CN107596344A - 天蚕素多肽作为抗炎药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天蚕素多肽作为抗炎药物的应用，其中，天蚕素多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。本发明还公开了一种抗炎药物，包括天蚕素多肽，天蚕素多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1‑SEQ ID No.5中的一种或几种。本发明公开了五种天然免疫多肽及其协同效应在制备抗炎药物中的应用，特别是涉及埃及伊蚊(Aedes aegypti)来源的五种天然免疫多肽及其协同效应的应用。

Description

天蚕素多肽作为抗炎药物的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种天蚕素多肽作为抗炎药物的应用。

背景技术

感染性疾病一直是威胁人类健康的全球性公共问题。病原微生物感染的患者，通常伴随着机体不可控的炎症反应。例如，细菌感染过程中，革兰氏阴性菌会大量释放出细胞壁组分-脂多糖，而革兰氏阳性菌也会大量释放出细胞壁组分-脂质胞壁酸，而脂多糖和脂质胞壁酸分别是Toll样受体4和Toll样受体2的激动剂，从而激活免疫细胞下游的一系列炎症信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶信号通路MAPKs和核转录因子信号通路NF-kappa B等，从而导致机体过度产生大量的细胞因子和一氧化氮的释放，这种释放在临床上被称为“细胞因子风暴”，导致内毒素休克或者脓毒血症，诱发机体/器官损伤、衰竭或坏死，最终导致病人死亡。

一直以来对细菌感染引发的脓毒血症的主要治疗方法为输液、改善机体供氧、抗感染治疗和免疫治疗等。从上个世纪30年代开始，科学家们发现了抗生素，渐渐地抗生素被广泛地应用于临床感染性疾病的治疗，拯救了无数感染性疾病患者的生命。但是，这些治疗方法又存在着诸多不足，比如抗感染治疗会导致大量细菌被杀死而释放出大量内毒素，加剧脓毒血症。此外，随着抗生素的广泛使用和临床上的不规范用药，导致了越来越多的临床病原微生物的耐药菌株的出现，包括多重耐药菌株和广泛耐药菌株，近年来，耐药形式严峻，甚至出现对所有抗生素都耐药的“超级细菌”，耐药细菌的出现，让抗生素对细菌的感染及感染导致的不可控炎症和脓毒血症束手无策。面对该严峻的现实，一方面，我们通过修饰现有的抗生素来提高抗感染效率，并继续开发新型化学小分子抗生素，另一方面，需要持续寻找治疗脓毒血症的新型有效的生物小分子，来应对世界范围内日益严重的耐药菌的感染。

蚊子，是一类重要的吸血节肢动物，同时是多种病原微生物的传播媒介。蚊子在吸血过程中，会产生一系列具有生理学和药理学活性的分子，这些分子可以有效的作用于哺乳动物宿主的凝血系统和免疫系统。这些具有生理学和药理学活性的分子可分为两大类：一类是作用于哺乳动物宿主的凝血系统的分子，抑制宿主的凝血过程，以帮助蚊子完成整个吸血过程，又称为抗凝分子。另一类是作用于哺乳动物宿主的免疫系统，抑制宿主的免疫反应，包括过敏反应、炎症反应等。目前，对于蚊子的抗凝物质研究的颇多，已知按蚊(anopheline)和库蚊(culicine)的吐液中含有三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)，有效的抑制宿主的凝血系统，分子机制是通过抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的血小板聚集，从而抑制局部的凝血过程，缩短蚊子的口针刺入微血管系统的时间，从而成功的完成吸血过程。此外，从埃及伊蚊(Aedes aegypti)唾液腺中发现两种神经肽sialokinin-I和sialokinin-II，属于速激肽激肽(tachykinin)家族，sialokinin-I和sialokinin-II与哺乳动物来源的血管舒张药P物质(substance P)在氨基酸序列上具有同源性，功能上，与P物质也类似，可以诱导平滑肌收缩。蚊子来源的速激肽在伊蚊属的埃及伊蚊(Aedes aegypti)和三列伊蚊(Aedes triseriatus)，以及按蚊属的冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)中是一类具有高度保守性的速激肽。总体上来说，已发现蚊子的吐液复合物和吐液腺粗提物具有抗凝功能，并鉴定到特异性的抗凝分子，这些抗凝物质不但在蚊子的吸血过程中发挥极具重要的生理学功能，同时为开发生物抗凝药物应用于临床血栓等的治疗提供优秀的先导分子。

蚊子来源的另一类重要的具有生理学和药理学活性的物质是免疫相关分子，主要在吸血过程中发挥抗感染和免疫调节的功能。根据文献报道，抗感染相关分子已有大量的报道，其中一类主要的抗感染分子为抗菌肽(antimicrobial peptide)，蚊子的抗菌肽起初是因为其在体外具有抗菌活性而被鉴定，主要包括天蚕素(cecropin)、防御素(defensin)和GAM(gambicin)等，主要是有效的杀灭血餐中的病原微生物以及抑制病原微生物在宿主和虫媒之间的传播。免疫调节相关分子主要是蚊子在血餐过程中抑制宿主的免疫反应，包括免疫抑制作用和抗炎症作用，目前关于特异性的免疫抑制分子已有阐述，前面介绍的到的速激肽sialokinin-I和sialokinin-II的衍生肽可以发挥有效的免疫抑制的功能。然而，关于蚊子的抗炎生理学和药理学研究，目前仅停留在吐液复合物和吐液腺粗提物的研究层面，尚未有特异性的抗炎组分被鉴定，有待进一步的阐述。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种天蚕素多肽作为抗炎药物的应用，本发明公开了来源于蚊子的五种天然免疫多肽及其协同效应在制备抗炎药物中的应用。

本发明公开了天蚕素多肽(cecropin)作为抗炎药物的应用，其中，天蚕素多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1(以下命名为AeaeCec1)、SEQ ID No.2(以下命名为AeaeCec2)、SEQ ID No.3(以下命名为AeaeCec3)、SEQ ID No.4(以下命名为AeaeCec4)或SEQ ID No.5(以下命名为AeaeCec5)所示。

进一步地，SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5序列所示的天蚕素多肽(AeaeCec2～5)的碳端酰胺化。

进一步地，天蚕素多肽抑制MAPKs和/或NF-κB信号通路的激活。

进一步地，天蚕素多肽抑制细胞产生一氧化氮和/或促炎细胞因子。

进一步地，天蚕素多肽抑制细胞的诱导性一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)的转录。

进一步地，细胞为小鼠巨噬细胞、人外周血单核细胞(PBMCs)、小鼠中性粒细胞或人中性粒细胞。

进一步地，促炎细胞因子为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)中的一种或几种。

进一步地，应用在体外时，AeaeCec1的浓度为1～5μM；AeaeCec2的浓度为1～5μM；AeaeCec3的浓度为1～5μM；AeaeCec4的浓度为1～5μM；AeaeCec5的浓度为1～5μM。

进一步地，细胞受脂多糖(LPS)、革兰氏阴性菌、脂质胞壁酸(LTA)或革兰氏阳性菌的刺激。

在体内，脂多糖、革兰氏阴性菌可诱导小鼠出现脓毒血症，天蚕素多肽可对患有该症状的小鼠起到保护作用。其机理是天蚕素多肽能够抑制MAPKs和/或NF-κB信号通路的激活。并且天蚕素多肽能够部分中和脂多糖LPS的内毒素活性。

进一步地，革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏伤寒杆菌、副溶血性弧菌中的一种或几种。

进一步地，应用在体内时，AeaeCec1的使用浓度为2～10mg/kg；AeaeCec2的使用浓度为2～10mg/kg；AeaeCec3的使用浓度为2～10mg/kg；AeaeCec4的使用浓度为2～10mg/kg；AeaeCec5的使用浓度为2～10mg/kg。

进一步地，天蚕素多肽对哺乳动物细胞没有毒性。优选地，哺乳动物细胞为猴肾细胞Vero E6cells、小鼠腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophages)和人PBMCs。

进一步地，在浓度为0～50μM时，AeaeCec1-AeaeCec4对上述细胞没有毒性。在浓度为0～6.25μM时，AeaeCec5对上述细胞没有毒性。

本发明还公开了一种抗炎药物，包括天蚕素多肽，天蚕素多肽的氨基酸序列为SEQID No.1-SEQ ID No.5中的一种或几种。

进一步地，体外使用时，天蚕素多肽的浓度为1～5μM；体内使用时，天蚕素多肽的浓度为2～10mg/kg。

进一步地，天蚕素多肽来源于埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)、中华按蚊(Anopheles sinensis)或致乏库蚊(Culex fatigans)。

埃及伊蚊来源的五种天蚕素多肽具有较好的抗炎活性，且具有协同抗炎效应，这五种天蚕素多肽在本发明中的缩写名、原名、GeneBank登录号见表1。其中，AeaeCec1为直链肽，由36个氨基酸组成，分子量为3675.47道尔顿，等电点为10.79；AeaeCec2为直链肽，由34个氨基酸组成，分子量为3391.11道尔顿，等电点为10.39，其C-末端酰胺化；AeaeCec3为直链肽，由34个氨基酸组成，分子量为3571.35道尔顿，等电点为10.30，其C-末端酰胺化；AeaeCec4为直链肽，由34个氨基酸组成，分子量为3491.31道尔顿，等电点为10.47，其C-末端酰胺化；AeaeCec5为直链肽，由32个氨基酸组成，分子量为3560.34道尔顿，等电点为10.54，其C-末端酰胺化。这五种天蚕素多肽的所有氨基酸均为L型。

表1埃及伊蚊(A.aegypti)来源的五种天蚕素多肽相关信息

本发明提供了利用埃及伊蚊来源的五种天然多肽的协同抗炎效应在制备抗炎药物中的应用。这五种天然免疫多肽起初由于其具有体外的抗菌功能，被鉴定为抗菌肽，其杀菌机理是这类免疫多肽的两亲性的螺旋结构和净正电荷与细菌具有两亲性和负电荷性的细胞膜相互作用，改变细胞膜的通透性，导致细菌细胞的渗透压发生改变，细胞基因组等内容物外泄。

本发明中的五种天蚕素多肽在体外具有抑制LPS刺激的小鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞一氧化氮的释放和促炎细胞因子的产生，在体内可以抑制LPS和革兰氏阴性菌诱导的脓毒血症小鼠的炎症反应，分子机制研究发现，这五种天蚕素多肽能够抑制LPS刺激的炎症相关信号通路的激活和部分的LPS中和活性。重要的是，这五种cecropin在体内和体外都具有协同抗炎效应，鉴于本发明的公开内容，在细菌感染中，既可以利用以上天然多肽达到杀菌的作用，又可以中和被杀灭的细菌释放出来的内毒素，达到抗炎的功能。这五种天然免疫多肽的协同抗炎效应，为抗炎联合治疗提供了新方向，补充了现有临床上细菌感染引发的脓毒血症治疗方法的不足。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明中的埃及伊蚊来源的五种免疫多肽，是基于蚊子与其哺乳动物宿主之间相互作用的共进化的基础上鉴定到的抗炎症多肽，来源天然。

2、埃及伊蚊来源的五种免疫多肽具有较强的抗炎症效果，抑制感染过程中炎症因子的过渡分泌，兼具有中和内毒素的功能，而且五种多肽之间具有协同效应，一方面，他们可以与现有的脓毒血症治疗进行联合，中和抗感染治疗中杀死的细菌释放出的内毒素，另一方面，五种免疫多肽可以进行联合治疗，发挥协同效应。

3、埃及伊蚊来源的五中免疫多肽分子量小，合成成本低，在抗炎症药物的制备中具有较好的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1图示了埃及伊蚊cecropin抑制LPS刺激的NO的产生结果；

图2图示了埃及伊蚊cecropin抑制LPS刺激的促炎细胞因子的产生结果；

图3图示了埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制LPS诱导的脓毒血症小鼠的炎症反应；

图4图示了埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制LPS诱导的脓毒血症小鼠的肺部组织损伤和肺水肿；

图5图示了AeaeCec5抑制革兰氏阴性菌E.coli和P.aeruginosa诱导的脓毒血症小鼠的炎症反应；

图6图示了AeaeCec5抑制革兰氏阴性菌E.coli和P.aeruginosa诱导的脓毒血症小鼠的肺部组织损伤；

图7图示了埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞炎症信号通路的激活；

图8图示了埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin对LPS激活的小鼠腹腔巨噬细胞炎症信号通路的抑制效果统计；

图9图示了埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin中和了LPS内毒素活性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中，所使用的埃及伊蚊来源的五种cecropin类多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1-5所示。其中，AeaeCec1为直链肽，由36个氨基酸组成，分子量为3675.47道尔顿，等电点为10.79；AeaeCec2为直链肽，由34个氨基酸组成，分子量为3391.11道尔顿，等电点为10.39，其C-末端酰胺化；AeaeCec3为直链肽，由34个氨基酸组成，分子量为3571.35道尔顿，等电点为10.30，其C-末端酰胺化；AeaeCec4为直链肽，由34个氨基酸组成，分子量为3491.31道尔顿，等电点为10.47，其C-末端酰胺化；AeaeCec5为直链肽，由32个氨基酸组成，分子量为3560.34道尔顿，等电点为10.54，其C-末端酰胺化。这五种cecropin的所有氨基酸均为L型。

实施例1

埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞和人外周血单核细胞(human PBMCs)一氧化氮(NO)的产生

(1)抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的转录

iNOS是NO产生所必须的合成酶，首先检测埃及伊蚊五种cecropin对一氧化氮合酶转录水平的影响。

C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞铺于24孔细胞培养板中(2.5×10⁵细胞/孔)，用加有2％胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RMPI-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，如图1标注所示，在细胞中加入100ng/ml脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4，购买自Sigma)，同时分别加入5μM的AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4、AeaeCec5，用于协同效应检测的实验组同时加入AeaeCec1-5(1μM每个)，并加入等体积的PBS。共孵育6小时后，收集细胞，用Trizol(购买自Takara)裂解细胞，提取RNA，用逆转录试剂盒(购买自Takara)合成cDNA，并用荧光定量PCR检测不同处理的细胞中iNOS的转录水平。

由图1A可见，100ng/ml的LPS显著刺激了小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的转录，而埃及伊蚊的五种cecropin显著抑制了LPS刺激的小鼠巨噬细胞iNOS的转录。从图中可看出，AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4、AeaeCec5在5μM的浓度时，分别抑制了94.9％、91.9％、91.2％、89.4％和95.3％的iNOS转录，当同时加入AeaeCec1-5(每个1μM)时，五中cecropin表现出了协同效应，抑制了97.4％的iNOS转录。

(2)抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞和人外周血单核细胞(human PBMCs)亚硝酸盐(nitrite)的产生

不同处理的细胞培养基中亚硝酸盐的累积水平间接反映了NO的产生，接着检测了埃及伊蚊cecropin对亚硝酸盐产生的影响。

将步骤(1)中的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞换成人PBMCs，其它方法与步骤(1)相同，共孵育24小时后，收集培养上清，用格里斯试剂(购买自碧云天)检测不同处理的细胞培养上清亚硝酸盐的累积水平；或直接将步骤(1)中的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞共孵育24小时后，收集培养上清，用格里斯试剂(购买自碧云天)检测不同处理的细胞培养上清亚硝酸盐的累积水平。

如图1B所示，100ng/ml的LPS显著刺激了小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中nitrite的累积，而埃及伊蚊的五种cecropin显著抑制了LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清中nitrite的累积。AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4、AeaeCec5在5μM的浓度时，分别抑制了57.6％、57.9％、52.2％、48.0％和78.1％的nitrite的累积，当同时加入AeaeCec1-5(1μM每个)时，表现出了协同效应，抑制了84.2％的nitrite的累积。

此外，如图1C所示，100ng/ml的LPS显著刺激了人PBMCs培养上清中nitrite的累积，而埃及伊蚊的五种cecropin显著抑制了LPS刺激的人PBMCs培养上清中nitrite的累积。AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4、AeaeCec5在5μM的浓度时，分别抑制了50.5％、59.6％、60.9％、60.2％和72.8％的nitrite的累积，当同时加入AeaeCec1-5(每个1μM)时，表现出了协同效应，抑制了83.7％的nitrite的累积。

对照组细胞分别加入等体积的溶剂(PBS)；图1A-C中的柱形图数值为三次独立实验的均数±标准误差。*P<0.05,**P<0.01，表示多肽处理组和对照处理组相比有显著差异。

实施例2

埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞(mouseperitoneal macrophages)和人外周血单核细胞(human PBMCs)促炎细胞因子的产生

将C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞或人PBMCs铺于24孔细胞培养板中(2.5×10⁵细胞/孔)，用加有2％胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RMPI-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，在细胞中加入100ng/ml脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4，购买自Sigma)，同时分别加入5μM的AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4、AeaeCec5，用于协同效应检测的实验组同时加入AeaeCec1-5(每个1μM)。并设置对照组，加入等体积的PBS。共孵育6小时后，收集细胞培养上清，用酶联免疫试剂盒(购买自达科为)检测细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的累积水平。

结果如图2A-C所示，图2(A-C)分别为抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞(A)TNF-α，(B)IL-1β和(C)IL-6的产生；图2(D-F)分别为抑制LPS刺激的人PBMCs的(D)TNF-α，(E)IL-1β和(F)IL-6的产生。对照组细胞分别加入等体积的溶剂(PBS)。图中的柱形图数值为三次独立实验的均数±标准误差。*P<0.05,**P<0.01，表示多肽处理组和对照处理组相比有显著差异。

由图2(A-C)可知，100ng/ml的LPS显著刺激了小鼠腹腔巨噬细胞促炎细胞因子的产生，而埃及伊蚊的五种cecropin总体上减少了LPS刺激的小鼠巨噬细胞促炎细胞因子的产生。在浓度为5μM时，TNF-α的产生被AeaeCec3、4和5显著抑制，抑制率分别达到32.3％、50.3％和57.7％；IL-1β的产生被AeaeCec3、4和5显著抑制，抑制率分别达到48.8％、43.2％和63.9％；IL-6的产生被AeaeCec1、2、3、4和5显著抑制，抑制率分别达35.9％、24.1％、45.6％、61.5％和64.4％；此外同时加入AeaeCec1-5(1μM每个)时，表现出了协同效应，TNF-α、IL-1β和IL-6的产生分别被抑制了64.5％、66.9％和69.0％。

在人PBMCs中结果如图2(D-F)所示，100ng/ml的LPS显著刺激了人PBMCs促炎细胞因子的产生，而埃及伊蚊的五种cecropin总体上减少了LPS刺激的人PBMCs促炎细胞因子的产生。在浓度为5μM时，TNF-α的产生被AeaeCec2、3、4和5显著抑制，抑制率分别达到55.8％、50.2％、62.9％和71.6％；IL-1β的产生被AeaeCec1、2、3、4和5显著抑制，抑制率分别达到41.8％、54.0％、45.4％、30.0％和65.9％；IL-6的产生被AeaeCec2、3、4和5显著抑制，抑制率分别达到32.3％、33.4％、37.4％和51.6％；此外同时加入AeaeCec1-5(1μM每个)时，表现出了协同效应，TNF-α、IL-1β和IL-6的产生分别被抑制了73.9％、70.8％和60.9％。

实施例3

埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin对哺乳动物细胞毒性的测定

分别将C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞、人PBMCs和绿猴肾细胞系Vero E6细胞铺于96孔培养板中(2×10⁴细胞/孔)，用加有2％胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RMPI-1640培养基(100μl/孔，购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，加入一系列用无血清RPMI-1640培养基2倍梯度稀释的多肽，共培养24小时候，每孔加入细胞增殖与毒性检测试剂CCK-8(10μl/孔，购买自北京沃比森科技有限公司)，孵育4小时后，检测450nm处光吸收，将未加入多肽的细胞活力定义为100％，并计算不同浓度多肽处理后的细胞活力。

结果表明，在浓度高达50μM时，AeaeCec1、2、3、4和5对Vero E6没有细胞毒性，AeaeCec1、2、3和4对小鼠腹腔巨噬细胞没有细胞毒性，AeaeCec1、2、3和4对人PBMCs没有细胞毒性。而AeaeCec5在浓度低于6.25μM时，对小鼠腹腔巨噬细胞和人PBMCs没有细胞毒性，在浓度高于6.25μM时，对小鼠腹腔巨噬细胞和人PBMCs以剂量依赖的方式显示出一定的细胞毒性，在浓度为12.5、25和50μM时，AeaeCec5诱导了9.5、18.7和28.9％小鼠腹腔巨噬细胞的死亡，以及8.9％、12.6％和17.5％的人PBMCs的细胞死亡。在合适的浓度范围内，AeaeCec1、2、3、4和5均对这三种细胞是安全的，表明其抑制促炎因子的产生不是通过影响单核/巨噬细胞的活力来实现的。

实施例4

埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制LPS诱导的脓毒血症小鼠的保护作用

C57BL/6小鼠(雌性，18-20g，n＝6，购买自上海斯莱克)腹腔注射10mg/kg LPS(来源于E.coli 0111:B4,Sigma)，多肽处理组小鼠腹腔注射10mg/kg的AeaeCec1、2、3、4和5，用于协同效应检测时，分别同时加入2mg/kg的AeaeCec1-5，阴性对照组小鼠腹腔注射等体积的溶剂(PBS)，同时设置正常对照安慰剂Sham组(均注射PBS作为安慰剂)。处理4小时后，将小鼠颈椎脱臼处死，采集血样本、腹腔灌洗液以及肺组织，并取一份肺组织固定于10％福尔马林中，用石蜡包埋，切成5μm石蜡片后进行美兰和伊红染色，另外再取一份肺组织立马称湿重后放到80℃烘箱中烘干48小时后，称取干重。其中，用于小鼠实时定量qPCR测定肺部促炎细胞因子的引物序列如下表2所示：

表2.用于qPCR的引物

结果如图3和图4所示，图3为促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在(A)肺部的转录水平、(B)血清中的生成水平和(C)腹水中的生成水平。图4为(A)肺部组织损伤和(B)肺部干重/湿重比。图中的柱形图数值为三次独立实验的均数±标准误差。图3和图4中的*P<0.05,**P<0.01，表示多肽处理组小鼠和Sham对照组与阴性对照组(LPS，10mg/kg)小鼠相比有显著差异。

由图3和图4可知，腹腔注射10mg/kg的LPS引起严重的炎症浸润、肺部组织损伤，注射AeaeCec1、2、3、4和5后，对LPS引起的炎症浸润和肺部组织损伤起到了不同程度的保护作用。对LPS诱导的脓毒血症小鼠的促炎细胞因子分析发现，腹腔注射LPS显著导致了肺部促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的转录，而AeaeCec1、2、3、4和5(10mg/kg)抑制了这三种促炎细胞因子的转录，其中AeaeCec1、2、4和5(10mg/kg)对TNF-α转录的抑制达到显著性差异，抑制率分别为48.0％、48.6％、39.8％和61.6％；AeaeCec 5(10mg/kg)IL-1β转录的抑制呈显著性差异，抑制率达到25.5％；AeaeCec1、2、3、4和5(10mg/kg)对IL-6转录的抑制呈显著性差异；此外同时注射2mg/kg的AeaeCec1、2、3、4和5呈现出协同效应，对TNF-α、IL-1β和IL-6转录的抑制率分别为72.7％、55.2％和83.2％。在血清(serum)和腹腔灌洗液(peritoneallavage)中观察到了相似的结果，10mg/kg的LPS显著导致了腹腔灌洗液和血清中这三种促炎细胞因子的产生，而腹腔注射AeaeCec1、2、3、4和5(10mg/kg)不同程度的抑制了血清和腹腔灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。同时，AeaeCec5还显著抑制了肺部水肿的发生。此外，同时注射2mg/kg的AeaeCec1、2、3、4和5对抑制促炎细胞因子在血清和腹腔灌洗液中的产生以及抑制肺部水肿呈现出协同效应。

实施例4

埃及伊蚊天然免疫多肽AeaeCec5对革兰氏阴性菌(E.coli和P.aeruginosa)诱导的脓毒血症小鼠的保护作用

在上述实验中，AeaeCec5显示出最强的体内、体外抗炎效果，于是，选用AeaeCec5进一步探索其在体内对革兰氏阴性菌诱导的脓毒血症小鼠的作用。

C57BL/6小鼠，雌性，18-20g，n＝6，购买自上海斯莱克。每只小鼠腹腔注射2×10⁷CFUs大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 25922)或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC 27853)，多肽处理组小鼠腹腔注射10mg/kg的AeaeCec5，阴性对照组小鼠腹腔注射等体积的溶剂(PBS)，同时设置只注射PBS的安慰剂对照组(Sham)。处理24小时后，将小鼠颈椎脱臼处死，采集血样本、腹腔灌洗液以及肺组织，并取一份肺组织固定于10％福尔马林中，用石蜡包埋，切成5μm石蜡片后进行美兰和伊红染色。

结果如图5和图6所示，图5为促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在(A)肺部、(B)血清和(C)腹水中的产生水平，图6为肺部的病理切片，放大倍数为200×。图5中的柱形图数值为三次独立实验的均数±标准误差。*P<0.05,**P<0.01，表示多肽处理组小鼠和Sham对照组与阴性对照组(LPS，10mg/kg)小鼠相比有显著差异。

由图5和图6可知，腹腔注射E.coli和P.aeruginosa诱导的脓毒血症小鼠肺部出现了严重的炎症反应和肺组织损伤，注射AeaeCec5减轻了E.coli和P.aeruginosa引起的炎症反应和肺组织损伤。对E.coli和P.aeruginosa诱导的脓毒血症小鼠的促炎细胞因子分析发现，腹腔注射E.coli和P.aeruginosa显著导致了肺部、腹腔灌洗液和血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，而AeaeCec5(10mg/kg)显著抑制了这三种促炎细胞因子的产生(图5)，其中AeaeCec5(10mg/kg)对E.coli感染导致的肺部TNF-α、IL-1β和IL-6产生的抑制率分别为60.3％、77.9％和67.0％，对P.aeruginosa感染导致的肺部TNF-α、IL-1β和IL-6产生的抑制率分别为50.4％、62.9％和60.2％；AeaeCec5同样显著抑制了血清和腹腔灌洗液中这三种促炎细胞因子的产生。同时，注射AeaeCec5对E.coli和P.aeruginosa感染导致的肺部组织损伤也起到了良好的保护作用(图6)。

实施例5

埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞炎症信号通路的激活

为了进一步研究埃及伊蚊免疫多肽cecropin抗炎机理，将C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞铺于6孔细胞培养板中(1×10⁶细胞/孔)，用加有2％胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RMPI-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，在细胞中加入100ng/ml脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4，购买自Sigma)，同时分别加入不同浓度的AeaeCec1、2、3、4和5(1.25、2.5和5μM)，并设置对照组，加入等体积的PBS。孵育30分钟后，收集细胞，用RIPA裂解液(购买自碧云天)裂解细胞，收取细胞蛋白，再用BCA蛋白定量试剂盒(购买自碧云天)进行蛋白定量。将裂解好的蛋白按照40微克的上样量用10％聚丙酰胺凝胶在100伏的电压下电泳90分钟，再将蛋白电转(300毫安，90分钟)到杂交膜上，然后室温用5％牛血清白蛋白封闭2小时。

将MAPKs信号通路相关的一抗：Phospho-ERK、ERK、Phospho-JNK、JNK、Phospho-p38和p38和NF-κB信号通路相关的一抗：Phospho-p65、和p65(购买自美国CST公司)，以及内参β-actin(购买自上海鼎国生物技术有限公司)用5％的牛血清白蛋白按照1:2000的方法稀释，把封闭好的杂交膜与稀释的一抗4℃孵育过夜，用含0.1％吐温-20的Tris缓冲液(TBST,2.42g/L Trisbase,8g/L NaCl,0.1％Tween 20,pH 7.6)洗涤3次，每次5分钟，再用5％的牛血清白蛋白稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000，购买自美国CST公司)在室温下孵育1小时后，用TBST洗涤3次，每次10分钟，再用发光底物(购买自中国天根生化科技有限公司)在暗室显影曝光。

结果如图7和图8所示，图7各图分别对应(A)AeaeCec1，(B)AeaeCec2，(C)AeaeCec3，(D)AeaeCec4，(E)AeaeCec5，图8为灰度值比值统计。AeaeCec1,2,3,4和5的浓度如图所示，对照组细胞加入等体积的溶剂(PBS)，灰度值用软件Quantity One(Bio-Rad,Richmond,CA USA)分析的，图中的柱形图数值为三次独立实验的均数±标准误差。*P<0.05,**P<0.01，表示多肽处理组和PBS对照组与单独的100ng/ml的LPS处理组相比有显著差异。

由图7和图8可知，100ng/ml的LPS显著激活了MAPKs和NF-κB信号通路，AeaeCec1、2、3、4和5以剂量依赖的方式选择性的抑制了LPS激活的MAPKs和NF-κB信号通路。在浓度为5μM时，AeaeCec1显著抑制了56.9％的NF-κB p65的磷酸化；AeaeCec2显著抑制了78.0％的ERK1、49.2％的ERK2、75.1％的JNK1、64.2％的JNK2、67.7％的p38和84.1％的NF-κB p65的磷酸化；AeaeCec3显著抑制了78.6％的JNK1、82.5％的JNK2、78.6％的p38和51.0％的NF-κBp65的磷酸化；AeaeCec4显著抑制了94.9％的JNK1、93.3％的JNK2、43.5％的p38和76.5％的NF-κB p65的磷酸化；AeaeCec5显著抑制了99.7％的ERK1、83.6％的ERK2、90.7％的JNK1、86.9％的JNK2、99.2％的p38和78.5％NF-κB的磷酸化。然而在浓度为5μM时，AeaeCec1对ERK1、ERK2、JNK1、JNK2和p38的磷酸化没有显著影响；AeaeCec3对ERK1和ERK2的磷酸化没有显著影响；AeaeCec4对ERK1、ERK2、JNK1、JNK2和p38的磷酸化没有显著影响。以上结果表明埃及伊蚊的五种免疫调节肽选择性的抑制了LPS激活的炎症信号通路，这可能是它们执行协同抗炎效应的分子基础。

实施例6

埃及伊蚊天然免疫多肽cecropin部分中和LPS内毒素活性

为了进一步探索埃及伊蚊免疫多肽cecropin的抗炎机理，使用ToxinSensor^TM内毒素显色鲎检测试剂盒分析了AeaeCec1、2、3、4和5的LPS内毒素中和功能及其协同效应。

LPS(5endotoxin units/ml)和多肽用试剂盒提供的LAL水进行溶解，AeaeCec1,2,3,4和5的浓度分别为20μM，用于协同效应测定时(AeaeCec1-5)，分别加入4μM的AeaeCec1,2,3,4和5。对照组加入等体积的溶剂(PBS)。多肽(20μl/孔)和等体积的LPS混合加入无热源的96孔板中后，加入LAL试剂(20μl/孔)并在37℃孵育10分钟，最后加入显色底物(40μl/孔)并在37℃孵育6分钟，最后分别加入颜色稳定剂1、2和3(40μl/孔)，并在545mm的光波长小测定吸收值。LPS中和活性计算方法为：(A_blank-A_peptide)/A_blank×100％。

结果如图9所示，图中的柱形图数值为三次独立实验的均数±标准误差。*P<0.05,**P<0.01，表示多肽处理组和PBS处理组相比有显著差异。

由图9可知，在浓度为20μM时，AeaeCec1、2、3、4和5中和了20.2％、12.5％、24.3％、40.9％和66.0％的LPS内毒素活性，此外，分别同时加入4μM时AeaeCec1、2、3、4和5时，除了最强的中和能力，这五种埃及伊蚊免疫多肽在中和LPS内毒素活性上具有协同效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 天蚕素多肽作为抗炎药物的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys

20 25 30

Ala Leu Arg Lys

35

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys

20 25 30

Ala Leu

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 3

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Val Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Lys Ala Ser Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Thr Gly Tyr Lys

20 25 30

Ala Ile

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 4

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Lys Ala Ser Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Val Gly Ile Lys

20 25 30

Ala Ile

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 5

Arg Trp Lys Phe Gly Lys Lys Leu Glu Lys Val Gly Lys Asn Val Phe

1 5 10 15

Asn Ala Ala Lys Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Tyr Lys Ala Leu

20 25 30

Claims (10)

1.天蚕素多肽作为抗炎药物的应用，其中，所述天蚕素多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5序列所示的天蚕素多肽的碳端酰胺化。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述天蚕素多肽抑制MAPKs和/或NF-κB信号通路的激活。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述天蚕素多肽抑制细胞产生一氧化氮和/或促炎细胞因子。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞为小鼠巨噬细胞、人外周血单核细胞、小鼠中性粒细胞或人中性粒细胞。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述促炎细胞因子为肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和白介素-6中的一种或几种。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞受脂多糖、革兰氏阴性菌、脂质胞壁酸或革兰氏阳性菌的刺激。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏伤寒杆菌和副溶血性弧菌中的一种或几种。

9.一种抗炎药物，其特征在于：包括天蚕素多肽，所述天蚕素多肽的氨基酸序列为SEQID No.1-SEQ ID No.5中的一种或几种。

10.根据权利要求9所述的抗炎药物，其特征在于：体外使用时，所述天蚕素多肽的浓度为1～5μM；体内使用时，所述天蚕素多肽的浓度为2～10mg/kg。