CN110484556B - 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途 - Google Patents

一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110484556B
CN110484556B CN201810456822.9A CN201810456822A CN110484556B CN 110484556 B CN110484556 B CN 110484556B CN 201810456822 A CN201810456822 A CN 201810456822A CN 110484556 B CN110484556 B CN 110484556B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vector
atg5
silencing
gfp
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810456822.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110484556A (zh
Inventor
彭杰军
鲁宇文
燕飞
陈思涵
郑红英
林林
程晔
陈剑平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201810456822.9A priority Critical patent/CN110484556B/zh
Publication of CN110484556A publication Critical patent/CN110484556A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110484556B publication Critical patent/CN110484556B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种Atg5的瞬时沉默载体的用途。本发明通过将Atg5瞬时沉默载体与内质网、线粒体、过氧化物酶体或质体的GFP表达载体共浸润，揭示Atg5瞬时沉默载体在缓解不同细胞器定位的蛋白降解方面的用途。本发明所述的Atg5瞬时沉默载体能够作用于细胞器区域，促进细胞器外源蛋白的积累。本发明表明siatg5沉默的自噬途径涉及内质网、质体、线粒体、过氧化物酶体等绝大多数细胞场所，siatg5沉默载体可能对植物细胞中的多种场所、细胞器的自噬途径具有调节作用。本发明对于阐明Atg5基因所调控的自噬途径在影响外源蛋白表达方面的分子机理具有重要意义，对提高以植物作为生物反应器的外源蛋白的表达具有指导意义。

Description

一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种自噬途径关键基因Atg5的瞬时沉默载体。该沉默载体能够导致Atg5基因沉默，抑制自噬途径，缓解不同细胞器定位的蛋白的降解，从而促进外源蛋白的积累。
背景技术
利用基因重组技术，通过将生物体作为生物反应器来表达和生产外源蛋白是当前生物技术研究的热点问题。常用的外源蛋白表达系统主要有原核表达、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统等，不同的表达系统具有不同的表达特征。与其他表达系统相比，植物表达系统具有以下优点：(1)植物作为真核生物，具有真核蛋白的修饰机制，能够进行蛋白折叠、翻译后修饰，从而表达高生物活性的目的蛋白；(2)没有哺乳动物病原的污染，几乎不受病原菌感染，产品具有较高的安全性；(3)植物的生产成本低廉，其总体生产成本大概为微生物的2％-10％，为动物的0.1％；(4)植物表达产品的分离纯化成本相对较低，适用于大规模生产；(5)便于外源蛋白贮存，外源蛋白可以贮存在种子、果实等部位。因此，以植物表达系统作为生物反应器来表达外源蛋白越来越引起国内外研究者的重视。植物表达系统常用于具有重要经济价值的药用蛋白或疫苗的制备，目前已利用普通烟、本氏烟、水稻细胞等细胞或植株成功表达了鼠IgG1抗体、hGM-CSF、人类VEGF等，产生了较高的经济价值。然而植物表达系统仍然存在目标蛋白表达量低下的问题，该问题是制约植物表达系统产业化的主要因素之一。
自噬途径(Autophagy)是普遍存在于生物体内的重要蛋白降解途径，主要通过细胞内双层膜凹陷形成囊泡结构后，与溶酶体(lysosome)融合成为自噬溶酶体(autolyosomes)执行降解功能。在胁迫条件下，通过自噬途径可以将一些胞质内容物包括多余或者受损的蛋白质和细胞器送入液泡中进行降解，并加以循环利用，从而维持细胞内稳态，并帮助生命体抵抗外界胁迫环境。根据形成自噬体的方式不同可以将自噬分为三类：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和伴侣参与的自噬(Chaperone-mediated autophagy)，而在植物中只发现巨自噬和微自噬。
植物中，多种自噬相关基因(autophagy-related genes,ATG)参与自噬途径，植物中自噬途径涉及30多个蛋白，其中,Atg5是参与自噬途径的重要基因，在植物体内仅发现一个，它参与Atg8介导的泛素化系统，是自噬途径的重要调节基因。自噬途径检测研究表明，Atg8被Atg4、Atg3、Atg7等切割修饰后，形成成熟的Atg8后与Atg5-Atg12-Atg16复合体协作，最终形成自噬囊泡。在这个过程中，Atg5通过与Atg12、Atg16L1互作形成复合体，附着在未成熟的自噬体外膜上指导自噬体的成熟，由此可见，沉默Atg5可以抑制自噬途径。
目前，针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的siRNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默，是RNA干扰技术最广泛的应用。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种Atg5瞬时沉默载体，即siatg5沉默载体，该载体可以特异沉默Atg5而不能对其它基因造成沉默，为深入研究该基因单独的功能提供可能性。另外，选在不同位置的片段进行沉默，发现可以实现精确定位细胞器的沉默片段，为揭示Atg5基因在细胞器水平上的作用机理提供了可能。
该沉默载体包括元双表达载体以及插入所述双元表达载体的SL片段和SS片段。由于两个片段长度不同，农杆菌瞬时表达后产生单链发夹结构，该结构通过RNA沉默途径切割产生siRNAs，从而导致Atg5沉默，得到siatg5沉默载体。
载体的构建主要包括如下步骤：
(1)根据Nb-Atg5基因序列设计SL片段和SS片段扩增引物；
(2)PCR扩增产物分别构建T-SL、T-SS载体；
(3)双酶切T-SS和双元表达载体，连接得到重组质粒；
(4)双酶切步骤(3)得到的重组质粒和T-SL，进行连接；
(5)将步骤(4)得到的连接产物转化至农杆菌感受态细胞，筛选得到阳性克隆，提取质粒，得到沉默载体；
在一些优选方式中，所述SL片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SS片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在一些优选方式中，所述SL片段由编码为KX369397.1，全长1116bp的Atg5基因序列的第63-552位核苷酸组成，包括490bp碱基；所述SS片段由编码为KX369397.1，全长1116bp的Atg5基因序列的第63-476位核苷酸组成，包括414bp碱基。
在一些优选方式中，所述SS片段与双元表达载体的连接为反向连接；所述SL片段与双元表达载体的连接为正向连接。
在一些优选方式中，所述获得SL片段引物的碱基序列如下：
正向引物序列是5’-GGGATCCACTACAGATTCACCTTCATAAA-3’；
反向引物序列是5’-GGGTACCATCCACTAATAGGCCAAGTTTAA-3’；
所述获得SS片段引物的碱基序列如下：
正向引物序列是5’-GGGTACCCAGAGTTCTAATTGGTCAGGTT-3’；
反向引物序列是5’-GGAGCTCACTACAGATTCACCTTCATAAA-3’。
另一方面，本方面提供一种Atg5瞬时沉默载体在缓解细胞器定位的蛋白降解的用途，该沉默载体能够作用于细胞器，促进细胞器外源蛋白的表达。
主要采用如下技术步骤：
1、构建Atg5瞬时沉默载体；
2、将绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)与细胞器定位信号肽融合构建细胞器-GFP表达载体。
3、将Atg5瞬时沉默载体与细胞器-GFP表达载体共浸润。
在一些优选方式中，所述细胞器分别为内质网、线粒体、过氧化氢物体和质体。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明利用基因沉默技术，首次从Atg5靶基因片段筛选到Atg5基因的两段特异性沉默片段SL和SS，通过RNAi技术构建Atg5的瞬时沉默载体，该沉默载体能有效沉默Atg5基因表达，抑制自噬途径。
本发明所构建的瞬时沉默载体能够作用于细胞器，缓解不同细胞器定位的蛋白的降解，促进不同细胞器外源蛋白的表达。本发明首次公开了Atg5瞬时沉默载体在缓解不同细胞器定位的蛋白降解方面的用途，本发明对于阐明Atg5基因所调控的自噬途径在影响外源蛋白表达方面的分子机理具有重要意义，对提高以植物作为生物反应器的外源蛋白的表达具有指导意义。
附图说明
图1是siatg5沉默载体构建，其中，图A)表示siatg5构建策略，图B)表示siatg5构建载体图谱。
图2是pCV1300构建策略。
图3是NbAtg5沉默特异性序列区段分析。
图4是与NbAtg5同源性较高的Niben101Scf02433g01001.1保守区域分析。
图5是siatg5载体沉默效果的检测。
图6是sinb1001载体沉默效果的检测。
图7是siatg5载体抑制自噬途径效果的检测。
图8是siatg5促进内质网定位的蛋白的表达。
图9是siatg5促进线粒体定位的蛋白的表达。
图10是siatg5促进过氧化物酶体定位的蛋白的表达。
图11是siatg5促进质体定位的蛋白的表达。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 pCV1300双元表达载体的改造
本发明选择pCV1300作为沉默载体构建的双元表达载体，其结构图如图2所示。
将质粒pCAMBIA1300和PBI121质粒利用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121的35S-GUS-NOS区段连入pCAMBIA1300载体构成pCV1300载体。
实施例2 siatg5沉默载体构建
1、目的片段的筛选
筛选具有发夹结构的RNA干扰基因沉默片段的方法为：
根据NCBI(KX369397.1，全长1116bp)的Nb-Atg5基因序列(SEQ ID No.3)，将其分割成长度约为300-500bp的连续核苷酸短片段，通过http://vigs.solgenomics.net/分析可能的特异沉默区段为1-300bp序列，但序列分析显示Niben101Scf02433g01001.1(简称Nb1001，该序列与Atg5同源性较高，也具有Autophagy protein Apg5结构域，但基因功能未知)基因序列(SEQ ID No.4)与NbAtg5从450-1000左右区段保守性较高(图3)。并根据NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)分析进一步确认NbAtg5与Niben101Scf02433g01001.1的保守区域集中在450-1000bp区段(图4)。
分别选取NbAtg5的63-552bp区段、Nb1001的500-1000bp区段进行分析：
(1)SL片段为63-552bp区段，包括490bp碱基；SS片段为63-476bp区段，包括414bp碱基；
(2)SL片段为500-1000bp区段，包括501bp碱基；SS片段为500-950bp区段，包括451bp碱基；
2、引物设计及目的片段的合成
根据选择的特异沉默片段设计引物，通过PCR扩增特异沉默Atg5基因的RNA干扰基因沉默片段。并在相应片段引物对的两侧分别依次添加特异性酶切位点，以便将扩增获得的RNA干扰片段连接到双元表达载体中特定的克隆位点以形成发夹结构。
PCR反应体系和扩增程序如下：
反应体系为：10×PrimeSTAR buffer 6μL，dNTPs 6μL，上下游检测引物各0.5μL，模板DNA 0.5μL，Prime STAR DNA聚合酶0.5μL，水46.5XXμL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，68℃延伸15sec，40个循环后，72℃继续延伸15sec。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳得到目的基因片段，回收纯化目的片段，并对回收片段进行测序。
3、载体连接
PCR扩增产物采用凝胶电泳分离回收后，分别与两个独立的
Figure BDA0001659881890000041
EasyVector(商业购买)连接，构建得到T-SL和T-SS；双酶切T-SS和pCV1300，T4DNA ligase反向连接形成pCV1300-SS；进一步双酶切T-SL和pCV1300-SS，T4DNA ligase正向连接形成pCV1300-SL-SS，所构建的载体即为siatg5。最终形成的siatg5载体为SL的正义链与SS的负义链相连接，由于SL片段与SS片段长度不同，反向重复配对后SL-SS单链形成一个发夹结构，其构建策略如图1A)所示。
酶切反应体系为：质粒30μL，相对应的内切酶酶切缓冲液6μL，限制性内切酶各2μL，水20μL。
将载体质粒或者PCR产物在所用限制性内切酶的最适温度下进行酶切约12小时。将酶切反应完成后得到的产物在1％(v/w)琼脂糖凝胶中分离并回收所需要的片段以备连接用。
连接反应总体积20μL，目的基因与载体比为15：2，T4DNA连接酶1U，16℃连接12～16h。
4、农杆菌瞬时表达
将构建好的载体加入农杆菌感受态细胞中，siatg5农杆菌浸润后第3天，筛选阳性菌落，提取总RNA反转录后，进行酶切验证。
进一步地，以UBC为内参，通过半定量检测NbAtg5和Nb1001mRNA表达水平来验证基因沉默效果。
从图5可以看出，SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段时，所构建的siatg5沉默载体使得atg5mRNA明显下调，与其同源性较近的Nb1001没有明显沉默，说明该沉默载体能够导致Atg5基因沉默，沉默效果显著。
从图6可以看出，SL片段为500-1000bp区段，SS片段为500-950bp区段时，所构建的sinb1001沉默载体使得NbAtg5和Nb1001mRNA均有下调，说明该沉默载体可以导致Atg5和Nb1001基因沉默，不具有特异性。
以上结果说明，SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段可以形成较好的发夹结构，并产生小RNA导致Atg5基因沉默，并显示出更强的特异性，本发明所选择的区域可以获得特异的沉默载体，其能有效特异沉默Atg5基因。
实施例3 GFP-Atg8f能作为自噬途径的指示蛋白的验证
Atg8在不同物种中具有数量各异的同源物，拟南芥、本氏烟中Atg8f是监测自噬途径的有效蛋白。由于GFP对pH较为敏感，瞬时表达GFP-Atg8f后，被修饰的GFP-Atg8f与其他自噬蛋白协作形成自噬囊泡，随后与Atg8f融合的GFP蛋白在酸性环境下被切割释放到细胞质，因此通过检测游离GFP(Cleave GFP)的蛋白表达量便能检测自噬途径的激活水平。
MV(methyl viologen)是自噬途径诱导剂，MV处理能激活自噬途径，因此通过利用MV处理来验证GFP-Atg8f是否能够作为自噬途径的指示蛋白。根据XM_016638904.1序列，扩增获得本氏烟Atg8f序列(SEQ ID No.5)，以pCV1300为载体，利用巢式PCR融合的GFP与Atg8f序列后，BamHI、SalI双酶切连入pCV1300载体，命名为GFP-Atg8f。
在GFP-Atg8f农杆菌瞬时转染2天后，以水为对照组、40μM MV为处理组分别进行实验处理，12h后采用Western检测GFP-Atg8f表达变化，利用ImageJ分析Cleave GFP与GFP-Atg8f的蛋白表达量。从图7可以看出，MV处理组Cleave GFP/GFP-Atg8f的比值为0.84，对照组Cleave GFP/GFP-Atg8f的比值为0.29，结果表明MV处理后GFP-Atg8f产生的Cleave GFP明显高于对照组，说明GFP-Atg8f可以作为自噬途径的指示蛋白。
实施例4 siatg5沉默载体对自噬途径抑制作用的检测
为检测siatg5沉默载体对自噬途径的影响，以空载体gus+GFP-Atg8f为对照，siatg5+GFP-Atg8f为处理组，农杆菌瞬时转染2天后，用40μM MV处理12h，采用Western检测GFP-Atg8f表达变化，利用ImageJ分析Cleave GFP与GFP-Atg8f的蛋白表达量。
从图7可以看出，对照组Cleave GFP/GFP-Atg8f的比值为0.69，siatg5沉默载体(SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段)处理组Cleave GFP/GFP-Atg8f的比值为0.38，说明对照组经MV处理后自噬途径被诱导，而处理组经MV处理后未能有效诱导自噬途径。由此可知该siatg5沉默载体能有效抑制自噬途径。反之，如果siatg5不被沉默，MV可以有效诱导自噬途径。
实施例5 siatg5沉默载体促进内质网定位蛋白的表达
1、内质网GFP表达载体的构建
根据(http://nebenfuehrlab.utk.edu/markers/default.htm)提供的已确认的内质网定位信号肽序列，以本实验室改造的pCV1300为载体，GFP的C末端融合ER信号肽后双酶切构建ER-GFP。
根据ER信号肽(HDEL)设计引物，在上下引物的5’端分别引入BamH I和SacI酶切位点。所述ER信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述ER-GFP正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
反应体系为：10×PrimeSTAR buffer 6μL，dNTPs 6μL，上下游检测引物各0.5μL，模板DNA 0.5μL，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL，水46.5XXμL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，68℃延伸15sec，40个循环后，72℃继续延伸15sec。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳得到目的基因片段，回收纯化目的片段，并对回收片段进行测序。
酶切反应体系为：质粒30μL，相对应的内切酶酶切缓冲液6μL，限制性内切酶各2μL，水20μL。
将载体质粒或者PCR产物在所用限制性内切酶的最适温度下进行酶切约12小时。将酶切反应完成后得到的产物在1％(v/w)琼脂糖凝胶中分离并回收所需要的片段以备连接用。
连接反应总体积20μL，目的基因与载体比为15：2，T4DNA连接酶1U，16℃连接12～16h。
2、siatg5与ER-GFP共浸润
将构建的siatg5与ER-GFP共浸润(OD600＝0.500)，以sigus+ER-GFP为对照组，以Actin作为内参蛋白，利用荧光显微镜观察及Western blotting检测第2-4天GFP的分泌表达情况。
从图8可以看出，siatg5沉默载体(SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段)处理后GFP蛋白表达量明显高于对照组，第4天处理组GFP表达量与对照组第2天表达量相似。
结果表明该沉默载体能够有效缓解内质网定位的蛋白降解，促进内质网定位的外源蛋白的表达。反之，可以确定，Atg5对于调节自噬途径的启动可能发生于内质网，至少证明细胞中内质网是自噬途径的一个重要场所。虽然通过载体可以使某些功能基因沉默，但是本发明的沉默载体导致atg5沉默，造成自噬途径受到抑制，从而缓解定位于某一具体细胞器上的蛋白降解延缓。一般认为植物中微自噬是通过液泡膜内陷包裹胞内物质发生降解作用，巨自噬则是形成双层膜的自噬小泡，通过在细胞膜上进行受体结合从而引起信号的传导。但是本发明揭示了，siatg5的抑制自噬作用能够发生在内质网，可能Atg5引起的自噬至少与内质网有关。由于内质网是蛋白合成的主要场所，外源蛋白定位于内质网也是目前增加外源蛋白表达的重要策略。由于外源蛋白在内质网过度表达会引起胁迫，激活自噬途径并降解外源蛋白。因此通过siatg5来抑制内质网定位的外源蛋白的降解，有利于外源蛋白的进一步积累。
实施例6 siatg5沉默载体促进线粒体定位蛋白的表达
1、线粒体GFP表达载体的构建
根据(http://nebenfuehrlab.utk.edu/markers/default.htm)提供的已确认的线粒体定位信号肽序列，以本实验室改造的pCV1300为载体，GFP的N末端融合Mt信号肽后双酶切构建Mt-GFP。
根据Mt信号肽(LSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLLQQKP)设计引物，在上下引物的5’端分别引入BamH I和SacI酶切位点。所述Mt信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述Mt-GFP正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。
PCR扩增反应及连接反应程序同实施例5。
2、siatg5与Mt-GFP共浸润
将构建的siatg5与Mt-GFP共浸润(OD600＝0.500)，以sigus+Mt-GFP为对照组,以Actin作为内参蛋白，利用荧光显微镜观察及Western blotting检测第2-4天GFP的分泌表达情况。
从图9可以看出，siatg5沉默载体(SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段)处理后siatg5+Mt-GFP共浸润第3天蛋白表达量高于对照样品。对照样品第3天蛋白已经发生降解，而siatg5处理组仍然继续表达蛋白。说明该沉默载体能够有效缓解线粒体定位的蛋白降解，促进线粒体定位的外源蛋白的表达。
目前研究表明线粒体也是自噬囊泡形成和作用的重要场所，线粒体定位蛋白大量表达，细胞为保持内环境的平衡会激活自噬途径，并降解外源蛋白，从而限制线粒体定位的外源蛋白积累。通过siatg5抑制自噬途径可以一定程度缓解线粒体外源蛋白的降解过程，最大限度增加蛋白的得率。
实施例7 siatg5沉默载体促进过氧化物酶体定位蛋白的表达
1、过氧化物酶体GFP表达载体的构建
根据(http://nebenfuehrlab.utk.edu/markers/default.htm)提供的已确认的过氧化物酶体定位信号肽序列，以本实验室改造的pCV1300为载体，GFP的C末端融合Px信号肽后双酶切构建Px-GFP。
根据Px信号肽(RSKL)设计引物，在上下引物的5’端分别引入BamH I和SacI酶切位点。所述Px信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述Px-GFP正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示。
PCR扩增反应及连接反应程序同实施例5。
2、siatg5与Px-GFP共浸润
将构建的siatg5与Px-GFP共浸润(OD600＝0.500)，以sigus+Px-GFP为对照组,以Actin作为内参蛋白，利用荧光显微镜观察及Western blotting检测第2-4天GFP的分泌表达情况。
从图10可以看出，siatg5载体(SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段)处理后siatg5+Px-GFP共浸润第2-4天蛋白表达量均高于对照样品,第3天蛋白表达量高于对照样品近3倍。结果表明该沉默载体能够有效促进过氧化物酶体定位的蛋白的表达水平。
在植物中过氧化物酶体的作用主要有：①参与光呼吸作用，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢，②在萌发的种子中，进行脂肪的β-氧化，产生乙酰辅酶A，经乙醛酸循环，由异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸，后者离开过氧化物酶体进一步转变成葡萄糖，这一过程称为乙醛酸循环，因此植物细胞的过氧化物酶体又称乙醛酸循环体(glyoxysome)。过氧化物酶体是参与植物细胞生理反应的重要细胞器，而自噬途径过程中形成的自噬囊泡中过氧化物酶体是主要的内吞物，通过siatg5与过氧化物酶体的研究发现，siatg5能使定位于过氧化物酶体的外源蛋白缓解变缓。这间接说明siatg5沉默载体能导致过氧化物酶体的自噬途径降解速率降低，从而更好的保证其执行生物学功能。
实施例8 siatg5沉默载体促进质体定位蛋白的表达
1、质体GFP表达载体的构建
根据(http://nebenfuehrlab.utk.edu/markers/default.htm)提供的已确认的质体定位信号肽序列，以本实验室改造的pCV1300为载体，GFP的N末端融合Pt信号肽后双酶切构建Pt-GFP。
根据Pt信号肽(ASSVLSSAAVATRSNVAQANMVAPFTGLKSAASFPVSRKQNLDITSIASNGGRVQCMQVWPPINKKKYETLSYLPDLS)设计引物，在上下引物的5’端分别引入BamH I和SacI酶切位点。所述Pt信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，所述Pt-GFP正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示。
PCR扩增反应及连接反应程序同实施例5。
2、siatg5与Pt-GFP共浸润
将构建的siatg5与Pt-GFP共浸润(OD600＝0.500)，以sigus+Pt-GFP为对照组,以Actin作为内参蛋白，利用荧光显微镜观察及Western blotting检测第2-4天GFP的分泌表达情况。
从图11可以看出，siatg5载体(SL片段为63-552bp区段，SS片段为63-476bp区段)处理后siatg5+Pt-GFP共浸润第2-4天蛋白表达量均高于对照样品，对照样品第3天蛋白已经发生降解，而siatg5处理组仍然继续表达蛋白。结果表明该沉默载体能够有效缓解质体定位的蛋白降解，促进质体定位的外源蛋白的表达。
质体是一类与碳水化合物的合成与贮藏密切相关的细胞器，它是植物细胞特有的结构。根据色素的不同，质体可分成三种类型：叶绿体(chloroplast)、色质体(或称有色体)(chromoplast)和白色体(leucoplast)。质体为双侧膜结构，双层膜是自噬囊泡形成的前体物质，因此质体也是自噬途径的潜在场所，目前研究表明叶绿体也具有自噬过程，研究发现衰老叶片中叶绿体的降解可能与自噬途径有关，叶绿体被自噬途径降解可能具有两条途径，分别为RCB(Rubisco-containing bodies)途径和chlorophagy途径。本研究利用siatg5沉默载体抑制自噬途径从而导致质体定位蛋白降解减缓，证明siatg5沉默载体对叶绿体自噬途径可能也存在抑制作用。
综合上述实施例，优选构建Atg5瞬时沉默载体的SL片段为Atg5基因序列的63-552bp区段，包括490bp碱基，酶切位点依次为BamHI、KpnI；SS片段为Atg5基因序列的63-476bp区段，包括414bp碱基，酶切位点依次为SacI、KpnI。siatg5沉默载体可以一定程度缓解内质网、质体、线粒体、过氧化物酶体定位的外源蛋白降解，这也说明siatg5沉默的自噬途径涉及内质网、质体、线粒体、过氧化物酶体等绝大多数细胞场所。因此siatg5也可能对植物细胞中的多种场所、细胞器的自噬途径具有调节作用。目前研究表明植物表达系统仍然存在目标蛋白表达量较低的问题，研究发现蛋白降解过程是影响外源蛋白表达的重要因素之一。植物中大约有2000余种直接或间接参与蛋白降解的酶类，目前只针对一种或一类酶的抑制剂或者沉默策略，无法具有广谱的抑制外源蛋白降解的效果。通过本研究表明siatg5对多种细胞器定位的自噬途径具有抑制作用，通过siatg5沉默Atg5导致自噬途径抑制，可能是一种潜在的广谱抑制外源蛋白降解的策略。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途
<130> 18-100070-00005070
<141> 2018-05-14
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> DNA
<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)
<400> 1
actacagatt caccttcata aatccgaagt cactactctc cctcctcctc cccctgctct 60
gattttagct cctcgaatag gttacctgcc tcttttagga acaaaaataa aacctttctt 120
cagtaattca cttcctcctg gtgtagatac cgtatggttt gagtacaaag gcttccctct 180
caaatggtat ataccaactg gggtactctt tgatcttctt tgtgcagaac ctgaacgtcc 240
ttggaatctg acggtacatt ttagaggata tcctggaaat attttaacac cttgtgaagg 300
agaagatagt gcaaagtgga gttttatcaa ttcactgaaa gaggcggcat acataatcaa 360
tgggaactgc aagaatgtaa tgaatatgtc ccaacctgac caattagaac tctggcgctc 420
cattatggat ggtaatttag aagcttatct ccgaatctcg tctaagctta aacttggcct 480
attagtggat 490
<210> 2
<211> 414
<212> DNA
<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)
<400> 2
actacagatt caccttcata aatccgaagt cactactctc cctcctcctc cccctgctct 60
gattttagct cctcgaatag gttacctgcc tcttttagga acaaaaataa aacctttctt 120
cagtaattca cttcctcctg gtgtagatac cgtatggttt gagtacaaag gcttccctct 180
caaatggtat ataccaactg gggtactctt tgatcttctt tgtgcagaac ctgaacgtcc 240
ttggaatctg acggtacatt ttagaggata tcctggaaat attttaacac cttgtgaagg 300
agaagatagt gcaaagtgga gttttatcaa ttcactgaaa gaggcggcat acataatcaa 360
tgggaactgc aagaatgtaa tgaatatgtc ccaacctgac caattagaac tctg 414
<210> 3
<211> 1116
<212> DNA
<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)
<400> 3
atgggaagta aaggggcagg agaaagtgaa gcacagaaat acatatggga aggagcaatt 60
ccactacaga ttcaccttca taaatccgaa gtcactactc tccctcctcc tccccctgct 120
ctgattttag ctcctcgaat aggttacctg cctcttttag gaacaaaaat aaaacctttc 180
ttcagtaatt cacttcctcc tggtgtagat accgtatggt ttgagtacaa aggcttccct 240
ctcaaatggt atataccaac tggggtactc tttgatcttc tttgtgcaga acctgaacgt 300
ccttggaatc tgacggtaca ttttagagga tatcctggaa atattttaac accttgtgaa 360
ggagaagata gtgcaaagtg gagttttatc aattcactga aagaggcggc atacataatc 420
aatgggaact gcaagaatgt aatgaatatg tcccaacctg accaattaga actctggcgc 480
tccattatgg atggtaattt agaagcttat ctccgaatct cgtctaagct taaacttggc 540
ctattagtgg atgatttttc aatacaactt agctcctcct cttctaaatc accggaaagc 600
actcaaaatg cagatggcac aggaccagct aaaacaggta gaataccggt tcgactgtat 660
gttaggacta tcaatgagga ttttgatgac ttgcaagatg cacctgcagt tgaaagttgg 720
gacaaaatct cttacataaa cagacctgtt gagattcatg gagatggagg caaatgcttc 780
accttgtgtg acgcaataac aaagcttctg ccggagctgt ttggggaaaa actgatgcca 840
atggatgacg tttctggaga ggaagttgag gttggacaga gattatctct tgaagaaaca 900
agcaagagca gcacgggaca aagtggagag atgttgaatg agcgcattgt ctcctgctcc 960
gtgtcagatg gtgctgagat taagctcata cgcattcagg gaattgaacc aaagatggag 1020
attccttttg catgggtggt aaacaatttg atgaaccctg aatactttct tcatatctgt 1080
gtatatgtca aaattcaaga acccatcacc atatag 1116
<210> 4
<211> 834
<212> DNA
<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)
<400> 4
atgatgtctc gccatattgg acttgttgtt tactttctga tatttctact ggatgatctg 60
caggcagcat acataatcaa tgggaactgc aagaatgtaa tgaacatgtc ccaacctgac 120
caattagaac tctggcgctc cattatggat ggtaatttag aagcttatct ccgaacctcg 180
tctaagctta aacttggcct agtggtggat gatttttcaa cacaacttag ctcttcctct 240
cctaaatcac cggaaagcac tcaaaatgca gatggcacag gaccagctaa aacaggtgtc 300
acatgggtgt atggtactcc gtatggattg ttcatacacc ctagtccatt tgacactggt 360
agaaaaccgg ttcgactgta tgttaggact ataaatgagg attttgataa cttgcaagat 420
gcacctgcag atgaaagttg ggacaaaatc tcttacataa acagacctgt tgagattcat 480
ggagatggag gcaaatgctt caccttgtgt gacgcaataa cgaagcttct gccggagctg 540
tttggggaaa aactgctgcc gaaagatatt tctggagaag aagttgaggt tggacagaga 600
ttacctcttg aagaaacaaa caagagcagc acgggacaaa gtggagagat gttgaatgag 660
cgtgttgtct cctgctctgt gtcagatggt gctgagatta agctaatacg cattcagggc 720
attgaaccaa agatggagat tccttttgca tgggtggtaa acaatttgat gaaccctgaa 780
tactttcttc atatctgtgt atatgtcaaa attgaagaac ccatcaccat atag 834
<210> 5
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggttaaga gctcattcaa gcaggagcat gatcttgaga agaggcgcgc cgaggctgct 60
gggattaggg aaaaatactc agataggatt ccggtgatag ttgaaaaggc tgaaaaaagt 120
gatattccca acatcgacaa gaaaaagtat ctcgtgccag ctgacttgac agttgggcaa 180
tttgtctatg tcattcgcaa gagaatcaaa ttgagtgcag aaaaggcaat attcatattt 240
attgacaatg tcctaccgcc aacaggggca atcatgtctg caatctatga cgagaagaag 300
gatgaagatg gtttccttta tgttacttac agtggagaaa acacattcgg ggacctgaac 360
gagctgtag 369
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catgatgagc tt 12
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggatccatg aagactaatc tttttctctt t 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggagctctta gagttcgtca tgtttgtata g 31
<210> 9
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctttcactac gtcaatctat aagatttttc aagccagcca caagaacttt gtgtagctct 60
agatatctgc ttcagcaaaa accc 84
<210> 10
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggatccatg ctttcactac gtcaatctat aagatttttc aagccagcca caagaacttt 60
gtgtagctct agatatctgc ttcagcaaaa acccatgaag actaatcttt ttctcttt 118
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagctctta tttgtatagt tcatccatgc ca 32
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agatcgaagc tg 12
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggatccatg aagactaatc tttttctctt t 31
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggagctctta cagcttcgat ctgagttcgt catgtttgta tag 43
<210> 15
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggcttcct cagttctttc ctctgcagca gttgccaccc gcagcaatgt tgctcaagct 60
aacatggttg cacctttcac tggccttaag tcagctgcct cattccctgt ttcaaggaag 120
caaaaccttg acatcacttc cattgccagc aacggcggaa gagtgcaatg catgcaggtg 180
tggccaccaa ttaacaagaa gaagtacgag actctctcat accttcctga tttgagcatg 240
aagactaatc tttttctctt t 261
<210> 16
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggatccatg gcttcctcag ttctttcctc tgcagcagtt gccacccgca gcaatgttgc 60
tcaagctaac atggttgcac ctttcactgg ccttaagtca gctgcctcat tccctgtttc 120
aaggaagcaa aaccttgaca tcacttccat tgccagcaac ggcggaagag tgcaatgcat 180
gcaggtgtgg ccaccaatta acaagaagaa gtacgagact ctctcatacc ttcctgattt 240
gagcatgaag actaatcttt ttctctttat gaagactaat ctttttctct tt 292
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggagctctta tttgtatagt tcatccatgc ca 32
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gggatccact acagattcac cttcataaa 29
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gggtaccatc cactaatagg ccaagtttaa 30
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggtacccag agttctaatt ggtcaggtt 29
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggagctcact acagattcac cttcataaa 29

Claims (3)

1.一种Atg5基因瞬时沉默载体在缓解植物细胞器定位的蛋白降解方面的用途，其特征在于，该沉默载体能够作用于细胞器区域，促进细胞器定位的外源蛋白表达，其中，所述的植物细胞为内质网、质体、线粒体、过氧化物酶体；所述沉默载体包括双元表达载体以及插入所述双元表达载体的SL片段和SS片段；所述沉默载体的SL片段由Atg5基因序列的第63-552位核苷酸组成，包括490bp碱基；所述SS片段由Atg5基因序列的第63-476位核苷酸组成，包括414bp碱基; 所述沉默载体的SL片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述SS片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示; 所述沉默载体的SS片段与双元表达载体的连接为反向连接；所述SL片段与双元表达载体的连接为正向连接;所述 的Atg5基因序列如SEQ IDNo.3所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建Atg5瞬时沉默载体；
（2 ）将GFP与细胞器定位信号肽融合构建细胞器-GFP表达载体；
（3）将Atg5瞬时沉默载体与细胞器-GFP表达载体共浸润。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述沉默载体的SL片段引物的碱基序列如下：正向引物序列是5’-GGGATCCACTACAGATTCACCTTCATAAA-3’；
反向引物序列是5’-GGGTACCATCCACTAATAGGCCAAGTTTAA-3’；
所述SS片段引物的碱基序列如下：
正向引物序列是5’-GGGTACCCAGAGTTCTAATTGGTCAGGTT-3’；
反向引物序列是5’-GGAGCTCACTACAGATTCACCTTCATAAA-3’。
CN201810456822.9A 2018-05-14 2018-05-14 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途 Active CN110484556B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810456822.9A CN110484556B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810456822.9A CN110484556B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110484556A CN110484556A (zh) 2019-11-22
CN110484556B true CN110484556B (zh) 2021-11-09

Family

ID=68544835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810456822.9A Active CN110484556B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110484556B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115989790B (zh) * 2022-11-01 2024-02-27 华南师范大学 一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857845A (zh) * 2010-03-05 2010-10-13 华东理工大学 可利用非甲醇碳源诱导aox1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株
CN102813915A (zh) * 2012-07-24 2012-12-12 东南大学 药物诱导的亚细胞结构疫苗及其制备方法
CN103088064A (zh) * 2012-12-19 2013-05-08 复旦大学附属中山医院 一种肝癌组织特异性rna干扰系统及其建立和应用方法
CN103833850A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 中国人民解放军第四军医大学 Lc3-i抗体的制备方法及其应用
CN104826113A (zh) * 2014-02-12 2015-08-12 中国科学院上海生命科学研究院 抑制间充质干细胞自噬在自身免疫性疾病中的应用
WO2016081634A1 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 University Of South Florida Compositions and methods for treating endometriosis
CN106460002A (zh) * 2014-01-10 2017-02-22 瑞来斯实业公司 增加微生物中生物质和脂质含量的方法及展现增强的自噬的基因修饰微生物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857845A (zh) * 2010-03-05 2010-10-13 华东理工大学 可利用非甲醇碳源诱导aox1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株
CN102813915A (zh) * 2012-07-24 2012-12-12 东南大学 药物诱导的亚细胞结构疫苗及其制备方法
CN103088064A (zh) * 2012-12-19 2013-05-08 复旦大学附属中山医院 一种肝癌组织特异性rna干扰系统及其建立和应用方法
CN106460002A (zh) * 2014-01-10 2017-02-22 瑞来斯实业公司 增加微生物中生物质和脂质含量的方法及展现增强的自噬的基因修饰微生物
CN104826113A (zh) * 2014-02-12 2015-08-12 中国科学院上海生命科学研究院 抑制间充质干细胞自噬在自身免疫性疾病中的应用
CN103833850A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 中国人民解放军第四军医大学 Lc3-i抗体的制备方法及其应用
WO2016081634A1 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 University Of South Florida Compositions and methods for treating endometriosis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes;P O Seglen et al.;《PNAS》;19820331;第79卷;第1889-1892页 *
Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5–Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation;Julia Romanov et al.;《The EMBO Journal》;20121012;第31卷;第4304–4317页 *
农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究;陈思涵等;《西南林业大学学报》;20180731;第38卷(第4期);第6-13页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110484556A (zh) 2019-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stern et al. Control of plastid gene expression: 3′ inverted repeats act as mRNA processing and stabilizing elements, but do not terminate transcription
Feldbrügge et al. PcMYB1, a novel plant protein containing a DNA‐binding domain with one MYB repeat, interacts in vivo with a light‐regulatory promoter unit
CN113136391B (zh) 小麦抗病蛋白TaWK6D及其相关生物材料与应用
NZ514547A (en) Plastid alph-amylase protein and nucleic acids encoding same and methods for altering the starch content of a plant
Graham et al. UbiA, the major polyubiquitin locus in Caenorhabditis elegans, has unusual structural features and is constitutively expressed
CN109554354A (zh) 能提高水稻抗病性的烟草铁氧还蛋白及其编码基因
CN110066323B (zh) 微藻捕光蛋白NoHLR1基因及其应用
CN110484556B (zh) 一种Atg5瞬时沉默载体缓解细胞器定位蛋白降解的用途
Herrin et al. Self-splicing of the Chlamydomonas chloroplast psbA introns.
CN1821395B (zh) 一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用
CA2674170C (en) Artificial dna sequence with optimized leader function in 5&#39; (5&#39;-utr) for the improved expression of heterologous proteins in plants
Hovemann et al. Heat-shock locus 93D of Drosophila melanogaster: An RNA with limited coding capacity accumulates precursor transcripts after heat shock
CN110484557A (zh) 一种Atg5瞬时沉默载体
CN106987591B (zh) 一种光诱导型启动子基因及其应用
JP6856639B2 (ja) ドリメノールシンターゼｉｉｉ
SATO et al. Light-responsive and rhythmic gene expression of psbA2 in cyanobacterium Microcystis aeruginosa K-81
CN112048507B (zh) 一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用
CN111518816B (zh) 一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因及其应用
CN114920812A (zh) 低钾胁迫响应相关的GhERF9蛋白及其相关生物材料与应用
CN114350681A (zh) 一种甘蔗单糖转运蛋白ShSTP7基因及其应用
CN114231539A (zh) 柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL6的应用及其重组载体
CN113801887A (zh) 一种水稻纹枯病菌脂肪基因沉默片段RslipA及其应用
CN114539371A (zh) 小麦白粉病抗性相关蛋白MlWE18和MlIW172及其应用
JP2004105164A (ja) 植物のアルミニウム応答性リンゴ酸輸送体の遺伝子及び当該遺伝子がコードする蛋白質
CN112980842B (zh) 一种非编码的核苷酸序列及其在提高外源基因表达水平的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant