CN109485717B - 西伯利亚鲟白细胞介素8及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种西伯利亚鲟白细胞介素8及其应用。本发明提供了蛋白质，西伯利亚鲟白细胞介素8，为如下任一种：1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；2)氨基酸序列是序列表中序列2第23‑98位所示的氨基酸残基。实验证明，重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟外周血白细胞和脾脏细胞具有明显的趋化活性，提高西伯利亚鲟脾脏细胞的增殖活性，可诱导西伯利亚鲟免疫基因il6、il1β、IgM和MHCII的上调表达，并提高其对嗜水气单胞菌的抵抗能力，该重组AbIL8蛋白可在鲟鱼免疫增强剂中应用。

Description

西伯利亚鲟白细胞介素8及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种西伯利亚鲟白细胞介素8及其应用。
背景技术
白细胞介素8(Interleukin-8,IL-8)，也称为CXCL8，是一种同时具有促进炎症反应和趋化作用的细胞因子，在免疫和炎症过程中具有重要调节意义。黑线鳕在注射LPS或者细菌感染后，IL8基因表达上调(Hu Y H,Chen L,Sun L.CXCL8of Scophthalmus maximus:expression,biological activity and immunoregulatory effect[J].Developmental&Comparative Immunology,2011,35(10):1032-1039.t)，IL-8同时是中性粒细胞重要和有效的趋化因子，是激活嗜中性粒细胞的有效刺激物，最先到达炎症部位的中性粒细胞同时能够分泌CXCL8，从而诱导更多中性粒细胞的流入，一旦到达受伤部位，中性粒细胞就能够通过分泌蛋白酶和抗菌肽来杀死细菌、净化伤口。
鲟鱼，属软骨硬鳞类，是一种经济价值高的鱼类，全身除骨板外其它部分都可食用，其卵制成的鱼子酱更具有高经济价值。近年来，随着鲟鱼养殖规模的扩大，病害发生频繁，给鲟鱼养殖业造成巨大损失，这使得免疫防治技术在鱼病防治中具有广阔的应用前景。白细胞介素8作为免疫佐剂已在哺乳和禽类动物疫苗中广泛应用，而其在鱼类的研究应用处于起步阶段，可预测其具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，西伯利亚鲟白细胞介素8，为如下1)-5)中任一种：
1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
2)氨基酸序列是序列表中序列2第23-98位所示的氨基酸残基；
3)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
4)在1)或2)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
5)将1)或2)或3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。
上述核酸分子为如下(a1)-(a8)任一所示的DNA分子：
(a1)编码区包括序列表中序列1的DNA分子；
(a2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；
(a3)编码区包括序列表中序列1第51-347位所示的DNA分子；
(a4)核苷酸序列是序列表中序列1第51-347位所示的DNA分子；
(a5)编码区包括序列表中序列1第117-347位所示的DNA分子；
(a6)核苷酸序列是序列表中序列1第117-347位所示的DNA分子；
(a7)与(a1)-(a6)任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；
(a8)在严格条件下与(a1)-(a6)任一限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述75％或75％以上同一性具体为80％、85％、90％、95％或98％以上同一性。
含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
上述蛋白质在作为趋化因子中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在趋化细胞迁移中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备趋化细胞迁移产品中的应用也是本发明保护的范围。
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在促进脾脏细胞的增殖活性中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备促进脾脏细胞的增殖活性产品中的应用也是本发明保护的范围。
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在清除和/或抑制细菌中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备清除和/或抑制细菌产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在提高鱼类抗菌或清除菌的能力也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备提高鱼类抗菌或清除菌的能力产品中的应用也是本发明保护的范围。
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调节机体免疫中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备调节机体免疫产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在提高免疫相关基因的表达中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备提高免疫相关基因的表达产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述细胞为脾脏细胞或外周血白细胞；
或所述细胞源自鱼类；所述鱼类为软骨硬鳞类；
或所述细菌为鱼体脾脏细菌。
上述中，所述产品为试剂盒。
所述免疫相关基因具体为炎症因子IL6基因、组织相容性抗原MHCII基因、免疫球蛋白IgM基因。
软骨硬鳞鱼具体为西伯利亚鲟。
本发明的实验证明，重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟外周血白细胞和脾脏细胞具有明显的趋化活性，提高西伯利亚鲟脾脏细胞的增殖活性，可诱导西伯利亚鲟免疫基因il6、il1β、IgM和MHCII的上调表达，并提高其对嗜水气单胞菌的抵抗能力，该重组AbIL8蛋白可在鲟鱼免疫增强剂中应用。
附图说明
图1为西伯利亚鲟重组蛋白AbIL8的诱导表达。
图2为西伯利亚鲟IL8重组蛋白6×His标签的western检测。
图3为重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟外周血白细胞和脾脏细胞的趋化活性。
图4为重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟脾脏细胞增殖活性的影响。
图5为重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟脾脏细胞抑制嗜水气单胞菌感染的效果。
图6为注射AbIL8对西伯利亚鲟脾脏和头肾免疫基因表达的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、西伯利亚鲟AbIL8cDNA全长序列的克隆
一、AbIL8cDNA全长序列的克隆与分析
设计了4条RACE引物:
AbIL8-GSP5-1:5’-TCT TTT TTA ATG CAC TGA CAA CGG AG-3’；
AbIL8-GSP5-2:5’-ATT CTG GAT CTG CCT GGG ATG G-3’；
AbIL8-GSP3-1:5’-CAA GGA TGC TGA AGT CAT TGC CA-3’；
AbIL8-GSP3-2:5’-GCC CGC TGG GTC AAG ATA GT TA-3’。
提取西伯利亚鲟脾脏的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用RACE技术，扩增基因的5’和3’端，分别获得了205bp和837bp的扩增片段，结合实验室前期转录组测序得到的部分序列，通过序列拼接得到了cDNA序列全长，即序列表中序列1；该基因的开放阅读框为序列1中第51位到第347位，其中序列1第51-116位为信号肽编码区；该基因命名为AbIL8；该基因编码一个98个氨基酸的蛋白质AbIL8，其氨基酸序列为序列表中序列2，理论蛋白分子量为10.8kDa，等电点为8.85，含有一个信号肽，为序列2中第1到第22位，成熟肽为序列2第23-98位。
实施例2、西伯利亚鲟AbIL8的功能研究
一、西伯利亚鲟AbIL8基因成熟肽核苷酸序列的克隆
以西伯利亚鲟脾脏cDNA为模板，用带有EcoRV和XhoI酶切位点的引物F(F:CCGGATATCATGTCTTTGAAAAGC)和R(R：CCGCTCGAGTCAGGCCTTGGAGCT)进行PCR扩增，得到249bp的PCR扩增产物。
上述PCR扩增的体系为如下25μL反应体系：
25μL反应体系中含2.5μL 10×Ex buffer，2μLdNTP，F和R引物各0.3μmol，1U Extaq酶(Takara)，500ng cDNA模板，其余用水补齐体积；
上述PCR反应程序为：94℃10min；94℃25s，52℃25s，72℃30s(10个循环)；94℃25s，60℃25s，72℃30s(25个循环)；72℃7min。经1％琼脂糖凝胶电泳分析后用DNA凝胶回收试剂盒(Takara)进行回收纯化。
经过测序，PCR扩增产物具有序列表中序列1第117-347位核苷酸序列(即含有终止子的AbIL8基因成熟肽编码序列)。
二、表达载体pET30a(+)-AbIL8的构建
表达载体pET30a(+)-AbIL8为将序列表中序列1第117-347位所示的AbIL8基因成熟肽编码序列替换pET30a(+)载体(Merck millipore公司，69909)的EcoRI和XhoI酶切位点间的DNA分子，得到的载体，序列1第117-347位所示的AbIL8基因成熟肽编码序列与pET30a(+)载体上的His标签融合表达，得到重组蛋白AbIL8(序列3中第47-122位为蛋白AbIL8成熟肽，第2-7位为N端有6个his标签；第8-46位为一段载体的序列)。
构建方法为常规的酶切连接。
二、重组菌的构建
将上述重组载体pET30a(+)-AbIL8转化至大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞(Merck millipore公司，71351)中(该细胞增强了细胞内二硫键的形成和含有在大肠杆菌中稀有密码子的真核细胞蛋白的表达能力)，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃培养18h，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，引物为通用引物T7(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')和T7t(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')，得到546bp为阳性重组菌，将阳性重组菌命名为pET30a(+)-AbIL8-Rosetta-gami2。
采用同样的方法将空载体pET30a(+)转化至大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中，得到对照菌pET30a(+)-Rosetta-gami2。
三、西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白的诱导表达及纯化
1、西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白的诱导表达
将pET30a(+)-AbIL8-Rosetta-gami2接种于含有卡那霉素的LB培养基中，在37℃震荡培养至OD600约为0.6，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续培养5h，离心收集菌体。以培养基1/10体积的PBS悬起菌体，并加入PMSF至终浓度1mM，防止蛋白降解，在冰浴上经100W超声破碎裂解细胞，离心分别收集裂解液上清和沉淀。以pET30a(+)-Rosetta-gami2为对照。
SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，泳道1为沉淀对照，是pET30a(+)-Rosetta-gami2诱导产物裂解液的沉淀样品，泳道2为pET30a(+)-AbIL8-Rosetta-gami2诱导产物裂解液的沉淀样品；泳道3为pET30a(+)-Rosetta-gami2诱导产物裂解液的上清样品，泳道4为pET30a(+)-AbIL8-Rosetta-gami2诱导产物裂解液的上清样品；可以看出，西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白得到表达，且存在于包涵体，大小约为16.4kDa，与预期大小一致。
2、西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白的纯化
将收集的经超声破碎的pET30a(+)-AbIL8-Rosetta-gami2沉淀重悬于Buffer A(6M盐酸胍，137mMNaCl，8mM Na2HP04，2.7mMKCl，1.5mM KH2P04，于800mL双蒸水，充分溶解，定容至1L，调节pH值至7.4)中，用TALON Superflow Resin CO2+亲和层析柱来纯化西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白(带有6×His标签的AbIL8蛋白)。
Co2+亲和层析纯化蛋白的步骤具体如下：
(1)收集超声破碎的菌体沉淀，向沉淀中加入适量的洗涤Buffer(50Mm Tris-HCL,(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0),50mMNaCL,2M尿素，0.5％Triton x-100)重悬沉淀，洗涤包涵体，洗涤完毕后，4℃，12000g离心10min，弃去上清。反复操作3次；
(2)将洗涤后的沉淀重悬于Buffer A中，振荡摇匀使蛋白充分溶解。溶解后，4℃，12000g离心10min收集上清；将收集的上清用0.45μm孔径的滤膜过滤，去除杂质；
(3)将Co2+树脂装入层析柱中，用5倍的柱体积，经0.45μm孔径的滤膜过滤后的清水洗柱；然后加5倍的柱体积A液平衡柱子，至紫外分析仪的数值稳定后调为0.000。
(4)将过滤好的上清加入层析柱中，流速控制在1mL/min；待柱体饱和，停止加上清，改用A液洗柱，至紫外吸收峰接近0.000；
(5)加入含150mM咪唑的洗脱液BufferC(5.4M盐酸胍，150mM咪唑，137mMNaCl，8mMNa2HP04，2.7mMKCl，1.5mM KH2P04，于800mL双蒸水，充分溶解，定容至1L，调节pH值至7.4)洗脱蛋白，收集洗脱组分；
(6)待收集完，依次用10倍柱体积ddH2O、5倍柱体积MES、10倍柱体积ddH2O洗柱，然后用20％酒精保存柱子以备下次使用；
(7)将收集的洗脱组分置于透析袋中，将透析袋的两头用夹子夹好，放于复性缓冲液(50mM Tris-HCL，Ph8.0；6M尿素)中，于4℃透析，每24h更换尿素浓度逐级降低的复性缓冲液，使蛋白复性。将复性后的蛋白用10KD的超滤管(Millipore)超滤浓缩，得到纯化的西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白(浓度为1mg/mL)。
将3μg纯化的西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白上样，并以BSA作对照，进行SDS-PAGE。将电泳结束后凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。PBST漂洗3次，每次10min，在含1％BSA的PBST溶液中，4℃下封闭过夜，PBST漂洗后，加入单抗Anti-His-HRP(1：10000)(Invitrogen，PA1-983B-HRP)在37℃下孵育2h，PBST漂洗3次，每次10min，然后用DAB显色。
结果如图2所示，泳道1为纯化的西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白、泳道2为BSA蛋白；可以看出，泳道1上目的条带发生显色，而泳道2上BSA蛋白对照未显色。表明西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白带有His标签，诱导及纯化成功。
四、西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白功能的研究
A、AbIL8重组蛋白对西伯利亚鲟外周血白细胞和脾脏细胞的趋化活性
1.取样：
(1)外周血白细胞的提取
参考董颖等的方法(董颖,胡红霞,田照辉,等.鲟鱼外周血淋巴细胞的分离及最佳体外增殖性反应条件[J].生物技术通报,2018,34(3):150-155.)，西伯利亚鲟使用MS-222(100mg/L，杭州动物药厂)麻醉后，通过无菌注射器尾静脉取血，取出的血马上转移至含肝素的离心管中，与RPMI1640(无血清，加双抗)1：2混匀，取5m L轻轻加入5m L 65％percoll溶液的15ml离心管中，4℃，840g离心25min，吸取含外周血白细胞的percoll与RPMI1640交界处的细胞层，RPMI1640(无血清，加双抗)清洗一遍，用RPMI1640完全培养基重悬。
(2)脾脏细胞的提取
无菌取出西伯利亚鲟的脾脏，用PBS+1％抗生素洗2遍，放入100目筛网中加RPMI1640(无血清，加双抗)研磨，4℃，840g离心25min，弃培养基，并用RPMI 1640(无血清，加双抗)清洗一遍，用RPMI1640完全培养基重悬。
2.血球计数板计数，将细胞悬液稀释至1×105个/m L.
3.下层小室加样
将24孔Transwell外盖打开，将小室取出小心用枪头每孔加入600μL含梯度稀释浓度(100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml)上述三得到的纯化的西伯利亚鲟AbIL8重组蛋白的1640培养基，同时设置阴性对照(未加AbIL8重组蛋白蛋白的1640培养基)和阳性对照(含10nmol/L fMLP的1640培养基)；
4.加入细胞
将已稀释好的细胞悬液加入上层小室中，每孔100μL，加样时枪头贴壁，垂直快速加样，避免孔底滞留气泡。
5.孵育
将趋化小室放入25℃的细胞培养箱中，孵育45min。
6.取出上层小室，清洗，染色
用镊子夹出上层小室，用PBS小心洗去残留的细胞培养液，注意不要碰到迁移细胞面。甲醇固定3min，再次用PBS清洗，然后用棉签小心擦去内膜上的未迁移细胞，将小室倒置，用DAPI染料染色，避光处理15min，荧光显微镜下随机计数4个高倍视野，累计细胞数，算出平均值，作为该稀释度的迁移细胞数。
结果如图3(纵坐标为迁移细胞数)所示，可以看出，西伯利亚鲟的重组蛋白AbIL8对外周血白细胞和脾脏细胞都有趋化效应，并且活性呈现添加浓度依赖性；西伯利亚鲟的重组蛋白AbIL8对外周血白细胞的趋化活性较脾脏细胞更显著。
B、AbIL8重组蛋白对西伯利亚鲟脾脏细胞增殖活性的影响
向96孔板的每个孔中加入150μL(1×105个/mL)西伯利亚鲟脾脏细胞培养液。将上述三得到的重组蛋白AbIL8加入细胞培养液中，设置终浓度分别为10ng/ml,100ng/ml,500ng/ml,以添加等量体积的PBS作为对照,于刺激三天后,向每个孔中加入20μL5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮哇嗅盐(MTT),22摄氏度孵育4h，小心吸出孔内培养液，然后加入150μLDMSO，震荡10min，时结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值(波长490nm)，记录结果。
结果如图4所示，可以看出，10ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的重组蛋白AbIL8均可显著促进脾脏细胞的增殖活性，无添加剂量依赖性。添加100ng/mLAbIL8对脾脏细胞增殖活性的促进效果较对照组提高了2.3倍，达到最大值。
C、重组蛋白AbIL8对鱼体脾脏抑制病原菌感染的效果
1、分组
将上述三得到的重组蛋白AbIL8用0.9％生理盐水稀释至0.2mg/ml，即为重组蛋白AbIL8稀释液。
将8尾西伯利亚鲟(约85g)随机分为2组，每组4尾鱼：
注射生理盐水(0.9％NaCL)的对照组：每条鱼腹腔注射200μL生理盐水；
注射重组蛋白AbIL8的实验组：每条鱼腹腔注射200μL重组蛋白AbIL8稀释液。
2、攻毒
细菌悬液：LB培养基中培养嗜水气单胞菌NX830(中国农业部水生动物病原库保藏，编号：BYK20130805)至OD600为0.6-0.8，然后离心(8000g，2min)，倾倒上清，将菌体用生理盐水悬浮，调至终浓度为5×107CFU/mL，得到嗜水气单胞菌NX830菌悬液。
攻毒感染：对照组和实验组注射5h后，再向各组鱼体腹腔注射200μL嗜水气单胞菌NX830菌悬液。在注射24h后，麻醉鲟鱼后，解剖，取出脾脏，称重，并根据重量加入不同量的生理盐水(1mg组织/10μL生理盐水)，用无菌研磨棒研磨后，取50μL组织匀浆液均匀得涂在LB平板上，28℃培养16-24h，进行菌落计数，并进行统计。
结果如图5所示，可以看出，生理盐水组的菌落数数(平均值：173个)显著大于注射重组蛋白AbIL8组的菌落数(平均值：45个)。可见，注射重组蛋白AbIL8对鱼体脾脏感染的嗜水气单胞菌有清除和抑制作用。
D、注射重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟免疫相关基因表达的影响
随机选取9尾西伯利亚鲟(体重约为100g)，注射200μL上述三得到的重组蛋白AbIL8(0.2mg/mL)，并于注射后6h和24h，采集免疫组织脾脏和头肾，提取总RNA，反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR方法检测AbIL8mRNA相对表达量，所用引物序列如下：
MHCII-F:5’-CGA TGC CCG AAT CTG AAA G-3’；
MHCII-R:5’-GCA CCA AAA TGC GAC CTG TA-3’；
IgM-F:5’-AGC AAG TTG ACC GTG CCT ACC-3’；
IgM-R：5’-CAG TGG AAT CTG CGT TTC TGG-3’；
IL6-F:5’-TTTAGCCGAGTGGCTGCAC-3’；
IL6-R:5’-GCCCCATAGCGATTGTTCTT-3’。
结果见图6，可以看出，注射重组AbIL8可诱导早期炎症因子IL6和组织相容性抗原MHCII、免疫球蛋白IgM这三种免疫相关基因的上调表达，说明AbIL8可能参与机体的免疫调节。
E、重组蛋白AbIL8对西伯利亚鲟感染嗜水气单胞菌后存活情况的影响
将24尾西伯利亚鲟(体重约100g)随机分为2组，每组2个平行，各12尾。将其命名为PBS对照组和重组蛋白实验组。
对照组(PBS-1组/PBS-2组)：每尾鱼腹腔注射200μLPBS；
实验组(AbIL8-1组/AbIL8-2组)：每尾鱼注射200μL上述三得到的重组蛋白AbIL8(0.2mg/mL)。
在循环水养殖系统中饲养4周，水温24±1℃，每天投喂2次。在第29d，每尾鱼腹腔注射嗜水气单胞菌NX830(1×109CFU/mL)200μL，攻毒后连续观察96h，记录死亡情况。
西伯利亚鲟的存活情况见表1，可以看出，注射重组AbIL8蛋白的西伯利亚鲟存活率为37.5％(平均值)，对照组西伯利亚鲟存活率为12.5％(平均值)，显著高于对照组。说明重组AbIL8蛋白可以提高西伯利亚鲟对嗜水气单胞菌的抵抗能力。
表1西伯利亚鲟感染嗜水气单胞菌后的存活情况
Figure BDA0001858318270000091
序列表
<110> 北京市水产科学研究所（国家淡水渔业工程技术研究中心）
<120> 西伯利亚鲟白细胞介素8及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgaaaagct tcagcttcat tttccagaaa cgaacaagct cacgaaaatc atggactcca 60
aaactacagt gaccgtggtc attttctgcc tggccgttgt tgcactatct gaagggatgt 120
ctttgaaaag cattggactg gagctccgtt gtcagtgcat taaaaaagaa tccagattca 180
tccatcccag gcagatccag aatgtagagc tcttccccag tggaccgcac tgcaaggatg 240
ctgaagtcat tgccactttg aaatctggtg atcagatttg cttggaacca actgcccgct 300
gggtcaagat agttataaag aaaatattgg aaagctccaa ggcctgaatc ctgccatgga 360
aatttagagg aacaaaccta aagagaaact gaagttaatc aagggttgat ctttttaacc 420
acttgtttat ttattagtgt gtttatttat ttgccaattt agttaacaaa ttgtatttaa 480
tatgttatta gactgaacag ttgtcattcg acatataggg tatggaagga ttgtatcaga 540
ccactcagga aaggatttaa actacaaact ctgtttgctt aatacagtgt ttttcaagtt 600
tttgttaaat tctgttaatt gtcttgcagt atcactcagt gggtttttaa ttttttttat 660
aaaaaattga aaacgtgaac atgatatgta aattgtacct ttttttaaaa aaaaactgga 720
aattggtcaa aaacagatga aggaagggtt tttaaaccct tattttatat tgtgcattcc 780
ttaaaccaat ggccggggat ggcaaactgg cctatttctt ttggttggtt ggccaacttg 840
attatttttg aaactataca tataatggat taattcattg aatttaatct ggatattttt 900
gaaaccaatt ggaataatta aactggtaaa gttattggtt aagtgtggca gtatgaatgg 960
ggttagtttt gccatgtttt tttttaataa tttttttttt tttacaaagg ggggaaaccc 1020
aatttttaaa aattcggggg ccccccctct tttttagggc cccaaaacaa attgttaaaa 1080
aaaaaaattt tattttttga ttatcaaaaa aaacaaataa aaaaaaaaaa 1130
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 2
Met Asp Ser Lys Thr Thr Val Thr Val Val Ile Phe Cys Leu Ala Val
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Glu Gly Met Ser Leu Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Lys Glu Ser Arg Phe Ile His Pro Arg Gln
35 40 45
Ile Gln Asn Val Glu Leu Phe Pro Ser Gly Pro His Cys Lys Asp Ala
50 55 60
Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Ser Gly Asp Gln Ile Cys Leu Glu Pro
65 70 75 80
Thr Ala Arg Trp Val Lys Ile Val Ile Lys Lys Ile Leu Glu Ser Ser
85 90 95
Lys Ala
<210>3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Met Ser
35 40 45
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Lys Glu
50 55 60
Ser Arg Phe Ile His Pro Arg Gln Ile Gln Asn Val Glu Leu Phe Pro
65 70 75 80
Ser Gly Pro His Cys Lys Asp Ala Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Ser
85 90 95
Gly Asp Gln Ile Cys Leu Glu Pro Thr Ala Arg Trp Val Lys Ile Val
100 105 110
Ile Lys Lys Ile Leu Glu Ser Ser Lys Ala
115 120

Claims (9)

1.蛋白质，为如下1）-3）中任一种：
1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
2）氨基酸序列是序列表中序列2第23 -98位所示的氨基酸残基；
3）氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下（a1）-（a3）任一所示的DNA分子：
（a1）核苷酸序列是序列表中序列1的 DNA分子；
（a2）核苷酸序列是序列表中序列1第51-347位所示的 DNA分子；
（a3）核苷酸序列是序列表中序列1第117-347位所示的 DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备趋化细胞迁移产品中的应用；
所述细胞为西伯利亚鲟脾脏细胞或西伯利亚鲟外周血白细胞。
6.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备促进西伯利亚鲟脾脏细胞的增殖活性产品中的应用。
7.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在如下1）或2）中的应用：
1）制备清除和/或抑制嗜水气单胞菌产品；
2）制备提高西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌或清除嗜水气单胞菌的能力产品。
8.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在如下1）或2）中的应用：
1）制备调节西伯利亚鲟机体免疫产品；
2）制备西伯利亚鲟鱼类免疫增强剂；
3）制备提高西伯利亚鲟免疫相关基因的表达产品；
所述西伯利亚鲟免疫相关基因为早期炎症因子IL6、组织相容性抗原MHCII和/或免疫球蛋白IgM。
9.根据权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
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