CN109602894A - 一种天蚕素衍生肽的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天蚕素衍生肽在制备抗鲍曼不动杆菌感染药物中的应用，其中，天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了一种抑菌药物，包括SEQ ID No.1所示的天蚕素衍生肽，抑菌药物用于抑制鲍曼不动杆菌。本发明还提供了一种抗炎药物，包括SEQ ID No.1所示的天蚕素衍生肽，炎症由鲍曼不动杆菌感染诱导。本发明的天蚕素衍生肽能够制备抵抗鲍曼不动杆菌感染的药物，其分子量小，生产成本低，对耐药菌同样具有抵抗作用。

Description

一种天蚕素衍生肽的应用
技术领域
本发明涉及一种天蚕素衍生肽在制备抗鲍曼不动杆菌感染药物中的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)属于革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界，如土壤、水源中，此外，在人类皮肤、消化道、呼吸道和泌尿生殖道等部位都有分布且能长期存活。鲍曼不动杆菌作为一种拥有很强的粘附力和传播能力的条件致病菌，通过一般物理或化学方法如紫外线、高温、化学消毒剂等也难以消除它。一旦免疫力低下的人，如新生儿、老人、病人等通过空气或直接接触携带鲍曼不动杆菌的人或物则极易产生感染并诱发严重的并发症。鲍曼不动杆菌主要感染肺部，可导致肺炎，还可以感染口腔、腹腔、皮肤软组织、中枢神经系统和泌尿生殖系统等，病死率高。因此鲍曼不动杆菌被列为医院感染的重要病原菌之一。
随着抗菌药物大量且广泛使用，耐药性鲍曼不动杆菌菌株越来越多。根据CHINET细菌耐药监测资料显示，自2010年起鲍曼不动杆菌在医院感染的临床检出率仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，排行第三。且其医院感染率、临床分离率、检出率还不断上升，耐药性也不断增强。目前鲍曼不动杆菌几乎对所有临床使用的抗菌药物耐药，可形成耐多种抗菌药物的鲍曼不动杆菌。世界卫生组织(WHO)在2017年2月发表的第一份抗生素耐药“重点病原体”中把鲍曼不动杆菌纳入第1类重点。这种耐多种抗菌药物的鲍曼不动杆菌广泛传播，给临床治疗带来许多困难，因此寻找新的抗鲍曼不动杆菌药物迫在眉睫。而这时抗菌肽(AMP)由于其具有优良的抗菌特性进入了我们的视野。
抗菌肽的独特抗菌机理，使其成为当前世界上新型抗耐药菌感染药物研发的热点。抗菌肽主要是通过疏水性相互作用、净电荷相互作用等直接结合并聚集到细菌细胞表面，进一步在改变微生物细胞膜的通透性，导致微生物细胞渗透压发生改变，形成穿孔而导致细胞质外流。而抗生素主要通过抑制微生物代谢、蛋白质合成等机制抑制细菌的感染，与抗生素的抗菌机理相比，抗菌肽独特的抗菌机理不易诱导细菌的耐药性，而且对耐药菌同样有效。此外，目前已报道的抗菌肽中有的可以在不到一分钟内发挥杀菌效果，而作为阳性对照的抗生素需要至少3小时，因此其杀菌速度快、短杀菌时间很难导致微生物耐药。更为重要的是，在临床重症细菌感染的抗生素治疗中，杀灭的细菌会释放出大量的内毒素，极易导致脓毒症的产生，而抗菌肽独特的抗菌机理，不仅可以结合细菌所释放的内毒素(脂多糖)，还可中和内毒素(脂多糖)的毒性，抑制重症细菌感染过程中内毒素的大量释放和“细胞因子”风暴的发生，从而抑制感染并发症的发生。因此，以抗菌肽来制备新型抗耐药菌感染的药物，具备杀菌直接、速度快、不易诱导耐药性和不易产生脓毒症等并发症的良好特性。
蚊子来源一类重要的具有生理学和药理学活性的固有免疫分子-抗菌肽。蚊子的抗菌肽起初是因为其在体外具有抗菌活性而被鉴定，主要包括天蚕素(cecropin)、防御素(defensin) 和GAM(gambicin)等。后来的研究表明，抗菌肽在蚊子的血餐过程中可以杀灭血餐中的病原微生物，还可以抑制病原微生物在宿主和蚊虫之间的传播。此外还有研究表明，蚊子的抗菌肽也可以抵抗脂多糖、大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌感染诱发的炎症反应。但是抗菌肽一直没有大范围应用，其中一个重要的受限制因素是合成成本相对较高。
总之，耐药菌的感染治疗方法，临床上还是以抗生素治疗为主，以及以多种抗生素的联合治疗，不仅会加快耐药菌产生的进程，而且会导致大量细菌被杀死而释放出大量内毒素，加剧脓毒血症等并发症的发生。抗菌肽在治疗耐药菌感染中具有一定的优势，但由于生产成本高，限制了其大范围的推广和应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种小分子天蚕素衍生肽在制备抗鲍曼不动杆菌感染药物中的应用，本发明的天蚕素衍生肽能够制备抵抗鲍曼不动杆菌感染的药物，其分子量小，生产成本低，对耐药菌同样具有抵抗作用。
本发明的第一个目的是公开天蚕素衍生肽在制备抗鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)感染药物中的应用，其中，天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示(以下将其命名为RL23)。
进一步地，天蚕素衍生肽的碳端酰胺化。
进一步地，天蚕素衍生肽的最小抑菌浓度为1.17-4.68μg/mL。
本发明的天蚕素衍生肽为α-螺旋结构，由23个氨基酸组成，分子量为2661.24道尔顿，等电点为10.75，为直链肽，所有氨基酸均为L型。
本发明的第二个目的是提供一种抗炎药物，包括天蚕素衍生肽，天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，炎症由鲍曼不动杆菌感染诱导。
进一步地，炎症包括鲍曼不动杆菌感染诱导的机体炎症损伤。机体炎症损伤包括腹膜炎、肺部组织炎症损伤和全身性炎症反应综合征。
进一步地，抗炎药物抑制机体产生促炎细胞因子。
进一步地，促炎细胞因子为肿瘤坏死因子-α和/或白介素-1β。
进一步地，抗炎药物可与抗生素联用，治疗耐药菌的感染，中和抗感染治疗中杀死的细菌释放出的内毒素，抑制感染导致的炎症损伤。
本发明的第三个目的是提供一种抑菌药物，包括天蚕素衍生肽，天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，抑菌药物用于抑制鲍曼不动杆菌。
进一步地，天蚕素衍生肽的最小抑菌浓度为1.17-4.68μg/mL。
本发明中，天蚕素衍生肽衍生于埃及伊蚊(Aedes aegypti)的cecropin N。
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)可为Acinetobacter baumanniiATCC19606，也可为Acinetobacter baumannii(临床耐药菌株)。
本发明的有益效果在于：
1、本发明中的RL23在体外对鲍曼不动杆菌的标准株和临床耐药株，都具有较好的抑菌活性，在体内对鲍曼不动杆菌的标准株和临床耐药株也具有较好的抑菌活性。
2、本发明中的RL23在体内可以抑制鲍曼不动杆菌标准株和临床耐药株感染诱导的炎症反应、机体炎症损伤，可以与抗生素进行联合治疗耐药菌的感染，中和抗感染治疗中杀死的细菌释放出的内毒素，抑制感染导致的机体炎症损伤。
3、本发明中的RL23，为cecropin N衍生肽，分子量比cecropin N小，但RL23抵抗鲍曼不动杆菌感染的效果与cecropin N相当，大大降低了合成成本，在临床耐药性鲍曼不动杆菌重症感染的治疗中，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例4中不同实验组小鼠的腹水和外周血中的鲍曼不动杆菌的生长情况测试结果；
图2是本发明实施例5中不同实验组小鼠的血清中的TNF-α和IL-1β的累积水平测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：RL23序列及其制备
为了降低埃及伊蚊来源的cecropin类多肽cecropin N(GeneBank登录号：AHH41648.1，成熟肽氨基酸序列为RWKFGKKLEKVGKNVFNAAKKALPVVAGYKAL-NH2，由32个氨基酸组成，分子量为3560.34道尔顿，等电点为10.54，为直链肽，所有氨基酸均为L型，其 C-末端酰胺化)在抵抗耐药菌感染中应用的生产成本，以cecropin N为模板，截取该成熟肽 N-端的α-螺旋结构域，命名为RL23，其氨基酸序列为 RWKFGKKLEKVGKNVFNAAKKAL-NH2(SEQ IDNo.1)，由23个氨基酸组成，分子量为 2661.24道尔顿，等电点为10.75，为直链肽，所有氨基酸均为L型，其C-末端酰胺化。
合成RL23序列时，可用自动多肽合成仪合成全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
实施例2：RL23与cecropin N对鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度的测试与比较
在96孔培养板中预先加入100μL LB肉汤培养基；然后在第1孔中加入100μL稀释好的多肽(cecropin N或RL23)样品，混匀后取100μL加入第2孔，依次进行一系列的二倍梯度稀释；将鲍曼不动杆菌菌液稀释至2×105CFU/mL，随后向已经加入多肽样品的96孔培养板中加入100μL已经稀释好的菌液；轻轻振荡混匀后将96孔培养板放入37℃培养16 小时，再用酶标仪测定600nm处的光吸收值。
结果如表1所示，母体肽cecropin N及其衍生肽RL23均可有效抑制鲍曼不动杆菌的生长，母体肽cecropin N对鲍曼不动杆菌标准株(Acinetobacter baumanniiATCC19606)及临床分离的鲍曼不动杆菌耐药株(Acinetobacter baumannii)的最小抑菌浓度分别为4.68μg/mL (1.31μΜ)和2.34μg/mL(0.66μM)，最小抑菌浓度范围为2.34-4.68μg/mL；衍生肽RL23 对鲍曼不动杆菌标准株(Acinetobacter baumannii ATCC19606)及临床分离的鲍曼不动杆菌耐药株(Acinetobacter baumannii)的最小抑菌浓度分别为4.68μg/mL(1.75μΜ)和1.17μg/mL (0.44μM)，最小抑菌浓度范围为1.17-4.68μg/mL。结果显示，RL23与cecropin N具有相当的抑制鲍曼不动杆菌生长的能力。
表1衍生肽RL23及其母体肽cecropin N对鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度
实施例3：鲍曼不动杆菌对抗生素敏感性测试
按照实施例1的方法，测定实施例1中所选的鲍曼不动杆菌菌株对其感染的临床治疗上常用抗生素的敏感性。以青霉素和庆大霉素为代表，检测青霉素和庆大霉素对实施例1所选菌株的最小抑菌浓度浓度。
结果如表2所示，庆大霉素对鲍曼不动杆菌标准株(Acinetobacter baumanniiATCC19606) 的最小抑菌浓度为8μg/mL，但青霉素对鲍曼不动杆菌标准株(Acinetobacterbaumannii ATCC19606)的最小抑菌浓度高于256μg/mL。值得注意的是，临床分离的鲍曼不动杆菌对庆大霉素和青霉素表现出高度的耐药性，庆大霉素和青霉素在浓度高达256μg/mL时，对鲍曼不动杆菌临床分离株的生长也没有产生抑制效果。相反，如实施例2所示，RL23对同样的鲍曼不动杆菌临床分离株则表现出较好的抑菌效果，最小抑菌浓度为1.17-4.38μg/mL。
表2抗生素对鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度
实施例4：RL23与cecropin N在小鼠体内抑菌效果的测试与比较
将C57BL/6小鼠(18-20g，雌性)随机分为3组，小鼠经腹腔注射感染鲍曼不动杆菌(ATCC19606，1×107CFU)，30分钟后，多肽治疗组小鼠腹腔注射RL23或者cecropin N(10mg/kg)，阴性对照组则只注射等体积的PBS，选健康小鼠作为空白对照。感染18小时后，小鼠摘眼球取血后，颈椎脱臼处死，并用2mL的PBS灌洗腹腔，取出腹腔灌洗液。取适量的外周血和腹腔灌洗液，进行梯度稀释，涂布到LB固体培养基上，在培养箱中37℃培养18小时后，进行菌落形成计数。
结果如图1所示，RL23治疗组和cecropin N治疗组小鼠的腹水(图1a)和外周血(图1b)中的细菌载量显均著低于PBS组治疗组小鼠(图中PBS)，表明RL23和cecropin N在小鼠体内对鲍曼不动杆菌也有较好的抑菌效果，且RL23和cecropin N在小鼠体内具有相当的抑制鲍曼不动杆菌生长的能力。
实施例5：RL23与cecropin N在小鼠体内抗炎效果的测试与比较
按照实施例4的方法感染小鼠，并给予多肽(RL23或cecropin N)治疗，感染18小时后，小鼠摘眼球取血，制备血清，用酶联免疫试剂盒(购买自达科为)检测小鼠血清中炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的累积水平。
结果如图2所示，图2中，对照组代表正常组小鼠，PBS、cecropin N和RL23分别代表鲍曼不动杆菌感染后的PBS治疗组小鼠、cecropin-N治疗组小鼠和RL23治疗组小鼠，图 2a、b分别代表小鼠的血清中的TNF-α和IL-1β的累积水平。图2表明，与正常组小鼠相比，鲍曼不动杆菌感染后，PBS治疗组小鼠的血清中的TNF-α和IL-1β的累积水平显著增加，正常组小鼠血清中TNF-α含量约为100pg/mL，PBS治疗组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的累积水平约为1600pg/mL，而cecropin N和RL23(10mg/kg)治疗组的小鼠血清中的TNF-α和 IL-1β的累积显著被抑制，接近对照组小鼠的水平。表明cecropin N和RL23可以有效抑制鲍曼不动杆菌感染后小鼠机体炎症细胞因子的产生，从而抑制鲍曼不动杆菌感染诱导的小鼠机体炎症损伤。此外，RL23和cecropin N在体内具有相当的抗炎效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种天蚕素衍生肽的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Arg Trp Lys Phe Gly Lys Lys Leu Glu Lys Val Gly Lys Asn Val Phe
1 5 10 15
Asn Ala Ala Lys Lys Ala Leu
20

Claims (10)

1.天蚕素衍生肽在制备抗鲍曼不动杆菌感染药物中的应用，其中，所述天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述天蚕素衍生肽的碳端酰胺化。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述天蚕素衍生肽的最小抑菌浓度为1.17-4.68μg/mL。
4.一种抗炎药物，其特征在于：包括天蚕素衍生肽，所述天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，炎症由鲍曼不动杆菌感染诱导。
5.根据权利要求4所述的抗炎药物，其特征在于：所述炎症包括鲍曼不动杆菌感染诱导的机体炎症损伤。
6.根据权利要求5所述的抗炎药物，其特征在于：所述机体炎症损伤包括腹膜炎、肺部组织炎症损伤和全身性炎症反应综合征。
7.根据权利要求4所述的抗炎药物，其特征在于：所述抗炎药物抑制机体产生促炎细胞因子。
8.根据权利要求7所述的抗炎药物，其特征在于：所述促炎细胞因子为肿瘤坏死因子-α和/或白介素-1β。
9.一种抑菌药物，其特征在于：包括天蚕素衍生肽，所述天蚕素衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述抑菌药物用于抑制鲍曼不动杆菌。
10.根据权利要求9所述的抑菌药物，其特征在于：所述天蚕素衍生肽的最小抑菌浓度为1.17-4.68μg/mL。
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