CN117844847A - 白菜BrPILS5基因在提高植物花粉耐热性中的应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了白菜BrPILS5基因在提高植物花粉耐热性中的应用，所述应用为抑制表达白菜BrPILS5基因提高花粉发育期在高温胁迫下植物花粉的抗性，所述抑制表达白菜BrPILS5基因是共抑制白菜BrPILS5a和BrPILS5b基因。过量表达抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段，能提高花粉发育早期、发育晚期的耐热性，挽救高温条件下造成的完全雄性不育。将该基因应用于白菜或其它开花植物中抗性育种，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及白菜BrPILS5基因在提高植物花粉耐热性中的应用。
背景技术
近些年来，随着人口的增长、经济的发展，温室效应越来越突出，高温造成的损失对全球粮食安全构成了重大威胁(Peng et al.,2004；Charles et al.,2010；Chaturvedietal.,2021)。植物是固着生长，不断受到包括热害在内的环境胁迫的挑战，这对植物的生长发育造成严重威胁(Ding et al.,2020)。在种子植物中，生殖发育是形成种子、完成世代交替的重要过程，已有研究表明，其是植物生命周期中对高温等环境胁迫最为敏感的发育过程，而其中，雄性生殖发育(主要为花药和花粉发育)对环境胁迫的敏感性又高于雌性生殖发育过程(Begcy et al.,2019)。由于环境胁迫对花粉发育产生严重影响，进而影响了农作物种子以及以种子为产品的粮食和蔬菜等的正常生产(De Storme and Geelen,2014；Ghadirnezhad and Fallah,2014)。因此，制定出应对环境胁迫的技术措施或培育出抗逆农作物，对确保全球粮食安全至关重要。
生长素在花药开裂、花粉成熟、花丝伸长及花粉管生长方面具有重要的调控作用(Cecchetti et al.,2008)。生长素作用于植物过程包括合成、代谢、转运及信号转导四大过程，任何一个过程发生不正常变化都会影响植物花粉的发育，例如拟南芥中生长素合成基因yuc2和yuc6双突变形成无花粉的短雄蕊(Cheng et al.,2006)；水稻中研究发现生长素代谢突变体dao花药不裂和花粉粒发育缺陷(Zhao et al.,2013)；生长素信号转导基因突变体arf17中花粉壁发育和花药开裂异常(Yang et al.,2013)，tir1 afb2 afb3三重突变体和tir1 afb1 afb2 afb2四重突变体中花粉早熟(Cecchetti et al.,2008)；生长素转运突变体pin8引起花粉外壁的发育和花粉萌发异常(Dal Bosco et al.,2012；Ding etal.,2012)，abcb1 abcb19双突变体中花粉早熟(Cecchetti et al.,2015)。
在开花植物中，雄性生殖器官雄蕊的正常发育是成功有性生殖所必需的。在拟南芥中，通常六个雄蕊原基出现在花器官的第三轮，随后分化为雄蕊花丝和花药，在那里发生雄性减数分裂，这一早期阶段之后是一个后期发育阶段，该阶段包括雄蕊花丝的快速伸长，与花药开裂和花粉成熟相协调，越来越多的证据表明，生长素运输对于雄蕊发育的早期和晚期都是必要的(Cecchetti et al.,2017)。PIN家族的蛋白质是具有极性细胞分布的主要外排载体(Galweiler et al.,1998；Friml1.et al.,2003；Paponov et al.,2005；Friml,2010)。PINs载体可分为一个大环和一个短环子组。大环PINs(PIN1、PIN2、PIN3、PIN4和PIN7)以一个大的亲水环为特征，定位在质膜上，并通过定位的膜直接转运生长素，短环PINs(PIN5,PIN6,和PIN8)不被募集到质膜，但被提议调节细胞质和内质网(ER)之间的生长素稳态(Mravec et al.,2009；Wabnik et al.,2011)。
在植物细胞中还存在一个保守的细胞内生长素运输体家族，即PIN-LIKES蛋白质家族(PILS)。PILS蛋白质家族是近年来被新发现及进行生理功能阐释的一类生长素运输体。该类蛋白质与PIN蛋白质在序列同源性上相似性并不高，但在蛋白质高级结构上具有较高的相似性。PILS蛋白质家族在拟南芥中存在7个成员，这些成员通过定位在内质网上介导细胞质内的生长素向内质网腔中运输(Barbez et al.,2012)。PILS蛋白是生长素依赖性调节植物生长所必需的。PILS蛋白调节细胞内生长素在内质网的积累，从而调节生长素在细胞核生长素信号传导中的可用性。PILS活性可能通过细胞内积累和代谢影响内源性生长素吲哚-3-乙酸(IAA)的水平(Barbez et al.,2012；Feraru et al.,2012；Sauer andKleine-Vehn,2019)。但是，目前关于PILS蛋白功能的研究还较少。
仅有的研究发现，过表达PILS1、3、5、6抑制植株的生长(Barbez et al.,2012；Beziat et al.,2017；Feraru et al.,2019；Sun et al.,2020)，pils6突变体植株长势良好，高温条件(29℃)下，PILS6改变根的伸长(与对照相比过表达和突变体中根的长度变短，但是过表达根的长度最短)(Feraru et al.,2019)。GASP1(Gloomy And Shiny Pils)编码一种影响生长素信号输出的RING/U-box超家族蛋白。gasp1突变体中的低生长素信号传导与PILS5和PILS6蛋白丰度的降低相关。高生长素和低生长素条件分别增加和降低PILS6蛋白水平。因此，非最佳生长素浓度通过PILS6丰度的改变来缓冲，从而导致稳态生长素输出调节(Feraru et al.,2022)。
花粉成熟的主要作用似乎是由内质网定位的PINs(如PIN8和PIN5，可能还有PILS5)提供的。众所周知，发育和萌发的花粉粒具有高生长素水平，内质网定位的PINs可能调节内质网内部储存的生长素的释放，以控制花粉发育并驱动生长素介导的花粉管伸长(Cardarelli and Cecchetti,2014)。p35S:PIN8-VEN和p35S:PILS5-GFP植物在补充生长素的培养基上表现出根系生长不敏感，生长素反应降低。这两种表型都表明PIN8和PILS5对核生长素信号传导的负面影响。此外，PILS5的根毛特异性表达导致对细胞长度的抑制(DalBosco et al.,2012)。对于PILS5和PIN8的功能是否相互关联，以及它们在内质网的活动如何影响花粉功能还有待研究。此外，目前还没有关于PILS5基因在植物花粉中的功能及耐热性方面的研究。因此，利用现代生物技术手段研究白菜BrPILS5基因与植物花粉耐热性的潜在联系，有利于为在白菜及其他开花作物繁种中采取有效的保护措施提高种子产量和质量提供理论支撑。
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发明内容
本发明提供了白菜BrPILS5基因在提高植物花粉耐热性中的应用，在受体植物中过表达抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段，发现抑制白菜BrPILS5基因的表达能够提高花粉发育早期、发育晚期的耐热性，挽救高温条件下造成的完全雄性不育，为选育植物抗性新品种提供了宝贵资源。
本发明具体采用的技术方案如下：
白菜BrPILS5基因在提高植物花粉耐热性中的应用，所述应用为抑制表达白菜BrPILS5基因提高花粉发育期在高温胁迫下植物花粉的抗性，所述抑制表达白菜BrPILS5基因是共抑制白菜BrPILS5a和BrPILS5b基因，其中，BrPILS5a基因编号为BraA09g010950.3C，基因序列如SEQ ID NO.1所示，BrPILS5b基因编号为BraA07g003460.3C，基因序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步地，所述花粉发育期为花粉发育早期或/和花粉发育晚期。
进一步地，所述植物花粉为双子叶被子植物花粉或单子叶被子植物花粉。
更进一步地，所述植物花粉为十字花科植物花粉。
更进一步地，所述植物花粉为白菜花粉。
进一步地，应用时，将抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段连入植物过表达载体中，构建得到重组过表达载体，然后将重组过表达载体转化到受体植物中。
更进一步地，所述植物过表达载体为pCAMBIA1300。
更进一步地，将重组过表达载体转化到受体植物中，操作如下：将重组过表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。
本发明的有益效果：
本发明通过分别克隆白菜BrPILS5基因和抑制其表达的人工miRNA片段，并在十字花科植物白菜中进行遗传转化，结果表明过量表达抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段，能提高花粉发育早期、发育晚期的耐热性，挽救高温条件下造成的完全雄性不育，说明白菜BrPILS5基因在高温条件下提高植物制种过程中种子的产量和质量具有一定的应用潜力。将该基因应用于白菜或其它开花植物中抗性育种，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为7个PILS基因在花粉发育不同时期花药中表达分析。CKT、CKU、CKB和CKM分别表示在正常条件下四分体时期、单核时期、双核时期和花粉成熟期。
图2为白菜中2个BrPILS5同源基因蛋白序列比对分析。A为2个BrPILS5同源基因蛋白序列比对，相似度约为92％。B为2个BrPILS5同源基因在白菜高温处理及未处理对照花药中表达分析。HST表示高温胁迫后四分体时期花药(即四分体时期遭受高温胁迫的花药)，CKT为其对照，即正常条件下生长的四分体时期花药；HSTM为花粉发育四分体时期遭受高温胁迫后在正常条件生长至成熟期花药，CKTM为其对照，即正常条件下生长的四分体发育至成熟期花药；HSM为高温胁迫后成熟期花药(即成熟期遭受高温胁迫的花药)，CKM为其对照，即正常条件下生长的成熟期花药。
图3为白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)和抑制表达(BrPILS5RNAi)载体构建。A，pCAMBIA1300载体酶切电泳图。M泳道为DNAmarker，下同。B，白菜BrPILS5基因CDS克隆PCR电泳图。C，白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)重组载体菌液阳性鉴定电泳图。D，抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段(BrPILS5RNAi/BrPILS5-amiRNA)克隆PCR电泳图。E，白菜BrPILS5基因抑制表达(BrPILS5RNAi)重组载体菌液阳性鉴定电泳图。F，白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)和抑制表达(BrPILS5RNAi)重组载体示意图。
图4为白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)和抑制表达(BrPILS5RNAi)阳性植株鉴定。A，白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)阳性植株GFP荧光鉴定。左边为白场条件下拍照，右边为荧光条件下拍照。B，白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)阳性植株PCR鉴定。正方形框为入选的株系，M泳道为DNAmarker，P为阳性对照(载体质粒)，下同。C，白菜BrPILS5基因抑制表达((BrPILS5RNAi)阳性植株GFP荧光鉴定。左边为白场条件下拍照，右边为荧光条件下拍照。D，白菜BrPILS5基因抑制表达(BrPILS5RNAi)阳性植株PCR鉴定。
图5为白菜BrPILS5基因抑制表达(BrPILS5RNAi)转基因株系花粉耐热性观察与统计分析。A，白菜BrPILS5基因抑制表达(BrPILS5RNAi)转基因植株及未进行转基因的对照植株在正常条件下花粉体外萌发及体内授粉结实(转基因植株花粉及未进行转基因的对照植株花粉授到未进行转基因(野生型)的柱头上)观察。CK为未进行转基因，RNAi-2/10/14为白菜BrPILS5基因抑制表达转基因株系，分别标记为2、10和14。C和D为对应的统计分析。B，白菜BrPILS5基因抑制表达(BrPILS5RNAi)转基因植株及未进行转基因的对照植株在高温胁迫条件下花粉体外萌发及体内授粉结实(转基因植株花粉及未进行转基因的对照植株花粉授到未进行转基因(野生型)的柱头上)观察。HSTM-CK为未进行转基因的对照植株四分体时期遭受高温胁迫后正常条件下恢复生长至成熟期，HSTM-RNAi-2/10/14表示白菜BrPILS5基因抑制表达转基因植株四分体时期遭受高温胁迫后正常条件下恢复生长至成熟期，HSM-CK为未进行转基因的对照植株花粉成熟期遭受高温胁迫，HSM-RNAi-2/10/14表示白菜BrPILS5基因抑制表达转基因植株花粉成熟期遭受高温胁迫。E-H为对应的统计分析。经单因素方差分析后进行多重比较检验，采用不同字母(P<0.05)表示样本间差异有统计学意义。花粉体外萌发图标尺为50μm，角果及花朵图标尺为1cm，植株图标尺为10cm。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1植物材料与高温处理
(1)白菜品种‘Byq97-02’(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino,syn.B.rapa ssp.chinensis，简称Brassica campestris syn.B.rapa)播种在由泥炭、蛭石和珍珠岩按照质量比3:2:1混合而成的基质中，花盆中浇透水，于相对湿度65％和300μmol*m-2*s-1最大光强度的温室中培养至开花期，昼/夜的光周期和温度分别为16h/8h和22℃/18℃。
(2)对于高温处理，将正常条件(上述(1))生长至开花期的白菜植株做好标记(即花粉不同发育时期标记，将白菜花序开放的花朵摘除，留下5级花蕾进行试验，花粉发育典型的5个时期：花粉母细胞时期、四分体时期、单核时期、双核时期、三核成熟期(即花粉成熟期)，根据花蕾的大小及显微镜观察确认)后转移至高温培养箱(宁波东南仪器有限公司)进行高温处理，38℃/28℃(昼/夜16h/8h)处理24h，其它条件不变。对照为同一时间播种一直生长在正常条件下的白菜植株。高温处理于上午9:00开始处理。高温处理完成后立取其四分体时期花药、成熟期花药及未处理对照四分体时期花药、成熟期花药于液氮中速冻用于基因表达分析或于-75℃保存备用。待高温处理过的四分体时期花蕾正常条件恢复生长至成熟期再取其花药及未处理对照成熟期花药(即正常条件下四分体时期长成的成熟花药)于液氮中速冻用于基因表达分析或于-75℃保存备用。每个处理处理10株，实验重复三次。
实施例2白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)和抑制表达(BrPILS5RNAi)载体构建
(1)在拟南芥不同时期花药转录组分析可知，PILS5基因在花粉发育过程中表达丰度较其他同家族基因高，且在花粉发育晚期极高表达(图1)，说明该基因在花粉发育过程中特别重要，故选此基因进行转基因研究。
(2)取白菜高温处理及未处理对照花粉发育过程中对高温胁迫最敏感的两个时期(即四分体时期和花粉成熟期)的花药组织样品用Trizol试剂提取总RNA，cDNA的合成用TAKARA反转录试剂盒完成，具体方法如下：5×gDNAEraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，RNA 1μg，RNase Free H2O补足至10μL，42℃，2min去除基因组DNA，在上一步的反应液中加入5×Primer Script Buffer 4μL，RT Primer Mix 1μL，Primer Script RT Enzyme Mix 1μL，RNase Free H2O 4μL，吸打混匀后37℃反应20min，85℃反应5s即完成cDNA的合成，cDNA在-20℃冰箱保存。
(3)以(2)中白菜花药cDNA为模板，对白菜BrPILS5基因(在白菜中有2个拷贝，但是同源性极高(图2A)，白菜花药转录组结果分析发现其中一个拷贝表达量极高(BrPILS5a，基因编号为BraA09g010950.3C)，另外一个(BrPILS5b，基因编号为BraA07g003460.3C)几乎接近0(图2B)，可能因为其同源性太高，基因表达信号检测的时候难以区分彼此，故集中在其中一个拷贝ID中，基于以上原因，选择表达量极高的BrPILS5a默认为BrPILS5)用表1中带pCAMBIA1300载体同源壁的引物通过高保真酶进行PCR扩增得到PCR产物，即获得了带载体同源壁的白菜BrPILS5基因克隆，将目的条带切胶回收，与此同时利用限制性内切酶Sac I和BamH I酶切线性化pCAMBIA1300载体，跑胶并割胶回收，最后将白菜BrPILS5基因片段和线性化载体片段利用同源重组方法进行重组，将重组产物进行热击转化，随机挑取单菌落利用表2中引物进行PCR鉴定，挑取阳性菌落提质粒，交由测序公司(浙江有康生物科技有限公司)测序验证，即得到BrPILS5OE重组质粒，-20℃保存备用。结果见图3A-C和F。
涉及的具体步骤如下：
①片段扩增
PCR体系50μL：DNA/cDNA(模板)1μL，2×Phanta Max Master Mix(高保真酶预混液)25μL，正向和反向引物各2μL，ddH2O 20μL。
PCR程序：预变性95℃反应3min，变性95℃反应15s，退火58℃反应15s(温度可根据设计的引物做调整)，延伸72℃反应1min(根据酶的效应及片段大小做调整)，总延伸72℃反应5min。
将扩增完成的产物点入中孔1.0％的凝胶中于电泳仪中120v 100mA 跑30min，于凝胶成像仪中拍照。
②酶切
体系：DNA质粒1μg，Sac I和BamH I酶各2μL，Buffer 4μL，ddH2O补足至20μL。
反应：37℃反应1h。
将酶切完成的产物点入中孔1.0％的凝胶中于电泳仪中120v 100mA跑30min，于凝胶成像仪中拍照。
③凝胶回收
在紫外光下切下含目的条带的胶块，置于1.5mL离心管中，离心管中加入300μL左右(能完全浸没胶块即可，一般每0.1g凝胶加300μL)Buffer MB，放置在37℃金属浴/水浴中加热使胶块融化释放目的片段(大概5-10min左右)；将上述溶液转移至DNA Fragment Minicolumn(即试剂盒配套柱子)中，室温静置1min；12000rpm离心1min，弃滤液；向Mini column中加入750mL Buffer WB(事先加入指定体积无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃滤液，重复一次；将Mini column安置于新的2mL Collection Tube上，12000rpm离心2min；将Minicolumn安置于新的1.5mL离心管上，在Mini column膜中央加入50μL ddH2O(加热至50-65℃时有利于提高DNA洗脱效率)，室温静置1min；12000rpm离心2min，即获得纯化片段。随后测浓度，-20℃保存。
④同源重组
体系：线性化载体200ng，基因片段60ng左右(根据片段大小做调整，一般约等于0.04×片段总碱基对数)，5×CE MultiS Buffer 4μL,，Exnase MultiS2μl，ddH2O补充至20μL。
反应：37℃反应30min。
⑤热击转化
冰上解冻DH5а大肠杆菌；吸取10μL同源重组产物加入100μL大肠杆菌中，轻柔地吸打混匀；冰上静置30min；42℃金属浴热激60s，之后立即置于冰上冷却2-3min；在超净台中加入1mL不含任何抗生素的LB液体培养基，放入37℃摇床复苏45-60min；5000rpm离心2min，弃大部分滤液留100μL左右；用移液枪将剩余的滤液和菌块混匀；将菌液均匀地涂到含抗生素(卡那霉素50mg/L)的LB固体培养基上，用封口膜封好平板，做好标记，放置在37℃培养箱中培养过夜。
⑥菌落阳性鉴定
超净工作台中在⑤中每个重组载体的固体培养基中随机挑取8个单菌落，分别于加入1mL含卡那霉素(卡那霉素50mg/L)的LB液体培养基的1.5mL离心管中，37℃摇床摇4-5h。
PCR体系25μL：菌液(模板)1μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，正向、反向引物各1μL，ddH2O 9.5μL。
PCR程序：预变性95℃反应3min，变性95℃反应15s，退火58℃反应15s(温度可根据设计的引物做调整)，延伸72℃反应1min(根据酶的效应及片段大小做调整)，总延伸72℃反应5min。
将扩增完成的产物点入小孔1.0％的凝胶中于电泳仪中120v 100mA跑30min，于凝胶成像仪中拍照。
⑦质粒提取
吸附柱先加100μL 3M NaOH，12,000rpm离心30-60s进行柱平衡；⑥中阳性菌液5000rpm离心1min，弃上清；加入250μL Solution I颠倒混匀完全重悬菌体；加入250μLSolution II，上下轻柔倒转几次，静置2-3min；350μL SolutionⅢ，立即上下倒转几次产生沉淀；12000rpm离心10min；将上清转移到平衡过的吸附柱内，12000rpm离心1min，弃废液；加入500μL HBC buffer，12000rpm离心1min，弃废液；加入700μL Wash Buffer，12,000rpm离心1min，弃废液，重复一次；12,000rpm离心2min，弃废液；换1.5mL离心管接收，加入50μL ddH2O，室温下静置1min；12,000rpm离心1min；检测浓度后，-20℃保存。
表1白菜BrPILS5基因带载体同源臂的CDS序列的PCR扩增所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| BrPILS5-CDS-p1300-F | gagaacacgggggacgagctcATGGGGTTTTGGTCATTGTTGG |
| BrPILS5-CDS-p1300-R | catgtcgactctagaggatccGACTAACAAGTGAAGGAAGATTGTGG |
表2白菜BrPILS5基因重组载体阳性菌落鉴定引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| 35S-1300GFP-F | CTCCTCGGATTCCATTGCCC |
| BrPILS5-R | GACTAACAAGTGAAGGAAGATTGTGG |
(4)根据(3)中得到的白菜BrPILS5基因CDS序列利用在线网络工具(http://wmd3.weigelworld.org/)和(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/)设计并筛选抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段，将初筛选到的片段再去大白菜数据库(http://brassicadb.cn)中进行比对，最终确定优选的抑制白菜BrPILS5基因表达(共抑制BrPILS5a和BrPILS5b)的人工miRNA片段(BrPILS5-amiRNA，如SEQ ID NO.3所示)并交由生物公司(北京擎科生物科技股份有限公司)合成。利用表3中带pCAMBIA1300载体同源壁的引物通过高保真酶进行PCR扩增得到PCR产物，即获得了带载体同源壁的抑制白菜BrPILS5基因表达(共抑制BrPILS5a和BrPILS5b)的人工miRNA片段(BrPILS5RNAi/BrPILS5-amiRNA)克隆。按照(3)中具体的方法构建重组质粒(利用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切线性化pCAMBIA1300载体)PCR鉴定后(阳性菌落PCR鉴定引物见表4)并交由测序公司测序验证，即得到BrPILS5RNAi重组质粒，-20℃保存备用。结果见图3D-F。
表3带载体同源壁的BrPILS5-amiRNA PCR扩增所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| BrPILS5-amiRNA-p1300-F | gagctcggtacccggggatccGGGTGAGAATCTCCATGTTTATGTC |
| BrPILS5-amiRNA-p1300-R | gcccttgctcaccatgtcgacGGGTGAAGAGCTCATGTTTATGTCC |
表4 BrPILS5-amiRNA重组载体阳性菌落鉴定引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| BrPILS5-amiRNA-F | GGGTGAGAATCTCCATGTTTATGTC |
| 35S-1300GFP-R | AACTTGTGGCCGTTTACGTC |
实施例3采用真空浸花法进行白菜遗传转化
(1)重组过表达载体转化农杆菌
选取实施例2中得到的白菜BrPILS5基因过表达BrPILS5OE和抑制白菜BrPILS5基因表达的BrPILS5RNAi重组质粒分别转入农杆菌GV3101中，具体方法如下：取解冻的农杆菌感受态细胞50μL与1μg实施例2中获得的重组质粒混匀后，冰上静置10min，在液氮中反应5min，28℃反应5min，冰上静置5min；在超净工作台上加入1mL不含任何抗生素的液体LB培养基，28℃摇床200rpm培养4-5h；离心5000rpm，2min，弃大部分上清液，剩余约100μL将菌体重悬后涂于含利福平(50mg·L-1)和卡那霉素(50mg·L-1)的固体LB平板上；28℃正向放置30min后倒置培养2d。取阳性菌落PCR检测正确后，菌株用30v/v％甘油LB重悬后，即为含有BrPILS5OE重组质粒的农杆菌GV3101菌种和含有BrPILS5RNAi重组质粒的农杆菌GV3101菌种，分别于-75℃保存备用。
(2)真空浸花法转化白菜
侵染前两天，从超低温冰箱中取出含有BrPILS5OE重组质粒的农杆菌GV3101菌种和含有BrPILS5RNAi重组质粒的农杆菌GV3101菌种，分别在超净工作台上用接种环将菌种接种于含有利福平(50mg·L-1)和卡那霉素(50mg·L-1)的固体LB筛选平板上，活化菌种。接种后封口，将其倒置于28℃培养箱中，培养36h。挑取单菌落于15mL含有利福平(50mg·L-1)和卡那霉素(50mg·L-1)的LB液体培养基中。放到28℃摇床，200rpm培养12h以制成农杆菌母液，保存于4℃。侵染前一天，取5mL母液于500mL液体LB培养基(含利福平(50mg·L-1)和卡那霉素(50mg·L-1))中28℃培养至OD值0.8-1.0。
侵染当天，去除抽薹开花后的白菜开放花，并对未开放花进行剥蕾(柱头露出即可)；将菌液室温离心(4000rpm，10min)，弃废液，加入500mL的5wt％蔗糖溶液重悬菌体，加入200μL/L的表面活性剂Silwet-77，搅拌均匀。将剥过蕾的白菜花序完全浸没在农杆菌重悬液中，利用-0.09MPa的压力抽真空5min,放气5min，再利用同样的条件抽真空5min，吸水纸吸干多余农杆菌重悬液，于湿润黑暗的环境中暗培养48h，取未浸过花的植株花粉对浸过花的植株进行授粉，每隔1天再授一次，一直持续2周。再培养1个月左右即可得到种子。
(3)转基因阳性白菜植株的筛选检测
GFP荧光初筛选：将步骤(2)收获的种子均匀播种于湿润铺有三层滤纸的方形培养皿中，待发芽后，用手持荧光仪于完全黑暗的环境中拍照观察。
PCR检测：上述初筛的幼苗，取1cm2叶子进行DNA提取。DNA提取：采用DNA简易提取法提取DNA，首先，配制DNA提取缓冲液，取20wt％的SDS溶液0.5mL，0.5mol·L-1EDTA水溶液0.5mL，1mol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)2mL，2mol·L-1LiCl溶液2mL，ddH2O补足至10mL，混合均匀即可使用。然后，取约0.1g样品放入2mL离心管中，加入200μL DNA提取缓冲液及1个磁珠，放入磨样机中研磨(65Hz，120s)，取出离心管中的磁珠后，12000rpm离心5min；转移100μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入100μL异丙醇后，迅速温和颠倒混匀，室温静置5min后，13,000rpm离心10min；弃上清液，用1mL 70v/v％乙醇洗涤沉淀后，12000rpm离心3min，弃上清液；重复洗涤一次后，将离心管倒置于吸水纸上，吹干乙醇后，加入50μL ddH2O溶解DNA。将得到的DNA利用PCR进行检测，具体步骤及所用引物见实施例2中(3)和(4)。
结果见图4。
实施例4表型观察及统计分析
因为白菜BrPILS5基因过表达(BrPILS5OE)株系长势较弱，无法正常生长结实，所以只对抑制白菜BrPILS5基因表达(BrPILS5RNAi)的株系进行了表型观察及统计分析。
(1)体外萌发试验
将实施例3中得到的转基因植株及未进行转基因(野生型)的对照植株按照实施例1中的种植及高温处理方法进行处理及正常条件恢复生长。取正常条件下转基因植株及未进行转基因的对照植株的成熟花粉、高温处理后转基因植株及未进行转基因的对照植株的成熟花粉(成熟期遭受高温胁迫后的花粉、四分体时期遭受高温胁迫后正常条件下恢复生长至成熟期的花粉)于30μL相对湿度为100％的培养基(15wt％蔗糖、0.4mmol·L-1HBO3、0.4mmol·L-1Ca(NO3)2和0.1wt％琼脂，用2mmol·L-1NaOH溶液调节pH至5.8)中20℃黑暗条件下培养3h后，分别滴入30μL的Alexander染料溶液(用于检测花粉活力)，室温黑暗条件下染色30min，在显微镜下观察拍照，利用ImageJ软件对图片进行分析。
(2)体内授粉结实试验
取正常条件下转基因植株及未进行转基因的对照植株的成熟花粉、高温处理后转基因植株及未进行转基因的对照植株的成熟花粉(成熟期遭受高温胁迫后的花粉、四分体时期遭受高温胁迫后正常条件下恢复生长至成熟期的花粉)作为父本，正常条件下未进行转基因的植株作为母本，于正常条件下进行授粉、生长，20天左右观察角果结实情况。
(3)统计分析
这些实验结果使用Graphpad prism 9.0(GraphPad Software，San Diego，USA)软件进行统计分析及图表绘制。数据表示为均值±SD，并使用方差分析进一步评估以确定显著性。在95％的置信水平下，差异被认为是显著的(p<0.05)。
结果如图5所示，虽然抑制白菜BrPILS5基因表达(BrPILS5RNAi)的转基因植株在正常条件下花粉萌发率和结实率略显著低于对照(白菜是总状花序，花粉数量多，所以对种子的生产影响不大)，但是在高温条件下，抑制白菜BrPILS5基因表达(BrPILS5RNAi)的转基因植株花粉耐热性显著提高了，具体表现在转基因植株显著提高了花粉发育过程中对高温胁迫最敏感的两个时期(即花粉发育早期(以四分体时期为代表)和花粉发育晚期(以花粉成熟期为代表))的花粉萌发率和结实率。由此，在受体植物中抑制白菜BrPILS5基因表达，能够提高花粉发育期(花粉发育早期、花粉发育晚期)的耐热性，挽救高温条件下造成的完全雄性不育，为选育植物抗性新品种提供了宝贵资源。
以上所述实施方案对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.白菜BrPILS5基因在提高植物花粉耐热性中的应用，其特征在于，所述应用为抑制表达白菜BrPILS5基因提高花粉发育期在高温胁迫下植物花粉的抗性，所述抑制表达白菜BrPILS5基因是共抑制白菜BrPILS5a和BrPILS5b基因，其中，BrPILS5a基因编号为BraA09g010950.3C，基因序列如SEQ ID NO.1所示，BrPILS5b基因编号为BraA07g003460.3C，基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述花粉发育期为花粉发育早期或/和花粉发育晚期。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物花粉为双子叶被子植物花粉或单子叶被子植物花粉。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物花粉为十字花科植物花粉。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物花粉为白菜花粉。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用时，将抑制白菜BrPILS5基因表达的人工miRNA片段连入植物过表达载体中，构建得到重组过表达载体，然后将重组过表达载体转化到受体植物中。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物过表达载体为pCAMBIA1300。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将重组过表达载体转化到受体植物中，操作如下：将重组过表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。
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