DE69632576T2

DE69632576T2 - Binärer bac-vektor

Info

Publication number: DE69632576T2
Application number: DE69632576T
Authority: DE
Inventors: M. Carol HAMILTON
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2016-01-12
Also published as: EP0805851A4; US5977439A; ATE267871T1; DE69632576D1; EP0805851A1; US5733744A; WO1996021725A1; JPH11500306A; EP0805851B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor zur Pflanzentransformation und insbesondere einen binären BAC-Vektor und Verwendungsmöglichkeiten des Vektors.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Hauptproblem, dem sich Pflanzenmolekularbiologen und Pflanzenzüchter heute gegenüber sehen, besteht darin, wie landwirtschaftlich wichtige Gene, die nur durch ihren Phänotyp bekannt sind, zu identifizieren sind. Obwohl positionelles Klonieren und Transposon-Tagging die Identifizierung von Pflanzengenomklonen durch Beobachten eines Phänotyps ermöglichten, ist es ein technisch schwieriges und arbeitsintensives Verfahren. Bisher wurden nur einige wenige größere Pflanzengene dieses Typs kloniert (Martin et al, 1993, Bent et al, 1994, Jones et al, 1994, Whitham et al, 1994).
Pflanzenzüchter bauten immer auf die genetische Variation für klassische Zuchtprogramme. Um möglichst effektiv zu sein, müssen moderne Pflanzenzüchter die Molekularbiologie von Genen, die für die Landwirtschaft wichtig sind, kennen. Wenn die für ein gewünschtes Merkmal codierenden Gene kloniert wurden, ist es nun in einigen Fällen möglich, klassische Zuchttechniken zu umgehen und dieses Merkmal durch Pflanzentransformation direkt einzuführen. In Zukunft kann es sogar möglich sein, gewünschte Merkmale aus Spezies, die nicht kreuzkompatibel sind, einzuführen, eine Sache, die durch klassische Pflanzenzucht nicht erreicht werden kann. Die Klonierung von landwirtschaftlich wichtigen Genen eröffnet auch neue Forschungsbereiche in der Pflanzenbiolo gie.
Als die Idee einer positionellen Kartierung zum ersten Mal aufkam, wurde Chromosome Walking zur Verknüpfung überlappender Genomklone in der interessierenden Region als Notwendigkeit angesehen. Bei Feldfruchtpflanzen besteht die Tendenz, dass sie relativ große Genome und hohe Mengen repetitiver DNA besitzen, Merkmale, die Chromosome Walking langwieriger und komplizierter machen. Glücklicherweise führte die jüngste Entwicklung von Verfahren, die die Identifizierung von eng mit einem Gen verknüpften Molekülmarkern ermöglichen, zum Konzept des Chromosome Landing.
Chromosome Landing beruht auf der Tatsache, dass es nicht mehr so schwierig ist, Marker, die eng mit einem interessierenden Gen verbunden sind, auch in einem Gen, das nicht gut charakterisiert ist, zu erhalten. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)- und AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)-Verfahren können in Kombination mit der Analyse naher isogener Linien oder massiger abgetrennter Elemente zur Identifizierung von Molekülmarkern, die sich sehr nahe an einem interessierenden Gen befinden, verwendet werden (Williams et al, 1990, Zabeau und Vos, 1992, Martin et al, 1991, Michelmore et al, 1991). Eine Genombibliothek kann dann unter Verwendung von Markern, die das Gen flankieren, zur Identifizierung potentieller Klone durchmustert werden.
Derzeit besteht die bedeutendste Hürde, die zur Verwendung von positioneller Klonierung in breitem Maßstab verbleibt, darin, wie zu verifizieren ist, dass ein potentieller Klon tatsächlich das interessierende Gen trägt. Bisher bestand der Ansatz darin, eine Reihe von Subklonen eines Yeast Artificial Chromosome (YAC) (Burke et al, 1987) oder eines Bacterial Artificial Chromosome (BAC), von denen angenommen wurde, dass sie ein interessierendes Gen enthalten, zu erzeugen. Jeder dieser Subklone muss dann individuell in Pflanzen transformiert werden, um das Vorhandensein (oder Nichtvorhandensein) des Gens durch Testen transgener Pflanzen auf den erwarteten Phänotyp zu identifizieren. Dies ist nicht nur sehr zeitaufwendig, sondern auch ein risikobehaftetes Projekt, da ein gegebener Subklon nur einen Teil des Zielgens enthalten kann und daher ein negatives Ergebnis der Transformations/Komplementierungsexperimente ergeben kann. Wenn das Zielgen eine große Zahl von Introns und daher Strecken über ein großes Segment genomischer DNA enthält, ist dann keiner der Subklone ausreichend groß, um das gesamte Gen zu enthalten.
Was am stärksten benötigt wird, ist eine Technologie, die dieses Hindernis der Genverifizierung umgehen kann. Die Möglichkeit zur Übertragung großer DNA-Konstrukte auf Pflanzen würde die erforderliche Subklonierungsmenge von einem YAC- oder BAC-Bibliothek-Vektor mit hohem Molekulargewicht vor dem Fortschreiten zur Pflanzentransformation verringern. Ein Vektor einer Bibliothek mit hohem Molekulargewicht, der zur direkten Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, wäre ideal. Tatsächlich ist die Entwicklung einer Technologie zur Transformation von Pflanzen mit DNA von hohem Molekulargewicht für die Klonierung von QTLs (Quantitative Trait Loci), die den Hauptteil von landwirtschaftlich wichtigen Genen ausmachen, entscheidend.
Keine der existierenden Vektoren für Genombibliotheken mit hohem Molekulargewicht sind zur Pflanzentransformation geeignet. Eine Reihe von Cosmid-Bibliotheksvektoren (maximale Insertgröße 46 kb), die zur Agrobacterium-vermittelten Pflanzentransformation geeignet sind, wurden von Ma et al (1992) konstruiert. Die geringe Insertgröße macht sie jedoch für Genome, die viel größer als Arabidopsis sind, we niger geeignet. Während Arabidopsis ein attraktives Modellsystem ist, da dessen Genomgröße klein ist, etwa 100 Megabasenpaare (Mbp) beträgt, besitzen andere höhere Pflanzen 4-20fach größere Genome (Bennet und Smith, 1976). Die ersten Pflanzengenombibliotheken mit höherem Molekulargewicht wurden in YAC-Vektoren konstruiert. Das Pto-Krankheit-Resistenzgen von Tomaten (Martin et al, 1992) und das RPS2-Krankeit-Resistenzgen von Arabidopsis (Bent et al, 1994) wurden ausgehend von YAC-Bibliotheken kloniert. Jedoch ist eine YAC-Bibliothek eine größere Investition im Hinblick auf Konstruktion, Aufrechterhaltung und Verwendung, und einige YAC-Bibliotheken wurden von Deletionen, Umlagerungen und Chimären heimgesucht (Anderson, 1993).
Vor kurzem wurden BAC-Bibliotheken für Sorghum (Woo et al, 1994) und für Reis (Whang und Ronald, 1994) mit durchschnittlichen Insertgrößen von etwa 180 kb konstruiert. Es zeigte sich, dass BAC-Bibliotheken leichter als YAC-Bibliotheken zu konstruieren, zu durchmustern und aufrechtzuerhalten sind.
Agrobacterium tumefaciens ist ein natürlich vorkommendes Pflanzentransformationssystem (siehe allgemein die Übersicht bei Kado, 1991; und Zambryski, 1988). Vor kurzem zeigten Miranda et al, dass mindestens 170 kb von dem Ti-Plasmid von Agrobacterium auf ein Pflanzengenom übertragen werden konnten (Miranda et al, 1992). Weitere binäre Vektoren für eine Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation sind in McBride und Summerfelt (1990), Plant Molecular Biology, 14: 269–276, offenbart und diskutiert. Das sehr spannende Potential für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pflanzen mit Konstrukten mit hohem Molekulargewicht besteht darin, dass gezeigt wurde, dass A. tumefaciens dessen T-DNA auf das Pflanzengenom in linearer Weise überträgt. Es wäre ein riesiger Vorteil, wenn trans gene Pflanzen erzeugt werden könnten, die das gesamte Genombibliothekinsert (intakt) in dem Pflanzengenom tragen. Ein linearer Transfer würde die Möglichkeit gekürzter Gene, ausgenommen an den Grenzen der Inserts, beseitigen und die Einführung sehr großer Pflanzengene (wenn sie existieren) oder von Genclustern ermöglichen.
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation ist die am breitesten verwendete Technik zur Einführung neuer genetischer Information in Pflanzenzellen. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist routinemäßig in Arten wie Tabak, Petunia und Tomate verwendbar und beträchtliche Anstrengungen wurden in die Anwendung dieser Technik auf Hauptfeldfruchtarten (Übersicht bei van Wordragen und Dons, 1992) und Monokotylenarten gesteckt. Vor kurzem wurde über eine Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis berichtet (Hiei et al, 1994).
Jedoch besteht immer noch Bedarf an einem Vektor zur Transformation von Pflanzen mit DNA-Sequenzen mit hohem Molekulargewicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dieser Bedarf wird durch die Konstruktion eines neuen BAC-Bibliothek-Vektors, der zur Agrobacterium-vermittelten Pflanzentransformation gestaltet wurde, gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllt. Da jeder BIBAC-Bibliothek-Klon als Plasmid in Escherichia coli existiert, kann die DNA individueller Klone ohne weiteres durch Standardplasmidisolierungstechniken isoliert werden. Diese Plasmid-DNA kann dann in Agrobacterium durch Elektroporation eingeführt werden. Alternativ können BIBAC-Bibliothek-Klone von einem E. coli-Wirt auf Agrobacterium durch Triparental Mating übertragen werden.
Die Erfindung stellt einen Vektor zur Übertragung von heterologer DNA in eine Pflanzenzelle bereit. Der Vektor umfasst ein Gerüst mit einem ersten Replikationsstartpunkt mit der Fähigkeit, heterologe DNA als Einzelkopie in einer Escherichia coli-Wirtszelle zu halten, und einen zweiten Replikationsstartpunkt mit der Fähigkeit, heterologe DNA als Einzelkopie in einer Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle zu halten. Der Vektor umfass ferner eine singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle zur Insertion von heterologer DNA und linke und rechte Agrobacterium-T-DNA-Randsequenzen, die die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle flankieren. Die T-DNA-Randsequenzen ermöglichen die Einführung von heterologer DNA, die sich zwischen den linken und rechten T-DNA-Randsequenzen befindet, in eine Pflanzenzelle.
Der Vektor ermöglicht die Konstruktion von Pflanzengenombibliotheken mit großen DNA-Inserts. Individuelle Klone können durch Transformation direkt in Pflanzen eingeführt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen klar, wenn diese in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird, wobei.
1 die Karte des BIBAC-Vektors zeigt; und
2 die Strategie zur Konstruktion des BIBAC-Vektors zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Der Vektor der Bezeichnung BIBAC wurde als das Plasmid der Bezeichnung pCH23 in den Escherichia coli-Stamm der Bezeichnung DH10B(pCH23) gemäß den und in Erfüllung der Anforderungen des Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 69743 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor zur Übertragung heterologer DNA in eine Pflanzenzelle. Der Vektor umfasst ein Gerüst mit zwei Replikationsstartpunkten. Der erste Replikationsstartpunkt besitzt die Fähigkeit, die heterologe DNA als Einzelkopie in einer Escherichia coli-Wirtszelle zu halten. Wie dies durchgängig in dieser Anmeldung, falls nicht anders angegeben, verwendet wird, bezeichnet das Halten einer Einzelkopie eine nichtreplizierende Zelle, d. h. eine Zelle, die keine Zellteilung erfährt; während der Zellteilung erhöht sich die Kopienzahl pro Zelle auf nahezu zwei vollständige Kopien pro Zelle. Der zweite Replikationsstartpunkt besitzt die Fähigkeit, die heterologe DNA als Einzelkopie in einer Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle zu halten.
Der Vektor umfasst auch eine singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle zur Insertion heterologer DNA. Das Vorhandensein von nur einer Schnittstelle für eine spezielle Restriktionsendonuklease in der den Vektor codierenden DNA-Sequenz ist das Vorhandensein einer "singulären" Restriktionsendonukleaseschnittstelle. Die spezielle Restriktionsendonuklease schneidet die DNA daher nur an der einen Stelle oder "singulären Stelle". Heterologe DNA bezeichnet DNA, die in der speziellen Wirtszelle, die durch den Vektor transformiert wird, normalerweise nicht vorhanden ist.
Der Vektor umfasst auch linke und rechte Agrobacterium-T-DNA-Randsequenzen, die die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle flankieren (Peralta und Ream, 1985). Diese Randsequenzen ermöglichen die Einführung heterologer DNA, die zwischen den linken und rechten T-DNA-Randsequenzen lokalisiert ist, in eine Pflanzenzelle.
Das stabile Halten von DNA mit hohem Molekulargewicht in Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens wird ermöglicht, da diese DNA-Sequenzen mit hohem Molekulargewicht von einem Einzelkopie-Plasmid getragen werden. Mit Mehrfachkopien von derartigen großen DNA-Inserts wären die instabilen Wirtszellen zur Pflanzentransformation nicht verwendbar.
In einer Ausführungsform des Vektors der vorliegenden Erfindung, der als BIBAC-Vektor bezeichnet wird, ist die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle eine BamHI-Schnittstelle. Diese Schnittstelle befindet sich zwischen den Agrobacterium tumefaciens-T-DNA-Randsequenzen, wie auch ein Selektionsmarker für den Einbau heterologer DNA in den Vektor (das sacB-Gen). Die BamHI-Schnittstelle und das sacB-Gen sind so lokalisiert, dass, wenn heterologe DNA an der BamHI-Stelle insertiert wird, das sacB-Gen inaktiviert wird. Der BIBAC-Vektor umfasst den F-Replikationsstartpunkt von Escherichia coli zum Halten der heterologen DNA als Einzelkopie in Escherichia coli (Low, 1972) und den Ri-Replikationsstartpunkt von Agrobacterium rhizogenes zum Halten der heterologen DNA als Einzelkopie in Agrobacterium tumefaciens. Die linken und rechten T-DNR-Randsequenzen in dem BIBAC-Vektor sind von der TL-DNA des Octopineplasmids pTiA6 abgeleitet.
Der BIBAC-Vektor umfasst auch einen Selektionsmarker zur Einführung der heterologen DNA in die Bakterienzellen von Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens. Der Bakterienselektionsmarker umfasst das Kanamycinresistenzgen. Der BIBAC-Vektor umfasst auch einen Selektionsmarker zur Einführung der heterologen DNA in eine Pflanzenzelle. Dieser Selektionsmarker muss zwischen den linken und rechten T-DNA-Randsequenzen lokalisiert sein, da nur die von den Randsequenzen umfasste Region in die Pflanzenwirtszelle übertragen wird. Daher muss der Pflanzenselektionsmarker zur Übertragung in die Pflanzenzelle zwischen den T-DNA-Rändern liegen. In dem BIBAC-Vektor geht der Pflanzenselektionsmarker auf die Kanamycinresistenz (die durch das GUS-NPTII-Konstrukt bereitgestellt wird). Andere geeignete Pflanzenselektionsmarker umfassen Hygromycinresistenz (das HYG-Konstrukt) und Phosphinothricinresistenz (bereitgestellt durch das BAR-GUS-Konstrukt).
Der BIBAC-Vektor umfasst auch einen Konjugationstansferstartpunkt (der oriT-Startpunkt von Plasmid RK2). Dieser Startpunkt ermöglicht die Übertagung heterologer DNA von einer Escherichia coli-Wirtszelle direkt zu einer Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle durch bakterielle Konjugation.
Der Vektor wird zur Einführung von heterologer DNA in eine Wirtszelle verwendet. Daher umfasst der Vektor vorzugsweise heterologe DNA, die in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle insertiert wurde. DNA wird in den Vektor unter Verwendung von ohne weiteres einschlägig bekannten Standardklonierungsverfahren eingeführt. Dies umfasst allgemein die Verwendung von Restriktionsenzymen (im Falle von BIBAC BamHI) und DNA-Ligasen gemäß der Beschreibung bei Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York [1982]. Der Vektor kann zur Transformation einer Wirtszelle, wie Escherichia coli, Agrobacterium tume faciens, und/oder einer Pflanzenzelle verwendet werden.
Es gibt zahlreiche Verwendungsmöglichkeiten des Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung. Eine Verwendungsmöglichkeit ist die als Bibliothek-Klonierungsvektor. Genomische DNA von einer Pflanze kann mit einer Restriktionsendonuklease (BamHI im Falle des BIBAC-Vektors) geschnitten werden. Die Restriktionsfragmente, die gemeinsam das gesamte Genom der Pflanze darstellen, werden dann in einen BIBAC-Vektor (der durch Schneiden mit BamHI geöffnet wurde) ligiert. Dies erzeugt eine Bibliothek im BIBAC-Vektor. (Siehe allgemein: Current Protocols in Molecular Cloning, F. M. Ausubel et al, Hrsg., Greene Publishing und Wiley Interscience, New York (1989)).
Zum leichteren Arbeiten mit der Bibliothek wird der Vektor allgemein in einer Bakterienwirtszelle gehalten. Escherichia coli ist eine Standardbakterienwirtszelle zum Halten einer derartigen DNA-Bibliothek. Die Vektor-DNA kann in die Bakterienwirtszelle durch verschiedene einschlägig bekannte Verfahren eingeführt werden. Diese umfassen Elektroporation, Calciumchloridtransformation und Transformation durch Partikelbeschuss. Die transformierten Bakterienzellen können durch ihre Fähigkeit, auf verschiedenen selektiven Mitteln zu wachsen, identifiziert werden. Daher können Bakterienzellen, die den Vektor enthalten, durch deren Resistenz gegenüber Kanlamycin identifiziert werden. Das Vorhandensein von insertierter heterologer DNA wird durch die Fähigkeit der Bakterien, auf hohen Saccharosekonzentrationen zu wachsen, angezeigt. Die Fähigkeit, auf hohen Saccharosekonzentrationen zu wachsen, beruht auf der Inaktivierung eines weiteren Selektionsmarkers, des sacB-Gens. Potentielle Klone, die die gewünschte heterologe DNA enthalten, können durch Southern-Analyse (Southern, 1975) unter Verwendung von eng verbundenen Molekülmarkern oder heterologer DNA als Sonde identifiziert werden. Interessierende Klone (Vektoren, die heterologe DNA enthalten) werden dann für weitere Experimente verwendet.
Der Vektor oder ein abgeleiteter interessierender Klon (gemäß der obigen Beschreibung) können in Agrobacterium tumefaciens eingeführt werden. Diese Einführung kann unter Verwendung von Fachleuten bekannten Verfahren, die Elektroporation oder Teilchenbeschuss umfassen, durchgeführt werden. Ein weiteres Verfahren, das zur Einführung des Vektors in Agrobacterium tumefaciens verwendet werden kann, ist Triparental Mating. Bei Triparental Mating werden den Vektor enthaltende Escherichia coli, ein Helferplasmid enthaltende zweite Escherichia coli und ein Agrobacterium kombiniert, was zur Einführung der Vektor-DNA in das Agrobacterium führt. Die Agrobacterium-Zellen werden dann unter Verwendung eines Selektionsmarkers (beispielsweise Kanamycinresistenz im BIBAC-Vektor) auf das Vorhandensein der Vektor-DNA in diesen durchmustert. Die die Vektor-DNA enthaltenden Zellen werden dann für weitere Experimente verwendet.
Ein Vektor oder ein abgeleiteter interessierender Klon (gemäß der obigen Beschreibung) können auch in eine Pflanzenzelle eingeführt werden. (Siehe allgemein: Plant Molecular Biology Manual, 2. Auflage, S. B. Gelvin und R. A. Schilperoort, Hrsg., Kluver Academic Press, Dordrecht, Niederlande (1994)).
Ein Verfahren zur Einführung des Vektors oder Klons in eine Pflanzenzelle ist eine (stabile oder transiente) Agrobacterium-vermittelte Transformation der Pflanzenzelle. Kurz gesagt, wird das Gewebe von Pflanzen mit einem Inoculum des mit dem Vektor (mit heterologer DNA in diesem) transformierten Agrobacterium in Kontakt gebracht. Allgemein um fasst dieses Verfahren das Beimpfen des Pflanzengewebes mit einer Suspension der Bakterien und das Inkubieren des Gewebes auf Regenerationsmedium ohne Antibiotika bei 25–28°C während 48 bis 72 h.
In der Praxis kann das Verfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation ein dreistufiges Verfahren umfassen. Die Vektor-DNA wird zunächst in einer Escherichia coli-Wirtszelle analysiert und dann in eine Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle eingeführt, die dann zur Agrobacteriumvermittelten Übertragung der T-DNA in dem Vektor auf die Pflanzenzelle verwendet wird. Allgemein wird nur ein Teil der T-DNA-Randsequenzen und dazwischen lokalisierte DNA durch eine derartige Agrobacterium-vermittelte Übertragung in die Pflanzenzelle übertragen. Daher sollte eine etwaige heterologe DNA zur Übertragung in die Pflanzenzelle in dem Vektor zwischen den T-DNA-Randsequenzen lokalisiert sein.
Ein Standardverfahren zur T-DNA-Übertragung ist das binäre System. Der binäre Vektor enthält die T-DNA-Ränder, die für Ausschneiden und Integration benötigt werden, mit heterologer DNA, die zwischen den Rändern insertiert ist. Die entscheidenden vir-Gene des Ti-Plasmids besitzen trans-Wirkung und werden auf einem getrennten Plasmid, das als Helferplasmid bezeichnet wird, geliefert.
Die Blatt-Plattentechnik kann in Verbindung mit der Agrobacterium-vermittelten Transformation verwendet werden. Kurz gesagt, werden verletzte Pflanzenzellen (wie Blätter, Wurzeln und Stämme) kurz mit Agrobacterium-Zellen kultiviert, um die Übertragung der T-DNA von dem Agrobacterium zu der Pflanzenzelle zu initiieren. Nach mehreren Tagen wird das Pflanzengewebe auf sprossinduzierendes Medium, das ein selektives Mittel enthält, übertragen. Im Falle des BIBAC-Vektors, der den GUS-NPTII-Pflanzenselektionsmarker enthält, wird ein Kanamycin enthaltendes Medium verwendet. Nach der Bildung von Sprossen werden die Sprosse auf ein Medium übertragen, das die Wurzelbildung stimuliert.
Ein weiteres Verfahren zur Einführung des Vektors oder Klons in eine Pflanzenzelle erfolgt durch Transformation des Pflanzenzellkerns, beispielsweise durch Partikelbeschuss.
Ein weiteres Verfahren zur Einführung des Vektors oder Klons in eine Pflanzenzelle erfolgt durch Transformation von Pflanzenzellprotoplasten (stabil oder transient). Pflanzenprotoplasten werden nur von einer Plasmamembran umhüllt und nehmen daher Makromoleküle, wie heterologe DNA, auf. Diese technisch veränderten Protoplasten können die Fähigkeit besitzen, erneut ganze Pflanzen zu erzeugen. Geeignete Verfahren zur Einführung heterologer DNA in Pflanzenzellprotoplasten umfassen Elektroporation und PEG-Transformation.
Ein weiteres Verfahren zur Einführung des Vektors oder Klons in eine Pflanzenzelle erfolgt durch Transformation von Pflanzenorganellen (wie Chloroplasten oder Mitochondrien), beispielsweise durch Partikelbeschuss. Obwohl der Vektor sich in den Pflanzenorganellen nicht repliziert, kann die heterologe DNA in das Genom durch Rekombination eingebaut werden.
Die in dieser Anmeldung durchgängig verwendete Elektroporation ist ein Transformationsverfahren, bei dem allgemein eine hohe Konzentration von Vektor-DNA (die heterologe DNA enthält) zu einer Suspension von Wirtszellprotoplasten oder Bakterienzellen gegeben wird und das Gemisch mit einem elektrischen Feld von 200 bis 600 V/cm geschockt wird. Nach der Elektroporation werden transformierte Zellen durch Wachstum auf einem geeigneten Medium, das ein selektives Mittel enthält, identifiziert.
Der ebenfalls durchgängig in dieser Anmeldung verwendete Partikelbeschuss (auch als biolistische Transformation bekannt) der Wirtszelle kann auf eine von mehreren Wegen durchgeführt werden. Der erste umfasst das Schießen von inerten oder biologisch aktiven Partikeln auf Zellen. Diese Technik ist im US-Patent Nr. 4 945 050, 5 036 006 und 5 100 792, alle von Sandord et al, offenbart. Allgemein umfasst dieses Verfahren das Schießen von inerten oder biologisch aktiven Partikeln auf die Zellen unter Bedingungen, die das Durchdringen der äußeren Oberfläche der Zelle und den Einbau im Inneren derselben bewirken. Wenn inerte Partikel verwendet werden, kann der Vektor in die Zelle durch Beschichten der Partikel mit dem Vektor, der die heterologe DNA enthält, eingeführt werden. Alternativ kann die Zielzelle vom Vektor derart umgeben werden, dass der Vektor durch die Anregung des Partikels in die Zelle getragen wird. Biologisch aktive Partikel (beispielsweise getrocknete Bakterienzellen, die den Vektor und heterologe DNA enthalten) können ebenfalls in Pflanzenzellen geschossen werden.
Daher kann der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung zur Transformation einer Vielzahl von Wirtszellen auf eine Vielzahl von Wegen verwendet werden. Speziell kann heterologe DNA mit Codierung für das gewünschte Genprodukt in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle des BIBAC-Vektors insertiert werden. Der die heterologe DNA enthaltende Vektor wird zur Transformation von Escherichia coli und/oder zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens verwendet. Agrobacterium tumefaciens wird dann zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Einführung der heterologen DNA in die Pflanzenzelle ermöglicht die Produk tion des Genprodukts, das durch die heterologe DNA codiert wird, wenn die DNA in der Pflanzenzelle exprimiert wird.
Alternativ kann ein gewünschtes Genprodukt in einer Pflanzenzelle durch direktes Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem BIBAC-Vektor (mit heterologer DNA mit Codierung für das Genprodukt, die in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle insertiert ist), beispielsweise durch biolistische Transformation, produziert werden. Dieses Verfahren kann auch die heterologe DNA in die Pflanzenzelle einführen, was die Produktion des Genprodukts, das durch die heterologe DNA codiert wird, gestattet, wenn die DNA in der Pflanzenzelle exprimiert wird.
Bei Berücksichtigung derartiger Verfahren kann der Vektor zur Klonierung von Pflanzengenen durch deren Phänotyp verwendet werden. Beispielsweise wird bestimmt, dass eine bestimmte Pflanze gegenüber einem Virus empfindlich ist, und die Existenz eines Gens mit Codierung für Virusresistenz angenommen. Eine Genombibliothek wird in dem BIBAC-Vektor erzeugt, und der Vektor, der das DNA-Segment enthält, das potentiell das Virusresistenzgen codiert, wird zur Transformation der Pflanze verwendet. Die transformierte Pflanze wird dann dem Virus ausgesetzt. Das Fehlen phänotypischer Merkmale, die für eine Virusinfektion der Pflanze charakteristisch sind, zeigt an, dass das Virusresistenzgen durch das spezielle heterologe DNA-Insert in dem BIBAC-Vektor in die Pflanze übertragen wurde. Daher kann die das Virusresistenzgen codierende Sequenz unter Verwendung des BIBAC-Vektors zur Klonierung von Genen durch deren Phänotyp identifiziert werden.
Die durchgängig in dieser Anmeldung verwendete Transformation umfasst eine entweder transiente oder stabile Transformation. Bei transienter Transformation wird heterologe DNA in eine Wirtszelle eingeführt, ohne in die DNA der Wirtszelle eingebaut zu werden (Einbau ist eine stabile Transformation). Im Falle einer Pflanzentransformation kann DNA transient in die Pflanze eingeführt werden oder stabil eingeführt werden (d. h. in das Pflanzenkerngenom, Chloroplastengenom oder Mitochondriengenom eingebaut werden). Im Falle einer Agrobacterium-vermittelten Pflanzentransformation wird heterologe DNA transient in die Pflanzenzelle eingeführt oder stabil in das Kerngenom der Pflanze eingeführt (d. h, eingebaut). Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation baut heterologe DNA nicht stabil in das Chloroplasten- oder Mitochondriengenom ein. Die hier verwendete Transformation umfasst jede dieser Transformationsarten, die für eine spezielle Vektor/Wirt-Kombination verfügbar ist.
Beispiel 1
Konstruktion des BIBAC
Die Bibliotheksmerkmale des BIBAC basieren auf dem Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Klonierungssystem gemäß der Beschreibung bei Shizuya et al (1992). Ferner ist der Vektor ein binärer Vektor des "Standes der Technik" für eine Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation (Hoekema et al, 1983).
Zwei Hauptkomponentengruppen wurden in das BIBAC eingebaut. Die erste Gruppe umfasst die Funktionen, die in dessen Bakterienwirten: E. coli und A. tumefaciens erforderlich sind und Merkmale, die zur Charakterisierung der Bibliothek dienen. Die zweite Gruppe umfasst die Merkmale des BIBAC, die die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation erleichtern sollen. Eine Karte des BIBAC ist in 1 angegeben.
Das Gerüst des BIBAC besitzt die minimale Region, die zur F-Faktor-Replikation und Beibehaltung erforderlich sind (O'Conner et al, 1989). Die λ-cosN- und P1-loxP-Stellen von pBAC108 werden ebenfalls in das BIBAC eingebaut. Diese Stellen fungieren als singuläre Restriktionsstellen zur Verankerung von einem Ende des Inserts und Erleichterung der Analyse von partiellen Verdaus mit Restriktionsendonuklease(n). Die cosN-Stelle kann mit der Bakteriophage-λ-Terminase (Rackwitz et al, 1985), die loxP-Stelle durch Bakteriophage-P1-Cre-Protein in Gegenwart des loxP-Oligonucleotids (Abremski et al, 1983) geschnitten werden. Restriktionskarten der individuellen Klone können durch indirekte Endmarkierung und anschließenden partiellen Verdau bestimmt werden (Rackwitz et al, 1985; Abremski et al, 1983; Kohara et al, 1987).
Ein Marker, der eine positive Selektion auf Inserts bereitstellt, wird in das BIBAC eingebaut. Dieser Marker ist das sacB-Gen von Bacillus amyloliquifaciens (Tang et al, 1990), das das Protein Levansucrase codiert. Levansucrase wurde zum ersten Mal als 50-kD-Protein identifiziert, das von Bacillus subtilis nach einer Induktion durch Saccharose sezerniert wurde. Das Enzym katalysiert die Transfructorylierung von Saccharose zu verschiedenen Rezeptoren (Dedonder, 1966). Das sacB-Strukturgen von B. subtilis wurde durch Gay et al (1983) kloniert. Anschließend wurde entdeckt, dass, wenn 5% Saccharose in Agarmedium vorhanden ist, die Produktion von Levansucrase für E. coli, A. tumefaciens und Rhizobium meliloti letal ist (Gay et al, 1985).
Das sacB-Gen wurde aus dem Bakteriophage-P1-Klonierungsvektor pRd10sacBII (Pierce et al, 1992) subkloniert. (Die Codierungsregionen der B. amyloliquifaciens- und B. subtilissacB-Gene zeigen auf Nukleotidebene 90% Identität.) Dieses Konstrukt besitzt eine BamHI-Klonierungsstellenregion und einen synthetischen E. coli-Promotor strangaufwärts des sacB-Strukturgens. Die BamHI-Klonierungsstelle wird von T7- und SP6-RNR-Polymerasepromotoren, die zur Erzeugung von RNA-Sonden für Chromosome Walking verwendet werden können, flankiert. Die BamHI-Klonierungsstelle ist für das BIBAC singulär. Wenn ein DNA-Fragment in die BamHI-Stelle insertiert wird, wird das sacB-Gen inaktiviert und der Stamm ist lebensfähig, wenn er auf 5% Saccharose enthaltendem Medium gezüchtet wird. Das sacB-Gen wurde in pBAC108 zur Erzeugung von pCH1 eingeführt. Dieses Konstrukt wurde in den E. coli-Stamm DH10B durch Elektroporation eingeführt, und der gebildete Stamm wurde auf Empfindlichkeit gegenüber hohem Saccharosegehalt durch Ausplattieren einer Verdünnungsreihe auf Standard-LB-Medium und auf 5% Saccharose enthaltendem LB getestet. Auf 5% Saccharose enthaltendem LB ausplattierte Zellen zeigten eine Plattierungseffizienz von weniger als 10^–6 im Vergleich zu auf Standard-LB-Medium ausplattierten Zellen. Daher sollte das Ausplattieren einer potentiellen Bibliothek auf 5% Saccharose primär Genomklone ergeben.
Das BIBAC besitzt die Replikationsstartpunktregion von dem Ri-Plasmid von A. rhizogenes, dem Verursacher von Hairy Root Disease. Die Ti- und Ri-Plasmide gehören zu unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen und können stabil zusammen in einer Zelle gehalten werden (White and Nester, 1980; Constantino et al, 1980). Dies ist wichtig, da viele zur Pflanzentransformation verwendete A. tumefaciens-Stämme ein entschärftes Ti-Plasmid als das Virulenz-Helferplasmid enthalten. Es wurde gezeigt, dass die minimale Ri-Startpunktregion, die in das BIBAC eingebaut wird, zur Plasmidreplikation und stabilen Beibehaltung mit 1–2 Kopien pro Zelle in A. tumefaciens ausreichend ist (Jouanin et al, 1985). (Die "2" Kopien pro Zelle werden hier umfasst, um das Vorhandensein der duplizierten DNA während der Zell replikation abzudecken.) Der minimale Ri-Startpunkt wurde von pLJbB11, das von Jouanin et al (1985) charakterisiert wurde, subkloniert. Die oriT-Kassette und der Ri-Startpunkt wurden aneinander angrenzend in pUC19 (Yanisch-Perron et al, 1985) kloniert, um pCH9 zu erzeugen. Dies erfolgte derart, dass die zwei Komponenten als einzige Einheit auf den Vektor übertragen werden konnten.
Das BIBAC besitzt einen Konjugationstransferstartpunkt (oriT), der von dem Plasmid RK2 mit breitem Wirtsbereich der Inc-P-Gruppe abgeleitet ist. Wenn alle anderen Transferfunktionen trans durch ein Helferplasmid bereitgestellt werden, ermöglicht der oriT den Konjugationstransfer etwaiger kovalent gebundener selbstreplizierender DNA (Ditta et al, 1980). Der RK2-oriT des BIBAC wird von einer DNA-Kassette in pNHKan-oriT, konstruiert von Hengen und Iyer (1992), subkloniert. Das BIBAC kann durch Konjugation auf A. tumefaciens übertragen werden. Der RK2-oriT wurde zum Bewirken des Konjugationstransfers der Chromosomen von E. coli und Rhizobium meliloti verwendet (Yakobson und Guiney, 1984). Daher ist ein Konjugationstransfer von DNA mit hohem Molekulargewicht von E. coli zu A. tumefaciens möglich. Alternativ können BIBAC-Klone in Agrobacterium durch Elektroporation eingeführt werden. Mozo und Hooykaas (1991) berichteten, dass Plasmide einer Größe von 250 kb in A. tumefaciens durch Elektroporation eingeführt werden können.
Die Merkmale, die in das BIBAC zur Erleichterung der Verwendung des Vektors bei einer Pflanzentransformation eingebaut werden, sind: A. tumefaciens-T-DNA-Ränder und Pflanzenselektionsmarker. Es bestanden zwei Kriterien für die Wahl der Ränder des BIBAC: 1) die Pflanzentransformation möglichst effizient zu machen; und 2) den Vektor mit entschärften Ti-Plasmiden von A. tumefaciens, die Virulenzgene des Octopinetyps, Nopalinetyps oder Supervirulenztyps tra gen, kompatibel zu machen.
2 erläutert die Konstruktion des BIBAC. Die rechten und linken Randsequenzen des BIBAC sind von der TL-DNA des Octopineplasmids pTiA6 abgeleitet. Die "Overdrive"-Sequenzen des rechten Randes sind vorhanden (Peralta et al, 1986; van Haaren et al, 1987). Die Ränder in dem BIBAC wurden durch Pfu-Polymerase-PCR unter Verwendung von Primern, die mit Cosmid pVK232 (Knauf und Nester, 1982) hybridisieren, erzeugt. Das Plasmid pVK232 enthält die gesamte TL-DNA von TiA6 (de Vos et al, 1981; Barker et al, 1983; Gielen et al, 1984). Ein synthetischer Polylinker verbindet die Randsequenzen und er ist so gestaltet, dass er singuläre Klonierungsstellen angrenzend an die rechten und linken Randsequenzen bereitstellt, um die Einführung von Pflanzenselektionsmarkern zu erleichtern. Diese werden als MSR (Marker Site Right) und MSL (Marker Site Left) in 1 bezeichnet. Die durch PCR erzeugten Ränder und der Polylinker wurden zunächst in pUC19 kloniert.
Infolgedessen werden die rechten und linken Ränder und der Polylinker auf einem SalI-Fragment in pCH7 getragen. Dies erfolgte zu Erleichterung der anschließenden Klonierung dieses Fragments in die SalI-Stelle von mini-F-pMBO131.
Das sacB-Gen wurde in pCH7 durch Transformieren eines pcnB-Stamms von E. coli und Inkubieren der Transformanten bei 30°C kloniert. Wenn ein Plasmid des pUC-Typs bei 30°C vermehrt wird, wird dessen Kopienzahl von 80 auf 20 Kopien pro Zelle verringert (Lin-Chao et al, 1992). Die pcnB (Plasmid Copy Number)-Mutation verringert die Kopienzahl von Plasmiden des ColE1-Typs von etwa 20 Kopien pro Zelle auf etwa 1 Kopie pro Zelle (Lopilato et al, 1986). Diese Bedingungen wurden verwendet, um das gewünschte Konstrukt pCH10 zu erhalten. Wenn das SalI-Fragment von pCH10 in das mini-F zur Herstellung von pCH13 eingeführt wurde, wurden positive Klone ohne weiteres durch Screening auf den sacB-Marker identifiziert. Das oriT/Ri-Startpunkt-Fragment wurde dann in eine singuläre HpaI-Stelle, die 35 Nucleotide von dem SalI-Rand des mini-F entfernt ist, zur Herstellung von pCH16 eingeführt. Vorversuche zeigten, dass Chloramphenicol kein verwendbarer Marker für einige Stämme von Agrobacterium ist, weshalb eine Kanamycinresistenzgenkasette (Smith und Crouse, 1989) in die PvuII-Stelle des Chloramphenicolgens des mini-F kloniert wurde, um das Gerüst des BIBAC fertigzustellen.
Die Übertragung der T-DNA wird am rechten Rand initiiert und sie verläuft zum linken Rand, so dass die Übertragung des nahe dem linken Rand lokalisierten Pflanzenselektionsmarkers die Übertragung der gesamten T-DNA anzeigt. Daher ist es entscheidend, an der MSL einen Pflanzenselektionsmarker zu haben. Falls gewünscht, kann ein zweiter Pflanzenselektionsmarker an der MSR eingeführt werden. Für einige Anwendungen kann es günstig sein, ein Ds-Element an der MSR einzuführen. Das GUS-NPTII-Konstrukt (Datla et al, 1991) ist ein bifunktionales Fusionspeptid zwischen E. coli-β-Glucuronidase (GUS) und Neomycinphosphotransferase II (NPTII). Wenn dieses Konstrukt in der Pflanze exprimiert wird, ist die transformierte Pflanze gegenüber Neomycin resistent und sie kann auf die Expression des GUS-Gens getestet werden (Jefferson et al, 1987). Dieses GUS-NPTII-Konstrukt wird auf einem EcoRI-HindIII-Fragment getragen. Das Fragment wurde mit Klenow behandelt und in die Srf-I-Stelle an der MSL-Stelle ligiert, um BIBAC1 zu erzeugen.
Mehrere BIBACs, die andere Pflanzenselektionsmarker tragen, wurden erzeugt. BIBAC2 trägt das BAR-GUS-Konstrukt an der MSL. Das BAR-GUS-Konstrukt (Fromm et al, 1990) ist ein bifunktionales Fusionspeptid zwischen dem Gen für Phosphino thricin-Acetyltransferase (BAR), das Resistenz gegenüber dem Herbizid Phosphinothricin verleiht, und dem GUS-Gen. Die GUS-NPTII- und BAR-GUS-Konstrukte werden von einem starken doppelten CaMV-35S-Promotor (Kay et al, 1987) und Terminationssequenzen, die von dem Nopalinsynthasegen stammen, angetrieben. Zusätzlich ist in dem GUS-NPTII-Konstrukt ein AMV (Alfalfa Mosaic Virus)-Enhancer vorhanden.
Wenn zwei Pflanzenselektionsmarker in einem BIBAC-Vektor gewünscht sind, sollten die Promotoren und Transkriptionsterminationssequenzen der zwei Konstrukte nicht-homolog sein. Dies dient zur Verhinderung einer Sequenzredundanz in dem Vektor, die dessen Stabilität verringern könnte. Diese Warnung sollte auch für den Fall beachtet werden, dass der Einbau eines anderen Pflanzenselektionsmarkers gewünscht wird. Ferner sollte jedes Paar von Pflanzenselektionsmarkern in dem BIBAC so ausgerichtet werden, dass sie nicht konvergent transkribiert werden, da diese Konfiguration die Transgenexpression beeinträchtigen kann (Jones et al, 1992). In dem BAC, in dem die Marker durch 200 kb von Pflanzengenom-DNA getrennt sein können, ist es wahrscheinlich kein Problem. Jedoch könnten Kontrollexperimente, die den Vektor allein verwenden, beeinträchtigt werden.
BIBAC3 trägt das HYG-Konstrukt an der MSL zusätzlich zu dem GUS-NPTII-Konstrukt an der MSR. Das Hygromycin-Phosphotransferase (HYG)-Konstrukt ergibt Resistenz gegenüber Hygromycin (Becker et al, 1992). Das HYG-Konstrukt besitzt einen Nopalinsynthasepromotor und Terminatorsequenzen von pAg7. Jeder andere Pflanzenselektionsmarker kann ohne weiteres an einer der singulären Polylinkerstellen eingeführt werden. Natürlich darf der Pflanzenselektionsmarker keine BamHI-Stelle aufweisen, so dass die Bibliothek-Klonierungsstelle immer noch singulär ist.
Beispiel 2
Testen des BIBAC-Vektors
BIBAC1 wurde für erste Tests verwendet. Eine physikalische Karte von BIBAC1 wurde erstellt, und der Vektor allein (ohne irgendein DNA-Insert) funktioniert wie erwartet. Er repliziert in E. coli und A. tumefaciens und kann dessen T-DNA auf Tabak übertragen. Heterologe DNA von Tomate und Hefe wurde in die BamHI-Stelle des BIBAC-Vektors insertiert. Jeder gebildete Klon (der den Vektor und die heterologe DNA umfasst) wurde dann in den Escherichia coli-Stamm DH10B durch Elektroporation eingeführt. Der E. coli-Stamm DH10B wurde in weitem Umfang zur Konstruktion von Genombibliotheken verwendet, und die Stabilität sollte für die Mehrheit der BIBAC-Klone kein Problem sein. Der DH10B-Stamm enthält recA1, das die Stabilität der Inserts erhöht, sowie mcrA, mcrB, mcrC und mrr, die in Kombination die Restriktion von DNA, die methylierte Cytosin- und Adeninreste enthält, verhindern. Das heißt, es sollte kein Problem sein, selbst stark methylierte Pflanzengenom-DNA unter Verwendung dieses Stamms zu klonieren.
Ein Triparental Mating wurde dann mit den gebildeten Escherichia coli, ein Helferplasmid pRK2073 (das Resistenz gegenüber Spectinomycin trägt (Leong et al, 1982)) enthaltenden Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Nach der Übertragung des Vektors auf Agrobacterium tumefaciens wurden Tabakpflanzen unter Verwendung des im folgenden Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens transformiert.
Transgene Pflanzen wurden mit BIBAC1 in den Agrobacterium-Stämmen EHA105 (Hood et al, 1993), der ein entschärftes Ti-Plasmid des supervirulenten Typs trägt, LBA4404 (Ooms et al, 1982), der ein entschärftes Ti-Plasmid des Octopinetyps trägt, GV3101 (Koncz und Schell, 1986), der pMP90, ein entschärftes Ti-Plasmid des Nopalintyps, trägt, und einem recA^–-Stamm von A. tumefaciens, UIA143 (Farrand et al, 1989), der mit pMP90 transformiert war, erhalten.
Von den ersten neun transgenen Pflanzen mit BIBAC1, die mittels PCR auf das Vorhandensein eines für die BIBAC1-T-DNA singulären Fragments durchmustert wurden, wurden alle neun positiv getestet. Das PCR-Verfahren kann auch A. tumefaciens-Bakterien erfassen, die mit dem Blattgewebe verbunden geblieben sind, sowie stabil transformierte DNA erfassen. Zur Bestätigung der PCR-Ergebnisse wird die genomische DNA von diesen Pflanzen einer Southern-Analyse unter Verwendung der BIBAC1-T-DNA als Sonde unterzogen.
Beispiel 3
Transformation von Tabakpflanzen
Agrobacterium-Stämme wurden in Pflanzen durch Agrobacterium-vermittelte Transformation von Tabakblattstreifen eingeführt. Transformierte Pflanzen wurden durch Selektion auf Kanamycinresistenz identifiziert. Vermutete transgene Pflanzen wurden mittels PCR durchmustert (Saiki, 1988).
Das zur Agrobacterium-vermittelten Transformation verwendete Verfahren ist die folgende Modifikation von Horsch et al (1985).
Agrobacterium-vermittelte Blattexplantattransformation Tag 1
Von jungen gesunden Pflanzen (beispielsweise Nicotiana tabacum (Tabak) Petit Havana) werden junge Blätter gesammelt. Eine gute grobe Abschätzung der passenden Menge ist das Gewinnen einer ausreichenden Blattoberfläche, um den Boden von 1 bis 2 Petrischalen von Standardgröße zu bedecken.
Zu einem Tiegel, der etwa 400 ml steriles destilliertes Wasser enthält, werden 40 ml Bleichmittel und 4 ml 5%iger SDS gegeben, wobei etwa 0,05%ige SDS erhalten wird. Ein Rührstäbchen und alle Blätter werden in den Tiegel gegeben. Der Tiegel wird mit einem Deckel bedeckt. Es wird 20 Minuten gerührt, wobei die Geschwindigkeit so eingestellt wird, dass die Blätter nicht beschädigt werden.
In einem Abzug mit steriler Luft werden die Blätter gespült, indem sie in einen Tiegel, der 400 ml steriles destilliertes Wasser enthält, übertragen werden. Zur Übertragung der Blätter werden sterile Pinzetten verwendet. Die Blätter werden durch leichtes Schütteln des Tiegels verwirbelt. Nach 5 min werden sie in einen zweiten Tiegel mit sterilem destilliertem Wasser übertragen. Nach 5 min werden sie in einen dritten Tiegel übertragen. Die Blätter können in dieser letzten Spüllösung verbleiben, bis sie in dem Abzug mit steriler Luft bearbeitet werden. Der Tiegel bleibt mit einem Deckel verschlossen.
Das folgende erfolgt in dem Abzug mit steriler Luft. Zur Herstellung von Streifen werden die Blätter in eine sterile Petrischale übertragen, wobei sie in der Schale mit der Oberseite nach unten platziert werden (d. h. die untere Epidermis oben). Während es an der Mittelrippe mit sterilen Pinzetten gehalten wird, wird jedes Blatt unter Verwendung eines sterilen Skalpells senkrecht zur Mittelrippe in zahlreiche dünne Streifen zerschnitten. Die Streifen sollten eine Breite von etwa 5 mm aufweisen.
Alternativ können aus oberflächensterilisierten Samen unter sterilen Bedingungen gezüchtete Pflanzen direkt verwendet werden.
Fünf Streifen werden mit der richtigen Seite nach oben auf jede von zwei Regenerationsplatten gesetzt. Dies sind Kontrollen zur Überprüfung, ob sich nicht-beimpfte Blätter auf dem Medium ohne Antibiotika regenerieren. Es ist anzumerken, dass 100 × 20 mm-Platten bei Explantaten verwendet werden, um Raum für Pflanzenwachstum zu lassen. 100 × 26 mm-Platten können ebenfalls verwendet werden. (Standardbakterienplatten sind 100 × 15 mm).
Drei Regenerationsplatten werden zur Verwendung zur Vorkultur von Explantaten hergenommen. Etwa 15 Streifen werden mit der Oberseite nach unten auf jede Platte gesetzt. Es wird mehr als das notwendige Material vorkultiviert, da einiges davon kontaminiert oder geschädigt werden kann.
Anmerkung: Es spielt keine wirkliche Rolle, ob das Blattmaterial mit der Oberseite nach unten oder mit der richtigen Seite nach oben vorkultiviert wird. Das Protokoll gibt speziell die Oberseite nach unten an, da die Unterseite üblicherweise für eine Schädigung anfälliger ist. Nach der Vorkultur, wenn der Zeitpunkt der Impfung ansteht, sind Blattstreifen oder -scheiben mit geschädigter unterer Epidermis leicht zu beobachten. Diese Blattexplantate werden verworfen.
Die wie oben vorbereiteten Explantatplatten werden mit Parafilm verschlossen und in einen beleuchteten Inkubator mit 25–28°C gegeben (einige Forscher führen die Vorkultur im Dunkeln durch).
Nächster Tag (Tag 2)
Eine einfachmarkierte LB-kan-Platte, die elektroporiertes Agrobacterium enthält, wird verwendet. Ausgehend von zwei einzelnen Kolonien wird eine 5-ml-Übernachtkultur in LB-Medium, das 50 μg/ml Kanamycin enthält, gestartet. Wiederholung zur Herstellung eines zweiten Röhrchens. Inkubation mit Schütteln bei 30°C.
Nächster Tag (Tag 3)
Fünf Blattstreifen werden mit der richtigen Seite nach oben auf jede der zwei Platten mit Regenerationsmedium, das Carbenicillin plus Kanamycin oder Timentin plus Kanamycin enthält, gegeben. Kontrollen sind vorhanden, um zu testen, ob etwaiges nicht-geimpftes Gewebe auf selektivem Medium wachsen und/oder Sprosse bilden kann.
Die Blattexplantate von einigen Arten produzieren mehr Sprosse, wenn sie mit der richtigen Seite nach oben platziert werden; daher die Vorschriften, die Streifen auf den Regenerationsplatten mit der richtigen Seite nach oben zu platzieren.
Um die Schalen wird Parafilm gegeben.
Die Übernachtkultur von Agrobacterium wird 1 : 10 durch Mischen von 2 ml mit 18 ml MSO-Medium verdünnt. Die Verdünnung wird in eine sterile Petrischale gegossen.
Blattstreifen, die offensichtlich geschädigt sind oder nicht gequollen sind, werden von den Vorkulturschalen verworfen. Die gesunden Streifen werden in die verdünnte Bakterienkultur gesetzt und die Schale wird nicht mehr als 5 s leicht gedreht, so dass die Schnittkanten feucht werden.
Warnung: Das Blattgewebe darf in der Kultur nicht länger verbleiben, als notwendig ist, um alle Wundränder mit dem Inoculum zu befeuchten. Die Sättigung des Gewebes mit Bakterien kann zu einer unheilbaren Infektion führen.
Das Gewebe wird aus der Bakterienkultur entfernt und auf ein steriles Whatman Nr. 1-Filterpapier gegeben, um einen Teil der überschüssigen Bakterienkultur abzutupfen. Dann werden zehn Streifen mit der Oberseite nach unten auf zwei Regenerationsplatten (ohne Antibiotika) gegeben.
Um die Schalen wird Parafilm gegeben und die Schalen werden mit der Deckelseite nach oben inkubiert.
(Einige Labors finden es hilfreich, eine Ammenzellkultur zu verwenden, insbesondere bei Pflanzenarten, die schwierig zu regenerieren sind. Sie setzen 1 bis 1,5 ml einer rasch wachsenden flüssigen Pflanzensuspensionskultur einer Regenerationsplatte zu und bedecken diese vollständig mit einem sterilen Whatman Nr. 1-Filterpapier. Das Filterpapier verhindert eine Kontamination der Explantate mit den Zellen. Dann setzen sie Blattstreifen oben auf das Filterpapier. Tabaksuspensionskulturzellen werden häufig verwendet, da diese Zellen in einem Medium gezüchtet werden, das kein 2,4-D enthält. 2,4-D hemmt die Pflanzenregeneration, wenn es in der Ammenkultur verwendet wird.)
Drei Tage später
Die Blattstreifen und/oder -scheiben werden auf Regenerationsplatten, die 500 μg/ml Carbenicillin oder 100 μg/ml Tementin zum Abtöten der Bakterien und 300 μg/ml Kanamycin zur Selektion auf transformierte Zellen, die Kanamycinresistenz exprimieren, enthalten, übertragen. Das Blattgewebe wird mit der richtigen Seite nach oben auf das Medium gesetzt.
Noch später ...
Sprosse beginnen sich auf dem Blattgewebe nach 2 bis 3 Wochen in einer beleuchteten Zuchtkammer bei 25–28°C zu bil den. Nach 2 Wochen werden die Explantate auf frische Regenerationsplatten mit Carbenicillin (oder Tementin) und Kanamycin übertragen.
Die Platten werden weiterhin häufig überprüft. Wenn sich Callusauswüchse bilden, werden diese (ohne das Blattgewebe) auf frische Regenerationsplatten mit Carbenicillin und Kanamycin übertragen.
Nach etwa 1 bis 2 Wochen bilden sich Sprosse auf dem Callus. Wenn die Sprosse so groß genug sind, dass sie von dem Callus abgeschnitten werden können, wird dies getan und die Sprosse werden auf Bewurzelungsmedium mit Carbenicillin plus Kanamycin oder Tementin plus Kanamycin übertragen. Es ist wichtig, eine Calluskontamination der Sprosse zu vermeiden, da der Callus wahrscheinlich noch etwas Agrobacterium enthält. Eine Verringerung oder das Weglassen von Kanamycin dient manchmal der Beschleunigung des Bewurzelungsprozesses.
Die Schalen werden weiterhin beobachtet. Wenn ein Wachstum von Agrobacterium beobachtet wird, werden die Sprosse sofort auf frisches Bewurzelungsmedium mit Carbenicillin oder Tementin plus Kanamycin übertragen. Wenn das Agrobacterium-Wachstum auf eine kleine Zahl von Sprossen beschränkt ist, werden nur die ohne ein sichtbares Herauswachsen von Agrobacterium auf neues Medium übertragen und die alte Schale verworfen.
Nach der Bildung von Wurzeln werden die kleinen Pflanzen in Magenta-Boxen, die Bewurzelungsmedium ohne Antibiotika enthalten, übertragen.
Wenn Pflanzen 4 bis 5 Blätter und Wurzeln einer Länge von 3 bis 4 cm besitzen, können sie in Erdreich getopft werden.
Beim Austopfen wird das Agar von den Wurzeln entfernt. Jede neu ausgetopfte Pflanze wird in einen Kunststoffbeutel gehüllt, der oben mit einer Fadenschleife verschlossen wird. Der Beutel wird allmählich (über einen Zeitraum von etwa 2 Wochen) geöffnet oder aufgeschnitten, um eine immer größere Öffnung herzustellen. Dann wird der Beutel entfernt.
LISTE ANGEFÜHRTER LITERATURSTELLEN

Abremski, K. et al. (1983). Studies of the properties of P1 site-specific recombination: evidence for topolgically unlinked products following recombination. Cell 32, 1310–1311.
Anderson, C. (1993). Genome shortcut leads to problems. Science 259, 1684–1687.
Barker, R. F. et al. (1983). Nucleotide sequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid pTil5955. Plant Mol. Biol. 2, 335–350.
Becker, D. et al. (1992). New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left T-DNA border. Plant Mol. Biol. 20. 1195–1197.
Bennett, M. D. and Smith, J. B. (1976). Nuclear DNA amounts in angiosperms. Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. 274, 224–274.
Bent, A. F. et al. (1994). RPS2 of Arabidopsis thaliana: A leucine-rich repeat class of plant disease resistance gene. Science 265, 1856–1860.
Burke, D. et al. (1987). Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science 236, 806–812.
Constantino, P. et al. (1980). Tumor formation and rhizogenicity of Agrabacterium rhizogenes carrying Ti plasmids. Gene 31, 79–87.
Datla, R. S. S. et al. (1991). A bifunctional fusion between β-glucuronidase and neomycin phosphotransferase: a broad-spectrum marker enzyme for plants. Gene 101, 239–246.
Dedonder, R. (1966). Levansucrase from Bacillus subtilis. Meth. Enzymol. 8, 500–505.
de Vos, G. et al. (1981). Restriction endonuclease mapping of the octopine tumor inducing plasmid pTiAch5 of Agrobacterium tumefaciens. Plasmid 6, 249–253.
Ditta, G. et al. (1980). Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: Construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 7347–7351.
Farrand, S. K. et al. (1989). Construction of an Agrobacterium tumefaciens C58 recA mutant. J. Bact. 171, 5314–5321.
Fromm, M. E. et al. (1990). Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. Bio/Tech. 8, 833–839.
Gay, P. et al. (1983). Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: Expression of the gene in Escherichia coli. J. Bact. 153, 1424–1431.
Gay, P. et al. (1985). Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J. Bact. 164, 918–921.
Gielen, J. et al. (1984). The complete nucleotide sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J. 3, 835–846.
Hengen, P. N., und Iyer, V. N. (1992). DNA cassettes containing the origin of transfer (oriT) of two broad-host-range transfer systems. BioTech. 13, 56–62.
Hiei, Y. et al. (1994). Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271–282.
Hoekema, A. et al. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303, 179–180.
Hood, E. E. et al. (1993). New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Research 2, 208–218.
Horsch, R. B. et al. (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227, 1229–1231.
Jefferson, R. A, et al. (1987). GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901–3907.
Jones, J. D. G. et al. (1992). Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes, and assaying transposon excision in transgenic plants. Transgenic Research 1, 285–297.
Jones, D. A. et al. (1994). Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladisporium fulvum by transposon tagging. Science 266, 789–794.
Jouanin, L. et al. (1985). Localization and restriction maps of the replication origin regions of the plasmids of Agrobacterium rhizogenes strain A4. Mol. Gen. Genet. 201, 370–374.
Kado, C. Y. (1991). Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis. Critical Reviews in Plant Sciences 10, 1–32.
Kay, R. et al. (1987). Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science 236, 1299–1302.
Knauf, V. C. and Nester, E. W. (1982). Wide host range cloning vectors: a cosmid clone bank of an Agrobacterium Ti plasmid. Plasmid 8, 45–54.
Kohara, Y. et al. (1987). The physical map of the whole E. coli chromosome: application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library. Cell 50, 495–548.
Koncz, C. und Schell, J. (1986). The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol. Gen. Genet. 204, 383–396.
Leong, S. A. et al (1982). Heme biosynthesis in Rhizobium. Identification of a cloned gene coding for S-aminolevulinic acid synthetase from Rhizobium meliloti. J. Biol. Chem. 257, 8724–8730.
Lin-Chao, S. et al. (1992). High copy number of the pUC plasmid results from a Rom/Rop-suppressible point mutation in RNAII. Molec. Microbiol. 6, 3385–3393.
Lopilato, J. et al. (1986). Mutations in a new chromosomal gene of Escherichia coli K-12,pcnB, reduce plasmid copy number of pBR322 and its derivatives. Mol Gen. Genet. 205, 285–290.
Low, K. B. (1972). Escherichia coli K-12 F-prime factors old and new. Bacteriol. Rev. 36, 587–607.
Ma, H. et al. (1992). Vectors for plant transformation and cosmid libraries. Gene 117, 161–167.
Martin, G. B. et al. (1991). Rapid identification of markers linked to a pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines-Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 2336–2340.
Martin, G. B. et al. (1992). Construction of a yeast artificial chromosome library of tomato and identification of cloned segments linked to two disease resistance loci. Mol. Gen. Genet. 233, 25–32.
Martin, G. B. et al. (1993). Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science 262, 1432–1436.
Michelmore, R. W. et al. (1991). Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 9828–9832.
Miranda, A. et al. (1992). Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bact. 174, 2288–2297.
Mozo, T., and Hooykaas, P. J. J. (1991). Electroporation of megaplasmid into Agrobacterium Plant Mol. Biol. 16, 917–918.
O'Conner, M. et al. (1989). Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science 244, 1307–1312.
Ooms, G. et al. (1982). Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of. the T-region. Plasmid 7, 15–29.
Peralta, E. G. und Ream, L. W. (1985). T-DNA border sequence required for crown gall tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 5112–5116.
Peralta, E. G. et al. (1986). Overdrive, a T-DNA transmission enhancer on the A. tumefaciens tumor-inducing plasmid. EMBO J. 5, 1137–1142.
Pierce, J. C. et al. (1992). A positive selection vector for cloning high molecular weight DNA by the bacteriophage P1 system: Improved cloning efficacy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 2056–2060.
Rackwitz, H. R. et al. (1985). Analysis of cosmids using linearization by phage lambda terminase. Gene 40, 259–266.
Saiki, R. K. (1988). Optimization of the polymerase chain reaction. In: Current Communications in Molecular Biology: Polymerase Chain Reaction, H. A. Erlich et al. Hrsg. (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), S. 25–30.
Shizuya, H. et al. (1992). Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 8794–8797.
Smith, M. L., and Crouse, G. F. (1989). Construction of linker-scanning mutations using a kanamycin-resistance cassette with multiple symmetric restriction sites. Gene 84, 159–164.
Southern, E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503–517.
Tang, L. B. et al. (1990). Isolation and characterization of levansucrase-encoding gene from Bacillus amyloliquefaciens. Gene 96, 89–93.
van Haaren, M. J. J. et al. (1987). Overdrive is a T-region transfer enhancer which stimulates T-strand production in A. tumefaciens. Nucleic Acids Res. 15, 8983–8997.
van Wordragen, M. F. und Dons, H. J. M. (1992). Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of recalcitrant crops. Plant Mol. Biol. Rep. 10, 1236.
Wang, G. und Ronald, P. C. (1994) Construction of a bacterial artificial chromosome (BAC) library for physical mapping and cloning of a bacterial blight resistance gene Xa-21. Abstract P214 von "Second International Conference on the Plank Genome", San Diego, California, Januar 1994.
White, F. F. und Nester, E. W. (1980). Relationship of plasmids responsible for hairy root and crown gall tumorigenicity. J. Bact. 144, 710–720.
Whitham, S. et al. (1994). The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell. 78, 1101–1115.
Williams, J. G. K. et al. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18, 6531–6535.
Woo, S.–S. et al. Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library for Sorghum bicolor. Abstract P223 von "Second International Conference on the Plant Genome", San Diego, California, Januar 1994.
Yakobson, E. A. and Guiney, D. G. J. (1984). Conjugal transfer of bacterial chromosomes mediated by the RK2 plasmid transfer origin cloned into transposon Tn5. J. Bact. 160, 451–453.
Zabeau, M. und Vos, P. (1992): Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting. (Übertragen an Keygene N. V.) europäische Patentanmeldung Nr. EP 91402542 , veröffentlicht 24, September 1991, niederländisches Patent Nr. 0 534 858 A1, erteilt 31. März 1993.
Zambryski, P. (1988). Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells. Ann. Rev. Genet. 22, 1–30.

Claims

Vektor zur Übertragung heterologer DNA in eine Pflanzenzelle, wobei der Vektor umfasst: ein Gerüst, das einen ersten Replikationsstartpunkt mit der Fähigkeit, heterologe DNA als Einzelkopie in einer Escherichia coli-Wirtszelle zu halten, umfasst, und das ferner einen zweiten Replikationsstartpunkt mit der Fähigkeit, heterologe DNA als Einzelkopie in einer Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle zu halten, umfasst; eine singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle zur Insertion von heterologer DNA; und linke und rechte Agrobacterium T-DNA-Randsequenzen, die die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle flankieren, wobei die linken und rechten T-DNA-Randsequenzen die Einführung von heterologer DNA, die sich zwischen den linken und rechten T-DNA-Randsequenzen befindet, in eine Pflanzenzelle ermöglichen.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der erste Replikationsstartpunkt einen F-Startpunkt von Escherichia coli umfasst.
Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der zweite Replikationsstartpunkt einen Ri-Startpunkt vom Agrobacterium rhizogenes umfasst.
Vektor nach Anspruch 1, wobei die singuläre Restrik tionsendonukleaseschnittstelle eine BamHI-Schnittstelle umfasst.
Vektor nach Anspruch 1, wobei die linken und rechten T-DNA-Randsequenzen von TL-DNA des Octopineplasmids pTiA6 abgeleitet sind.
Vektor nach Anspruch 1, der ferner einen Selektionsmarker für den Einbau von heterologer DNA in den Vektor umfasst.
Vektor nach Anspruch 6, wobei der Selektionsmarker ein sacB-Gen umfasst und wobei, wenn heterologe DNA in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle des Vektors insertiert wird, das sacB-Gen inaktiviert wird.
Vektor nach Anspruch 1, der ferner einen Selektionsmarker für die Einführung der heterologen DNA in Escherichia coli umfasst.
Vektor nach Anspruch 1, der ferner einen Selektionsmarker für die Einführung der heterologen DNA in Agrobacterium tumefaciens umfasst.
Vektor nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei der Selektionsmarker ein Kanamycinresistenzgen umfasst.
Vektor nach Anspruch 1, der ferner einen Selektionsmarker für die Einführung der heterologen DNA in eine Pflanzenzelle umfasst, wobei der Selektionsmarker zwischen den linken und rechten T-DNA-Randsequenzen lokalisiert ist.
Vektor nach Anspruch 11, wobei der Selektionsmarker angrenzend an die linke T-DNA-Randsequenz lokalisiert ist.
Vektor nach Anspruch 11, wobei der Selektionsmarker ein Kanamycinresistenzgen oder ein Hygromycinresistenzgen umfasst.
Vektor nach Anspruch 13, wobei das Kanamycinresistenzgen ein GUS-NPTII-Gen umfasst.
Vektor nach Anspruch 1, wobei das Gerüst ferner einen Startpunkt für eine Konjugationstransfer umfasst.
Vektor nach Anspruch 15, wobei der Startpunkt für Konjugationstransfer einen oriT-Startpunkt von dem Plasmid RK2 umfasst.
Vektor nach Anspruch 1, der ferner heterologe DNA, die in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle insertiert ist, umfasst.
Wirtszelle, die mit dem Vektor von Anspruch 17 oder Anspruch 1 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die Wirtszelle Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens oder eine Pflanzenzelle umfasst.
Verfahren zur Einführung heterologer DNA in eine Pflanzenzelle, wodurch ein Genprodukt in einer Pflanzenzelle produziert wird, wobei das Verfahren umfasst: Insertieren von heterologer DNA mit Codierung für das Genprodukt in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle des Vektors nach Anspruch 1; Transformieren einer Escherichia coli-Wirtszelle mit dem gebildeten Vektor, um die heterologe DNA in die Escherichia coli-Wirtszelle einzuführen; Transformieren einer Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle mit aus der erhaltenen Escherichia coli-Zelle isolierter Vektor-DNA, um die heterologe DNA in die Agrobacterium tumefaciens-Wirtszelle einzuführen; und Transformieren einer Pflanzenzelle mit der erhaltenen Agrobacterium tumefaciens-Zelle, um die heterologe DNA in die Pflanzenzelle einzuführen; und Exprimieren der heterologen DNA in der Pflanzenzelle, um das durch die heterologe DNA codierte Genprodukt in der Pflanzenzelle zu produzieren.
Verfahren zur Produktion eines Genprodukts in einer Pflanzenzelle, wobei das Verfahren umfasst: Insertieren von heterologer DNA mit Codierung für das Genprodukt in die singuläre Restriktionsendonukleaseschnittstelle des Vektors nach Anspruch 1; Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem erhaltenen Vektor, um die heterologe DNA in die Pflanzenzelle einzuführen; und Exprimieren der heterologen DNA in der Pflanzenzelle, um das durch die heterologe DNA codierte Genprodukt in der Pflanzenzelle zu produzieren.