CN115989790B - 一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用。该植物非经典自噬模型的构建方法包括如下步骤：(1)幼苗培养：将植物种子点种于固体培养基上，常规培养5～10天，得到植物幼苗；(2)热激处理：将植物幼苗转移到液体培养基中，于40～45℃条件下加热3～10分钟，然后转移到固体培养基上，放置于22±1℃条件下恢复0.5～3小时，得到所述的植物非经典自噬模型。该非经典自噬模型热激处理后呈现出大量点状信号，够引起植物细胞功能的改变，可用于调控植物抗热性、调控植物细胞生长素受体PIN2稳定性以及调控植物细胞蛋白转运能力。
Description
技术领域
本发明生物技术领域，特别涉及一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用。
背景技术
自噬是真核细胞存在的利用溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)降解自身胞质蛋白、损伤细胞器或入侵病原菌的物质周转途径。迄今为止，研究者已鉴定出40多个自噬相关编码基因，它们协同调节自噬的发生。近来，在动物细胞中，发现一种不依赖于自噬上游核心因子参与的催化自噬蛋白ATG8锚定到单膜细胞器的过程，称之为非经典自噬。该途径在细胞内吞、病菌免疫及细胞器修复等多个生物学过程中发挥重要作用。
与经典自噬途径不同，ATG8靶向到单膜结构的非经典自噬最主要的特征是不依赖于上游调节因子如ATG1复合体及ATG9等，然而，却依赖于ATG16-ATG5-ATG12为核心的脂化修饰系统。此外，在经典自噬途径中，ATG8特异地与磷脂酰乙醇胺偶联，并结合到双层膜的自噬小体上。而在非经典自噬中，ATG8既可以偶联磷脂酰乙醇胺(PE)，也可以共价结合磷脂酰丝氨酸，进而锚定到单层膜的细胞器。
相比于动物领域，植物中关于非经典自噬的功能研究显著滞后，其根本原因是缺乏稳定、可靠、有效的非经典自噬模型的构建体系。因此，建立一套快速、可重复的植物非经典自噬模型，可以为探究植物非经典自噬功能提供重要的方法基础。该模型不仅有利于开发新的植物抗性性状，还可为提高植物产量提供更好的理论依据和策略。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种植物非经典自噬模型的构建方法。
本发明的另一目的在于提供所述植物非经典自噬模型的构建方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种植物非经典自噬模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)幼苗培养：将植物种子点种于固体培养基上，常规培养5～10天，得到植物幼苗；
(2)热激处理：将植物幼苗转移到液体培养基中，于40～45℃条件下加热3～10分钟，然后转移到固体培养基上，放置于22±1℃条件下恢复0.5～3小时，得到所述的植物非经典自噬模型。
步骤(1)中所述的植物为野生型植物或非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物，其中所述非ATG8脂化修饰系统相关基因包括ATG5、ATG7、ATG12、ATG3、ATG4和ATG10基因；本发明中的植物非经典自噬模型依赖于ATG8脂化修饰系统，因此，ATG5、ATG7、ATG12、ATG3、ATG4和ATG10基因均需要未发生突变(缺失)。
所述的野生型植物包括农作物、水果和烟草中的至少一种；进一步优选为水稻、草莓、烟草和拟南芥中的至少一种；再进一步优选为野生型拟南芥(拉丁学名：Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)。
所述的非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物中的转基因植物包括农作物、水果和烟草中的至少一种；进一步优选为转基因水稻、草莓、烟草和拟南芥中的至少一种；再进一步优选为转基因拟南芥。
所述的转基因拟南芥为过表达ATG8基因的拟南芥，ATG11基因突变(缺失)的拟南芥，ATG9基因突变(缺失)的拟南芥，ATG11基因突变(缺失)背景下过表达ATG8基因的拟南芥，ATG9基因突变(缺失)背景下过表达ATG8基因的拟南芥和过表达PIN2基因的拟南芥中的至少一种。
所述的转基因拟南芥，为了方便在荧光显微镜下进行观察，可同时转入荧光蛋白基因。
所述的荧光蛋白基因包括黄色荧光蛋白YFP基因、绿色荧光蛋白GFP基因或红色荧光蛋白mCherry基因等。
所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种。
所述的转基因拟南芥优选为转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0，YFP-ATG8/atg11，YFP-ATG8/atg9和PIN2-GFP中的至少一种；其中，
所述的转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0、YFP-ATG8/atg11和YFP-ATG8/atg9通过如下方法获得：
(I)将荧光蛋白基因和ATG8基因通过同源重组方法构建到pCambia1300载体上，得到荧光蛋白-ATG8融合基因的表达载体；其中，荧光蛋白基因包括YFP、GFP和mCherry基因中的至少一种；所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种；
(II)将荧光蛋白-ATG8融合基因的表达载体利用农杆菌蘸花法分别导入到野生型拟南芥(Col-0)、拟南芥atg11突变体或拟南芥atg9突变体中，经潮霉素抗性筛选，得到转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0、YFP-ATG8/atg11和YFP-ATG8/atg9。
步骤(I)所述的YFP、GFP和mCherry基因在NCBI的登录号依次为AFI26426.1，AMQ45836.1和UFQ89828.1。
步骤(I)所述的ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因在TAIR数据库中的Locus依次为AT4G21980、AT4G04620、AT1G62040、AT2G05630、AT2G45170、AT4G16520、AT3G60640、AT3G06420及AT3G15580。
步骤(II)中所述的荧光蛋白-ATG8融合基因优选为YFP-ATG8融合基因。
步骤(II)中所述的潮霉素抗性筛选通过如下方法实现：收获F0代种子，点种在含有50μmol/L潮霉素的MS培养基上，进行阳性转基因植物筛选。
步骤(II)中所述的转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0、YFP-ATG8/atg11或YFP-ATG8/atg9优选为T3代纯合种子。
步骤(1)中所述的固体培养基优选为MS固体培养基。
步骤(1)中所述的幼苗培养优选为通过如下步骤实现：将植物种子点种于MS固体培养基上，4℃放置2～3天后，置于恒温光照培养箱中，设置培养温度为22±1℃，日照16小时，黑暗8小时，培养4～7天，得到植物幼苗。
所述的4℃放置的时间优选为2天。
所述的培养的时间优选为5天。
步骤(2)中所述的液体培养基优选为MS液体培养基。
步骤(2)中所述的液体培养基的用量按加入液体培养基能够淹没幼苗即可。
步骤(2)中所述的热激处理为采用金属浴或水浴的方式进行。
步骤(2)中所述的热激的温度优选为43～45℃；更优选为45℃。
步骤(2)中所述的热激的时间优选为5～10分钟；更优选为5分钟。
所述的植物非经典自噬模型的构建方法，在步骤(2)之后还包括进一步验证的步骤；具体为：利用激光共聚焦显微镜进行观察，若观察到完全呈现点状信号，说明该植株为非经典自噬模型植株。
所述的植物非经典自噬模型的构建方法在调控植物抗性方面的应用。
所述的植物抗性为抗热性。
所述的植物非经典自噬模型的构建方法在调控植物细胞生长素受体PIN2稳定性和/或调控植物细胞蛋白转运能力方面的应用。
所述的调控植物细胞生长素受体PIN2稳定性为降低植物细胞生长素受体PIN2稳定性。
所述的调控植物细胞蛋白转运能力为降低植物细胞蛋白转运能力。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明首先提供一种快速、高效、稳定的植物非经典自噬的构建方法，继而通过建立非经典自噬模型，评估非经典自噬对植物细胞的一系列功能，包括质膜生长素受体PIN2蛋白稳定性，蛋白转运过程等所造成的影响，建立一种切实可行的植物非经典自噬模型。
2、本发明构建了一种可靠的、可重复性俱佳的标准化植物非经典自噬模型，在激光共聚焦荧光显微镜可以观察到热激处理后呈现出大量点状信号，该点状结构的形成不依赖于经典自噬上游调节因子ATG11及ATG9，却依赖于ATG8脂化修饰系统中的ATG5，符合非经典自噬，为研究植物非经典自噬引起的细胞器功能改变提供一个新的研究平台。
3、本发明利用荧光漂白恢复方法检测PIN2在质膜的积累情况分析非经典自噬对植物细胞生长素受体稳定性的影响，并通过检测统计BFA小体的形成情况分析非经典自噬对植物细胞的蛋白转运过程的影响，发现构建的非经典自噬模型够引起植物细胞功能的改变，因此可将其用于植物抗性研究方面。
附图说明
图1是利用不同温度(22℃、37℃、40℃、43℃及45℃)热激诱导拟南芥根部细胞中非经典自噬情况图。
图2是YFP-ATG8g在45℃热激不同时间(1min、3min、5min、10min、20min)下定位的变化图(对照组保持在22℃条件下)。
图3是ATG8不同亚型(GFP-ATG8a、YFP-ATG8b、YFP-ATG8c、YFP-ATG8d、YFP-ATG8e、mCherry-ATG8f、YFP-ATG8g、YFP-ATG8h及YFP-ATG8i)表征热激诱导(45℃，5分钟)的植物非经典自噬情况图。
图4是热激诱导的植物非经典自噬情况图(不依赖于ATG11及ATG9而依赖于ATG5)；其中，A为热激诱导YFP-ATG8g在野生型背景(Col-0)下呈现出大量点状信号；B为突变ATG11不影响YFP-ATG8g点状聚集；C为在atg9自噬突变体背景下热激仍能诱导YFP-ATG8g呈现点状聚集；D为突变ATG5抑制YFP-ATG8g点状聚集。
图5是ATG8蛋白在免疫电镜下显示结果图(显示ATG8蛋白定位到单层膜的细胞器上)。
图6是荧光漂白恢复实验检测非经典自噬发生时PIN2的蛋白稳定性情况图；其中，A为漂白恢复前后的共聚焦图像；B为PIN2-GFP相对荧光强度随时间恢复情况。
图7是非经典自噬对植物细胞的蛋白转运过程的影响图(热激诱导非经典自噬抑制细胞对BFA的响应)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中涉及的以Col-0为背景的GFP-ATG8a、YFP-ATG8b、YFP-ATG8c、YFP-ATG8d、YFP-ATG8e、mCherry-ATG8f、YFP-ATG8g、YFP-ATG8h和YFP-ATG8i转基因材料，以及YFP-ATG8g/atg11、YFP-ATG8g/atg9及YFP-ATG8g/atg5转基因材料通过如下方法获得：
(1)①将GFP(NCBI登录号：AMQ45836.1)和ATG8a(TAIR数据库中的Locus为AT4G21980)通过同源重组方法构建到pCambia1300载体(NCBI，ACCESSION,FJ362600)上，获得GFP-ATG8a融合基因的表达载体；
②将YFP(NCBI登录号：AFI26426.1)分别和ATG8b(TAIR数据库中的Locus为AT4G04620)、ATG8c(TAIR数据库中的Locus为AT1G62040)、ATG8d(TAIR数据库中的Locus为AT2G05630)、ATG8e(TAIR数据库中的Locus为AT2G45170)、ATG8g(TAIR数据库中的Locus为AT3G60640)、ATG8h(TAIR数据库中的Locus为AT3G06420)及ATG8i(TAIR数据库中的Locus为AT3G15580)通过同源重组方法构建到pCambia1300载体(NCBI，ACCESSION,FJ362600)上，获得YFP-ATG8b、YFP-ATG8c、YFP-ATG8d、YFP-ATG8e、YFP-ATG8g、YFP-ATG8h和YFP-ATG8i融合基因的表达载体。
③将mCherry(NCBI登录号：UFQ89828.1)和ATG8f(TAIR数据库中的Locus为AT4G16520)通过同源重组方法构建到pCambia1300载体(NCBI，ACCESSION,FJ362600)上，获得mCherry-ATG8f融合基因的表达载体。
(2)利用农杆菌蘸花法将GFP-ATG8a、YFP-ATG8b、YFP-ATG8c、YFP-ATG8d、YFP-ATG8e、mCherry-ATG8f、YFP-ATG8g、YFP-ATG8h和YFP-ATG8i融合基因的表达载体分别导入到野生型拟南芥种子Col-0(Columbia，Col-0，ABRC stock number:CS1092)，并将YFP-ATG8g融合基因的表达载体分别导入到拟南芥atg11(TAIR数据库中的Locus为SAIL_1166_G10)、atg9(TAIR数据库中的Locus为SALK_145980)及atg5(TAIR数据库中的Locus为SAIL_129_B07)植物中。收获F0代种子，点种在含有50μmol/L潮霉素的MS培养基上，进行阳性转基因植物筛选，得到野生型背景(Col-0)转基因植物GFP-ATG8a/Col-0、YFP-ATG8b/Col-0、YFP-ATG8c/Col-0、YFP-ATG8d/Col-0、YFP-ATG8e/Col-0、mCherry-ATG8f/Col-0、YFP-ATG8g/Col-0、YFP-ATG8h/Col-0和YFP-ATG8i/Col-0，atg11突变体背景转基因植物YFP-ATG8g/atg11，atg9突变体背景转基因植物YFP-ATG8g/atg9，以及atg5突变体背景转基因植物YFP-ATG8g/atg5。
实施例1
热激诱导植物非经典自噬模型的建立，具体操作步骤如下：
1.选取同一时期(T3代纯合种子)收获的以Col-0为背景的GFP-ATG8a/Col-0、YFP-ATG8b/Col-0、YFP-ATG8c/Col-0、YFP-ATG8d/Col-0、YFP-ATG8e/Col-0、mCherry-ATG8f/Col-0、YFP-ATG8g/Col-0、YFP-ATG8h/Col-0和YFP-ATG8i/Col-0种子，以及YFP-ATG8g/atg11、YFP-ATG8g/atg9和YFP-ATG8g/atg5转基因种子，经70％(v/v)酒精消毒后，分别点种于MS固体培养基上，4℃放置2天后，置于恒温光照培养箱中，设置培养温度为22℃，日照16小时，黑暗8小时，培养5天。
2.将生长一致的幼苗分别转移到含有1毫升MS液体培养基中，在不同温度和不同时间下进行热激处理，实验均分成处理组和对照组，每个处理各10棵；其中，
①不同热激温度：
对照组保持在22℃条件下，处理组进行热激处理，条件分别是：37℃、40℃、43℃及45℃金属浴加热5分钟，随即分别转移至新的MS固体培养基上，放置于22℃恢复2小时；
②不同热激时间：
对照组保持在22℃条件下2小时，处理组进行热激处理，条件分别是：45℃加热1min、3min、5min、10min、20min，随即分别转移至新的MS固体培养基上，放置于22℃恢复2小时。
3.激光共聚焦荧光显微镜观察GFP-ATG8a/Col-0、YFP-ATG8b/Col-0、YFP-ATG8c/Col-0、YFP-ATG8d/Col-0、YFP-ATG8e/Col-0、mCherry-ATG8f/Col-0、YFP-ATG8g/Col-0、YFP-ATG8h/Col-0、YFP-ATG8i/Col-0、YFP-ATG8g/atg11、YFP-ATG8g/atg9及YFP-ATG8g/atg5在不同处理下的形态变化，YFP激发波长为514nm，发射收集波段为518～550nm，GFP激发波长为488nm，发射收集波段为500～550nm，mCherry激发波长为561nm，发射收集波段为570～650nm；利用荧光显微镜将完全呈现点状信号的幼苗分选出来，得到正在发生非经典自噬的植物。
4.利用免疫电镜检测ATG8的亚细胞定位情况，对非经典自噬引起植物细胞功能的改变情况进行鉴定，得到所述植物非经典自噬模型，具体步骤为：先利用电镜制样方法即高压冷冻制样技术制备根尖超薄切片：取生长5天的野生型拟南芥Col-0(培育方法同上述步骤1)，进行热激(45℃加热5分钟)处理，22℃恢复2小时后，用刀片切下根尖，送入高压冷冻仪进行固定(压力2000bar，冷冻速率18000℃/s)。制备好的样品在液氮保护下，放置于提前预冷的固定液(0.25％(v/v)戊二醛和0.1％(w/v)醋酸双氧铀)中，-80℃保存72h，然后用48h缓慢升温至-50℃，进行HM20树脂梯度替换(33％(w/v)1h、66％(w/v)1h、100％(w/v)16h)。60℃干燥2天后，进行超薄切片(厚度80nm)，孵育偶联有ATG8抗体的纳米金颗粒(10nm)(Sigma，G5402)，漂洗后，透射电子显微镜观察ATG8的亚细胞器定位情况。
结果分析：与其他温度(22℃、37℃、40℃及43℃)条件相比，热激(45℃)处理诱导YFP-ATG8g/Col-0形成大量的点状结构(图1)；进一步的，相比于其他处理时间，45℃热激3～10分钟(最优为5分钟)可以诱导YFP-ATG8g呈现出大量点状信号(图2)。此外，ATG8所有9个亚型(GFP-ATG8a、YFP-ATG8b、YFP-ATG8c、YFP-ATG8d、YFP-ATG8e、mCherry-ATG8f、YFP-ATG8g、YFP-ATG8h及YFP-ATG8i)均可以在热激条件下(45℃，5分钟)形成点状结构(图3)，并且该点状结构的形成不依赖于经典自噬上游调节因子ATG11及ATG9，却依赖于ATG8脂化修饰系统中的ATG5(图4)。通过免疫电镜分析发现，相比于对照条件下(22℃)，拟南芥根部细胞在45℃条件下呈现出大量泡状结构聚集，偶联有ATG8抗体的纳米金颗粒可以标记到这些单膜结构上，说明ATG8蛋白主要定位到单膜的囊泡结构上(图5)，这些特征符合非经典自噬。预示着我们通过热激方法(最优为45℃，5min)成功在植物中建立一个非经典自噬模型。
实施例2
热激诱导非经典自噬对植物细胞生长素受体PIN2稳定性的影响，具体操作步骤如下：
1.将拟南芥PIN2-GFP转基因种子(参考文献获得：Kleine-Vehn,J.,Leitner,J.,Zwiewka,M.,Sauer,M.,Abas,L.,Luschnig,C.,&Friml,J.(2008).Differentialdegradation of PIN2 auxin efflux carrier by retromer-dependent vacuolartargeting.Proceedings of the National Academy of Sciences,105(46),17812-17817)，点种于MS固体培养基上，4℃放置2天后，置于恒温光照培养箱中，设置培养温度为22℃，日照16小时，黑暗8小时，培养5天。
2.将20棵生长一致的PIN2-GFP转基因幼苗分别转移到含有1毫升MS液体培养基中，分成处理组和对照组，每组各10棵。
3.对照组保持在22℃条件下，处理组进行热激处理，条件是45℃加热5分钟，随即分别转移至新的MS固体培养基上，放置于22℃恢复2小时。
4.激光共聚焦荧光显微镜观察PIN2-GFP不同处理下定位的变化，GFP激发波长为488nm，发射收集波段为500～550nm。
5.开展荧光漂白恢复实验，对比处理组和对照组PIN2-GFP漂白后荧光恢复能力。设置好YFP荧光采集通道后，打开Bleaching功能，用方框框选漂白区域，激光强度调到100％，进行漂白操作，随后积累方框区域内荧光强度变化。
结果分析：与常温(22℃)对照相比，热激(45℃加热5分钟)处理诱导非经典自噬之后，PIN2-GFP在质膜处的恢复能力明显减弱(图6)。该结果预示着热激诱导非经典自噬后，质膜定位的生长素受体蛋白稳定性受到影响，可为高温抑制植物根部生长提供一个生物机制。
实施例3
热激诱导非经典自噬对植物细胞的蛋白转运过程的影响，具体操作步骤如下：
1.将野生型拟南芥种子Col-0点种于MS固体培养基上，4℃放置2天后，置于恒温光照培养箱中，设置培养温度为22℃，日照16小时，黑暗8小时，培养5天。
2.将20棵生长一致的Col-0幼苗分别转移到含有1毫升MS液体培养基中，分成处理组和对照组，每组各10棵。
3.对照组保持在22℃条件下，处理组进行热激处理，条件是45℃加热5分钟，随即分别转移至新的MS固体培养基上，放置于22℃恢复2小时。
4.采用FM4-64染料(Invitrogen，T13320)进行细胞质膜染色，随后加入50μM/L布雷非德菌素A(Brefeldin A，BFA)(MCE，20350-15-6)，处理30分钟后，激光共聚焦荧光显微镜观察BFA小体的产生情况。FM4-64激发波长为561nm，发射收集波段为575～650nm。
结果分析：与常温(22℃)对照相比，热激(45℃加热5分钟)处理诱导非经典自噬之后，BFA小体的产生能力明显抑制(图7)。该结果预示着热激诱导非经典自噬抑制了植物细胞的蛋白转运过程，该模型可为研究蛋白转运过程提供一个很好地范例。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)幼苗培养：将植物种子点种于固体培养基上，常规培养5～10天，得到植物幼苗；
(2)热激处理：将植物幼苗转移到液体培养基中，于40～45℃条件下加热3～10分钟，然后转移到固体培养基上，放置于22±1℃条件下恢复0.5～3小时，得到所述的植物非经典自噬模型；
步骤(1)中所述的植物为野生型植物或非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物，其中所述非ATG8脂化修饰系统相关基因不包括ATG5、ATG7、ATG12、ATG3、ATG4和ATG10基因；
所述的野生型植物为野生型拟南芥；
所述的非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物中的转基因植物为转基因拟南芥。
2.根据权利要求1所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的热激的温度为43～45℃；
步骤(2)中所述的热激的时间为5～10分钟。
3.根据权利要求2所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的热激的温度为45℃；
步骤(2)中所述的热激的时间为5分钟。
4.根据权利要求1所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：
所述的转基因拟南芥为过表达ATG8基因的拟南芥，ATG11基因突变的拟南芥，ATG9基因突变的拟南芥，ATG11基因突变背景下过表达ATG8基因的拟南芥，ATG9基因突变背景下过表达ATG8基因的拟南芥和过表达PIN2基因的拟南芥中的至少一种；
所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：
所述的转基因拟南芥为转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0，YFP-ATG8/atg11，YFP-ATG8/atg9和PIN2-GFP中的至少一种；其中，
所述的转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0、YFP-ATG8/atg11和YFP-ATG8/atg9通过如下方法获得：
(I)将荧光蛋白基因和ATG8基因通过同源重组方法构建到pCambia1300载体上，得到荧光蛋白-ATG8融合基因的表达载体；其中，荧光蛋白基因包括YFP、GFP和mCherry基因中的至少一种；所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种；
(II)将荧光蛋白-ATG8融合基因的表达载体利用农杆菌蘸花法分别导入到野生型拟南芥、拟南芥atg11突变体或拟南芥atg9突变体中，经潮霉素抗性筛选，得到转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0、YFP-ATG8/atg11和YFP-ATG8/atg9。
6.根据权利要求5所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：
步骤(II)中所述的潮霉素抗性筛选通过如下方法实现：收获F0代种子，点种在含有50μmol/L潮霉素的MS培养基上，进行阳性转基因植物筛选；
步骤(II)中所述的转基因拟南芥YFP-ATG8/Col-0、YFP-ATG8/atg11或YFP-ATG8/atg9为T3代纯合种子。
7.根据权利要求1所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的固体培养基为MS固体培养基；
步骤(1)中所述的幼苗培养通过如下步骤实现：将植物种子点种于MS固体培养基上，4℃放置2～3天后，置于恒温光照培养箱中，设置培养温度为22±1℃，日照16小时，黑暗8小时，培养4～7天，得到植物幼苗；
步骤(2)中所述的液体培养基为MS液体培养基；
步骤(2)中所述的热激处理为采用金属浴或水浴的方式进行。
8.权利要求1～7任一项所述的植物非经典自噬模型的构建方法在调控植物抗性方面的应用，其特征在于：
所述的植物抗性为抗热性；
所述的植物为拟南芥。
9.权利要求1～7任一项所述的植物非经典自噬模型的构建方法在调控植物细胞生长素受体PIN2稳定性和/或调控植物细胞蛋白转运能力方面的应用，其特征在在于：
所述的调控植物细胞生长素受体PIN2稳定性为降低植物细胞生长素受体PIN2稳定性；
所述的调控植物细胞蛋白转运能力为降低植物细胞蛋白转运能力；
所述的植物为拟南芥。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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