胞依然保持活性，这在之后的溶血性试验中，同样证实了重组融合蛋白的生物安全性，说明融合蛋白具有一定的生物安全，为蛋白药物的推广奠定基础。
6、融合蛋白的溶血性试验
用无菌PBS(pH7.4)将新鲜猪红细胞稀释(PBS与猪红细胞的体积比为97:3)，再用无菌PBS将1.4得到的融合蛋白4倍倍比稀释至4-5，取20μL分别加入无菌离心管中，同时设PBS为阴性对照，0.2％TritonX-100为阳性对照，分别向每管加入180uL稀释好的红细胞。37℃孵育1h，1000r/min离心10min后取上清，用微量分光光度计测OD560值并计算溶血指数，溶血指数(％)＝(OD蛋白-ODPBS)/(ODTriton-100-ODPBS)。每个样品做3个平行测定，取平均值。
经检测，所述融合蛋白具有很低的溶血性。如图7所示，将融合蛋白稀释为4-1时，红细胞会出现75％的溶血，但是随着稀释度增加，溶血性逐渐降低，4-5时几乎对红细胞没有损害。
7、融合蛋白的抗病毒活性
PK-15在96孔细胞培养板生长至单层后，4倍比稀释1.4得到的融合蛋白，共稀释9个梯度，每个梯度8个重复孔，每个梯度取100μL加至96孔板中，于37℃、5％的CO2的细胞培养箱中孵育15h，弃去培养液。VSV溶液用含2％的FBS的DMEM营养液稀释至100TCID50，向96孔板中每孔加100uL。同时设计阳性对照(只用病毒处理)、阴性对照(共稀释64倍的蛋白处理)和正常细胞对照(不做处理，control)。当观察到的阳性对照组细胞出现75％以上病变时判定结果，按照Reed-Muench法计算重组蛋白对细胞的保护率(抗病毒活性)，保护率越高其对应的抗病毒活性越高。结果如图8所示，说明该融合蛋白具有极高的抗病毒活性。
通过细胞病变抑制法测得重组融合蛋白不仅在本属动物细胞(PK-15)上具有抗VSV的活性，而且试验发现其在MDBK和BHK细胞上同样具有抗病毒活性，这说明本申请提供的融合蛋白具有跨物种抗病毒的活性，并且试验所得蛋白抗病毒比活性高达2.37×106IU。
8、融合蛋白的抑菌活性
8.1、琼脂扩散法
将大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)活化菌落接种于无抗的LB液体培养基中，以37℃、200rpm的条件培养8h。后将菌液按1:1000的比例接种于无抗的LB液体培养基中，以37℃、200rpm的条件培养12h。将培养后的菌液按1:100的接种于无抗的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600值为0.6-0.8。取20μL培养好的菌液与20mL冷却至50℃的LB固体培养基混匀，倒入直径90mm灭菌培养皿中，凝固后用直径6mm的打孔器打孔，每孔加入重组蛋白(浓度为1.374mg/mL)、Amp(100μg/mL)和Kan(50μg/mL)各20μL，37℃培养16h，测量抑菌圈直径。
见图9所示，融合蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为150mm；见图10所示，融合蛋白对大肠杆菌的抑菌圈为148mm。
若将上述重组基因转载至原核表达系统(BL21)中进行蛋白的表达，用得到的融合蛋白进行与上述相同的抑菌试验，平板上R(融合蛋白)对应的位置均未出现抑菌圈，说明用原核表达系统得到的上述融合蛋白的活性达不到本申请中的融合蛋白的抑菌活性。
8.2、细菌生长曲线法
无菌条件下大肠杆菌接种、摇菌，OD600＝1时，其菌密度达到109CFU/mL，用不加抗性的LB将融合蛋白等比稀释成4-1、4-2、4-3、4-4，将100μL不同浓度的融合蛋白分别与100μL、109CFU/mL的大肠杆菌在96孔板中混匀后37℃共培养，每组实验5个平行，并用酶标仪测定其在0h、1h、4h和8h的光吸收值，计算抑菌率＝[(Bxh-B0h)/(Axh-A0h)]×100％(A为对照组，B为实验组)。
见图11所示，与对照组相比，融合蛋白可以显著抑制细菌的增殖，且随着融合蛋白浓度的增加，抑菌效果更显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北瑞兰生物科技有限公司
<120> 一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白及其编码基因和应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213>
<400> 1
Ile Asn Leu Leu Thr Gly Leu Gly Gln Arg Ser Asp His Tyr Ile Cys
1 5 10 15
Ala Lys Lys Gly Gly Thr Cys Asn Phe Ser Pro Cys Pro Leu Phe Asn
20 25 30
Arg Ile Glu Gly Thr Cys Tyr Ser Gly Lys Ala Lys Cys Cys Ile Arg
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser
50 55 60
Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile
65 70 75 80
Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His
85 90 95
Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu
100 105 110
Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly
130 135 140
Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala
145 150 155 160
Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val
165 170 175
Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr
180 185 190
Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe
195 200 205
Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu
210 215 220

Claims (3)

1.一种猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白，其特征在于：由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成。
2.权利要求1所述的猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
3.权利要求1所述的猪β防御素2与猪α干扰素融合蛋白在制备抑菌药物中的应用。
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