DE69929073T2

DE69929073T2 - Verfahren und Zusammensetzungen für die Transformation von Pflanzen

Info

Publication number: DE69929073T2
Application number: DE69929073T
Authority: DE
Inventors: L. Dennis BIDNEY; Jay Christopher SCELONGE
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: CA2344700C; EP1117816B1; ATE313635T1; AU6164899A; DE69929073D1; WO2000018939A1; WO2000018939A9; EP1117816A1; US6265638B1; AU764100B2; CA2344700A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen für die Transformation von Pflanzen, insbesondere auf Verfahren zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Agrobacterium, ein natürliches Pflanzenpathogen, wurde in großem Umfang für die Transformation von dikotylen Pflanzen und kürzlich zur Transformation von monokotylen Pflanzen eingesetzt. Der Vorteil des Agrobacterium-vermittelten Gentransfersystems besteht darin, dass es das Potential bietet, transgene Zellen bei relativ hoher Häufigkeit ohne signifikante Reduzierung der Pflanzenregenerationsraten zu regenerieren. Darüber hinaus ist das Verfahren des DNA-Transfers in das Pflanzengenom im Vergleich zu anderen DNA-Abgabeverfahren gut charakterisiert. DNA, die über Acrobacterium transferiert wird, unterliegt weniger leicht wesentlichen Umlagerungen als DNA, die über direkte Abgabe transferiert wird, und sie integriert oft in Einzelkopie oder in niedrige Kopienzahl in das Pflanzengenom.
Derzeit ist das am häufigsten verwendete Agrobacterium-vermittelte Gentransfersystem ein binäres Transformationsvektorsystem, in dem das Agrobacterium so manipuliert wurde, dass es ein entwaffnetes oder nicht-onkogenes Ti-Helferplasmid, welches für die vir-Funktionen codiert, die für den DNA-Transfer erforderlich sind, und ein viel kleineres getrenntes Plasmid, das sogenannte binäre Vektorplasmid, das die transferierte DNA oder die T-DNA-Region trägt, enthält. Die T-DNA ist durch Sequenzen an jedem Ende, die sogenannten T-DNA-Ränder, definiert, welche bei der Produktion von T-DNA und im Transferprozess eine wichtige Rolle spielen.
Die Agrobacterium-vermittelte Einführung von mehreren Genen oder die sogenannte Co-Transformation erfolgt natürlich. In der Natur haben das Ti-Plasmid sowohl des Octopinproduzierenden Stamms A348 als auch der A. rhizogenes-Stämme mehrere T-DNA-Regionen, die unabhängig transferieren und in das Pflanzengenom integrieren.
Eine Co-Transformation wurde auch mit genetisch veränderten Agrobacterium-Stämmen durchgeführt. Die Einführung von mehreren Genen in Pflanzen unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Transformationssystemen kann in Abhängigkeit von dem verwendeten Co-Transformationsverfahren in einer verknüpften oder unverknüpften Integration von T-DNA- Regionen resultieren. In einigen Fällen kann eine transformierte Pflanze sowohl eine verknüpfte als auch eine nicht-verknüpfte Integration der T-DNA-Regionen haben, wenn mehrere T-DNA-Regionen übertragen werden. Als Resultat können nachfolgende Generationen transformierter Pflanzen nur Untergruppen der ursprünglich transferierten und integrierten T-DNA-Regionen beibehalten. Eine derartige Segregation von T-DNA-Regionen, die verschiedene Gene tragen, kann wünschenswert sein, wenn die T-DNA-Region oder -Regionen, die für Segregationsnachkommenschaft verloren sind, selektierbare Markergene tragen, die zur Selektion ursprünglich transformierter Pflanzen wünschenswert sind, aber in der Nachkommenschaft dieser transformierten Pflanzen unerwünscht sind.
Eine Co-Transformation in gentechnisch veränderten Agrobacterium-binärer Vektor Systemen wurde bislang auf drei unterschiedlichen Wegen erreicht. Die erste dieser Methoden involviert eine Co-Infektion einer Pflanze mit zwei Agrobacterium-Stämmen, von denen jeder eine einzigartige T-DNA hat, die auf identischen binären Vektorplasmiden (McNight et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8:439-445) oder verschiedenen binären Vektorplasmiden (DeNeve et al. (1997) Plant J. 11(1): 15-29) getragen wird. Alternativ kann eine Co-Transformation durch Infektion einer Pflanze mit einem einzelnen Agrobacterium-Stamm erreicht werden, der eine T-DNA, die auf dem Ti-Helferplasmid liegt, und eine zweite T-DNA, die auf einem binären Plasmid liegt, hat (de Framond et al. (19986) Mol. Gen. Genet. 202:125-133). Eine dritte Methode der Co-Transformation involviert eine Infektion einer Pflanze mit einem einzelnen Agrobacterium-Stamm, der zwei getrennte T-DNA-Regionen auf einem einzelnen binären Plasmid hat (Komari et al. (1996) Plant J. 10(I): 165-174). Die ersten zwei Methoden begünstigen eine nicht verknüpfte Integration von T-DNA-Regionen, während die letztgenannte Methode eine verknüpfte Integration der T-DNA-Regionen begünstigt, obgleich beide Integrationstypen innerhalb einer Pflanze erfolgen können.
Bei den gegebenen Vorzügen von Agrobacterium-vermittelten Transformationssystemen und dem Bedarf für eine gleichzeitige Transformation von Pflanzen mit mehr als einem Gen von Interesse werden weitere Verfahren für eine effiziente Co-Transformation unter Verwendung von Agrobacterium benötigt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Zusammensetzungen und Verfahren für die effiziente Co-Transformation einer Pflanze. Neue Zusammensetzungen sind Agrobacterium-Stämme, die gentechnisch so manipuliert wurden, dass sie wenigstens zwei binäre Vektorplasmide zusätzlich zu einem Helferplasmid, das die vir-Funktionen umfasst, umfassen. Jeder der binären Vektoren umfasst seine eigenen T-DNA-Ränder, die eine heterologe Nucleotidsequenz von Interesse flankieren.
Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Agrobacterium-Stamm bereit, umfassend ein Helferplasmid und wenigstens zwei binäre Vektorplasmide, wobei jedes der binären Vektorplasmide wenigstens eine T-DNA-Region umfasst, die eine heterologe Nucleotidsequenz von Interesse umfasst.
Die heterologe Nucleotidsequenz innerhalb wenigstens einer der T-DNA-Randsequenzen umfasst wenigstens eine Expressionskassette, die eine codierende Sequenz für ein "plant scorable" Markergen exprimiert. Die Nucleotidsequenz von Interesse kann zusätzlich wenigstens eine codierende Sequenz von Interesse funktionell mit regulatorischen Regionen verknüpft umfassen, die innerhalb einer Wirtspflanze funktionell sind. Verfahren der Erfindung umfassen die Verwendung dieser neuen Zusammensetzungen, um eine Co-Transformation einer Pflanze durchzuführen. Auf diese Weise können heterologe Nucleotidsequenzen von Interesse, die sich auf verschiedenen binären Vektoren befinden, unabhängig voneinander in einem einzigen Transformationsereignis in die Pflanze eingeführt werden und in einer nicht verknüpften An in das Pflanzengenom eingebaut werden. Die transferierten Nucleotidsequenzen werden von ihren entsprechenden T-DNA-Rändern flankiert und liegen in der transformierten Pflanze mit niedriger Kopienzahl vor.
Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Co-Transformation einer Pflanze mit wenigstens zwei einzigartigen heterologen Nucleotidsequenzen von Interesse bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen eines Gewebes aus der Pflanze mit einem Agrobacterium-Stamm, der ein Helferplasmid und wenigstens zwei binäre Vektorplasmide umfasst, wobei jedes der binären Vektorplasmide wenigstens eine T-DNA-Region umfasst, wobei jede der T-DNA-Regionen eine der einzigartigen Nucleotidsequenzen umfasst, wobei wenigstens eine der Nucleotidsequenzen wenigstens eine Expressionskassette umfasst, welche ein "plant scorable" Markergen umfasst;
b) Co-Kultivieren des Gewebes mit dem Agrobacterium;
c) Kultivieren des Gewebes in einem Kulturmedium, das ein Antibiotikum umfasst, das das Wachstum von Agrobacterium inhibieren kann;
d) Durchmustern des Gewebes auf Expression des "plant scorable" Markergens und
e) Regenerieren der transformierten Pflanze aus Gewebe, das das "plant scorable" Markergen exprimiert.

Es werden auch transformierte Pflanzenzellen, Gewebe, Pflanzen und Samen bereitgestellt. Solche transformierten Zusammensetzungen sind durch das Vorliegen von unabhängig integrierten T-DNA-Rändern und einer niedrigen Kopienzahl der transferierten Nucleotidse quenzen charakterisiert. Die Erfindung umfasst regenerierte, fertile transgene Pflanzen, daraus produzierte transgene Samen und T1- und nachfolgende Generationen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt eine Plasmidkarte des binären Vektors pPHP9755 dar.
2 stellt ein Diagramm dar, das den Aufbau des binären Vektors pPHP9755 veranschaulicht.
3 stellt eine Plasmidkarte des binären Vektors pPHP762 dar.
4 stellt ein Diagramm dar, das den Aufbau des binären Vektors pPHP762 veranschaulicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zusammensetzungen und Verfahren für die effiziente Co-Transformation einer Pflanze werden bereitgestellt. Neue Zusammensetzungen sind Agrobacterium-Stämme, die gentechnisch so manipuliert wurden, dass sie einen Co-Transfer von wenigstens zwei heterologen Nucleotidsequenzen von Interesse in unabhängiger Weise ermöglichen. Verfahren der Erfindung umfassen die Verwendung dieser neuen Zusammensetzungen für die Co-Transformation einer Pflanze.
Durch "Co-Transformation" sollen wenigstens zwei unabhängige Transformationsereignisse gemeint sein, wobei jedes unabhängige Ereignis den Transfer einer heterologen Nucleotidsequenz in eine Pflanzenzelle und die anschließende stabile Integration der transferierten Sequenz in das Pflanzengenom umfasst. Mit "heterolog" ist fremd für das Pflanzengenom oder nicht natürlich auftretend im Pflanzengenom vor einer Transformation gemeint. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Co-Transformation in einem einzelnen Transformationsereignis mit der Verwendung des Agrobacterium-vermittelten Gentransfers bzw. der Verwendung der Agrobacterium-vermittelten Genübertragung erreicht.
Agrobacterium-vermittelter Gentransfer nutzt die natürliche Fähigkeit von Agrobacterium tumefaciens und A. rhizogenes, DNA in Pflanzenchromosomen zu transferieren. Agrobacterium ist ein Pflanzenpathogen, das einen Satz von Genen, die in einer Region, T-DNA genannt, seines Tumor-induzierenden (Ti)-Plasmids oder Haarwurzel-induzierenden (Ri)-Plasmids codiert werden, an Wundstellen in Pflanzenzellen überträgt. Dieser Prozess hängt von den cis-wirkenden T-DNA-Randsequenzen ab, die die übertragene DNA flankieren, und den trans-wirkenden Virulenz (vir)-Funktionen, die durch das Ti-Plasmid oder Ri-Plasmid codiert werden, und dem Bakterienchromosom ab. Das typische Resultat eines Gentransfers in A. tumefaciens ist ein tumorartiges Wachstum, das Wurzelkropf genannt wird. Das Resultat des Gentransfers in A. rhizogenes ist Haarwurzelkrankheit. In beiden Fällen resultiert ein Gentransfer in der stabilen Integration der T-DNA-Region in ein Pflanzenwirtschromosom. Die Fähigkeit, Wurzelkropfkrankheit oder Haarwurzelkrankheit zu erzeugen, kann durch Deletion der onkogenen Gene in der T-DNA ohne Verlust von DNA-Transfer und -Integration entfernt werden. Wenn die onkogenen Gene auf diese Art entfernt werden, wird das Agrobacterium als entwaffnet oder nicht-onkogen bezeichnet.
Solche Agrobacterium-vermittelten Gentransfersysteme werden so modifiziert, dass sie eine heterologe oder fremde Nucleotidsequenz von Interesse, z.B. ein Fremdgen oder Fremdgene von Interesse enthalten, die in den transformierten Pflanzenzellen zu exprimieren sind. Die heterologe Nucleotidsequenz, die transferiert werden soll, wird in die T-DNA-Region eingebaut, die durch nicht korrekte 25-bp-terminale Wiederholungen oder T-DNA-Grenzsequenzen flankiert wird, die die Endpunkte einer integrierten T-DNA definieren. Beliebige Sequenzen zwischen diesen terminalen Wiederholungen werden in die Pflanzen-Kern-DNA integriert.
Gentransfer durch gentechnisch veränderte Agrobacterium-Stämme ist für die meisten dikotylen Pflanzen und für einige monokotyle Pflanzen Routine geworden. Siehe z.B. Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80:4803; Watson et al. (1985) EMBO J. 4:277; Horsch et al. (1985) Science 227:1229; Hernalsteens et al. (1984) EMBO J. 3:3039; Comai et al. (1984) Nature 317:741; Petit et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:388-393; Shah et al. (1986), Science 233:478; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345; Schafew et al. (1987) Nature 327:529; McKnight et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8:439-445; Potrykus (1990) Biotechnol. 8:535; Grimsley et al. (1987) Nature 325-177; Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745; und US-Patent Nr. 5,591,616, und darin zitierte Referenzen.
Die Fähigkeit von Agrobacterium, dieses DNA-Transferverfahren durchzuführen, wird vollständig ermöglicht, wenn die T-DNA-Randsequenzen, die die heterologe Nucleotidsequenz, die zu transferieren ist, flankieren, und die vir-Funktionen auf getrennten kompatiblen Plasmiden lokalisiert sind. Diese Tatsache hat für die Entwicklung von binären Vektorsystemen gesorgt, bei denen Agrobacterium-Stämme so manipuliert werden, dass sie ein Ti- (oder im Fall von A. rhizogenes Ri-) Plasmid, das die vir-Funktionen umfasst und das in dem Transferverfahren als Helfer dient, und ein zweites kompatibles binäres Plasmid enthalten, das die T-DNA-Grenzsequenzen, welche die heterologe Nucleotidsequenz von Interesse, die in eine Pflanzenwirtszelle zu transferieren ist, flankieren, umfasst. Auf diese Weise wird eine modifizierte T-DNA-Region, die eine Fremd-DNA (die zu transferierende heterologe Nucleotidsequenz) umfasst, in einem kleinen Plasmid konstruiert, dessen Replikationsursprung für eine stabile Aufrechterhaltung des Plasmids sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium sorgt. Dieses Plasmid wird in A. tumefaciens transferiert, das ein kompatibles Ti-Plasmid (oder A. rhizogenes, das ein kompatibles Ri-Plasmid enthält), das das Virulenzgen trägt, enthält. Das resultierende Agrobacterium-vermittelte binäre Vektor Transformationssystem hat die vir-Funktionen, die in trans angeordnet sind, um einen Transfer der T-DNA in das Pflanzengenom zu erleichtern. Solche Agrobacterium-vermittelten binäre Vektor-Transformationssysteme und Verfahren zu ihrer Konstruktion sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-180; Simpson et al. (1986) Plant Mol. Biol. 6:403-415; An et al. (1988) Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19; Walkerpeach and Velten (1994) Plant Mol. Biol. Manual B1: 1-19; Komari et al. (1996) Plant J. 10(I):165-174.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Zusammensetzungen bereit, die Agrobacterium-Stämme sind, die genetisch so manipuliert sind, dass sie wenigstens zwei heterologe Nucleotidsequenzen von Interesse, z.B. Gene, auf einen Empfängerpflanzenwirt in unabhängiger Weise transferieren. Diese Stämme wurden insbesondere so manipuliert, dass sie ein Helfer-Ti (A. tumefaciens)- oder Ri (A. rhizogenes)-Plasmid, das die vir-Funktionen umfasst, und wenigstens zwei binäre Vektorplasmide umfassen, von denen jedes wenigstens eine T-DNA-Region umfasst. Obgleich das Helfer-Ti- oder -Ri-Plasmid nicht entwaffnet werden muss (siehe z.B. An et al. (1986) Plant Physiol. 81:301-305), wird es vorzugsweise durch Deletion der onkogenen Gene entwaffnet, um sicherzustellen, dass eine Entwicklung von Wurzelkropf- bzw. Haarwurzelkrankheit in der transformierten Pflanze verhindert wird, während die vir-Gene intakt gelassen werden. Dies wird durch Entfernung der vollständigen T-DNA-Region aus dem Ti- oder Ri-Plasmid erreicht, was in dem Agrobacterium-Stamm der Wahl durch in vivo-Deletionstechniken erfolgen kann (siehe z.B. Ooms et al. (1982) Plasmid 7:15-29). Da die vir-Gene intakt bleiben, kann das entwaffnete Helferplasmid einen Transfer von anderen T-DNA-Regionen, die in trans auf binären Vektoren zugeführt, welche in den Agrobacterium-Stamm eingeführt wurden, erleichtern.
Die binären Vektorplasmide, die bei der Konstruktion des Agrobacterium-Stamms mit mehreren binären Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden jeweils wenigstens die folgenden Standardmerkmale umfassen: 1) einen breiten Wirtsbereichs-Replikationsursprung; 2) eine Mehrfachklonierungsstelle; 3) ein selektierbares Markergen oder selektierbare Markergene, die sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium aktiv sind; 4) Transferfunktionen (z.B. oriV, oriT und trfA), die für eine Transformation von Agrobacterium via Konjugation sorgen (nicht notwendig, wenn der DNA-Transfer zu Agrobacterium direkt ist, wie mit Gefrieren-Tauen, oder via Elektroporation); und 5) wenigstens eine T-DNA-Randregion, die vorzugsweise durch ihre rechte und linke T-DNA-Randsequenz definiert ist, obgleich ein DNA-Transfer in die Pflanze durch das Vorliegen nur der rechten T-DNA-Randsequenz ermöglicht wird; jede dieser T-DNA-Regionen wird auch modifiziert worden sein, so dass sie Restriktionsstellen für die anschließende Insertion einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse, die in die Pflanze transferiert werden soll und anschließend in das Pflanzengenom integriert werden soll, haben. Die heterologe Nucleotidsequenz, die transferiert und integriert werden soll, wird wenigstens ein Gen umfassen, das funktionell mit regulatorischen Regionen verknüpft ist, die innerhalb der Pflanze funktionell sind, so dass eine Expression des transferierten Gens gemessen werden kann, um einen erfolgreichen Transfer und eine anschließende Integration der T-DNA-Region, die aus einem bestimmten binären Vektorplasmid stammt, in das Pflanzengenom zu bestätigen. Dieses Gen kann ein selektierbares Markergen sein, das innerhalb einer Pflanze funktionell ist, um eine Selektion von transformierten Pflanzen zu ermöglichen. Für eine Übersicht siehe An et al. (1998) Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19 und Walkerpeach und Velten (1994) Plant Mol. Biol. Manual B1: 1-19. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eines der binären Vektorplasmide, das in den Agrobacterium-Stamm gentechnisch eingearbeitet werden soll, ein "scorable" Markergen innerhalb einer T-DNA-Region tragen, wobei es chemisch selektierbar, visuell oder durch ein anderes Verfahren, z.B. einen Enzymassay, ELISA und dergleichen, analysierbar ist. Andere Sequenzen, die das T-DNA-Transferverfahren erleichtern, können in die binären Vektoren eingearbeitet sein, einschließlich einer, aber nicht beschränkt auf eine "Overdrive"-Sequenz (siehe z.B. Peralta et al. (1986) EMBO J. 5:1137-1142; Zyprian und Kado (1990) Plant Mol. Biol. 15:245-256) und T-DNA-Transferstimulatorsequenz (Hansen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:113-122).
Auf diese Weise wird eine modifizierte T-DNA-Region, die eine heterologe Nucleotidsequenz von Interesse umfasst (die Sequenz, die in die Pflanzenzelle transferiert werden soll), die in eine Mehrfach-Klonierungsstelle, die zwischen den T-DNA-Randsequenzen liegt, insertiert wurde, in vitro in einem "broad-host-range-Plasmid" konstruiert. Mit "broad-host-range" ist gemeint, dass das Plasmid sowohl in E. coli als auch in dem Agrobacterium-Stamm, der gentechnisch verändert werden soll, replizieren wird. Solche Plasmide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Plasmide, die zu den E. coli in den Gruppen P, Q und W gehören, z.B. pGA473 (ähnlich pGA472, der in An et al. (1985) EMBO J. 4:277-284 beschrieben ist, aber mit einem Ampicillinmarker), pGA482, An et al. (1986) Plant Physiol. 81:86-91), pBIN 19 und seine Derivate (siehe Frisch et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27:405-409) und andere, wie in der Übersicht von An et al. (1988) Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19 gezeigt. Andere bakterielle Plasmide, die als Grundgerüst für einen binären Vektor dienen können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, mit RSF1010 verwandte Plasmide (Bagdasarian et al. (1981) Gene 16 (1-3):237-247), pSa (Inkompatibilitätsgruppe W)-Plasmide (Leemans et al. (1983) Gene 19(3):361-364, und Tait et al. (1983) Mol. Gen Genet. 192 (1-2):32-38); und endogene Agrobacterium-Plasmide, die mit residenten Ti- oder Ri-Plasmiden kompatibel sind (Jouanin et al. (1985) Mol. Gen Genet. 201(3): 370-374).
Die resultierenden binären Vektorplasmide, die die modifizierten T-DNA-Regionen tragen, werden mit dem Helfer-Ti- oder -Ri-Plasmid, das sich innerhalb des Agrobacterium-Stamms befindet, der eine gentechnische Veränderung durchmachen wird, kompatibel sein. Mit "kompatibel" ist gemeint, dass das Plasmid fähig ist, in Gegenwart des Helferplasmids zu replizieren und somit mit dem Helferplasmid in dem gentechnisch veränderten Agrobacterium-Stamm zu co-existieren. Wenn Plasmide fähig sind, zu co-existieren, werden sie stabil in nachfolgenden Generationen des Bakterienstamms vererbt und werden somit im Bakterienstamm gehalten. Plasmide werden entsprechend ihrer Inkompatibilität klassifiziert. Inkompatible Plasmide haben denselben Replikationsursprung und stehen sowohl während der Replikation als auch während der nachfolgenden Teilung in Tochterzellen miteinander im Wettbewerb. Inkompatible Plasmide sind fähig, zu co-existieren und stabil in nachfolgenden Bakteriengenerationen vererbt zu werden, wenn der Selektionsdruck im Kulturmedium jedem von ihnen erlaubt, kontinuierlich zu replizieren und in Tochterzellen geteilt zu werden. Demnach wird für die binären Vektoren, die mit dem Helfer-Ti- oder -Ri-Plasmid kompatibel sind, ihr Replikationsursprung verschieden sein. Alternativ kann ihr Replikationsursprung derselbe wie der des Helferplasmids sein, vorausgesetzt, der Selektionsdruck im Kulturmedium ist so manipuliert, dass sie mit dem Ti- oder Ri-Plasmid, das im Agrobacterium der Wahl resistent ist, co-existieren.
Obgleich die binären Vektorplasmide alle mit einander kompatibel sein können, kann einer oder können mehrere von ihnen mit einem oder mehreren der anderen Plasmide inkompatibel sein. So können wenigstens zwei der binären Vektorplasmide denselben Replikationsursprung haben, vorausgesetzt Selektionsdruck im Kulturmedium erleichtert ihre Co-Existenz.
Daher können die binären Vektorplasmide, die bei der gentechnischen Veränderung des Agrobacterium-Stamms der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einen beliebigen Replikationsursprung haben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RK2 oriV, pSA oriV und pVS1 ori. In einer Ausführungsform der Erfindung hat das gentechnisch veränderte Agrobacterium zwei binäre Vektorplasmide, die den RK2 oriV-Replikationsursprung haben.
Die binären Vektorplasmide werden auch ein einmal vorkommendes bakterielles selektierbares Markergen umfassen, das für eine Selektion von Agrobacterium sorgt, welche erfolgreich so gentechnisch verändert wurden, dass sie die binären Vektorplasmide von Interesse ent halten. Mit "eindeutig" bzw. "einzigartig" ist gemeint, dass jedes binäre Vektorplasmid ein unterschiedliches bakterielles selektierbares Markergen haben kann, dessen Expression Resistenz gegenüber einem bestimmten Selektionsmittel, z.B. einem Antibiotikum, verleiht. Das bakterielle selektierbare Markergen jedes Plasmids befindet sich innerhalb der Hauptkette des Plasmids und ist funktionell mit regulatorischen Regionen verknüpft, die in E. coli und Agrobacterium funktionell sind. Geeignete selektierbare Markergene sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Gene, die für Resistenz gegen Kanamycin (Neomycinphosphotransferase (npt) II (Fraley et al. (19986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1-25)), Ampicillin/Carbenicillin, Streptomycin/Spectinomycin, Gentamicin und Tetracyclin codieren. Wenn das nptII-Gen funktionell mit dem Nopalinsynthase (nos)-Promotor und -Terminator verknüpft ist, kann es auch als selektierbarer Marker in Pflanzenzellen dienen, allerdings bei viel höheren Konzentrationen an Selektionsmittel (mindestens 500 mg/ml Kanamycinsulfat in Pflanzen gegenüber 40 mg/ml in Agrobacterium, und 20 mg/ml in E. coli (siehe An et al. (1988) Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19)). Somit wird z.B. eine Kultur eines Agrobacterium-Stamms in Gegenwart eines Selektionsmittels für Gen A nach Transformation jenes Stamms mit einem binären Vektorplasmid, das selektierbares Markergen A hat, für Wachstum nur solcher Agrobakterien sorgen, die binäre Vektorplasmide mit Gen A umfassen. Entsprechend würde eine erfolgreiche Transformation von Agrobacterium mit zwei binären Vektorplasmiden, von denen einer selektierbares Markergen A enthält, und von denen der andere selektierbares Markergen B enthält, für solche Agrobacterium-Kolonien bestätigt, die fähig sind, auf einem Medium zu wachsen, das sowohl ein Selektionsmittel für Gen A als auch ein Selektionsmittel für Gen B enthält. Somit wird ein Vorliegen jedes binären Vektors in dem gentechnisch veränderten Agrobacterium durch die Fähigkeit der gentechnisch veränderten Bakterien, auf einem Medium zu wachsen, das jedes der Selektionsmittel enthält, die so konzipiert sind, dass sie Expression jedes der entsprechenden selektierbaren Markergene detektieren, bestätigt.
Außerdem kann einer oder können mehrere der binären Vektorplasmide, die bei der gentechnischen Veränderung des Agrobacterium-Stamms der Erfindung verwendet werden, ein super-binärer Vektor sein. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,591,616, EP-A-0 604 662 A1 und die gleichzeitig anhängige Anmeldung mit dem Titel "Agrobacterium-Mediated Transformation of Sorghum", US-Patentanmeldung, Serial Nr. 09/056,418, eingereicht am 07. April 1998, die hier durch Referenz aufgenommen gilt. Es wurde ein derartiger super-binärer Vektor konstruiert, der eine DNA-Region enthält, die aus der Virulenzregion von Ti-Plasmid pTiBo542 stammt (Jin et al. (1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425), die in einem super-virulenten Agrobacterium tumefaciens, A281, enthalten ist, wobei dieser Vektor extrem hohe Transformationseffizienz aufweist (Hood et al. (1984) Biotechnol. 2:702-709; Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168:1283-1290; Komari et al. (1986) J. Bacteriol. 166:88-94; Jin et al. (1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425; Komari T. (1989) Plant Science 60:223-229; ATCC-Eingangs-Nr. 37394).
Super-binäre Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen pTOK162 (Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 4-222527, EP-A-0 504 869, EP-A-0 604 662 und US-Patent 5,591,616, und pTOK233 (T. Komari (1990) Plant Cell Reports 9:303-306; und Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745). Es können andere super-binäre Vektoren durch die Verfahren, die in den oben genannten Literaturstellen ausgeführt sind, konstruiert werden. Der super-binäre Vektor pTOK162 ist zur Replikation sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium fähig. Außerdem enthält der Vektor die virB-, virC- und virG-Gene aus der Virulenzregion von pTiBo542. Das Plasmid enthält auch ein Antibiotikumresistenzgen, ein selektierbares Markergen und die Nucleinsäure von Interesse, die in die Pflanze transferiert werden soll. Die Nucleinsäure, die in das Pflanzengenom zu insertieren ist, befindet sich zwischen den zwei Grenzsequenzen der T-DNA-Region. Es können super-binäre Vektoren der Erfindung konstruiert werden, die die oben für pTOK162 beschriebenen Merkmale haben. Super-binäre Vektoren sind insbesondere bei der Transformation von monocotylen Pflanzen einsetzbar (siehe z.B. Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282).
Jede T-DNA-Region der binären oder super-binären Vektorplasmide ist so konstruiert, dass sie Restriktionsstellen für die Insertion der heterologen Nucleotidsequenz von Interesse, die an die Pflanze abzugeben ist, hat. Alternativ kann die in die Pflanze zu transferierende Sequenz in eine T-DNA-Region eines binären Vektorplasmids insertiert werden, indem eine homologe in vivo-Rekombination genutzt wird. Siehe z.B. Herrera-Esterella et al. (1983) EMBO J. 2:987-995; Horch et al. (1984) Science 223:496-498). Eine derartige homologe Rekombination beruht auf der Tatsache, dass das binäre Vektorplasmid eine Region hat, die homolog zu einer Region von pBR322 oder einem anderen ähnlichen Plasmid ist. Wenn demnach die zwei Plasmide zusammengebracht werden, wird eine gewünschte heterologe Nucleotidsequenz durch genetische Rekombination über die homologen Regionen in den binären Vektor insertiert.
Wie einem Fachmann klar sein wird, kann eine beliebige Nucleotidsequenz von Interesse in eine T-DNA-Region eines binären Vektorplasmids für eine anschließende Transformation einer Pflanze mit dem Agrobacterium-Stamm mit mehreren binären Vektoren der vorliegenden Erfindung insertiert werden. Beispielsweise kann eine Pflanze gentechnisch so verändert werden, dass sie Krankheits- und Insekten-Resistenzgene, Gene, die einen Nährwert verleihen, Gene, die männliche und/oder weibliche Sterilität verleihen, antifungale, antibakterielle oder antivirale Gene und dgl. exprimiert. Entsprechend kann das Verfahren verwendet werden, um eine Nucleotidsequenz zu übertragen, um eine Genexpression zu kontrollieren. Beispielsweise könnte wenigstens eine der Nucleotidsequenzen, die zu transferieren sind, für ein Antisense-Oligonucleotid codieren.
Transformationstechnologie hat es dem Wissenschaftler ermöglicht, fast jedes Gen von Interesse im Inneren einer Pflanzenzelle zu platzieren, und unter der Voraussetzung, dass die umgebende Information für jene Zelle erkennbar ist, wird dieses Gen in jener Pflanze exprimiert werden. Die nativen Gene des Organismus können in nicht normalen Geweben oder bei nicht normalen Konzentrationen exprimiert werden und Gene aus anderen Pflanzen oder sogar aus anderen Organismen, z.B. Bakterien, Drosophila oder Säugern, können ebenfalls exprimiert werden.
Verschiedene Änderungen beim Phänotyp sind von Interesse, einschließlich Modifizierung der Fettsäurezusammensetzung in einer Pflanze, Veränderung des Aminosäuregehalts einer Pflanze, Veränderung des Pathogen-Abwehrmechanismus der Pflanze und dergleichen. Diese Resultate können erreicht werden, indem eine Expression von heterologen Produkten oder eine verstärkte Expression von endogenen Produkten in Pflanzen bereitgestellt wird. Alternativ können die Resultate erreicht werden, indem für eine Verringerung der Expression eines oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere Enzyme oder Co-Faktoren, in der Pflanze gesorgt wird. Diese Änderungen resultieren in einer Änderung beim Phänotyp der transformierten Pflanze.
Gene von Interesse sind ein Spiegelbild der wirtschaftlichen Märkte und Interessen derjenigen, die bei der Entwicklung der Nutzpflanze involviert sind. Bei einer Veränderung bei den Nutzpflanzen und Märkten von Interesse und mit der Öffnung der Entwicklungsländer für den Weltmarkt werden auch neue Nutzpflanzen und Technologien auftauchen. Mit Zunahme unseres Verständnisses für agronomische Merkmale und Charakteristika, z.B. Ausbeute und Heterosis, wird außerdem die Auswahl an Genen zur Transformation sich entsprechend ändern. Allgemeine Kategorien von Gene von Interesse umfassen z.B. solche Gene, die bei der Information involviert sind, z.B. Zinkfinger, solche die bei der Kommunikation involviert sind, z.B. Kinasen, und solche, die bei den Grundfunktionen involviert sind, z.B. Hitzeschockproteine. Spezifischere Kategorien von Transgenen z.B. umfassen Gene, die für agronomisch wichtige Merkmale codieren, z.B. für Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Herbizidresistenz, Sterilität, Kornmerkmale und kommerzielle Produkte. Gene von Interesse umfassen im Allgemeinen solche, die beim Öl-, Stärke-, Kohlenhydrat- oder Nährstoffmetabolismus involviert sind, wie auch solche, die die Korngröße, die Saccharosebeladung und dergleichen beeinflussen.
Agronomisch wichtige Merkmale, z.B. Öl-, Stärke- und Proteingehalt, können außer durch Verwendung traditioneller Züchtungsmethoden genetisch verändert werden. Modifikatio nen umfassen eine Erhöhung des Gehalts an Ölsäure, gesättigten und ungesättigten Ölen, eine Erhöhung der Konzentrationen an Lysin und Schwefel, Bereitstellung essentieller Aminosäuren und auch Stärkemodifikation. Hordothioninprotein-Modifikationen sind in der US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/838,763, eingereicht am 10. April 1997 (veröffentlicht als US-Patent Nr. 5,990,389) und in den US-Patenten Nrn. 5,703,049, 5,885,801 und 5,885,802 beschrieben. Ein anderes Beispiel ist Lysin- und/oder Schwefel-reiches Samenprotein, das durch das Sojabohnen-2S-Albumin codiert wird, das im US-Patent Nr. 5,850,016 beschrieben ist, und der Chymotrypsin-Inhibitor aus Gerste, der in Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106 beschrieben wird.
Derivate der codierenden Sequenzen können durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden, um die Konzentration von vorher ausgewählten Aminosäuren in dem codierten Polypeptid zu erhöhen. Beispielsweise ist das Gen, das für das Gerste-Polypeptid mit hohem Lysingehalt (BHL) codiert, vom Gerste-Chymotrypsin-Inhibitor abgeleitet; US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/740,682, eingereicht am 1. November 1996 (korrespondierend zur veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 98/20133). Weitere Proteine umfassen Methionin-reiche Pflanzenproteine, z.B. aus Sonnenblumensamen (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs; Herausg. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), S. 497-502; die hierin als Referenz aufgenommen gilt); Mais (Pedersen et al. (1986) J. Biol.Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359, die beide hier durch Referenz aufgenommen werden); und Reis (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123). Andere agronomisch wichtige Gene codieren für Latex, Floury 2, Wachstumsfaktoren, Samenspeicherfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
Gene für Resistenz gegen Insekten können für Resistenz gegen Schädlinge, die einen großen Ernteertragsausfall bewirken, z.B. Wurzelwurm, Erdraupe, Maiszünler und dergleichen, codieren. Solche Gene umfassen z.B. Bacillus thuringiensis-Gene für toxisches Protein (US-Patente Nrn. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; und Geiser et al. (1986) Gene 48:109); Gene für Lectine (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825) und dergleichen.
Gene, die für Krankheitsresistenzmerkmale codieren, umfassen Detoxifikationsgene, z.B. gegen Fumonosin (US-Patent Nr. 5,792,931); Avirulenz (avr)- und Krankheitsresistenz (R)-Gene (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; und Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089) und dergleichen.
Herbizidresistenzmerkmale können Gene einschließen, die für Resistenz gegen Herbizide codieren, welche unter Inhibierung der Wirkung von Acetolactatsynthase (ALS) wirken, ins besondere gegen die Herbizide vom Sulfonylharnstoff-Typ (z.B. das Acetolactatsynthase (ALS)-Gen, das Mutationen enthält, die zu einer solchen Resistenz führen, insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen), Gene, die für Resistenz gegen Herbizide codieren, welche unter Inhibierung der Wirkung von Glutaminsynthase wirken, z.B. Phosphinothricin oder Basta (z.B. das bar-Gen), oder andere derartige fachbekannte Gene. Das bar-Gen codiert für Resistenz gegen das Herbizid basta, das nptII-Gen codiert für Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin und Geneticin, und die ALS-Genmutanten codieren für Resistenz gegen das Herbizid Chlorsulfuron.
Sterilitätsgene können auch in einer Expressionskassette codiert sein und eine Alternative für physikalisches Entfahnen bereitstellen. Beispiele für Gene, die auf diese Weise verwendet werden, umfassen Gene, die bevorzugt in männlichem Gewebe vorkommen, und Gene mit männlichen Sterilitätsphänotypen, z.B. QM, beschrieben im US-Patent Nr. 5,583,210. Andere Gene umfassen Kinasen und solche, die für Verbindungen codieren, die für männliche oder weibliche gametophytische Entwicklung toxisch sind.
Die Qualität der Körner spiegelt sich in Merkmalen wie Konzentration und Typ der Öle, gesättigt und ungesättigt, Qualität und Quantität der essentiellen Aminosäuren und Cellulosekonzentration wider. Für Mais sind Modifikationen des Hordothioninproteins für gewünschte Zwecke in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung, Serial Nr. 08/838,763 (US-Patent Nr. 5,990,389), eingereicht am 10. April 1997, und in den US-Patenten Nr. 5,703,049, 5,885,801 und 5,885,802 beschrieben.
Kommerzielle Merkmale können auch auf einem Gen oder auf Genen codiert sein, die z.B. Stärke zur Ethanolproduktion erhöhen können oder für eine Expression von Proteinen sorgen. Eine andere wichtige kommerzielle Verwendung von transformierten Pflanzen ist die Produktion von Polymeren und Biokunststoffen, wie sie z.B. im US-Patent Nr. 5,602,321 beschrieben ist. Gene, z.B. für β-Ketothiolase, PHBase (Polyhydroxyburyratsynthase) und Acetoacetyl-CoA-Reduktase (siehe Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) erleichtern die Expression von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs).
Exogene Produkte beinhalten Pflanzenenzyme und Produkte wie auch solche aus anderen Quellen, einschließlich Prokaryoten und andere Eukaryoten. Solche Produkte umfassen Enzyme, Co-Faktoren, Hormone und dergleichen. Die Konzentration an Proteinen, insbesondere modifizierten Proteinen mit verbesserter Aminosäureverteilung zur Verbesserung des Nährwerts der Pflanze, kann erhöht werden. Dies wird durch die Expression von solchen Proteinen, die einen erhöhten Aminosäuregehalt haben, erreicht.
Aus Gründen der Zweckdienlichkeit können die heterologen Nucleotidsequenzen, die in die Pflanze transferiert werden sollen, in Expressionskassetten enthalten sein. Solche Expressionskassetten werden eine Transkriptionsstartregion mit der heterologen Nucleotidsequenz von Interesse verknüpft umfassen. Jede Expressionskassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen zur Insertion der Nukleotidsequenz versehen, um unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen zu sein.
Die Transkriptionsstartregion, der Promotor, kann für den Pflanzenwirt nativ (d.h. analog) oder fremd (d.h. heterolog) sein. Außerdem kann der Promotor die natürliche Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die Transkriptionsstartreaktion in der nativen Pflanze, in die die Transkriptionsstartregion eingeführt wird, nicht gefunden wird. Ein chimäres Gen – so wie der Ausdruck hierin verwendet wird – umfasst eine codierende Sequenz funktionell mit einer Transkriptionsstartregion, die zu der codierenden Sequenz heterolog ist, funktionell verknüpft.
In der Expressionskassette kann eine Vielzahl von Promotoren verwendet werden. Die Promotoren können auf der Basis des gewünschten Ziels, z.B. um eine konstitutive, induzierbare oder gewebespezifische Expression von heterologen Nucleotidsequenzen in Pflanzen zu steuern, ausgewählt werden. Konstitutive Promotoren umfassen z.B. den Kernpromotor von Rsyn7 (gleichzeitig anhängige US-Anmeldung, Serial Nr. 08/661,601 (US-Patent Nr. 6,072,050)); den Kern-CaMV 35S-Promotor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), den Reis-Actin-Promotor (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171), den Ubiquitin-Promotor (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); den MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); den ALS-Promotor (US-Anmeldung Serial Nr. 08/409,297) und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen z.B. die der US-Patente Nrn. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463 und 5,608,142).
Induzierbare Promotoren umfassen z.B. solche von mit Pathogenese in Verbindung stehenden Proteinen (PR-Proteinen), die nach Infektion durch ein Pathogen induziert werden; z.B. PR-Proteine, SAR-Proteine, β-1,3-Glucanase, Chitinase usw. Siehe z.B. Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; und Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Siehe auch die gleichzeitig anhängige Anmeldung mit dem Titel "induzierbare Maispromotoren", US-Anmeldung, Serial Nr. 09/257,583, eingereicht am 25. Februar 1999 (US-Patent Nr. 6,429,362).
Von Interesse sind Promotoren, die lokal an oder nahe der Stelle der Pathogeninfektion exprimiert werden. Siehe z.B. Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989Somsisch et ) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; und Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Siehe auch Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; US-Patent Nr. 5,750,386 (Nematodeninduzierbar); und darin angegebene Literaturstellen. Von besonderem Interesse ist der induzierbare Promotor für das Mais-PRms-Gen, dessen Expression durch das Pathogen Fusarium moniliforme induziert wird (siehe z.B. Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200). Andere induzierbare Promotoren umfassen die Wund-induzierbaren Promotoren, d.h. Kartoffelproteinase-Inhibitor (pin II)-Gen (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 und wun2, US-Patent Nr. 5,428,148; win1 und win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1570Rohmeier et -1573); WIP1 (al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); MPI-GenCorderok et (al. (1994) Plant J. 6(2):141-150) und dergleichen.
Gewebe-spezifische Promotoren werden z.B. in Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Sci USA 90(20):9586-9590; und Guervara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3)495-505 offenbart. Siehe auch Bevan et al. (1993) in Gene Conservation and Exploitation: Proceedings of the 20th Stadler Genetics Symposium, Herausg. Gustafson et al. (Plenum Press, New York), S. 109-129; Brears et al. (1991) Plant J. I:235-244; Lorenz et al. (1993) Plant J. 4:545-554; US-Patent Nrn. 5,459,252; 5,608,149; 5,599,670, 5,466,785, 5,451,514; und 5,391,725.
Die Transkriptionskassette wird in 5'-zu-3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsstartregion, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine Transkriptions- und Translationsterminierungsregion, die in Pflanzen funktionell sind, enthalten. Die Terminierungsregion wird mit der Transkriptionsstartregion nativ sein, kann mit der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminierungsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminierungsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (199Munroe et 0) Plant Cell 2:1261-1272; al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.
Die heterologe Nucleotidsequenzen von Interesse werden in Expressionskassetten bereitgestellt, die innerhalb der T-DNA-Regionen von binären Vektoren insertiert sind, um eine Expression in der Pflanze von Interesse nach Transformation der Pflanze mit den gentechnisch manipulierten Acrobacterium-Stämme mit mehreren binären Vektoren der Erfindung zu ermöglichen. Die Kassette wird 5'- und 3'-regulatorische Sequenzen funktionell verknüpft mit der Nucleotidsequenz von Interesse enthalten. Eine gegebene Expressionskassette in einer T-DNA-Region eines gegebenen binären Vektorplasmids kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches Gen enthalten, das in den Organismus co-transformiert werden soll. Alternativ kann das zusätzliche Gen (können die zusätzliche Gene) auf einer anderen Expressionskassette bereitgestellt werden.
Wo es geeignet ist, kann die Nucleotidsequenz von Interesse oder können die Nucleotidsequenzen von Interessen für eine verstärkte Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. Das heißt, diese Nucleotidsequenzen können unter Verwendung von Pflanzenbevorzugten Codons für eine verbesserte Expression synthetisiert werden. Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Synthese von Pflanzen-bevorzugten Nucleotidsequenzen verfügbar. Siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391, und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
Von weiteren Sequenzmodifikationen ist bekannt, dass sie eine Genexpression in einem zellulären Wirt verstärken. Diese umfassen Eliminierung von Sequenzen, die für falsche Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellen-Signale, Transposon-artige Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen codieren, welche für eine Genexpression schädlich sein können. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level eingestellt werden, die für einen gegebenen Zellwirt durchschnittlich sind, wie sie durch Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, erreicht werden. Wenn möglich, wird die Sequenz modifiziert, um vorausgesagte Haarnadel-Sekundär-mRNA-Strukturen zu vermeiden.
Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leader-Sequenzen im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leader-Sequenzen können unter Verstärkung der Translation wirken. Translations-Leader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z.B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS USA 86:6126-6130); Potyvirus-Leader, z.B. TEV-Leader (Tabak-Etch-Virus) (Allison et al. (1986); MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaik-Virus); Virology 154:9-20) und humanes Immunglobulin-schwere Kette-Bindungsprotein (BiP), (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); nicht-translatierte Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfa-Mosaik-Virus (AMV-RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Hrsg. Cech (Liss, New York), S. 237-256) und chlorotisches Maisscheckungsvirus-Leader (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Andere Verfahren, von denen bekannt ist, dass sie eine Translation verstärken, können auch verwendet werden, z.B. Introns und dergleichen.
Im Allgemeinen wird wenigstens eines der binären Vektorplasmide eine T-DNA-Region umfassen, deren heterologe Nucleotidsequenz wenigstens eine Expressionkassette umfasst, die ein eindeutiges "scorable" Markergen umfasst, das in der Pflanze funktionell ist. Mit "scorable Markergen" ist ein Gen gemeint, das für die Selektion von Pflanzenzellen oder -geweben verwendet wird, die mit dem T-DNA-Insert transformiert wurden, das den "scorable Marker" umfasst, der durch das besondere binäre Vektorplasmid, das den "scorable Marker" trägt, in die Pflanze transferiert wurde. "Plant scorable"-Markergene umfassen z.B. selektierbare Markergene und analysierbare Reportergene.
"Plant selectable" Markergene verleihen Resistenz für ein bestimmtes Selektionsmittel und sorgen so für eine Selektion von transformierten Zellen/Geweben in Gegenwart eines solchen Selektionsmittels. Selektierbare Markergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Gene, die für Antibiotikumresistenz codieren, z.B. solche, die für Neomycinphosphotransferase II (NEO) (Fraley et al. (1986) CRC Critical Review in Plant Science 4:1-25) und Hygromycinphosphotransferase (HPT oder HYG) codieren (Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299, Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6:1074), wie auch Gene, die Resistenz gegen herbizide Verbindungen, wie z.B. Glufosinatammonium, Bromoxynil und 2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D), verleihen.
Mit analysierbarem bzw. assayable "Reportergen" ist jedes andere "scorable" Markergen als ein selektierbares Markergen gemeint, das auf sein Vorliegen und/oder seine Expression analysiert werden kann. Reportergene codieren im Allgemeinen für ein Protein, dessen Aktivität untersucht werden kann, um zu bestimmen, ob das Reportergen vorhanden ist und/oder exprimiert wird. Vorzugsweise kann das Protein unter Verwendung nicht-letaler Verfahren untersucht werden. Die Verwendung von solchen "assayable" Reportergenen im Gegensatz zu selektierbaren Markergenen ist im Detail in der noch anhängigen Anmeldung mit dem Titel "Recove ry of Transformed Plants Without Selectable Markers by Nodal Culture and Enrichment of Transgenic Sectors", US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/857,664, eingereicht am 16. Mai 1997 (veröffentlicht als entsprechende PCT-Anmeldung WO 98/51806), offenbart.
Für "assayable" bzw. "analysierbare" Reportergene gibt es eine bestimmte Art eines chemischen, biologischen oder physikalischen Assays, der verfügbar ist und der das Vorliegen oder das Fehlen oder die Änderung bei der Menge des Expressionsproduktes des Gens bestimmen wird. In bestimmten Ausführungsformen, in denen das analysierbare Reportergen ein Enzym produziert, das im Stoffwechselweg involviert ist, kann der Assay das Vorliegen oder das Fehlen oder eine Änderung in der Menge eines Metaboliten, der direkt durch das Enzym produziert wird, oder das Vorliegen oder das Fehlen oder eine Änderung in der Menge eines Metaboliten, der direkt durch das Enzym produziert wird, oder das Vorliegen oder das Fehlen oder eine Änderung in der Menge des Endproduktes des Stoffwechselwegs anstatt das Vorliegen oder das Fehlen des Expressionsproduktes (des Enzyms) selbst bestimmen. Beispielsweise könnte ein solches Enzym in einem Stoffwechselweg involviert sein, der Öle mit einer bestimmten Fettsäurezusammensetzung produziert. Dem Fachmann wird klar sein, dass viele Formen der Assaytechniken verfügbar sind, um das Vorliegen und/oder die Expression von Reportergenen zu detektieren. Beispielsweise könnte ein beliebiges exprimiertes Protein, das zur Detektion durch ELISA geeignet ist, unter Verwendung des assoziierten ELISA analysiert werden, oder eine Modifikation in der Menge einer spezifischen Fettsäure könnte unter Verwendung der geeigneten biochemischen analytischen Technologie (z.B. GCMS) bestimmt werden; oder es könnte ein Bioassay verwendet werden (z.B. Expression eines Kristallproteintoxins aus Bacillus thuringiensis (Bt) könnte durch Screening auf nachteilige Effekte von transformiertem Pflanzengewebe bei Insekten oder Insektenlarven, die für das Kristallproteintoxin empfindlich sind, bestimmt werden).
Der Fachmann wird auch erkennen, dass das Vorliegen des analysierbaren Reportergens direkt unter Verwendung von DNA-Amplifikationstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, PCR, RT-PCR oder LCR zum Beispiel, detektiert werden kann. Als Erläuterung sei angeführt, dass das analysierbare Reportergen ein embryospezifisches Gen sein könnte, z.B. eine Desaturase unter der Kontrolle eines embryospezifischen Promotors. Es würde erwartet, dass eine genetische Modifikation unter Verwendung eines solchen Genkonstrukts Samenölprofile modifiziert, ohne eine Expression in Blättern zu beeinträchtigen. Ein geeignet durchgeführtes PCR-Screening würde das Vorliegen der Sequenz in transformierten Pflanzen detektieren. Der Fachmann wird erkennen, dass, wenn eine Agrobacteriumvermittelte Transformation als Transformationsverfahren verwendet wurde, bestimmte Maß nahmen notwendig sein werden, um das in Agrobacterium vorliegende analysierbare bzw. "assayable" Reportergen von dem im Genom von transformierten Pflanzenzellen vorliegenden Reportergen zu unterscheiden. Die Verwendung eines geeigneten Satzes an Primern, der Primer für Agrobacterium-DNA beinhaltet, wird auf dieses Problem gerichtet sein. Es wird auch erkannt werden, dass ein beliebiges Gen, das unter Verwendung der Amplifikationstechnologie, z.B. PCR, amplifiziert werden kann, als analysierbares Reportergen in der vorliegenden Erfindung dienen kann.
Reportergene sind besonders nützlich, um das räumliche Expressionsmuster eines Gens in spezifischen Genen zu quantifizieren oder zu visualisieren. Üblicherweise verwendete Reportergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, B-Glucuronidase (GUS) (Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387); B-Galactosidase (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343-350); Luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) (Lindsey und Jones (1987) Plant Mol. Biol. 10:43-52); grünes Fluoreszenzprotein (GFP) (Chalfie et al. (1994) Science 263:802); und die Maisgene, die für Anthocyaninproduktion codieren (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).
Weitere Beispiele für analysierbare Reportergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, das Oxalatoxidasegen, das aus Weizen (Dratewka-Kos et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:4896-4900) (das "Germin"-Gen) und Gerste (WO 92/14824) isoliert wurde; das Oxalatdecarboxylasegen, das aus Aspergillus und Collybia isoliert wurde (siehe WO 94/12622); andere Enzyme, die Oxalat verwenden; andere Enzyme, z.B. Polyphenoloxidase, Glucoseoxidase, Monoaminoxidase, Cholinoxidase, Galactoseoxidase, 1-Aspartatoxidase und Xanthinoxidase und dergleichen.
Wie der Fachmann erkennen wird, wird der Assay für Reportergene mit der Natur des Expressionsproduktes variieren. Beispielsweise kann ein enzymatischer Assay in solchen Fällen verwendet werden, in denen das Expressionsprodukt ein Enzym ist, z.B. im Fall einer Transformation mit einem Gen, das für Oxalatoxidase oder Oxalatdecarboxylase codiert. Ein visueller oder kolorimetrischer Assay wäre für Pflanzenzellen oder -gewebe, die mit einem GFP-Gen transformiert sind, geeignet. Der Fachmann wird auch erkennen, dass, wenn ein enzymatischer Assay geeignet ist, die Existenz eines Assays auf dem Fachgebiet besonders nützlich wäre. Darüber hinaus werden, wie oben angegeben, andere Assaytechniken (z.B. PCR für den analysierbaren Reporter selbst oder ELISA oder ein Bioassay oder chemische Analyseverfahren, z.B. GCMS) bei der Durchführung der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung geeignet sein.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Assay ein Verfahren beinhalten, das außerdem einen Verlust eines messbaren Produktes oder eine Abnahme beim Expressionslevel eines messbaren Produktes, das normalerweise vorhanden ist oder das normalerweise bei höheren Leveln exprimiert wird, misst. Beispielsweise kann Antisense- oder Co-Suppressionstechnologie eingesetzt werden, um die Expression eines bestimmten Gens nach unten zu regulieren, und es kann ein geeigneter Assay eingesetzt werden, der das Verschwinden oder die Abnahme in der Menge des Expressionsproduktes oder eines metabolischen Produktes detektieren wird.
Bezüglich weiterer Informationen über die Verwendung von "scorable" Markergenen siehe allgemein Yarranton (1992) Curr. Opin.Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) The Operon, S. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deutschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deutschle et al. (1990) Science 248:480-483; M. Gossen (1993) Ph.D. Thesis, Universität Heidelberg, Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topcs Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397-404; A.L. Bonin (1993) Ph. D. Thesis, Universität Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook Exp. Pharmacol. 78, Gill et al. (1988) Nature 334:721-724.
Bei der Herstellung der Expressionskassetten können die verschiedenen DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass sie die DNA-Sequenzen in der geeigneten Orientierung und gegebenenfalls im geeigneten Leseraster bereitstellen. Zu diesem Zweck können Adapter oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verknüpfen, oder es können andere Manipulationen involviert sein, um für zweckdienliche Restriktionsstellen, Entfernung überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu diesem Zweck können eine in vitro-Mutagenese, eine Primerreparatur, eine Restriktion, ein Anlagern, Resubstitutionen, z.B. Transitionen und Transversionen, involviert sein.
Somit werden die binären Vektorplasmide, die in einen Agrobacterium-Stamm eingeführt werden, um den neuen Agrobacterium-Stamm mit mehreren binären Vektoren der vorlie genden Erfindung zu konstruieren, modifiziert, so dass sie vorstehend genannten Schlüsselmerkmale, einschließlich eines "broad-host-range"-Replikationsursprungs, einer Mehrfachklonierungsstelle, eines bakteriellen selektierbaren Markergens, Transferfunktionen, wo erforderlich, und wenigstens eine T-DNA-Randregion umfasst, die die heterologe Nukleotidsequenz von Interesse, die in eine Pflanze zu transferieren und anschließend in das Pflanzengenom zu integrieren ist, umfasst.
Wenigstens zwei dieser modifizierten binären Vektorplasmide werden in einen Agrobacterium-Stamm eingeführt oder transferiert, um den gentechnisch veränderten Agrobacterium-Stamm mit mehreren binären Vektoren der vorliegenden Erfindung zu konstruieren. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Agrobacterium-Spezies und ihre jeweiligen Stämme (insbesondere zur Dikotylen-Transformation) bekannt. Siehe z.B. Hooykaas (1989) Plant Mol. Biol. 13:327; Hooykaas (1988) Plant Mol. Biol. Manual A4:1-13; Smith et al. (1995) Crop Science 35:301; Chilton (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3119; Mollony et al. (1993) Monograph Theor. Appl. Genet. NY, Springer-Verlag 19:148; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:745; und Komari et al. (1996) The Plant Journal 10:165. Vorzugsweise ist das gentechnische veränderte Agrobacterium ein Stamm von A. tumefaciens, bevorzugter der A. tumefaciens-Stamm EHA101 oder EHA105, obgleich ein beliebiger Agrobacterium-Stamm gentechnisch verändert werden kann.
Methoden zum Plasmidtransfer in Agrobacterium sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können die binären Vektorplasmide konjugativ in einer triparentalen Paarung in ein Agrobacterium, das ein Helfer-Ti- oder -Ri-Plasmid enthält (siehe z.B. Hooykaas und Schilperoort (1984) Adv.Genet. 22:209-283), transferiert werden. Alternativ kann eine sequenzielle Transformation mit wenigstens zwei binären Vektorplasmiden unter Verwendung der Gefrier-Tau-Methode (Holsters (1978) Mol. Gen. Genet. J.:181-187) oder der Elektroporationsmethode (Lalonde et al. (1989) Am. J. Vet. Res. 50(11) 1957-1960); Wen-jun und Forde (1989) Nucleic Acids Res. 17(20):8385) erreicht werden.
Nach Transformation mit jedem binären Vektorplasmid können Bakterienkolonien, die ein bestimmtes binäres Vektorplasmid oder bestimmte binäre Vektorplasmide enthalten, selektiert werden, indem ein besonderes Selektionsmittel (besondere Selektionsmittel) in dem Wachstumsmedium enthalten ist (sind), das (die) für das bakterielle selektierbare Markergen (die bakteriellen selektierbaren Markergene), das (die) in dem binären Vektorplasmid (den binären Vektorplasmiden) enthalten ist (sind), spezifisch ist (sind). So könnte z.B. ein Agrobacterium mit zwei binären Vektorplasmiden transformiert sein, von denen eines das selektierbare Markergen für Kanamycinresistenz (kan^r) trägt und das andere das Markergen für Carbenicillinresistenz (amp^r) trägt. In diesem Beispiel wird der Agrobacterium-Stamm, der mit dem binären kan^r-Vektorplasmid transformiert ist, in Gegenwart von Kanamycin kultiviert, um auf Bakterienkolonien zu selektieren, die das selektierbare Markergen enthalten, das Resistenz gegenüber diesem Arzneimittel verleiht. Nach diesem Selektionsprozess werden Agrobacterium-Kolonien, die das binäre kan^r-Vektorplasmid enthalten, mit dem binären amp^r-Vektorplasmid transformiert. Nach Kultur in einem Medium, das Carbenicillin enthält, werden Carbenicillin-resistente (amp^r)-Kolonien in einem Medium kultiviert, das beide Selektionsmittel enthält, um Bakterienkolonien zu isolieren, die beide, das binäre kan^r-Vektorplasmid und das binäre amp^r-Vektorplasmid, umfassen. Obgleich ähnliche Konstruktionen eines bestimmten Selektionsmittels in aufeinander folgenden Selektionsrunden auf weitere binäre Vektorplasmide verwendet werden können, kann es bevorzugt sein, eine geringere Konzentration eines Selektionsmittels während der ersten Selektionsrunde auf das entsprechende selektierbare Markergen zu verwenden, um den Tod von Kolonien, die geringe Kopienzahlen des bestimmten binären Vektorplasmids, das das Gen umfasst, das Resistenz gegen das Selektionsmittel verleiht, zu verhindern.
Die resultierenden Agrobacterium-Stämme mit mehreren binären Vektoren stellen ein neues Acrobacterium-vermitteltes Gentransfersystem bereit, das zur Co-Transformation einer beliebigen Pflanze eingesetzt werden kann, wobei eine Co-Transformation in einem einzelnen Transformationsereignis erreicht wird. Transformierte Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens zwei unabhängig transferierte heterologe Nucleotidsequenzen von Interesse enthalten, z.B. transferierte Gene, von denen jedes von T-DNA-Rändern flankiert ist und in unverknüpfter Art in das Genom der Pflanze insertiert ist. Die transformierten Pflanzen sind in der Morphologie normal und sind fertil. Vorzugsweise enthalten die transformierten Pflanzen eine einzelne Kopie jeder der transferierten Nucleotidsequenzen ohne erkennbare Umlagerungen. Alternativ liegen die unabhängig transferierten Nucleotidsequenzen von Interesse in der transformierten Pflanze in niedriger Kopienzahl vor. Mit niedriger Kopienzahl ist gemeint, dass Transformanten nicht mehr als fünf (5) Kopien der T-DNA, vorzugsweise nicht mehr als drei (3) Kopien der T-DNA, bevorzugter weniger als drei (3) Kopien jeder T-DNA umfassen. Auf diese Weise können genetisch modifizierte Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, Samen und dergleichen erhalten werden. Agrobacterium-vermittelte Transformationsprotokolle können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder Pflanzenzelle, d.h. Monokotyle oder Dikotyle, die zur Transformation targetiert wird, variieren.
Agrobacterium-Transformationsprotokolle sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Eine Agrobacterium-vermittelte Transformation beinhaltet eine Inkubation von Zellen oder Geweben mit dem Bakterium, gefolgt von einer Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Zel len, die eine Kallusbildungsstufe beinhalten kann oder nicht. Eine Inokulation von Explantaten hat sich als das wirksamste Mittel zur Erzeugung transgener Pflanzen erwiesen.
Solche Explantate umfassen Zellen aus Meristem, z.B. die Primärmeristeme, die sich an den Apices von Haupt- und Seitensprossen und -wurzeln befinden, Blattbasalmeristeme, Knotenmeristeme, die zu Nebensprossen und -wurzeln wachsen, Sekundärmeristeme und Meristeme, die zu Adventivknospen oder -wurzeln wachsen. Andere geeignete Explantate umfassen das Keimlingshypokotyl, unreife und reife Kotyledone, Kotyledonen-Knotenzellen, Meristeme aus unreifen Samenembryoachsen, unreife und reife Embryos, Primärblättchen und dergleichen.
In einer Ausführungsform ist das Explanat ein Keimlingsapicalmeristem, insbesondere ein intaktes Keimlingsapicalmeristem, das aus einer Embryoachse eines reifen Samens erhalten wird. Nach Sameninhibierung wird das Meristem durch Entfernung der primordialen Scheidenblätter oder Keimblätter freigelegt und dann mit einem erfindungsgemäßen Agrobacterium-Stamm mit mehreren binären Vektoren (multiple-binary vector) inokuliert. Nach der Agrobacterium-vermittelten Transformation regeneriert ein solches Explantat Keimlinge bzw. Schösslinge während einer Kultur. Die transformierten Meristemzellen/das transformierte Meristemgewebe können kann manipuliert werden, so dass die transgenen Sektoren vergrößert werden, und zwar entweder durch Selektion und/oder durch Durchführung der Proliferation aus Gewebe von Keimlingen oder mehreren Meristemen per se. Die erhaltene Schößlingspopulation kann dann auf transgene Sektoren durchgemustert und bezüglich dieser angereichert werden, welche dann Bedingungen ausgesetzt werden, die für eine Differenzierung zu transgenen Pflänzchen sorgen. Siehe insbesondere US-Patent Nr. 5,736,369. In einer anderen Ausführungsform ist das Explantat ein Meristem einer gespaltenen Embryoachse, das aus reifem Samen erhalten wurde, wie es in Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Sci. 103:199-207 beschrieben ist.
Agrobacterium-vermittelte transformierte Schösslinge, die aus Meristemen, z.B. Embryoachsenmeristeme, laterale oder Nebenmeristeme oder Adventivmeristeme, erzeugt wurden, können weiter kultiviert werden, indem ein Knotenexplantatverfahren zur Bildung von Schösslingen und schließlich Pflanzen mit angereicherten transgenen Sektoren verwendet wird. Auf diese Weise werden Schösslinge, die bezüglich einer Transformation positiv analysiert wurden, in Segmente unterteilt, von denen jedes einen identifizierbaren Knotenübergang mit seinem assoziierten Knotenmeristem umfasst. Die resultierenden Knotenexplantate werden dann kultiviert, um eine Knotenmeristementwicklung und eine Bildung von Schösslingen mit angereicherten transgenen Sektoren zu induzieren. Die Schlösslinge, die bezüglich der Transformation positiv sind, können dann zu transgenen Pflanzen kultiviert werden oder für eine anschließende Knotenkultur und -anreicherung vor Kultivierung transgener Pflanzen verwendet werden. Eine Noduskultur und eine Anreicherung an transgenen Sektoren ist insbesondere zur Regeneration von transformierten Pflanzen ohne selektierbare Markergene effektiv. Siehe insbesondere die gleichzeitig anhängige Anmeldung mit dem Titel "Recovery Transformed Plants Without Selectable Markers by Nodal Culture and Enrichment of Transgenic Sectors", US-Patentanmeldung, Serial No. 08/857,664, eingereicht am 16. Mai 1997 (veröffentlicht als entsprechende PCT-Anmeldung WO 98/51806).
Der gentechnisch veränderte Agrobacterium-Stamm mit mehreren binären Vektoren bzw. der "multiple binary vector"- Agrobacterium-Stamm kann eingesetzt werden, um die Zellen einer beliebigen Pflanze zu transformieren. Solche Zellen umfassen Kallus, der aus beliebigen Geweben einer Pflanze stammen kann. Vorzugsweise ist das Gewebe, das bei der Initiierung von Kallus eingesetzt wird, unreifes Gewebe, z.B. unreife Embryos, unreife Blütenstände und der Basalteil junger Blätter. Alternativ kann der Kallus aus Staubblättern, Mikrosporen, reifen Embryos und hauptsächlich aus einem anderen Gewebe, das zur Bildung von Kallus und/oder Sekundärembryonen fähig ist, stammen.
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um Zellsuspensionen zu transformieren. Solche Zellsuspensionen können aus einem beliebigen Pflanzengewebe gebildet werden.
Das Verfahren zur Transformation mit dem gentechnisch hergestellten "multiple-binary vector"- Agrobacterium-Stamm der Erfindung kann in mehrer Schritte aufgeteilt werden. Die Grundschritte umfassen einen Inokulations- oder Infektionsschritt (Schritt 1); einen Co-Kultivierungsschritt (Schritt 2) eines transgenen Kallus und/oder Schösslingsgewinnungsschritt, der ein Selektionsmittel (zur Verwendung mit einem "plant selectable")-Markergen einarbeitet, oder nicht selektives Wachstum, gefolgt von einem Screening (zur Verwendung mit einem analysierbaren Reportergen) (Schritt 3); und Gewinnung von bewurzelten transgenen Schösslingen, gefolgt von einem Transfer in Erde zur Entwicklung von transgenen Pflanzen (Schritt 4).
Im Infektionsschritt werden die Gewebe oder Zellen, die zu transformieren sind, isoliert und dem gentechnisch veränderten Agrobacterium-Stamm ausgesetzt, so dass ein Kontakt mit einer Agrobacterium-Suspension bereitgestellt wird. Wie oben beschrieben wurde, wurde jedes binäre Vektorplasmid in dem gentechnisch veränderten Agrobacterium so modifiziert, dass es eine heterologe Nucleotidsequenz von Interesse in einer T-DNA-Region umfasst. Wenigstens eine dieser T-DNA-Regionen umfasst eine Expressionskassette, die ein eindeutiges "plant scorable" Markergen umfasst, z.B. ein selektierbares Markergen oder ein analysierbares Reportergen, wie hierin definiert, um auf transformierte Pflanzen zu selektieren oder durchzumustern. Allgemeine Molekulartechniken, die in der Erfindung verwendet werden, werden z.B. von Sambrock et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) bereitgestellt.
Agrobacterium, das die binären Vektorplasmide von Interesse enthält, wird vorzugsweise auf Agrobacterium-Masterplatten mit Glycerol-Stocks, die bei –80°C gefroren sind, gehalten. Der Ausdruck "Agrobacterium", das fähig ist, wenigstens zwei Gene zu transferieren, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf das gentechnisch veränderte Agrobacterium, das die binären Vektorplasmide enthält, die die Gene oder Nucleotidsequenzen von Interesse umfassen und die zur Vermittlung der Ereignisse geeignet sind, die erforderlich sind, um die Gene oder Nucleotidsequenzen auf die zu infizierenden Zellen zu übertragen. Masterplatten können verwendet werden, um Agarplatten zu inokulieren, um Agrobacterium zu erhalten, das dann in flüssigen Suspensionskulturen, z.B. YPC, YEP, LB, MinA mit geeigneten Antibiotika wachsen gelassen wird, zentrifugiert wird und dann in einem Inokulationsmedium zur Verwendung im Infektionsprozess resuspendiert wird. Solche Inokulationsmedien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen im Allgemeinen die wichtigen anorganischen Salze und Vitamine. Siehe z.B. Chu (1987) Proc. Symp. Plant Tissue Culture (Science Press, Peking), S. 43-50; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Skirvin (1981) in Cloning Agricultural Plants Via In vitro Techniques, Herausg. Conger (CRC Press, Knoxville, Tennessee), S. 51-140; EP-A-0 672 752 A1; EP-A-0 687 730 A1; und US-Patent Nr. 5,591,616. Alternativ können Bakterien von der Masterplatte verwendet werden, um Brühkulturen zu inokulieren, die vor der Transformation zur logarithmischen Phase gewachsen sind.
Die Konzentration an gentechnisch verändertem Agrobacterium, das im Infektionsschritt und Co-Kultivierungsschritt eingesetzt wird, kann die Transformationshäufigkeit beeinflussen. Entsprechend können sehr hohe Konzentrationen an Agrobacterium die Zellen oder Gewebe, die zu transformieren sind, z.B. Primärmeristeme oder unreife Embryos, schädigen und zu einer verringerten Wachstumsantwort von transformierten Zellen führen. Demnach kann die Konzentration an Agrobacterium, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, in Abhängigkeit von dem verwendeten Agrobacterium-Stamm, dem transformierten Gewebe, der Pflanzenspezies, die transformiert wird, und dergleichen variieren. Um das Transformationsprotokoll für eine bestimmte Pflanzenspezies oder ein bestimmtes Pflanzengewebe zu optimieren, können die Zellen oder kann das Gewebe, die zu transformieren sind (z.B. Primärmeristeme oder unreife Embryos) mit verschiedenen Konzentrationen an Agrobacterium inkubiert werden. Entsprechend können der Level an "scorable" Markergen, die Expression und die Transformationseffizienz für verschiedene Agrobacterium-Konzentrationen bestimmt werden.
Die Zellen/das Gewebe, die zu transformieren sind, werden im Allgemeinen in einer flüssigen Kontaktphase, die eine Konzentration des gentechnisch veränderten Agrobacterium enthält, zu der Agrobacterium-Suspension gegeben, um die Transformationseffizienz zu optimieren. Die Kontaktphase erleichtert einen maximalen Kontakt der Zellen/des Gewebes, die zu transformieren sind, mit der Agrobacterium-Suspension. Die optimale Länge für die Kontaktphase kann experimentell für die Gewebe und die Pflanzenspezies, die eine Transformation durchmachen, bestimmt werden. Im Allgemeinen werden die Zellen/Gewebe mit der Agrobacterium-Suspension für einen Zeitraum von wenigstens etwa 5 Minuten bis etwa 60 Minuten, vorzugsweise etwa 5 Minuten bis etwa 45 Minuten, bevorzugter etwa 5 Minuten bis etwa 25 Minuten, bevorzugter etwa 10 Minuten bis etwa 15 Minuten in Kontakt gebracht.
Nach dem Inokulations- oder Infektionsschritt werden die zu transformierenden Zellen/Gewebe mit dem gentechnisch veränderten Agrobacterium-Stamm auf einem Medium, das keine Antibiotika enthält, co-kultiviert. Die Länge des Co-Kultivierungszeitraums wird für den Typ der Explantate, Zellen oder Gewebe und die bestimmte Pflanzenspezies, die eine Transformation durchmacht, bestimmt. Im Allgemeinen werden die Zellen/das Gewebe mit dem gentechnisch veränderten Agrobacterium-Stamm für etwa 1 bis 30 Tage, vorzugsweise etwa 1 bis 20 Tage und bevorzugter etwa 1 bis 10 Tage co-kultiviert.
Nach dem Co-Kultivierungsschritt können die transformierten Zellen/das transformierte Gewebe einem optionalen Ruheschritt unterworfen werden. Wenn kein Ruheschritt verwendet wird, kann ein verlängerter Co-Kultivierungsschritt verwendet werden, um einen Kulturzeitraum vor Zusatz eines Selektionsmittels, wenn ein selektierbares Markergen verwendet wird, oder vor Bestimmung der Aktivität eines Reportergens bereitzustellen.
Für den Ruheschritt werden die transformierten Zellen in ein zweites Medium übertragen, das ein Antibiotikum enthält, das fähig ist, das Wachstum von Agrobacterium zu hemmen. Diese Ruhephase wird in Abwesenheit eines selektiven Drucks durchgeführt, um eine bevorzugte Initiierung und Wachstum von Kallus, wenn notwendig, aus den transformierten Zellen, die die heterologe Nucleotidsequenz enthalten, zuzulassen. Ein Antibiotikum, das keines der bakteriellen Selektionsmittel ist, für welches das gentechnisch veränderte Agrobacterium ein Resistenzgen hat, wird zugesetzt, um Agrobacterium-Wachstum zu hemmen. Alternativ kann das Antibiotikum im Selektionsmedium eines sein, für das der gentechnisch veränderte Agrobacterium-Stamm ein entsprechendes Resistenzgen hat, für das aber nur bei Konzentrationen unter der Konzentration im Kulturmedium Resistenz verliehen wird. Antibiotika, die Agrobacterium hemmen, sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Cefotaxim, Timetin, Vancomycin, Carbenicillin und dergleichen. Konzentrationen des Antibiotikums werden sich entsprechend dem Standard für jedes Antibiotikum ändern. Beispielsweise werden die Konzentrationen an Carbenicillin im Bereich von etwa 50 mg/l bis etwa 250 mg/l Carbenicillin in festen Medien, vorzugsweise etwa 75 mg/l bis etwa 200 mg/l, bevorzugter etwa 100 bis 125 mg/l, liegen. Der Fachmann auf dem Gebiet der Transformation wird erkennen, dass die Konzentration an Antibiotikum für ein besonderes Transformationsprotokoll ohne unnötiges Experimentieren optimiert werden kann.
Die Ruhephasenkulturen werden vorzugsweise im Dunklen bei 28°C für etwa 1 bis etwa 15 Tage, vorzugsweise für etwa 3 bis etwa 10 Tage, bevorzugter für etwa 5 bis etwa 8 Tage, ruhen gelassen. Für den Ruheschritt kann ein beliebiges der Medien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden.
Nach dem Co-Kultivierungsschritt oder nach dem Ruheschritt, wenn dieser verwendet wird, werden transformierte Zellen/Gewebe durchgemustert, um solche Zellen/Gewebe zu selektieren, die T-DNA-Regionen aufgenommen und eingebaut haben, welche die heteolngen Nucleotidsequenzen von Interesse umfassen, die unabhängig durch den gentechnisch veränderten Agrobacterium-Stamm eingeführt wurden. Transformierte Zellen/Gewebe werden auf ein Medium übertragen, das ein Antibiotikum enthält, um das Wachstum des Agrobacteriums zu hemmen. Wenn ein "plant selectable" Marker als ein "scorable" Markergen dient, wird das Medium auch ein Selektionsmittel enthalten, das für das "plant selectable" Markergen spezifisch ist. Wenn das "scorable" Markergen ein analysierbares Reportergen ist, werden dann die Zellen/Gewebe, die auf diesem Agrobacterium-hemmenden Medium gewachsen sind, auf Aktivität des Reportergens untersucht. Auf diese Weise werden das Mittel oder die Assays, die zum Screening von Transformanten eingesetzt werden, auf transformierte Zellen selektieren, die T-DNA-Inserts und ihre entsprechenden Nucleotidsequenzen von Interesse enthalten, welche wenigstens das entsprechende "scorable" Markergen oder die entsprechenden "scorable" Markergene umfassen und die während der Transformation durch das Agrobacterium abgegeben wurden.
Im Allgemeinen kann ein beliebiges der Medien, die auf dem Fachgebiet als für die Kultur der Pflanze von Interesse geeignet bekannt sind, im Screeningschritt verwendet werden. Während des Screenings werden die transformierten Zellen/Gewebe kultiviert, bis eine Kallus- und/oder Schössling-Bildung beobachtet wird, was von dem Materialtyp abhängt, der einer Transformation unterliegt. Die Kalli und/oder Schösslinge werden dann auf einem geeigneten Medium in einem Licht/Dunkel-Zyklus kultiviert, bis sich Schösslinge und/oder Wurzeln entwickeln. Verfahren zur Pflanzenregeneration sind im Fachgebiet bekannt und bevorzugte Verfah ren werden von Kamo et al. (1985) Bot. Gaz 146(3):327-334, West et al. (1993) The Plant Cell 5:1361-1369, und Duncan et al. (1985) Planta 165:322-332 bereitgestellt.
Kleine Pflänzchen werden dann in Röhrchen, die Bewurzelungsmedium enthalten, transferiert und für etwa eine weitere Woche wachsen und mehr Wurzeln entwickeln gelassen. Die Pflanzen werden dann in eine Erdmischung in Töpfen im Gewächshaus umgepflanzt. Alternativ kann in vitro-gewachsener Wurzelstamm zum Pfropfen der Pflänzchen und zur Gewinnung von transgenen Schösslingen verwendet werden.
Weitere Modifikationen, die verwendet werden können, umfassen Bereitstellung eines zweiten Infektionsschritts zur Verstärkung einer Infektion durch das Agrobacterium. Es können auch die Vektoren und Verfahren der Erfindung in Kombination mit einem Partikelbeschuss zur Erzeugung transformierter Pflanzen verwendet werden. Partikelbeschuss kann eingesetzt werden, um die Verwundung in den Geweben, die durch Agrobacterium zu transformieren sind, zu erhöhen (Bidney et al. (1990) Plant Mol. Biol. 18:301-313, EP 0 486 233 . Verfahren zum Partikelbeschuss sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,879,918; Tomes et al., US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,879,918; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,886,244; Bidney et al., US-Patent Nr. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojective Bombardment", in Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Herausg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740; Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (Mais), Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; und Hooydaas-Van Slogteren und Hooykaas (1984) Nature (London) 311:763-764; und Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5354-5349.
Nach Verwundung der Zellen durch Mikroprojektilbeschuss werden die Zellen mit Agrobacterium-Lösung inokuliert. Der zusätzliche Infektionsschritt und der Partikelbeschuss können bei der Verstärkung der Transformationseffizienz in solchen Pflanzen, die sich gegen eine Infektion durch Agrobacterium besonders sträuben, nützlich sein.
Transgene Pflanzen, die stabil integrierte T-DNA-Regionen haben, welche heterologe Nucleotidsequenzen enthalten, die andere codierende Sequenzen von Interesse als ein "plant scorable" Markergen oder zusätzlich zu einem "plant scorable" Markergen umfassen, werden unter Verwendung von Assays identifiziert, die für die codierende Sequenz von Interesse spezifisch sind. Wenn z.B. eines der binären Vektorplasmide in einer Expressionskassette getragen wird, die ein Pathogenresistenzgen innerhalb einer T-DNA-Region umfasst, könnte das Vorliegen der transferierten T-DNA in der regenerierten Pflanze durch Überwachen der Pathogenresistenz in der regenerierten Pflanze bestimmt werden.
Die Tatsache, dass jede T-DNA-Region, die heterologe Nucleotidsequenzen von Interesse umfasst, in das Pflanzengenom in einer nicht-verknüpften Weise integriert wird, hat Auswirkungen für nachfolgende sexuell produzierte Generationen der ursprünglichen transformierten Pflanzen. So kann die sexuell produzierte Nachkommenschaft der Anfangstransformanten nur Untergruppen der ursprünglich transferierten und integrierten T-DNA-Regionen zurückbehalten. Auf diese Weise kann eine Nachkommenschaft, die nur nicht-selektierbare codierende Sequenzen von Interesse und somit einen Verlust an selektierbaren Markergenen hat, durch nachfolgende Züchtungspraktiken erhalten werden. Dies ist günstig, wenn das selektierbare Markergen, das für eine Anfangsselektion von transformierten Pflanzen erwünscht ist, in der Nachkommenschaft dieser transformierten Pflanzen unerwünscht ist.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zur Erläuterung und keineswegs zur Beschränkung angeführt.
EXPERIMENTELLES
Beispiel 1: Konstruktion von binären Plasmiden
Plasmid pPHP9755 (1) ist ein binäres Agrobacterium-Plasmid, das den superMAS-Promotor ((ocs)₃mas aus Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676), der die Expression des Weizen-Oxalatoxidase-Gens (auch bekannt als Germin) steuert (Lane et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:10461-10469), mit dem Kartoffel-Proteinase-Inhibitor II (PINII)-Terminator (An et al. (1989) Plant Cell I:115-122) enthält. Die superMAS::Oxalatoxidase::pinII-Kassette wurde zuerst in einer pUC-Plasmid-Hauptkette zusammengebaut, indem eine NcoI-Stelle, die das 3'-Ende des superMAS-Promotors flankiert, an die NcoI-Überlappung des Startcodons der Oxalatoxidase ligiert wurde. Der PINII-Terminator wurde mit den stumpfen Enden 21 Basen stromabwärts des Stopcodons der Oxalatoxidase ligiert. Eine pBIN19-Plasmidhauptkette (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8721), bei der die Expressionssequenzen zwischen den T-DNA-Rändern entfernt waren, wurde zur Insertion der superMAS::Oxalatoxidase::PINII-Kassette verwendet. Die Kassette wurde mit dem superMAS-Promotor proximal zu der linken T-DNA-Grenze bzw. -Border orientiert. Der abschließende Konstruktionsschritt ist schematisch in 2 dargestellt.
Plasmid pPHP762 (3) ist ein binäres Agrobacterium-Plasmid, das den CaMV35S-Enhancer und Promotorregionen (Kay et al. (1987) Science 236:1299-1302), gefolgt von dem NPTII-Gen und der Kartoffelproteinaseinhibitor II (PIN II)-Terminatorregion (An et al. (1989) Plant Cell I:115-122) zwischen den rechten und linken T-DNA-Rändern enthält. Das NPTII-Genkonstrukt war für eine konstitutive Expression von NPTII in Pflanzen konzipiert.
Ein anderes binäres Agrobacterium-Plasmid wurde verwendet, um pPHP762 herzustellen. Dieses eine war ein Derivat von pGA473, das nahezu identisch mit pGA472 ist, welches in An et al. (1985) EMBO J. 4:277-284 veröffentlicht ist, außer dass ein CAT-Genmarker in der T-DNA-Region angeordnet war, um pGA473 herzustellen. Pioneer-Plasmid pPHP84 wurde hergestellt, indem zuerst die Gene aus der T-DNA-Region von pGA473 entfernt wurden und dann Restriktionsstellen addiert wurden, um eine Konstruktsynthese zu erleichtern. Eine Kombination von durch EcoRI-linearisiertem pPHP227 und mit EcoRI partiell verdautem pPHP84 resultierte in pPHP762. Dies platzierte das vollständige pPHP227-Plasmid, das sowohl das in Pflanzen exprimierbare NPTII-Gen als auch Ampicillinresistenzmarker enthielt, zwischen die T-DNA-Ränder von pPHP84. Das NPTII-Gen von pPHP227 wird konstitutiv über einen CaMV 355-Enhancer und eine Promotorregion und die PIN II-Terminierungsregion konstitutiv in Pflanzen exprimiert. Plasmid pPHP762 wurde für Co-Transformationsexperimente verwendet, da es sowohl das Pflanzen-selektierbare NPTII-Gen als auch das bakterielle Ampicillinresistenzgen bereit stellt, um für eine differenzielle Selektion von bakteriellen Isolaten, die sowohl es als auch den oben beschriebenen pBIN19-Vektor enthalten. Der abschließende Konstruktionsschritt ist in 4 schematisch gezeigt.
Beispiel 2: Agrobacterium-Transformation
Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 (beschrieben in Hood et al. (1993) Transgen. Res. 2:208-218) wurde mit dem Kanamycin-Resistenz-binären Vektor pPHP9755 (in Beispiel 1 beschrieben) unter Verwendung des Gefrier-Tau-Verfahrens von Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genetics 1:181-187 transformiert. Transformierte, Kanamycin-resistente Isolate wurden auf verfestigtem 60A-Medium mit 50 mg/l Kanamycin (YEP-Medium, 50 mg/l Kanamycin) selektiert. Bakterielle Isolate wurden durch Ausstreichen gereinigt, indem frische Platten aus selektivem YEP-Medium inokuliert wurden. Einzelne Kolonien wurden in flüssige Schüttelkulturen desselben Mediums pickiert, zu einer OD600 von 1,0 wachsen gelassen und zur Herstellung von gefrorenen Glycerol-Stocks verwendet, die bei –80°C gelagert wurden. Diese Stocks können verwendet werden, um Agrobacterium-Kulturen wieder zu initiieren. Flüssige Schüttelkulturen wurden aus Glycerol-Stocks initiiert und zur binären Plasmidisolierung verwendet (Qiagen Inc., Chatsworth, Kalifornien). Aus Agrobacterium isoliertes Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen verdaut und mit verdauten Quellen-Plasmidpräparationen verglichen, um zu beweisen, dass Fragmente durch das Transformationsverfahren in der Größe nicht verändert waren.
Der Agrobacterium-Stamm EHA105/pPHP9755 wurde anschließend mit dem Carbenicillin/Ampicillin-resistenten binären Vektor pPHP762 (in Beispiel 1 beschrieben) unter Verwendung des obigen Verfahrens tranformiert und auf 34Z-Medium (LB-Medium, 100 mg/l Carbenicillin) plattiert. Carbenicillin-resistente Kolonien wurden auf festen YEP-Platten, die 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Ampicillin enthielten, ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden aus diesen Platten herausgenommen und in 3 ml Flüssigschüttelkulturen mit Kanamycin und Carbenicillin inokuliert. Das Wachstum in diesem Medium war im Vergleich zu einzelnen binären Stämmen, die auf einem einzelnen Antibiotikum gewachsen waren, langsam. Plasmid wurde aus vermeintlichen doppelt-binären Stämmen isoliert, um das Vorliegen von beiden Plasmiden durch Gelelektrophorese von durch Restriktion verdauten Proben im Vergleich zu Kontrollen der ursprünglichen Quelle zu beweisen. Der neue Stamm EHA105/pPHP9755/pPHP762 wurde zur Sonnenblumentransformation verwendet.
Beispiel 3: Sonnenblumentransformation
Eine Sonnenblumentranformation wurde durch ein Protokoll erreicht, das eine Kombination von Partikelbeschuss, gefolgt von einer Agrobacterium-Inokulation zur DNA-Abgabe, wie bei Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313 beschrieben, umfasste. Der Agrobacterium-Stamm mit zwei binären Vektoren, der verwendet wurde, EHA105/pPHP9755/pPHP762, ist in Beispiel 2 beschrieben. Die Sonnenblumenlinie SMF3, beschrieben bei Burrus et al. (1991) Plant Cell Rep. 10:161-166, wurde bei dieser Transformation verwendet. Die Explantatquelle waren trockener Sonnenblumensamen, der gequollen wurde und in Explantate mit gespaltener Embryoachse geschnitten wurde, wie es in Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Sci. 103:199-207 beschrieben ist. Verfahren zur Herstellung und Behandlung der Explantate sind genau wie bei Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Sci. 103:199-207 beschrieben, außer dass für den Partikelbeschuss eine Dupont PDS-1000-Helium-angetriebene Partikelvorrichtung verwendet wurde. Explantate wurden mit einem kleinen Stück sterilem 150 μm Nytex-Netz bedeckt, dann zweimal mit 1,8 μm-Wolframpartikeln in dieser Vorrichtung auf der höchsten Stufe mit 600 psi-Berstscheiben und einem Vakuumdruck von 26 in. Quecksilber beschossen.
Das Transformationsverfahren mit dem Explantat mit gespaltener Embryoachse wurde durch Schälen und Oberflächensterilisieren von Sonnenblumensamen, Quellen in sterilem destilliertem Wasser für 1 bis 2 h, dann Sezieren des Samens zu Explantaten für einen Partikelbeschuss und zur Agrobacterium-Behandlung durchgeführt. Agrobacterium-Kulturen wurden in der Nacht vor der Verwendung begonnen und zu einer OD600 von 0,5 bis 1,0, üblicherweise aber näher an 1,0, wachsen gelassen. Die Bakteriensuspension wurde zentrifugiert und zu einer endgültigen errechneten OD600 von 0,6 in Inokulationsmedium resuspendiert. Partikelbeschus sexplantate wurden für 0,5 h in den resuspendierten Bakterien eingetaucht, dann für einen 3-d-Co-Kultivierungszeitraum auf Medium, das keine Antibiotika enthielt, plattiert (Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Sci. 103:199-207). Diese Platten wurden bei 26°C für 3 d in Licht kultiviert. Behandelte Explantate wurden dann auf ein Medium, das keine Antibiotika enthielt, transferiert, um gegen Agrobacterium und positiv für transformiertes Pflanzengewebe zu selektieren.
Beispiel 4: Gewinnung von Segreganten
Um eine Erhöhung der Möglichkeit, die Segregation der Oxalatoxidase- und NPTII-Gene zu detektieren, wurde eine Fremdbestäubung unter Verwendung der T0-Pflanze als Pollenquelle für männlich-sterile (CMS)-Sonnenblumenlinien und durch Verwendung nichttransformierter SMF3 als Pollenquelle für die T0-Pflanzen durchgeführt. Für die Dauer des Blühens wurden täglich Pollen von der T0-Pflanze geerntet. Die Ernte erfolgte nachdem die Stigmas aus den Antherröhren ausgetreten waren, aber vor der Stigmarezeptivität. Nach der Pollensammlung wurden die Blüten mit einem Wasser gefüllten Benebelungsgerät besprüht, um die verbleibenden Pollen inaktiv zu machen. Mehrere Stunden später wurden die getrockneten Blüten mit nicht-transformierten SMF3-Pollen bestäubt. Die CMS-Sonnenblumenlinien wurden direkt ohne Verwendung zusätzlicher Verfahren bestäubt.
T1-Samen wurde aus reifen, getrockneten, T0-transformierten Pflanzen und gekreuzten CMS-Linien geerntet. Die Samen wurden geschält, oberflächensterilisiert (20 %ige Bleichlösung, die zwei Tropfen Tween 20 enthielt, 20 min) und in sterile Petrischalen gegeben, die sterile mit Wasser befeuchtete Filterscheiben enthielten. Keimlingskotyledon und/oder Blattgewebe wurden für die NPTII- und Oxalatoxidase-Enzym-Analysen gesammelt. Individuen, die nur eine Aktivität zeigten, wurden zur Southern-Analyse und zum Samenansatz gehalten.
Beispiel 5: Enzymassay
sOxalatoxidase-Enzym-Assays wurden unter Verwendung von frischem Blatt- oder Kotyledonen-Gewebe zur Identifizierung von Transformanten durchgeführt. Das Assayverfahren erfolgte nach dem Protokoll von Suigura et al. (19979) Chem. Pharm. Bull. 27(9):2003-2007. Der Assay ist eine Zweistufenreaktion, in der Wasserstoffperoxid durch Oxalatoxidase in der ersten Stufen erzeugt wird, dann quantitativ durch eine Peroxidase-verknüpfte Farbreaktion in der zweiten Stufe detektiert wird. Die Farbreaktion wird dann durch ein Spektralphotometer unter Verwendung von sichtbarem Licht mit 550 nm gemessen.
Die erste Stufe des Assays wird durch Vermahlen von Gewebe in 0,1 M Succinatpulver, pH 3,5, initiiert. Die Extrakte wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden verworfen. Das Pellet wurde in 0,1 M Succinatpuffer, pH 3,5, und 0,05 ml einer Oxalsäurelösung, bestehend aus 10 mM Oxalsäure, gelöst in 0,1 M Succinatpuffer, pH 3,5, suspendiert. Die Oxalatoxidase-Enzymreaktion lief unter milder Bewegung bei Raumtemperatur (25°C) für 4 h ab. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Reaktionen zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands entfernt und zu einem Volumen von 1 M Tris, nicht im pH eingestellt, gegeben, um die Proben auf einen End-pH von 7,0 (Tris zu 0,147 M) für die zweite Reaktionsstufe des Assays einzustellen. Es erfolgte eine Farbentwicklung, indem die folgenden Komponenten in 0,2 M Tris HCl, pH 7,0, in einem solchen Gemisch zugegeben wurden, dass die angegebenen Endkonzentrationen erreicht wurden: Meerrettichperoxidase (20 μ/ml), 4-Aminoantipyrin (0,165 mM) und N,N-Dimethylanilin (0,33 mM). Die Extinktion bei 500 nm wurde für Proben der Farbentwicklungsreaktion abgelesen. Diese Werte konnten mit einer Wasserstoffperoxidkurve zur Quantifizierung der Oxalatoxidase-Enzymaktivität verglichen werden.
Die Resultate dieser Oxalatoxidase-Enzymassays sind in Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
Zusammenfassung der Proteinanalyseresultate von transgenen T0- und T1-Sonnenblumenpflanzen.
ELISA-Analyse wurde zur Detektion von NPTII-Protein verwendet und Oxalatoxidase-Enzymassay wurde zur Bestätigung des Vorliegens jenes Proteins verwendet.

* oxox – Oxalatoxidase, #na – nicht anwendbar
1. T1-Genetik bezieht sich auf Samen, der durch Kreuzen von transgenen T0-Sonnenblumen mit nicht-transgener Sonnenblume derselben Varietät oder aus Kreuzungen, die mit männlich sterilen Sonnenblumenlinien VK820F oder VK70F unter Verwendung von Transgenen als Pollenquelle durchgeführt wurden, erhalten wurden.
2. Summe bzw. Gesamtzahl stellt einzelne Pflanzen dar, die sowohl auf Oxalatoxidase-Enzymaktivität als auch auf NPTII-Protein durch NPTII ELISA analysiert wurden. oxox sind solche, die nur für Oxalatoxidase positiv sind, oxox + NPTII sind solche, die für beide Proteine positiv sind, und NPTII sind solche Individuen, bei denen nur NPTII detektiert wurde.

Beispiel 6: ELISA
NPTII ELISA-Assays wurden mit Proben aus frischen Blättern und Kotyledon laufen gelassen, die identisch mit denen waren, die für den Oxalatoxidase-Enzymassay verwendet wurden. Das Vorliegen des NPTII-Enzyms wurde durch ein Doppel-Sandwich-ELISA-Verfahren bestimmt. Gewebeextrakte wurden unter Verwendung eines Immunoassays analysiert, der für NPTII spezifische Antikörper enthält. Quantitative Werte des Enzyms in den Gewebeproben wurden durch Interpolation aus einer Standardkurve von gereinigtem NPTII-Protein bestimmt. Resultate dieser Assays sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 7: Southern-Analyse
Blattproben wurden entsprechend PHIAN-SP-0010/01 lyophilisiert. Das gefriergetrocknete Material wurde gemäß PHIAN-SP-0015/01 pulverisiert. Genomische DNA wurde aus dem pulverisierten Blattmaterial unter Verwendung eines CTAB-Extraktionspuffers gemäß PHIAN-SP-0001/01 extrahiert. Gereinigte DNA wurde fluorometrisch quantitativ bestimmt, wie es in PHIAN-SP-0016/01 beschrieben ist. Isolierte DNA wurde gemäß PHIAN-SP-0005/01 unter Verwendung der in Tabelle 2 angegebenen Restriktionsenzyme verdaut.
Die verdaute DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und entsprechend PHIAN-SP-0007/01 und PHIAN0012/01 auf Nylonmembran transferiert. Die DNA wurde anschließend durch UV-Bestrahlung immobilisiert, wie es in PHIAN-SP-0012/01 beschrieben ist. DNA-Sonden, die für das Oxalatoxidasegen (a.k.a. Germin) oder die für das NPTII-Gen codierenden Regionen wurden mit 32P durch das statistische Priming-Verfahren gemäß PHIAN-SP-0009/01 markiert. Die markierten Sonden wurden an die DNA, die an der Nylonmembran immobilisiert war, gemäß PHIAN-SP-0008/01 hybridisiert. Radioaktive DNA, die verbunden mit der Membran nach stringenten Waschgängen zurückblieb, wurde unter Verwendung eines Molecular Dynamics Storm Phosphor Imaging System sichtbar gemacht. Die Bilder wurden elektronisch eingefangen, wobei Molecular Dynamics ImageQuant-Software verwendet wurde. Eine Zusammenfassung der Resultate ist in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 2 Experimentelles Konzept zur Southern-Analyse
TABELLE 3 Zusammenfassung der Southern-Analyse-Resultate aus Pflanzen, die oben gewonnen worden waren, die entweder Oxalatoxidase, NPTII oder beides aufwiesen T0/gekreuzt

1. Proteinanalyse ist dieselbe wie die, die in Tabelle 1 oben präsentiert wurde. Sie wird mit der Southern-Analyse zum direkten Vergleich präsentiert.
2. Die Summe stellt die Gesamtzahl von Pflanzen dar, die durch Southern-Analyse analysiert wurden. Jede Pflanze wurde mit einer DNA-Sonde für das Oxalatoxidasegen und für das NPTII-Gen hybridisiert. Oxox – die Anzahl der T1-Nachkommenschaft – die nur Oxalatoxidase hatte; oxox + NPTII – die Anzahl von T1-Pflanzen, deren DNA sowohl an Oxalatoxidase- als auch an NPTII-Hybridisierungssonden hybridisierte; und NPTII – solche Individuen, die nur an die NPTII-Sonde hybridisierten.

Claims

Agrobacterium-Stamm, umfassend ein Helferplasmid und wenigstens zwei binäre Vektorplasmide, wobei jedes der binären Vektorplasmide wenigstens eine T-DNA-Region umfasst, die eine heterologe Nukleotidsequenz von Interesse umfasst.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 1, wobei jedes der binären Vektorplasmide ein einzelnes selektierbares Markergen umfasst.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 2, wobei das einzelne selektierbare Markergen ein bakterielles selektierbares Markergen ist.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 3, wobei wenigstens eines der binären Vektorplasmide ein „plant scorable" Markergen umfasst.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 4, wobei das „plant scorable" Markergen ein selektierbares Pflanzenmarkergen ist, das Resistenz gegenüber einem einzelnen Selektionsmittel verleiht.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 4, wobei das „plant scorable" Markergen ein „assayable" Reportergen ist.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 1, worin jedes der binären Vektorplasmide einen Replikationsursprung hat, der aus der Gruppe, bestehend aus RK2 oriV, pSA oriV und pVS1ori, ausgewählt ist.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 7, worin der Replikationsursprung RK2 oriV ist.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 8, worin die binären Vektorplasmide pPHP9799 und pPHP762 sind.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 9, wobei der Stamm ein Agrobacterium tumefaciens-Stamm ist.
Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 10, wobei der Stamm Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 oder EHA105 ist.
Verfahren zur Co-Transformation einer Pflanze mit wenigstens zwei einzigartigen heterologen Nukleotidsequenzen von Interesse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) In Kontakt bringen eines Gewebes aus der Pflanze mit einem Agrobacterium-Stamm, der ein Helferplasmid und wenigstens zwei binäre Vektorplasmide umfasst, wobei jeder der binären Vektorplasmide wenigstens eine T-DNA-Region umfasst, wobei jede der T-DNA-Regionen eine der einzigartigen Nukleotidsequenzen umfasst, wobei wenigstens eine der Nukleotidsequenzen wenigstens eine Expressionskassette umfasst, welche ein „plant scorable" Markergen umfasst; b) Co-Kultivieren des Gewebes mit dem Agrobacterium; c) Kultivieren des Gewebes in einem Kulturmedium, das ein Antibiotikum umfasst, das das Wachstum von Agrobacterium inhibieren kann; d) Durchmustern des Gewebes auf Expression des „plant scorable" Markergens und e) Regenerieren einer transformierten Pflanze aus Gewebe, das das „plant scorable" Markergen exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das „plant scorable" Markergen ein selektierbares Pflanzenmarkergen ist, das Resistenz gegenüber einem einzelnen Selektionsmittel verleiht, wobei auf Expression des selektierbaren Pflanzenmarkergens durchgemustert wird, indem ein einzelnes Selektionsmittel in das Kulturmedium eingeschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das „plant scorable" Markergen ein „assayable" Reportergen ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Dikotyle Sonnenblume ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Monokotyle Mais ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die binären Vektorplasmide einen Replikationsursprung haben, der aus der Gruppe, bestehend aus RK2 oriV, pSA oriV, und pVS1ori ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Replikationsursprung RK2 oriV ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die binären Vektorplasmide pPHP9755 und pPHP762 sind.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Stamm ein Agrobacterium tumefaciens-Stamm ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Stamm Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 oder EHA105 ist.