CN104826113B - 抑制间充质干细胞自噬在自身免疫性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制间充质干细胞自噬在自身免疫性疾病中的应用。具体而言，本发明涉及间充质干细胞自噬抑制剂的用途，用于制备增强间充质干细胞的免疫抑制能力的组合物；和/或用于制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物。本发明还涉及将安全有效量的间充质干细胞自噬抑制剂作为药物组合物的活性成分，并将其用于治疗自身免疫性疾病的方法。本发明抑制间充质干细胞自噬从而增强其免疫抑制功能的方法可应用于治疗自身免疫性疾病，其具有良好的应用前景和经济效益。

Description

抑制间充质干细胞自噬在自身免疫性疾病中的应用

技术领域

本发明涉及一种基于抑制间充质干细胞自噬增强其免疫抑制功能的方法，属于医药技术领域。

背景技术

自身免疫性疾病是一类机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，通常认为异常炎症反应发生在由各类自身免疫性疾病引发的组织损伤处，如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)，多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。RA的主要特征为滑膜炎症伴随有关节骨和软骨损伤，MS是以中枢神经系统的脱髓鞘现象为特征的一种炎症病变，SLE是一种由免疫复合物沉积。免疫系统慢性激活造成多系统自身免疫性疾病，并常常伴随有肾炎的发生。胶原诱导的类风湿性关节炎(collagen-induce arthritis，CIA)和实验性变态反应性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是由自身抗原诱导产生自身免疫性疾病的小鼠模型，分别对应于RA和MS。而MRL/lpr小鼠则是一种可以自发产生SLE的小鼠模型。

目前，对自身免疫性疾病的治疗措施包括使用免疫抑制剂、抗炎、调节细胞因子等。近年来，间充质干细胞也被广泛用于自身免疫性疾病的治疗中。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是纺锤体型、异质性的成体多能组织干细胞，广泛分布于动物体内骨髓、脂肪、肌肉、皮肤等组织中。目前，它被广泛用于治疗各种自身免疫性疾病，如多发性硬化(MS)/实验性变态反应性脑脊髓膜炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)、移植物抗宿主病、风湿性关节炎、感染性休克和骨损伤等。

体内炎症微环境对MSCs的免疫治疗功能而言非常重要，但人体内的微环境又是一个互相影响的极其复杂的网络。例如，微环境中的免疫细胞和炎症因子活化MSCs，诱导其免疫调节功能，从而发挥免疫治疗作用。然而，炎症微环境中的炎症细胞和炎症因子也会作用于MSCs，降低其免疫功能，减弱其对炎症性疾病的治疗效果。

因此，本领域迫切需要开发疗效确切、副作用小的预防或治疗自身免疫性疾病的方法，尤其是作用于细胞微环境的方法。

发明内容

本发明的目的是公开一种增强间充质干细胞免疫抑制功能的方法。

本发明第一方面，提供了一种间充质干细胞自噬抑制剂的用途，用于制备增强间充质干细胞的免疫抑制能力的组合物；和/或用于制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物组合物。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞自噬抑制剂包括3-甲基腺嘌呤、自噬相关基因和/或蛋白的拮抗剂。

在另一优选例中，所述自噬相关基因和/或蛋白的拮抗剂包括抗体、siRNA、miRNA、前体RNA等。

在另一优选例中，一种优选的拮抗剂是选自下组的核酸类抑制剂：

(a).siRNA；

(b).前体RNA，所述的前体RNA能在宿主内加工成(a)中所述的siRNA；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体RNA，并加工形成(a)中所述的siRNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的siRNA、或(b)中所述的前体RNA、或(c)中所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的核酸类抑制剂是干扰性RNA，如siRNA、miRNA、shRNA。

在另一优选例中，所述的拮抗剂序列如SEQ ID NO.:1(GGAGAAAGGCAAGATTGAAGA)所示的shRNA。

在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病是免疫过度(亢进)所导致的疾病。

在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、移植物抗宿主病、感染性休克、类风湿性关节炎、爆发性肝衰竭、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、或其组合。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带充质干细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括间充质干细胞自噬抑制剂和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞自噬基因包括Beclin-1。

在另一优选例中，所述的“增强间充质干细胞的免疫抑制能力”包括抑制T细胞的增殖和/或活化。

在另一优选例中，所述的T细胞包括CD4⁺T细胞。

在另一优选例中，所述抑制T细胞增殖和活化表现为CD25和CD69低表达。

本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括安全有效量的间充质干细胞自噬抑制剂和药学上可接受的载体。

本发明第三方面，提供了一种体外非治疗性的增强间充质干细胞对CD4⁺T细胞增殖或活化的抑制作用的方法，在间充质干细胞自噬抑制剂存在的条件下，共培养CD4⁺T细胞和间充质干细胞，从而增强间充质干细胞对CD4⁺T细胞增殖或活化的抑制作用。

本发明第四方面，提供了一种筛选免疫调节剂的方法，包括步骤：

(a)提供一试验组和一对照组，其中所述试验组中在测试物存在下，培养间充质干细胞，并观察间充质干细胞的自噬情况；而对照组是在所述测试物不存在且其他条件与测试组完全相同的条件下，培养间充质干细胞并观察间充质干细胞的自噬情况；

(b)比较所述试验组与所述对照组中的间充质干细胞的自噬情况，如果试验组的自噬显著高于对照组，则提示所述测试化合物是潜在的促进免疫的免疫调节剂；如果试验组的自噬显著低于对照组，则提示所述测试化合物是潜在的抑制免疫的免疫调节剂。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：将步骤(b)筛选出的潜在的促进免疫的免疫调节剂或抑制免疫的免疫调节剂，施用于动物，进一步观察其对免疫的调节作用。

在另一优选例中，所述方法还包括：进一步测试步骤(b)所筛选出的潜在的促进免疫的免疫调节剂或抑制免疫的免疫调节剂的毒副作用。

在另一优选例中，所述的“显著高于”是指M1/M2≥150％(较佳地≥200％，更佳地≥250％)，其中M1为试验组的自噬的细胞数量，M2为对照组的自噬的细胞数量。

在另一优选例中，所述的“显著低于”是指M1/M2≤75％(较佳地≤50％，较佳地≤33％)，其中M1为试验组的自噬的细胞数量，M2为对照组的自噬的细胞数量。

本发明第五方面，提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法，对需要的对象施用间充质干细胞自噬抑制剂或如本发明第二方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述自身免疫性疾病包括多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、移植物抗宿主病、感染性休克、类风湿性关节炎、爆发性肝衰竭、炎症性肠病或系统性红斑狼疮。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为EAE小鼠临床评分。图中，PBS为溶剂、shNC-MSCs为对照MSCs，shBecn1-MSCs为shRNA沉默自噬关键基因Beclin-1的抑制自噬MSCs，图1A为PBS、shNC-MSCs和shBecn1-MSCs的预防性处理方案，图1B为治疗性处理方案，图1C为使用自噬抑制剂3-Ma抑制MSCs自噬的治疗性处理方案。

图2为EAE小鼠脊髓髓鞘炎症细胞浸润情况和脱髓鞘情况。图中，图2A为PBS、shNC-MSCs或shBecn1-MSCs处理组EAE小鼠脊髓切片的苏木精-伊红染色和固蓝染色，图2B为PBS、shNC-MSCs或shBecn1-MSCs处理组EAE小鼠脊髓中浸润的单个核细胞计数。

图3为抑制自噬增强MSCs抑制EAE小鼠体内T细胞的活化。图中，图3A为流式细胞仪检测正常小鼠、PBS、shNC-MSCs或shBecn1-MSCs处理组小鼠脊髓和脾脏中CD4⁺T细胞上CD25和CD69表达水平；图3B为对图3A的统计分析。

图4为抑制自噬增强MSCs抑制EAE小鼠体内T细胞的增殖。图中，图4A为流式细胞仪检测正常小鼠、PBS、shNC-MSCs或shBecn1-MSCs处理组小鼠脊髓和脾脏中CD4⁺T细胞的增殖比率；图4B为免疫荧光分析正常小鼠、PBS、shNC-MSCs或shBecn1-MSCs处理组小鼠脊髓和脾脏中CD4⁺T细胞的增殖情况。

图5为抑制自噬增强MSCs对T细胞体外增殖的抑制功能。图中，图5A为CFSE法检测shNC-MSCs或shBecn1-MSCs与CD4⁺T细胞共培养后CD4⁺T细胞增殖情况；图5B为[3H]掺入法检测shNC-MSCs或shBecn1-MSCs与CD4⁺T细胞共培养后CD4⁺T细胞增殖情况。

图6为抑制自噬通过上调COX-2增强其对T细胞增殖的抑制功能。图中，图6A为实时定量的聚合酶链反应检测MSCs中COX-2的表达水平；图6B为免疫印迹检测MSCs中COX-2的表达水平；图6C为在shNC-MSCs或shBecn1-MSCs与CD4⁺T细胞共培养体系中加入COX-2抑制剂NS398，[3H]掺入法检测CD4⁺T细胞增殖情况。

图7为抑制自噬通过活化活性氧/细胞外信号调节激酶通路。图中，图7A为对流式细胞仪检测的MSCs中活性氧的平均荧光强度的统计分析；图7B和图7C为免疫印迹分析shNC-MSCs和shBecn1-MSCs中细胞外信号调节激酶的磷酸化水平

图8为抑制自噬通过活化活性氧/细胞外信号调节激酶通路上调COX-2。图中，图8A为实时定量的聚合酶链反应检测MSCs中COX-2的表达水平；图8B为在shNC-MSCs或shBecn1-MSCs与CD4⁺T细胞共培养体系中加入活性氧清除剂NAC或细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059，[3H]掺入法检测CD4⁺T细胞增殖情况。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，通过自噬抑制剂抑制间充质干细胞自噬，提高间充质干细胞对自身免疫性疾病(如多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、移植物抗宿主病、感染性休克、类风湿性关节炎、爆发性肝衰竭、炎症性肠病、系统性红斑狼疮)尤其是炎症亢进性的疾病的预防或治疗功能。本发明人通过进一步的实验发现，采用自噬抑制剂或自噬关键基因拮抗剂抑制间充质干细胞的自噬，能够抑制MSCs中活性氧/细胞外信号调节激酶通路，上调环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)，从而增强间充质干细胞对T细胞(尤其是CD4⁺T细胞)体内外增殖的免疫抑制能力。

自噬

自噬是细胞内一个稳态调节过程，细胞的自噬广泛存在于生物体内，人体约50％的细胞存在着自噬现象。自噬通过一个精确调节的方式降解胞内受损或过剩细胞器、受损蛋白或长寿命蛋白与大分子及其它成分，为细胞在饥饿环境下提供营养，促进细胞在各种压力环境下存活或抵抗一些病原体感染。

细胞自噬受多种环境和免疫信号调节，饥饿、生长因子耗竭、能量缺乏、内质网压力、病原体感染和一些免疫相关信号，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等炎症因子，可诱导细胞自噬，而营养充足、胰岛素和白细胞介素-4等可抑制细胞自噬。

自噬对各种细胞的存活、增殖和分化发挥重要的调节作用。研究发现，IFN-γ诱导小鼠胚胎成纤维细胞的自噬抑制胞内ROS的产生，从而促进IFN-γ诱导的细胞炎症反应。TNF-α通过诱导人骨骼肌细胞自噬上调MHC II类分子，促进骨骼肌细胞的抗原递呈。LPS通过TLR4/HO-1依赖方式诱导小鼠巨噬细胞自噬，抑制其炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌，而阻断自噬可增加其炎症因子的释放。LPS还可通过TLR4/HO-1/p38通路诱导小鼠原代肝细胞自噬，从而抑制LPS诱导的肝细胞死亡。病原体成分MDP通过NOD2受体诱导DCs自噬，这种NOD2介导的自噬可增强DCs对病原体成分的处理能力和其MHC II类分子介导的抗原递呈能力，而克罗恩病患者的DCs上NOD突变或缺失导致不能诱导其自噬，导致细菌不能被清除而持续存在。DCs与T细胞之间形成的免疫脂筏可诱导DCs自噬，进而抑制T细胞的活化和TH17细胞反应。T细胞活化信号可诱导其自噬对Bcl10进行选择性降解，而Bcl10的降解会抑制T细胞NF-κB信号通路，对T细胞炎症反应发挥负反馈调节。此外，病原体双链DNA可诱导AIM2炎症小体和自噬，而自噬会抑制炎症小体活性，减少IL-1β的分泌，从而对炎症反应起抑制作用。而我们研究发现，炎症微环境中炎症因子活化MSCs，上调其免疫功能的同时诱导MSCs自噬；然而，自噬对MSCs的免疫功能发挥负性调节作用，抑制其过强的免疫抑制功能。

间充质干细胞自噬抑制剂

如本文所用，“间充质干细胞自噬抑制剂”指能够起到抑制间充质干细胞自噬作用的制剂。

可用于本发明的间充质干细胞自噬抑制剂没有特别限制，优选的例子有：间充质干细胞自噬基因和/或蛋白的拮抗剂，例如间充质干细胞自噬基因或蛋白具有抑制作用的抑制性mRNA、抗间充质干细胞自噬蛋白抗体、间充质干细胞自噬基因核酸的反义RNA、miRNA(microRNA)、siRNA、shRNA，间充质干细胞自噬抑制剂还可包括用于抑制间充质干细胞自噬活性的小分子化合物。

一种优选的间充质干细胞自噬抑制剂是自噬抑制基因的siRNA或shRNA，较佳地，如SEQ ID NO.:1所示。

另一种优选的间充质干细胞自噬抑制剂为小分子化合物，如3-MA。当然，本发明间充质干细胞自噬抑制剂还可包括其他来源的具有抑制间充质干细胞自噬抑制作用的物质，其中，优选为特异性较高的间充质干细胞自噬抑制剂。

活性氧/细胞外信号调节激酶通路

活性氧是一组能够氧化蛋白质、脂质和DNA的小分子，包括超氧自由基(·O₂-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(·OH)等。细胞内一定水平的活性氧对维持多种信号通路的活化起重要作用，这些分子通过直接氧化信号分子关键位点，从而激活或抑制其功能，参与信号通路调节，进而调控基因表达、炎症反应和细胞存活。研究发现，活性氧能诱导细胞自噬，自噬反过来能对活性氧产物进行清除。大量活性氧通过caspase依赖的途径诱导细胞凋亡，也可通过失活caspase，直接导致细胞坏死96。也有研究报道，活性氧通过活化NF-κB和细胞外信号调节激酶通路通路上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl，从而抑制细胞凋亡

COX-2

环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)又称前列腺素内氧化酶还原酶,是一种双功能酶，具有环氧化酶和过氧化氢酶活性，是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶。目前发现环氧化酶有两种COX-1和COX-2同工酶，前者为结构型，主要存在于血管、胃、肾等组织中，参与血管舒缩、血小板聚集、胃粘膜血流、胃黏液分泌及肾功能等的调节，其功能与保护胃肠黏膜、调节血小板聚集、调节外周血管的阻力和调节肾血流量分布有。后者为诱导型，各种损伤性化学、物理和生物因子激活磷脂酶A2水解细胞膜磷脂，生成花生四烯酸，后者经COX-2催化加氧生成前列腺素。其中，前列腺素e2能诱发炎症，促进局部血管扩张，毛细血管通透性增加，引起红、肿、痛、热等症状。然而，目前大量研究发现，前列腺素e2能够抑制T细胞的活化和增殖，从而对适应性免疫应答产生抑制作用。

本发明人发现，采用自噬抑制剂或自噬关键基因拮抗剂抑制间充质干细胞的自噬，能够抑制MSCs中活性氧/细胞外信号调节激酶通路，上调环氧化酶2(cyclooxygenase2,COX-2)，从而增强间充质干细胞对T细胞(尤其是CD4⁺T细胞)体内外增殖的免疫抑制能力。

自身免疫性疾病

如本文所用，“自身免疫性疾病”指的是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。

优选地，本发明所述“自身免疫性疾病”包括(但不限于)多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、移植物抗宿主病、感染性休克、类风湿性关节炎、爆发性肝衰竭、炎症性肠病、系统性红斑狼疮。其中，多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性自身免疫性神经系统脱髓鞘性疾病。

EAE是一种常用模拟人MS的疾病模型。目前研究认为，MS/EAE脱髓鞘的机制主要是由自身反应性T细胞在外周活化，迁移进入中枢神经系统后接受局部抗原递呈细胞递呈抗原而再次活化，产生大量炎症因子，如IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和IFN-γ等，造成髓鞘损伤，从而导致肢体瘫痪。因此，EAE可在动物实验中作为多种由免疫亢进造成的自身免疫性疾病的病理模型。

此外，目前还有常用于自身免疫性疾病研究动物模型还包括：移植物抗宿主病、感染性休克、类风湿性关节炎、爆发性肝衰竭、炎症性肠病、系统性红斑狼疮等各种疾病的对应模型动物。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的间充质干细胞自噬抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-毫克/千克体重。

药物筛选方法

本发明还提供了一种筛选潜在的免疫调节剂的方法。包括步骤：

(a)提供一试验组和一对照组，其中所述试验组中在测试物存在下，培养间充质干细胞，并观察间充质干细胞的自噬情况；而对照组是在所述测试物不存在且其他条件与测试组完全相同的条件下，培养间充质干细胞并观察间充质干细胞的自噬情况；

(b)比较所述试验组与所述对照组中的间充质干细胞的自噬情况，如果试验组的自噬显著高于对照组，则提示所述测试化合物是潜在的促进免疫的免疫调节剂；如果试验组的自噬显著低于对照组，则提示所述测试化合物是潜在的抑制免疫的免疫调节剂。

此外，还可将步骤(b)筛选出的潜在的促进免疫的免疫调节剂或抑制免疫的免疫调节剂，施用于动物，进一步观察其对免疫的调节作用或进一步测试步骤(b)所筛选出的潜在的促进免疫的免疫调节剂或抑制免疫的免疫调节剂的毒副作用。

其中，所述的“显著高于”是指M1/M2≥150％(较佳地≥200％，更佳地≥250％)，其中M1为试验组的自噬的细胞数量，M2为对照组的自噬的细胞数量；所述的“显著低于”是指M1/M2≤75％(较佳地≤50％，较佳地≤33％)，其中M1为试验组的自噬的细胞数量，M2为对照组的自噬的细胞数量。

本发明有益效果

1.抑制间充质干细胞自噬增强其免疫抑制功能效果确切，可更好地应用于自身免疫性疾病的治疗。

2.间充质干细胞体外易培养、扩增，免疫原性低，且具有免疫抑制功能，用于治疗炎症性疾病安全有效，抑制自噬进一步增强其免疫抑制功能。

3.抑制间充质干细胞自噬方法易行可靠安全，在应用于治疗自身免疫性疾病中具有良好的前景和经济效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料

实验用C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海交通大学医学院实验动物中心。

间充质干细胞为小鼠骨髓来源，使用代数在5到15代之间。

实施例1

抑制间充质干细胞自噬增强其对实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)的免疫抑制能力

方法：取6-8周龄小鼠随机分组，使用合成髓鞘蛋白肽段进行免疫，建立实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)动物模型。于建模第3天和第8天分别使用溶剂(PBS)、对照MSCs(shNC-MSCs)和抑制自噬MSCs(shBecn1-MSCs)进行预防性处理，并于建模第10天和第15天分别使用PBS、shNC-MSCs和shBecn1-MSCs进行治疗性处理，观察三组小鼠的发病情况。

评分标准：0分为不发病；1分为尾巴无力；2分为轻微后肢无力；3分为严重后肢麻痹；4分为四肢麻痹；5分为濒死或死亡。

结果：沉默Beclin-1表达的抑制自噬处理组小鼠疾病评分在预防性处理(见图1A)和治疗性处理方案中(见图1B)均显著低于对照MSCs处理组，且自噬抑制剂3-Ma预处理MSCs处理组小鼠疾病评分也显著低于对照MSCs处理组(见图1C)。对小鼠脊髓病理切片染色分析显示，抑制MSCs自噬处理组小鼠脊髓中浸润炎症细胞明显少于对照MSCs处理组(见图2A，2B)，且小鼠脊髓脱髓鞘情况也有更好的缓解(见图2A)。

结论：抑制间充质干细胞自噬，能够增强其对实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)的免疫抑制能力。

实施例2

抑制MS自噬对CD4⁺T细胞的作用检测

方法：根据实施例1的结果进一步测定抑制MS自噬对CD4⁺T细胞的作用，即检测分析PBS、shNC-MSCs和shBecn1-MSCs处理组EAE小鼠CD4⁺T细胞，

结果：实验发现，shBecn1-MSCs处理组EAE小鼠CD4⁺T细胞活化水平显著低于shNC-MSCs处理组，表现为T细胞活化标记CD25和CD69的表达水平低于shNC-MSCs处理组(见图3A，3B)。

检测CD4⁺T细胞体内增殖情况后，发现shBecn1-MSCs处理组EAE小鼠靶器官脊髓和外周免疫器官脾脏中BrdU+的CD4⁺T细胞，即增殖中的CD4⁺T细胞，明显少于shNC-MSCs处理组(见图4A)。

进一步使用免疫荧光分析发现，相比于shNC-MSCs处理组，shBecn1-MSCs处理组EAE小鼠脊髓中浸润CD4⁺T细胞(灰色箭头)明显较少，且增殖的CD4⁺T细胞更少(白色箭头)；脾脏中增殖的CD4⁺T细胞也显著少于shNC-MSCs处理组(见图4B)。

结论：实验表明抑制MSCs自噬能增强其抑制CD4⁺T细胞的体内活化和增殖。

实施例3

抑制自噬能够增强间充质干细胞免疫抑制功能

方法：将活化的CD4⁺T细胞与shNC-MSCs和shBecn1-MSCs共培养，使用CFSE法和3H掺入法检测T细胞增殖情况，并使用实时定量聚合酶链反应检测MSCs发挥免疫抑制功能的效应分子的表达水平。

结果：CD4⁺T细胞与MSCs的比例从10：1到50：1，shBecn1-MSCs均能较shNC-MSCs更强地抑制CD4⁺T细胞的增殖(见图5A，5B)。

实验表明，抑制自噬后COX-2的mRNA表达上调，且在炎症因子TNF-α和IFN-γ联合刺激下COX-2的表达进一步上调(见图6A)，进一步使用免疫印迹法在蛋白质水平证实了该结果(见图6B)。

实施例4

MSC上调COX-2从而抑制CD4⁺T细胞增殖及其机制研究

4.1方法：在T细胞与MSCs共培养体系中加入COX-2抑制剂NS398(购自Sigma-Aldrich)。

结果：MSCs对CD4⁺T细胞增殖的抑制效应很大程度地减弱，且shBecn1-MSCs增强的免疫抑制效应被完全阻断(见图6C)。

4.2抑制自噬对信号通路的影响

方法：在shNC-MSCs和shBecn1-MSCs培养体系中加入TNF-α和IFN-γ，和(或)活性氧清除剂NAC(购自Sigma-Aldrich)，使用流式细胞仪检测活性氧水平，

结果：研究发现抑制自噬后MSCs内活性氧产生增加，在TNF-α和IFN-γ联合刺激下进一步增加(见图7A)，同时抑制自噬后细胞内细胞外信号调节激酶磷酸化水平显著升高，在TNF-α和IFN-γ联合刺激下进一步上升(见图7B)。

在shNC-MSCs和shBecn1-MSCs培养体系中加入活性氧清除剂NAC，本发明人发现细胞内细胞外信号调节激酶的磷酸化水平明显被抑制(见图7C)，说明抑制自噬会活化活性氧/细胞外信号调节激酶通路。

4.3使用TNF-α和IFN-γ联合刺激shNC-MSCs和shBecn1-MSCs，并加入ERK抑制剂PD98059(购自Merck)和活性氧清除剂NAC。实时定量聚合酶链反应结果显示，TNF-α和IFN-γ联合诱导的COX-2的上调被完全抑制(见图8A)。

为验证抑制自噬增强MSCs的免疫抑制功能是通过活化ROS/ERK通路实现的，在T细胞与MSCs共培养体系中加入PD98059和NAC，发现MSCs对CD4⁺T细胞增殖的抑制效应很大程度地被阻断，且shBecn1-MSCs增强的免疫抑制效应被完全阻断(见图8B)。

这表明，抑制MSCs自噬通过活化活性氧/细胞外信号调节激酶通路上调COX-2的表达，从而增强MSCs对T细胞增殖的抑制功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，凡是依据本发明原理对以上方案所做的任何简单修改、改进与润饰，均属于本发明技术方案的范围内。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种间充质干细胞特异性自噬抑制剂的用途，其特征在于，用于制备增强间充质干细胞的免疫抑制能力的组合物；和/或用于制备活化活性氧/细胞外信号调节激酶通路的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的特异性间充质干细胞自噬抑制剂包括间充质干细胞自噬相关基因和/或蛋白的拮抗剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述间充质干细胞自噬相关基因和/或蛋白的拮抗剂包括抗体、siRNA、miRNA、前体RNA等。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述拮抗剂是选自下组的核酸类抑制剂：

(a).siRNA；

(b).前体RNA，所述的前体RNA能在宿主内加工成(a)中所述的siRNA；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体RNA，并加工形成(a)中所述的siRNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的siRNA、或(b)中所述的前体RNA、或(c)中所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的核酸类抑制剂是干扰性RNA，如siRNA、miRNA、shRNA。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂序列如SEQ ID NO.:1(GGAGAAAGGCAAGATTGAAGA)所示的shRNA。

7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，间充质干细胞的自噬抑制还用于治疗自身免疫性疾病。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性疾病是免疫过度即亢进所导致的疾病。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、移植物抗宿主病、感染性休克、类风湿性关节炎、爆发性肝衰竭、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、或其组合。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带充质干细胞、或其组合。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括特异性间充质干细胞自噬抑制剂和药学上可接受的载体。

12.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的间充质干细胞自噬基因包括Beclin-1基因。

13.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的“增强间充质干细胞的免疫抑制能力”包括抑制T细胞的增殖和/或活化。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的T细胞包括CD4⁺T细胞。

15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述抑制T细胞增殖和活化表现为CD25和CD69低表达。

16.一种体外非治疗性的增强间充质干细胞对CD4⁺T细胞增殖或活化的抑制作用的方法，其特征在于，在间充质干细胞自噬抑制剂存在的条件下，共培养CD4⁺T细胞和间充质干细胞，从而增强间充质干细胞对CD4⁺T细胞增殖或活化的抑制作用。

17.一种筛选免疫调节剂的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一试验组和一对照组，其中所述试验组中在测试物存在下，培养间充质干细胞，并观察间充质干细胞的自噬情况；而对照组是在所述测试物不存在且其他条件与测试组完全相同的条件下，培养间充质干细胞并观察间充质干细胞的自噬情况；

(b)比较所述试验组与所述对照组中的间充质干细胞的自噬情况，如果试验组的自噬显著高于对照组，则提示所述测试化合物是潜在的促进免疫的免疫调节剂；如果试验组的自噬显著低于对照组，则提示所述测试化合物是潜在的抑制免疫的免疫调节剂。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的“显著高于”是指M1/M2≥150％，其中M1为试验组的自噬的细胞数量，M2为对照组的自噬的细胞数量。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的“显著低于”是指M1/M2≤75％，其中M1为试验组的自噬的细胞数量，M2为对照组的自噬的细胞数量。