CN109627316A

CN109627316A - 草鱼IFN-γ2基因及其编码的重组蛋白和应用

Info

Publication number: CN109627316A
Application number: CN201811615473.7A
Authority: CN
Inventors: 袁改玲; 周建成; 陈桐; 胡亚珍; 刘小玲; 苏建国
Original assignee: Wuhan Dabei Agricultural And Fisheries Technology Co Ltd; Huazhong Agricultural University
Current assignee: Wuhan Dabei Agricultural And Fisheries Technology Co Ltd; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109627316B

Abstract

本发明公开了一种草鱼IFN‑γ2基因，具有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还公开了表达草鱼IFN‑γ2基因的重组蛋白，具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该重组蛋白在体外可以促进草鱼头肾巨噬细胞的活化，上调免疫相关基因的表达。将该重组蛋白注射草鱼，可显著降低草鱼感染柱状黄杆菌的死亡率，提高草鱼的免疫保护率，并且可以调节草鱼免疫指标，增强草鱼抵抗细菌感染的能力。

Description

草鱼IFN-γ2基因及其编码的重组蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种草鱼IFN-γ2基因，其编码的蛋白及应用。

背景技术

草鱼是我国重要的淡水经济鱼类，主要以混养为主，但养殖过程中出现的“四病”及病原微生物对草鱼产量及质量造成一定的损失。干扰素(Interferon，IFN)是机体最重要的细胞因子之一，主要生物学功能体现为广谱的抗病毒活性，抗细胞增殖和免疫调节功能，能够诱导细胞产生抗病毒状态的细胞因子，它不直接参与抗病毒的生物学过程，而是通过产生靶基因下游的效应基因来调控病毒的感染，具有多效能、低分子量、分泌型等特点。

干扰素最初是由Issac等人在鸡胚绒毛尿囊膜细胞的病毒干扰实验中被发现，也是人类发现的第一种细胞因子，被认为是脊椎动物抵抗病毒入侵的第一道防线。不同物种间干扰素的基因结构和亚基组成具有较大的差异，根据干扰素与受体结合的方式和其与抗体结合的抗原性不同可分为三类：Ⅰ型干扰素主要包括α和β，Ⅱ型干扰素只有一个成员为γ型干扰素和Ⅲ型干扰素λ。

1965年，在发现哺乳类IFN 8年后，Gravell和Malsberger首次在传染性胰腺坏死病毒(IPNV)诱导的鱼类培养细胞FHM中检测到鱼类干扰素活性。此后从人工病毒感染如polyI:C等诱导剂诱导的多种鱼类培养细胞和鱼体血清中检测到IFN活性。我国学者在研究草鱼出血病病毒GCRV感染草鱼培养细胞时，也从培养上清中发现有抗病毒活性物质产生。这些研究虽然都未能成功分离纯化鱼类IFN蛋白，但是都表明鱼类具有类似于哺乳类IFN的抗病毒反应。

随着分子生物学研究的深入，鱼类IFN基因以及与IFN反应相关的一些重要基因如Stat家族成员、IRF家族成员、包括Mx等在内的抗病毒效应基因相继被鉴定，从分子水平证明鱼类存在IFN系统。目前已鉴定出两类鱼类IFN基因：一类与哺乳类II型IFN同源，与哺乳类只具有一个IFN-γ拷贝不同的是，很多种鱼的基因组中至少有2个以上拷贝，另外一类与哺乳类病毒诱导的IFN基因同源。

IFN-γ是一种典型的Th1细胞因子，主要由CD4⁺Th1细胞和NK细胞产生，能够激活Th1的反应和活化巨噬细胞。IFN-γ与机体内细胞因子网络相互作用显著，可诱导细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1等细胞因子，并可上调TNF、淋巴毒素和IL-1等细胞因子的受体，从而增强了其促炎作用；IFN-γ可使巨噬细胞和中性粒细胞上Fc受体表达增加，使多种组织细胞II类MHC表达增加，从而增强这些细胞的吞噬活性和抗原递呈能力；IFN-γ可刺激巨噬细胞内活性氧和活性氮的产生，增强细胞内杀菌和杀寄生虫活性；IFN-γ能抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞株的分化，同时能直接抑制病毒的复制，调节细胞免疫和抗细胞增殖的功能，所以又称免疫干扰素。

发明内容

本发明目的之一是提供一种克隆草鱼IFN-γ2基因，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明目的之二是提供表达草鱼IFN-γ2基因的重组蛋白。将草鱼IFN-γ2基因与载体pGEX-4T1双酶切后连接，构建重组质粒pGEX-4T1-IFN-γ2，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，将重组菌株经诱导、纯化后得到重组蛋白，该重组蛋白具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明目的之三是提供所述重组蛋白的用途。分离草鱼头肾巨噬细胞，用草鱼IFN-γ2重组蛋白刺激头肾巨噬细胞，提取RNA并反转录为cDNA，检测免疫基因IL-1β、IL-6、iNOS、MHCⅡ、TNF-α的表达水平，结果发现草鱼IFN-γ2重组蛋白可以促进草鱼巨噬细胞的活化及上调免疫相关基因的表达，因此可用于制备草鱼免疫增强剂，具有非常好的生物学活性。

另向草鱼腹腔注射IFN-γ2重组蛋白，再注射感染柱状黄杆菌，结果发现草鱼IFN-γ2重组蛋白可以明显降低草鱼的死亡率，从而能提高草鱼对柱状黄杆菌的抗病能力。

附图说明

图1为草鱼IFN-γ2基因的扩增电泳图，1：克隆引物从草鱼cDNA中扩增的目的基因；M：DNA分子量标准。

图2为草鱼IFN-γ2重组蛋白定性分析的SDS-PAGE电泳结果，1：IPTG未诱导的pGEX-4T1-IFN-γ2；2：IPTG诱导的pGEX-4T1-IFN-γ2表达产物；M：蛋白质分子质量标准。

图3为草鱼IFN-γ2重组蛋白酶切及纯化后的SDS-PAGE电泳结果。1：纯化的草鱼IFN-γ2融合蛋白；2：酶切后的草鱼IFN-γ2重组蛋白；3：经过阳离子交换柱纯化后的草鱼IFN-γ2重组蛋白；M：蛋白质分子质量标准。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：草鱼头肾巨噬细胞的分离

实验鱼获取：从水产实验基地捞六尾150g草鱼，用MS-222溶液进行深度麻醉。

1.头肾样品的采集

尾静脉取血，抽取干净；剪掉头部后直接挑取头肾组织，置于灭菌过的一次性培养皿，于超净台上用AIM液清洗2-3次，直至AIM血色变淡，低温离心，降温至4℃。

2.单细胞悬液制备

用AIM液浸泡上步骤所得组织30min，研磨后得到细胞悬液。

3.将细胞悬液3ml缓慢加入至Percoll连续密度梯度液上层，使其分层，400g低温离心30min。

4.吸取所得中间层的白细胞悬液约3-4mL，并用L-15配平至25mL，400g低温离心15min。

5.弃步骤4所得上清，用L-15重悬细胞后，400g低温离心15min。

6.将样品分别用2％FCS—L15培养基重悬，于6孔板中，分别贴壁培养3h。

7.3h后对3个6孔板进行换液，换液时先摇晃倒去原液，再用L-15清洗两次，再加10％FCS—L15培养基，再轻晃动平板使其混匀。

显微镜下观察贴壁细胞情况，所得贴壁细胞绝大多数为巨噬细胞。

实施例2：提取巨噬细胞RNA并获得cDNA

1.总RNA的提取

①吸去上述贴壁细胞培养液，再用1mL TRIzol裂解，之后将2孔板中混匀，加到1.5ml EP管中。

②向上述步骤的匀浆裂解液中加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，震荡，待充分乳化溶液呈乳白状后，再冰上静置5min。

③12,000g，4℃离心15min。

④取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中。

⑤向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在冰上放置5min。

⑥12,000g 4℃离心10min。

2.RNA沉淀的清洗

小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g，4℃离心5min后弃去乙醇。

3.RNA的溶解

室温干燥沉淀2～5min，加入适量的无RNase酶DEPC处理水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

4.反转录

按照说明书使用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)反转上述RNA得到草鱼头肾巨噬细胞cDNA。

实施例3：草鱼IFN-γ2的克隆及序列分析

1.引物设计

利用clone manager软件设计上下游引物，引物序列如下：

上游引物F1：5'-ATGATTGCACAACACATG-3'

下游引物R1：5'-CTAAGACTCCTGCCTCTT-3'

2.PCR扩增：以草鱼头肾巨噬细胞cDNA为模板，以F1、R1引物进行PCR扩增，反应体系为20μL，PCR反应体系如下：

PCR反应条件：反应条件为94℃，5min；72℃，30sec，57℃，45sec，72℃，10min；35个循环周期。

3.PCR产物鉴定：扩增完成后，取PCR产物10μL用10×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V，电泳30分钟观察结果，得到目的片段。

取PMD-18T载体(宝生物工程(大连)有限公司)1μL与胶回收的目的片段4μL混合后，加入5μL solution，混匀后置16℃连接过夜，连接产物为PMD-18T-IFN-γ2，将其命名为IFN-γ2。取10μL连接产物，无菌条件下加入大肠杆菌Trans-5α感受态细胞中，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min，42℃水浴，热激90sec，之后立即冰浴3min使之冷却。转移菌液至装有500μL预热至37℃的LB培养液中，150rpm 37℃温和振荡45min，吸取80μL菌液涂布于平板上，倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h。

挑取单克隆菌落，接种至1mL的LB培养基中，PCR检测阳性克隆，结果如图1所示，在500bp左右扩增出一条明亮的条带，大小符合预期。取菌液送上海擎科生物科技有限公司进行测序分析，得到546bp的cDNA序列。

序列号：SEQ ID NO：1

序列长度：546bp

序列类型：cDNA

来源：草鱼

序列特征：有正确的开放阅读框(ORF)：546bp；决定位置：起止密码子存在位置：ATG，1位。

实施例4：草鱼IFN-γ2原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的诱导表达

1.设计草鱼IFN-γ2的表达引物：

设计表达的同源引物，利用clone manager软件设计上下游引物，并在上游引物F2中引入EcoRI限制性酶酶切位点和TVE蛋白酶酶切位点，下游引物R2中引入XhoI限制性内切酶酶切位点，引物序列如下：

上游引物F2：5'-ATCGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCAGCGTCCCTGAGAACCTG-3'

下游引物R2：5'-ATCGCTCGAGCTAAGACTCCTGCCTCTT-3'

2.重组表达质粒的构建

利用同源重组的方法将IFN-γ2加酶切位点片段与GST标签载体pGEX-4T1连接。

3.PCR扩增：以IFN-γ2为模板，以F2、R2引物进行PCR扩增，反应体系为20μL，PCR反应体系如下：

4.PCR产物鉴定：扩增完成后，取PCR产物10μL用10×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V，电泳30分钟观察结果，得到目的片段。

5.pGEX-4T1-IFN-γ2阳性克隆子鉴定

取pGEX-4T1-IFN-γ2质粒(1μL)无菌条件下加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(100μL)，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42℃水浴，热激90sec，之后立即冰浴2min使之冷却。转移菌液至装有500μL预热至37℃的LB培养液中，150rpm，37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性，取150μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(AMP)(100μg/mL)的LB琼脂平板上，倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h，挑单个菌落接种于含150μg/mL AMP的LB培养液中，剧烈振摇(230rpm)12～16h后鉴定。同时转化未加入任何外源基因的pGEX-4T1空载体作为阴性对照。

取1μL菌液做PCR，反应体系为25μL，如下：

PCR反应条件：反应条件为94℃5min；72℃30sec，57℃45sec，72℃10min；35个循环周期。

扩增为阳性的克隆子，取菌液送上海擎科生物科技有限公司，进行测序分析。

6.pGEX-4T1-IFN-γ2重组蛋白的原核表达

按1：100将上述阳性pGEX-4T1-IFN-γ2/BL21(DE3)菌液加入含有AMP的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入1mmol/LIPTG于25℃诱导3h。收集大量诱导表达的菌液，在4℃以5000rpm离心15min，弃上清，加入PBS重悬菌体沉淀后，压力破碎3次；然后4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清，微滤后即为重组表达的粗蛋白，结果如图2所示，与未诱导相比，在25℃诱导5h后在40KD处，有一条明显的条带，说明草鱼IFN-γ2得到重组表达。

实施例5：草鱼IFN-γ2重组蛋白的纯化

1.重组蛋白的纯化

用BufferA(50mM磷酸缓冲液，PH:7.5)重悬菌体，进行高压破碎3min，将破碎菌液在4℃，12000r/min离心40min，收集上清。使用100mL BufferA缓冲液清洗GST填料，将上清液过柱2次后，将上清与GST填料冰上震荡孵育2小时，用100mL Buffer A将杂蛋白冲洗去除，再用Buffer B(50mM磷酸缓冲液，10mM谷胱甘肽PH:7.5)将目的蛋白洗脱出来，并进行收集，用15％SDS-PAGE胶跑胶检测。

2.TEV蛋白酶酶切重组蛋白：将重组蛋白用50mM PH6.5磷酸缓冲液(PB)过夜透析后，将重组蛋白业稀释至3mg/ml，按照1:100比例加入TEV蛋白酶，16℃酶切9小时后，带样品上样至GEAKTAPure蛋白质层析纯化系统仪，调制标准程序，以阳离子交换柱层析法梯度洗脱纯品草鱼IFN-γ2蛋白。

阳离子柱A液：50mM磷酸缓冲液，PH:6.5

阳离子柱B液：50mM磷酸缓冲液，1M氯化钠，PH：6.5

SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图3所示，与酶切前(1号条带)草鱼IFN-γ2重组融合蛋白相比，3号条带在17KD左右有一条明显的条带，说明得到草鱼IFN-γ2重组蛋白。

紫外分光光度计检测蛋白浓度；将蛋白分装置于-80℃保存。

实施例6：草鱼IFN-γ2重组蛋白刺激巨噬细胞分泌免疫基因的水平

1.按实施例1的方法分离草鱼头肾巨噬细胞。

2.草鱼IFN-γ蛋白刺激头肾巨噬细胞

将分离所得草鱼头肾巨噬细胞贴壁培养9h，中间每隔3～4小时用PBS清洗细胞并更换新培养基，观察巨噬细胞纯度高时进行下一步实验。

将250ng/ml IFN-γ2加入贴壁后9h草鱼巨噬细胞的培养基中，并分别在3h、6h、12h用800μl Trizol收样。

3.按实施例2的方法提取巨噬细胞RNA并获得cDNA。

4.荧光定量PCR检测免疫基因的变化

采用荧光定量RT-PCR技术检测免疫基因IL-1β、IL-6、iNOS、MHCⅡ、TNF-α的变化。将上述cDNA按照荧光定量PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司)的要求用ddH₂O稀释至50ng/μl，以此为模板，采用20μl体系，具体如下：

RealTime PCR反应条件设置：95℃，1min；95℃，15sec；60℃，15sec；72℃，30sec；35个循环周期；荧光信号采集设在72℃。

检测结果如表1、2、3所示，与对照组相比，免疫基因IL-1β、IL-6、iNOS、MHCⅡ、TNF-α在3h、6h、9h的mRNA平均表达水平均显著高于对照组，说明草鱼IFN-γ2重组蛋白可以刺激巨噬细胞分泌免疫基因，促进巨噬细胞的活化。

表1 qRT-PCR检测IFN-γ2刺激3小时后免疫基因上调水平

基因	对照	IFN-γ2
			IL-1β	1.05±0.36	65.31±17.59
IL-6	1±0.02	2.66±0.72
			iNOS	1±0.10	15.41±1.02
MHCⅡ	1±0.02	22.62±1.69
			TNF-α	1.01±0.15	37.69±2.82

表2 qRT-PCR检测IFN-γ2刺激6小时后免疫基因上调水平

基因	对照	IFN-γ2
			IL-1β	1.00±0.24	5.52±2.33
IL-6	1±0.05	1.03±0.03
			iNOS	1±0.04	1.57±0.33
MHCⅡ	1±0.04	5.44±0.28
			TNF-α	1.01±0.14	5.86±0.68

表3 qRT-PCR检测IFN-γ2刺激9小时后免疫基因上调水平

基因	对照	IFN-γ2
			IL-1β	1.00±0.15	11.16±3.96
IL-6	1±0.01	0.96±0.12
			iNOS	1±0.04	1.74±0.38
MHCⅡ	1±0.02	10.08±0.9
			TNF-α	1.01±0.09	10.37±1.56

实施例7：草鱼注射IFN-γ2重组蛋白后攻毒检测保护率

实验鱼来自浠水水产养殖基地，每尾鱼30g，分两组(对照组和实验组)，每组30尾。

华中农业大学水产学院养殖基地保持水温27℃暂养两周后，开始正式实验。

将上述蛋白用PBS(PH6.5)稀释至30μg/mL，按0.1μg/g鱼体重腹腔注射鱼体后6小时，再腹腔注射1×10⁸柱状黄杆菌150μL感染，观察七日内死亡率，结果如表4所示，与没有注射蛋白的对照组相比，草鱼注射IFN-γ2重组蛋白可以明显降低草鱼感染柱状黄杆菌的死亡率，表明草鱼IFN-γ2重组蛋白具有良好的免疫保护效果。

表4不同处理组对草鱼感染柱状黄杆菌的死亡率

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 草鱼IFN-γ2基因及其编码的重组蛋白和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 546

<212> DNA

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)

<400> 1

atgattgcac aacacatgat ggccttattc tggggagtat gtttgatgac tttgggatgg 60

atgacatatg ccgaggccag cgtccctgag aacctggaca agagcattga tgagctgaaa 120

gcatactata taaaagatga ccttgagcta cacaacgcac atcctgtctt cctgcgggtc 180

ctgaaagact taaaggtgaa tcttgaggaa agtgaacaga atctattgat gagcatcata 240

atggacacat acagtaggat attcactcgc atgcagaacg agagcctgga cacagctaca 300

aaagaaagat tggcacatgt tcaacagcat ttgaaaaaac tgcaagaaaa ctacttccca 360

ggcaagagtg cagagctcaa gacatatgca gaaaccctat gggcgattaa ggaaaatgac 420

ccaatcgtcc agcgcaaagc actgttcgag ttcaagcgcg tctacagaga agcaacacag 480

ctgaaaaacc tgaagaataa agaccgccgg aggcgacagg ccaaaagcat caagaggcag 540

gagtct 546

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)

<400> 2

Met Ile Ala Gln His Met Met Ala Leu Phe Trp Gly Val Cys Leu Met

1 5 10 15

Thr Leu Gly Trp Met Thr Tyr Ala Glu Ala Ser Val Pro Glu Asn Leu

20 25 30

Asp Lys Ser Ile Asp Glu Leu Lys Ala Tyr Tyr Ile Lys Asp Asp Leu

35 40 45

Glu Leu His Asn Ala His Pro Val Phe Leu Arg Val Leu Lys Asp Leu

50 55 60

Lys Val Asn Leu Glu Glu Ser Glu Gln Asn Leu Leu Met Ser Ile Ile

65 70 75 80

Met Asp Thr Tyr Ser Arg Ile Phe Thr Arg Met Gln Asn Glu Ser Leu

85 90 95

Asp Thr Ala Thr Lys Glu Arg Leu Ala His Val Gln Gln His Leu Lys

100 105 110

Lys Leu Gln Glu Asn Tyr Phe Pro Gly Lys Ser Ala Glu Leu Lys Thr

115 120 125

Tyr Ala Glu Thr Leu Trp Ala Ile Lys Glu Asn Asp Pro Ile Val Gln

130 135 140

Arg Lys Ala Leu Phe Glu Phe Lys Arg Val Tyr Arg Glu Ala Thr Gln

145 150 155 160

Leu Lys Asn Leu Lys Asn Lys Asp Arg Arg Arg Arg Gln Ala Lys Ser

165 170 175

Ile Lys Arg Gln Glu Ser

180

Claims

1.草鱼IFN-γ2基因，具有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.表达权利要求1所述草鱼IFN-γ2基因的重组蛋白，具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的重组蛋白在制备草鱼免疫增强剂的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：所述重组蛋白通过刺激草鱼头肾巨噬细胞的活化，上调免疫相关基因的表达，从而提高对柱状黄杆菌的抗病能力。