KR20070059093A - 상류기술 및 하류기술에서 형질전환 식물체 종자의이력추적관리 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수확 전 및 수확 후에 형질전환 종자의 봉쇄 및 이력 추적관리를 증가시키는 개선된 방법에 관한 것이다. 시각적인 독특한 특징을 갖지 않는 동일한 종의 비-형질전환 종자로부터 현장에서 또는 수확 동안 및/또는 수확 후에 용이하게 구별되며 추적관리될 수 있는 종피 또는 종자의 다른 부위에 특징적인 착색과 같은 시각적인 독특한 특징을 가지며 형질전환 및 재생을 위해 용이하게 이용가능한 것을 특징으로 하는, 분자 농업에 적합한 식물 품종을 생산하고 선택하는 방법을 개시한다.

형질전환, 추적관리, 종자, 분자 농업

Description

상류기술 및 하류기술에서 형질전환 식물체 종자의 이력추적관리{Traceability of transgenic plant seeds in upstream and downstream processing}

본 발명은 식물 생물공학 분야에 속하며 상세하게는 형질전환을 위해 이용된 바람직한 품종의 표적화된 육종(targeted breeding)을 통해, 수확 이전 및 수확 이후에 형질전환 종자의 봉쇄(containment) 및 이력추적관리(traceability)를 개선하는 방법에 관한 것이다.

농작물 종자의 개발시 단백질 축적에 대한 고유한 생물학적 능력은 다수의 농작물, 특히, 단자엽성 식물이 이종기원의(heterologous) 재조합 단백질, 예를 들면, 제약 산업에서 이용되는 고-가치 폴리펩티드의 대량 생산; 종종 분자 농업(molecular farming)이라 불리는 제조 방법을 위한 실용적이고 효율적인 비히클이 될 수 있는 잠재력을 가진다는 것을 의미한다. 또한, 종자에 이종기원의 폴리펩티드를 저장하는 것은 이 종자들이 상기 이종기원의 폴리펩티드의 품질에 영향을 미치지 않고 수년간 저장될 수 있기 때문에 하류기술(down-stream processing) 비용을 감소시킨다. 그와 같은 단백질의 발현은 바람직하게는 종자-특이적 또는 내배유(endosperm)-특이적 프로모터의 제어 하에 놓인다.

생물공학 산업은 식량 및/또는 곡류와 같은 사료용 농작물, 약물 및 산업용 단백질을 생산하는 분야로의 발전을 지속하고 있는 반면에, 형질전환 식물체로부터 유래된 종자가 수확, 저장 또는 하류 처리(downstream processing) 동안 비-형질전환(non-transgenic) 종자들과의 혼합을 통해 인간의 식량 공급에 우발적으로 들어갈 수 있다는 우려가 커지고 있다. 이는 예를 들면, 분자 농업을 위해 생산된 형질전환 곡물로부터의 종자가 단순한 육안 검사에 의해 비-형질전환 종자로부터 식별될 수 없다는 사실에 의해 강조된다. 따라서, 분자 농업에서, 식량 공급 및 환경을 보호하기 위해 현장에서 또는 수확 및 하류 처리 동안 형질전환 종자를 비-형질전환 종자로부터 구별하는 간단한 기술이 긴급히 요구된다. 또한, 특정한 고-가치의 이종기원 단백질의 고 수준 발현을 위해 분자 농업에서 이용될 수 있는 효율적인 발현 카세트(streamlined expression cassett)에 추가적인 유전자를 첨가하지 않고 이 육안 추적을 달성하는 것이 긴급히 요구되고 있다. 그와 같은 기술은 제약 산업의 원재료로 의도된 형질전환 종자의 개선된 봉쇄(containment)를 위해 엄격한 가이드라인을 채택하는 데 있어서 중요한 인자일 것이다. 이는 우수 농작물 관리 규정(Good Agricultural Practices: GAP)에 관한 일반적인 가이드라인이 약물 및 산업용 효소의 모든 분자 농업에 대한 필요 조건으로 제시될 때 훨씬 더 중요하다.

간단한 육안 검사에 의해 비-형질전환 물질로부터 구별할 수 없는 형질전환 물질, 예를 들면 종자를 추적하는 것은 매우 어려울 수 있고 시간이 소요되며 지루한 추출 프로토콜 및 비교적 값비싼 진단 기술 예를 들면 정량적 PCR 및 실시간 PCR 또는 ELISA에 기초한다.

스크린가능한(screenable) 마커와 같은 유전적 마커가 유효한 형질전환에 대해 숙주 개체들을 스크리닝하기 위해 발현 벡터에서 이용될 수 있고, 그와 같은 마커들은 식물 조직에서 안토시아닌 색소(적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-좌(R-locus) 유전자(Dellaporta et al. 1988), 생물발광 검출을 가능하게 루시페라아제(lux) 유전자 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 포함한다. 그들은 유전자 전달 후에 조직 배양에서 유용할 수 있으나, 예를 들면, 인-시투 적용(in-situ applicaiton)의 어려움 또는 대상 식물체에서 결여될 수 있는 마커를 활성화하는 원형의(native) 생화학적 전구체 경로에 대한 요구 때문에, 이들 중 어느 것도 GM 농작물의 생물농업(biofarming)에서 대량 표지(labeling) 및 추적에 적용가능하지 않다.

또한, 식물 생물공학에서 이용되는 통상적인 형질전환 기법들은 종종 하나 이상의 세포로부터 유래하는 "키메라(chimeric)" 또는 "모자이크(mosaic)" 하이브리드 계통을 생산하고, 식물체 내로 도입된 관심의 대상인 이종기원 유전자를 발현하나 스크린가능한 마커는 발현하지 않는 식물체를 초래할 수 있다는 것에 유념해야 한다. 형질전환에서 발현 벡터에 의해 도입되는 스크린 가능한 마커의 발현은 종종 세대 간에 사라지고 따라서 그와 같은 마커는 육안 검사를 위해 신뢰할 수 없는 형질일 수 있다.

유전적으로 변형된 농작물 및 생물농업과 관련한 안전성 우려의 증가에 따라, 안전하게 봉쇄되며, 변형되지 않은 야생형 또는 경작된 식물체로부터 확실하게 구별가능한 유전적으로 변형된 식물체를 생산하는 안전하고 효과적인 방법이 긴급 하게 요구된다.

착색된(pigmentized) 종자의 단순한 육안 검사 또는 기계화된 시각화에 기초한 추적관리 기술(traceability technology)은 분자 농업 및 식물 생물공학에서 즉각적인 자산이 될 것이다. 또한, 분자 농업에서 유전적 봉쇄에 대한 절실하게 요구되는 보호수단(safeguard)을 도입할 수 있는 단순한 기술적 접근방법을 갖는 것은 매우 바람직할 것이다.

본 발명의 주요한 목적은 분자 농업에서 종자 물질의 생물학적 봉쇄 및 추적 관리의 수준을 강화하는 방법을 제공하는 것으로 요약된다. 전술된 목적의 바람직한 구체예에서, 주요한 접근방법은 분자 농업에 적합한 바람직한 식물체 숙주로 종피 또는 종자의 다른 부위의 특징적인 착색과 같은 시각적인 독특한 유전 형질을 도입하고 현장에서 또는 수확 동안 또는 수확 후에 종자의 특징적인 착색과 같은 시각적 특징을 갖지 않는 동일한 종의 비-형질전환 종자로부터 용이하게 식별되고 추적될 수 있는 종자를 갖는 원하는 이종기원의 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 생산하기 위해 이 새로운 품종(cultivar)을 비히클 또는 숙주 식물체로 이용하는 것이다.

통상적으로, 본 발명에 따라 이용되고 생산되는 식물체 및 식물 품종은 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물로부터 선택되고, 바람직한 구체예에서, 상기 식물은 평지씨, 대두, 보리, 옥수수, 밀, 귀리 및 쌀의 군으로부터 선택된다. 본 발명은 특히, 식물체의 종자에서 이종기원 단백질을 발현하고 축적하기 위해 이용되는 곡물과 같은 형질전환 식물체를 제조하고 이용하는 데 특히 유용하다. 도 1 및 도 2에 도시된 특정한 구체예에 의해 예시되는 바와 같이, 그와 같은 구체예에서, 본 발명의 형질전환 식물체는 비-형질전환 식물체로부터 구별될 뿐 아니라, 식물체의 줄기, 잎 등으로부터 분리된 형질전환 식물체로부터의 종자는 비-형질전환 종자로부터 용이하게 인식될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

보리, 및 특히 호르데움 불가리스(Hordeum vulgaris)는 우발적인 타가수분( cross-pollination)은 실제로 존재하지 않는 문제이기 때문에, 시각적으로 표지된 종자를 갖는 형질전환 식물체에서 원하는 이종기원의 단백질을 생산하기 위한 식물체 숙주로서 특히 유용하다는 것이 확인되었다.

본 발명자들은 그 자체로는 유전적 조작에 적합하지 않으나 그 품종의 식물체 및 그의 종자가 일반적인 경작용 또는 야생형 품종으로부터 용이하게 식별되게 하는 매우 독특한 시각적 특징을 갖는 드문 보리 품종을 발견하였다.

보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 시각적 특징, 예를 들면, 특히 단순한 가시화를 통해 용이하게 추적될 수 있는 착색된 종피 또는 종자를 갖는, 분자 농업에 적합한 신규한 숙주 식물체/품종을 생산하기 위해 역-교배 육종법(back-cross breeding)을 적용하고, 이에 의해 증가된 수준의 봉쇄를 가능하게 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 분자 농업에 적합한 것으로 선택된 보리 숙주 식물체가 착색된 종피 또는 종자에 대한 유전자 좌 또는 유전자 좌들을 갖는 공여(donor) 보리 식물체로부터의 화분으로 수분되는 것인 구체예에 의해 예시되며, 반복적인 역-교배를 통해, 용이하게 육안으로 식별가능하거나 또는 자동 검출 장치에 의해 식별가능한 착색된 종자 또는 종피와 같은 공여 식물체로부터의 시각적 특징을 갖는 것 외에 조직 배양 및 유전적 형질전환에 용이하게 이용될 수 있는 것을 포함한, 분자 농업에 적합한 원래의 식물 품종의 모든 필요한 특징들을 갖는 숙주 식물체를 생산하는 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 현장에서, 수확 동안 또는 수확 후에 용이하게 식별되고 시각적으로 추적될 수 있는 흑색 종자(black seed)를 갖는, 분자 농업에 적합한 신규한 동질 유전자형(isogenic) 보리 숙주 식물체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 그와 같은 동질 유전자형의 숙주 식물체는 모든 개별 식물체들이 종자 색에 실질적으로 변이 없이, 동일한 이배수체(double haploid) 유전적 구성(genetic makeup)을 가지기 때문에, 이종기원 단백질의 생산에서 재현성 및 안전성을 제공할 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 숙주 식물체, 특히, 흑색 종자를 갖는 분자 농업에 적합하고 조직 배양 및 유전적 형질전환에서 용이하게 이용가능한 동질 유전자형의 보리 숙주 식물체와 같은 숙주 식물체를 제조하는 방법으로서: (1) 조직 배양 및 유전적 형질전환에서 용이하게 이용가능한 품종으로부터 제1 보리 식물체를 선택하는 단계; (2) 유색의 종피를 가지며 상업적인 농업에서 통상적으로 이용되지 않는 품종으로부터 제2 보리 식물체를 선택하는 단계; (3) 상기 제2 식물체를 상기 제1 식물체와 교배시키는 단계, 즉, 하이브리드 Fl 식물체를 생성하기 위해 상기 유색의 종피(예를 들면, 흑색, 진회색 또는 진청색 또는 적색)를 갖는 상기 제2 식물체로부터의 화분으로 상기 제1 식물체를 수분시키는 단계; (4) 상기 하이브리드 F1 식물체를 조직 배양 및 유전적 형질전환에서 용이하게 이용가능한 품종과 역-교배시키는 단계; (5) 역-교배의 횟수에 따라, 상기 제2 식물체의 유색의 종피를 가지며 조직 배양 및 유전적 형질전환에서 용이하게 이용될 수 있는 상기 제1 식물체의 유전적 구성을 실질적으로 유지하는 하이브리드 품종 계통을 생성하기 위해 1회 내지 수회 상기 역-교배를 반복하는 단계; (6) 흑색 종피를 갖는 동질 유전자형의 품종 계통을 생성하기 위해 꽃밥-소포자(anther-microspore) 배양 절차를 이용하는 단계; (7) 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물로 복수 개의 그와 같은 동질 유전자형의 계통(isogenic line)을 형질전환시키고 유색의 종자를 가지며 조직배양 및 유전적 형질전환을 위해 이용가능한 가장 적합한 동질 유전자형의 분자 농업용 계통을 스크리닝하는 단계;를 포함한다. 본 발명의 방법의 구체예는 고-가치의 이종기원 단백질을 고-수준으로 발현하는, 착색된 종자를 갖는 형질전환 보리 계통을 생산하기 위해 원하는 이종기원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결된 식물-활성 프로모터(plant-active promoter)를 코딩하는 핵산 작제물로 그와 같은 적합한 동질 유전자형의 분자 농업용 계통을 형질전환시키는 추가적인 단계들을 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 명세서에서 "Dimma"로 표시되는 분자 농업용 동질 유전자형의 보리 품종이 신규한 보리 식물체의 구체예로서 제공된다.

본 발명은 분자 농업에서, 현장에서, 수확 동안 또는 수확 후에 형질전환 종자의 적합한 추적관리를 제공하는 현재의 이용가능한 기법들의 단점들을 성공적으로 해결한다. 특히, 본 발명은 형질전환 식물체로부터 유래된 종자가 수확 또는 보관 동안 형질전환 종자와 비-형질전환 종자의 혼합을 통해 우연히 인간 또는 동물의 식량 공급에 들어가게 되는 것인 종자 오염의 문제에 대한 간단한 해결책을 제공한다. 본 발명은 그와 같은 종자 오염의 위험을 감소시키는 경제적이고 신뢰할 수 있는 방법이다.

하기에서, 본 발명의 바람직한 구체예들이 상세하게 기재될 것이다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되고 이용되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분자 농업(molecular farming)"은 추가적인 처리를 위해 단백질과 같은 유용한 생물학적 화합물을 생산하기 위해 개방된 현장 또는 폐쇄된 시설에서 임의의 종류의 식물체를 이용하는 과정을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질(protein)"은 용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "펩티드(peptide)"와 호환적으로 이용된다.

용어 "종자 오염(seed contamination)"은 분자 농업을 위해 이용된, 곡물과 같은 식물체로부터의 종자가 식량 또는 사료 생산을 위해 이용되는 식물체로부터의 종자와 우발적으로 혼합된 경우를 의미한다. 용어 "봉쇄(containment)" 또는 "형질전환 종자의 봉쇄(containment of transgenic seeds)"는 형질전환 식물체 품종으로부터의 종자가 비-형질전환 종자로부터 성공적으로 분리되어 존재하고 현장에서, 수확 동안 또는 수확 후에 비-형질전환 종자와 혼합되지 않는 경우를 의미한다.

용어 "식물 품종(plant cultivar)"은 선택적 교배(selective hybridization)에 의해 생산될 수 있거나 또는 야생 모집단에서 발견될 수 있고 영양 번식(vegetative propagation) 또는 동종교배에 의한 종자(inbred seed)에 의해 유지되는, 경작에서 유래되고 지속되는 종류의 식물을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "원하는 모 품종(desirable parent cultivar)" 또는 "원하는 품종(desirable cultivar)"은 분자 농업을 위해 적합한 숙주 품종이 될 수 있도록 육종을 통해 변형되어 선택된 식물 품종을 의미한다. 용어 "숙주 품종(host cultivar)"은 분자 농업에서 재조합 단백질의 생산을 위해 식물 품종으로서 이용되기 위해 유전적으로 형질전환되는 품종을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "F₁ 세대(F₁ generation)" 또는 "F₁ 식물체(F₁ plant)" 또는 "F₁ 하이브리드(F₁ hybrid)"는 종자 또는 종피에서 특징적인 착색 패턴과 같은 원하는 형질을 갖는 품종과 원하는 품종 간의 교배에서 생성되는 제1 세대를 의미한다.

용어 "역-교배(back-crossing)"는 육종자가 반복적으로 하이브리드 자손(F₁ 내지 n은 1 또는 1보다 큰 것인 F_1+n)을 최초의 원하는 모 품종에 역으로 교배시키는 과정을 의미한다. 비-한정적인 예는 호르데움 불가리스 품종 "골든 프로미스"(원하는 모 품중)와 호르데움 불가리스 품종 "스바르토브디"(원하는 형질을 갖는 품종) 간의 하이브리드 자손이 반복적으로 최초의 원하는 모 품종 "골든 프로미스"와 역으로 교배되는 경우이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "동질 유전자형 계통(isogenic line)" 또는 "동질 유전자형의 보리(isogenic barley)"는 거의 모든 대립 유전자(allele)에 대해 반수성 이배체 계통 또는 동형접합체(homozygous)인 이배수체 보리 품종 또는 계통을 의미한다.

용어 "종자 착색(seed pigmentation)"은 종자 또는 종피에서 식물 세포에 의해 생산되는 색소 화합물의 축적을 의미한다. 용어 "특징적인 착색(characteristic pigmentation)"은 상업용 또는 일반적인 품종이 가질 수 착색 패턴으로부터 용이하게 구별되는 종자 또는 종피의 착색 패턴을 의미한다. 상업용 품종에서 착색 패턴의 비-한정적인 예는 호르데움 불가리스 품종 "골든 프로미스"에서 관찰되는 착색 패턴이다(도 1a). 특징적인 착색 패턴의 비-한정적인 예는 호르데움 불가리스 품종"스바르토브디"에서 관찰되는 착색 패턴이다(도 1b). "종피(Seed coat)" 또는 "종각(testa)"은 종자의 색소 층, 또는 보호성 외층을 포함하는, 종자의 외부 및 내부 외피(integument)를 의미한다. 비-한정적인 예로서, 본 발명에 따른, 보리 품종 "스바르토브디"의 종자에서 흑색 멜라닌-유사 색소 축적이 있다.

용어 "기계화된 검출 장치(mechanised detection equipment)" 또는 "자동 검출 장치(automatic detection equipment)"는 착색된 종자와 착색되지 않은 종자를 구별할 수 있는 도구 또는 장치이다. 용어 "육안 추적 관리(visual tracking)"는 종피 또는 종자의 다른 부위의 착색 또는 착색 패턴에 기초하여 종자를 추적하고 확인하는 수단을 의미한다. 그와 같은 검출 장치는 광원과 검출기 사이의 광 빔의 경로(light beam path)를 통과하는 시료 종자의 흡광도 및/또는 반사율을 측정하는 분광광도 분석법(spectrophotometric techniquee)에 기초할 수 있다. 적합한 패턴 인식 소프트웨어로 프로그래밍된 컴퓨터 장치에 연결된 CCD 또는 CMOS 검출기를 갖춘 머신 비젼 카메라(machine vision camera)가 또한 본 발명에 따른 시각적으로 표지된 종자의 자동 검출에 적용될 수 있다.

용어 "코딩 서열(coding sequence)"은 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"프로모터(promoter)"는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 하나 이상의 핵산 제어 서열 또는 전자 조절자 결합 부위의 배열로 정의된다.

용어 "형질전환(transformation)" 또는 "유전적 형질전환(genetic transformation)"은 유전적으로 안정한 계승(inheritance)를 가져오는, 핵산 분자의 숙주 개체의 게놈으로의 전달을 의미한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 개체는 "형질전환(transgenic)" 개체로 불린다. 본 발명의 "형질전환 식물 숙주 세포(transgenic plant host cell)"는 게놈 내에 안정적으로 통합된 하나 이상의 외래 핵산 분자, 바람직하게는 두 개의 외래 핵산 분자를 포함한다. 식물 형질전환의 방법의 예들은 아그로박테리움-매개 형질전환(De Blaere et al. 1987) 및 입자-충격(particle-bombardment) 또는 "유전자 총(gene gun)" 형질전환 기술(Klein et al. (1987); 미국특허 제4,945,050호)을 포함한다.

용어 "선택가능한 마커(selectable marker)" 또는 "선택가능한 마커 유전자(selectable marker gene)"는 그 유전자를 발현하는 세포 또는 개체에 독특한 표현형 형질을 부여하는 유전자로서, 상기 세포 또는 개체는 제초제 또는 항생제 또는 그 등가물과 같은 특정한 화학적 작용제의 독성에 대해 보다 높은 내성을 갖게 되는 것을 특징으로 하는 것인 유전자를 의미한다.

용어 "스크린 가능한 마커(screenable marker)"는 관찰 또는 테스트, 일반적으로 육안 검사를 통해 검출될 수 있는 세포 또는 개체의 표현형 형질을 의미한다.

조직 배양 및 유전적 형질전환을 위해 용이하게 이용될 수 있는, 분자 농업을 위한 원하는 식물 품종을 선택한 후에, 상기 원하는 품종의 종자로부터 시각적으로 용이하게 구별될 수 있는 종자를 갖는 또 다른 품종을 선택한다. 이 종자들은 일부 이디오피아 보리 품종의 흑색 종자, 또는 청색, 적색 또는 회색 또는 색상 패턴과 같은 상이한 색상 또는 착색을 가지거나, 또는 식량 또는 사료로 이용되는 품종의 종자로부터 시각적으로 용이하게 구별되는 다른 형태적 특징을 가질 수 있다. 일부 이디오피아 보리 품종의 흑색 종피와 같이, 독특한 특징을 담당하는 유전자 좌가 우성이며, 강한 침투도(penetrance)를 갖는 높은 유전성의 형질인 것이 바람직하다. 착색된 종자를 초래하는 높은 유전성의 형질을 갖는 다수의 상이한 보리 품종들이 문헌에 기재되어 있다. 분자 농업을 위한 바람직한 품종은 착색된 종자 또는 종피에 대한 원하는 형질을 갖는 품종과 수동적으로 교배되고, 하이브리드 자손은 상기 원하는 품종과 반복적으로 역-교배된다. 수 회의 역-교배(예를 들면, 2. 3, 4회, 또는 그 이상) 후에, 하이브리드는 조직 배양 및 유전적 형질전환에 대한 이용가능성(amenability)에 대해 테스트되고 최초의 원하는 품종과 비교된다. 하이브리드 계통의 조직 배양 및 유전적 형질전환에 대한 이용가능성이 충분하고 원하는 품종과 유사한 것으로 간주되면, 상기 하이브리드 계통은 바람직하게는 실시예 2에 기재되고 Kasha et al.(1992; 2001)에 의해 상세하게 기재된 꽃밥-소포자 배양 절차를 이용하여 이배수체 계통 또는 동질 유전자형 계통을 생성하기 위해 이용되어 착색된 종자의 원하는 형질에 대해 동형접합체인 이 하이브리드 품종 계통으로부터 계통을 생성한다. 이 동질 유전자형의 하이브리드 계통은 그 후 분자 농업을 위한 숙주 품종으로 이용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 복수의 동질 유전자형의 식물체들이 역-교배 후에 수득된 하이브리드 계통으로부터 수득된다; 개별적인 동질 유전자형 계통의 상이한 동질 유전자형의 유전적 구성은 다수의 F3 자손의 가능한 교배 결과를 나타내고; 상기 동질 유전자형의 식물체로부터의 종자가 파종되고 경작되며, 뒤이어 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환되고 효율적인 형질전환 및 발현에 대해 스크리닝되어 형질전환 및 조직 배양에 대한 이용가능성에 대해 테스트되고; 상기 테스팅에 근거하여, 원하는 이종기원의 단백질의 생산을 위한 형질전환 가능한 식물체로서 하나의 동질 유전자형 계통이 상기 복수 개의 동질 유전자형 식물체로부터 선택된다.

유전적으로 조작될 수 있는 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물이 본 발명에서 바람직한 품종으로서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 식물체는 단자엽 식물이고, 보다 바람직하게는 보리이며, 가장 바람직하게는 보리인 호르데움 불가리스이다. 유전적으로 형질전환될 수 있는 식물체는 코딩 영역에 대한 DNA 서열을 포함한 이종기원의 DNA 서열이 도입되고, 발현되며, 안정적으로 유지되고 후 세대의 자손들에게 전달될 수 있는 식물체이다. 예를 들면, 비알라포스(bialaphos) 또는 바스타(basta)를 포함하는 제초제 저항성, 또는 히그로마이신 저항성과 같은 항생제 저항성을 선택가능한 마커로 이용하는 유전적 변형 및 형질전환 방법이 보리 식물체를 생산하기 위해 이용되고 있다.

본 발명의 DNA 작제물에서 이용되는 프로모터는 원하는 이종기원의 폴리펩티드의 축적이 요구되는 종자 조직에서와 같은 시각적으로 구별가능한 식물체 부위에서 강한 활성을 갖는 것이 바람직하다. 그와 같은 프로모터는 다양한 식물 유전 물질 또는 식물 바이러스로부터 수득될 수 있다. 선택된 특정한 프로모터는 단자엽 종자, 보다 바람직하게는 보리, 및 가장 바람직하게는 종자의 내배유 조직에서의 이종기원의 단백질의 발현을 위해 적합한 것이 선호된다.

본 발명의 재조합 플라스미드는 원하는 DNA 서열을 세균 숙주 내에서 복제가능한 적합한 플라스미드로 라이게이션(삽입)하는 것에 의해 수득될 수 있다. 원하는 이종기원의 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 조직-특이적 종자 발현을 위해 설계된 DNA 프로모터 서열과 같은 DNA 서열은 프로모터 외에, 본 목적을 위해, 원하는 경우, 추가적인 인핸서 DNA 서열, 스카폴드(scaffold)-결합 영역, 인트론, 폴리(A) 추가 신호, 리보종 결합 서열 및 히드로마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자, 비알라포스 저항성 유전자 등과 같은 원하는 선택가능한 마커 유전자를 포함할 수 있는 플라스미드에 작동가능하게 연결되어야 한다. 그와 같은 선택가능한 마커가 보리 식물체의 형질전환에서 바람직하며, 이는 그 형질전환 효율이 비교적 낮고 따라서, 비-형질전환된 세포들로부터 양성의 형질전환된 세포들을 선택할 수 있는 것이 바람직하기 때문이다.

도 1은 보리 품종 "골든 프로미스(Golden Promise)"(a), "스바르토브디(Svarthovdi)"(b) 및 동질 유전자형 보리 하이브리드 계통 "Dimma"(c)로부터의 완전히 발육된 종자의 사진이다.

도 2는 "Dimma"와 품종 "골든 프로미스" 종자의 혼합물에서 "Dimma" 종자의 시각적 차이를 보여준다.

도 3은 본 발명에 따른 "Dimma"의 형질전환 및 선택을 위해 이용된 발현 카세트 pbGF20lif의 개략적 표현을 도시한다. 약어: Dhor, endosperm-specific D-hordein promoter(내배유-특이적 D-호르데인 프로모터); pb, signal peptide(신호 펩티드); lif, leukemia inhibitory factor cDNA sequence(백혈병 억제 인자 cDNA 서열); p, linker(링커); CBM, carbohydrate binding module cDNA(탄수화물 결합 모듈 cDNA); pinII, potato proteinase inhibitor II gene termination signal(감자 프로테이나아제 억제자 II 유전자 종결 신호); 35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter(코올리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터); hph, hygromycin phosphotransferase from E. coli(대장균 유래의 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제)(Genebank accession #K01193); nos, nopaline synthase termination signal(노팔린 신타아제 종결 신호); R, right border(우측 경계); L, left border(좌측 경계).

하기의 실시예들은 본 발명을 보다 잘 정의하고 본 발명의 실시에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않으면, 용어는 관련 기술 분야에서 당업자들이 이용하는 통상적인 용법에 따라 이해된다.

방법

교배 및 역-교배에서 보리 계통의 인공 수분

호르데움 불가리스 또는 보리는 자가수정(self-fertilizing) 식물이고, 이는 하나의 꽃으로부터의 화분이 통상적으로 동일한 꽃의 배주(ovule)를 수분시키는 것을 의미한다. 경작 시, 자가-수분은 궁극적으로 동질 유전자형(isogenic line) 또는 동질 유전자형에 가까운 계통을 초래하며, 이는 모든 또는 대부분의 대립 유전자가 동형접합체라는 것을 의미한다. 그와 같은 자가-수정 종으로 새로운 형질 또는 표현형을 도입하기 위해서, 인공 수분 또는 이종 교배(crossing)가 필요하다. 보리에서 인공 수분, 또는 교배는 온실에서 수행하였다. 개시 시에, 특정한 원하는 형질을 갖는 두 개의 품종을 선택하고, 그들의 종자를 분(pot)에 심었다. 교배를 위해 선택된 모 식물의 발육 단계가 융화가능하도록 하기 위해 수일에 걸쳐 파종(sowing)을 반복했다. 인공 수분은 두 단계로 수행하였다. 제1 단계는 숙주 품종 상의 꽃이 완전히 만개하거나, 또는 수상화서(spike) 하부의 곁눈이 엽초(leaf sheath)로부터 나온 직후에 수행했다. 그 후, 수상화서 상의 각각의 꽃 또는 수상화(spikelet)를 열고, 꽃 내부에 있는 세 개의 수술을 집게(forcep)로 제거하였다. 화분의 수상화로의 확산을 방지하고 꽃의 건조를 방지하기 위해 각각의 처리된 수상화서에 봉지를 씌웠다(bag). 제2 단계는 실질적인 인공 수분 또는 교배이며, 수술 제거 후 3 내지 5일 후에 또는 숙주 품종에서 심피(carpel)가 완전히 발육되어 수분될 준비가 되었을 때 수행하였다. 자신의 화분을 자기 자신의 심피 상에 흩뜨리지 않고, 완전히 발육된 공여 품종의 수술을 선택하여 수술이 제거된 숙주 수상화를 수분시키기 위해 이용하였다. 인공 수분의 성공률은 통상적으로 50% 내지 70%였다.

이배체, 동질 유전자형의 보리 하이브리드 계통의 생산

본 방법은 Kasha et al.(2001)에 의해 개발된 프로토콜에 기초한다. 종자를 75% 경수태(light sphagnum peat) 및 25% 부석(중간 입자 크기)의 혼합물에 파종하고 식물체를 주간 동안 냉백(cool-white) 형광에 의한 250 μmol m^-2s^-1의 연속적인 광 하에서 필요한 경우 물을 덜 대면서(sub-irrigate) 주간(16 시간)에는 16℃, 야간(8 시간)에는 12℃ 및 70% 상대 습도 하에 생장시켰다. 이와 같은 조건에서, 미성숙한 수상화서가 적합한 단계에 수집될 수 있을 때까지 약 55-95일간 식물체를 영양적으로(vegetatively) 생장시켰다. 소포자를 배양하는 이상적인 단계는 단핵 단계의 중-후반(mid to late-uninucleate stage)이다. 수집한 후, 수상화서를 무명지(cheese cloth) 상에 배치하고 80% EtOH을 고르게 분무한 후, 무명지로 싸고 5분간 건조시켰다. 엽초로부터 수상화서를 제거하고 멸균된 페트리 플레이트 상에, 각 플레이트 당 약 10개의 수상화서를 배치했다. 각 플레이트에 15 ml의 0.3 M 만니톨을 첨가하고 투명한 플라스틱 랩으로 밀봉한 후, 알루미늄 호일을 덮고 4℃에서 3-4일간 보관하였다. 그 후, 사전-처리된 수상화서로부터 말단을 절단하여 버리고 수 상화서를 1-2 cm 조각들로 잘라서 차가운(ice-cold) 만니톨이 담긴 냉각된 블렌더 컵에 넣었다. 성분들을 Waring 블렌더에서 낮은 속도로 5초간 블렌딩하고 그 슬러리를 500μ+200μ 나일론 막을 통해 여과시켰다. 여과액을 회수하고 100μ 막을 통해 여과하여 50 ml BD 팔콘 튜브에 모았다. 상기 튜브를 5분간 스피닝하고(spun) 액체를 조심스럽게 따라내고, 0.3 M 만니톨로 세척하고 하나 또는 두 개의 50 ml 튜브에 합치고, 5분간 스피닝하여 50ml 튜브로부터 액체는 따라내고, 펠렛을 2 ml의 만니톨에 재-현탁시키고 15 ml 팔콘 튜브에 담긴 약 12 ml의 20% 말토오스로 피펫에 의해 옮겼다. 상기 튜브를 5분간 스피닝하고, 살아있는 소포자를 상기 튜브의 중간부 위에 있는 층으로부터 피펫으로 모아서, 만니톨에 재현탁시키고 5분간 스피닝한 후 소포자 펠렛을 2 ml FHG 배지에 재현탁시켰다. 그 후, 소포자 현탁액을 피펫을 이용하여 진공 하에 자기 깔때기(porcelain funnel)의 미리-적신 여과지 상에 조심스럽게 옮겼다. 최-상위(top-most) 여과지를 페트리 디쉬에 담긴 FHG-고형화된 배지의 중심부 상으로 옮기고 플레이트를 플라스틱 랩으로 밀봉하여 암기, 25℃에서 3-4주간 방치하였다. 7-10일 후에, 새로운 액체 FHG를 상기 플레이트에 첨가하였다. 배-유사 구조의 크기가 1-2mm에 도달했을 때, 이들을 MS 분화 배지로 옮겨서 암기에서 3일간 방치하고 그 후 22℃, 8시간 명기로 옮겨서 수주 간 방치하였다. 작은 식물(3-4 cm)을 상자에 담긴 MS 재생 배지로 옮기고 뿌리가 발육되자마자 이식했다.

보리 하이브리드 계통에서 조직 배양 및 유전적 형질전환의 이용가능성 평가

a) 유전적 형질전환용 식물 재료

호르데움 불가리스 품종 골든 프로미스 종자 및 상이한 하이브리드 계통으로부터의 종자를 75% 경수태 및 25% 부석(중간 입자 크기)의 혼합물에 파종하고 식물체를 주간 동안 냉백 형광에 의한 250 μmol m^-2s^-1의 연속적인 광 하에서 필요한 경우 물을 덜 대면서 주간(16 시간)에는 16℃, 야간(8 시간)에는 12℃ 및 70% 상대 습도 하에 생장시켰다. 이와 같은 조건에서, 약 55-95일간 또는 미성숙한 종자가 형질전환용 재료로서 준비될 때까지, 개화 후 약 8 내지 14일까지 식물체를 영양적으로 생장시켰다. 종자를 회전식 진탕 배양기(rotary shaker)에서 40분간 3% 하이포아염소산나트륨으로 멸균하고 멸균수를 5회 교환하여 세정하였다.

b) 세균 균주 및 식물 형질전환의 준비

원하는 이종기원의 단백질의 발현을 조절하는 DNA 작제물을 갖는 T-DNA 영역을 보리에 도입하기 위해, vir 영역을 갖는 Ti-플라스미드와 트랜스로 바이너리 벡터(binary vector)를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하였다. 대장균 XL-Blue 및 아그로박테리움 투메파시엔스의 형질전환은 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982)에 기재된 바와 같이 전기천공법(electroporation)에 의해 수행하였다. 식물의 형질전환을 준비하기 위해, 아그로박테리움 배양의 단일 콜로니를 5 ml 아그로(Agro) 배지(트립톤 5 g/L, 효모 추출물 2.5 g/L, 만니톨 5 g/L, 글루탐산 1 g/L, KH₂PO₄ 250 mg/L, MgSO₄-7H₂O 100 mg/L, 비오틴 1 ㎍/L, pH 7.0, 25 ㎍/ml 리팜피신, 50 ㎍/ml 스펙티노마이신)에 접종하고 27℃에서 24 내지 40시간 배양하였다. 멸균된 에펜도르프 튜브에서, 200㎕의 30% 글리세롤 수용액(사전에 멸균됨)에 200㎕의 배양액을 첨가한 후 잘 볼텍싱하고 작업대(bench)에서 2 시간 동안 방치하고 -80℃에서 보관하였다. 각 형질전환 수행 시, 하나의 튜브를 -80℃ 냉동고로부터 꺼내서 해동하고 약 200㎕의 아그로벡테리움 균주 스톡을 항생제를 포함하지 않는 아그로 배지에 첨가하였다. 그 후, 배양물을 식물 재료로의 접종을 위해 이용하기 전에 27℃에서 17 내지 20시간 동안 배양하였다(하기 참조).

c) 아그로박테리움-유도 형질전환을 위한 보리 외식편의 제조

1일 차에 개화 후 약 8 내지 14일 경과된 약 10개의 보리의 두부(barley head)를 채취하고, 까끄라기(awn) 및 종자를 제거하고 크기가 1.5 mm 내지 2 mm인 배를 선택하였다. 초기 식물 재료는 건강하고 성숙된 것이어야 하며, 물에 젖지 않아야 하며, 종자는 질병 또는 진균의 징후 없이 녹색이어야 한다. 종자를 50 ml 팔콘 튜브에 넣고(총 용량의 반이 넘지 않아야 함) 70% 에탄올로 세정한 후 에탄올을 따라냈다. 그 후, 20% 표백 용액(White King)을 첨가하고 20분간 혼합시켰다. 층상 기류 후드(laminar airflow hood)에서 상기 표백 용액을 따라 내고, 종자를 멸균 수로 세정하고(약 5-8회) 튜브를 4 ℃ O/N에 두었다. 2일 차에, 두 개의 종자를 현미경 플랫폼 상에 놓인 멸균된 페트리 디쉬에 놓았다. 배의 위치를 확인하고, 종자 로부터 말단부를 잘라내고 종자의 측부를 절단하였다. 그 후, 종자를 집게로 고정한 후에 종자의 중간을 눌러서 배가 빠져나오게 하였다. 배를 집게로 고정하고 칼날을 배반과 축 사이의 홈(groove)에 삽입하고 축을 서서히 절개하였다. 축이 제거된 배( embryo minus the axis)을 페트리 디쉬의 중앙에서 재생 배지 상에 절단된 면이 위를 향하도록 배치하여, 각 플레이트당 약 25개의 배가 놓이게 하였다. 각 형질전환을 위해, 총 200개의 배를 이용하였다.

d) 바이너리 벡터(binary vector)의 취급

바이너리 벡터는 37℃에서 100㎍/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 대장균 Xl-Blue LB 배양 배지에서 증식시키고 뒤이어 QIAGEN® Plasmid Midi Kit를 이용하여 밤새 배양한 100 ml 배양물로부터 벡터를 정제하였다. 0.1 cm 갭을 갖는 멸균된 큐벳(BioRad)에 1 ㎕(1 ㎍)의 벡터를 넣고, 상기 벡터를 40㎕의 전기천공 가능한 세포(electrocompetent cell)로 흘려넣고, 전기 천공을 위해 전압을 2.5 kV, 전기용량(capacitance)를 21μF로 설정하여, 정제된 바이너리 벡터를 전기천공에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스로 도입시켰다. 세포들을 100 ㎍/ml 스펙티노마이신 및 20 ㎍/ml 리팜피신을 포함하는 YEP 선택 배지 상에 도말(spread)하고 28℃에서 2일간 배양하였다. 바이너리 벡터의 무손상(intactness)를 확인하기 위해 A. 투메파시엔스 형질전환체로부터의 플라스미드 제한효소 분석을 수행하였다.

e) 보리 외식편의 아그로박테리움 감염

약 10 ㎕의 아그로박테리움 배양액을 모든 배가 상기 용액과 접촉하도록 하기 위해 각 배 상에 피펫을 이용하여 적용했다. (절단 면이 하부를 향하도록) 배를 뒤집고 재생 배지 상에서 플레이트의 외부로 쓸어내어(drag), 과량의 아그로박테리움을 제거하였다. 그 후, 배를 균일하게 배치된 간격으로(플레이트 당 25개) 신선한 재생 배지 플레이트로 옮기고(절단 면이 상부를 향하게 함) 24℃에서 암실(dark cabinet)에 방치하였다.

아그로박테리움 감염 후 보리 조직 배양에서의 재생 및 기관 형성

3일 후에, 배를 비알라포스 또는 히그로마이신과 같은 선택가능한 마커를 포함하는 신선한 재생 배질로 옮기고 4 내지 6주 동안 방치하고 2주 간격으로 계대배양하였다. 엽조(shoot)를 재생하기 위해, 캘루스(callus)를 엽조-유도 배지(SIM)으로 옮기고 작은 식물(plantlet)이 형성될 때까지 생존 캘루스 및 재생 엽조를 2주 간격으로 신선한 SIM으로 옮겼다. 그 후, 작은 식물을 뿌리-유도 배지(RIM)으로 옮기고, 생존한 식물체를 계수한 후 토양에 심었다. 1 개월 후에, 토양에서 각 식물로부터 엽 외식편(leaf explant)을 채취하여 형질전환 유전자의 PCR 스크니링을 수행하고 아그로박테리움이 접종된 100 개의 배당 생성된 형질전환 식물체의 수를 계산하였다.

형질전환 계통의 DNA 추출 및 PCR 분석

PCR 증폭을 위한 게놈 DNA를 Clonetech의 NucleoSpin Plant Kit®를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 약 200 mg의 어린 잎 조직으로부터 추출하였다. 히그로 마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자(hph)의 PCR 증폭을 25㎕ 반응 혼합물(50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl₂, 200 μM의 각 dNTP, 약 0.25 μM의 프라이머, 2.5 U Taq 폴리머라아제(Fermentas) 및 50 ng 내지 100 ng 주형 DNA)로 수행하였다. PCR 반응은 먼저 94℃에서 3분을 수행하고, 하기 단계들로 이루어진 사이클을 31회 반복하였다: 66℃ 30초, 72℃ 45초, 94℃ 30초. 증폭 반응은 72℃에서의 4분의 신장 단계로 종료하였다. 증폭을 위해, 두 개의 hph 특이적 프라이머(hphl29 and hphl30)를 이용하였다. 프라이머의 서열은 하기와 같다: hph 129, 5'-CGGGCGCCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3' (서열번호: 1); hphl30, 5'-CGGGCGCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3' (서열번호: 2).

실시예 1

흑색 종자를 갖는 형질전환 가능한 보리 하이브리드의 육종

식물 형질전환 및 조직 배양을 통한 식물 재생에 이용가능한 호르데움 불가리스 품종 골든 프로미스로부터의 종자를 분에 심었다. 수일에 걸쳐 파종을 반복하고 식물체는 온실에서 자연 채광 하에 생장시켰다. 동시에, 흑색 종자를 가지나 식물 형질변환 및 조직 배양을 통한 식물 재생에 이용가능하지 않은 "스바르토브디"라 불리는 호르데움 불가리스 품종으로부터의 종자를 심고 동일한 조건에서 생장시켰다. 흑색 종자는 "스바르토브디"의 우성 형질이고 그 표현형은 종자의 종피 또는 호분층에서 나타났다. 종자가 완전히 성숙한 경우, 50% 이상의 종피는 흑색 착색을 보였다. 골든 프로미스 품종 상에 꽃이 막 개화하거나 또는 수상화서 하부의 곁눈이 엽초로부터 나온 직후에, 수상화서 상의 10송이의 꽃 또는 작은 수상화를 절개하고 그 꽃 안에 있는 3 개의 수술을 집게로 제거하였다. 화분의 수상화로의 확산을 방지하고 꽃의 건조를 방지하기 위해 각각의 처리된 수상화서에 봉지를 씌웠다. 4일 후에 "스바르토브디" 품종의 완전히 생장된 수술을 채취하고 수술이 제거된 골든 프로미스의 10 송이의 꽃의 심피를 수분시키기 위해 이용하였다. 수분 후에, 수상화서는 봉지를 씌운 채로 유지하고 종자는 완전히 생장할 때까지 채취하지 않았다. 이 종자들에서 F1 배는 흑색 대립 유전자에 대해 모두 이형접합체이다. 유전적 배경은 50% 골든 프로미스 및 50% "스바르토브디"로 흑색 대립 형질이 우성이기 때문에 흑색 종피를 가졌다. 모든 처리된 F1 종자를 분에 심고 작은 수상화가 골든 프로미스로부터의 화분에 의한 역-교배를 위해 준비될 때까지 생장시켰다. 골든 프로미스와의 역-교배는 전술된 바와 같이 수행하였고, F2 종자를 분에 심고 작은 수상화가 골든 프로미스로부터의 수분에 의한 역-교배의 반복을 위해 준비될 때까지 F2 식물체를 온실 조건 하에서 생장시켰다. F2 식물체의 유전적 배경은 75% 골든 프로미스 및 25% "스바르토브디"로 산출되었다. 전술된 바와 같이, 작은 수상화가 골든 프로미스로부터의 화분에 의한 역-교배의 반복을 위해 준비될 때까지 F2 식물체를 온실 조건 하에서 생장시켰다. F3 식물체의 유전적 배경은 87.5% 골든 프로미스 및 12.5% "스바르토브디"이어야 한다. F3의 작은 수상화를 자가-수분시키고 생장시켜 완전히 성숙한 F3 종자를 얻었다. F3 종자의 75%는 흑색 표현형을 가졌고 25%는 전통적인 황색 종자 표현형을 가졌다. 흑색 F3 종자를 수집하여 분에 심고, 흑색 종자 표현형 또는 황색 종자 표현형에 대해 동형접합체이고, 모두 식물 형질전환 및 식물 재생을 위해 이용가능한 골든 프로미스로부터의 유전적 배경이 우세한(87.5%로 산출됨) 이배수체의 동질 유전자형 하이브리드 계통을 생산하기 위한 소포자 배양을 위해 소포자가 수확될 수 있을 때까지 온실 조건 하에서 F3 식물체를 생장시켰다. 동질 유전자형 하이브리드 계통을 성숙기까지 생장시키고 흑색 종자 표현형을 갖는 계통을 회수하여 식물 형질변환 및 식물 재생에 대한 이용가능성에 대해 테스트하였다.

실시예 2

흑색 종자를 가지며 유전적 형질전환을 이용한 조직 배양을 통한 식물 재생 및 식물 형질전환에 이용가능한 보리 하이브리드 계통의 선택

개화 후 약 8 내지 14일 후에 50개의 하이브리드 이배수체 동질 유전자형 계통의 미성숙 종자를 수확하고 암기에서 4℃에서 밤새 저장하였다. 냉소에서 방치되었던(cold-incubated) 미성숙 종자를 70% EtOH로 1분간 처리하고 10분간 0.6% 하이포아염소산나트륨에서 처리한 후 뒤이어 멸균 증류수로 철저하게 세척(5-8회)한 후 멸균 조건의 층상 기류 후드에서 해부현미경 아래에 놓인 멸균 페트리 디쉬 상에 배치했다. 배의 위치를 확인하고, 종자로부터 말단부를 잘라내고 종자의 측부를 절개하였다. 그 후, 종자를 집게로 고정한 후에 종자의 중간을 눌러서 배가 빠져나오게 하였다. 배를 집게로 고정하고 칼날을 배반과 축 사이의 홈에 삽입하고 축을 서서히 절개하였다. 배반을 캘루스(callus) 유도 배지 상에 절단된 면이 상부가 되도 록 배치하고, 식물 형질전환 벡터 pbGF20lif (서열번호: 3, 도 3 및 전술된 설명 참조)를 가진 완전한(full-strength) 아그로박테리움 투메파시엔스 25 ㎕ 내지 40 ㎕를 1 내지 5분간 접종하였다. 접종 후에, 배반을 디쉬의 외부로 끌어내어 세균 로드를 낮추고 동시-배양(co-cultivation)기 동안 과다 성장을 저하시켰다. 감염된 배반을 새로운 캘루스 유도 배지 플레이트로 옮기고 플레이트를 암기에서 24℃에서 3일간 배양하였다. 3일 후에, 배반을 아그로박테리움을 살해하기 위한 100 ㎍/ml 티멘틴 및 형질전환된 세포를 선택하기 위한 50 ㎍/ml의 히그로마이신을 포함하는 새로운 칼루스 유도 배지로 옮겨서 암기에서 24℃에서 4주간 배양하고 2주 후에 계대배양하였다. 그 후, 캘루스를 2.5 mg/L BAP, 50 ㎍/ml 티멘틴 및 25 ㎍/ml 히그로마이신을 포함하는 아조 유도 배지로 옮기고 높은 광 조건에서 4 내지 10주간 배양하였다. 개개의 재생되는 작은 식물을 뿌리 유도 배지(rooting medium)(50 ㎍/ml 티멘틴 및 25 ㎍/ml 히그로마이신 포함 및 호르몬 불포함)로 옮겼다. 뿌리를 가진 약 5 내지 7 cm의 아조로 생장한 후에, 형질전환 식물체를 토양으로 옮겨서 완전한 광 조건 하에서 생장시켰다. 형질전환 계통으로부터의 종자를 대상으로 lif-cbm 이종기원 융합 단백질의 발현 여부에 대해, 토끼에서 cbm(셀룰로오스 결합 모듈)에 대해 생성된 폴리클론 항체에 의한 ELISA를 이용하여 스크리닝하였다. 가장 높은 백분율의 형질전환 식물체를 생성한 하이브리드 이배수체 동질유전자형 계통을 분자 농업을 위해 가장 적합한 계통으로 선택하고 "Dimma"로 명명하였다.

실시예 3

원하는 이종기원 단백질의 생산

실시예 2에서 선택되어 Dimma로 명명된 식물 계통으로부터의 종자를 lif-cbm 코딩 서열 대신에 원하는 이종기원 단백질을 코딩하는 유전자가 발현 벡터에 도입된 것을 제외하고는 전술된 바와 같이 형질전환시켰다. 성공적인 형질전환체를 파종하고 생장시켰다; 종자를 채취하고 그로부터 원하는 단백질을 추출하였다. 원하는 이종기원 단백질을 cbm 융합 단백질로 발현시키는 것이 특히 바람직한데, 이는 그와 같은 융합 단백질은 대량으로 용이하게 추출되고 정제될 수 있으며 cbm 코딩 서열과 상기 원하는 이종기원 단백질을 코딩하는 서열 사이에 적합한 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위를 도입하는 것에 의해 상기 융합 단백질의 cbm 부분은 선택적으로 이종기원 단백질로부터 절단되어 원하는 분리될 수 있기 때문이다. 그와 같은 방법은 본 명세서에 원용에 의해 그 전체가 포함된 본 출원인의 공동 계류 중인 WO 2005/021762 및 WO 2005/021764에 상세하게 기재된다.

본 발명의 바람직한 구체예들만 구체적으로 예시되었으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 전술된 실시예에 기재된 바와 같은 본 발명에서 본 발명의 원칙 및 의도된 범위를 벗어나지 않으면서 다수의 수정 및 변형이 일어날 것으로 예상한다.

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SEQUENCE LISTING <110> ORF EHF. ORVAR, Bjorn <120> TRACEABILITY OF TRANSGENIC SEEDS IN UPSTREAM AND DOWNSTREAM PROCESSING <130> P5395PC00 <150> IS 7396 <151> 2004-08-11 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA primer <400> 1 cgggcgccat gaaaaagcct gaactcaccg cgacg 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA primer <400> 2 cgggcgccct attcctttgc cctcggacga gtgc 34 <210> 3 <211> 4313 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> expression vector <400> 3 gaattccctt cgagtgcccg ccgatttgcc agcaatggct aacagacaca tattctgcca 60 aaaccccaga acaataatca cttctcgtag atgaagagaa cagaccaaga tacaaacgtc 120 cacgcttcag caaacagtac cccagaacta ggattaagcc gattacgcgg ctttagcaga 180 ccgtccaaaa aaactgtttt gcaaagctcc aattcctcct tgcttatcca atttcttttg 240 tgttggcaaa ctgcacttgt ccaaccgatt ttgttcttcc cgtgtttctt cttaggctaa 300 ctaacacagc cgtgcacata gccatggtcc ggaatcttca cctcgtccct ataaaagccc 360 agccaatctc cacaatctca tcatcaccga gaacaccgag aaccacaaaa ctagagatca 420 attcattgac agtccaccga gatggctaag cggctggtcc tctttgtggc ggtaatcgtc 480 gccctcgtgg ctctcaccac cgctgaacgt cccatggtgg ccaccgccaa gtacggcacc 540 ccagtgatcg acggggagat cgacgagatc tggaacacca ccgaggagat cgagaccaag 600 gccgtggccg tggggagcct cgacaagaac gccaccgcca aggtgcgcgt gctctgggac 660 gagaactacc tctacgtgct cgccatcgtg aaggacccag tgctcaacaa ggacaacagc 720 aacccctggg agcaagacag cgtggagatc ttcatcgacg agaacaacca caagaccggc 780 tactacgagg acgacgacgc ccaattccgc gtgaactaca tgaacgagca aaccttcggg 840 accggcggga gcccagcccg cttcaagacc gccgtgaagc tcatcgaggg gggctacatc 900 gtggaggccg ccatcaagtg gaagaccatc aagccaaccc caaacaccgt gatcggcttc 960 aacatccaag tgaacgacgc caacgagaag gggcaacgcg tggggatcat cagctggagc 1020 gacccaacca acaacagctg gcgcgaccca agcaagttcg ggaacctccg cctcatcaag 1080 ccaaccccaa ccccattgta caccgacgac gacgacaagt ccccactccc aatcacccca 1140 gtgaacgcca cctgcgccat caggcaccca tgccacggca acctcatgaa ccagatcaag 1200 aaccagctcg cccagctcaa cggctccgcc aacgccctct tcatctccta ctacaccgcc 1260 cagggcgagc cattcccaaa caacgtggag aagctctgcg ccccaaacat gaccgacttc 1320 ccatccttcc acggcaacgg caccgaaaag accaagctcg tggagctgta ccgcatggtg 1380 gcctacctct ccgcctccct caccaacatc accagggacc agaaggtgct caacccaacc 1440 gccgtgtccc tccaggtgaa gctcaacgcc accatcgacg tgatgagggg cctcctctcc 1500 aacgtgctct gccgcctctg caacaagtac cgcgtgggcc acgtggacgt gccaccagtg 1560 ccagaccact ccgacaagga ggccttccag aggaagaagc tcggctgcca gctcctcggc 1620 acctacaagc aggtgatctc cgtggtggtc caggccttca tcagcgtggt cgtccaggcg 1680 ttctgaggcg cgccacttaa ataatgtatg aaataaaagg atgcacgcat agtgacatgc 1740 taatcactat aatgtgggca tcaaagttgt gtgttatgtg taattactag ttatctgaat 1800 aaaagagaaa gaggtcatcc atatttcttt tcctaaagaa atgtcacgtg tctttataat 1860 tctttgatga accagatgca ttttattaac caaatccata tacatataaa tattaatcat 1920 atataattaa tatcaattgg gttagcaaaa caaatctagt ctaggtgtgt tttgctaatt 1980 attgggggat agtgcagaaa gaaatctacg ttctcaataa ttcagataga aaacttaata 2040 aagtgagata atttacatag attgctttta tcctttgata catgtgaaac catgcatgat 2100 ataaggaaaa tagatagata agcttggcat gcctgcaggt ccgattgaga cttttcaaca 2160 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 2220 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 2280 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 2340 caccgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatgg 2400 ccgattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggagacc tcctcggatt ccattgccca 2460 gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 2520 cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccagagat 2580 ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 2640 caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 2700 tcgcaagacc cttcctcaat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggag atctttttat 2760 ttttaatttt ctttcaaata cttcccgggc ctctagagcg atcgcgggat cccgcgatcg 2820 ccaccatgaa gaagccagag cttaccgcca cctccgtgga gaagttcctc atcgagaagt 2880 tcgactccgt gtccgacctc atgcaactct ccgagggcga ggagtccagg gccttctctt 2940 tcgacgtggg cggcaggggc tacgtgctca gggtgaactc ctgcgccgac ggcttttaca 3000 aggaccgcta cgtgtaccgc cacttcgcct ctgccgccct cccaatccca gaggtggctc 3060 gacatcggcg agttctctga gtctctcacc tactgcatct ctaggagggc ccagggcgtg 3120 accctccagg acctcccaga gaccgagctt ccagccgtgc tgcaggtaaa tttctagttt 3180 ttctccttca ttttcttggt taggaccctt ttctcttttt atttttttga gctttgatct 3240 ttctttaaac tgatctattt tttaattgat tggttatggt gtaaatatta catagcttta 3300 actgataatc tgattacttt atttcgtgtg tctatgatga tgatgataac tgcagccggt 3360 cgccgaggcc atggacgcca tcgccgctgc cgatctctcc cagacctccg gcttcggccc 3420 attcggccct cagggcatcg gccagtacac cacctggagg gacttcatct gcgccattgc 3480 cgacccacat gtgtaccatt ggcagaccgt gatggacgat accgtgtctg cctctgtggc 3540 ccaggccctc gacgagctta tgctctgggc cgaggactgc ccagaggtga ggcacctcgt 3600 gcacgccgac ttcggctcca acaacgtgct caccgacaac ggcaggatca ccgccgtgat 3660 cgattggtct gaggccatgt tcggcgactc tcagtacgag gtggccaaca tcttcttctg 3720 gcgcccatgg ctcgcttgca tggagcagca gaccagatac ttcgagagga ggcacccaga 3780 gcttgccggc tccccaaggc tcagggctta catgctcagg atcggcctcg atcagctcta 3840 ccagtctctc gtggacggca acttcgacga tgccgcctgg gctcagggca ggtgcgatgc 3900 catcgtgagg tctggcgctg gcaccgtggg caggacccag atcgccagga ggtctgccgc 3960 cgtgtggacc gatggctgcg tggaggtgct cgccgactct ggcaacagga ggccatccac 4020 caggccaagg gccaaggagt gagaagcaga tctcgagcgt tcaaacattt ggcaataaag 4080 tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa 4140 ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 4200 tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 4260 aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgac gtc 4313

Claims (25)

1. 시각적인 독특한 특징을 갖는 종자를 갖는 형질전환가능한 식물체를 생산하는 방법으로서:

   (a) 식물 형질전환 및 조직 배양을 통한 식물 재생을 위해 이용가능하고, 그 종자 또는 그의 일부에서 이종기원 단백질을 발현하고 축적하는 제1 품종을 제공하는 단계,

   (b) 시각적인 독특한 특징을 갖는 종자를 갖는 제2 품종으로서, 상기 품종의 종자는 상기 형질변환된 식물체의 재배를 위해 의도된 지리적 지역에서 생장하는 동일한 종의 일반적인 경작용 품종 또는 야생형 품종과 시각적으로 실질적으로 상이한 것인 제2 품종을 제공하는 단계,

   (c) 하이브리드 계통을 생성하기 위해 상기 제2 품종을 상기 제1 품종과 교배하는 단계,

   (d) 실질적으로 상기 제1 품종의 게놈으로 구성된 게놈을 가지며, 상기 제2 품종의 종자와 동일한 시각적인 독특한 특징을 갖는 종자를 갖는 하이브리드 식물체를 수득하기 위해 상기 하이브리드 계통을 상기 제1 품종과 역-교배시키는 단계, 및

   (e) 상기 하이브리드 식물체로부터 식물 형질전환 및 식물 재생을 위해 이용가능하게 하는 상기 제1 품종의 특징을 보유하는 숙주 하이브리드 계통을 선택하는 단계

   를 포함하는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 시각적인 독특한 특징은 상기 형질전환된 식물체의 재배를 위해 의도된 지리적 지역에서 생장하는 상기 동일한 종의 일반적인 경작용 또는 야생형 품종의 종자 색과 실질적으로 상이한 종자 색인 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전적으로 형질전환된 식물체는 단자엽 식물인 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전적으로 형질전환된 식물체는 보리인 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이브리드 식물체를 수득하기 위해 상기 역-교배 단계 (d)는 1회 이상 반복되는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이브리드 식물체로부터의 소포자는 상기 상이한 색을 갖는 종자를 가지며, 식물 형질전환 및 식물 재생을 위해 이용가능한 동질 유전자형의 하이브리드 계통을 생성하기 위한 조직배양을 위해 이용되는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 복수 개의 상기 동질 유전자형 하이브리드 식물체가 프로모 터에 작동가능하게 연결된 선택가능한 마커를 포함하는 핵산 작제물로 형질전환되고, 상기 숙주 하이브리드 계통은 형질전환 및 상기 핵산 작제물의 유전자 산물의 발현의 효율성의 평가에 기초하여 선택되는 것인 방법.
8. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적으로 형질전환된 식물체의 상기 시각적으로 표지된 종자 표면의 50% 이상은 상기 형질전환된 식물체의 재배를 위해 의도된 지리적 지역에서 생장하는 상기 동일한 종의 일반적인 경작용 또는 야생형 품종의 종자 색과 실질적으로 상이한 색을 갖는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   (f) 원하는 이종기원의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 식물-활성 프로모터를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 제공하는 단계,

   (g) 상기 숙주 하이브리드 계통으로부터의 하나 이상의 세포들을 상기 핵산 작제물로 형질전환시키는 단계,

   (h) 상기 숙주 하이브리드 계통으로부터의 상기 하나 이상의 식물체 숙주 세포로부터 식물체를 재생하고, 상기 이종기원 단백질을 발현하는 시각적으로 표지된 종자를 갖는 유전적으로 형질전환된 식물체를 수득하기 위해 상기 식물체를 생장시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 프로모터는 종자-특이적 프로모터인 것인 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 원하는 이종기원의 단백질은 콜라겐, 콜라게나아제, 호메오박스 폴리펩티드(homeobox polypeptide), 단일클론 항체, 분비형 항체(secreted antibody), 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체 단일 사슬, 만노오스-결합 렉틴, 펩신, 키모트립신, 트립신, 카세인, 인간 성장 호르몬, 인간 혈청 알부민, 인간 인슐린, 셀룰라아제, 펙티나아제, 헤미셀룰라아제, 피타아제(phytase), 히드롤라아제, 페록시다아제, 피브리노겐, 인자 IX, 인자 XIII, 트롬빈, 프로테인 C, 자일라나아제(xylanase), 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제, 아밀라아제, 리소자임, 베타-글루카나아제, 글루코세레브로시다아제, 카세인, 락타아제, 우레아제, 글루코오스 이소머라아제, 인버타아제(invertase), 스트렙타비딘, 에스테라아제, 알칼리 포스파타아제, 프로테아제 억제제, 펩신, 키모트립신, 트립신, 파파인, 키나아제, 포스파타아제, 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 포스포리파아제(phosphlipase), 리파아제, 락카아제(laccase), 거미 실크 단백질, 부동 단백질(antifreeze protein), 항생 펩티드(antimicrobial peptide) 또는 데펜신, 성장 인자 및 사이토키닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 원하는 이종기원의 단백질은 백혈병 억제 인자인 것인 방법.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 선택적으로 단백질 분해효소에 의한 절단 부위(proteolytic cleavage site)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 구분된, 상기 원하는 이종기원의 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 인접한 셀룰로오스 결합 모듈(cbm)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시각적으로 표지된 종자를 갖는 상기 유전적으로 형질전환된 식물체는 상기 원하는 이종기원의 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 발현되어 상기 단백질이 상기 식물체의 종자에 축적되게 하는 조건 하에서 생장되는 것인 방법.
15. 원하는 이종기원의 단백질을 그의 종자에서 발현하고, 그의 종자 또는 종피에서 보리의 종인 호르데움 불가리스와 같은 통상적인 보리의 황색 종자 색상과 실질적으로 시각적으로 상이한 색소를 생성하는 형질전환 보리 식물체.
16. 제15항에 있어서, 상기 식물체의 종자에 현저한 청색, 적색, 회색 또는 흑색을 부여하기에 충분한 흑색, 적색 또는 청색 색소를 생성하는 형질변환 보리 식물체.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 그의 종자 내에서 실질적으로 상기 이종기원의 단백질 모두를 발현하는 형질전환 보리 식물체.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 그 게놈 내에 상기 이종기원의 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 종자-특이적 프로모터를 갖는 형질전환 보리 식물체.
19. 제18항에 있어서, 상기 종자-특이적 프로모터는 주로 종자-특이적인 단자엽 식물체로부터의 프로모터들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 것인 형질전환 보리 식물체.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 동질 유전자형인 것인 형질전환 보리 식물체.
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 조직배양 및 유전적 형질전환에 이용가능한 것인 형질전환 보리 식물체.
22. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 형질전환 보리 식물체.
23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종기원의 단백질은 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 것인 형질전환 보리 식물 체.
24. 원하는 이종기원의 단백질을 생산하는 방법으로서:

    (a) 15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 보리 식물체로서, 상기 식물체는 그의 종자에서 상기 원하는 이종기원의 단백질을 발현하는 상기 형질전환 보리 식물체를 재배하도록 의도된 지리적 지역에서 생장하는 동일한 종의 일반적인 경작용 품종 또는 야생형 품종과 시각적으로 상이한 종자를 갖는 것인 형질전환 보리 식물체를 생장시키는 단계,

    (b) 상기 식물체를 수확하는 단계 및

    (c) 그 종자로부터 상기 이종기원의 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 복수의 상기 형질전환 보리 식물체는 비-형질전환 보리 식물체와 분리되어, 야외에서 생장되는 것인 방법.

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