CN108752457A - 一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽及其应用，所述的衍生多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，本干扰素衍生多肽具有高效的抗菌效果，对于耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌和嗜水气单胞菌均可发挥功能。本干扰素衍生多肽对真核细胞毒性小，针对致病性细菌引起的小鼠疾病模型中，可有效降低小鼠死亡率。本干扰素衍生多肽分子量小，合成简单，具有很好的应用价值。

Description

一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽及其应用。

背景技术

传统抗生素在过去数十年对治疗细菌性感染疾病方面取得了一定的成果，但是近年来尤其在养殖业中抗生素的滥用，越来越多的病原微生物对传统抗生素产生了耐药性，“超级细菌”的出现更是为人类健康和养殖业发展产生了巨大威胁。所以，研发出一种新型的药物具有重要意义和价值。

干扰素是一类分泌型细胞因子，在机体中主要发挥抗病毒和免疫调节的功能。草鱼IF N1属于干扰素家族蛋白，该家族蛋白还包括：IFN2，IFN3，IFN4，IFNγ等。本课题组在最新的研究中发现，IFN1除了上述功能外，还具有类似抗菌肽的直接杀菌功能。

草鱼IFN1蛋白三级结构主要由六个α螺旋的短肽构成。申请人通过人工合成不同螺旋段的多肽，发现草鱼IFN1的第107-127位氨基酸具有直接的杀菌功能。同时通过体外细胞毒性检测该段多肽毒性显著低于人类抗菌肽LL37。相较于草鱼IFN1蛋白而言，草鱼IFN1衍生多肽分子量更小，直接注射哺乳动物机体不会产生抗体反应，具备一定的跨界研究价值。研究表明，多种抗菌蛋白的衍生多肽具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽，所述的衍生多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽的应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽，来源于草鱼IFN1蛋白序列，所述的衍生多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。

一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽的应用，包括利用本发明提供的衍生多肽制备成细菌抑制剂，或是制备成治疗或预防细菌感染引起的疾病的药物。

以上所述的应用中，所述细菌包括但不限于：耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌或嗜水气单胞菌。

一种治疗或预防细菌感染引起的疾病的方法，其步骤包括：将以SEQ ID NO.1所示序列为主效成分或主效成分之一的药物注射进动物体内；

以上所述的方法中，所述的细菌包括但不限于：耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌和嗜水气单胞菌。

一种抑制细菌的方法，其步骤包括：将以SEQ ID NO.1所示序列为主效成分或主效成分之一的药物直接作用于细菌；

以上所述的方法中，所述的细菌包括但不限于：耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌和嗜水气单胞菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的干扰素衍生多肽是一种来源于草鱼IFN1蛋白序列的干扰素衍生多肽。本干扰素衍生多肽具有高效的抗菌效果，且可以针对猪源多耐药细菌发挥功能。本干扰素衍生多肽对真核细胞毒性小，针对致病性细菌引起的小鼠疾病模型中，可有效降低小鼠死亡率。本干扰素衍生多肽分子量小，合成简单，具有很好的应用价值，例如可以作为治疗细菌病的药物。

附图说明

图1是干扰素衍生多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)的体内杀菌实验结果。

图2为衍生多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)在小鼠体内不同器官载菌量实验结果示意图。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明所述干扰素衍生多肽的应用。这些实施例仅对本发明进行说明，而不是对本发明进行限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，可参考《微生物学实验》(第四版)，本发明实施例所用的衍生多肽(SYEKKINRH FKILKKNLKKK，SEQ ID NO.1所示)为人工合成，利用本领域的常规方式进行真核表达获得的衍生多肽也实现本发明。

实施例1：

一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽的合成：

本发明所用的衍生多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK，SEQ ID NO.1所示)由南京金斯瑞公司合成提供，纯度大于95％。人类抗菌肽LL37购于南京金斯瑞公司。

实施例2：

抗菌活性检测

测试细菌：河流弧菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、致病性多耐药大肠杆菌PCN033(Genome analysis and in vivo virulence of porcineextraintestinal pathogeni c Escherichia coli strain PCN033)。

具体步骤如下：

(1)先把-80℃条件下保存的五种细菌：河流弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌置于4℃熔解后，取出平衡至室温，然后分别进行小量肉汤液体培养基接菌种活化，于30℃条件下恒温摇床培养18小时至对数生长期。

(2)将活化好的菌液接种到肉汤琼脂固体斜面培养基上，30℃恒温摇床培养18小时，用无菌水洗下菌苔，稀释至5×10⁶CFU/ml。

(3)取稀释后的菌液10μl与不同浓度的多肽溶液10μl混合均匀，放在30℃恒温水浴锅内孵育2小时，取出10μl混合液涂平板，每组做3个平行，30℃倒置培养12小时后计数菌落并拍照，阴性对照为菌液+无菌水。

(4)根据以下公式计算抑菌率：

抑菌率(100％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100％

(5)结果分析：

表1多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)对五种细菌抑制率

由表1可以得到，多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)对大肠杆菌，河流弧菌，嗜水气单胞菌3种细菌在低浓度就有很高的抑制率，说明多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK) 对这三种菌有明显的抑制作用。由上表的抑制率可知，多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKK K)对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用。

实施例3：

衍生多肽对小鼠和草鱼红细胞溶血毒性检测：

(1)采集新鲜的草鱼和BALB/c小鼠的血液1ml，使用肝素钠抗凝保存。

(2)将上述得到的新鲜的血浆溶液在1000g条件下离心5分钟，弃除上清，收集红细胞。

(3)将收集的红细胞用PBS缓冲液洗涤3次，每次都在1000g条件下离心5min，最后使用5m l PBS缓冲液重悬。

(4)不同浓度的多肽配制：吸取100μl 256μM/L的干扰素衍生多肽(SYEKKINRHFKILKK NLKKK)与256μM/L的人类抗菌肽LL37分别加入96孔板中，按照2倍倍比稀释方式，每次设置3组平行。

(5)取50μl上述准备好的红细胞悬液与50μl溶解于PBS中的不同浓度的干扰素衍生多肽或人类抗菌肽LL37溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h，50μl PBS+50μl红细胞悬浮液作为阴性对照；50μl红细胞悬浮液+50μl 0.2％TritonX-100作为阳性对照。

(6)1h后取出96孔板，4℃、1000g离心5分钟。

(7)吸取上述离心溶液的上清，再次放到一个洁净的96孔板上，用酶标仪在570nm处测吸光值。

(8)每组取平均数，并比较分析。试验重复操作三次。

(9)计算公式：溶血率＝(实验组吸光度-阴性组吸光度)/(阳性组吸光度-阴性组吸光度)×100％。

(10)由溶血毒性分析显示：干扰素衍生多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)在128μM以下对鼠红细胞和草鱼红细胞溶血毒性均低于15％，而人类LL37在64μM及以上抗菌肽溶血毒性很明显，在128μM高剂量浓度下，对草鱼和小鼠红细胞溶血毒性都达到50％以上，说明本干扰素衍生多肽相比人LL37而言毒性很弱，实验结果见表2。

表2多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)与LL37的溶血率

实施例4

干扰素衍生多肽对人HEK293T细胞和草鱼CIK细胞细胞毒性检测：

MTT法又称MTT比色法，是用于细胞增殖及细胞生存率测定的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥拍酸脱氧酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formaza n)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 492nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。—定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

(1)细胞准备：将液氮中保存的人HEK293T细胞系和草鱼CIK细胞系复苏后，分别培养于含有10％胎牛血清的DMEM中，培养条件为37℃/28℃、5％CO₂、饱和湿度。每隔1天换1次培养液，细胞传代采用胰蛋白酶消化法。当细胞长满培养瓶底80％-90％后，用PBS液洗涤细胞2次，加入0.25％的胰酶消化液2ml，于倒置显微镜下观察消化程度，当大部分细胞变圆，细胞间连接疏松，表明消化适度，此过程约3分钟；加入含胎牛血清的DMEM或MEM培养液终止消化，将消化液倒掉，加入3ml左右的细胞培养液充分吹打细胞使其形成单细胞悬液。最终将稀释后的细胞悬液加入到96孔板中，每孔加入50μl，浓度大约为1×10⁴cells/孔；

(2)药物处理：待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度干扰素衍生多肽的培养液或人LL37抗菌肽。以不加干扰素衍生多肽的细胞孔为阳性对照，加干扰素衍生多肽而不加细胞的孔为阴性对照，继续培养24h。

(3)读数：待培养到一定时间后，每孔中直接加入MTT 50μl(5mg/ml)，培养4小时后加入 150μl DMSO震荡10分钟以溶解晶体，用酶联免疫检测仪在492nm测定吸光度。试验重复操作三次。

(4)由表3结果分析显示：人HEK293T细胞系和草鱼CIK细胞系在8-128μM的浓度多肽(S YEKKINRHFKILKKNLKKK)存在范围内，细胞存活率随抗菌肽浓度增加微弱降低，在12 8μM高浓度下细胞存活率大于80％，而对照组LL37处理后的细胞，存活率随LL37浓度增大而降低且变化明显，在128μM的高浓度下，存活率在仅为15％。

(5)存活率＝(实验组吸光度-阴性组吸光度)/(阳性组吸光度-阴性组吸光度)×100％

表3多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)与LL37处理后细胞存活率

实施例5：

干扰素衍生多肽在小鼠体内的抑菌效果

(1)试验动物

SPF级BALB/c小鼠，体重20±2g，雌性，购于华中农业大学实验动物中心。BALB/c小鼠饲养在华中农业大学实验动物研究中心。饲养于代谢笼内，给予自由饮水、饲养以普通的颗粒饲料。饲养环境：湿度(50％±10％)，光照(12h照明和12h黑暗交替)，温度(23±2)℃。适应饲养7天后，随机分给药组和对照组。

(2)腹膜炎模型的建立

以pH7.2的PBS作为溶剂配制工作液，用0.22μm孔径的水系微孔滤器过滤除菌备用；将新鲜培养的致病性大肠杆菌用PBS倍比稀释成3个浓度，每一浓度腹腔注射感染10只小鼠，注射完毕后小鼠自由进食饮水，在48内每6h观察和记录一次死亡情况。选取小鼠100％死亡率组对应剂量建立腹膜炎模型。通过预试验确认细菌在48h导致小鼠100％死亡的最小菌液量，最终实验的100％致死最小剂量是2×10⁷CFU/只。

(3)腹膜炎生存率考察

菌液的制备：将细菌接种于LB培养基中，37℃过夜培养；然后取一定量的菌液培养，至最小致死剂量所需的菌体浓度。

先通过预试验选择合适的药物治疗剂量，通过3-5个不同的药物剂量浓度组，找到合适的药物剂量浓度。另外，还要通过药物对小鼠进行毒性试验初步评价药物的安全性，即在没有细菌感染的情况下，只是通过对小鼠腹腔注射干扰素衍生多肽药物，安全剂量范围是≤2 00μg/只。

实验分组及处理：实验分成6组，每组10只。每只小鼠均腹腔注射细菌悬液(1×10⁸C FU/ml,0.2ml),分组情况如下：

小鼠自由进食和饮水，连续观察7天，记录死亡情况。

由图1衍生多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)对小鼠保护率实验结果分析显示：

1.注射干扰素衍生多肽25-200μg的小鼠，死亡率在20％-40％。对照组死亡率100％。

2.连续注射干扰素衍生多肽25μg的小鼠，死亡率为0。

3.对照组小鼠死亡时间在0-48h内全部死亡，注射干扰素衍生多肽的小鼠死亡时间在48h之后或不死亡。

(4)腹膜炎小鼠腹腔中细菌数量的检测

急性腹膜炎小鼠模型建立方法和给药情况同前。在小鼠感染病菌24h后，腹腔注射2ml 生理盐水；然后采用颈椎脱臼处死小鼠，将腹腔打开，取肝脏、脾脏、肾脏、脑脏、肺脏、血液，经研磨稀释后将菌液均匀涂布于LB琼脂培养基表面，37℃恒温孵育过夜，并进行菌落计数。每组动物取6只，取平均值作为试验结果。

由图2衍生多肽(SYEKKINRHFKILKKNLKKK)对小鼠体内不同器官载菌量实验结果分析显示：

通过比较发现，注射多肽后实验组小鼠的组织载菌量数量均明显下降。其中：血液，脾脏，肝脏下降1000倍左右，肾脏，脑脏，肺脏下降10-100倍。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Glu Lys Lys Ile Asn Arg His Phe Lys Ile Leu Lys Lys Asn

1 5 10 15

Leu Lys Lys Lys

20

Claims (5)

1.一种来源于草鱼干扰素的衍生多肽，所述的衍生多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的衍生多肽或权利要求2所述的核苷酸序列在制备细菌抑制剂中的应用，所述细菌包括但不限于耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌或嗜水气单胞菌。

4.权利要求1所述的衍生多肽或权利要求2所述的核苷酸序列在制备治疗或预防细菌感染引起的疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述细菌包括但不限于耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌或嗜水气单胞菌。