CN101027398B

CN101027398B - 转基因植物种子在上游和下游加工中的可跟踪性

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Publication number: CN101027398B
Application number: CN2005800272753A
Authority: CN
Inventors: 比约登·拉鲁斯·奥瓦尔
Original assignee: ORF Liftaekni hf
Current assignee: ORF Liftaekni hf
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2025-08-11
Also published as: RU2007107976A; WO2006016381A9; CA2573775A1; US7428875B2; AU2005270845B2; CN101027398A; CA2573775C; US20080029003A1; KR20070059093A; EP1794300A2; WO2006016381A3; WO2006016381A2; AU2005270845A1; RU2397250C2

Abstract

本发明涉及在收获前和收获后增加对转基因种子的遏制和可追踪性的改进方法。该方法公开了分子农业适用的所需植物栽培种的产生和选择，所需植物栽培种特征在于易于适于转化和再生长，并具有可目测的特征性特性，如种皮和种子其它部分的特定特征性着色，使种子在田里或在收获期间和/或之后易于被追踪并且，很容易与不具可目测的特征性特性的相同品种的非转基因种子区别开来。

Description

转基因植物种子在上游和下游加工中的可跟踪性

发明领域

本发明属于植物生物技术领域，并具体涉及通过靶向培育用于转化所需的栽培种，改进在收获之前和收获之后对转基因种子的遏制和跟踪的方法无论是。

背景

发育中的农作物种子中，固有的积累蛋白质的能力意味着许多农作物植株，特别是单子叶植物，具有成为大规模生产异源性重组蛋白的实用且有效的载体的能力，所述重组蛋白如用于制药工业的高价值的多肽；制造过程经常称作分子农业。另外，由于这些种子可以常年储存而不影响异源性多肽的质量，因此在种子中储存异源性多肽降低了下游加工的成本。这种蛋白的表达优选在种子特异性或胚乳特异性启动子的控制下。

虽然生物技术工业继续循其在食物和/或饲料作物，如谷物中生产药用和工业用蛋白的途径，但是对于源于转基因植物的种子可能在收获、储存或下游加工期间，通过与非转基因种子混合意外地进入人类的食物供应却受到越来越多的关注。例如，尤其是转基因谷物生产的用于分子农业的种子以简单的目测与非转基因种子不能区分开来。因此，为了保障食物供应和环境的安全，分子农业迫切需要将在地里或收获和下游加工中的转基因种子与非转基因种子区分开来的简单技术。此外，还有一个迫切需要是不用在流线型的表达框中加入另外的基因即可实现这种目测跟踪，所述流线型表达框可以用于分子农业高水平表达尤其高价值的异源蛋白。这样的技术将是获得改进的对作为制药工业的原材料的转基因种子材料的遏制的严格指导原则的重要因素。当Good Agriculture Practice(GAP)的一般原则作为制药和工业用酶的所有分子农业的先决条件提出时，这就更为重要了。

通过简单的目测，对不能与非转基因材料区别开的转基因材料，如种子进行跟踪，是非常困难的，并且既耗时又要基于繁琐的提取方案和相对价昂的诊断技术，如定量PCR和实时PCR或ELISA。

如可筛选标记的遗传标记可用在表达载体中，来筛查用于有效转化的宿主生物体，所述标记包括R-座基因，其在植物组织中编码一种调节花青素(红色)生成的产物(Dellapotra等，1988)，能实现生物荧光检测的荧光素酶(lux)基因，或绿色荧光蛋白(GFP)基因。虽然它们可用于在基因转移后的组织培养中，但是在GM农作物的生物农业中，它们无一适用于大规模标记和追踪，原因是例如原位应用中的困难，或是由于需要天然生化前体途径去激活可能在所靶植物中缺失的标记。

还应该注意的是植物生物技术中所采用的传统转化技术常常产生源自一个以上细胞的“嵌合”或“镶嵌”杂交株，并可以产生表达在植物中引入的靶异源基因但是不表达可筛选的标记的植物。在转化中表达由表达载体引入的可筛选标记经常会在个世代间消失，因此所述标记对于目测是不可靠的特征。

随着对与遗传修饰农作物和生物农业有关的一般安全性顾虑的提高，迫切需要安全有效的方法，用于生产遗传修饰的植物，所述植物被安全地牵制并且与非修饰的野生或种植的植物可靠地区分开来。

发明概述和目的

基于着色种子的简单目测或机械观测的追踪技术是分子农业和植物生物技术的直接优点。同样也非常希望存在简单的技术方法，所述方法可以有助于获得分子农业中对于基因遏制所继续的安全措施。

本发明的主要目标概括为提供改进分子农业中种子材料的生物遏制性和可追踪性水平的方法。在以上的优选实施方式中，主要的方法是将可目测的可遗传特性，如种皮或种子其它部分的特征性颜色引入适于分子农业的适宜的植物宿主，并将此新型栽培种用作载体或宿主植物来产生表达靶异源蛋白的转基因植物，其种子在田里或收获期间或收获后可被追踪并且可与同样栽培种、没有目测特征，例如种子的特征性颜色的非转基因种子轻易地区分开来。

通常，根据本发明所使用和产生的植物和植物栽培种选自双子叶植物和单子叶植物，并且在优选实施方案中，所述植物来自油菜籽、大豆、大麦、玉米、小麦、燕麦和水稻。本发明尤其适用于产生和使用转基因植物如谷物，所述谷物在植物种子中用于表达和累积异源蛋白。在这样的实施方案中，应当理解不仅是本发明的转基因植物从非转基因植物中轻易地识别出来，而且转基因植物的种子，在与植物的茎、叶等分离时，能轻易地从非转基因种子中识别出来，正如图1和2具体实施方式的描述。

本发明的发明人发现，大麦，特别是Hordeum vulgaris大麦，特别适用于作为在具有可目测标记的种子的转基因植物中产生靶异源蛋白的植物宿主，因为实际上不存在意外的交叉授粉的问题。

本发明的发明人发现了稀有的大麦栽培种，其本身并不适于基因操作，但具有非常显著的可目测特点，使所述栽培种的植株及其产生的种子能与普通农业或野生的栽培种很容易地区分开来。

更具体地，本发明的目标是应用回交育种来为分子农业产生具有可目测特征的新型、合适的宿主植物/栽培种，所述可目测特征例如为具有着色的种皮，或能通过简单的目测很容易地进行追踪的种子，并从而使提高遏制水平成为可能。

本发明的另一个目的是由实施方案说明的，在所述实施方案中，被选作适用于分子农业的大麦宿主植株用具有使种皮或种子着色的基因座的供体大麦植株的花粉授粉，并通过反复回交来产生除了具有来自供体植物的可目测特征以外具有适用于分子农业的原始栽培种所有必要特征的宿主植物，所述原始栽培种的必要特征包括易于进行组织培养和基因转化，所述供体的可目测特征为诸如特别是易于被目测识别或自动检测设备识别的着色的种子或种皮。

尤其是，本发明的目的是提供产生适合分子农业的新型等基因大麦宿主植物的方法，所述所述植物易于进行组织培养和基因转化，具有能够在田里、收获期间或收获后被轻易识别和目测追踪的黑色种子。这样的等基因宿主植物将在异源蛋白的生产中提供可复制性和安全性，因为所有的个体植株都具有相同的二倍体基因结构，种子的颜色基本没有差异。

在前述的优选实施方式中，产生宿主植株，例如，特别是适用于分子农业、具有黑色种子、并易于进行组织培养和基因转化的等基因大麦宿主植株的方法，包括：(1)从易于进行组织培养和基因转化的栽培种中选择第一大麦植株；(2)从具有着色种皮、并且通常不用于商业农业的栽培种中选择第二大麦植株；(3)将第二植株与所述第一植株杂交，即，用具有着色种皮(如黑色、深灰或深蓝或红色)的植株的花粉为第一植株授粉，产生杂交F1植株；(4)用易于进行组织培养和基因转化的栽培种回交杂交的F1植株；(5)重复回交一至数次，取决于回交次数，产生具有与所述第二植株的着色种皮，并保留易于进行组织培养和基因转化的所述第一植株的大体的基因结构所杂交品系；(6)采用花药/小孢子培养方法来产生具有黑色种皮的等基因品系；(7)用含有表达盒的核酸构建体多次转化所述等基因系，并筛选最适合的等基因分子农业品系，其具有着色的种子并适于进行组织培养和基因转化。该方法的实施方式包括的如下的其他步骤：用编码植株活性启动子的核酸构建体来转化所述合适的等基因分子农业品系来产生具有着色的种子的转基因大麦，所述种子表达高水平表达的高价值异源蛋白。

根据本发明，提供了用于分子农业的等基因大麦栽培种，作为新型大麦植株的实施方式，本申请中其称作“Dimma”。

本发明成功解决了分子农业、田里、收获期间或收获后对转基因种子进行充分追踪的现有技术的不足。特别是，本发明提供了种子污染问题的简单解决方案，所述问题指通过在收获期间或储存过程中，转基因种子与非转基因种子的混合，将来自转基因植物的种子偶然进入人类或动物食物供应中。本发明提供了降低了所述种子污染的风险的即经济又可靠的方法。

附图简述

图1大麦栽培种“Golden Promise”(a)、“Svarthovdi”(b)和等基因大麦杂交系“Dimma”(c)的完全发育的种子。

图2显示了“Dimma”和栽培种“Golden Promise”的种子混合物中“Dimma”种子的目测差异。

图3显示了本发明用于“Dimma”转化和选择的表达盒pbGF20lif的示意图。

缩写：Dhor，胚乳特异性D-大麦醇溶蛋白启动子；pb，信号肽；lif，白血病抑制因子cDNA序列；p，接头；CBM，碳水化合物结合组件cDNA；pin II，马铃薯蛋白酶抑制剂II基因终止信号；35S，花椰菜花叶病毒35S启动子；hph，E.coli的潮霉素磷酸转移酶(Genebank登录号#K01193)；nos，胭脂碱合成酶终止信号；R，右边界；L，左边界。

发明详述

后文将详细描述本发明的优选实施方案。

除了另有定义，本文使用的所有技术和科学术语，与本发明所属领域的技术人员通常所理解和使用的含义相同。

用于本文的术语“分子农业”，指应用敞田或封闭设备中的任何种类的植物，生产有价值的生物化合物如蛋白质从而用于进一步处理的过程。

术语“蛋白质”在本文中与“多肽”和“肽”可互换使用。

术语“种子污染”指，用于分子农业的植物，如谷物的种子与用于食物或食品生产的植物种子意外混合的情况。术语“遏制”或“转基因种子的遏制”是指，不管是在田里、收获期间还是收获后，转基因植物栽培种的种子成功地与非转基因种子保持隔离，并且不与非转基因的种子混合。

术语“植物栽培种”指培植下发芽和持续生长的植物，其通过选择性杂交产生或存在于从野生群落中，并且通过无性繁殖或纯系种子得以保持。

用于本文的术语“所需的亲本栽培种”或“所需的栽培种”是指所选择的通过培育成为用于分子农业的合适宿主栽培种改良的植物栽培种。术语“宿主栽培种”是指通常遗传转化用作分子农业中生产重组蛋白的植物栽培种。

本文所用的术语“F₁代”或“F₁植株”或“F₁杂交种”是指所需的栽培种和具有所需的特征如种子或种皮的特征性着色图案的栽培种之间杂交产生的第一代。

术语“回交”指培育者反复将杂交后代(F₁至F_1+n，其中n为1或大于1)与初始所需的亲本栽培种杂交的过程。非限制性实例是，大麦(Hordeum vulgaris cv.)“Golden Promise”(所需的母本栽培种)与大麦(Hordeum vulgaris cv.)‘Svarthovdi”(有所需特征的栽培种)之间的杂交后代与初始的所需母本“Golden Promise”反复回交。

本文所用的术语“等基因系”或“等基因大麦”指二倍体大麦栽培种或系，其为或多或少的等位基因的双单倍体系或纯合子。

术语“种子着色”指由植物细胞生成的色素化合物累积在种子或种皮中。术语“特征性着色”指种子或种皮的着色图案，其能轻易地与商用或普通的栽培种可能具有的着色图案区分开来。作为商用栽培种着色图案的非限制性实例是在栽培种大麦(Hordeum vulgaris cv.)“Golden Promise”中所见的着色图案(图1a)。作为特征性着色图案的非限制性实例是在大麦(Hordeum vulgaris cv.)“Svarthovdi”(图1b)中所见的着色图案。“种皮”或“外种皮”指种子的外和内株被，包括色素层，或种子的保护性外层。本发明的非限制性实例为大麦栽培种‘Svarthovdi”种子中黑色黑色素样色素的累积。

术语“机械化检测设备”或“自动化检测设备”是能区分着色种子和不着色种子的任何工具或仪器。术语“目测追踪”指基于种皮或种子其它任何部分的着色或着色图案，对其进行追踪和鉴别的任何方法。所述检测设备可基于用于测定通过光源和检测器之间的光束路的样品种子的吸光率和/或反射率的分光光度技术。具有CCD或CMOS检测器的机器视觉(Machine vision)照相机，与装有合适的图案识别软件程序的计算机设备相连，也适于本发明对可目测标记的种子的自动化检测。

术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。

“启动子”定义为一种或多种核酸控制序列或转录调节子结合位点的排列，其能导可操作性连接的核酸的转录。

术语“转化”或“基因转化”指核酸分子转移入宿主生物体的基因组，产生遗传稳定的遗传特征。含有转化的核酸片断的宿主生物体被称作“转基因”生物体。本发明的“转基因植物宿主细胞”含有稳定整合到基因组中的至少一种外源，优选两种外源核酸分子。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等，1987)和粒子轰击或“基因枪”转化技术(Klein等(1987)；美国专利4,945,050)。

术语“选择标记”或“选择标记基因”是指能给表达基因的细胞或生物体赋予独特的表型特征的基因，其特征是细胞或生物体能更耐受特定化学剂如除草剂或抗生素等的毒性。

术语“筛选标记”指细胞或生物体的表型特征，其能通过观察或检验通常是通过目测进行检测。

选择适于分子农业、易于进行组织培养和基因转化的所需植物栽培种之后，选择具有能轻易地以目测与所需的栽培种的种子相区分的种子的另一栽培种。这些种子可以有不同的颜色或着色，如某些埃塞俄比亚当地大麦栽培种的黑色种子，或蓝色、红色或灰色，或彩色图案，或具有能以目测轻易地与用于食品或饲料的栽培种的种子相区别的其它形态特征。优选决定特征性特性的基因座，如某些埃塞俄比亚当地的大麦栽培种的黑色种皮是显性的、有很强表现率的高度可遗传特征。文献中记述了许多具有产生着色的种子的高度可遗传特性的不同大麦栽培种。分子农业所需的栽培种与具有所需的用于着色种子或种皮的特性的栽培种进行人工杂交，杂交后代与所需的栽培种反复回交。数次回交后(如2、3、4或更多次)，检验杂交种对组织培养以及遗传转化的适应性，并与最初所需的栽培种相比较。一旦认为杂交系对组织培养或遗传转化的适应性已充分，并与所需的栽培种相当，杂交系就被用于产生双单倍体系或等基因系，例如优选通过使用实施例2描述的和Kasha等(1992；2001)详细描述的花药-小孢子培育方法，从该杂交栽培种产生作为着色种子的所需特性的纯合子的株系。然后该等基因杂交系可用作用于分子农业的宿主栽培种。

在优选实施方案中，回交后得到的杂交系中获得多个等基因植株；个体等基因系不同的等基因的基因组成表明了F3代有大量可能产生的杂交；播种所述等基因植物的种子并生长，随后通过如在本文描述的表达载体的转化，并筛选有效转化和表达来检验其对转化和组织培养的可行性；并且基于所述检验，从所述的多个等基因植株中选择一个等基因系，作为用于产生靶异源蛋白的可转化植株。

可遗传操作的单子叶和双子叶植物在本发明中可以用作所需的栽培种。优选单子叶植物，更优选大麦，并且最优选Hordeum vulgaris大麦。能遗传转化的植物可以向其中引入异源DNA序列，包括编码区DNA序列，在其中表达、稳定保持并传递到后代中的植物。已经将遗传操作和转化方法用于生产大麦植株，所述植株应用除草剂抗性包括，例如，双丙氨膦或Basta，或者抗生素抗性，如潮霉素抗性作为选择标记。

优选在本发明的DNA构建体中利用的启动子在可目测区分的植物部分(如种子组织中)具有很强的活性，在所述种子组织中需要积聚靶异源多肽。这样的启动子可以得自不同的植物遗传材料或者植物病毒。优选所选的特定启动子适于在单子叶种子中表达异源蛋白，更优选在大麦中，并最优选在种子的胚乳组织中表达异源蛋白。

本发明的重组质粒可以通过将靶DNA序列连接(插入)到适当的质粒中获得，所述质粒可在细菌宿主中复制。如编码靶异源蛋白的基因的DNA序列，或者为组织特异性种子表达而设计的启动子序列应当可操作性整合到质粒中，所述质粒为了这个目的，如果需要的话，除了启动子之外可以含有另外的增强子DNA序列、支架连接区、内含子、poly(A)加尾信号、核糖体结合序列和靶选择标记基因如潮霉素耐受基因、氨苄青霉素耐受基因、双丙氨膦耐受基因等。所选择标记优选用在大麦的转化中，因为转化率相对低下，因此需要能从非转化的细胞中选择阳性转化的细胞。

实施例

下列实施例的提供是为了更好地限定本发明，并指导本领域的普通技术人员实施本发明。除了另有说明，术语的理解参照相关领域的普通技术人员的传统用法。

方法

大麦品系杂交和回交中的人工授粉

Hordeum vulgaris或大麦是自体受精的植物，意即一朵花的花粉通常给同一朵花的胚珠授粉。通过栽培，自体授粉将最终产生等基因或接近等基因的品系，意味着大多数或所有的等位基因都是纯合子。为了在这样的自体受精品种中引入新的特征或表型，人工授粉或杂交是必需对。大麦的人工授粉或杂交在温室中进行。开始，选择两个具有某些所需特型的栽培种，并将其种子种植在盆中。在数日内重复播种，以确保选用于杂交的亲本的发育阶段可以相匹配。人工授粉分两步骤进行。第一步骤是当宿主栽培种的花恰好发育完全，或者恰好在穗状花序下的分蘖开始从叶鞘中出现后进行。然后打开穗状花序上的每一朵花或小穗状花序，用镊子除去花内的三个雄蕊。然后用袋子包好每个处理过的花穗，防止花粉传播到小穗状花序并防止花朵干燥。第二步骤是实际上的人工授粉或杂交，在除去雄蕊后三至五天进行，或当心皮在宿主栽培种中发育完全并准备授粉时进行。选择供体栽培种还没有将其花粉播散到自己的心皮上并且发育完全的雄蕊，用于给除去雄蕊的宿主小穗状花序授粉。人工授粉的成功率通常在50％和70％之间。

双单倍体、等基因大麦杂交品系的产生

该技术是基于Kasha等建立的方案(2001)。种子播种在75％的轻质水藓泥炭和25％浮石(中等粒径)的混合物中，植株生长条件是，白天16℃(16小时)，夜间12℃(8小时)，白天在白色冷荧光250μmolm^-2s^-1的持续光照下，相对湿度70％，需要时用水根下灌溉(sub-irragated)。这些条件下，植株营养生长约55-95天，直至未成熟的穗状花序在适当的阶段可以收集。培养小孢子的理想阶段是在单核阶段的中间期至晚期。采集后，穗状花序放置在粗滤布(cheese cloth)上，用80％EtOH喷洒，用粗滤布覆盖，并干燥5分钟。从鞘除去穗状花序，放在无菌Petri培养皿中，每皿约10个穗状花序。每皿加入15ml冰冷的0.3M甘露醇，然后用透明塑料膜密封，用铝箔覆盖，保存于4℃3-4天。然后切去预处理过的穗状花序的根部，弃去，将穗状花序切成1-2cm的小片，放入用冰冷的甘露醇变冷的搅拌杯中。组分在Waring搅拌机上低速混合5秒，浆状物通过500μ+200μ的尼龙膜过滤。收集滤出液，用100μ的膜过滤并收集在50ml BD Falcon管中。旋转试管5分钟，仔细倒出液体，以0.3M甘露醇、与一个或两个50ml管合用清洗，并旋转5分钟，液体从50ml管中倒出，颗粒物再悬浮于2ml的甘露醇中，用吸量管放入15ml Falcon管中大约(ca)12ml的20％麦芽糖内。旋转试管5分钟，用吸量管从试管中部以上的层中收集存活的小孢子，再悬浮于甘露醇中，并旋转5分钟，小孢子花粉再悬浮于2ml FHG介质中。然后悬浮的小孢子被吸量管轻柔地放在真空条件下、瓷漏斗中预先湿润过的滤纸上。最上层的滤纸移至Petri培养皿中FHG固化培养基的中央，培养皿用塑料膜密封，在25℃的黑暗中孵育3-4周。7-10天后在培养皿中加入新鲜的液体FHG。当其达到1-2mm大小时，胚芽状组织被移入MS分化培养基，黑暗中孵育3天，然后移入22℃的8小时光照数周。小植株苗(3-4cm)移入盒中的MS再生长培养基，植株根系发育良好后马上移植。

对大麦杂交品系组织培养和基因转化的适应性的评价

a)用于基因转化的植物材料

大麦(Hordeum vulgaris cv)Golden Promise的种子和不同的杂交系的种子，播种在75％的轻质水藓泥炭和25％浮石(中等粒径)的混合物中，植株生长条件是，白天16℃(16小时)，夜间12℃(8小时)，白天在白色冷荧光250μmol m^-2s^-1的持续光照下，相对湿度70％，需要时用水根下灌溉(sub-irragated)。这些条件下，植株营养生长约55-95天，或直至未成熟的种子可以作为转化的材料，即开花后约8-14天。种子在震摇器中，以3％次氯酸钠消毒40分钟，并用无菌水冲洗五次。

b)菌株以及植株转化的准备

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，其带有具vir区的Ti-质粒的反式双元载体，用于利用具有调节靶异源蛋白表达的DNA构建体将T-DNA区导入大麦。大肠杆菌(E.coli)X-Blue和根癌农杆菌两个细菌的转化通过电穿孔完成，描述于Maniatis等的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1982)。为了准备植株的转化，在5ml Agro培养基(胰化蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，甘露醇5g/L，谷氨酸1g/L，KH₂PO₄250mg/L，MgSO_s-7H₂O 100mg/L，生物素1μg/L，pH7.0，25μg/ml利福平，50μg/ml奇霉素)中接种农杆菌培养菌的单个菌落，并在27℃下生长24-40小时。在无菌eppendorf管中，将200μl培养菌放入200μl的水合甘油中(预先灭菌)，储存在-80℃以前，培养菌被充分涡旋，并留在工作台上2小时。每次转化，从-80℃冰箱中取出一个试管，融化，将200μl的农杆菌原种加入5ml没有抗生素的Agro培养基中。然后培养菌在用作接种植株材料前，在27℃下生长17-20小时(见下文)。

c)制备用于农杆菌诱导的转化的大麦外植体

在第一天大约采摘10个大麦穗，约在开花后8-14天，除去芒和种子，选择1.5mm和2mm大小之间的胚芽。最初的植物材料要健康和成熟，不能过量吸水，种子应为绿色，没有真菌病的征象。种子置于50ml的falcon管中(不超过半满)，用70％乙醇冲洗，然后倒掉乙醇。然后加入20％漂白溶液(White King)，混合20分钟。在层流空气净化罩中倒掉漂白液，用无菌水冲洗种子(约洗5-8次)，放在4℃O/N。第二天，种子放在显微镜平台上的无菌Petri培养皿中。确定胚芽的位置，切除种子尾部并切下种子侧面。然后用镊子稳定地夹起种子，在种子中间加压，从而使胚芽突出。用镊子将胚芽放好，用解剖刀片插入盾片和茎轴间的沟槽，慢慢切除茎轴。在Petri培养皿中心，除去茎轴的胚芽放在再生长培养基中，切侧朝上，大约每皿25个胚芽。每次转化用的胚芽总数为200。

d)双元载体的处理

双元载体37℃下在含有100μg/ml奇霉素的大肠杆菌Xl-Blue LB培养培养基中增殖，然后用

Plasmid Midi Kit，从过夜生长的100ml培养菌中纯化载体。把1μl(1μg)的载体放入带有0.1cm间隙的无菌小瓶(BioRad)中，以电穿孔法把纯化的双元载体导入根癌农杆菌中，用40μl电感受态细胞(electrocompetent cell)洗脱载体，设置电压为2.5kV，电容为21μF，用于电穿孔。细胞涂布在含有100μg/ml奇霉素和20μg/ml利福平的YEP选择皿上，28℃生长2天。进行根癌农杆菌的质粒限制性消化分析，以证实双元载体的完整性。

e)大麦外植体的农杆菌感染

大约10μl的农杆菌培养液滴到每个胚芽上，保证所有的胚芽与溶液接触。轻弹胚芽(切侧朝下)，并拖动通过再生长培养基至培养皿外面，取出多余农杆菌。然后将胚芽转入新鲜的再生长培养基培养皿(切侧朝上)，间距相等(每皿25个)，放在24℃的黑暗柜中。农杆菌感染后在大麦组织中再生和器官形成。三天后，胚芽被移入带有选择标记(如双丙氨膦或潮霉素)的新鲜再生长培养基中，放置四至六周，每两周进行次培养。为了新芽再生，将愈伤组织转入新芽-诱导培养基(SIM)中，存活的愈伤组织和再生的新芽每两周转入新鲜SIM，直至形成小植株苗。然后植株苗转入根诱导培养基(RIM)，对存活的植株计数，然后盆栽于土壤中。一个月后，从每个植株中收集土壤中的叶外植体，进行转基因的PCR筛查，计算每100个接种农杆菌的胚芽的转基因植株数。

转基因品系的DNA提取和PCR分析

用Clonetech的NucleoSpin Plant

并根据制造商的说明书，对从大约200mg幼叶组织中提取的基因组DNA进行PCR扩增。在25μl反应混合物中(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.4)，1.5mM MgCl₂，每种dNTP 200μM，大约0.25μM引物，2.5U Taq引物酶(Fermentas)和50ng-100ng的模版DNA，进行潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的PCR扩增。PCR反应首先在94℃下进行3分钟，然后以下列步骤进行31次循环：66℃30秒，72℃45秒，94℃30秒。扩增反应以72℃下的4分钟延伸步骤终止。两种hph特异性引物(hph129和hph130)用于扩增。引物的序列如下：hph129，5’-CGGGCGCCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3’(SEQ IDNO：1)；hph130，5’-CGGGCGCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3’(SEQ IDNO：2)。

实施例1

培育具有黑色种子的可转化大麦杂交系

通过组织培养适于植物转化和植物再生的大麦(Hordeum vulgariscv)Golden Promise的种子，种植在盆中。数日内反复播种，植株在自然光下于温室中生长。同时，称作“Svarthovdi”的大麦Hordeum vulgaris栽培品种，具有黑色种子，但通过组织培养不适应植物转化和植物再生，其种子在同样条件下盆栽和生长。黑色种子是“Svarthovdi”的显性特征，表型表现在种皮或种子的糊粉层。种子完全成熟时，至少有50％的种皮有黑色着色。当Golden Promise栽培种的花恰好发育完全时，或者恰好在穗状花序下的分蘖开始从叶鞘中出现后，打开穗状花序上的十朵花或小穗，用镊子除去花内的三个雄蕊。然后用袋子包好每个处理过的花穗，防止花粉传入小穗状花序和花朵干燥。四天后，采集栽培种“Svarthovdi”发育完全的雄蕊，用于给除去雄蕊的GoldenPromise栽培种的十朵花的心皮授粉。授粉后继续用袋子包好穗状花序，不收获种子，直至其完全发育。这些种子中的F1胚芽都为黑色等位基因的杂合子。遗传背景是50％Golden Promise和50％有黑色着色种皮的“Svarthovdi”，因为黑色等位基因是显性的。所有处理过的F1种子进行盆播种，F1植株生长，直至小花穗可以与栽培种Golden Promise的花粉回交。与Golden Promise回交按上面所描述的进行，盆播种F2种子，F2植株在温室条件下生长，直至小穗状花序可以反复与栽培种Golden Promise的花粉回交。计算F2植株的遗传背景为75％cv GoldenPromise和25％cv“Svarthovdi”。F2植株在温室条件下生长，直至小穗状花序可以反复与栽培种Golden Promise的花粉按上面所述回交。F3植株的遗传背景应当是87.5％cv Golden Promise和12.5％cv“Svarthovdi”。允许F3小穗状花序自体授粉，产生完全成熟的F3种子。75％的F3种子有黑色表型，25％有传统的黄色种子表型。采集黑色F3种子进行盆播种，F3植株在温室条件下生长，直至可以收获小孢子用于孢子培养，以产生或为黑色种子表型或为黄色种子表型的双单倍体等基因杂交系纯合子，遗传背景均为主要(计算为87.5％)来自于Golden Promise栽培种，其适应植株转化和植株再生。等基因杂交系生长至成熟，收集具有黑色种子表型的品系，用于检验植株转化和植株再生的适应性。

实施例2

用基因转化通过组织培养选择具有黑色种子并适应植株转化和植株再生的大麦杂交系

50粒杂交的双单倍体等基因系的不成熟种子，大约在开花后8-14天收集并保存在4℃黑暗中。冷孵育的不成熟种子在70％EtOH中处理1分钟，然后在0.6％的次氯酸钠中10分钟，然后用无菌蒸馏水彻底清洗(5-8次)，无菌环境下在层流净化罩中的解剖显微镜下放置在无菌Petri培养皿上。确定胚芽的位置，切去种子尾部，切断种子侧面。用镊子压迫种子，种子中部受压因而胚芽被挤出。用镊子放好胚芽，用解剖刀片插入盾片和茎轴间的沟槽，慢慢切除茎轴。盾片放在愈伤组织诱导培养基中，切侧朝上，用25μl至40μl全浓度带有植株转化载体pbGF20lif(SEQ ID NO：3，见图3及其前面的描述)的根癌农杆菌接种1-5分钟。接种后，拖动盾片至培养皿外侧，以降低细菌负载和降低共培育期的过度生长。感染的盾片转入新的愈伤组织诱导培养基培养皿中，培养皿在24℃的黑暗中孵育3天。3天后盾片转入新的愈伤组织诱导培养基中，但所述培养基带有100μg/ml的特泯菌(timentin)以杀灭农杆菌和50μg/ml潮霉素以选择转化细胞，在24℃的黑暗中孵育4周，2周后次培养。然后愈伤组织转入新芽诱导培养基(包括2.5mg/LBAP，50μg/ml特泯菌和25μg/ml潮霉素)，高光下孵育4-10周。单个再生植株苗转入生根培养基(50μg/ml特泯菌和25μg/ml潮霉素，没有激素)。在生长出大约5-7cm带根的新芽后，转基因植株被移种入土壤，在此在全光下生长。采用抗兔cbm(纤维素结合组件)的多克隆抗体ELISA，筛查转基因系种子lif-cbm异源融合蛋白的表达。给出了转基因植株最高的百分率的杂交的双单倍体等基因系，被选作分子农业的最适品系，称作“Dimma”。

实施例3

靶异源蛋白的生产

从实施例2选择的植株系并被称作Dimma的种子基本按照上述转化，除了编码靶异源蛋白的基因被导入表达载体，而不是lif-cbm编码序列。播种成功的转化株并生长；收集种子和从其提取的靶蛋白。特别优选表达靶异源蛋白作为cbm融合蛋白，因为这样融合蛋白可以容易地提取并大规模纯化，并且通过导入能被合适的蛋白酶识别的、在cbm编码序列和编码靶异源蛋白的序列之间的切割位点，融合蛋白的cbm部分能任选被轻易切割开来，并与靶异源蛋白分离。所述方法详细描述于申请人的共同未决申请WO 2005/021762和WO 2005/021764，在此全文引入作为参考。

虽然只是具体阐述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可以预料到对前面实施例描述的本发明的众多修改和变化，只要不背离本发明的精神和要求保护的范围。

引用的参考文献

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序列表

<110>奥夫莱夫塔埃克尼公司

<120>转基因植物种子在上游和下游加工中的可跟踪性

<130>SCT070078-66

<150>IS 7396

<151>2004-08-11

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>DNA primer

<400>1

cgggcgccat gaaaaagcct gaactcaccg cgacg 35

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>DNA primer

<400>2

cgggcgccct attcctttgc cctcggacga gtgc 34

<210>3

<211>4313

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>e×pression vector

<400>3

gaattccctt cgagtgcccg ccgatttgcc agcaatggct aacagacaca tattctgcca 60

aaaccccaga acaataatca cttctcgtag atgaagagaa cagaccaaga tacaaacgtc 120

cacgcttcag caaacagtac cccagaacta ggattaagcc gattacgcgg ctttagcaga 180

ccgtccaaaa aaactgtttt gcaaagctcc aattcctcct tgcttatcca atttcttttg 240

tgttggcaaa ctgcacttgt ccaaccgatt ttgttcttcc cgtgtttctt cttaggctaa 300

ctaacacagc cgtgcacata gccatggtcc ggaatcttca cctcgtccct ataaaagccc 360

agccaatctc cacaatctca tcatcaccga gaacaccgag aaccacaaaa ctagagatca 420

attcattgac agtccaccga gatggctaag cggctggtcc tctttgtggc ggtaatcgtc 480

gccctcgtgg ctctcaccac cgctgaacgt cccatggtgg ccaccgccaa gtacggcacc 540

ccagtgatcg acggggagat cgacgagatc tggaacacca ccgaggagat cgagaccaag 600

gccgtggccg tggggagcct cgacaagaac gccaccgcca aggtgcgcgt gctctgggac 660

gagaactacc tctacgtgct cgccatcgtg aaggacccag tgctcaacaa ggacaacagc 720

aacccctggg agcaagacag cgtggagatc ttcatcgacg agaacaacca caagaccggc 780

tactacgagg acgacgacgc ccaattccgc gtgaactaca tgaacgagca aaccttcggg 840

accggcggga gcccagcccg cttcaagacc gccgtgaagc tcatcgaggg gggctacatc 900

gtggaggccg ccatcaagtg gaagaccatc aagccaaccc caaacaccgt gatcggcttc 960

aacatccaag tgaacgacgc caacgagaag gggcaacgcg tggggatcat cagctggagc 1020

gacccaacca acaacagctg gcgcgaccca agcaagttcg ggaacctccg cctcatcaag 1080

ccaaccccaa ccccattgta caccgacgac gacgacaagt ccccactccc aatcacccca 1140

gtgaacgcca cctgcgccat caggcaccca tgccacggca acctcatgaa ccagatcaag 1200

aaccagctcg cccagctcaa cggctccgcc aacgccctct tcatctccta ctacaccgcc 1260

cagggcgagc cattcccaaa caacgtggag aagctctgcg ccccaaacat gaccgacttc 1320

ccatccttcc acggcaacgg caccgaaaag accaagctcg tggagctgta ccgcatggtg 1380

gcctacctct ccgcctccct caccaacatc accagggacc agaaggtgct caacccaacc 1440

gccgtgtccc tccaggtgaa gctcaacgcc accatcgacg tgatgagggg cctcctctcc 1500

aacgtgctct gccgcctctg caacaagtac cgcgtgggcc acgtggacgt gccaccagtg 1560

ccagaccact ccgacaagga ggccttccag aggaagaagc tcggctgcca gctcctcggc 1620

acctacaagc aggtgatctc cgtggtggtc caggccttca tcagcgtg9t cgtccaggcg 1680

ttctgaggcg cgccacttaa ataatgtatg aaataaaagg atgcacgcat agtgacatgc 1740

taatcactat aatgtgggca tcaaagttgt gtgttatgtg taattactag ttatctgaat 1800

aaaagagaaa gaggtcatcc atatttcttt tcctaaagaa atgtcacgtg tctttataat 1860

tctttgatga accagatgca ttttattaac caaatccata tacatataaa tattaatcat 1920

atataattaa tatcaattgg gttagcaaaa caaatctagt ctaggtgtgt tttgctaatt 1980

attgggggat agtgcagaaa gaaatctacg ttctcaataa ttcagataga aaacttaata 2040

aagtgagata atttacatag attgctttta tcctttgata catgtgaaac catgcatgat 2100

ataaggaaaa tagatagata agcttggcat gcctgcaggt ccgattgaga cttttcaaca 2160

aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 2220

gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 2280

catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 2340

caccgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatgg 2400

ccgattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggagacc tcctcggatt ccattgccca 2460

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 2520

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccagagat 2580

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 2640

caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 2700

tcgcaagacc cttcctcaat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggag atctttttat 2760

ttttaatttt ctttcaaata cttcccgggc ctctagagcg atcgcgggat cccgcgatcg 2820

ccaccatgaa gaagccagag cttaccgcca cctccgtgga gaagttcctc atcgagaagt 2880

tcgactccgt gtccgacctc atgcaactct ccgagggcga ggagtccagg gccttctctt 2940

tcgacgtggg cggcaggggc tacgtgctca gggtgaactc ctgcgccgac ggcttttaca 3000

aggaccgcta cgtgtaccgc cacttcgcct ctgccgccct cccaatccca gaggtggctc 3060

gacatcggcg agttctctga gtctctcacc tactgcatct ctaggagggc ccagggcgtg 3120

accctccagg acctcccaga gaccgagctt ccagccgtgc tgcaggtaaa tttctagttt 3180

ttctccttca ttttcttggt taggaccctt ttctcttttt atttttttga gctttgatct 3240

ttctttaaac tgatctattt tttaattgat tggttatggt gtaaatatta catagcttta 3300

actgataatc tgattacttt atttcgtgtg tctatgatga tgatgataac tgcagccggt 3360

cgccgaggcc atggacgcca tcgccgctgc cgatctctcc cagacctccg gcttcggccc 3420

attcggccct cagggcatcg gccagtacac cacctggagg gacttcatct gcgccattgc 3480

cgacccacat gtgtaccatt ggcagaccgt gatggacgat accgtgtctg cctctgtggc 3540

ccaggccctc gacgagctta tgctctgggc cgaggactgc ccagaggtga ggcacctcgt 3600

gcacgccgac ttcggctcca acaacgtgct caccgacaac ggcaggatca ccgccgtgat 3660

cgattggtct gaggccatgt tcggcgactc tcagtacgag gtggccaaca tcttcttctg 3720

gcgcccatgg ctcgcttgca tggagcagca gaccagatac ttcgagagga ggcacccaga 3780

gcttgccggc tccccaaggc tcagggctta catgctcagg atcggcctcg atcagctcta 3840

ccagtctctc gtggacggca acttcgacga tgccgcctgg gctcagggca ggtgcgatgc 3900

catcgtgagg tctggcgctg gcaccgtggg caggacccag atcgccagga ggtctgccgc 3960

cgtgtggacc gatggctgcg tggaggtgct cgccgactct ggcaacagga ggccatccac 4020

caggccaagg gccaaggagt gagaagcaga tctcgagcgt tcaaacattt ggcaataaag 4080

tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa 4140

ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 4200

tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 4260

aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgac gtc 4313

Claims

1.一种产生能跟踪种子具有能目测的特征性特性、用于分子农业的能转化植株的方法，包括如下步骤：

(a)提供用于在其种子或其任何部分表达和累积异源蛋白的所需的第一栽培种，其中所述栽培种通过组织培养适于植株转化和植株再生，以及

(b)提供种子具有能目测的特征性特性的第二栽培种，使得所述栽培种的种子与相同品种的普通农作物或野生栽培种的种子有能目测的差异，所述的相同品种生长在意图用于生长所述能转化植株的地理区域，

(c)将所述的第二栽培种与所述的第一栽培种杂交，以产生杂交系，

(d)所述杂交系与所述第一栽培种回交，以获得杂交植株，其具有与所述第二栽培种所见种子具有相同的能目测特征性特性的种子。

(e)从所述杂交植株中选择宿主杂交系，所述宿主杂交系保持了所述第一栽培种的特征使其适于植株转化和植株再生。

2.权利要求1所述的方法，其中所述能目测的特征性特性是与所述相同品种的普通农作物或野生栽培种的种子颜色有显著不同的种子颜色，所述相同品种生长在意图用于生长所述转化植株的地理区域。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述遗传转化的植株是单子叶植物。

4.权利要求3所述的方法，其中所述遗传转化的植株是大麦。

5.权利要求1所述的方法，其中回交步骤(d)重复至少一次以得到所述杂交植株。

6.权利要求5所述的方法，其中回交步骤(d)重复至少两次以得到所述杂交植株。

7.权利要求1所述的方法，其中所述能转化植株能被农杆菌转化。

8.权利要求1所述的方法，其中所述杂交植株的小孢子被用于组织培养，以生成适于植株转化和植株再生、并具有所述不同颜色的种子的等基因杂交系。

9.权利要求8所述的方法，其中用包含与启动子可操作性连接的选择标记基因的核酸构建体来转化多个所述的等基因杂交植株，并且基于所述核酸构建体的基因产物的转化和表达效率的评价来选择所述宿主杂交系。

10.权利要求2所述的方法，其中至少50％的所述遗传转化植株的所述能目测标记的种子的表面与生长在意图用于生长所述转化植株的地理区域的相同品种的普通农作物或野生栽培种的种子有显著不同的颜色。

11.权利要求1所述的方法，进一步包含如下步骤：

(f)提供包含有编码植株活性启动子的核酸序列的核酸构建体，所述启动子与编码靶异源蛋白的核苷酸序列可操作性连接，

(g)从所述的带有所述核酸构建体的宿主杂交系中转化一或多个细胞，

(h)从来自所述宿主杂交系的所述一或多个转化的植株宿主细胞再生植株，并生长所述植株，以获得表达所述异源蛋白的有能目测标记的种子的遗传转化的植株。

12.权利要求11所述的方法，其中所述启动子是种子特异性启动子。

13.权利要求11所述的方法，其中所述的靶异源蛋白选自胶原、胶原酶、同源异形盒多肽、单克隆抗体、分泌的抗体、包括轻链和重链的抗体单链、甘露糖结合的凝集素、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰岛素、酪蛋白、人生长激素、人血清白蛋白、人胰岛素、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、肌醇六磷酸酶、水解酶、过氧化物酶、纤维蛋白原、凝血因子IX、凝血因子XIII、凝血酶、蛋白C、木聚糖酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、同工酶、β葡聚糖酶、葡糖脑苷脂酶、酪蛋白、乳糖酶、尿素酶、葡萄糖异构酶、转化酶、链亲合素、酯酶、碱性磷酸酶、蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰岛素、木瓜蛋白酶、激酶、磷酸酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷脂酶、脂肪酶、漆酶、蜘蛛丝蛋白、抗冻蛋白、抗微生物肽或防御素、生长因子和细胞分裂素。

14.权利要求11所述的方法，其中所述靶异源蛋白是白血病抑制因子。

15.权利要求11所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码碳水化合物结合组件(cbm)的核酸序列，所述cbm与编码所述靶异源蛋白的核酸序列邻接，任选被编码蛋白水解切割位点的核酸序列所截断。

16.权利要求11所述的方法，其中具有所述的能目测标记种子的遗传转化植株生长在如下条件下：由此表达编码所述靶异源蛋白的核酸序列，使所述蛋白蓄积在所述植株的种子中。

17.权利要求1的方法，其中的普通农作物或野生栽培种是大麦品种Hordeum vulgaris。

18.权利要求17所述的方法，其中能目测的特征性特性是显著的蓝色、红色、灰色或黑色。

19.权利要求17所述的方法，其中所选择的宿主杂交系在其种子中表达所有的所述异源蛋白。

20.权利要求17所述的方法，其中所选择的宿主杂交系在其基因组中具有与编码所述异源蛋白的核酸序列可操作性连接的种子特异性启动子。

21.权利要求20所述的方法，其中所述种子特异性启动子选自来自种子特异性的单子叶植株的启动子。

22.权利要求17所述的方法，其中所选择的宿主杂交系为等基因的。

23.权利要求17所述的方法，其中所选择的宿主杂交系适于组织培养和基因转化。

24.权利要求1所述的方法，其中所述异源蛋白作为含有碳水化合物结合组件的融合蛋白表达。

25.一种生产靶异源蛋白的方法，包括：

(a)生长根据权利要求1获得的所选择的宿主杂交系的至少一种植株，

(b)收获所述植株以及

(c)从所述植株的种子中提取所述异源蛋白。

26.权利要求25所述的方法，其中所述植株生长在敞田中，与任何非转基因的大麦植株隔开。