CN118048364A - GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用 - Google Patents

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CN118048364A
CN118048364A CN202410037337.3A CN202410037337A CN118048364A CN 118048364 A CN118048364 A CN 118048364A CN 202410037337 A CN202410037337 A CN 202410037337A CN 118048364 A CN118048364 A CN 118048364A
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cotton
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范术丽
陈玲玲
马启峰
张朝军
乔凯凯
王宁娜
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Sanya National Academy Of Southern Propagation Chinese Academy Of Agricultural Sciences
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Sanya National Academy Of Southern Propagation Chinese Academy Of Agricultural Sciences
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用。所述GhTKPR1_8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用生物技术手段使得所述GhTKPR1_8基因功能缺失，进而表现出雄性不育。本发明通过对棉花中TKPR1基因进行鉴定，确定了其在四个棉种中的进化关系。同时对GhTKPR1_8进一步研究，发现其在花药发育的四分体时期高度表达，且通过双荧光素酶实验发现其表达受GhAMS转录因子正向调控；随后通过拟南芥突变体回补实验、病毒诱导的基因沉默实验探讨了GhTKPR1_8在花药发育中的作用。本研究为进一步研究棉花中的TKPR1奠定了基础，同时为研究棉花雄性不育、提高棉花产量提供了一个候选基因。

Description

GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用。
背景技术
杂种优势是指两个遗传背景不同的亲本杂交后，产生的杂种F1代生活力、生长势、繁殖力、适应性、抗逆性、产量和品质等性状优于亲本的现象。棉花是我国当前一种十分重要的经济作物，与很多作物相同，棉花的种间与品种间杂交具有杂种优势。杂交棉的大面积推广应用为提高我国棉花产量做出了重要贡献。一个简易的授粉控制系统是杂种优势利用的前提，雄性不育系的利用有利于简化杂交种制备流程，是杂种优势利用途径中应用最广泛的一种途径。前面研究报道孢粉素相关基因TKPR1在玉米、水稻及拟南芥等开花植物中缺失会导致雄性不育，但目前在棉花中，未见有关于TKPR1的相关报道。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为挖掘TKPR1在棉花中的新用途，本发明提供了GhTKPR1_8基因在植物雄性不育中的应用，利用生物技术手段使得所述GhTKPR1_8基因功能缺失，进而植物表现出雄性不育。
本发明提供了GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，所述GhTKPR1_8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过构建pCLCRVA:GhTKPR1_8载体，利用VIGS技术转入棉花构建获得GhTKPR1_8基因沉默株系，发现GhTKPR1_8基因沉默导致棉花雄性不育，表现为花药完全不开裂，花粉染色浅，活力低，花粉发育异常。
2、本发明从实时荧光定量数据结果证实在棉花中GhTKPR1_8基因的表达主要发生在孢粉素合成的四分体阶段，GhTKPR1_8基因定位在内质网上，抑制棉花中GhTKPR1_8基因的表达，植株表现出雄性不育；在拟南芥突变体tkpr1中利用GhTKPR1_8基因回补，植株可恢复正常表型；通过双荧光素酶实验发现其表达受GhAMS转录因子正向调控；因此，表明GhTKPR1_8基因在调节棉花雄性不育方面可能具有关键作用，可以作为培育棉花种质的有利基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为GhTKPR1_8和GhTKPR1_17在棉花不同组织或器官的表达情况；
图中，A是陆地棉中GhTKPR1_8家族基因在棉花不同组织或器官的表达量，B为GhTKPR1_8在棉花不同组织或器官的表达量；C为GhTKPR1_17在棉花不同组织或器官的表达量；D表示GhTKPR1_8在棉花不同组织或器官的相对表达量；E为GhTKPR1_17在棉花不同组织或器官的相对表达量。
图2为利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体对GhTKPR1_8的亚细胞定位研究结果；图中，A为空载GFP和转化GhTKPR1_8基因的GhTKPR1_8-eGFP在细胞中的定位；B为GhTKPR1_8所示荧光强度分析；C为GFP所示荧光强度分析。
图3为利用GhTKPR1_8对拟南芥突变体的回补实验；
图中，A-C分别是tkpr1纯合背景下非转基因拟南芥植株(ecotype Col-0和tkpr1纯合)和转基因GhTKPR1_8拟南芥植株的花序、植株和花粉粒活力染色，D为C的放大图。
图4为棉花中GhTKPR1_8基因沉默对株系的影响；
图中，A-C分别为阴性对照CLCRV::00、阳性对照CLCRV::PDS和沉默株系CLCRV::GhTKPR1_8的植株、花和花药性状；D为CLCRV::00、CLCRV::PDS和CLCRV::GhTKPR1_8的花粉粒活力染色结果；E-H分别为GhTKPR1_8、GhCYP703A2、GhCYP704B1和GhABCG26在CLCRV::00和CLCRV::GhTKPR1_8植物株系中的表达水平；图中，Line1、Line2和Line3均表示GhTKPR1_8基因沉默株系。
图5为双荧光素酶瞬时表达试验；
图中，A是双荧光素酶在烟草中的瞬时表达试验，从红色到蓝色的颜色变化表示从高到低的表达水平；B是拟南芥原生质体双荧光素酶瞬时表达试验。
图6为ZmTKPR1_1和ZmTKPR1_2序列比对图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在相关实验进行前，已比对玉米中已报道过的ZmTKPR1_1和ZmTKPR1_2，证明存在序列差异(图6)，玉米中ZmTKPR1_1和ZmTKPR1_2双突表现出雄性不育，主要表现为绒毡层降解延迟，缺失花粉外壁和不正常的花药角质层。本研究通过病毒诱导的基因沉默实验以及拟南芥突变体回补实验证明GhTKPR1_8在棉花中表现为花药不开裂，花粉活力降低，因此可与玉米中TKPR1基因进行区分。
实施例1：GhTKPR1_8的表达分析
1、实验材料及处理
本实验选取的棉花材料为陆地棉CCRI24，所使用的棉花植株种植于大田中，具体环境为16小时光照，8小时黑暗，温度25-28℃，相对湿度80％；其余管理措施均按照正常大田管理。
2、实验方法
2.1cDNA的获得
采集陆地棉CCRI24的各部位，包括根、茎、叶、花药、花瓣、以及不同时期的胚珠或纤维，采集花药发育的不同阶段的雄蕊，主要包括花蕾长度为3-4mm、4-5mm、5-6mm、6-7mm、7-8mm、8-9mm、9-14mm、14-24mm、30mm、50mm。
利用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒RNAprep Pure Plant Plus kit提取陆地棉各组织或器官的RNA；用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒TransCript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qpcr(One-Step gDNA Removal)对得到的RNA进行反转录，得到陆地棉CCRI24的cDNA。
反应体系如表1所示，反应条件为混匀，42℃孵育15分钟，注意将初始温度调至60℃；85℃加热5秒钟；8℃forever。结束后，-20℃冰箱保存。
表1反转录反应体系
2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
使用Histone 3引物作为内参，上游引物如SEQ ID NO.4所示，下游引物如SEQ IDNO.5所示；每个样品3个重复。
SEQ ID NO.4：TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA；
SEQ ID NO.5：GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC。
使用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒，针对GhTKPR1_8基因设计引物，上游引物如SEQ ID NO.6所示，下游引物如SEQ ID NO.7所示，qRT-PCR检测GhTKPR1_8基因的表达量。
所述GhTKPR1_8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：MEWVKGGKVCVTGAAGFLASWLVKRLLLSGYHVIGTVRDPANEKKLAHLWRLDGAKERLKLVRADLLEEGSFDDAIMGCQGVFHTASPTEILEPAVKGTLNVLGSCKKNPSLRRVVLTSSSSTVRARDDFDYKIPLDESSWSSLELCETLRVWYALAKTQAEKAAWEFCNENKIDLVTVLPAFVIGPSLPPDLCSTASDVLALLKGETEQFQWHGRMGYVHIDDVALCHILLYEHEGASGRYLCSSTVIDNDELVLILSARYPSLPVPKGFAKLDRLYYEFNTSKITSLGFKFRPIEEMFDDCIESLVEKGLLSLHSAHQRPLS；
SEQ ID NO.6：AGCATCGAGGAGCTGTGAAC；
SEQ ID NO.7：TTAGGGGTCTCTGGTAGGGC。
qRT-PCR反应体系如表2所示，加完样品后，小心地在板子上盖膜，注意不要用手触碰盖膜；盖膜后，进行离心，放在荧光定量仪(ABI7500)中进行反应，收集数据。
表2qRT-PCR反应体系
3、结果分析
根据获得的数据进行分析，结果如图1，GhTKPR1_8在花药中表达量较高，尤其是花蕾长度在3-6mm时表达量最高。其同源基因GhTKPR1_17也表现出相似的表达模式。
实施例2：GhTKPR1_8基因的亚细胞定位
1、实验材料、试剂或所用载体
实验所用材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana)，种植于温室中，进行正常管理。
大肠感受态，酵母提取物YEAST EXTRACT；胰蛋白胨，TRYPTONE；NaCl，-Blunt Zero Cloning Kit(T载)，Kana抗生素，南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)酶，天根无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree MaxiPlasmid Kit，内切酶SpeI1、SaI1及相应Buffer，Super Promoter-GFP载体。
2、实验方法
2.1GhTKPR1_8开放阅读框序列的获取
(1)使用Toyobo/东洋纺的KOD-Plus-Neo高保真酶。模板为上述得到的陆地棉TM-1的叶片cDNA，使用上游引物SEQ ID NO.8：ATGGAGTGGGTGAAAGGTGG；下游引物SEQ ID NO.9：CTAAGAAAGTGGTCTCTGATGGG进行克隆，反应体系和条件如表3和表4所示。
表3扩增反应体系
表4扩增反应条件
(2)电泳：用大孔板进行制备胶，电泳检测前用loading Buffer混染，有目标条带后进行切胶回收。
(3)胶回收步骤：
使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒，具体步骤如下：
a.切取琼脂糖凝胶中的目的片段条带，放入干净的离心管中，称重。
b.加入3倍于胶重量体积的GSB溶液(100mg胶重量可等同于100μl)，于55℃水浴10min左右，确保胶块完全融化，注意确保胶完全融化。
c.待融化的凝胶溶液将至室温(高温时，离心柱结合DNA能力弱)，加入离心柱中，静置1min，12000转速下离心1min，弃流出液。
d.加入650μl WB溶液，12000转速下离心1min，弃流出液。
e.12000转速下离心1-2min，彻底去除残留WB。
f.将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置1min，使残留的乙醇挥发干净，在柱的中央加入30μl去离子水，室温静置1min。
g.12000转速下，离心1min，洗脱DNA。
h.检测DNA浓度，做好标记，于-20℃下保存，即最终得到含有GhTKPR1_8基因的开放阅读框序列SEQ ID NO.2。
2.2连接反应
分别吸取-Blunt Zero Cloning Kit(T载)1μL，上述克隆得到的目标基因DNA 4μL于离心管中，轻轻吸混均匀。室温下(25℃)放置5min充分反应。
2.3转化反应
(1)配制培养基
LB液体培养基配制方法：配置400mL液体培养基所加试剂：酵母提取物2g；胰蛋白酶4g；NaCl 4g；
LB固体培养基配制：可在液体培养基原有样品基础上直接加6g琼脂，灭菌后冷却，进行倒平板操作。如要加AMP、Kana、Rif，上述培养基在灭菌后，冷却，吸取200μL AMP、400μLKana或Rif溶液，摇匀，再进行相应操作；
(2)取100μL大肠感受态于冰上融化后，加入上述连接反应后的产物5μL，轻轻吹得搅拌混匀，冰上静置5min。
(3)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴，静置2min。
(4)向离心管中加入500μL无抗性的LB培养基溶液，37℃,180rpm复苏，上下轻摇混匀，根据需要吸取100μL均匀涂布到含有Kana抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置过夜(24h)。
2.4挑取克隆单菌落
(1)观察长出的单菌落，确定可挑取。
(2)在超净工作台中，按1mL LB溶液：1μL Kana的比例，向LB中相应体积的Kana抗生素，并轻轻摇匀。
(3)向离心管中加入上述LB溶液300μL左右，随后挑取单菌落，连同枪头一起打入离心管中。
(4)放入37℃摇床进行摇菌2h以上，以备检测。
(5)检测体系：20μL的体系，其中2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)10μL，上游引物(序列为SEQ ID NO.10：GTAAAACGACGGCCAGT)0.8μL，下游引物(SEQ ID NO.9)0.8μL，菌落1μL，无菌水7.4μL；
PCR反应条件根据所用酶2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)的说明书。
(6)PCR检测后，挑选目的条带较亮的进行送样检测，根据样品测序反馈的结果，挑取质量较好的进行摇菌。
(7)摇菌：加30μL Kana抗生素的LB培养液30mL，将上述挑选的菌液从离心管全部吸入，37℃摇床摇菌，6h后，从菌中进行目标片段的质粒提取。
2.5目标片段质粒的提取
使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒，使用前，将RNase加入RB中；根据说明向WB溶液中加入不同体积的无水乙醇。根据菌液体积，按照下表5在以下步骤中加不同试剂。
表5目标片段质粒提取所用试剂
LB Media RB LB NB
小于5mL 250μL 250μL 350μL
5-10mL 500μL 500μL 700μL
10-15mL 750μL 750μL 1050μL
15-20mL 1000μL 1000μL 1400μL
具体操作如下：
(1)菌液12000转速下离心1min，去上清。
(2)根据上表，加入上述无色溶液RB(含RNase A)，振荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。
(3)根据上表，加入蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4至6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，即表示完全裂解。
(4)根据上表，加入黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。
(5)12000转速离心5min，小心吸取上清加入离心柱中。12000转速下离心1min，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分多次加入离心柱中，并同上离心，弃流出液。
(6)加入650μL溶液WB，12000转速下离心1min，弃流出液。
(7)12000转速下1-2min，彻底去除残留WB。
(8)将离心柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入30μL去离子水，室温静置1min。(注意去离子水提前在60℃-70℃预热，效果更好。)
(9)10000转速下离心1min，洗脱DNA，进行浓度检测后，置于-20℃保存，以备克隆连接载体的DNA模板。
2.6设计连接载体的接头引物及克隆片段
(1)为连接GFP载体，需要根据GFP载体序列设计引物，重新克隆带有接头的目标基因DNA片段，本次试验的酶切位点为Sa1I、SpeI，以该位点，在软件SnapGene进行引物设计，上游引物如SEQ ID NO.11所示，下游引物如SEQ ID NO.12所示；
SEQ ID NO.11：GGGGCCCGGGGTCGACATGGAGTGGGTGAAAGGTGG；
SEQ ID NO.12：TACCGGATCCACTAGTAGAAAGTGGTCTCTGATGGGC。
(2)克隆体系及反应体系与上述步骤相同。
(3)电泳、胶回收，测其浓度，同上述步骤，放入-20℃中，以备连接GFP使用。
2.7酶切、连接反应：
按照表6所示体系进行酶切反应，反应条件为37℃，3h。酶切产物电泳、胶回收，检测浓度，以备连接克隆片段。连接体系见表7，连接反应条件为37℃，30min。
表6酶切体系
组分 体积
SpeI1 2μL
SaI1 2μL
Buffer 5μL
GFP 2000/提取的GFP浓度
去离子水 加至50μL
表7连接体系
组分 体积
Buffer 2μL
连接酶 1μL
GFP载体 GFP长度*0.02/提取的浓度
克隆片段 长度*0.04/片段浓度
ddH2O 加至10μL
2.8转化反应
(1)取100μl大肠感受态于冰上融化后，加入上述连接反应后的产物10μL，轻轻吹得搅拌混匀，冰上静置30min。
(2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。
(3)向离心管中加入500μL无抗性的LB培养基溶液，上下轻摇混匀，放入37℃摇床中1-2小时，进行复苏。
(4)根据需要吸取100μL均匀涂布到含有卡那抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置过夜(24h)。
2.9挑取单菌落、检测：
(1)观察长出的单菌落，确定可挑取。
(2)在超净工作台中，按1mL：1μL的比例，向LB中相应体积的卡那抗生素，并轻轻摇匀。
(3)向离心管中加入上述LB溶液300μL左右，随后挑取单菌落，连同枪头一起打入离心管中。
(4)放入37℃摇床进行摇菌2h以上，以备检测。
(5)检测，如上述描述。
(6)PCR检测后，挑选目的条带较亮的进行送样检测，根据样品测序反馈的结果，挑取质量较好的进行摇菌，并将相应阳性质粒保存。
(7)摇菌步骤：加30μl Kana抗生素的LB培养液30mL，将上述挑选的菌液从离心管全部吸入，37℃摇床摇菌。
(8)6小时后，取出菌液，在超净工作台中，吸取甘油500μL，相应菌液500μL，于干净的离心管，上下颠倒混匀后，放入-80℃保菌。
2.10质粒大提
(1)将2.8得到的阳性甘油菌和GFP载体以及内质网marker大肠甘油菌过夜培养。
(2)柱平衡步骤：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，8,000rpm(～8,228×g)离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(用平衡液处理过的柱子最好立即使用)。
(3)取100mL(根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200mL)过夜培养的菌液加入离心管，室温8，000rpm(～8，228×g)离心3min收集细菌，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。
(4)尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
(5)向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P4的用量。
(6)向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
(7)向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8,000rpm(～8，228×g)离心5-10min，使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL的管中(自备)。
注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多(＞100mL)，推荐延长离心时间至20-30min。
(8)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)。
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP6的最大容积为15mL，所以需要分2次过柱。个别情况下离心机转子倾角较大，此时，建议加入吸附柱CP6的溶液体积不超过10mL，以防产生漏液现象。
(9)室温8,000rpm(～8，228×g)离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。
注意：将第7步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。
(10)向吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，8,000rpm(～8,228×g)离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(11)重复操作步骤9。
(12)向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8，000rpm(～8，228×g)离心2min，倒掉废液。
(13)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000rpm(～8,228×g)离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(14)将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2mi洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8,000rpm(～8，228×g)离心2min。将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH,O做洗脱液应保证其pH值在7.5-8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质粒的拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于1mL，体积过小影响回收效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
(15)每1mL洗脱液加入1.42mL异丙醇以及0.42mL 5M NaCl(客户自备)，混匀，室温放置5min，8,000rpm(～8，228×g)离心10min，小心弃上清。
(16)加入0.5mL的70％乙醇洗涤沉淀，室温8,000rpm(～8，228×g)离心5min，小心弃乙醇。
(17)重复操作步骤15。
(18)空气中干燥沉淀约5-10 min，根据需要用适当体积的TB缓冲液溶解沉淀。
2.11拟南芥原生质体的提取
准备工作
(1)自备材料：
锋利刀片；血球计数板；50 mL离心管；2mL离心管
(2)即用型醇解液配制
表8即用型醇解液配制
注：在三小时内游离原生质体，酶解液无需过滤除菌。
(3)预冷溶液II-W5 solution
冰上或4℃冰箱预冷溶液II-WS solution，备用。
原生质体制备
取短日照温室条件下培养约4周未抽苔的拟南芥叶片(取其完全展开的叶片)，优选第2、3和4对叶片；或在培养皿中生长10天左右的拟南芥幼苗。
(1)按照10-20个叶片10mL酶解液的比例，将烟草叶片切成0.5-1.0mm宽的细条，迅速浸入酶解液中。注意在切割过程中避免拖拽，以防破坏原生质体。
(2)避光，28℃左右，摇床40rpm，酶解3个小时。酶解完成后，取一滴酶解液镜检，细胞圆而发亮，则健康；细胞扁且发黑，则弃去。
(3)将细胞筛置于50mL离心管上，用1mL预冷的溶液I1-W5 solution浸湿细胞筛，小心倒入醇解产物过滤，再用9mL预冷的溶液II-W5 solution冲洗酶解器皿和未消化的组织，将所得液体倒入细胞筛过滤。
(4)100g离心3min，升速3，降速3。
(5)小心去除上清，贴壁缓慢加入1mL预冷的溶液II-W5 solution，轻轻旋转离心管重悬原生质体，随后贴壁缓慢加入4mL预冷的溶液II-W5 solution，轻轻旋转离心管混匀。
(6)冰上静置30min。
(7)显微镜下观察原生质体的状态并用血球计数板进行计数。
(8)转速100g离心3min，升速3，降速3，小心去除上清，贴壁缓慢加入适量溶液Ⅲ-MMg solution重悬原生质体，调整原生质体密度为2×105个/mL。
原生质体转化
(1)将10-20g质粒加入2mL离心管(质粒浓度21pg/uL)。
(2)加入100uL原生质体，轻柔地敲打离心管底部，混匀。
(3)再加入110L溶液IV-PEG solution，轻柔地敲打离心管底部，混匀。
(4)室温放置5-30min。(常规实验需15min，间歇轻柔混匀)。
(5)加入440juL溶液1I-W5 solution，轻柔地上下颠倒离心管，混匀终止反应。
(6)室温条件，转速100g离心2min，升速3，降速3。
(7)小心去除上清，轻柔地敲打离心管底部，将原生质体重悬于残余的上清液中，再贴壁缓慢加入1mL溶液II-W5 solution，轻轻旋转离心管混匀。
(8)将离心管水平放置于光照培养箱中(28℃)，黑暗条件下孵育16h。
(9)利用共聚焦显微镜观察实验结果。
3、结果分析：
如图2，空载GFP在细胞核及细胞膜上表达，而连接GhTKPR1_8基因的GFP只在内质网上表达，说明GhTKPR1_8基因定位在内质网上。
实施例3：利用GhTKPR1_8在拟南芥突变体tkpr1中进行互补实验
1、实验步骤
1.1实验材料、试剂或所用载体
实验所用材料为拟南芥(ecotype Col-0)T-DNA插入系SALK_205577C的tkpr1杂合植株种子来自福州爱若莎生物科技有限公司。在后代中，使用基因特异性和T-DNA特异性引物(表2)，通过PCR鉴定野生型、tkpr1纯合子和杂合子个体。将鉴定到的tkpr1杂合植株进行花浸转化。拟南芥的生长，先在4℃黑暗条件下对种子进行表面灭菌，培养2天，然后在1/2MS培养基上(对照植株不加抗生素，转基因植株加50mg/L(卡那霉素)22℃连续光照下发芽。将1周龄的幼苗移栽到土壤中，在22℃的长日照条件下(光/暗循环16h/8h)生长。
大肠感受态，酵母提取物YEAST EXTRACT；胰蛋白胨，TRYPTONE；NaCl，-Blunt Zero Cloning Kit(T载)，Kana抗生素，南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)酶，天根无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree MaxiPlasmid Kit，内切酶HindIII、BamHI及相应Buffer，pBI121载体,农杆菌菌株GV3101，亚历山大染色液(Solarbio)。
1.2GhTKPR1_8启动子序列及开放阅读框序列的获取
利用SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列，将陆地棉基因组DNA中GhTKPR1_8起始密码子上游2.0kb的区域克隆到T载体，然后根据SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列将启动子序列连入表达载体pBI121中。利用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列从野生型(TM-1)花芽cDNA中PCR扩增出GhTKPR1的全长编码序列，并将其克隆到pBI121中。根据上述步骤构建了由GhTKPR1_8启动子驱动的GhTKPR1_8的互补构建体。
SEQ ID NO.13：CCCCTCTCACGCAAATGCTA
SEQ ID NO.14：GGACCATTGCACTCAATGCC
SEQ ID NO.15：tgattacgccaagcttcttaggtgtacatcaacccaaagatgtg
SEQ ID NO.16：CACTCCATttccacttccctataatcaaatatcatgcaatgg
1.3转GV3101农杆菌检测
(1)取-80℃保存的GV3101农杆菌(100μL规格)，于室温或手心片刻，处于冰水混合状态，吸取步骤1.2中得到的阳性质粒5μL加入其中，用手轻轻拨打管底混匀，依次冰上5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。
(2)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃摇床上振荡培养2-3小时。
(3)吸取50μL进行涂布，平板为含有卡那抗生素、利福平抗生素的双抗培养基(RK培养基)。
(4)最后倒置于28℃培养箱中培养2-3天。
(5)长出单菌落后，挑取单菌落于300μL RK液体培养基中，28℃摇2-3小时后，进行检测。
(6)电泳检测后，挑选阳性菌，进行保菌，保菌步骤同上。
1.4悬浮液配制、OD值测定、侵染
100mL体积的悬浮液配制：1/2MS 0.217g，蔗糖5g，以上定容溶解后将PH至调至5.8，再加Silwet-L77 20μL。
菌液3500r/min转速下离心10分钟，弃上清，加悬浮液，震荡溶解，用分光光度仪器OD值600nm调至0.7-1.0，直接将拟南芥杂合tkpr1/+突变株浸入悬浮液中60秒(在侵染前，将已经开花的花蕊减掉，只留尚未开花的、露白的花蕊。)
侵染后，放置在黑暗(避光)中24小时后取出。
1.5转基因拟南芥筛选
收集侵染后的拟南芥种子，获得T0代种子，注意在收集管中加入干燥剂。
常温干燥7至15天后，低温7天进行春化(也可直接点播在含相应抗性的培养基上后再低温春化)。
前期准备：滤纸、枪头、超纯水等的灭菌，培养基的配制。
1/2MS培养基配制：100mL：1/2MS，0.22g；Agar，0.8g；蔗糖，3g；配制后再灭菌前，将PH值调到5.6至5.8。灭菌后，待溶液降温至室温，在提前灭菌后的超净工作台中，加入60μL浓度为50mg/μL的潮霉素，摇匀，并随后进行倒板，注意板子可稍微厚些。
拟南芥种子灭菌：
(1)将种子在2-3％次氯酸钠中旋涡振荡5min；
(2)离心，倒掉次氯酸钠，加入75％酒精，漩涡振荡2min；
(3)离心，倒掉75％酒精，加入无水乙醇，摇晃；
(4)连同无水乙醇一起，将种子撒在滤纸上，待酒精挥发后，将滤纸上的种子直接撒入培养基中。
最终将含有拟南芥种子的培养基平板放置4℃中，低温春化2天，然后放置正常情况下进行生长。
待长出植株后，移苗，进行检测以确定是否为转基因植株，检测步骤如上述。
1.6亚历山大染色
利用亚历山大染色液对野生型，突变体拟南芥及回补后的转基因株系染色操作步骤：
(1)取新鲜花朵
(2)将花粉物质置于载玻片，滴加2-3滴亚历山大染色液。
(3)充分混合，立即盖上盖玻片染色5-10min。
(4)吸去多余液体，显微镜下观察。
结果如图3所示，野生型结荚正常，花粉活力正常，突变体不结荚，花药内无花粉，但是回补后的拟南芥表现出和野生型一致的表型，花粉活力正常，结荚正常。
实施例4：GhTKPR1_8基因在调控棉花雄性不育中的应用研究
1、实验步骤
1.1目标序列连接载体的合成
为了进一步阐明GhTKPR1_8基因对棉花育性的影响，本研究通过基于病毒介导的基因沉默技术沉默了棉花中的GhTKPR1_8基因，采用棉花品种中棉所24进行VIGS实验。选取的GhTKPR1_8基因的一段特异表达片段(核苷酸如SEQ ID NO.17所示)，利用双酶切位点SpeI、AscI，插入pCLCRVA载体，送至北京擎科生物科技有限公司，构建pCLCRVA:GhTKPR1_8载体。
SEQ ID NO.17：
GAGCCAAGGAGAGACTGAAATTGGTGAGGGCCGATCTACTGGAAGAAGGAAGCTTTGACGATGCAATCATGGGGTGTCAAGGCGTTTTCCACACTGCTTCCCCCACGGAAATCCTAGAACCGGCTGTGAAGGGCACATTGAATGTGCTAGGCTCATGTAAGAAGAACCCATCTCTCAGACGTGTAGTTCTCACATCGTCGTCTTCAACAGTGAGGGCTAGAGATGATTTTGACTACAAAATTCCCCTTGATGAGTCCTCTTGGAGCTCCCTTGAACTCTGCGAGACTTTGCGGGTTTGGTATGCATTGGCGAAAACCCAAGCTGAGAAGGCTG
1.2转LBA4404农杆菌
合成的基因质粒及菌液返回后，将质粒直接转农杆菌LBA4404，转农杆菌步骤如下：
(1)将从公司合成的基因干粉，离心加入40μl无菌水，振荡、混匀；
(2)取-80℃下保存的LBA4404农杆菌感受态于温室或手心片刻，待其部分融化，处于冰水混合物状态时插入冰中；
(3)向农杆菌感受态加入5μl质粒DNA，用手轻轻拨打管底混匀，依次冰上5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min；
(4)加入700μl无抗生素的L液体培养基，于28℃摇床振荡培养2-3小时；
(5)吸取50μl进行涂布，平板为含有卡那、利福平的双抗培养基(即RK固体培养基)；
(6)将平板倒置于28℃培养箱中2-3天；
(7)平板中长住菌落后，挑选单克隆菌落于300μl RK液体培养基，28℃摇菌3小时左右，进行检测；
(8)检测，挑选阳性菌进行保菌，或转移至30ml RK培养液中进行摇菌至浑浊黄色以备注射棉花幼苗植株；
1.3缓冲液的配置
在进行注注射棉花幼苗之前，需配置相应缓冲溶液，以激活菌的活性。
该缓冲溶液配置步骤如下：500ml所需量
向50ml超纯水中加入1.066g MES，溶解，并调整PH至5.6；
向50ml超纯水中加入1.0165g MgCI2.6H20,溶解；
将以上溶液混合定容至500ml
加AS溶液，按照1ml：2μl的比例加入，例如500ml,需1000μl。
(AS溶液配置：配置1ml，需19.62mg粉末，用DMSO溶液溶解)
以上配制好的缓冲液注意黑暗放置。
1.4注射幼苗
摇菌时，除含有pCLCRVA:GhTKPR1_8载体的菌液外，需阳性菌(PDS)、阴性菌(VA)、活性菌VB。
将摇好的菌液进行重悬，加入以上缓冲液进行混合，利用分光光度仪器调节OD值至1.5左右(调OD值前用缓冲液调零)，特别注意在调节OD值时，是在波长为600nm时；黑暗放置2至3小时后直接进行注射幼苗。
注射时，每个菌液均需加入等比例的VB菌液，混合后，进行注射；幼苗应为子叶刚刚展平植株；
注射后，将植株进行黑暗处理12小时以上，然后拿出正常培养，注意农杆菌活性所处于的温度不能太高。
1.5表达量的检测
表达量的检测：待注射阳性菌(PDS)的植株出现黄化表型后，取注射阴性菌(VA)、含有pCLCRVA:GhTKPR1_8菌液的棉花嫩叶进行RNA的提取、反转录得到相应cDNA，步骤均如上所述，以备目的基因的表达量检测。
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)步骤如上述。
2、结果分析
结果如图4在发育后期，叶片、茎、铃和花萼上出现了白斑，这表明CLCRV对棉花的系统性沉默是有效的(图4的A)。为了进一步验证pCLCRVA:GhTKPR1_8的株系是否构建成果，我们利用qRT-PCR分析pCLCRVA:GhTKPR1_8株系(Line1、Line2和Line3)中GhTKPR1_8表达水平。结果显示，与阴性对照相比，接种pCLCRV-GhTKPR1_8的3个株系中，GhTKPR1_8表达量显著降低约60％-70％，说明GhTKPR1_8基因的表达在pCLCRVA:GhTKPR1_8植株中明显被抑制，进一步验证了GhTKPR1_8的沉默株系构建成功(图4的E)。空白对照组pCLCRVA:00和阳性对照pCLCRV:PDS株系其花药色泽淡黄，花药开裂，亚历山大染色显示花粉染色深，其活力正常。与对照组相比，pCLCRVA:GhTKPR1_8营养生长无明显差异，花药色泽正常，但花药完全不开裂，经亚历山大染色，花粉染色浅，活力低(图4A-D)。因此，可以推断，抑制了GhTKPR1_8基因表达影响了棉花花药的发育，可能导致花粉发育异常。
利用qRT-PCR对pCLCRVA:GhTKPR1_8植株中GhCYP704B1、GhCYP703A2、GhABCG26(SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.23)的表达量进行分析。结果显示，沉默株系中GhCYP703A2相比于阴性对照下降30％-60％，GhABCG26的表达量下降10％-40％，但GhCYP704B1的表达量相比阴性对照上升10％-20％(图5的F-H)。
SEQ ID NO.18：ACACGAGAATCGGGGGAGGATT
SEQ ID NO.19：GGCTGAGGTGGAATCAAGACCG
SEQ ID NO.20：CCATTTGCAAGGTGGGGTTTGG
SEQ ID NO.21：AAACGACCGAGCGAAGCTGTTA
SEQ ID NO.22：GAAACATTCCGCATGCACCCTG
SEQ ID NO.23：GCATTTCCTTTTCCCGGCACTG
实施例5：GhTKPR1_8的表达受GhAMS调控的相关研究
1、试验材料
植物材料：本氏烟草由本实验室繁种并保存。
菌株及质粒：pGreenlI 62-SK及pGreenll 0800-LUC均由实验室保存。其余试验材料详见上述实验步骤
主要试剂：Dual-LuciferaseReport Assay system(Promega)、拟南芥原生质体制备及转化试剂盒(Coolaber)、质粒大提纯化试剂盒(威格拉斯)及Beetle LuciferinPostassium Salt(Promega)。
主要设备：酶标仪(赛默飞)、FR-1800全功能发光及荧光生物图像分析系统(上海复日)、其余试剂和设备详见上述实验步骤
2、实验步骤
2.1GhAMS开放阅读框序列的获取
利用SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25克隆GhAMS的CDS序列，其余见上述实验步骤。
SEQ ID NO.24：ATGAACATCTTTCAAAACCTCATGG
SEQ ID NO.25：TCATGCCGCTTGCTTTGGT
2.2载体构建
pGreenlI 62-SK采用Hind III以及Sal I进行双酶切，利用SEQ ID NO.26和SEQID NO.27将GhAMS连入载体。
SEQ ID NO.26：
ATTCGATATCAAGCTTATGAACATCTTTCAAAACCTCATGGAGAGAC
SEQ ID NO.27：CCCCCTCGAGGTCGACTGCCGCTTGCTTTGGTGGG
pGreenI10800-LUC采用Hind III以及BamHI进行双酶切，利用SEQ ID NO.28和SEQID NO.29将ProGhTKPR1_8的2000bp的片段连入载体。
SEQ ID NO.28：CGGTATCGATAAGCTTggcgattgatttagcggccg
SEQ ID NO.29：TAGAACTAGTGGATCCtgtgagcggataacaattcacacagaaac
2.3烟草与原生质体瞬时表达
(1)烟草注射时pGreenlI 62-SK及pGreenII 0800-LUC需要转入含有psoup的GV3101农杆菌，并且按照1：2的比例混合注射。
(2)原生质体转化时向200μL原生质体细胞溶液中加入10L浓度为1μg/uL的pGreenI 62-SK质粒及20μL浓度为1ug/uL的pGreenlI0800-LUC质粒。
(3)原生质体提取与质粒大提详见上述步骤
2.4双荧光素酶荧光的检测
(1)溶液的准备
将5×Passive Lysis Buffer(PLB)加蒸馏水稀释至1×，可临时储存在4°℃约30天。将LuciferaseAssay Substrate充分溶解在Luciferase Assay Buffer II中。将50×Stop&Glo Substrate使用Stop&Glo Buffer稀释至1×。
(2)将转化好的原生质体转移至圆底离心管，水平转头100g离心2min，轻轻倒出上清液。并用PBS重悬，同样速度进行离心，倒出上清液。
(3)加入200uL1×PLB，轻微晃动，室温孵育15min，期间会有原生质体的沉淀，保持轻微晃动，使原生质体充分裂解。
(4)将准备好的Luciferase Assay Substrate以及Stop&Glo Substrate分别吸入96孔板，方便之后酶标仪测量时可以用排枪同时吸取多孔的样品，同时加入原生质体中，保证反应时间相同。
(5)酶标仪设置2s延迟测量，10s读数，向不透明的酶标板中加入50L裂解后的原生质体以及50L配制好的Luciferase Assay Substrate，吸打混匀，进行萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase,LUC)数值的测量。
(6)读数后弹出酶标板，加入50L配制好的Stop&Glo Substrate吸打混匀，进行海肾荧光素酶(Ranilla Luciferase,Rluc,REN)数值的测量。
(7)计算LUC/REN值。
3、结果分析
如图5所示，烟草叶片左侧共转报告基因ProGhTKPR1_8::LUC和效应子SK-GhAMS的实验组合，烟草叶片右侧是报告基因ProGhTKPR1_8::LUC和空载体PGreenⅡ62-SK的对照组合。结果显示，如图5的A所示颜色从红色到蓝色分别代表荧光素酶活性由强到弱，对照和实验组合在烟草叶片中均显示出荧光素酶活性，说明GhTKPR1_8的启动子在烟草体内可正常激活LUC的表达。而烟草叶片右侧报告基因显示荧光素酶活性明显强于对照组合，揭示了GhAMS对GhTKPR1_8具有转录激活作用。为了进一步验证转录因子的激活调控作用，分别在拟南芥原生质体中瞬时表达对照和实验组合。结果如图5的B，组合ProGhTKPR1_8::LUC和空载体PGreenⅡ62-SK作为对照，共转报告基因ProGhTKPR1_8::LUC和效应子SK-GhAMS的LUC/REN的比值是对照的1.4倍，进一步验证了GhAMS对GhTKPR1_8具有一定的转录激活作用，但激活效果较弱。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述GhTKPR1_8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述GhTKPR1_8基因沉默导致功能缺失，进而导致植物雄性不育。
3.根据权利要求2所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，通过将靶向抑制或敲除GhTKPR1_8基因的生物材料转入植物。
4.根据权利要求3所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述生物材料包括实现GhTKPR1_8基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默的基因表达盒、表达载体或宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述表达载体为pCLCRVA:GhTKPR1_8载体。
6.根据权利要求5所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述pCLCRVA:GhTKPR1_8载体构建过程为：选择核苷酸如SEQ ID NO.17所示的GhTKPR1_8基因的一段特异表达片段，利用双酶切位点SpeI、AscI，插入pCLCRVA载体，获得pCLCRVA:GhTKPR1_8载体。
7.根据权利要求1所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述GhTKPR1_8基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述GhTKPR1_8基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求1所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述GhTKPR1_8基因控制花粉外壁形成，与花药开裂相关。
9.根据权利要求1所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述植物包括棉花和拟南芥。
10.根据权利要求1所述的GhTKPR1_8基因在调控植物雄性不育中的应用，其特征在于，棉花中GhTKPR1_8基因沉默获得的株系中GhTKPR1_8表达量显著降低约60％-70％。
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