DE69635955T2

DE69635955T2 - Verbesserter einbau exogener dna in pflanzenzellen

Info

Publication number: DE69635955T2
Application number: DE69635955T
Authority: DE
Inventors: Geneviève Durham HANSEN; Mary-Dell Raleigh CHILTON
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1995-09-25
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2016-09-13
Also published as: HUP9900451A2; ES2262158T3; CA2230966C; BR9610738A; HU227410B1; CN1193097C; AU707948B2; EP0853675B1; KR19990063713A; AU7128596A; CN1197482A; PL191113B1; EA001039B1; KR100477413B1; ATE321142T1; EP0853675A1; MX9802312A; HUP9900451A3; JPH11511336A; WO1997012046A1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Transformation von Pflanzezellen mit endogener DNA und die Erzeugung von transgenen Organismen, Geweben oder Kulturen aus solchen Zellen.
Mehrere Verfahren wurden zur Einführung von exogenen DNA-Molekülen in Pflanzenzellen entwickelt, um den Vorteil der weitverbreiteten Vorzüge zu nutzen, die aus der Anwendung von rekombinanter DNA-Technik zur Produktion von transgenen Pflanzen entsteht. Diese Verfahren schließen modifizierte biologische Systeme wie den Agrobacterium-vermittelten T-DNA-Transfer auf Pflanzenzellen und physikalische, nicht-biologische Systeme wie Elektroporation, Mikroinjektion, Calciumphosphat- oder Polyethylenglykol-(PEG)-vermittelte DNA-Aufnahme oder Zellfusion und Mikroprojektilbombardierung ein (für eine allgemeine und etwas ältere Übersicht siehe Kapitel 2 und 3 aus "Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual", Hrsg. J. Draper et al., veröffentlicht von Blackwell Scientific Publications (1988); siehe auch Potrykus et al., "Direct Gene Transfer: State of the Art and Future Potential", Plant Mol. Biol. Rep. 3: 117–128 (1985)).
Die Verfahren, die entwickelt wurden, haben die stabile Transformation einer großen Vielzahl von Pflanzenarten mit exogener DNA erlaubt. Insbesondere hat die Entwicklung von physikalischen Techniken die offensichtlichen Beschränkungen des Wirtebereichs ausgeräumt, die durch biologische Systeme auferlegt wurden. Jedoch ist ein gemeinsamer Mangel dieser physikalischen Verfahren, daß sie keine Mittel zur geordneten Integration der übertragenen DNA in das pflanzliche Zellgenom liefern. Entsprechend müssen diese Verfahren von der unkontrollierten Integration der übertragenen DNA durch schlecht verstandene Mechanismen abhängen, was dazu führt, daß exogene DNA als Mehrfachkopien von zufälligen Fragmenten gewöhnlich an einem einzelnen Ort im pflanzlichen Zellgenom integriert wird.
Eine Verbesserung der Vorhersagbarkeit von stabilen Transformationsereignissen, die aus der physikalischen Einführung von exogener DNA in die Pflanzenzelle herrühren, würde signifikant den Nutzen und die Gesamteffizienz dieser Verfahren zur Erzeugung von genetisch stabil transformierten Pflanzen verbessern, die eine stabile Expression von Transgenen aufweisen. Ein Ansatz, der unternommen wurde, um dieses Ziel zu erreichen, ist die Kombination von Proteinen, die die Transformation und/oder Integration in biologischen Systemen fördern, mit nicht-biologischen Übertragungstechniken. Zum Erreichen der gewünschten Wirkung ist es als notwendig erachtet worden, die Protein selbst mit den exogenen DNA-Molekülen vor der Übertragung auf die Transformationszielzellen zu assoziieren, um somit das biologische System, aus dem die Proteine stammen, soweit wie möglich nachzuahmen (WO 95/05471 und WO 95/34647).
Viele Proteine sind bekannt, die die stabile integrative Transformation von Pflanzenzellen mit exogener DNA fördern, wenn sie außerhalb der Pflanzenzelle erzeugt und in Kombination mit der exogenen DNA übertragen werden. Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß solche Proteine nicht außerhalb der Pflanzenzelle erzeugt und mit der exogenen DNA assoziiert werden müssen, da sie natürlicherweise geeignet sind, um die stabile integrative Transformation zu fördern. Stattdessen kann die Übertragung einer translatierbaren RNA oder eines chimären Gens, das ein solches Protein codiert, auf die pflanzliche Transformationszielzelle auch wirksam die stabile integrative Transformation einer gemeinsam übertragenen exogenen DNA wirksam fördern.
Es ist eines der Hauptziele der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur stabilen Integration einer DNA von Interesse durch Transformieren von Pflanzenzellen mit exogener DNA bereitzustellen. Dieses verbesserte Verfahren umfaßt allgemein das Versehen der Pflanzenzelle, auf die für die Transformation abgezielt wird, mit wenigstens einem chimären Gen oder RNA, die eines oder mehrere Proteine erzeugen kann, die die Integration fördern, in Kombination mit der exogenen DNA, die zu integrieren gewünscht ist.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Pflanzenzelle mit

(a) einem DNA-Fragment, das aus der DNA von Interesse besteht, die durch T-DNA-Randsequenzen gebunden ist;
(b) wenigstens einen chimären DNA- oder RNA-Molekül transformiert, das in der Pflanzenzelle ein oder mehrere Proteine exprimieren kann, die die Integration von DNA, die durch T-DNA-Randsequenzen gebunden ist, fördern können.

Ein exogenes DNA-Fragment von Interesse, auf das für die erfindungsgemäße Integration abgezielt wird, kann jedes DNA-Fragment sein, das der Fachmann in intakter Form in das eukaryontische Zellgenom integrieren möchte, wie ein chimäres Gen, das zur Expression einer besonderen biologisch aktiven RNA (z.B. Antisense-RNA oder Ribozym) oder eines Proteins von Interesse in der Pflanzenzelle oder resultierenden Pflanze oder Pflanzenzellkultur geschaffen ist.
Ein Protein, das die Integration der exogenen DNA fördern kann, ist insbesondere ein Protein, das durch die Virulenzregion von Agrobacterium Ti- oder Ri-Plasmiden codiert wird, und das zur Ausrichtung der Integration einer DNA von Interesse, die durch T-DNA-Randsequenzen gebunden ist, in das Genom einer Pflanzenzelle verwendet wird.
Insbesondere stelle die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur stabilen Transformation von Pflanzenzellen mit exogener DNA bereit, das die positiven Eigenschaften des Agrobacterium tumefaciensvermittelten T-DNA-Transfers und die Integration mit nicht-biologischen Übertragungsverfahren kombiniert. Dieses verbesserte Verfahren umfaßt das Versehen einer Pflanzenzelle mit dem exogenen DNA-Fragment, das in das pflanzliche Zellgenom integriert werden soll, gebunden durch T-DNA-Ränder, neben wenigstens einem chimären Gen oder RNA, die in der Pflanzenzelle ein aus Agrobacterium stammendes Protein exprimieren kann, das die Integration der exogenen DNA fördert. Das aus Agrobacterium stammende Protein, das erfindungsgemäß bereitgestellt wird, entspricht insbesondere VirD1, VirD2, VirC1, VirC2 oder VirE2. Bevorzugt wird eine Kombination aus VirD2 und entweder VirD1, VirC1, VirC2, VirE2 oder einer Unterkombination daraus verwendet. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung VirD2 allein, eine Kombination aus VirD1 und VirD2 oder eine Kombination aus VirD, VirD2 und VirE2. Die Expression des aus Agrobacterium stammenden Proteins (der Proteine) in der Pflanzezelle verursacht die Integration der exogenen DNA als intaktes Fragment mit vorhersagbaren Endpunkten.
Erfindungsgemäß kann das exogene DNA-Fragment, das durch T-DNA-Randsequenzen gebunden ist, auf die Pflanzezelle durch nicht-biologische Mittel wie Elektroporation, Mikroinjektion, induzierte Aufnahme und Mikroprojektilbombardierung übertragen werden.
Erfindungsgemäß können aus Agrobacterium stammende Proteine auch auf die Pflanzenzelle durch nicht-biologische Mittel in Form von DNA (chimäres Gen, das in der Pflanzenzelle exprimierbar ist) oder RNA (RNA, die in der Pflanzezelle translatierbar ist) übertragen werden.
Das exogene DNA-Fragment und aus Agrobacterium stammende Proteine in Form von DNA oder RNA werden zeitweilig übertragen, so daß die aus Agrobacterium stammenden Proteine in der Pflanzenzelle vorhanden sind, nachdem die exogene DNA übertragen wurde und bevor die exogene DNA integriert worden ist. Dies kann bevorzugt durch gleichzeitige Übertragung dieser Komponenten in einem einzelnen Schritt erreicht werden. Alternativ kann die Pflanzenzelle, auf die zur Transformation abgezielt wird, aus einer Pflanze oder Zellkultur stammen, die zuvor stabil mit einem chimären Gen (Genen) transformiert wurde, das aus Agrobacterium stammende Proteine exprimieren kann.
In einem anderen Aspekt der Erfindung werden Pflanzenzellen, die stabil mit einem diskreten DNA-Fragment transformiert sind, regeneriert, um fruchtbare transgene Pflanzen zu erzeugen, die stabil ein gewünschtes Transgen exprimieren und es auf Nachkommenschaft übertragen, in der die stabile Expression des Transgens als Mendelsches Merkmal vererbt wird.
Die folgenden Definitionen sollen das Verständnis der vorliegenden Erfindung fördern:
Integration: Wie hier verwendet, wird "Integration" verwendet, um allgemein den Prozeß zu bezeichnen, durch das ein in eine Pflanzenzelle übertragenes exogenes DNA-Molekül stabil in die genomische DNA einer Pflanzenzelle aufgenommen wird.
Mikroprojektilbombardierung: Wie hier verwendet, wird "Mikroprojektilbombardierung" verwendet, um das allgemeine Verfahren der Übertragung von Nukleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, auf eine lebende Zelle durch Auftragen der Nukleinsäuren auf ein Mikroprojektil und Beschleunigen des beschichteten Mikroprojektils in die lebende Zelle zu bezeichnen (siehe zum Beispiel Beispiele 1–4, US-PS 5,036,006; WO 91/02071 (Beschreibung der Anwendung dieses Ansatzes zur Transformation von Pflanzen und Zellen davon), siehe auch US-PS 5,302,523; Koziel et al., Biotechnology 11: 194–200 (1993) (Beschreibung der Transformation von Elite-Inzuchtlinien von Mais durch Partikelbombardierung); Vasil et alo., Biotechnology 11: 1553–1558 (1993); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077–1084 (1993); T. Tanaka et al., "Successful expression in pollen of various plant species of in vitro synthesized mRNA introcuced by particle bombardment", Plant Mol. Biol. 28: 337–341 (1995); Vasil et al., Biotechnology 10: 667–674 (1992); L. Walker et al., "GUS Messenger RNA Delivery and Expression in Plant Cells via Particle Bombardment", In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 70A-#218 (1990); A. Iida et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 560–563 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990); Fromm et al., Biotechnology 8: 833–839 (1990); H. Morikawa et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31: 320–322 (1989)).
Aerosolstrahlinjektion: Wie hier verwendet, wird "Aerosolstrahlinjektion" verwendet, um das Verfahren der physikalischen Übertragung von Nukleinsäuren auf eine lebende Zelle in Form eines Aerosolstrahls zu bezeichnen (siehe z.B. US-PS 5,240,842).
Elektroporation: Wie verwendet, wird "Elektroporation" verwendet, um das Verfahren der Übertragung von biologischen Molekülen, insbesondere Nukleinsäuren wie DNA und RNA, auf lebende Zellen durch Unterwerfen der Zellen einem elektrischen Impuls oder einer Entladung in Gegenwart der biologischen Moleküle zu bezeichnen (siehe z.B. US-PS 5,231,019; Kapitel 3 aus "Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual", Hrsg. J. Draper et al., veröffentlicht von Blackwell Scientific Publications (1988); M.W. Saul et al., "Direct DNA Transfer to Protoplasts With and Without Electroporation", Plant Molecular Biology Manual A1: 1–16 (1988); K. Okada et al., "Introduction of Functional RNA into Plant Protoplasts by Electroporation", Plant Cell Physiol. 27(4): 619–626 (1986); R.D. Shillito et al., "High Efficiency Direct Gene Transfer to Plants", Biotechnology 3: 1099–1103 (1985); EP 292 435 (Ciba-Geigy), EP 392 225 (Ciby-Geigy) und WO 93/07278 (Ciba-Geigy).
Mikroinjektion: Wie hier verwendet, wird "Mikroinjektion" verwendet, um ein Verfahren der mechanischen Injektion einer biologischen Substanz, insbesondere DNA oder RNA, direkt in eine lebende Zelle zu bezeichnen (siehe z.B. Kapitel 3.4 aus "Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual", s.o.; M. Graessmann et al., "Microinjektion of Tissue Culture Cells", Methods in Enzymology 101: 482–492 (1983)).
Induzierte Aufnahme: Wie hier verwendet, wird "induzierte Aufnahme" verwendet, um allgemein Verfahren zu bezeichnen, die die Aufnahme von biologischen Substanzen, insbesondere Nukleinsäuren, durch lebende Zellen induzieren (siehe z.B. Hintergrundabschnitt von US-PS 5,036,006). Solche Verfahren schließen insbesondere die Polyethylenglykol-(PEG)-vermittelte Aufnahme (siehe z.B. Kapitel 3.2 aus "Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual", Hrsg. J. Draper et al., veröffentlicht von Blackwell Scientific Publications (1988); M.W. Saul et al., "Direct DNA Transfer to Protoplasts With and Without Electroporation", s.o.; Negrutiu et al., Plant Mol. Biol. 8: 363–373 (1987)) und Hitzeschockbehandlung (siehe US-PS 5,231,019) ein.
VirD: Wie hier verwendet, wird "VirD" verwendet, um die aus dem Virulenz-(Vir)-D-Operon von Ti- oder Ri-Plasmiden stammenden Gene oder Proteine zu bezeichnen, die die für den T-DNA-Transfer erforderlichen Funktionen bereitstellen (für eine Übersicht siehe P.C. Zambryski, "Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story", Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465–490 (1992)). Besondere Gene und entsprechende Proteine aus dieser Region werden durch Ziffern entsprechend ihrem Auftreten auf dem VirD-Operon benannt. Zum Beispiel wird das erste Gen im Virulenz D-Operon mit "VirD1" benannt, das zweite wird mit "VirD2" benannt, etc.
Die DNA der Virulenzregion wird normalerweise nicht auf die Pflanzenzelle übertragen, noch wird sie in das pflanzliche Genom während des Agrobacterium-vermittelten T-DNA-Transfers integriert. Stattdessen wirken die vir-Genprodukte natürlicherweise in trans zur Mobilisierung des T-DNA-Elements aus dem bakteriellen Ti- oder Ri-Plasmid zum pflanzlichen Genom. Die T-Region und vir-Region können auf unterschiedlichen Plasmiden ohne Funktionsverlust getrennt werden (A.J. De Framond et al., Bio/Technology 1:262–269 (1983); Hoekema et al., Nature 303: 179–180 (1983); M. Bevan, Nucleic Acids Res. 12: 8711–8721 (1984)).
Zwei durch die 5'-Hälfte des VirD-Locus codierte Polypeptide spielen eine Schlüsselrolle in der Einleitung der DNA-Verarbeitung für den T-DNA-Transfer aus Agrobacterium auf die Pflanzenzellen: VirD1 und VirD2. VirD1- und VirD2-Proteine werden durch das erste Gen bzw. das zweite Gen des VirD-Operons codiert (S.E. Stachel & E.W. Nester, "The genetic and transcriptional organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens". EMBO J. 5: 1445–1454 (1986)). Genetische Studien haben gezeigt, daß die T-Strangbildung durch Produkte des VirD-Operons vermittelt wird (Yanofsky et al., Cell 47: 471–477 (1986); Stachel et al., EMBO J. 6:857–863 (1987)). Insbesondere wurde gezeigt, daß die ersten und zweiten Gene des VirD-Operons Polypeptide codieren, die für die T-DNA-Randspaltung erforderlich sind (De Vos & Zambryski, Mol. Plant. Microbe Inter. 2:43–52 (1989); Filichkin & Gelvin, Mol. Microbiol. 8:915–926 (1993); Jayaswal et al., J. Bacteriol. 169: 5035–5045 (1987); Porter et al., Nucleic Acids Res. 15:7503–7515 (1987); Stachel et al., EMBO J. 6:857–863 (1987)). Diese Aktivität führt zur Erzeugung von einsträngigen Spaltungen (Brüchen "Nicks"), innerhalb der T-DNA-Randsequenzen (S.E. Stachel et al., "Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stage of T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells", Nature (London) 322: 706–712 (198); Yanofsky et al., Cell 47: 471–477 (1986); Wang et al., Science 235: 587–591 (1987); Albright et al., J. Baceteriol. 169: 1046–1055 (1987)). VirD1/VirD2 spalten die T-DNA-Randsequenz zwischen der dritten und der vierten Base. Sobald diese gebrochenen Moleküle erzeugt wurden, wird die Produktion der freien linearen ssDNA-Kopien des unteren Strangs der T-DNA (T-Strang) beobachtet (Stachel et al., Nature (London) 322: 706–712 (1986); Stachel et al., EMBO J. 6: 857–863 (1987)). VirD2 bleibt kovalent an das 5'-Ende der T-DNA gebunden (für eine Übersicht siehe J.R. Zupan & P. Zambryski, "Transfer von T-DNA from Agrobacterium to the plant cell", Plant Physiol. 107: 1041–1047 (1995)).
Studien einer VirD2-Mutante, die die C-terminalen 50 % von VirD2 verloren hat, haben gezeigt, daß nur die N-terminalen 50 % von VirD2 für das Brechen der T-DNA-Ränder erforderlich sind. Jedoch kann diese Mutante keine Tumoren in infizierten Pflanzen hervorrufen. Der C-Terminus scheint somit eine Rolle im Transfer von T-DNA in Pflanzenzellen zu haben (Übersicht in P.C. Zambryski, "Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story", Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465–490 (1992)). Diese Domäne enthält ein zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal (NLS) (Howard et al., Cell 68: 109–118 (1992)). Die biologische Relevanz der NLS-Sequenzen wurde durch die Beobachtung bestätigt, daß Agrobacterium ernsthaft in seiner Kanzerogenität reduziert wird, wenn die zwei Grundstrukturen des zweigeteilten NLS aus VirD2 deletiert werden (Shurvinton, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 11837–11841 (1992)).
VirD2 allein übt eine ortsspezifische DNA-Spaltungs-Verbindungsreaktion an einsträngiger DNA aus, was zeigt, daß dieses Protein katalytische Aktivität trägt, die für die DNA-Abspaltung erforderlich ist (Pansegrau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11538–11542 (1993)). Es wurde von Scheiffle et al. berichtet, daß die Kombination von VirD1 und VirD2 aus pTiC58 ausreichend ist, um die T-Rand-spezifische Spaltung in vitro zu katalysieren, J. Biol. Chemistry 270: 1269–1276 (1995) (aber siehe Jasper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 694–698 (1994)).
Eine Topoisomeraseaktivität vom Typ I wurde für VirD1-haltige Extrakte beschrieben (Ghai & Das, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 319–3113 (1989)). Diese Aktivität wurde VirD1 zugeschrieben und als erforderlich für das Entspannen der DNA vorgeschlagen, um sie zur Spaltung durch VirD2 vorzubereiten. Jedoch zeigte höher gereinigtes VirD1-Protein keine Topo isomeraseaktivität (Scheiffle et al., J. Biol. Chemistry 270:1269–1276 (1995)).
Eine Sequenzanalyse von VirD2 hat gezeigt, daß der N-Terminus zu 85 konserviert unter Stämmen von Agrobacterium ist, die Plasmide vom entweder Octopin-, Nopalin- oder rhizogenen Typ tragen (Hirayama et al., Mol. Gen. Genet. 213:229–237 (1988); Wang et al., J. Bacteriol. 172:4432–4440 (1990); Yanofsky et al., Cell 47:471–477 (1986)). Der C-Termius ist nur zu 25 konserviert, aber die höchste Ähnlichkeit besteht in den letzten 30 Aminosäuren mit den NLS-Signalen (Übersicht von Zambryski, 1992).
VirE: Wie hierin verwendet, wird "VirE" verwendet, um die aus dem Virulenz-(Vir)-E-Operon des Ti- und Ri-Plasmids stammenden Gene oder entsprechenden Proteine zu bezeichnen, die Funktionen bereitstellen, die für den T-DNA-Transfer erforderlich sind. Der Begriff "VirE2" wird hier verwendet, um das einsträngige DNA-(ssDNA)-bindende Protein zu bezeichnen, das als das Produkt des VirE2-Gens auf dem VirE-Operon identifiziert wurde (C. Gielt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 9006–9010 (1987); Citovsky et al., Science 240 501–504 (1988)). Es wird angenommen, daß VirE2 den T-Strang entlang seiner Länge umhüllt. Die Wechselwirkung dieses Proteins mit einsträngiger DNA ist unspezifisch. Das Nopalin-VirE2-Protein (Hirooka et al., J. Bacteriol. 169: 1529–1536 (1987)) und das Octopin-VirE2-Protein (Winans et al., Nucleic Acids Res. 15: 825–837 (1987)) enthalten Kernlokalisierungssignale. Es wird angenommen, daß das VirE2-Protein ein Hauptteil des T-Komplexes ist und im Kerntransport unterstützen könnte (für eine Übersicht siehe Zupan & Zambryski, Plant Physiol. 107: 1041–1047 (1995)). Transgene Pflanzen, die das VirE2-Gen exprimieren, können VirE-Mutanten von Agrobacterium ergänzen, was einen Nachweis liefert, daß das VirE2-Protein eine wichtige Rolle in der Pflanzenzelle spielt (für eine Übersicht siehe Zupan & Zambryski, Plant Physiol. 107: 1041–1047 (1995)).
VirC: Wie hier verwendet, wird "VirC" verwendet, um den VirC-Locus des Ti- und Ri-Plasmids zu bezeichnen, der zwei Polypeptide codiert, VirC1 und VirC2 (M.F. Yanofsy & E.W. Nester, "Molecular characterization of a host-range-determining locus from Agrobacterium tumefaciens", J. Bacteriol. 168: 237–243 (1986)). Es wurde gezeigt, daß dieser Locus das Brechen des T-DNA-Rands in Agrobacterium steigert (N. Toto et al., "Role of the overdrive sequence in T-DNA border cleavage in Agrobacterium", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 (22): 8558–8562 (1988)). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß VirC1 die T-Strang-Erzeugung in einem heterologen E. coli-System steigert, wenn die Produkte der VirD1- und VirD2-Gene beschränkend sind (G. De Vos & P. Zambryski, "Expression of Agrobacterium nopaline specific VirD1, VirD2 und VirC1 and their requirement for T-strand production in E. coli", Molec. Plant Microbe Inter. 2: 42–52 (1989)). Obwohl durch DNA-Affinitätschromatographie gezeigt wurde, daß VirC1 mit Octopin-Overdrive-Sequenzen wechselwirkt, ist die genaue Funktion von VirCi unbekannt. Es mag mit VirD1 und VirD2 oder mit dem Rand-Repeat und/oder der Overdrive-Sequenz assoziieren, um die Bruch- und T-Trans-Produktion zu fördern (N. Toto et al., "The Agrobacterium tumefaciens virC1 gene product binds to overdrive, a T-DNA transfer enhancer", J. Bacteriol. 171: 6845–6849 (1989)).
T-DNA-Ränder: Wie hier verwendet, soll "T-DNA-Ränder" unperfekte direkte Repeat-DNA-Sequenzen mit ca. 25 bp bezeichnen, die aufgrund ihrer Gegenwart an beiden Enden eines DNA-Fragments dazu führen, daß das Fragment als eine T-DNA erkannt wird und auf es durch Agrobacterium-Proteine eingewirkt wird. Die T-DNA-Ränder, die an einem Ende der T-DNA auftreten, werden nach Konvention als "links" oder "rechts" benannt. Die Konsensussequenz für den rechten Rand ist 5'-GNNTGNCAGGATATATNNNNNNGTNAN-3' (SEQ ID NO:1), und die Konsensussequenz für den linken Rand ist 5'-GGTGGCAGGATATATNNNNNNTGTAAA-3' (SEQ ID NO:2) (Jouanin et al., Plant Mol. Biol. 12:75–85 (1989)). Jede DNA zwischen diesen Rändern wird aus Agrobacterium auf die Pflanzenzelle übertragen (für eine Übersicht siehe P.C. Zambryski, "Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story", Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465–490 (1992)).
Studien des T-DNA-Gehalts aus unterschiedlichen transformierten Pflanzenlinien haben gezeigt, daß die Integration von T-DNA in das pflanzliche Genom häufig an (für den rechten Rand) oder nahe (für den linken Rand) dieser Rand-Repeats stattfindet (Slighton et al., EMBO J. 4: 3069–3077 (1985); Gheysen et al., Genes & Dev. 5: 287–297 (1991); Mayerhofer et al., EMBO J. 10: 697–704 (1991); Ohta et al., Plant J. 7: 157–164 (1995); Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 8467–8471 (1989)).
Trotz der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen linken und rechten Rändern haben Studien der Randfunktionen gezeigt, daß die T-DNA-Ränder differentiell verwendet werden. Die Deletion oder Inversion der rechten Randsequenz führt zu einem fast vollständigen Verlust des T-DNA-Transfers, wohingegen die Deletion des linken Rand-Repeats fast keine Wirkung hat (C.H. Shaw et al., "The right hand copy of the nopaline Ti plasmid 25 bp repeat is required for tumor formation", Nucleic Acids Res. 12: 6031–6041 (1984); G.C. Jen & M.-D. Chilton, "The right border region of pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border in promoting T-DNA transformation", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 3895–3899 (1986)). Genetische Analysen zeigen, daß der T-DNA-Transfer polar ist, wobei die Polarität durch die Orientierung der Rand-Repeats bestimmt wird (Wang et al., Cell 38: 455–462 (1984); Peralta and Ream, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5112–5116 (1985)). Dies beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, daß der T-Strang in einer Richtung von rechts nach links erzeugt wird (Albright et al., "Processing of the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens generates border nicks and linear, single-stranded T-DNA", J. Bacteriol. 16, 1046–1055 (1987)).
Der Sequenzzusammenhang der T-DNA-Ränder beeinflußt stark ihre Aktivität. Sequenzen, die den rechten Rand umgeben, steigern, und Sequenzen, die den linken Rand umgeben, vermindern den polaren DNA-Transfer (K. Wang et al., "Sequence context of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells", Mol. Gen. Genet. 210: 338–346 (1987)). Eine cis-aktive Sequenz mit 24 bp, als "Overdrive" bezeichnet, ist neben dem rechten Rand des Octopinplasmids vorhanden (Peralta et al., EMBO J. 5:1137–1142 (1986); Shurviton & Ream, J. Bacteriol. 173: 5558–5563 (1991)). Overdrive stimuliert den T-DNA-Transfer selbst dann, wenn es sich mehrere tausend Basenpaare entfernt vom Rand befindet (M.J.J. van Haaren et al., "Overdrive is a T-region transfer enhancer which stimulates T-strand production in A. tumefaciens", Nucleic Acids Res. 15: 8986–8997 (1987)). Jedoch kann es nicht selbst den T-DNA-Transfer vermitteln (E.G. Peralta et al., "Overdrive, a T-DNA-Transmission enhancer on the Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid" EMBO J. 5: 1137–1142 (1986); M.J.J. Van Haaren et al., "Functional analysis of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti-plasmid left and right T-region border fragment", Plant Mol. Biol. 8: 95–104 (1987)). Die Overdrive-Sequenz war ursprünglich in einer Region rechts des rechten Rand-Repeats von Octopin Ti-Plasmid-TL-DNA lokalisiert. Ähnliche Sequenzen befinden sich neben dem rechten Rand-Repeat der Octopin-pTI-TR-Region und den Agropin pRi-TL- und TR-Regionen (Slightom et al., "Nucleotide sequence analysis of TL-DNA Agrobacterium rhizogenes type plasmid. Indentification of open reading frames", J. Biol. Chem. 261: 108–121 (1986); Jouanin et al., "Analysis of TR-DNA junctions in the genome of a Convolvulus arvensis clone transformed with Agrobacterium rhizogenes strain A4", Plant Mol. Biol. 12: 75–85 (1989)). Der Vergleich von Sequenzen in der Nachbarschaft des rechten Rands zeigte eine als Kernsequenz bezeichnete Region mit 8 bp (5'-TGTTTGTT-3'), die in unterschiedlichen Abständen rechter Hand jedes rechten Rand-Repeats erscheint. Der rechte Rand von pRi8196-T-DNA vom Mannopin-Typ enthält keine Sequenz in bezug auf die Overdrive-Sequenz, sondern enthält eine unterschiedliche Sequenz mit 8 bp (5'-ATTAGTTC-3'), die 6-mal wiederholt wird (G. Hansen et al., "Agrobacterium rhizogenes pRi8196 T-DNA: Mapping and DNA sequence of functions involved in manopine synthesis and hairy root differentiation", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7763–7767 (1991)). Diese Sequenz ist tatsächlich funktionell äquivalent zu Overdrive (G. Hansen et al., "A T-DNA transfer enhancer sequence in the vicinity of the right border of Agrobacterium rhizogenes pRi8196", Plant Mol. Biol. 20: 113–122 (1992)). Es gibt keine Sequenz, die der Overdrive-Sequenz nahe Nopalin-T-DNA-Rändern stark ähnelt (K. Wang et al., "Sequence context on the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells", Mol. Gen. Genet. 210, 338–346 (1987)), aber dies schließt nicht aus, daß eine in dieser Region vorhandene Sequenz eine analoge Rolle spielt.
Die in den Beispielen verwendete rechte Randsequenz mit 25 bp stammt aus pTiAch5 (M.J.J. van Haaren, Plant Mol. Biol. 13: 523–531 (1989)). Der auf Plasmid pNeoRBluc vorhandene linke Rand stammt aus pTiT37 (Bevan, Nucleic Acids Res., 12: 8711–8721 (1984)).
Obwohl gezeigt wurde, daß Sequenzen, die zum rechten Rand benachbart sind, den Transfer von DNA auf die Pflanzenzelle steigern können, wurde eine minimale Länge der rechten Randsequenz in den in den Beispielen beschriebenen Experimenten gewählt, um eine mögliche Unterbrechung der Expression des Luciferase-Gens zu minimieren. Jedoch können längere rechte Randsequenzen, die eine verstärkerähnliche Sequenz wie Overdrive enthalten, verwendet werden.
Chimäre Gene, die in einer Pflanzenzelle ein Protein erzeugen können, das die Integration einer DNA von Interesse fördert, können unter Verwendung von Standardtechniken der Gentechnik konstruiert werden, wie die Beispiele veranschaulichen. Ein solches chimäres Gen wird aus einer DNA-Sequenz bestehen, die für das Protein codiert, funktionsfähig verbunden mit geeigneten regulatorischen Signalen (z.B. Promotor, Leitsequenz, Transkriptionsterminator, Polyadenylierungsort), die die Expression der funktionsfähig verbundenen codierenden Sequenz in einer Pflanzenzelle ausrichten. Solche codierenden Sequenzen und regulatorischen Signale werden auf diesem Gebiet gut beschrieben. Zur Verbesserung der Expression des die Integration fördernden Proteins kann eine synthetische Version der codierenden Sequenz verwendet werden, die zur Expression in der Zielpflanzenzelle optimiert ist.
mRNA, die in einer Pflanzenzelle ein Protein erzeugen kann, das die Integration fördert, kann unter Verwendung von Standardsystemen zur Herstellung von translatierbaren verkappten poly-A-mRNA-Transkripten hergestellt werden, die ein gewünschtes Protein codieren, wie die Beispiele veranschaulichen.
Es wird für den Fachmann leicht ersichtlich sein, daß die exogene DNA und chimäre Gene oder RNAs, die Proteine codieren, die die stabile Integration von exogener DNA fördern, für die Pflanzenzelle in einer Vielzahl von Wegen unter Verwendung von Standardtechniken bereitgestellt werden können, die auf diesem Gebiet verfügbar sind. Die genaue weise, in der diese Komponenten auf die Pflanzenzelle übertragen werden, ist nicht kritisch, solange die Proteine (das Protein), die die stabile Integration der exogenen DNA fördern, in der gleichen Zelle mit dem exogenen DNA-Fragment während des relevanten Zeitraums wie nachfolgend beschrieben erzeugt werden.
Zum Erreichen der vorteilhaften Wirkung der Förderung der stabilen Integration des exogenen DNA-Fragments in intakter Form ist es nicht notwendig, daß die Proteine, die diese Wirkung bereitstellen, in der Pflanzenzelle entweder erzeugt werden, bevor das exogene DNA-Fragment für die Pflanzenzelle bereitgestellt wird, oder nachdem die exogene DNA in die Pflanzenzelle integriert wurde. Stattdessen ist es nur notwendig, daß diese Proteine in der Pflanzenzelle erzeugt werden, so daß sie in ausreichenden Mengen während des Übergangszeitraums vorhanden sind, nachdem das exogene DNA-Fragment für die Pflanzenzelle bereitgestellt wird und bevor die exogene DNA integriert wurde. Jeder Ansatz, der der Pflanzenzelle ein chimäres Gen oder translatierbare RNA bereitstellt, so daß das codierte Protein während dieses relevanten Zeitraums erzeugt wird, kann verwendet werden.
Wie die hier bereitgestellten Beispiele veranschaulichen, besteht ein Weg zum Erreichen der Produktion von ausreichenden Mengen dieser Proteine während des relevanten Zeitraums in der Einführung des chimären Gens oder von translatierbarer RNA, die das Protein codiert, in die Pflanzenzelle zusammen mit dem exogenen DNA-Fragment (d.h. gleichzeitige Übertragung der Komponenten). Dieser Ansatz ist bevorzugt, weil er eine einzelne Übertragung von Nukleinsäuremolekülen (DNA oder DNA und RNA) auf die Pflanzenzelle beinhaltet, auf die die Transformation abzielt. Ein anderer poten tieller vorteilhafter Aspekt dieses Ansatzes besteht darin, daß er zum Erreichen einer vorübergehenden Produktion des die Integration fördernden Proteins während des relevanten Zeitraums anstelle einer stabilen Produktion verwendet werden kann, die das normale Wachstum und die Entwicklung der Pflanzenzelle nachteilig beeinflussen könnte.
In einem Aspekt wird die vorliegende Erfindung verwendet, um eine stabile Transformation einer Pflanzenzelle mit einem durch T-DNA-Ränder gebundenen intakten exogenen DNA-Fragment zu erreichen, ein Ergebnis, das die Agrobacterium-vermittelte T-DNA-Transformation nachahmt. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die folgenden Komponenten für die Pflanzenzelle bereitgestellt, auf die die Transformation abzielt:

(a) das exogene DNA-Fragment von Interesse, das in das pflanzliche Zellgenom integriert werden soll, wobei das Fragment durch ein oder mehrere T-DNA-Ränder gebunden ist (ein einzelner T-DNA-Rand kann ausreichend sein, um den T-DNA-Transfer zu bewirken, insbesondere einer ringförmigen T-DNA, in der ein Rand sowohl rechten als auch linken Randfunktionen dienen kann); und
(b) wenigstens ein chimäres Gen oder RNA, wobei jedes solche chimäre Gen oder RNA in der Pflanzenzelle ein aus Agrobacterium stammendes Protein erzeugen kann, das entweder allein oder in Kombination mit anderen solchen Proteinen die stabile Integration des exogenen DNA-Fragments in intakter Form fördert.

Das aus Agrobacterium stammende Protein, das in der Pflanzenzelle gemäß diesem Aspekt der Erfindung erzeugt wird, schließt ohne Beschränkung Proteine ein, die aus der Virulenzregion des Ti- oder Ti-Plasmids eines Agrobacteriums stammen. Insbesondere schließt dies VirC1, VirC2, VirD1, VirD2 und VirE2 ein. Bevorzugt sind die erzeugten Proteine VirD2-Protein oder eine Kombination aus VirD2 mit entweder VirD1, VirE1 oder sowohl VirD1 als auch VirE2. Die Expression der aus Agrobacterium stammenden Proteine in der Pflanzenzelle verursacht die Integration der exogenen DNA als intaktes Fragment mit vorhersagbaren Endpunkten. Die resultierende transformierte Pflanzenzelle weist ein in ihr Genom integriertes exogenes DNA-Fragment auf, das einer T-DNA von Agrobacterium ähnelt.
Chimäre Gene, die ein aus Agrobacterium stammendes Protein der Erfindung in einer Pflanzenzelle erzeugen können, können unter Verwendung von Standardtechniken der Gentechnik konstruiert werden, wie die Beispiele veranschaulichen. Ein solches chimäres Gen wird aus einer DNA-Sequenz bestehen, die für das aus Agrobacterium stammende Protein codiert, funktionsfähig verbunden mit den geeigneten regulatorischen Signalen (zum Beispiel Promotor, Leitsequenz, Transkriptionsterminator, Polyadenylierungsort), die die Expression der funktionsfähig verbundenen codierenden Sequenz in einer Pflanzenzelle ausrichten. Solche codierenden Sequenzen und regulatorischen Signale sind auf dem Gebiet leicht erhältlich. Die codierenden VirD1- und VirD2-Sequenzen, die in den Beispielen verwendet werden, werden in GenBank als Eingangs-Nr. M14762 bereitgestellt.
RNA, die ein aus Agrobacterium stammendes Protein der Erfindung in einer Pflanzenzelle erzeugen kann, kann unter Verwendung von Standardsystemen zur Herstellung von translatierbaren verkappten poly-A-mRNA-Transkripten hergestellt werden, die ein gewünschtes Protein codieren, wie die Beispiele veranschaulichen.
Das exogene DNA-Fragment, auf das zur Integration gemäß diesem Aspekt der Erfindung abgezielt wird, kann jedes DNA-Fragment sein, das der Fachmann in intakter Form in das pflanzliche Zellgenom integrierten möchte, wie zum Beispiel ein chimäres Gen, das zur Expression einer besonderen biologisch wirksamen RNA (z.B. Antisense-RNA oder Ribozym) oder eines Proteins von Interesse in der Pflanzenzelle oder resultierenden Pflanze oder Pflanzenzellkultur geschaffen wird. Die einzige Anforderung besteht darin, daß das Fragment durch ein oder mehrere T-DNA-Ränder gebunden ist, so daß es durch die VirD1- und VirD2-Proteine erkannt und darauf eingewirkt werden kann. Die Bindung solcher T-DNA-Ränder an ein exogenes DNA-Fragment wird in Beispiel 1 beschrieben.
Der beschriebene Transformationsprozeß führt zu einem vollständigen Satz oder einer Sammlung von transformierten Zellen, die gewöhnlich durch die Expression eines Markergens identifiziert werden. Die Regeneration der Zellen zu Pflanzen liefert dann einen vollständigen Satz oder eine Sammlung von transformierten Pflanzen. Der vollständige Satz von sowohl transformierten Pflanzenzellen als auch transformierten regenerierten Pflanzen kann durch die Natur ihrer Integrationsereignisse gekennzeichnet werden. Ein Satz von Zellen oder Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung ist durch mehr als 5 % an individuellen Pflanzenzellen oder Pflanzen gekennzeichnet, die die DNA von Interesse umfassen, gebunden an genomische DNA durch rechte T-DNA-Randsequenzen von Agrobacterium, als ob sie unter Verwendung von Agroinfektion transformiert worden wären. Bevorzugt ist der Prozentanteil mehr als 10 %. Allgemein wird ein Prozentanteil von 5 bis 70 % und besonders bevorzugt von 10 bis 50 % beobachtet. Ein Satz von transformierten Pflanzenzellen oder Pflanzen beruht normalerweise auf 10 oder mehr unab hängigen Transformationsereignissen. Bevorzugt wird ein einzelnes physikalisches Transformationsexperiment zu mehr als 20, 30, 40 oder 50 unabhängigen Transformationsereignissen führen. Die Sätze von transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen sowie die Nachkommenschaft ihrer individuellen Pflanzenzellen oder Pflanzen stellen einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
Potentielle Pflanzenziele schließen sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen oder Pflanzenzellen ein, insbesondere landwirtschaftlich wichtige Nutzpflanzen wie Mais und andere Getreideanbauten wie Weizen, Hafer, Roggen, Sorghum, Reis, Gerste, Hirse, Rasen und Futtergräser und dgl. sowie Baumwolle, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Ölraps, Bananen, Pappel, Walnuß, Tabak und Sojabohnen.
Jeder Typ oder jede Quelle von Pflanzezellen, die als Ziel zur Transformation durch einen oder mehrere der verschiedenen biologischen und nicht-biologischen Übertragungsmechanismen dienen kann, die auf diesem Gebiet verfügbar sind, kann auch als Ziel zur erfindungsgemäßen Transformation dienen. Dies schließt ohne Beschränkung unreife und reife Embryos, Pollen, Protoplasten, Suspensionskulturzellen, Kalluszellen, Keimblätter oder andere Samen- und Sämlingsteile und Blätter oder Blattstücke ein.
Durch das Verfahren der Erfindung erhaltene transformierte Pflanzenzellen werden eine integrierte intakte exogene DNA von Interesse enthalten. Diese integrierte exogene DNA kann partielle T-DNA-Randsequenzen einschließen, die typischerweise auf integrierter DNA nach einem T-DNA-Insertionsereignis bewahrt werden. Durch das Verfahren der Erfindung erhaltene transformierte Pflanzenzellen können zur Erzeugung von transgenen Pflanzenzellkulturen und fruchtbaren transgenen Pflanzen gemäß fachbekannten Standardverfahren verwendet werden.
Somit ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer fruchtbaren transgenen Pflanze mit einem exogenen DNA-Fragment, gebunden durch T-DNA-Randsequenzen, das stabil in intakter Form in ihr Genom integriert ist, umfassend:

a) Transformieren oder Integrieren der exogenen DNA in das Genom einer Pflanzenzelle gemäß dem Verfahrender Erfindung; und
b) Regenerieren der Pflanzenzelle aus Schritt (a) zur Erzeugung der fruchtbaren transgenen Pflanze.

Bevorzugt wird die fruchtbare transgene Pflanze aus der Gruppe ausgewählt, die aus Tabak, Baumwolle, Ölraps, Sojabohne, Mais, Weizen und Reis besteht.
Die in die transgenen Pflanzen und daraus stammenden Samen manipulierten genetischen Eigenschaften werden durch geschlechtliche Fortpflanzung oder vegetatives Wachstum weitergegeben und können somit in Nachkommenschaftspflanzen aufrechterhalten und vermehrt werden. Allgemein macht die Aufrechterhaltung und Vermehrung Gebrauch von bekannten landwirtschaftlichen Verfahren, die entwickelt werden, um den spezifischen Zwecken zu entsprechen, wie Beackern, Säen oder Ernten. Spezialisierte Prozesse wie Hydrokultur oder Gewächshaustechniken können auch eingesetzt werden. Da der wachsende Anbau für Befall und Schädigungen, die durch Insekten oder Infektionen verursacht werden, sowie für Konkurrenz durch Unkrautpflanzen anfällig ist, werden Maßnahmen ergriffen, um Unkräuter, Pflanzenkrankheiten, Insekten, Nematoden und andere nachteilige Bedingungen zu bekämpfen, um den Ertrag zu verbessern. Diese schließen mechanische Maßnahmen wie das Pflügen des Bodens und der Entfernung von Unkräutern und infizierten Pflanzen sowie die Ausbringung von Agrochemikalien wie Herbiziden, Fungiziden, Gametoziden, Nematoziden, Wachstumsregulatoren, Reifungsmitteln und Insektiziden ein.
Gebrauch von den vorteilhaften genetischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und Samen kann ferner in der Pflanzenzüchtung gemacht werden, die auf die Entwicklung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften wie Toleranz für Schädlinge, Herbizide oder Streß, verbesserter Nährwert, erhöhter Ertrag oder verbesserte Struktur, die weniger Verlust durch Umlegen oder Zerfallen verursacht, abzielt. Die verschiedenen Züchtungsschritte sind durch einen wohldefinierten menschlichen Eingriff wie Selektion der zu kreuzenden Linien, Ausrichten der Bestäubung der Elternlinien oder Selektion geeigneter Nachkommenschaftspflanzen gekennzeichnet. Abhängig von den gewünschten Eigenschaften werden unterschiedliche Züchtungsmaßnahmen ergriffen. Die relevanten Techniken sind allgemein fachbekannt und schließen ohne Beschränkung Hybridisierung, Inzucht, Rückkreuzungszüchtung, Mehrfachlinienzüchtung, Sortenmischung, interspezifische Hybridisierung, aneuploide Techniken etc. ein. Hybridisierungstechniken schließen auch Sterilisierung von Pflanzen ein, um männlich- oder weiblich-sterile Pflanzen durch mechanische, chemische oder biochemische Mittel zu liefern. Die Kreuzbestäubung einer männlich-sterilen Pflanze mit Pollen einer unterschiedlichen Linie stellt sicher, daß das Genom der männlich-sterilen, aber weiblich-fruchtbaren Pflanze gleichförmig Eigenschaften beider Elternlinien erhalten wird. Somit können erfindungsgemäße transgene Samen und Pflanzen für die Züchtung von verbesserten Pflanzenlinien verwendet werden, die zum Beispiel die Wirksamkeit herkömmlicher Verfahren wie die Herbizid- oder Pestizidbehandlung erhöhen oder es erlauben, auf die Verfahren aufgrund ihrer modifizierten genetischen Eigenschaften zu verzichten. Alternativ können neue Anbauten mit verbesserter Streßtoleranz erhalten werden, die aufgrund ihrer optimierten genetischen "Ausrüstung" ein Ernteprodukt besserer Qualität als Produkte liefern, die vergleichbare nachteilige Entwicklungsbedingungen nicht tolerieren konnten.
Bei der Saatgutproduktion sind Keimungsqualität und Gleichförmigkeit der Samen wesentliche Produkteigenschaften, wohingegen Keimungsqualität und Gleichförmigkeit von Samen, die vom Landwirt geerntet und verkauft werden, nicht wichtig sind. Da es schwierig ist, einen Anbau frei von anderen Anbau- und Unkrautsamen zu halten, um saatgutbürtige Krankheiten zu bekämpfen, und Saatgut mit guter Keimung zu erzeugen, wurden relativ umfangreiche und wohldefinierte Saatgutproduktionspraktiken durch die Saatguterzeuger entwickelt, die Erfahrung auf dem Gebiet der Züchtung, Konditionierung und Vermarktung von reinem Saatgut haben. So ist es allgemeine Praxis für den Landwirt, zertifiziertes Saatgut zu kaufen, das spezifische Qualitätsstandards erfüllt, anstelle Saatgut zu verwenden, das aus seinem eigenen Anbau geerntet wurde. Vermehrungsmaterial zur Verwendung als Samen wird herkömmlich mit einem Schutzmittelüberzug behandelt, der Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematozide, Molluskizide oder Mischungen daraus umfaßt. Herkömmlich verwendete Schutzmittelüberzüge umfassen Verbindungen wie Captan, Carboxin, Thiram (TMTD^®), Methalaxyl (Apron^®) und Pirimiphos-methyl (Actellic^®). Nach Wunsch werden diese Verbindungen zusammen mit weiteren Trägern, Tensiden oder ausbringungsfördernden Hilfsstoffen formuliert, die herkömmlich auf dem Gebiet der Formulierung eingesetzt werden, um Schutz gegen Schädigung bereitzustellen, die durch bakterielle, pilzliche oder tierische Schädlinge verursacht wird. Die Schutzmittelüberzüge können durch Tränken von Fortpflanzungsmaterial mit einer flüssigen Formulierung oder durch Beschichten mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung aufgebracht werden. Andere Aufbringungsverfahren sind auch möglich, wie zum Beispiel die auf die Knospen oder die Früchte gerichtete Behandlung.
Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, neue landwirtschaftliche Verfahren wie die oben exemplarisch dargestellten Verfahren bereitzustellen, die durch die Verwendung von transgenen Pflanzen, trans genem Pflanzenmaterial oder transgenem Saatgut gemäß der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet sind.
Es wird für den Fachmann leicht ersichtlich sein, daß die Komponenten dieses Verfahrens (d.h. die exogene DNA und die chimären Gene oder RNAs, die Proteine codieren, die die Integration der exogenen DNA fördern) für die Pflanzenzelle in einer Vielzahl von Wegen unter Verwendung von auf diesem Gebiet verfügbaren Standardtechniken bereitgestellt werden können. Die genaue Weise, auf die diese Komponenten für die Pflanzenzelle bereitgestellt werden, ist nicht kritisch, solange die Proteine, die die stabile Integration der exogenen DNA fördern, während des relevanten Zeitraums wie oben beschrieben erzeugt werden.
Die genaue Menge jeder Komponente, die für die Pflanzenzelle bereitgestellt wird, ist gleichsam nicht kritisch und kann in Abhängigkeit von der Art und weise, in der die Komponente übertragen wird, variieren. Nach Wunsch kann der Fachmann routinemäßig die Menge jeder bereitgestellten Komponente variieren, um das optimale Maß für jede unter Verwendung eines besonderen Übertragungssystems zu bestimmen. Eine erfolgreiche Kombination wird in Beispiel 1 beschrieben und kann als Ausgangspunkt für eine weitere Optimierung dienen.
Die Übertragung der Komponenten dieses Verfahrens auf die Pflanzenzelle kann durch eine Vielzahl von Techniken erreicht werden, die auf diesem Gebiet für die Übertragung von Nukleinsäuren auf Pflanzenzellen verfügbar sind, die ohne Beschränkung biologische Mechanismen wie die Agrobacterium-vermittelte T-DNA-Transformation (siehe z.B. WO 95/35388 mit dem Titel "Plant Genetic Transformation Methods and Transgenic Plants") und nicht-biologiche Mechanismen wie Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation, Mikroinjektion, induzierte Aufnahme und Aerosolstrahlinjektion einschließen.
In einem bevorzugten Ansatz wird ein einzelnes Verfahren zur Übertragung aller Komponenten dieses Verfahrens (d.h. die exogene DNA und die chimären Gene oder RNAs, die Proteine codieren, die die Integration der exogenen DNA fördern) auf die Empfängerpflanzenzelle verwendet.
Es wird erwartet, daß mRNA, die ein integrationsförderndes Protein codiert, übertragen gemäß der Erfindung, das codierte Protein in der Pflanzenzelle für einen endlichen Zeitraum erzeugt, bevor sie abgebaut wird. Es wird erwartet, daß das von dieser mRNA erzeugte Protein in der Pflanzenzelle für einen endlichen Zeitraum verbleibt, bevor es auch durch normale zelluläre Prozesse abgebaut wird. Somit können diese Proteine vorübergehend auf die Pflanzenzelle in Form von RNA gemäß dem Verfahren der Erfindung übertragen werden. Die vorübergehende Übertragung dieser Proteine kann in denjenigen Situationen bevorzugt sein, in denen die fortgesetzte Gegenwart solcher Proteine unerwünschte Wirkungen haben kann. Die gleiche Wirkung kann durch Übertragen eines chimären Gens erreicht werden, daß ein integrationsförderndes Protein in einer Form codiert, die nicht leicht in das pflanzliche Zellgenom in einer funktionellen Form integrieren kann.
In Fällen, in denen die integrationsfördernden Proteine für die Zelle über ein chimäres Gen bereitgestellt werden, werden die jeweiligen chimären Gene bevorzugt neben dem exogenen DNA-Fragment als separate DNA-Moleküle zusammen übertragen, obwohl die unterschiedlichen Komponenten kombiniert und als einzelnes DNA-Molekül übertragen werden können. Die Übertragung als separate DNA-Moleküle erlaubt die Variation und Optimierung des Verhältnisses von chimärem Gen zu exogenem DNA-Fragment. Es ist auch wahrscheinlich zweckmäßiger, diese Konstrukte auf separaten Molekülen zu konstruieren.
Man kann erwarten, daß die stabile Aufnahme solcher chimären Gene in das Genom über eine zufällige Integration mit einer meßbaren Häufigkeit relativ zur gerichteten Integration der durch T-DNA-Ränder gebundenen exogenen DNA erfolgt. Zur Erleichterung der Trennung solcher zufälligen Integrationsereignisse von der gerichteten Integration der exogenen DNA können die chimären Gene, die die integrationsfördernden Proteine codieren, bevorzugt als einzelnes DNA-Molekül getrennt von der exogenen DNA übertragen werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes werden Kopien der chimären Gene wahrscheinlich an einem unterschiedlichen Locus von der gerichteten Integration der durch T-DNR-Ränder gebundenen exogenen DNA integriert. Im Ergebnis wird die Trennung der gerichteten Integrationsereignisse, die die exogene DNA beinhalten, von den zufällig integrierten VirD1- und VirD2-Genen durch anschließende Züchtung von Pflanzen, die aus den transformierten Pflanzezellen stammen, leicht erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein pflanzlicher viraler Vektor als Träger zur Übertragung des chimären DNA-Gens oder der RNA, die das integrationsfördernde Protein codiert, auf die Pflanzenzelle verwendet. Solche Vektoren können aus pflanzlichen DNA-Virus-Replikons wie Geminivirus-Replikons (M. Ugaki, Nucleic Acids Research 19: 371–377 (1994)) und RNA-Virusvektoren (R.W. Sablowski, Proc.Natl. Acad. Sci. 92: 6901–6907 (1995)) zur Aufnahme und Expression einer gewünschten DNA oder RNA in einer Pflanzenzelle konstruiert werden. Da sich diese Vektoren typischerweise in der Zielpflanzenzelle vermehren, wird eine Amplifikation des chimären Gens oder der RNA, die zu solchen Vektoren manipuliert ist, und eine Zunahme des daraus erzeugten Proteins erreicht. Auch wird nicht erwartet, daß virale Vektoren dieses Typs in das Genom der Pflanzezelle integrieren, weil die viralen Replikons, aus denen sie stammen, normalerweise dies nicht tun. Somit hat dieses Verfahren die Vorteile der vorübergehenden Erzeugung großer Mengen der integrationsfördernden Proteine, während das Risiko der Integration von chimären Genen, die solche Proteine codieren, reduziert wird. Es kann auch vorteilhaft sein, solche viralen Vektoren systemisch zu verwenden, um zuvor Pflanzenzellen, auf die für die Transformation abgezielt wird, zu infizieren. Dieser Ansatz erlaubt die Übertragung der zur Integration gewünschten exogenen DNA in höheren Mengen durch Vermeidung der Notwendigkeit, DNA oder RNA, die die integrationsfördernden Proteine codieren, zusammen zu übertragen.
Ein pflanzlicher viraler Vektor kann auch als Träger zur Übertragung des exogenen DNA-Fragments, auf das für die Integration abgezielt wird, auf die Pflanzenzelle verwendet werden. Da sich diese Vektoren typischerweise in der Zielpflanzenzelle vermehren, amplifiziert ihre Verwendung in dieser Weise die Anzahl von exogenen DNA-Fragmentmatrizen, die für die Integration verfügbar sind.
Wenn ein pflanzlicher viraler Vektor verwendet wird, um sowohl das exogene DNA-Fragment, auf das für die Integration abgezielt wird, als auch chimäre Gen, das das integrationsfördernde Protein codiert, auf die Pflanzenzelle zu übertragen, kann der gleiche virale Vektor zur Übertragung beider Komponenten verwendet werden, oder zwei separate virale Vektoren können verwendet werden. Wenn die Agrobacterium-vermittelte Transformation die zur Übertragung des viralen Vektors (der Vektoren) auf die Pflanzenzelle verwendete Technik ist, dann ist der Ansatz als "Agroinfektion" bekannt (siehe Grimsley et al., Nature 325: 177–179 (1987)).
Als eine alternative zur gemeinsamen Übertragung der chimären Gene, die die integrationsfördernden Proteine codieren, mit der exogenen DNA kann die exogene DNA auf eine transgene Pflanzenzelle übertragen werden, die bereits diese chimären Gene stabil in ihr Genom aufgenommen enthält. Transgene Pflanzen oder transgene Pflanzenzellkulturen, die durch Transformation unter Verwendung von Standardtechniken mit DNA-Molekülen erzeugt werden, die chimäre Gene einschließen, die integrationsfördernde Proteine codieren, können als Quelle für solche transgenen Pflanzenzellen verwendet werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können gerichtete Integrationsereignisse, die die exogene DNA beinhalten, von den stabil integrierten chimären Genen durch anschließende Züchtung von Pflanze getrennt werden, die aus den transformierten Pflanzenzellen stammen (siehe z.B. R. Peerbolte et al., "Transformation of plant protoplasts with DNA: contransformation of non-selected calf thymus carrier DNA and meiotic segregation of transforming DNA sequences", Plant Mol. Biol. 5 (4): 235–246 (1985)).
Obwohl die vorliegende Erfindung hier in bezug auf die Transformation einer einzelnen Pflanzenzelle beschrieben wird, wird der Fachmann einsehen, daß die Übertragungsverfahren, auf denen die Erfindung beruht (ausgenommen Mikroinjektion), typischerweise auf eine Population von Pflanzenzellen in Form einer Zellkultur, eines Kallus oder eines aus einer ganzen Pflanze ausgeschnittenen Gewebes angewendet werden. Als Ergebnis wurde eine Vielzahl von Techniken zur Verwendung in Verbindung mit diesen Übertragungsverfahren zur Identifizierung und/oder Selektion stabil transformierter Pflanzenzellen aus einer gemischten Population von transformierten und untransformierten Pflanzenzellen entwickelt (z.B. R. Dekeyser et al., "Evaluation of selectable markers for rice transformation", Plant Physiol. 90(1): 217–223 (1989)). Diese Techniken können auch in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung in der gleichen Weise verwendet werden. In bezug auf die exogene DNA-Komponente wird erwogen, daß die Transformation von Pflanzenzellen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung nicht-biologischer Übertragungsverfahren in zwei grundsätzlichen Typen von Integrationsereignissen resultiert: (1) einfache Insertion des intakten exogenen DNA-Fragments, das durch T-DNA-Ränder gebunden ist, gerichtet durch die Gegenwart von Protein(en), das (die) solche Integrationsereignisse fördern, und (2) zufällige Insertion von verschiedenen Anteilen und Permutationen der exogenen DNA, die charakteristisch für das verwendete nicht-biologische Übertragungsverfahren sind. Diese zwei Typen von Integrationsereignissen können leicht durch Einsatz standardmäßiger molekularer Analysewerkzeuge auf die genomische DNA der transformierten Pflanzenzelle unterschieden werden, wie zum Beispiel Southern-Blot-Hybridisierung von beschränkter genomischer DNA unter Verwendung des exogenen DNA-Fragments oder von Subfragmenten davon als Sonde, Techniken auf Basis von Polymerasekettenreaktion (PCR), die zur Detektion der Gegenwart: des exogenen DNA-Fragments in intakter Form geschaffen sind. Für Pflanzenzellen, die beide Typen der Insertionsereignisse enthalten, können solche Ereignisse in transgenen Pflanzen, die daraus abstammen, durch herkömmliche Züchtungsansätze getrennt werden. Unter Verwendung dieser Werkzeuge können transgene Pflanzenzellen oder Pflanzen mit einer einfachen Insertion des intakten exogenen DNA-Fragments, das durch T-DNA-Ränder gebunden ist, ausgehend von der Anwendung der vorliegenden Erfindung, identifiziert und verwendet werden, um transgene Pflanzenzellkulturen und/oder transgene Pflanzen und Nachkommenschaft zu erzeugen.
Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf verbesserte Integrationssysteme auf Basis des Agrobacterium-T-DNA-Transfersystems beschränkt ist. Zusätzliche Systeme, die integrationsfördernde Proteine und Erkennungssequenzen verwenden, die analog zu den Vir-Proteinen und T-DNA-Rändern sind, können erfindungsgemäß modifiziert werden, um die Häufigkeit von einfachen Integrationsereignissen in einer Pflanzenzelle zu verbessern, auf die für die Transformation abgezielt wird. Zum Beispiel legen akkumulierte Daten nahe, daß eine enge Beziehung zwischen dem T-DNA-Transfer von Agrobacterium auf Pflanzen und der Plasmid-vermittelten bakteriellen Konjugation besteht. Sequenzverwandtschaften wurden gefunden zwischen (i) den Nick-Regionen von T-Rändern und dem incP-Transferursprung; (ii) Genklustern des virD-Operons und Relaxase-Operons (TraI/TraJ). TraI und VirD2 sowie ihre Ziele – die RP4 oriT-Nick-Region bzw. T-Rand-Repeats – teilen signifikante Ähnlichkeiten (siehe WO 88/03564 mit dem Titel "Plant Transformation"). In vitro sind TraI und VirD2 jeweils ausreichend, um Brüche in einsträngigen Oligonukleotiden zu erzeugen, die ihre jeweiligen erkennenden Nick-Orte tragen (siehe Pansegrau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:11538–11542 (1993)). In Gegenwart eines Überschusses von Spaltprodukten können sowohl TraI als auch VirD2 die entgegengesetzte Reaktion katalysieren, wodurch zwei Stücke von einsträngiger DNA verbunden werden. VirD2 kann auch die Spaltung von oriT katalysieren. Funktionelle Ähnlichkeiten wurden auch zwischen den Geminivirus-Rep-Proteinen oder Proteinen, die an der Replikation von bakteriellen Phagen und Plasmiden durch den rollenden Kreis beteiligt sind, und andererseits Proteinen gefunden, die am bakteriellen konjugativen DNA-Transfer oder am Transfer und an der Integration der T-DNA aus Agrobacterium in das pflanzliche Genom teilnehmen (F. Heyraud-Nitschke et al., Nucl. Acids Res. 910–916 (1995)).
Beschreibung der Zeichnungen
1(A–B): In den in Beispiel 1 beschriebenen Experimenten verwendete Plasmidstrukturen werden gezeigt. Komponenten dieser Plasmide werden im Abschnitt Materialien und Methoden von Beispiel 1 beschrieben. RB entspricht der rechten Randsequenz mit 25 bp. Restriktionsorte sind wie folgt angegeben: E = EcoRI, P = PstI.
2: Ein schematisches Diagramm des pNeoRBLuc-Plasmids wird bereitgestellt. LB, linker Rand; RB rechter Rand. Die oberen Kästen oberhalb des Diagramms geben die für die Southern-Blot-Analyse von Transformanten verwendeten Sonden an. Restriktionsorte sind wie folgt angegeben: E = EcoRI; P = Pst; X = XbaI, H = HindIII. "NOS" bezeichnet den Nopalinsynthasepromotor. "NPTII" bezeichnet das offene Leseraster von Neomycinphosphotransferase II. "NOS T" bezeichnet den Nopalinsynthaseterminator. "CaMV 35S" bezeichnet den 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV). "LUC" bezeichnet das offene Leseraster für Luciferase. "35S T" bezeichnet den Terminator des CaMV 35S-Transkripts.
3: Eine Sequenzanalyse von pflanzlichen DNA-Zielorten nach Transformation mit pNeoRBLuc-, p35SD1- und p35SD2-Plasmiden wird bereitgestellt. Zahlen bezeichnen die Bestimmungsnummern der Zielklone. Die von pNeoRBLuc getragene rechte Randsequenz ist in Kleinbuchstaben geschrieben (Zeile Rb.junction). Die Pflanzenzielsequenzen von Fragment 1, 2a, 3 bzw. 5 zeigen 100 % Homologie mit PSII von Tabak (X62426; nt 908), 100 % mit NtpII10 von Tabak (X70088; nt 573), 100 % mit Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase von Tabak (X02353; nt 2174) und 80 % Homologie mit einem Chlorophyll-bindenden Protein von Petunia (M21317; nt 1013).
4(A–F): Karten von in den Beispielen 3 und 4 verwendeten Plasmiden werden bereitgestellt. Die verwendeten Abkürzungen werden im Abschnitt "Materialien und Methoden" von Beispiel 3 beschrieben.
5(A–B): Schematische Darstellung der in Beispiel 5 verwendeten Plasmide pwAdhD1, pwAdhD2, pwBarRBLuc und pBARRBLuc.
6: Schematische Darstellung von Plasmid pCIB1711 (siehe Beispiel 1).
7: Schematische Darstellung von Plasmid pCIB1711deltaB (siehe Beispiel 7).
8: Schematische Darstellung von Plasmid pCIB1711deltaB-H,N (siehe Beispiel 7).
9: Schematische Darstellung von Plasmid pCIB1711-H,N-B (siehe Beispiel 7).
10: Schematische Darstellung von Plasmid pCIB1711-H,N (siehe Beispiel 7).
11: Schematische Darstellung von Plasmid pBS-NC (siehe Beispiel 7).
12: Schematische Darstellung von Plasmid pB5-NC-RB (siehe Beispiel 7).
13: Schematische Darstellung von Plasmid UbiPATdl (siehe Beispiel 7).
14: Schematische Darstellung von Plasmid LB.UbiPATdl (siehe Beispiel 7).
15: Schematische Darstellung von Plasmid pAVM1 (siehe Beispiel 7).
16: Schematische Darstellung von Plasmid p35SD2 (siehe Beispiel 8).
17(A–B): Schematische Darstellung der Herstellung der Fragmente A-C aus dem EcoRI-Fragment von p35SD2, das das offene Leseraster von VirD2 enthält (siehe Beispiel 8).
18: Schematische Darstellung von Plasmid pTC182 (siehe Beispiel 8).
19: Schematische Darstellung von Plasmid pTC182-A (siehe Beispiel 8).
20: Schematische Darstellung von Plasmid pTC182-A-B (siehe Beispiel 8).
21: Schematische Darstellung von Plasmid pUC21 (siehe Beispiel 8).
22: Schematische Darstellung von Plasmid pC21-X (siehe Beispiel 8).
23: Schematische Darstellung von Plasmid ppUC21-C (siehe Beispiel 8).
24: Schematische Darstellung von Plasmid pUC21-VirD2 (siehe Beispiel 8).
25: Schematische Darstellung von Plasmid T7polyA (siehe Beispiel 8).
26: Schematische Darstellung von Plasmid T7virD2polyA (siehe Beispiel 8).
Beispiele
Standardmäßige rekombinante DNA- und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet werden, sind allgemein fachbekannt und werden beschrieben von J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) und von T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).
Beispiel 1: "Agrolistische" Transformation von Pflanzenzellen: Integration von in der Pflanze erzeugten T-Strängen nach biolistischer Übertragung von VirD1- und VirD2-Genen und eines selektierbaren Markergens mit T-DMA-Rand
A. Zusammenfassung
Die Virulenzgene VirD1 und VirD2 sind zum Ausschneiden von T-Strängen aus dem Ti-Plasmid in Agrobacterium tumefaciens vor der Übertragung auf Wirtspflanzenzellen erforderlich, wo T-DNA in die pflanzliche Kern-DNA inseriert. wir haben die biolistische Übertragung von Plasmid-DNAs eingesetzt, um auf Bindung und/oder ortsspezifisches Brechen ("Nicking") einer T-DNA- Randsequenz durch VirD1 und VirD2 in der Pflanze zu untersuchen. Gold-Mikroprojektile wurden mit einer Mischung aus 3 Plasmiden beschichtet, die VirD1- bzw. VirD2-codierende Regionen unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors und ein Testgen enthielten, das eine rechte Randsequenz enthielt, inseriert zwischen dem CaMV35S-Promotor und der Luciferase-codierenden Region. Wir maßen die transiente Luciferase-Expression, um auf Integrität und transkriptionelle Verfügbarkeit des Testgens zu untersuchen. In sowohl Tabak- als auch Maiszellen wurde die transiente Expression des Luciferase-Gens stark durch die gemeinsame Übertragung von VirD1- und VirD2-Plasmiden gehemmt. Die Inhibierung war größer, wenn das Verhältnis von VirD-Plasmiden zum Testgenplasmid erhöht wurde. Eine signifikante Inhibierung trat nur bei einer Orientierung der Randsequenz auf, d.h. bei der Richtung, die zum VirD2-Bruch des DNA-Strangs führen würde, der die Matrize für Luciferase-mRNA ist. Die Wirkung von VirD1 allein oder VirD2 allein war geringer. Die biolistische Übertragung eines Transformationsvektors mit einem selektierbaren Marker und dem Luciferase-Testgen plus der Mischung von VirD-Plasmiden erzeugte eine moderate Häufigkeit von "agrolistischen" Insertionen, deren rechte Verbindungen mit pflanzlicher DNA genau die Sequenz hatten, die für T-DNA-Insertionsereignisse erwartet wurde. Wir fanden sowohl biolistische als auch "agrolistische" Ereignisse in einigen Transformantenlinien.
B. Einleitung
Die Genübertragung durch Partikelbombardierung ist eine weithin akzeptierte Technik mit breiten Anwendungen in der Pflanzentransformation geworden (Übersicht in Ahl Goy und Duesing, 1995). Zum Beispiel wurde Mais durch diese Technik entwickelt, der resistent gegen den Europäischen Maiszünsler ist (Koziel et al., 1993). Im Verlauf der Produktentwicklung müssen die Struktur und Kopiezahl der Transgene sowie ihre Stabilität festgestellt werden. Das am stärksten wünschenswerte Produkt wäre eines mit einem einzelnen einfachen Insert und keiner fremden Plasmidvektor-DNA. Jedoch gibt es in der Pflanzentransformation durch Partikelbombardierung eine Tendenz zur Integration von mehrfachen Kopien der eingeführten Gene, einschließlich Plasmidvektor (Klein et al., 1988, Klein et al, 1989; W.J. Gordon-Kamm et al., 1990; Vasil et al., 1992; Y. Wan und P. Lemaux, 1994). Dieses Verfahren scheint die Konkatemerisierung entweder vor oder während der Integration zu fördern. Die während der biolistischen Transformation inserierten mehrfachen Kopien sind allgemein genetisch verbunden und können nicht während der anschließenden Züchtung aufgespalten werden.
Mehrfache Kopien von Transgenen können zu Instabilität ihrer Expression durch mehrere Mechanismen führen (Übersicht in M. Matzke und A. Matzke, 1995): mehrfache Kopien von Transgenen können wechselwirken, um einander und verwandte Wirtsgene durch epigenetische Mechanismen zu inaktivieren, die verschiedentlich als "Kosuppression" oder "Gen-Silencing" markiert werden. Zusätzlich kann eine homologe Rekombination eine genetische Instabilität von mehrfachen Kopien verursachen. Aus diesen Gründen sollte sich eine Reduzierung der Kopiezahl von inserierten Transgenen als vorteilhaft für die Aufrechterhaltung der Genauigkeit von eingeführten Genen erweisen.
Das Integrationsmuster für über die Agrobacterium-vermittelte Transformation eingeführte Fremdgene ist allgemein deutlich unterschiedlich von demjenigen, das aus der Partikelbombardierung von Pflanzenzellen resultiert (Übersicht Chilton, 1993). Die Anzahl von Kopien von intakten und umgelagerten Transgenen, die aus der biolistischen Übertragung resultieren, übersteigt häufig stark die Kopiezahl von Transgenen, die in Pflanzen durch das Agrobacterium-System eingeführt werden. Agrobacterium hat einen Mechanismus entwickelt, in dem die übertragenen Gene auf Plasmiden lokalisiert werden, die als Tumor-induzierende (Ti) oder Wurzel-induzierende (Ri) Plasmide bezeichnet werden (Übersicht in Kado, 1993). Ein als T-DNA (übertragene DNA) aus Ti- oder Ri-Plasmid-DNA bezeichnetes spezifisches Segment, das auf dem Ti/Ri-Plasmid von gerichteten wiederholten Randsequenzen mit 25 bp flankiert wird, wandert aus dem Bakterium in den Pflanzenzellkern und wird in die chromosomale DNA der Pflanze integriert. Ein komplizierter Mechanismus für den DNA-Transfer wird durch eine Reihe von Virulenz-(vir)-Genen codiert (Übersicht in Zambryski, 1992). Die Aktivierung der vir-Gene führt zur Erzeugung von ortsspezifischen Brüchen innerhalb der T-DNA-Rand-Repeats und erzeugt ein lineares einsträngiges DNA-Molekül (T-Strang), das dem unteren Strang der T-DNA entspricht. Das Brechen erfordert zwei Polypeptide, die durch das VirD-Operon codiert werden: VirD1 und VirD2 (Stachel und Nester, 1986; Stachel et al., 1987; Herrera-Estrella et al., 1988; DeVos und Zambryski, 1989; Durrenberger et al., 1989; Howard et al., 1989; Koukolikova-Nicola et al., 1993). VirD1 weist eine DNA-entspannende Aktivität auf (Ghai und Das, 1990; Filichkin und Gelvin, 1993), wärend VirD2 eine Endonuklease-Aktivität hat, die den unteren Strang der Randsequenz spaltet (Stachel et al., 1986; Yanofsky et al., 1986; Wang et al., 1987; Albright et al., 1987). Experimente in vitro haben auch gezeigt, daß gereinigtes VirD2 spezifisch einsträngige DNA spaltet (Pansegrau et al., 1993; Jasper et al.; 1994). Weder supercoiled noch entspannte doppelsträngige DNA wirkt als Substrat zur Spaltung durch VirD2 allein in vitro (Jasper et al., 1994).
VirD2 wird kovalent an das 5'-Ende der gebrochenen DNA (Ward und Barnes, 1988; Young und Nester, 1988; Howard et al., 1989) über den Tyrosin-Rest 29 gebunden (Durrenberger et al., 1989; Vogel und Das, 1992; Pansegrau et al. 1993). Eine zweite Spaltung an der linken Randsequenz führt zur Freisetzung des T-Strangs. Der T-Strang ist zusätzlich entlang seiner Länge durch ein einsträngiges Bindungsprotein, VirE2, umhüllt. VirD2 und VirE2 enthalten Kernlokalisierungssignale (NLSs), von denen angenommen wird, daß sie den T-Strang in den Pflanzenzellkern lotsen (Herrera-Estrella, 1990; Howard et al., 1992; Shurvinton et al., 1992; Tinland et al., 1992; Rossi et al., 1993). Die NLSs von VirD2 und VirE2 werden in Tabak und in Mais erkannt (Citovsky et al., 1994), aber ihre Effizienz hängt vom Entwicklungsstadium des Gewebes ab. Kürzliche Daten stützen die Ansicht, daß VirD2 an der Ligation des 5'-Endes des T-Strangs an die pflanzliche DNA teilnehmen kann (Tinland et al., 1995).
In der vorliegenden Untersuchung haben wird eine neue Pflanzentransformationstechnik entwickelt, die einige der Vorteile des Agrobacterium-Systems mit der erwiesenen hohen Effizienz des biolistischen und anderer Übertragungssysteme für ein weites Spektrum von Nutzpflanzen kombiniert. Sie ist geschaffen, um das interessierende Gen ohne Vektorsequenz wie bei T-DNA-Inserten zu integrieren und die Kopiezahl zu kontrollieren. Unser Ansatz besteht darin, Pflanzeexpressionskassetten für VirD1- und VirD2-Gene zu verwenden, die mit einem transformierenden Plasmid, das T-DNA-Randsequenzen enthält, die einen selektierbaren Marker flankieren, gemeinsam übertragen werden. Wir haben festgestellt, daß die vorübergehend exprimierten VirD1- und VirD2-Genprodukte tatsächlich T-DNA-Randsequenzen in der Pflanze spalten und Insertionsereignisse vom T-DNA-Typ ("agrolistische" Ereignisse) nach der biolistischen Übertragung erzeugen können.
C. Materialien und Methoden
1. Plasmide
Die Strukturen aller in dieser Untersuchung verwendeten Plasmidinserte sind in 1 dargestellt. pCIB1711 ist ein pUC-Derivat, das das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen enthält, angetrieben durch den Blumenkohlmosaikvirus 35S (CaMV35S)-Promotor.
Konstruktion von pCIB1711
pCIB1711 enthält ein Luciferase-Gen, das an 35S-Expressionssignale gebunden ist. Der Stammvektor pCIB710 (Rothstein et al., 1987) wurde vor der Insertion des Luciferase-Gens durch Entfernung besonderer Restriktionsorte PstI und NarI modifiziert. Der stromaufwärts des CaMV-Promotors befindliche PstI-Ort wurde durch Spaltung an benachbarten SalI- und SphI-Restriktionsorten und Ligation des synthetischen Linkers (5'-TCGACATG-3'] entfernt, um den SalI-Ort erneut zu schaffen und die SphI- und PstI-Orte zu entfernen. Der 3' zu den CaMV-Polyadenylierungssequenzen befindliche NarI-Ort wurde durch Spaltung mit NarI und NdeI entfernt, wobei ein Fragment mit 52 bp ausgeschnitten wurde, gefolgt von Klenow-Verdau und Ligation mit abgestumpften Enden. Plasmide pJD204 (Ow et al., Science 234: 856–859 (1986)) und pDO0432 (De Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7(2): 725–737 (1987)) wurden von Dr. Donald Helinski bzw. Dr. Steve Howell erhalten. Ein HindIII-bamHI-Fragment mit 1826 bp aus pJD204, das das Luciferase-Gen, 22 bp des Luciferase 5'-UTL und ca. 130 bp des 3'-Endes enthielt, wurde mit einem synthetischen Linker, hergestellt aus den Oligonukleotiden 5'-GATCCCTGCAGA-3' (SEQ ID NO:3) und 5'-AGCTTCTGCAGG-3' (SEQ ID NO:4), in den BamHI-Ort von pCIB710 ligiert, um zwischen dem 35S-Promotor und Polyadenylierungssignalen zu liegen.
Die Insertion des Luciferase-Genfragments in den modifizierten pCIB710-Vektor erzeugte pCIB1701. pCIB1711 wurde durch Verdau von pCIB1701 mit PstI und NarI und Ligation des resultierenden Plasmids mit einem Linker R5B1, der die Leitsequenz und das 5'-Ende des Gens enthielt, konstruiert.
Linker R5B1 besteht aus einem Fragment, das aus den folgenden komplementären Oligomeren hergestellt wird:
5'-ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCT ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGATCCCTGCAGGACACGCTGAAATCACCAG TCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATG-3' (SEQ ID NO: 5)
und
5'-GATCCATAGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTGCAGG GATCCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGT GGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT-3' (SEQ ID NO: 6).
Zur Einführung von T-DNA-Rändern wurden zwei synthetische Oligonukleotide, die der rechten Randsequenz von LBA5269 (Van Haaren et al., 1989) entsprachen, verschmolzen, um den folgenden Duplex zu liefern: 5'-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3' (SEQ ID NO:7). Dieser Duplex, flankiert von BamHI-PstI-Orten, wurde in die entsprechenden Orte in pCIB1711 zwischen dem Promotor und der Luciferase-codierenden Sequenz inseriert, um pRB(+)Luc zu liefern. In pRB(–)Luc wurde die rechte Randsequenz in umgekehrter Orientierung in bezug auf den Promotor eingeführt.
pNeoRBLuc wurde zur stabilen Transformation von Tabaksuspensionszellen geschaffen und enthält eine linke Randsequenz, das Neomycinphosphotransferase-Gen (nptII) und das Luciferase-Gen, wobei der rechte Rand zwischen dem Promotor und der Luciferase-codierenden Region aus pRB(+)Luc inseriert ist (2). Das durch den nos-(Nopalinsynthase)-Promotor angetriebene nptII-Gen wurde aus dem Plasmid pBin19 als 2,2 kb-SacII-HindIII-Fragment ausgeschnitten (Bevan, 1984). Die linke Randsequenz wurde aus pBin19 als BglII-EcoRI-Fragment ausgeschnitten. Beide Fragmente wurden in XbaI-HindIII-Orte von pRB(+)Luc inseriert. pNeoLuc ist das Äquivalent von pNeoRBLuc ohne rechte Randsequenz, die zwischen dem CaMV35S-Promotor und der Luciferase-codierenden Region inseriert ist.
VirD1- und VirD2-Gene aus pTiA6 wurden in den Expressionsvektor pMF6 subkloniert (Callis et al., 1987), der aus dem CaMV35S-Promotor (0,5 kb), dem ersten Adh1-Intron (0,5 kb) und der Nopalinsynthase-(nos)-Polyadenylierungsregion (0,25 kb) besteht (1). Das 0,6 kb EcoRI-PstI aus pAD1187 (Ghai und Das, 1989), das der VirD1-codierenden Sequenz entspricht, wurde in pMF6 unter Erhalt von p35SAdhD1 kloniert. Die VirD2-codierende Sequenz wurde als 1,8 kb EcoRI-Fragment aus pAD1190 (Ghai und Das, 1989) ausgeschnitten und im pMF6 kloniert. Die erhaltenen Plasmide, p35SAdhD2 und p35SAdhD2(rev), trugen die VirD2-codierende Region in entweder Sense- oder Antisense-Orientierung. Die Adh1-Intronsequenz wurde aus p35SAdhD1, p35SAdhD2 und p35SAdhD2(rev) deletiert, um p35SD1, p35SD2 bzw. p35SD2(rev) für Experimente, die für Tabakgewebe geschaffen wurden, zu erzeugen.
pGUS ist ein pUC-Derivat, das die β-Glucuronidase-(GUS)-codierende Sequenz GUS-Gen unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors und das Rhizinus-Katalasegen-Intron enthält (Ohta et al., 1990).
2. Pflanzenmaterial
Maissuspensionszellen: Suspensionskulturen von Mais (Zea mays L.) wurden aus gefrierkonserviertem embryogenem Typ II-Kallus gestartet, der aus unreifen Embryos einer mit B73 verwandten Elitelinie selektiert wurde. Ca. 1 g gefrierkonservierter Kallus (DiMaio und Shillito, 1992) wurde zu 50 ml N6-Flüssigmedium (Chu et al., 1975) gegeben, ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Kulturen wurden bei 25°C im Dunkeln auf einen Rundschüttler mit 150 U/min inkubiert. Suspensionskulturen wurden alle 7 Tage durch Übertragen von 1 ml von Packed-Cell-Volume in 50 ml frisches 2N63S-Flüssigmedium subkultiviert.
Für die Bombardierungsexperimente verwendete Maiszellsuspensionen wurden aus 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen entnommen. Vor der Bombardierung wurden ca. 0,5 ml Packed-Volume-Zellen an 7 cm-Filtern (Whatman Nr. 4) vakuumfiltriert. Die Filter wurden dann auf Gelrite-verfestigtes N6-Medium, das 120 g/l Saccharose enthielt, übertragen. Ausplattierte Zellen wurden für 4 Stunden bei 25°C vor der Bombardierung gehalten. Nach der Bombardierung wurden die Platten bei 25°C für 24 h inkubiert.
Tabaksuspensionszellen: Die Nicotiana tabacum-Zellinie NT-1 (An, 1985) wurde in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog) gezüchtet, ergänzt mit 2 mg/l 2,4-D und Saccharose (30 g/l) (MS3S). Zellen wurden einmal pro Woche durch Zugabe von 5 ml Inokulum auf 100 ml frisches Medium in 500 ml-Kolben subkultiviert. Die Kolben wurden bei 27°C auf einem Rundschüttler mit 125 U/min inkubiert. Teilmengen von 0,5 ml aus vier Tage alten Kulturen wurden auf sterilen Filtern (Whatman Nr. 4) ausgebreitet, die dann auf MS-Medium übertragen wurden, ergänzt mit 12 % Saccharose und gehalten bei Raumtemperatur für 4 Stunden vor der Bombardierung.
3. Bombardierung von Pflanzezellen
Gewebe wurden mit Gold-Mikroprojektilen bombardiert, auf die eine Mischung aus Plasmiden präzipitiert war. pGUS-Plasmid-DNA wurde als interne Kontrolle für Mais- und Tabakexperimente in allen Fällen verwendet. Für Co-Transformationsexperimente trugen die Goldpartikel entweder eine gleiche Masse aller Plasmid-DNAs (0,5 μg von jeder Plasmid-DNA pro Zielplatte) oder ein 2:1-Molverhältnis von Plasmiden, die VirD1- und VirD2-Gene tragen, zu Substratplasmid. Für stabile Transformationsexperimente enthielten Co- Transformationsmischungen ein 5:1-Molverhältnis von Plasmiden, die VirD1-und VirD2-Gene trugen, zu nptII-Selektionsplasmid. Jede Teilmenge von Plasmidmischung, die pro Zielplatte bombardiert wurde, bestand aus 0,1 μg des Selektionsmarkers und 0,5 μg von jeweils p35SD1- und p35SD2-Plasmid-DNAs. Geeignete Mengen jeder DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl vermischt und mit 50 μl 2,5 M CaCl₂ und 20 μl 0,1 M spermidinfreier Base zum Bewirken einer Ausfällung auf 50 μl von 1,0 μm Gold-Mikroträgern (60 mg/ml) ausgefällt. Mikroprojektilbombardierung wurde mit der Biolistic-Vorrichtung PDS-1000 He (DuPont) unter Verwendung von Berstscheiben mit 1500 psi durchgeführt, wobei sich die Probe 8 cm unterhalb der Bremsschirmebene befand.
4. Stabile Transformation von Tabaksuspensionszellen
24 h nach der Bombardierung wurden die Tabakzellen auf MS3S-Platten mit 300 μg/ml Kanamycin übertragen. Unabhängige Mikrokalli, die ca. 3 Wochen nach der Bombardierung erschienen, wurden auf frische Platten übertragen, die mit 300 μg/ml Kanamycin ergänzt waren. Nach zwei Subkulturen auf dem gleichem Medium wurden Suspensionskulturen durch Überimpfen von ca. 100 mg Tabakzellen in 25 ml Flüssigmedium, ergänzt mit 300 μg/ml Kanamycin, eingeleitet.
5. Transiente Expressionsassays
Luciferase wurde in Gewebeextrakten gemäß der Empfehlung des Lieferanten getestet (Luciferase-Assaysytem, Promega). β-Glucuronidase-Aktivität wurde durch einen Chemolumineszenz-Assay mit dem GUS-Light-Kit (Tropix) bestimmt. Luciferase- und β-Glucoronidase-Aktivitäten werden als Lichteinheiten ausgedrückt, die durch ein Luminometer Analytical Luminescence Modell 2001 detektiert werden, integriert über 10 Sekunden bei 25°C.
6. DNA-Extraktion und Southern-Blot-Hybridisierung
Zellkulturen wurden durch Filtration 10 Tage nach der Impfung geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. DNA wurde wie beschrieben isoliert (Hall et al., 1991).
Ca. 5 μg genomische DNA wurden zum Verdau mit EcoRI verwendet. Nach Trennung an einem 0,7%igen Agarose-Gel wurde die DNA auf Genescreen plus Membran übertragen, und die Hybridisierung erfolgte gemäß den vom Hersteller beschriebenen Bedingungen (NEN Research Products, DuPont). DNA-Sonden wurden mit [a-³²P]dCTP unter Verwendung des Oligo-Markierungskits von Pharmacia markiert. Die neo-Sonde entsprach einem 2 kb-PstI-Fragment des nptII-Gens (2). Die luc-Sonde entsprach einem 0,7 kb XbaI-EcoRI- Fragment des Luciferase-Gens (2). Zur Entfernung von Sonden wurden die Membranen mit einer Lösung von 0,1 % SDS bei 100°C für 5 min gestrippt.
7. Klovierung von T-DNA/Pflanzen-DNA-Verbindungen
DNA (30 μg) aus transgenen Tabak-Kalli wurde mit EcoRI verdaut und der präparativen Elektrophorese an einem 1 % Sea-Plaque-Agarosegel (FMC) unterworfen. Scheiben von Agarose, die der Größe der zu klonierenden Fragmente entsprachen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten, und DNA wurde aus Agarose mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Fragmente wurden dann in den dephosporylierten EcoRI-Ort von pUC19 kloniert. Ligationsmischungen wurden zur Transformation von E. coli HB101-Zellen durch Elektroporation verwendet. Kolonien, die das Plasmid mit dem korrekten Insert enthielten, wurde durch Koloniefilterhybridisierung unter Verwendung eines 0,5 kb-CaMV35S-Promotorfragments als Sonde identifiziert. Die Sequenz der Verbindung von Donorplasmid-DNA mit Pflanzen-DNA wurde unter Verwendung des Primers 5'-CCACTATCCTTCGCAAGACC-3' (SEQ ID NO:8) analysiert, der sich im CaMV35S-Promotor in einem Abstand von 106 bp von der rechten Randsequenz befand.
D. Ergebnisse
1. Experimenteller Aufbau
Zur Untersuchung, ob VirD1- und VirD2-Genprodukte eine T-DNA-Randsequenz bei Expression in Pflanzezellen brechen können, konstruierten wir das Testplasmid pRB(+)Luc, das eine Substrat-T-DNA-Randsequenz zwischen dem Promotor und der codierenden Region des Luciferase-Gens enthält. Die Insertion der rechten Randsequenz zwischen dem CaMV35S-Promotor und der Luciferase-codierenden Region wechselwirkt nicht mit der Expression des Luciferase-Gens in Pflanzengeweben (Daten nicht gezeigt). Die Randsequenz befand sich in einer solchen Weise, daß ein ortsspezifischer Bruch, eingeführt durch VirD1- und VirD2-Genprodukte, zu einem Bruch des DNA-Strangs führen würde, der eine Matrize für die Luciferase-mRNA ist, und somit die Produktion von Luciferasetranskript und -enzym verringern sollte. Nach Co-Bombardierung von Pflanzenzellen mit pRB(+)Luc und Plasmiden, die die VirD-Gene tragen, sollte jedes Brechen an der Randsequenz quantitativ durch Testen der Luciferaseaktivität meßbar sein. Jedoch könnte jede Abnahme an Luciferaseaktivität auch durch die Bindung von VirD1- und VirD2-Genprodukten an der Randsequenz erklärt werden, die sich zwischen dem Promotor und der codierenden Sequenz befindet, eine Bindung, die die Transkription des Luciferase-Gens inhibieren könnte. pRB(–)Luc, ein Plasmid, das die Randsequenz in umgekehrter Orientierung in bezug auf den Promotor enthält, wurde deshalb untersucht, um zwischen diesen zwei Möglichkeiten zu unterscheiden. Falls eine Abnahme der Luciferaseaktivät das Ergebnis der Bindung der VirD-Genprodukte an die Randsequenz ist, dann würde diese Abnahme wahrscheinlich selbst mit der Randsequenz in der umgekehrten Orientierung beobachtet werden.
Da VirD1- und VirD2-Proteine vorübergehend in den bombardierten Pflanzenzellen erzeugt werden müssen, bevor sie die Randsequenz brechen können, würde jeder solcher Bruch vermutlich auftreten, nachdem die Transkription des Luciferase-Gens bereits begonnen hat. Deshalb würden Messungen der Luciferaseaktivität vermutlich die VirD1- und Virb2-Aktivität in Pflanzenzellen unterschätzen.
Zur Expression von VirD1- und VirD2-Genen in Pflanzenzellen wurden ihre jeweiligen offenen Leseraster (ORFs) unter die Kontrolle des CaMV35S-Promotors gestellt. Das VirD2-ORF wurde auch in Antisense-Orientierung in bezug auf den Promotor eingeführt, um als Kontrolle zu dienen. Da festgestellt wurde, daß die Gegenwart des Alkoholdehydrogenase-1-Introns 1 aus Mais die Expression von Genen in Mais erhöht (Callis et al., 1987), konstruierten wir auch p35SAdhD1 und p35SAdhD2 (die das zwischen dem Promotor und der codierenden Region von VirD1- bzw. VirD2-ORF-Genen inserierte Intron enthalten) zur Verwendung in transienten Expressionsexperimenten in Mais. Ein Plasmid, das das β-Glucuronidase(GUS)-Gen exprimiert, pGUS, wurde in jeder Bombardierung als interner Standard zur Kontrolle auf Effizienz des DNA-Transfers eingeschlossen. In allen Fällen wird die Aktivität des Reporters al Verhältnis von Luciferasezu-GUS-Aktivität ausgedrückt, um auf Variabilität der Effizient der DNA-Übertragung zu korrigieren.
2. Transiente Expressionsassays zum Testen auf Spaltung der Randsequenz durch VirD1- und VirD2-Genprodukte in der Pflanze
Mais- und Tabakzellen wurden zuerst vorübergehend mit unserem Testplasmid transformiert, das getrennt mit VirD1- und VirD2-Genen co-übertragen wurden, um individuell auf ihre Fähigkeit zu testen, die Transkription durch die T-DNA-Randsequenz zu beeinflussen. Nach der gemeinsamen Übertragung von entweder p35SD1-DNA oder p35SAdhD1-DNA mit pRB(+)LUC-DNA wurden 80 % der Kontrollstärke von Luciferase-zu-GUS-Aktivität in Tabak- und Maisgeweben beobachtet (Tabelle 1 und Tabelle 2, nachfolgend). Die gemeinsame Übertragung von p35SD2-DNA (Tabak) oder p35SAdhD2-DNA (Mais) mit pRB(+)LUC-DNA führte zu 50 % und 80 % der Kontrollstärke von Luciferase-zu-GUS-Aktivität (Tabelle 1 und Tabelle 2, nachfolgend).
Tabelle 1: Aktivität von VirD1 und VirD2 in Tabaksuspensionszellen
Tabelle 1. Aktivität von VirD1 und VirD2 in Tabakzellen. Plasmidkonstrukte werden in 1 beschrieben und wurden auf Tabakzellen durch die Biolistic-Vorrichtung übertragen. Zahlen in Klammern geben das Molverhältnis von Plasmiden an. Nach Inkubation für 24 h wurden die Gewebe homogenisiert und Enzymaktivitäten bestimmt. Aktivitäten werden als Verhältnis von Luciferase (Luc) zu β-Glucuronidase (Glu) ausgedrückt. Unabhängige Bombardierungen wurden analysiert, und die Daten werden als Mittelwerte von sechs Wiederholungen plus oder minus Standardabweichung dargestellt. Prozentwerte der Kontrolle werden aus dem Verhältnis der Luciferase-zu-β-Glucuronidase-Aktivitäten zu denjenigen Aktivitäten bestimmt, die mit Kontrollplasmid beobachtet werden.
Tabelle 2: Aktivität von VirD1- und VirD2-Genen in Maissuspensionszellen
Tabelle 2: Aktivität von VirD1 und VirD2 in Maiszellen. Aktivitäten sind wie in der Fußnote zu Tabelle 1 beschrieben ausgedrückt.
Die zwei vir-Gene schienen zusammen eine synergistische Wirkung zu haben. Gleichzeitige Übertragung durch die Biolistic-Vorrichtung von gleichen Mengen von pRB(+)LUC-DNA mit beiden Plasmiden, die VirD1- und VirD2-Gene tragen (Verhältnis 1:1:1), reduzierte die Luciferaseaktivität auf ca. 20 % der Kontrolle in Tabak- (Tabelle 1) und 10 % in Maiszellen (Tabelle 2). Bei einem höheren Verhältnis von VirD1- und VirD2-Plasmiden zu Testplasmid (2:2:1) wurde die Luciferaseaktivität weiter auf ca. 10 % in Tabakzellen (Tabelle 1) und 1 % in Maiszellen (Tabelle 2) reduziert. Analoge Experimente unter Verwendung des Kontrollplasmids p35SD2(rev) (Tabak) oder p35SAdhD2(rev) (Mais) mit der VirD2-codierenden Sequenz in Antisense-Orientierung ergaben ähnliche Ergebnisse zu denjenigen mit VirD1 allein (Tabelle 1 und Tabelle 2) wie erwartet. Dies zeigte, daß unser internes Standard-GUS-Gen eine wirksame Kontrolle für alle Effekte der Veränderung der gesamten übertragenen DNA-Konzentration war.
Die Umkehr der Orientierung des T-DNA-Rands im Testplasmid eliminierte oder reduzierte stark jeglichen Einfluß von VirD1- und/oder VirD2-Genen auf die transiente Expression des Luciferase-Gens. Wenn pRB(–)Luc in Tabakzellen zusammen mit p35SD1- und p35SD2-Plasmid-DNA bombardiert wurde, wurde keine signifikante Abnahme der Luciferaseaktivität beobachtet.
Gleichzeitige Übertragung von pRB(–)Luc, die mit p35SD1 oder p35SD2 separat durchgeführt wurde, zeigte gleichsam keine signifikante Abnahme der Luciferaseaktivität (Tabelle 1). Diese Beobachtungen zeigen deutlich, daß die Abnahme der mit pRB(+)Luc-Testplasmid plus VirD1- und VirD2-Genen beobachtete Abnahme der Luciferaseaktivität das Ergebnis eines strangspezifischen Bruchs an der rechten Randsequenz durch vir-Genprodukte ähnlich demjenigen war, der in Agrobacterium beobachtet wurde (für eine Übersicht siehe Zambryski, 1992).
3. Analyse von stabilen Transformanten
Die stabile Transformation von Tabaksuspensionszellen wurde als nächstes unternommen, um die Aktivität von VirD1- und VirD2-Genprodukten auf das Muster der DNA-Integration nach gleichzeitiger Übertragung dieser Gene mit ihrer Substrat-DNA durch die Biolistic-Vorrichtung zu bewerten. Für diese Experimente wurde pNeoRBLuc verwendet, das einen linken T-DNA-Rand, nptII als selektierbaren Marker und das 35SRB(+)Luc-Gen mit dem rechten T-DNA-Rand, der zwischen Promotor und Luciferase-codierende Region inseriert ist, enthält. In den Ergebnissen und der nachfolgenden Diskussion bezeichnen wir diejenigen DNA-Insertionen in das Tabakgenom als "agrolistische Ereignisse", die nach VirD1- und VirD2-Aktivität an Randsequenzen unter Erzeugung eines T-Strangs resultieren würden. Im Gegensatz bezeichnen wir diejenigen DNA-Inserte als "biolistische Ereignisse", die den Prozeß darstellen, der normalerweise nach der Genübertragung in Pflanzenzellen durch die Biolistic-Vorrichtung auftritt. Das ursprüngliche Kriterium zur Unterscheidung von biolistischen Ereignissen und mutmaßlichen agrolistischen Ereignissen war das Fehlen von Luciferaseaktivität im transformierten Klon, das aus dem Ausschluß der Luc-codierenden Region durch T-DNA-Ausschneiden aus pNeoRBLuc entsteht. Auf der molekularen Ebene sollten die Transgene, die ein agrolistisches Ereignis darstellen, mit der neo-Sonde und nicht mit der luc-Sonde hybridisieren. Außerdem sollte in einem agrolistischen Ereignis die Sequenz der Verbindung zwischen eingeführter DNA und pflanzlicher DNA genau dem rechten Randende eines T-Strangs entsprechen. Beide Typen von Ereignissen können in der gleichen Pflanzenzelle auftreten, aber solche Klone würden genetisch als biolistische Ereignisse auf Basis der Gegenwart von Luciferaseaktivität bewertet werden. Sowohl biolistische als auch mutmaßliche agrolistische Ereignisse wurden durch Southern-Hybridisierung untersucht, um die Häufigkeit jedes Insertionstyps zu messen.
Tabaksuspensionszellen wurden mit Mikroprojektilen bombardiert, die mit pNeoRBLuc-Plasmid-DNA zusammen mit p35SD1- und p35SD2-DNA in einem Verhältnis von 1:5:5 beschichtet waren. Als Kontrollen wurde auch pNeoRBLuc-Plasmid allein bombardiert, und das randlose Kontrollplasmid pNeoLuc wurde zusammen mit p35SD1 und p35SD2 bombardiert. Stabile Transformanten wurde durch Wachstum auf kanamycinhaltigem Medium selektiert. Durchschnittlich 40 kanamycinresistente Klone erschienen pro bombardiertem Filter, aber nur einer oder zwei Kalli wurden weiter pro Platte analysiert. Ähnliche Zahlen von kanamycinresistenten Kalli wurden nach Bombardierung mit den Kontrollplasmiden pNeoRBLuc-DNA allein oder pNeoLuc-DNA plus p35SD1-DNA und p35SD2-DNA gewonnen.
Eine grobe Schätzung der Häufigkeit von agrolistischen Ereignissen konnte durch das Verhältnis der Gesamtanzahl von analysierten kanamycinresistenten Kalli, die keine Luciferase exprimieren, zu den gesamten Kanamycin-Kalli gemacht werden. Gemäß diesem Kriterium war die Häufigkeit agrolistischer Ereignisse ca. 10 %; von 32 analysierten Kalluslinien exprimierten 3 keine Luciferaseaktivität. Wie oben argumentiert ist diese Anzahl wahrscheinlich eine Unterbewertung von agrolistischen Ereignissen, weil agrolistische Ereignisse und biolistische Ereignisse in der gleichen Pflanzenzelle stattfinden können.
4. Soutern-Blot-Analyse von "biolistischen" Kontrollereignissen
Southern-Blot-Hybridisierung wurde an DNA aus kanamycinresistenten Kontroll-Kalluslinien durchgeführt, die nach Bombardierung mit (i) pNeoRBLuc allein und (ii) pNeoLuc-Plasmid, co-bombardiert mit p35SD1- und p35SD2-DNAs, erhalten wurden. Genomische DNA wurde mit EcoRI verdaut, was ein 3,9 kb-Fragment aus dem pNeoRBLuc-Plasmid erzeugt, das homolog zu sowohl neo- als auch luc-Sonden ist (2). Wenn genomische DNA-Verdaus mit der neo-Sonde hybridisiert wurden, wiesen alle Bahnen eine hybridisierende Bande der vorhergesagten Größe (3,9 kb) auf, und die Anzahl von intakten Fragmentkopien, beruhend auf Vergleich der Hybridisierungsintensität mit Kopiekontrollbahnen, variierte von 1 bis mehr als 10 pro Kern. Die Southern-Blot-Analyse von transformierten Linien aus der Co-Bombardierung mit p35SD1-DNA und p35SD2-DNA zusammen mit dem randlosen Kontrollplasmid pNeoLuc, verwendet als Sonden, zeigte die Gegenwart von sowohl intakten als auch umgelagerten Kopien des nptII-Gens in diesen Linien. Solche Umlagerungen werden häufig in Transformanten beobachtet, die durch die Biolistic-Vorrichtung erhalten werden.
5. Southern-Blot-Analyse von agrolistischen Kandidatenereignissen
Southern-Blot-Analyse wurde auch an DNA aus 15 kanamycinresistenten Kalluslinien durchgeführt, die nach Co-Bombardierung von pNeoRBLuc unter Verwendung von p35SD1- und p35SD2-Plasmid-DNA als Hybridisierungssonden erhalten wurden. Für die Southern-Blot-Analyse wurden 13 Kalluslinien zufällig aus den 32 gewählt, die positiv auf Luciferaseaktivität testeten, neben drei Klonen, von denen festgestellt wurde, daß sie keine Luciferase exprimieren. DNA aus den Luciferase-positiven Kalluslinien enthielt eine Bande der vorhergesagten Größe (3,9 kb), die mit der neo-Sonde hybridisierte. Die Anzahl von intakten nptII-Genkopien, beruhend auf dem Vergleich der Hybridisierungsintensität mit Kopiekontrollbahnen, reichte von 1 bis 10 pro Kern. Die Anzahl von beobachteten Kopien war viel geringer in den mit pNeoLuc-DNA und p35SD1- und p35SD2-DNA transformierten Kalli.
Wir beobachteten eine 3,4 kb-Bande in DNA aus allen transgenen Kalli, die mit p35SD1- und p35SD2-DNA zusammen mit pNeoRBLuc bombardiert wurden. Es wurde festgestellt, daß ein Fragment dieser Größe mit der VirD2-Sonde in diesen Linien hybridisierte. Das für die neo-Sonde verwendete Fragment enthielt ein Stück Terminatorsequenz, das auch in p35SD1- und p35SD2-Konstrukten vorhanden war, und obwohl es nur 1,2 % der markierten Sonde darstellt, kann es viele Kopien von VirD-Geninserten geben, und dies könnte ein Signal für die beobachtete Größe ergeben.
Wenn Blots mit der luc-Sonde hybridisierten, konnten 3 Gruppen von transgenen Kalluslinien unterschieden werden: (i) Kalluslinien mit Inserten, die mit der neo-Sonde und der luc-Sonde hybridisierten; (ii) Kalluslinien, in denen einige Inserte nur mit der neo-Sonde und einige Inserte mit sowohl neo- als auch luc-Sonden hybridisierten; (iii) Kalluslinien mit Inserten, die nur mit der neo-Sonde hybridisierten. Die erste Gruppe von Kalli enthielt wahrscheinlich keine agrolistischen Ereignisse. Die zweite Gruppe von Kalli enthielt wahrscheinlich zwei Arten von Ereignissen: agrolistische Ereignisse, nachgewiesen durch die Gegenwart von Fragmenten mit 4,8 kb, 4,6 kb und 5 kb, die mit der neo-Sonde hybridisierten, und biolistische Ereignisse, nachgewiesen durch die Gegenwart eines 3,9 kb-Fragments, das mit der luc-Sonde hybridisierte. Die dritte Gruppe von Kalli wies nur mutmaßliche agrolistische Ereignisse auf Basis ihrer Fähigkeit zur Hybridisierung allein mit der neo-Sonde auf. Drei Kalluslinien fielen in diese Gruppe; eine, die eine 3,2 kb hybridisierende Bande enthielt, eine zweite, die zwei hybridisierende Banden von 3,8 kb und 5 kb enthielt, und eine dritte, die eine Bande mit 5,5 kb enthielt. Diese 3 Hybridisierungsmuster waren einzigartig und stellten eindeutig unabhängige einzelne Zelltransformationsereignisse dar.
Unter 16 durch Southern-Hybridisierung analysierten transgenen Tabaklinien wiesen 10 biolistische Ereignisse auf, 3 wiesen mutmaßliche agrolistische Ereignisse auf und 3 wiesen beide auf.
6. Molekulare Analyse von mutmaßlichen agrolistischen Ereignissen
Die Natur von mutmaßlichen agrolistischen Insertionsereignissen wurde letztlich durch Bestimmung der Sequenz der Verbindung zwischen integrierter DNA und pflanzlicher DNA in Kalluslinien verifiziert, die Hybridisierungsmuster aufwiesen, die übereinstimmend mit solchen mutmaßlichen Ereignissen waren. DNA-Fragmente aus diesen Kalluslinien, die diese Verbindungen einschlossen, wurden kloniert und aus dem Inneren der T-DNA-Ränder heraus sequenziert (siehe Methoden). Die Nukleotidsequenz zeigte, daß jedes dieser Fragmente eine Sequenz enthielt, die Indikativ für eine Verbindung aus rechter Rand und Pflanzen-DNA war. Der rechte Endpunkt der T-DNA war identisch mit dem Bruchort der rechten Randsequenz von T-DNA.
Die pflanzliche Nukleotidsequenz in vier der fünf Fälle stimmte perfekt mit Tabak-Verbindungssequenzen überein, die zuvor in cDNA-Form durch andere angegeben wurden. Interessanterweise wird in allen vier Fällen der rechte Rand von T-DNA inseriert, wobei der CaMV35S-Promotor in der Antisense-Richtung in bezug auf die Pflanzengene in Regionen mit viel AT nahe dem Polyadenylierungsort in der 5'-untranslatierten Region des Gens orientiert ist. Keine zusätzlichen Nukleotide und keine wiederholten Sequenzen wurden an den rechten Verbindungsorten beobachtet. Es ist nicht möglich schlußzufolgern, ob etwaige Deletionen der Zielorte aufgetreten sind, weil der linke Rand des Inserts nicht bestimmt wurde.
Als Kontrollen wurden auch DNA-Fragmente, die die rechte Randsequenz und angrenzende Regionen auf einer Seite einschlossen, aus Kalluslinien kloniert, die Hybridisierungsmuster aufwiesen, die übereinstimmend mit DNA-Fragmenten aus biolistischen Ereignissen waren. Die Nukleotidsequenz aus diesen Ereignissen zeigte keine Verbindung aus rechter Randsequenz und Pflanzen-DNA, sondern vielmehr die rechte Randsequenz voller Länge und die erwartete Luciferase-codierende Sequenz darüber hinaus.
E. Schlußfolgerung
Die Ti-Plasmid-codierten Virulenzproteine VirD1 und VirD2 sind für die Bildung von T-Strängen in Agrobacterium erforderlich. Hier stellen wir einen Nachweis für die T-DNA-Bildung in der Pflanze und die Integration in Pflanzenzellen nach Einführung der zwei Virulenzgene VirD1 und VirD2 durch die Biolistic-Vorrichtung unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors zusammen mit einem Plasmid dar, das die Randsequenzen beherbergt. Ca. 10 der transformierten Tabakkalli wiesen agrolistische Inserte auf, d.h. DNA integrierte nur nach der Wirkung von VirD1- und VirD2-Genprodukten. Eine ähnliche Fraktion von transformierten Kalli enthielt sowohl agrolistische Ereignisse als auch biolistische Ereignisse. Die Transgen-Pflanzen-DNA-Verbindungen in agrolistischen Ereignissen zeigten eine ortsspezifische Spaltung innerhalb der rechten Randsequenz in Übereinstimmung mit zusammengestellten Daten, die zeigen, daß die rechte Rand-T-DNA gerade nach den ersten 3 Nukleotiden des 25 bp-Repeats endet (Gheysen et al., 1991; Mayerhofer et al., 1991; Ohba, 1995). Die Präzision der Integrationsereignisse wurde als eine direkte Beteiligung von VirD2 im Rekombinationsprozeß im Pflanzenzellkern interpretiert (Tinland et al., 1995).
Die Integrationsorte der agrolistischen Ereignisse werden hier in transkribierten Regionen identifiziert, was die Daten stützt, daß T-DNA vorzugsweise in potentiell transkribierte genomische Loci in unterschiedlichen Pflanzenarten integriert wird (Koncz et al., 1989; Herman et al., 1990; Kertbundit et al., 1991), wobei T-DNA-Insertionen zufällig in Pflanzenchromosomen verteilt sind (Chyi et al., 1986; Wallroth et al.; 1986). Obwohl die T-DNA-Integration gewöhnlich nicht mit großen Umlagerungen in der Pflanzen-DNA korreliert, können Deletionen, Inversionen und Duplikationen von Zielpflanzen-DNA-Sequenzen während der T-DNA-Transformation auftreten. Für die hier untersuchten agrolistischen Ereignisse wurden keine große Umlagerung in den Pflanzenzielorten festgestellt.
Das übereinstimmende Muster von agrolistischen Integrationen nahe dem Polyadenylierungssignal von bekannten Licht-induzierbaren und/oder photosynthetischen Genen von Tabak mit dem CaMV35S-Promotor am rechten Rand, gerichtet in einer Antisense-Orientierung zum offenen Leseraster, ist verblüffend. In dieser Orientierung kann die Insertion der T-DNA-Struktur ein Antisense-Transkript erzeugen, das die Expression des entsprechenden Tabakgens inaktivieren könnte. Solche photosynthetischen Gene werden jedoch nicht von diesen nicht-photosynthetisch kultivierten NT1-Zellen erfordert.
Auf Basis der transienten Expressionsexperimente, in denen die Spaltung an der rechten Randsequenz mit hoher Häufigkeit aufzutreten schien, wurde ein hoher Prozentanteil von Substratmolekülen offensichtlich gespalten. Überraschend wird dieser Anteil nicht für eine stabile Transformation bewahrt. Dies könnte durch eine Ligationsreaktion an der rechten Randsequenz nach Spaltung durch VirD2 erklärt werden, da In-vitro-Assays gezeigt haben, daß VirD2 eine ortsspezifische Spalt-Verbindungs- Reaktion innerhalb einsträngiger Oligonukleotide katalysiert, die T-DNA-Randsequenzen enthalten (Pansegrau et al., 1993). Eine andere Erklärung kann die Abwesenheit des einsträngigen bindenden VirE2 sein, das für eine effiziente Agrobacterium-vermittelte Transformation notwendig ist. Obwohl man annehmen kann, daß es ein Äquivalent zum unspezifischen einsträngigen Bindungsprotein VirE2 in Pflanzezellen gibt, das den T-Strang binden und schützen könnte, könnte die Addition des virE2-Gens zusammen mit VirD1 und VirD2 die Effizienz der Gewinnung von agrolistischen Ereignissen verbessern. Wir weisen auf den Nachteil hin, daß die begleitenden VirD1- und VirD2-Gene, die mit dem transformierenden Plasmid gleichzeitig übertragen werden, vermutlich biolistisch in die gleichen transformierten Linien mit hoher Häufigkeit integriert werden: die Co-Transformation ist sehr effizient in der Biolistic-Vorrichtung. Diese unerwünschten Gene stellen eine unterschiedliche Art von Fremd-DNA dar. Jedoch nehmen wir an, daß sie wegen ihres besonderen Insertionsmechanismus nicht mit dem "agrolistischen" Insert verbunden werden und durch anschließende Züchtung der transgenen Pflanze eliminiert werden können. Diese Annahme kann nicht mit diesen transgenen NT1-Zellen untersucht werden, die nicht regenerierbar sind.
Das agrolistische Transformationssystem bietet mehrere besondere Vorteile: (i) es sollte unmittelbar auf jedes Pflanzenzielgewebe anwendbar sein, das für biolistische Transformationsverfahren empfänglich ist. (ii) Die inserierte DNA trägt keine Fremdvektor-DNA. (iii) Weniger Kopien des Gens von Interesse werden inseriert, als es der Fall für DNA ist, die ohne VirD1- und VirD2-Gene übertragen wird. Dies sollte Homologieregionen minimieren, die zu Instabilität beitragen können.
Der agrolistische Ansatz kombiniert somit die besten Merkmale der biolistischen Übertragung mit der Eleganz und Präzision des Agrobacterium-T-DNA-Insertionsmechanismus, um eine neue, weithin anwendbare Technologie zur Erzeugung von transgenen Nutzpflanzen von landwirtschaftlichem Wert zu liefern.
Beispiel 2: Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten
Zur Expression in transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen beabsichtigte Gensequenzen werden zuerst in Expressionskassetten hinter einem geeigneten Promotor und stromaufwärts eines geeigneten Transkriptionsterminators zusammengebaut, um ein chimäres Gen zu erzeugen. Diese Expressionskassetten können leicht auf die oben in Beispiel 3 beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren übertragen werden.
Promotorselektion
Die Selektion eines in Expressionskassetten oder chimären Genen verwendeten Promotors wird das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des Transgens in der transgenen Pflanze bestimmen. Selektierte Promotoren werden Transgene in spezifischen Zelltypen (wie Blattepidermiszellen, Mesophyllzellen, Wurzelkortexzellen) oder in spezifischen Geweben oder Organen (Wurzeln, Blätter oder Blüten zum Beispiel) exprimieren werden, und diese Selektion wird den gewünschten Ort der Expression des Transgens reflektieren. Alternativ kann der gewählte Promotor die Expression des Gens unter einem Licht-induzierten oder anderen zeitlich regulierten Promotor antreiben. Eine weitere Alternative besteht darin, daß der selektierte Promotor chemisch reguliert wird. Dies würde die Möglichkeit der Induzierung der Expression des Transgens nur nach Wunsch und verursacht durch Behandlung mit einem chemischen Induktor bereitstellen.
Transkriptionsterminatoren
Eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren sind zur Verwendung in Expressionskassetten verfügbar. Diese sind verantwortlich für die Termination der Transkription über das Transgen hinaus und für seine korrekte Polyadenylierung. Geeignete Transkriptionsterminatoren und diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie in Pflanzen funktionieren, schließen den CaMV 35S-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalinsynthase-Terminator und den rbcS E9-Terminator aus der Erbse ein. Diese können sowohl in einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet werden.
Sequenzen zur Steigerung oder Regulation der Expression
Es wurde festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression aus der Transkriptionseinheit heraus steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit den Genen dieser Erfindung verwendet werden, um ihre Expression in transgenen Pflanze zu erhöhen.
Es wurde gezeigt, daß verschiedene Intron-Sequenzen die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß die Introns des Mais-Adh1-Gens signifikant die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem erkennenden Promotor bei Einführung in Maiszellen steigern. Es wurde festgestellt, daß Intron 1 besonders wirksam ist und die Expression in Fusionskonstrukten mit dem Chloramphenicolacetyltransferase-Gen steigerte (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183–1200 (1987)). Im gleichen experimentellen System hatte das Intron aus dem bronze1-Gen aus Mais eine ähnliche Wirkung in der Steigerung der Expression (Callis et al., s.o.). Intronsequenzen werden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren aufgenommen, typischerweise mit der nicht-translatierten Leitsequenz.
Eine Anzahl von nicht-translatierten Leitsequenzen, die aus Viren stammen, sind auch für die Steigerung der Expression bekannt. Spezifisch wurde gezeigt, daß Leitsequenzen aus dem Tabakmosaikvirus (TMV, die "omega-Sequenz"), dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) und dem Luzernemosaikvirus (AIMV) wirksam in der Steigerung der Expression sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693–8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65–79 (1990)).
Beispiel 3: Ein "Hit and Run"-Verfahren zum Bewirken der ortsspezifischen Rekombination in biolistisch übertragener DNA: gleichzeitige Übertragung von Rekombinase-mRNA
A. Zusammenfassung
Wir beschreiben ein Verfahren zur gleichzeitigen Übertragung von DNA und mRNA auf Pflanzenzellen unter Verwendung der Biolistic-Vorrichtung. Durch Gelelektrophorese haben wir die Stabilität und Gewinnung von auf Mikroprojektilen ausgefällter DNA und RNA unter verschiedenen Bedingungen gezeigt. Zur Übertragung von aktiver mRNA war die Ausfällung durch CaCl₂ allein oder CaCl₂ plus Spermidin plus Tris-Puffer wirksam, während ungepuffertes Spermidin die RNA fragmentierte.
Unter Verwendung effizienter Ausfällungsverfahren und der Biolistic-Vorrichtung für Mais- und Tabakzellen zeigten wir die Expression von in vitro synthetisierter verkappter polyadenylierter mRNA, die Leuchtkäfer-Luciferase codiert. Kinetische Studien zeigten, daß die Luciferase-mRNA-Expression früher ein Maximum zeigte als die transiente Expression einer 35S/Luciferase-DNA, die gleichzeitig übertragen wurde.
Zum Aufzeigen der Aktivität von biolistisch übertragener mRNA, die R codiert, die ortsspezifische Rekombinase von Zygosaccharomyces rouxii, übertrugen wir gleichzeitig auf Maiszellen ein Substratplasmid, das einen umgekehrten 35S-Promotor enthielt, flankiert von invertierten Kopien von RS, dem spezifischen Zielort mit 31 bp für die Rekombinase, gefolgt von der 35S-Leitsequenz, dem Luciferase-Gen und 35S-Terminatorregionen. Während das Substratplasmid allein keine signifikante Luciferaseexpression ergab, wurde sein 35S-Promotor bei gleichzeitiger Übertragung mit R-mRNA durch Rekombinase geflippt, und Luciferaseenzym wurde erzeugt.
Die potentielle Verwendung von ortsspezifischen Rekombinasesystemen zur Kontrolle der Transgeninsertion und Expression werden zusammen mit den Vorteilen der transienten Einführung von Rekombinaseaktivität als mRNA erörtert.
B. Einleitung
Wenn die Partikelbombardierung zur Genübertragung auf Pflanzenzellen verwendet wird, inseriert die Transgen-DNA zufällig in das Genom, allgemein an einem einzelnen Ort, der multiple Kopien enthält (Klein et al., 1988; Klein et al., 1989; W.J. Gordon-Kamm et al., 1990; Vasil et al., 1992; Y. Wan und P. Lemaux, 1994). Die Anordnung, Insertionposition und häufig hohe Kopiezahl von Transgenen können zu Instabilität der Expression durch mehrere Mechanismen führen: zum Beispiel durch Wechselwirkung multipler Kopien von Transgenen, die einander durch Antisense oder Methylierung oder "Silencing"-Mechanismen inaktivieren, die nicht gut verstanden werden (Übersicht in M. Matzke und A. Matzke, 1995). Weil die multiplen Kopien von Transgenen an einem einzelnen Insertionsort verbunden sind, ist es nicht möglich, die Kopiezahl durch Aufspaltung in nachfolgenden Generationen von Pflanzen zu verringern. Sowohl für grundlegende Studien der Transgenexpression als auch zur kommerziellen Erzeugung von transgenen Nutzpflanzen für landwirtschaftliche Anwendungen ist die Verbesserung der Anordnung und Expression von eingeführten Genen eine hohe Priorität. Ortsspezifische Rekombinationssysteme können als nützliches Mittel zur Vereinfachung des Insertionsmusters von Transgenen oder sogar zu ihrer Ausrichtung auf einen vorher festgelegten Ort im Pflanzengenom dienen (Albert et al., 1995).
Es wurde gezeigt, daß mehrere ortsspezifische Rekombinasen in Pflanzenzellen aktiv sind (für eine Übersicht siehe Odell & Russell, 1994): das Cre/lox-System des Bakteriophagen P1, das FLP/FRT-Rekombinationssystem aus dem 2 μ-Plasmid von Saccharomyces cerevisiae und das R/RS-System aus dem pSR1-Plasmid von Zygosaccharomyces rouxii (Matsuzaki et al., 1988). Dieses Systeme sind von potentiellem Nutzen wegen ihrer Einfachheit; damit sie vollständig funktionsfähig sind, brauchen sie nur ein einzelnes Rekombinaseprotein (Cre, FLP, R) und sein entsprechendes Ziel, einen kurzen definierten Rekombinationsort (lox, FLP bzw. RS). Ferner ist ihre Häufigkeit der Rekombination bemerkenswert hoch. Die Rekombinase kann drei Typen von DNA-Umlagerungen durch ihre Rekombinationsreaktionen vermitteln, abhängig vom Ort und der Orientierung der Erkennungsorte. Falls ein DNA-Fragment durch zwei Erkennungsorte gebunden wird, die in bezug aufeinander invertiert sind, erfolgt eine Inversion der dazwischenliegenden DNA. Falls die zwei Erkennungsorte in der gleichen Orientierung sind, erfolgt ein Ausschneiden und eine Zirkularisierung der dazwischenliegenden DNA. Wenn die Erkennungsorte auf getrennten DNA-Molekülen sind, erfolgt ein genetischer Austausch, und falls eines kreisförmig ist, wird dieses Molekül linear im anderen integriert.
Ortsspezifische Rekombinaseaktivität kann verwendet werden, um die in Pflanzen eingeführten Transgene zu vereinfachen und auszurichten. Falls diese Aktivität andauert, kann sie jedoch die rekombinante Struktur instabil machen. Es ist deshalb wünschenswert, die Rekombinaseaktivität nur transient zu exprimieren. Dies wurde in einer kürzlichen Untersuchung erreicht, die die ausgerichtete Integration eines lox-haltigen Transgens in einem lox-Ort in einer transgenen Pflanze zeigte, die Cre exprimierte (Albert et al., 1995). Weil sich der lox-Ort zwischen dem Promotor und der codierenden Region des cre-Gens befand, inaktivierte das ortsspezifische Rekombinationsereignis die Cre-Expression unter Stabilisierung des Produkts. Alle untersuchten Integrationsereignisse waren eine einzige Kopie auf Basis von Southern-Hybridisierungsanalyse.
In der vorliegenden Untersuchung haben wir das R/RS-ortsspezifische Rekombinasesystem zur Verwendung mit biolistischer Genübertragung angepaßt. Es wurde gezeigt, daß das R/RS-System effizient in Tabak funktioniert: wenn das R-Gen transient in Protoplasten transformiert wurde, schaltete sein Genprodukt ein kryptisches Glucuronidase-(GUS)-Gen durch ortsspezifische Inversion oder Ausschneiden von DNA ein (Onouchi et al., 1992). Wir zeigen hier, daß die durch Biolistik auf Mais- und Tabakzellen übertragene R-Rekombinase ähnlich funktioniert, auch wenn mit geringerer Effizienz (die Effizienz könnte durch Optimierung von Parametern erhöht werden), um ein kryptisches Luciferase-Gen durch Flippen seines Promotors einzuschalten. Außerdem stellt die Verwendung von mRNA anstelle von NA zur Erzeugung von Rekombinase sicher, daß sie schnell nach Einführung des DNA-Substrats in die Zelle erzeugt wird. Der Ziel-RS-Ort enthält eine Palindrom-Nukleotidsequenz mit 31 bp, die aus einem Paar von invertierten Repeats mit 14 bp besteht, die durch einen asymmetrischen Kern mit 3 bp getrennt sind (Matsuzaki et al., 1988). Zur Erzeugung von transgenen Pflanzen ist es wünschenswert, Rekombinase-RNA anstelle von DNA zu verwenden, um die Insertion des R-Gens in das Pflanzengenom zu vermeiden und so die nur transiente Rekombinaseexpression während der frühen Stufen der Transformation sicherzustellen. Wir beschreiben nachfolgend ein Verfahren zur gleichzeitigen Einführung von mRNA, die für R-Rekombinase codiert, zusammen mit einem Ziel-RS-haltigen kryptischen Luciferase-DNA-Konstrukt, was zu transienter Rekombinaseaktivität führt, die die Luciferase-Genexpression aktiviert.
C. Materialien und Methoden
1. Pflanzenmaterialien
Maiszellen:
Suspensionskulturen von Mais (Zea mays L.) wurden aus gefrierkonserviertem embryogenem Kallus Typ II gestartet, der aus unreifen Embryos einer mit B73 verwandten Elitelinie selektiert wurde. Gefrierkonservierte Kalli (DiMaio und Shillito, 1992) wurden schnell aufgetaut, und ca. 1 g wurde zu 50 ml N6-Flüssigmedium gegeben (Chu et al., 1975), ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Die Kulturen wurden bei 25°C in der Dunkelheit auf einem Rundschüttler mit 150 U/min inkubiert. Suspensionskulturen wurden alle 7 Tage durch Übertragen von 2 ml Packed-Cell-Volumen in 50 ml 2N63S-Flüssigmedium subkultiviert.
Teilmengen, die 200 mg Zellen enthielten, wurden gleichmäßig auf sterilen Durapore-Filtern ausgebreitet und auf Medium 2N6, ergänzt mit 12 Saccharose als Osmotikum, plaziert. Die ausplattierten Zellen wurden bei Raumtemperatur für 4 Stunden vor der Bombardierung und bis zu 24 Stunden nach der Bombardierung gehalten.
Tabakzellen:
Die Nicotiana tabacum-Zellinie NT-1 (An, 1985) wurde in Murashige-Skoog-Medium (Murashige & Skoog, 1962) kultiviert, ergänzt mit 2 mg/l 2,4-D und Saccharose (30 g/l). Die Zellen wurden einmal pro Woche durch Zugabe von 5 ml Inokulum auf 100 ml frisches Medium in 500 ml-Kolben subkultiviert. Die Kolben wurden bei 27°C auf einem Rundschüttler mit 125 U/min inkubiert. Teilmengen von 0,5 ml Zellen wurden vier Tage nach der Subkultur auf sterilen Filtern (Whatman Nr. 4) ausgebreitet. Die Filter wurden dann auf MS-Medium, ergänzt mit 12 % Saccharose, übertragen und bei Raumtemperatur für 4 Stunden vor der Bombardierung und bis zu 24 Stunden nach der Bombardierung gehalten.
2. Plasmide
T7LUCA50-Matrize (4A) für die In-vitro-Transkription von Leuchtkäfer-Luciferase-mRNA wurde konstruiert, indem zuerst luc an einen T7-Promotor gebunden und dann das T7/luc-Fragment in ein pUC18-Derivat mit einem poly-A-Insert inseriert wurde. Zur Verbindung des T7-Promotors mit der luc-codierenden Region wurde der T7-Promotor aus pET3 (Rosenberg et al., 1987) als BglII-Fragment ausgeschnitten und in den BamHI-Ort von pUC19 zur Bildung von pAT26 kloniert. Die Sequenz von +9 bis +26 wurde durch einen BamHI-Ort durch eine PCR-vermittelte Deletion zur Bildung von pAT27 ersetzt. Das 35S-Leader-Luciferase-Fragment, ausgeschnitten aus pCIB1711 (4C, siehe unten) als BamHI/Asp718-Fragment, wurde in pAT27 zur Bildung von T7Luc eingeführt. Das T7/luc-Insert aus diesem Plasmid wurde zu pUC18A50X als XbaI/Asp718-Fragment geführt. pUC18A50X ist ein pUC18-Derivat, das ein Oligonukleotidpaar mit 50 A-Resten enthält, flankiert von Asp718- (5') und HindIII-(3') Überhängen, dessen EcoRI-Ort zu einem XbaI-Ort mit einem synthetischen Oligonukleotid umgewandelt wurde.
pT7RecA50 (4B) ist ein pUC18A50X-Derivat, das den T7-Promotor, die 35S-Leitsequenz und eine Rekombinase-codierende Region zusätzlich zu seiner polyA-codierenden Region enthält. Das 35S Leader/Rekombinase-Fragment aus pRec (siehe unten) wurde als BamHI/Asp718-Fragment ausgeschnitten und in pAT27 zur Bildung von pT7Rec ligiert. Das Xba2/KpnI-Fragment aus pT7Rec wurde als nächstes in pUC18A50X zur Bildung von pT7RecA50 inseriert.
pCIB1711 (4C) ist ein Derivat von pCIB710 (Rothstein et al., 1987), in das die Luciferase-codierende Region aus pJD204 (de Wet et al., 1987) als HindIII-BamHI-Fragment in den BamHI-Ort des Vektors mit einem BamHI/PstI/HindIII-Oligonukleotid-Adapter am 5'-Ende zur Bildung von pCIB1701 eingeführt wurde. Die 35S-Promotor/Leitsequenz des resultierenden Plasmids wurde maßgeschneidert, um den BamHI-Ort exakt am Beginn der Transkription durch Substituieren seines EcoRV-BamHI-Fragments gegen das von pDO435 (Ow et al., 1986) zur Bildung von pCIB1700 zu positionieren. Der Hybrid 35S-Leader (50 bp)/Luciferase-Leitsequenz (22 bp) aus pCIB1700 wurde am PstI-Ort durch NarI im luc-Gen entfernt und durch ein synthetisches Oligonukleotid ersetzt, das der 58 bp 35S-Leitsequenz und dem Start des luc-ORF entsprach (siehe Carozzi et al., in Vorbereitung, für Einzelheiten dieser Konstruktion).
pRec (4D) ist ein Derivat von pCIB1711, das den 35S-Promotor, Leit- und Terminatorsequenzen bewahrt und die Luciferase-codierende Region durch die Rekombinase-codierende Region ersetzt aufweist. Um dies zu erreichen wurde das 5'-Ende des Rekonmbinase-Gens aus pGAHR (Onouchi et al., 1991) als BamHI/BglII-Fragment in die entsprechenden Orte von pSP72 (Promega) kloniert, und die DNA zwischen Vektor XhoI und Insert PvuII-Orten wurde durch ein Oligonukleotid: 5'-TCGAGTTGCATGCAG-3' (SEQ ID NO:9) ersetzt, so daß das Startcodon von Rekombinase (unterstrichen) zu einem SphI-Ort umgewandelt wurde. Der pCIB1711-Vektor wurde gleichsam modifiziert, um einen SphI-Ort am Ende der 35S-Leitsequenz wie folgt zu plazieren: Das PstI/EcoRI-Fragment, das die 35S-Promotor/Leitsequenz enthielt, wurde in den pSGpolyll-Vektor subkloniert, um seinen BamHI-Ort besonders zu machen. Nach Verdau mit BamHI/XbaI wurde ein Linker, der einen SphI-Ort enthielt, eingeführt: 5'-GATCGCAGCATGC(CTAG)-3' (SEQ ID NO:10; der Teil in Klammern zeigt die Sequenz auf dem komplementären Strang des Oligonukleotids an). Das resultierende modifizierte PstI/EcoRI-Fragment wurde zum pCIB1711-Gerüst durch 3-Wegeligation wiederhergestellt. Das Rekombinasegen wurde anschließend anstelle des luc-Gens in zwei aufeinanderfolgenden Ligationen wegen des internen SphI-Orts eingeführt.
p1RSLuc (4E) ist ein Derivat von pCIB1711, in das der 31 bp-RS-Ort zwischen dem 35S-Promotor und der 35S-Leitsequenz des Luciferase-Gens eingeführt wurde. Das Promotorfragment zwischen HindIII- und PstI-Orten wurde zuerst in pSGpoly7 zur Bildung von pSG35S subkloniert, und in den besonderen BamHI-Ort wurde ein Oligonukleotidpaar, das der folgenden Sequenz mit RS (fett) und einem HindIII-Ort (unterstrichen) entsprach, ligiert:
5'-GATCAAGCTTTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA (GATC)-3' (SEQ ID NO: 11)
Ein Klon, dessen inseriertes Oligonukleotid durch Sequenzierung im Uhrzeigersinn wie oben gezeigt bestimmt wurde, wurde gewählt, und sein RS-haltiges XbaI/PstI-Subfragment wurde zum Gerüst von pCIB1711 durch 3-Wegeligation zur Bildung von p1RSLuc wiederhergestellt.
p2RSLuc (4F) ist ein Derivat von pCIB1711, in das synthetische RS-Orte an beiden Seiten des 35S-Promotors in entgegengesetzter Orientierung eingeführt wurden, und in dem der gesamte 35S-Promotor in bezug auf den Rest des luc-Gens umgekehrt ist. Der oben beschriebene 35S-Promotorsubklon pSG35S wurde mit HindIII/XbaI verdaut, und ein Oligonukleotidpaar, das der folgenden Sequenz mit RS (fett geschrieben) und einem PstI-Ort (unterstrichen) entsprach, wurde eingeführt:
5'-AGCTACTGCAGTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA(CTAG)-3' (SEQ ID NO: 12)
Der resultierende Klon wurde mit BamHI verdaut, und eine zweite Kopie von RS wurde durch Ligation in das im vorhergehenden Absatz beschriebene Oligonukleotidpaar eingeführt. Ein Klon wurde ausgewählt, in dem die Orientierung des zweiten RS-Orts entgegen derjenigen des ersten war (d.h.
5'-GATCAAGCTTTTGATGAAAG-AATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3' (SEQ ID NO: 13)
war in Orientierung entgegen dem Uhrzeigersinn). Die Orientierung der Palindrom-RS-Sequenz wird durch das unterstrichene zentrale asymmetrische Trinukleotid CGT (oder ACG auf dem anderen Strang) definiert. Aus dem resultierenden 2RS-Promotorklon wurde ein HindIII/PstI-Fragment ausgeschnitten und zum pCIB1711-Gerüst durch 2-Wege-Ligation unter Umkehrung der Orientierung des 35S-Promotorfragments zur Bildung von p2RSLuc wiederhergestellt.
3. mRNA-Synthese
Die T7lucA50- und T7RecA50-Plasmide (4A und 4B) wurden mit HindIII linearisiert, das unmittelbar stromabwärts des poly(A)-Abschnitts schneidet. Linearisierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann in Ethanol ausgefällt. In-vitro-Transkription der linearisierten DNA wurde unter Verwendung der T7-Polymerase aus dem T7 Cap-Scribe-Kit, das [m⁷G(5')ppp(5')] enthält (Boehringer), durchgeführt. Für einige Experimente wurde das Transkriptionsprodukt unmittelbar mit RNase-freier DNase (0,03 U/ml, Worthington Biochemical) in Gegenwart von rRNasin (1 U/ml, Promega) für 5 min bei 37°C behandelt und schließlich mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die Integrität und Konzentration von mRNA wurden durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
4. Sterilisation von biolistischen Geräten
Goldpartikel (1,0 μm – Biorad, 0,3 μm – Heraeus) wurden durch Plazieren von 60 mg der Partikel in 100 % Ethanol und 0,1 % DEPC sterilisiert. Die Partikel wurden 3-mal mit RNase-freiem Wasser gespült und dann in 1 ml RNAse-freiem Wasser oder 1 ml RNAse-freier 50%iger Glycerin-Lösung resuspendiert. Teilmengen von 50 μl der hergestellten Partikel wurden für 6 Schüsse verwendet. Makroträger wurden in 100%iges Ethanol und 0,1 % DEPC getaucht, dann 3-mal in 100%igem Ethanol gespült und luftgetrocknet. Bremsschirme wurde autoklaviert.
5. Nukleinsäureausfällung
DNA wurde auf eine 50 μl-Suspension von Goldpartikeln (60 mg/ml) unter Befolgen der Anweisungen von Biorad ausgefällt. mRNA wurde auf eine 50 μl-Suspension von Goldpartikeln unter im Text angegebenen verschiedenen Bedingungen ausgefällt. Alle Ausfällungsreagenzien waren RNase-frei und wurden zur Goldpartikelsuspension während kontinuierlichem Verwirbeln bei 4°C gegeben. Nach Zugabe aller Reagenzien wurde das Verwirbeln für 3 Minuten fortgesetzt, worauf die Partikel durch kurzes Mikrozentrifugieren (1 min) sedimentiert wurden. Der Rückstand wurde entfernt und die Partikel wurden einmal mit kaltem 100%igem Ethanol gewaschen und in 60 μl 100%igem Ethanol resuspendiert. Diese Mischung wurde verwirbelt, und 10 μl-Teilmengen wurden auf eine Makroträgerscheibe pipettiert und in einem Abzug mit laminarem Strom luftgetrocknet.
6. Mikroprojektilübertragung auf Pflanzenzellen
Mikroprojektile wurden auf Pflanzenzellen durch einen Partikelbeschleuniger (PDS-1000/He-Vorrichtung) unter Verwendung von Berstscheiben mit 1100–1550 psi übertragen, wobei sich die Probe 5,5 cm entfernt von der Startvorrichtung befand. Ein Sieb mit 100 μm Maschenweite aus rostfreiem Stahl wurde auf der Hälfte zwischen dem Bremsschirm und dem Gewebe plaziert. Zielplatten wurden einmal (Tabakzellen) oder 2-mal (Maiszellen) bombardiert.
7. Luciferase-Assays
Luciferase wurde in Gewebeextrakten mit dem Luciferase-Assaysystem von Promega gemäß Herstellerempfehlung getestet. Die Luciferaseaktivität wird als Lichteinheiten ausgedrückt, detektiert mit einem Luminometer Analytical Luminescence Modell 2001, integriert über 10 s bei 25°C. Zur Berechnung der spezifischen Aktivität wurde die Protein-Konzentration unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Assay-Kit bestimmt.
Ergebnisse
1. Ausfällung von intakter mRNA auf Goldpartikeln
Zur Optimierung der mRNA-Übertragung und anschließenden Expression wurden mehrere Verfahren zur Ausfällung von mRNA auf Goldpartikeln untersucht, und der Zustand und die Gewinnung von mRNA in der Ausfällung und im Überstand wurden durch Elektrophorese an Agarosegelen analysiert. Fraktionen wurden als "Überstand" (direkt aus der anfänglichen Ausfällungsreaktion pipettiert), "Gold" (in Wasser nach mRNA-Ausfällung suspendierte Goldpartikel) und "Wassereluat" (der Überstand, nachdem in Wasser suspendierte mRNA-beschichtete Goldpartikel zentrifugiert wurden) bezeichnet. Das Wassereluat wurde zur Bestimmung untersucht, wie leicht die ausgefällte mRNA nach Übertragung auf die Pflanzenzelle erneut gelöst werden konnte.
Wenn sie dem DuPont-DNA-Ausfällungsverfahren mit 1,0 M CaCl₂ und 16 mM Spermidin unterworfen wurde, wurde mRNA ernsthaft beschädigt (Daten nicht gezeigt). Die freie Base von Spermidin verursacht wahrscheinlich eine alkalische Hydrolyse von RNA. Entsprechend wurden verschiedene Konzentrationen von CaCl₂ (1,0 M, 0,3 M und 0,07 M) ohne Spermidin zur Ausfällung von mRNA auf Goldpartikeln untersucht. 1,0 M CaCl₂ ergab überlegene Ergebnisse, und eine Inkubation von Goldpartikeln mit RNA in 1,0 M CaCl₂ bei –20°C über Nacht erwies sich als Verbesserung der Effizienz auf 90– 100 %. Die mRNA löste sich leichter von den Partikeln in das Wassereluat nach zwei Ethanolspülungen als nur nach einer, vermutlich wegen der CaCl₂-Entfernung.
2. Transiente Expression von Luciferase-mRNA nach biolistischer Übertragung
Zur Bestimmung, ob auf Goldpartikel in dieser Weise ausgefällte mRNA den biolistischen Übertragungsprozeß überlebt und transient in Pflanzenzellen funktionieren kann, wurde in vitro synthetisierte Luciferase-RNA auf Pflanzenzellen übertragen. Die CaMV35S-Leitsequenz und ein poly(A)-Schwanz mit 50 Adenylat-Resten wurden in das T7LucA50-Matrizenkonstrukt in einem Versuch eingeführt, die Luciferaseexpression in Pflanzenzellen zu steigern. Verkappte Luciferase-mRNA wurde auf Goldpartikeln mit 1,0 M CaCl₂ ausgefällt und über Nacht bei –20°C inkubiert, und die Partikel wurden in Mais- und Tabaksuspensionszellen bombardiert. Luciferase-Assays wurden 2, 6 und 24 Stunden nach der Übertragung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt. Nach 2 Stunden wurde eine signifikante Luciferaseaktivität detektiert. Die Aktivität erhöhte sich nach 6 Stunden, nahm aber nach 24 Stunden ab. Im Gegensatz war die transiente Expression des DNA-Plasmids, das das 35-Luciferase-Gen enthielt (pCIB1711), ausgefällt auf Goldpartikeln durch das BioRad DNA-Schema, am höchsten nach 24 Stunden.
Tabelle 3: Aufzeigen von Luciferaseaktivität in Tabakzellen und Maiszellen nach Bombardierung mit Luciferase-RNA. Die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen (Lichteinheiten/μg Protein) zu 2 h, 6 h und 24 h nach der Bombardierung sind gezeigt.
3. Demonstration, daß das R/RS-Rekombinasesystem in Mais funktioniert: ein invertierter Promotor wird geflippt, um die transiente Luciferase-Expression einzuschalten
Zur Untersuchung, ob das ortsspezifische Rekombinasesystem R/RS aus Z. rouxii in Mais funktionieren würde, wie es berichtet wurde, daß es in Tabak funktioniert (Onouchi et al., 1991), wurde ein doppelter transienter Expressionsassay verwendet, in dem R-Rekombinase, transient exprimiert in Maiszellen, einen Promotor flippen muß, um die transiente Expression eines gleichzeitig übertragenen kryptischen Luciferase-Gens einzuschalten. Als Positivkontrolle wurde der doppelte transiente Assay in Tabakzellen getestet. Durch Mikroprojektilbombardierung wurde das pRec-Plasmid (4D), das ein 35S-Rekombinasegen enthält, gleichzeitig auf Maiszellen mit dem kryptischen Luciferaseplasmid p2RSLuc (4F) übertragen. Das Flippen des Promotors von p2RS würde eine Kopie von RS (31 bp) zwischen dem Promotor und dem luc-Gen zurücklassen, dessen Einfluß auf die luc-Expression unbekannt war. Wir konstruierten deshalb auch ein Plasmid als Positivkontrolle. p1RSLuc wurde deshalb auch konstruiert (4E), um das erwartete Produkt von p2RSLuc zu simulieren, invertiert durch Rekombinase. p1RSLuc enthält den korrekt orientierten, aber durch einen einzelnen RS-Ort von der Leitsequenz und der Luciferase-codierenden Sequenz getrennten CaMV355-Promotor. Es wurde festgestellt, daß p1RSLuc auf einem ähnlichen Niveau zu demjenigen von pCIB1711 sowohl in Tabak als auch in Mais exprimiert wurde (Daten nicht gezeigt); somit hat der RS-"Fußabdruck" im Gen nur eine geringfügige Wirkung auf die luc-Expression.
Eine Mischung aus Plasmiden p2RSLuc und pRec sowie die Kontrollplasmide p2RSLuc allein, p1RSLuc und p1RSLuc plus pRec wurden auf Goldpartikeln durch das BioRad-Protokoll ausgefällt und in Tabak- und Maiszellen bombardiert (Tabelle 4). Während R-Rekombinase das luc-Gen in Tabak mit wenigstens 4 % Effizienz nach 24 Stunden einschaltete (26 000 gegenüber 597 000 Lichteinheiten/μg Protein), schien der Prozeß weit weniger effizient in Mais zu sein mit nur 0,27 % Effizienz (53 gegenüber 20 000 Lichteinheiten/μg Protein). Die in Mais detektierte sehr geringe Aktivität wurde tatsächlich als signifikant und reproduzierbar festgestellt. Das Merkmal, das die Rekombinaseaktivität in Mais in diesem Experiment begrenzt, könnten nukleare (geringe Transkription, falsche Spleißorte, Versagen der mRNA, den Kern zu verlassen) oder cytoplasmatische Ereignisse (Anhalten der Translation, seltene Codonverwendung, mRNA-Instabilität, etc.) sein. Falls das Problem nuklear wäre, sahen wir voraus, daß es durch die biolistische Übertragung von Rekombinase-mRNA umgangen werden könnte, die vermutlich das Transkript direkt in das Cytoplasma einführen würde.
Tabelle 4: Rekombinaseaktivität in Tabak- und Maiszellen nach Bombardierung. Ergebnisse des Mittelwerts und der Standardabweichung der Luciferaseaktivität (Lichteinheiten/μg Protein) aus 6 Wiederholungen für Tabakzellen und 3 Wiederholungen für Maiszellen.
Der Zielort für die Z. rouxii-Rekombinase wurde zuvor auf eine 58 bp-Region eingeengt (Matsuzaki et al., Molecular and Cellular Biology 8, 955–962 (1988)), die die hier eingesetzten 31 bp Palindromsequenz einschloß. Unsere Ergebnisse zeigen, daß das 31 bp-Palindrom ausreichend ist, um das R-Gen-vermittelte Flippen des Promotors unseres kryptischen Luciferasekonstrukts zu erlauben. Somit ist diese abgekürzte RS-Sequenz ausreichend für die ortsspezifische Rekombination sowohl in Tabak als auch in Mais.
4. Transiente Expression von Luciferase-DNA über Rekombinase-mRNA-Aktivität
Rekombinase-mRNA wurde mit p2RSLuc-DNA auf Goldpartikeln unter Bedingungen co-präzipitiert, die die RNA-Gewinnung begünstigen: 1,0 M CaCl₂ und Inkubation über Nacht bei –20°C. Die Partikel wurden in Maiszellen bombardiert, und Luciferaseaktivitäten wurden 2 und 24 Stunden später gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 5 gezeigt. Die Luciferaseexpression war 2 Stunden nach der Bombardierung vernachlässigbar. Nach 24 Stunden war die Luciferase-Expression sowohl für die mRNA-Rekombinasebehandlung als auch für die 35S-Rekombinase-DNA, die auf das 2RS-kryptische Luciferaseplasmid wirkte, offensichtlich. Die Inversionsreaktion, wenn sie sich dem Gleichgewicht nähert, erreicht einen Gleichgewichtszustand mit 50 % "ein" und 50 % "aus"-Orientierungen des Promotors. Die maximale erwartete Stärke der Luciferaseexpression wäre somit 50 % derjenigen der p1RSLuc-Aktivität. Das mRNA-angetriebene Flipping erreichte die überraschend hohe Effizienz von 67 % des theoretischen Maximums. Die Effizienz der DNA-angetriebenen Inversion wurde auch signifikant verbessert, jedoch zeigte das äußerst geringe Niveau der p1RSLuc-Expression, daß das für mRNA entwickelte Ausfällungsverfahren sehr ineffizient für DNA war. Deshalb wurden weitere Ausfällungsbedingungen untersucht, um einen optimalen Kompromiß zu suchen, der effektiv für sowohl DNA als auch RNA war.
Tabelle 5: Demonstration der Rekombinase-RNA-Aktivität in Maiszellen. Die Luciferaseaktivität ist als Lichteinheiten pro μg Protein ausgedrückt und wurde 2 Stunden und 24 Stunden nach der Bombardierung gemessen.
5. Effiziente Co-Präzipitation von mRNA und DNA auf Goldpartikeln
In einer Anstrengung, die Effizienz der gleichzeitigen Übertragung von DNA mit mRNA zu verbessern, untersuchten wird erneut die Verwendung von Spermidin in der Ausfällungsmischung, aber schlossen die Zugabe von Tris-Puffer ein, um den pH abzusenken und möglicherweise den RNA-Abbau zu vermeiden. In Gegenwart von 50 mM Tris-Puffer bei pH 7,5 wurden DNA und mRNA auf Partikeln unter Verwendung von 1,0M CaCl₂ und 2, 4, 10 oder 16 mM Spermidin co-präzipitiert. Die Effizienz der Nukleinsäureausfällung wurde durch Agarosegelelektrophorese wie oben beschrieben untersucht. Intakte DNA und mRNA wurden effizient auf Partikeln bei allen Spermidinkonzentrationen ausgefällt (Daten nicht gezeigt). Die geringste Konzentration erlaubte es mehr DNA und mRNA, sich von den Partikeln in das Wasser erneut zu lösen, ein möglicher Vorteil für die transiente Expression und stabile Transformation.
In einer endgültigen Verfeinerung variierten wir die Konzentration von Tris-Puffer und untersuchten auf Effizienz durch das Kriterium der biologischen Aktivität: Luc-mRNA wurde unter Verwendung von 2 mM Spermidin mit 5 mM (Behandlung A) oder 50 mM (Behandlung B) Tris-Puffer pH 7,5 ausgefällt und in Maiszellen bombardiert. 5 Stunden nach der Bombardierung betrugen die transienten Expressionswerte 1091 und 8000 Lichteinheiten/μg Protein für die Behandlungen A bzw. B. Die unter Verwendung von 50 mM Tris erreichte höhere mRNA-Aktivität stellt eine 3- bis 4-fache Verbesserung gegenüber vorhergehenden Ausfällungsbedingungen mit 1,0 M CaCl₂ und Inkubation über Nacht bei –20°C (Tabelle 1) dar.
Die Behandlungen A und B wurden verwendet, um Rekombinase-mRNA mit p2RSLuc-DNA auszufällen, die in Mais- und Tabakzellen bombardiert wurde. Luciferaseaktivität wurde nach 24 Stunden gemessen, wobei die Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt sind. Die DNA-Expression verbesserte sich unter Verwendung von sowohl 5 mM als auch 50 mM Tris, aber die Werte erreichten nicht diejenigen, die unter Verwendung des BioRad-Ausfällungsverfahrens erreicht wurden (Tabelle 4). Bedingungen, die die mRNA-Expression begünstigen, 50 mM Tris, ergaben die höchsten Effizienzwerte von Rekombinaseaktivität bei 18,9 % und 9,4 % für Mais bzw. Tabak. Obwohl die Rekombinaseeffizienz geringer als in Tabelle 1 beobachtet ist, ist der höhere Wert der DNA-Expression wichtig zum Erreichen einer stabilen Transformation. Wir schließen daraus, daß eine geringe Spermidinkonzentration, gepuffert mit Tris, mit RNA- und verbesserter DNA-Expression verwendet werden könnte.
Tabelle 6: Rekombinase-mRNA-Expression in Tabak- und Maiszellen. mRNA (4 μg/6 Schüsse), p2RSLuc-DNA (2 μg/6 Schüsse) und p1RSLuc-DNA (2 μg/6 Schüsse) wurden in Tabak- und Maiszellen bombardiert. Aus dem β-Glucuronidase-Gen synthetisierte mRNA wurde in Kontrollexperimenten verwendet. Luciferaseaktivität, ausgedrückt als Lichteinheiten/μg Protein wurde 24 Stunden nach der Bombardierung gemessen.
E. Diskussion
Wir berichten hier über ein Verfahren zur gleichzeitigen Übertragung von mRNA und DNA durch Partikelbombardierung, das die transiente Wirkung des mRNA-codierten Proteins auf das DNA-Molekül ermöglicht. Gleichzeitige Übertragung ("Co-Übertragung") von mRNA und DNA erlaubt die Einführung von trans-wirkenden Funktionen in die Zelle ohne die Möglichkeit der permanenten Expression, die aus stabiler Transformation resultiert. Die mRNA-codierte Rekombinase wird nur transient aktiv während eines kurzen Zeitraums zum Zeitpunkt der Übertragung. Dieser Ansatz kann zur ortsspezi fischen Einführung von Donor-DNA in einen RS-Ort im Pflanzengenom ohne die Komplikation der Rekombinaseexpression in der resultierenden Pflanze verwendet werden.
Sowohl die Agarosegel- als auch Luciferase-Expressionsstudien zeigen, daß Bedingungen, die die DNA-Übertragung begünstigen, nicht optimal für mRNA sind und umgekehrt. Durch unterschiedliche Ausfällungsbedingungen kann man eine der zwei begünstigen, um optimale Grade an umgelagerter DNA in der Zielpflanzenzelle zu erreichen. Elektrophoretische Analyse der Nukleinsäure auf den Goldpartikeln nach Ausfällung erwies sich als ein elegantes Mittel zur qualitativen und quantitativen Bewertung der Effizienz der unterschiedlichen Ausfällungsbedingungen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um weitere Verfeinerungen der Nukleinsäureübertragungsbedingungen durch Partikelbombardierung zu erforschen. Die letztliche Diagnostik muß jedoch die biologische Aktivität sein, da Gelelektrophorese nur die Bruttobeschädigung detektieren kann.
Die exogen in dieser Studie eingeführten mRNA-Moleküle wurden mit drei Merkmalen konstruiert, die dafür bekannt sind, eine Rolle in der effizienten Transkriptexpression zu spielen. Eine Verkappung wurde am 5'-Terminus addiert, um als Erkennungsort für die Bindung des eukaryontischen Startfaktors zu wirken, ein früher und wesentlicher Schritt in der Translation. Eine Poly(A)-Schwanz mit 50 Adenylatresten wurde an den 3'-Terminus während der In-vitro-Transkription synthetisiert, da nicht-adenylierte mRNAs ca. 100- bis 200-fach weniger effizient als ihre adenylierten Entsprechungen in elektroporierten Tabak-, Karotten-, Mais- und Reisprotoplasten translatieren (Gallie et al., 1989 Plant Cell). Die Effizienz einer polyadenylierten mRNA wurde ebenfalls als um eine Größenordnung gesteigert in Gegenwart der 5'-Verkappung nachgewiesen (Gallie, 1991). Die untranslatierte Leitsequenz von CaMV35S wurde eingeschlossen, und es wurde gezeigt, daß sie die Expression in sowohl Tabak als auch in Mais steigert (Gallie et al., 1989 Plant Cell; Dowson Day et al., 1993).
Die direkte Übertragung von mRNA auf Pflanzenzellen liefert Vorteile für die Untersuchung von Zellfunktionen. mRNA-Stabilität und Translationseffizienz können in vivo unabhängig von Transkriptionsfaktoren, Reifung und Transport in das Cytoplasma untersucht werden. Elektroporation (Higgs & Colbert, 1993) und Polyethylenlgykol (Gallie, 1993, Plant Cell Reports) haben sich als nützliche und effiziente Verfahren zur Einführung von mRNA in Pflanzeprotoplasten erwiesen. Jedoch sind diese Übertragungsverfahren auf Protoplasten beschränkt, wohingegen die biolistische Übertragung weithin für viele Arten von Pflanzenzellen und -organen anwendbar ist. Proteine, die nachteilig oder zu schädlich bei stabiler Expression in transgenen Pflanzen sein könnten, können transient aus durch Biolistik übertragener mRNA exprimiert werden. Die Rekombinaseexpression in der R/RS-Pflanze könnte zum Beispiel zu Mosaikmustern des Ausschneidens führen, genauso wie genetische Kreuzungen, die zwischen Rekombinase-Gen-haltigen Pflanzen und Zielort-haltigen Pflanzen durchgeführt werden, häufig zu chimärerer Rekombinationsaktivität und Mosaikexpression in F1-Pflanzen führen (Russell et al., 1992, Onouchi et al., 1995).
Zur Erzeugung von erfolgreich verbesserten transgenen Konstrukten in einer Nutzpflanze kann das R/RS-System verwendet werden, um die neuen Gene in der genauen Position der alten zu ersetzen. Somit können eine erste transgene Kassette und ihr selektierbarer Marker (flankiert von RS-Orten) durch eine zweite mit einem unterschiedlichen selektierbaren Marker ersetzt werden. Im Gegenzug kann die zweite schließlich durch eine dritte unter erneuter Verwendung des ersten selektierbaren Markers ersetzt werden. Dieser Ansatz würde die Anzahl der erforderlichen selektierbaren Marker reduzieren und würde eine Positionseffektvariation in der transgenen Kassette vermeiden.
Die Verwendung von ortsspezifischen Rekombinationssystemen in Pflanzen bietet das Potential für eine größere Kontrolle der transgenen Insertion und Expression. Rekombinasesysteme haben die Insertion an einem vorher festgelegten Ort in einem Genom ermöglicht und können sogenannte "Positionseffekte" umgehen (Fukushige & Sauer, 1992; Lakso et al., 1992; O'Gorman et al., 1991). Rekombinase-vermittelte Deletions- und Inversionsereignisse von Transgenen haben die Kontrolle der Genexpression und Entfernung von selektierbaren Markergenen erlaubt (für eine Übersicht siehe Odell & Russel, 1994). Die Einführung von Rekombinaseaktivität in Form von mRNA kann diese Verwendung durch Forcieren des Auftretens von Rekombinationsereignissen früh im Transformationsprozeß ausdehnen, wobei das Risiko für Mosaizismus reduziert wird. Zusätzlich sollte mRNA-Übertragung einen größeren Flexibilitätsgrad bei der Schaffung von ortsspezifischen Integrationsschemata liefern, die die Einführung von genetischer Rekombinaseinformation in das Genom vermeiden.
Beispiel 4: Co-Bombardierung von mRNA, die die integrationsfördernden Proteine VirD1 und VirD2 codiert, mit DNA in Tabak- und Maiszellen
Wie in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung angegeben, wird erwartet, daß die integrationsfördernden Proteine, die auf die Pflanzen zelle übertragen werden, auf die zur Transformation über eine translatierbare RNA abgezielt wird, für einen endlichen Zeitraum erzeugt werden, bis die translatierbare RNA abgebaut ist. Es wird erwartet, daß das aus dieser RNA erzeugte Protein in der Pflanzenzelle für einen endlichen Zeitraum verbleibt, bevor es durch normale zelluläre Prozesse ebenfalls abgebaut wird. Somit stellt die Übertragung von integrationsfördernden Proteinen in Form von translatierbarer RNA einen Weg zur transienten Übertragung solcher Proteine dar. Die transiente Übertragung dieser Protein kann in denjenigen Situationen bevorzugt sein, in denen die fortgesetzte Gegenwart solcher Proteine unerwünschte Wirkungen haben kann. Das folgende Beispiel beschreibt einen solchen Ansatz zur Übertragung von VirD1- und VirD2-Proteinen auf Pflanzenzellen zusammen mit einem durch T-DNA-Ränder gebundenen DNA-Fragment. Die angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Vir-Proteine ihre verbundene integrationsfördernde Aktivität erzeugten und auf das DNA-Fragment übertrugen.
Verwendete Pflanzenmaterialien:
Maiszellen:
Suspensionskulturen von Mais (Zea mays L.), gestartet aus gefrierkonserviertem embryogenem Kallus Typ II, ausgewählt aus unreifen Embryos einer mit B73 verwandten Elitelinie (2717), wurden in N6-Flüssigmedium (Chu et al., 1975) kultiviert, ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Die Kulturen wurden bei 25°C in der Dunkelheit auf einem Rundschüttler mit 150 U/min inkubiert. Die Suspensionskulturen wurden alle 7 Tage durch Übertragen von 1 ml Packed-Cell-Volumen in 50 ml frisches 2N63S-Flüssigmedium subkultiviert. Für Bombardierungsexperimente verwendete Maiszellsuspensionen wurden aus 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen entnommen. Vor der Bombardierung wurden ca. 0,5 ml Packed-Volume-Zellen auf 7 cm-Filtern (Whatman Nr. 4) vakuumfiltriert.
Tabakzellen:
Die Nicotiana tabacum-Zellinie NT-1 wurde in Murashige-Skoog-Medium, ergänzt mit 2 mg/l 2,4-D und Saccharose (30 g/l), kultiviert. Die Zellen wurden einmal pro Woche durch Zugabe von 5 ml Inokulum auf 100 ml frisches Medium in 500 ml-Kolben subkultiviert. Die Kolben wurden bei 27°C auf einem Rundschüttler mit 125 U/min inkubiert. Teilmengen von 0,5 ml aus den Zellen, 4 Tage nach der Subkultur, wurden auf einem sterilen Filter (Whatman Nr. 4) ausgebreitet. Die Filter wurden dann auf MS-Medium überführt.
Plasmidkonstruktion:
1 – Konstruktion eines Vektors, der den T7-Promotor und den polyA-Schwanz enthält:
Ein Polylinker (SphI-EcoRI-NheI-ClaI-BglIl-Asp718-HindIII-XhoI-Hind*III, unter Inaktivierung des HindIII-Orts) wurde in die SphI-HindIII-Orte von pT7RecA50 inseriert (siehe Beispiel 3). Das Oligonukleotid Asp718-A(50)-DraI-HindIII wurde dann in die entsprechenden Orte inseriert, was zu pT7-A50 führte.
2 – Konstruktion von pT7D1A50:
Das EcoRI-Bg1I2-Fragment, das die VirD1-codierende Region erhielt, die zuvor in EcoRI-BamHI von pSG5 (aus dem EcoRI-BamHI-Fragment von p35SAdh1D1) kloniert wurde, wurde in mit EcoRI und BglII verdautes pT7-A50 inseriert.
3 – Konstruktion von pT7D2A50:
Zwei Fragmente, EcoRI-BamHI (5'-Terminus) und BamI-ClaI (3'-Terminus), der VirD2-codierenden Region wurden in EcoRI-ClaI von pT7-A50 kloniert. Der 3'-Terminus wurde zuerst als BamHI-HaeIII-Fragment im BamHI-EcoRV des pBluescript-Plasmids pSK kloniert, um es zu einem BamHI-ClaI-Fragment umzuwandeln.
mRNA-Synthese:
Die T7D1A50- und T7D2A50-Plasmide wurden mit XhoI linearisiert, das unmittelbar stromabwärts des Poly(A)-Abschnitts schneidet. Linearisierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol ausgefällt. In-vitro-Transkription von linearisierter DNA wurde unter Verwendung der T7-Polymerase aus dem T7 Cap-Scribe-Kit durchgeführt, das [m⁷G(5')ppp(5')] enthält (Boehringer). Die Integrität und Konzentration von mRNA, die VirD1 und VirD2 codiert, wurden durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
Sterilisation von biolistischer Ausrüstung:
Goldpartikel (0,3 μm – Heraeus) wurden durch Plazieren von 60 mg Partikel in 100 % Ethanol und 0,1 % DEPC sterilisiert. Die Partikel wurden 3-mal mit RNase-freiem Wasser gespült und dann in 1 ml RNAse-freier 50%iger Glycerin-Lösung resuspendiert. Teilmengen von 50 μl an hergestellten Partikeln wurden für 6 Schüsse verwendet. Makroträger wurden in 100 % Ethanol und 0,1 % DEPC getaucht, dann 3-mal in 100 % Ethanol gespült und luftgetrocknet. Bremsschirme wurden autoklaviert.
Nukleinsäureausfällung:
DNA (1 μg) und mRNA (etwa 8 μg: 4 μg VirD1 und 4 μg VirD2 oder 8 μg unspezifische mRNA für die Kontrolle) wurden auf einer 50 μl-Suspension von Goldpartikeln (60 mg/ml; 0,3 μm) durch aufeinanderfolgende Zugabe von 0,5 μl Tris-Puffer (1 M), 50 μl CaCl₂ (2,5 M) 2,5 μl 0,1 M Spermidin ausgefällt. Nachdem alle Agenzien zugegeben waren, wurde das Verwirbeln für 3 Minuten fortgesetzt, worauf die Partikel durch kurzes Mikrozentrifugieren (1 min) sedimentiert wurden. Der Überstand wurde entfernt, und die Partikel wurden einmal mit kaltem 100%igen Ethanol gewaschen und in 60 ml 100%igem Ethanol resuspendiert. Diese Mischung wurde verwirbelt, und 10 μl-Teilmengen wurden auf eine Makroträgerscheibe pipettiert und in einem Abzug mit laminarem Fluß luftgetrocknet.
Mikroprojektilübertragung in Pflanzenzellen:
Mikroprojektile wurden auf Pflanzenzellen durch einen Partikelbeschleuniger (PDS-He 1000; DuPont) unter Verwendung von 1100 psi Berstscheiben übertragen, wobei sich die Probe 5,5 cm entfernt von der Abschußvorrichtung befand. Ein Gitter mit 100 μm mesh aus rostfreiem Stahl wurde auf halber Strecke zwischen der Bremsplatte und dem Gewebe plaziert. Die Zielplatten wurden zweimal bombardiert.
Luciferase-Assays
Luciferase wurde in Gewebeextrakten mit dem Luciferase-Assaysystem von Promega gemäß Herstelleranweisung untersucht. Luciferaseaktivität wird als Lichteinheiten ausgedrückt, detektiert durch Luminometer "Analytical Luminescence" Modell 2001 für 10 s bei 25°C. Zur Berechnung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration unter Verwendung des Bio-Rad Proteinassaykit bestimmt.
Ergebnisse:
Luciferase-Assays wurden 24 h nach der Bombardierung durchgeführt. mRNA von VirD1 und VirD2 wurde mit p35SRBLuc co-bombardiert, das eine zwischen dem 35S-Promotor und der Luciferase-codierenden Sequenz inserierte rechte Randsequenz enthält. Im Kontrollexperiment wurde p35SRBLuc mit unspezifischer mRNA bombardiert. Die Ergebnisse eines Anfangsexperiments sind nachfolgend in Tabelle 7 gezeigt. Die Ergebnisse eines anschließenden Experiments werden in Beispiel 8 beschrieben und sind in Tabelle 14 gezeigt.
Tabelle 7: Bombardierung von Pflanzenzellen mit VirD1- und VirD2-mRNA. Zahlen in Klammern zeigen das Molverhältnis von Plasmiden zu mRNA an. pGUS wurde auch in jedem Experiment co-bombardiert. Nach Inkubation für 24 h wurden Gewebe homogenisiert und Enzymaktivitäten bestimmt. Aktivitäten werden als Verhältnis von Luciferase (Luc) zu β-Glucuronidase (Glu) ausgedrückt. Unabhängige Bombardierungen wurden analysiert und Daten sind als Mittelwerte von drei Wiederholungen plus oder minus Standardabweichung dargestellt.
Schlußfolgerung:
Nach Co-Übertragung von VirD1-mRNA und VirD2-mRNA mit pRB(+)Luc-DNA wurde eine 50%ige Abnahme der Luciferaseaktivität in diesem Experiment beobachtet (Tabelle 7). Die als mRNA auf die Pflanzenzelle übertragenen zwei vir-Gene schienen eine synergistische Wirkung zu haben. Diese Beobachtungen weisen stark darauf hin, daß die beobachtete Abnahme der Luciferaseaktivität das Ergebnis eines strangspezifischen Bruchs ("Nick") an der rechten Randsequenz durch die VirD1- und VirD2-Proteine war.
Beispiel 5: T-Strang-Integration in das Maisgenom, erzeugt in der Pflanze
Zusammenfassung
Eine neue, hier als "agrolistisch" bezeichnete Pflanzentransformationstechnik wurde entwickelt, die die Integration allein des Gens von Interesse, ohne Vektorsequenz, wie in T-DNA-Inserten, und die Kontrolle der Kopiezahl erlaubt. Der Ansatz besteht in der Verwendung von Pflanzenexpressionskassetten für Virulenzgene, gleichzeitig übertragen durch die Biolistic-Vorrichtung mit einem Vektor, der T-DNA-Randsequenzen enthält, die einen selektierbaren Marker flankieren. In der vorliegenden Untersuchung wurde das Weizenzwergvirus (WDV) als replizierender Vektor zur Einführung von pflanzenexprimierbaren Virulenzgenen (VirD1, VirD2 und VirE2) und eines selektierbaren Markers, flankiert von den linken und rechten Randsequenzen, in Maiszellen gewählt. Es wurde festgestellt, daß VirD1- und VirD2-Genprodukte tatsächlich T-DNA-Randsequenzen in der Pflanze spalten und Insertionsereignisse vom T-DNA-Typ ("agrolistische" Ereignisse) nach biolistischer Übertragung erzeugen können.
Einleitung
Agrobacterium wird weithin als Werkzeug zur genetischen Manipulation oder Veränderung von Pflanzenzellen durch Transformation verwendet. Eine besondere Region seines pathogenen Plasmids, die T-DNA, wird in das Pflanzengenom übertragen und stabil darin integriert. Die T-DNA wird durch direkte Repeat-Sequenzen mit 25 bp, die als Randsequenzen bezeichnet werden, begrenzt (für eine Übersicht siehe Zupan & Zambryski, 1995). Jede zwischen T-Rändern befindliche DNA-Sequenz kann effizient aus Agrobacterium auf die Pflanzenzellen übertragen werden. Jedoch ist der T-DNA-Transfer und ihre Integration durch den Wirtebereich des Bakteriums beschränkt, was eine effiziente Transformation der meisten zweikeimblättrigen, aber nur weniger einkeimblättriger Pflanzen erlaubt (für eine Übersicht siehe Chilton, 1994).
Um die Lücke zu füllen, die aus dem beschränkten Wirtebereich von Agrobacterium entsteht, ist es wünschenswert, effiziente Verfahren zur genetischen Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen zu finden. Ein mögliches Verfahren besteht in der Erzeugung des T-Komplexes in der Pflanze durch Bereitstellen aller Werkzeuge für die Pflanzenzellen, die notwendig für die Rekonstruktion des Komplexes sind. Diese Werkzeuge sind: 1) das interessierende Gen, flankiert von Randsequenz, und 2) die Virulenzgene unter der Kontrolle einer Pflanzeexpressionskassette. Die VirD1- und VirD2-Genprodukte sind wesentlich für den Schlüsselschritt der T-DNA-Reifung (für eine Übersicht siehe Zupan & Zambryski, 1995). VirD2 ist eine strangspezifische Endonuklease, die bei Unterstützung durch VirD1 spezifische Randsequenzen kennt. Beim Schneiden bleibt VirD2 kovalent an das 5'-Ende der einsträngigen DNA oder des T-Strangs gebunden. Der T-Strang ist durch ein einzelnes einsträngiges Bindungsprotein virE2 geschützt. Der resultierende Nukleoproteinkomplex wird aus der Pflanzenzelle exportiert. VirD2 enthält Kernlokalisierungssignale, die den T-Strang in den Kern der Pflanzenzelle schleusen. VirD2 kann an der Ligation des 5'-Endes des T-Strangs an das Pflanzengenom teilnehmen (Tinland et al., 1995).
In der vorliegenden Untersuchung wurde das Weizenzwergvirus (WDV; Ugaki et al., 1987) als replizierender Vektor in Pflanzen gewählt, um die Bildung von T-Strängen in der Pflanze und seine Integration in das Pflanzengenom zu untersuchen. Der Zweck der Verwendung eines solchen Vektors besteht darin, daß sich Geminiviren im Pflanzenzellkern in hohen Kopiezahlen vermehren und eine hochgradige Expression erlauben.
Materialien und Methoden
Plasmide (siehe 5 für eine schematische Darstellung)
pCIB1711 ist ein pUC-Derivat, das das Leuchtkäferluciferasegen enthält, angetrieben vom Blumenkohlmosaikvirus-35S-(CaMV35S)-Promotor. Es wird in Beispiel 3 beschrieben.
pwiBarRBLuc wurde zur stabilen Transformation von Mais-Suspensionszellen geschaffen und enthält eine linke Randsequenz, das Bar-Gen (Thompson et al. 1987), angetrieben vom CaMV35S-Promotor, und das Luciferase-Gen, wobei die rechte Randsequenz zwischen dem Promotor und der Luciferasecodierenden Region inseriert ist. Das bar-Gen wurde aus pCIB3064 (Koziel et al., 1993) als HindIII-EcoRI-Fragment ausgeschnitten. Der linke Rand wurde aus pBin19 als BglII-EcoRI-Fragment ausgeschnitten (Bevan, 1984).
VirD1- und VirD2-Gene aus pTiA6 wurden zuerst in Expressionsvektoren pMF6 (Callis et al., 1987) subkloniert, die aus dem CaMV35S-Promotor (0,5 kb), dem ersten Adh1-Intron (0,5 kb) und der Nopalinsynthase-(nos)-Polyadenylierungsregion (0,25 kb) bestanden. Das 0,6 kb EcoRI-PstI-Fragment aus pAD1187 (Vogel und Das, 1992) und das 1,8 kb-Fragment aus pAD1190 wurden in pMF6 kloniert, was p35SAdhD1 bzw. p35SAdhD2 lieferte. Das XbaI-NotI-Fragment aus p35SAdhD1, das das VirD1-Gen unter der Kontrolle des 35S-Promotors umfaßt, wurde in die NheI-Not-Orte eines modifizierten pwi-11 subkloniert. Ein Polylinker (NheI-NotI-SpeI-KpnI-BglII) wurde in die besonderen BamHI-SalI-Orte von pwi-11 eingeführt (Ugaki et al., 1987). Das NotI-Fragment aus p35SAdhD2, das die VirD2-codierende Sequenz unter der Kontrolle des 35S-Promotors umfaßt, wurde in den besonderen NotI-Ort von pwi-11 subkloniert.
Die virE2-codierende Region wurde aus pw108 ausgeschnitten, das ein 3 kb XhoI-Fragment von Agrobacterium Ti-Plasmid pTiA6 enthält (Eingangs-Nr. X04784) (Winans et al., 1987). Das 687 bp SacI-SmaI-Fragment von pw108 wurde zuerst in die entsprechenden Orte von pBluescript KS- (Stratagene, Inc.) kloniert, was zu pKS3'E2 führte. Das 924 bp HaeIII-SacI-Fragment aus pw108 wurde mit dem SacI-PstI-Fragment aus pKS3'E2 und einem verschmolzenen Paar von DNA-Oligonukleotiden, flankiert von EcoRI-kohäsiven und abgestumpften Enden (5'-AATTCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3'; SEQ ID NO:14) kombiniert und in die EcoRI-PstI-Orte von pBluescript KS- kloniert, was zu pKSE2 führte. Ein XhoI-PstI-Fragment, das die gesamte VirE2-codierende Region abdeckte, wurde dann in XhoI-PstI von pMF6 subkloniert, was zu p35SAdhE2 führt. Das NotI-XbaI-Fragment, das den 35S-Promotor, das Adh1-Intron, die virE2-codierende Region und den Nos-Terminator enthält, wurde in die NotI-NheI-Orte von pwi-11 kloniert.
pGUS ist ein pUC-Derivat, das die β-Glucuronidase-(GUS)-codierende Sequenz unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors und das Rhizinuscatalasegen-Intron enthält (Ohta et al., 1990).
Mais-Suspensionszellen:
Die Suspensionskultur von Zea Mays Sorte Black Maxican Sweet (BMS) wurde in N6-Medien gehalten (Chu et al, 1975), ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Für die Bombardierungsexperimente verwendete Maiszellsuspensionen wurden aus 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen entnommen. Vor der Bombardierung wurden ca. 0,5 ml von Packed-Volume-Zellen auf 7 cm-Filtern (Whatman Nr. 4) vakuumfiltriert. Ausplattierte Zellen wurden 4 Stunden bei 25°C vor der Bombardierung auf Phytoagar-verfestigtem 2N6-Medium gehalten, das 120 g/l Saccharose enthielt. Für die stabile Transformation wurden die Filter auf 2N63S-verfestigtes Medium 24 Stunden nach der Bombardierung übertragen. Anschließende Übertragungen der Filter auf frisches Medium mit zunehmender Konzentration von Basta erfolgten in 8-tägigen Intervallen, bis die Mehrzahl der Zellen in der Kultur zu wachsen aufhörte. Dies erfolgte allgemein nach 4 bis 6 Wochen der Selektion auf Platten, die 8 bis 10 mg/l Basta enthielten. Auf dem Filter entwickelte unabhängige Kalli wurden dann auf Phytoagar-verfestigtes Medium übertragen, ergänzt mit Basta (10 mg/l). Nach zwei Subkulturen auf dem gleichen Medium wurden die Suspensionskulturen durch Überimpfen von ca. 100 mg Maiszellen in 25 ml Flüssigmedium, ergänzt mit Basta (10 mg/l), zur DNA-Isolierung eingeleitet.
Bombardierung von Pflanzenzellen
Gewebe wurden mit Goldmikroprojektilen bombardiert, auf die eine Mischung aus Plasmiden ausgefällt war. pGUS-Plasmid-DNA wurde als interne Kontrolle in transienten Experimenten verwendet. Für Co-Transformationsexperimente trugen die Goldpartikel entweder eine gleiche Masse aller Plasmid-DNAs (0,5 μg von jeder Plasmid-DNA pro Zielplatte). Für stabile Transformationsexperimente enthielten Co-Transformationsmischungen ein 1:1-oder 2:1-Molverhältnis von Plasmiden, die die Virulenzgene trugen, zum bar-Selektionsplasmid. Jede Teilmenge von Plasmidmischung, bombardiert pro Zielplatte, bestand aus 0,4 μg des Selektionsmarkers und jeweils 0,4 oder 0,8 μg von pwi35SAdhD1- und pwiAdh35SD2- und/oder pwiAdh35SE2-Plasmid-DNAs.
Geeignete Mengen von jeder DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl vermischt und mit 50 μl 2,5 M CaCl₂ und 20 μl Spermidin freie Base ausgefällt, um die Ausfällung auf 50 μl von 0,3 μm-Goldmikroträgern zu bewirken (60 mg/ml). Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit der PDS-1000-He-Biolistikvorrichtung (DuPont) unter Verwendung von 1100 psi-Berstscheiben durchgeführt, wobei sich die Probe 8 cm unterhalb der Bremsschirmhalterung befand.
Transiente Expressionsassays:
Luciferase wurde in Gewebeextrakten gemäß der Herstellerempfehlung getestet (Luciferase-Assay-System, Promega). β-Glucuronidase-Aktivität wurde durch einen Chemolumineszenz-Test mit dem GUS-Light-Kit (Tropix) bestimmt. Luciferase- und β-Glucuronidase-Aktivitäten werden als Lichteinheiten ausgedrückt, detektiert mit einem Luminometer "Analytical Luminescence" Modell 2001, integriert über 10 s bei 25°C.
DNA-Extraktion und Southern-Blot-Hybridisierung
Zellkulturen wurden durch Filtration 10 Tage nach Inokulation geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. DNA wurde wie beschrieben isoliert (Hall et al., 1991).
Ca. 10 μg genomische DNA wurden für den Verdau mit EcoRI verwendet. Nach Trennung an einem 0,7%igen Agarosegel wurde die DNA auf Amersham Hybond plus-Membran übertragen, und die Hybridisierung wurde gemäß den vom Hersteller (Amersham) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. DNA-Sonden wurden mit [a-³²P]dCPT unter Verwendung des Oligo-Markierungskits von Pharmacia markiert. Die Bar-Sonde entsprach einem 0,5 kb-BglII-Fragment des Bar-Gens. Die luc-Sonde entsprach einem 0,7 kb XbaI-EcoRI-Fragment des Luciferase-Gens. Zur Entfernung von Sonden wurden die Membranen mit einer Lösung von 0,1 % SDS bei 100°C für 5 min gestrippt.
Klonierung von T-DNA/Pflanzen-DNA-Verbindungen
DNA (30 μg) aus transgenen Maiskalli wurde mit EcoRI verdaut und der präparativen Elektrophorese an einem 0,8%igen Agarosegel unterworfen. Scheiben aus Agarose, die der Größe der zu klonierenden Fragmente entsprachen, wurden aus dem Gel geschnitten, und DNA wurde aus Agarose mit dem Gene-Clean-Kit extrahiert. Fragmente wurden dann in den dephosphorylierten EcoRI-Ort von pUC18 kloniert. Ligationsmischungen wurden verwendet, um E. coli HB101-Zellen durch Elektroporation zu transformieren. Kolonien, die das Plasmid mit dem korrekten Insert enthielten, wurden durch Koloniefilterhybridisierung unter Verwendung eines 0,5 kb Bar-Fragments als Sonde identifiziert. DNA aus positiven Klonen wurde dann mit BamHI-EcoRI verdaut.
BamHI hat einen Ort, der sich in einem Abstand von 3 bp von der rechten Randsequenz befindet. Das Fragment wurde in die entsprechenden Orte von pUC18 zurückkloniert. Die Sequenz der Verbindung von Donorplasmid-DNA mit pflanzlicher DNA wurde unter Verwendung des Universalprimers analysiert.
Ergebnisse
Transiente Expressionstests zur Untersuchung auf Spaltung der Randsequenz durch VirD1- und VirD2-Genprodukte in der Pflanze
Zur Untersuchung, ob VirD1- und VirD2-Genprodukte eine T-DNA-Randsequenz bei Expression in Pflanzenzellen brechen können ("Nick"), wurden die Testplasmide pwiRBLuc und pRBLuc getestet. Sie enthielten eine Substrat-T-DNA-Randsequenz zwischen dem Promotor und der codierenden Region des Luciferasegens. pRBLuc ist ein pUC-Derivat, wohingegen pwi ein aus weizenzwergvirus (WDV) stammender Vektor ist, der in Maiszellen replizieren kann und aus den zwei komplementären ORFs, C1 und C2, die für die Replikation des Virus erforderlich sind, und dem p15A-Replikationsstartpunkt aus E. coli besteht. Dieser Vektor enthält nicht ORF V1 und ORF V2, die an der viralen Ausbreitung und Symptomentwicklung beteiligt sind (Ugaki et al., 1991). Ein ortsspezifischer Bruch, eingeführt durch virD1- und virD2-Genprodukte, würde zu einem Bruch des DNA-Strangs führen, der die Matrize für die Luciferase-mRNA ist, und sollte somit die Erzeugung von Luciferasetranskript und -enzym verringern. Nach Co-Bombardierung von Pflanzenzellen mit pRBLuc oder pwiRBLuc und Plasmiden, die die virD-Gene unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors tragen, sollte jedes Brechen an der Randsequenz quantitativ durch Testen von Luciferaseaktivität meßbar sein.
Ein hoher Expressionsgrad des Luciferase-Gens wurde in Maiszellen erreicht, die mit pRBLuc-DNA oder mit pwiRBLuc-DNA bombardiert wurden. Gleichzeitige Übertragung von pwiD1-DNA und pwiD2-DNA mit pRBLuc-DNA oder mit pwiRBLuc-DNA in Maiszellen führte zu einer 10-fachen Abnahme von Luciferase- zu Gus-Aktivität (Tabelle 8). Gleichzeitige Übertragung von pwiD2-DNA mit pwiRBLuc-DNA führte ebenfalls zu einer 10-fachen Abnahme von Luciferase- zu GUS-Aktivität. Dieses Ergebnis kann durch die Tatsache erklärt werden, daß WDV ein Genom hat, das aus einer kreisförmigen einsträngigen DNA zusammengesetzt ist. Sie vermehren sich im Kern von infizierten Zellen über eine doppelsträngige Zwischenstufe, die anschließend als Matrize für die Replikation der DNA des viralen Strangs im rollenden Kreis verwendet wird (Saunders et al., 1991; Stenger et al., 1991). Es wurde gezeigt, daß VirD2 in vitro einsträngiges Oligonukleotid spaltet (Pansegrau et al., 1993; Jasper et al., 1994). Somit ist VirD1 nicht für die Spaltung der ssDNA-Form des Geminivirus erforderlich.
Analyse von stabilen Transformanten
Die stabile Transformation von Mais-Suspensionszellen erfolgte zur Bewertung der Aktivität von virD1- und virD2-Genprodukten auf das Muster der DNA-Integration nach gleichzeitiger Übertragung dieser Gene mit ihrer Substrat-DNA durch die Biolistic-Vorrichtung. Für diese Experimente verwendeten wir pwiBarRBLuc und pBarRBLuc, die einen linken T-DNA-Rand, Bar als selektierbaren Marker und das 35SRBLuc-Gen enthalten, wobei der rechte T-DNA-Rand zwischen Promotor und Luciferase-codierender Region inseriert ist. Die Durchmusterung auf virD-vermittelte Integrationsereignisse war das Fehlen von Luciferaseaktivität im transformierten Klon, die aus dem Ausschluß der Luc-codierenden Region durch T-DNA-Ausschneiden aus pBarRBLuc oder aus pwiBarLuc hervorgeht. Solche Ereignisse, die aus der Aktivität der vir-Genprodukte auf Randsequenzen unter Erzeugung eines T-Strangs resultieren würden, wurden als "agrolistische Ereignisse" bezeichnet. Im Gegensatz waren "biolistische Ereignisse" Inserte im Maisgenom, die den Prozeß darstellen, der normalerweise nach der Genübertragung in Pflanzenzellen durch die Biolistic-Vorrichtung auftritt.
Mais-Suspensionszellen wurden mit Mikroprojektilen bombardiert, die mit pBarRBLuc oder pwiBarRBLuc-Plasmid-DNA zusammen mit pwiD1- und pwiD2-DNA in einem Verhältnis von 1:1:1 oder 1:2:2 beschichtet waren. Als Kontrollen wurden auch pwiBarRBLuc- und pBarRBLuc-Plasmide allein bombardiert. Stabile Transformanten wurden durch Wachstum auf Basta-haltigem Medium selektiert. Im Durchschnitt 8 bis 10 Basta-resistente Klone erschienen pro Filter 3 bis 4 Wochen nach der Bombardierung, aber nur eine Untergruppe wurde weiter aus jeder Platte analysiert. Wenn p35AdhE2-Plasmid-DNA gleichzeitig mit den anderen Virulenzgenen übertragen wurde, wurde eine geringfügig höhere Anzahl von Kalli pro Filter gewonnen (12–15). Eine grobe Abschätzung der Häufigkeit von agrolistischen Ereignissen konnte durch das Verhältnis der Gesamtanzahl von analysierten Basta-resistenten Kalli, die keine Luciferase exprimieren, zu den gesamten Basta-Kalli vorgenommen werden. Nach diesem Kriterium betrug die Häufigkeit agrolistischer Ereignisse ca. 20 %, wenn pBarRBLuc gleichzeitig mit pwi35SAdhD1- und pwi35SAdhD2-Plasmid-DNAs übertragen wurde. Die Häufigkeit erhöhte sich auf ca. 40 %, wenn das verwendete Zielplasmid pwiBarRBLuc war. Diese Häufigkeit erhöhte sich auf ca. 50 %, wenn auch pwi35SAdhE2 gleichzeitig mit den oben beschriebenen Plasmiden übertragen wurden.
Southern-Analyse
Auf der molekularen Ebene sollten die Inserte, die ein agrolistisches Ereignis darstellen, mit der Bar-Sonde und nicht mit der luc-Sonde hybridisieren. Außerdem sollte in einem agrolistischen Ereignis die Sequenz der Verbindung zwischen eingeführter DNA und pflanzlicher DNA genau dem rechten Randende eines T-Strangs entsprechen. Beide Typen von Ereignissen können in der gleichen Pflanzezelle auftreten, aber solche Klone würden genetisch als biolistische Ereignisse auf Basis der Gegenwart von Luciferaseaktivität bewertet werden. Sowohl biolistische als auch mutmaßliche agrolistische Ereignisse wurden durch Southern-Hybridisierung zur Messung der Häufigkeit jedes Insertionstyps untersucht.
Southern-Blot-Hybridisierung wurde an DNA aus Basta-resistenten Kalluslinien durchgeführt, die nach Bombardierung mit (i) pwiBarRBLuc-DNA, (ii) pwiBARBLuc-, pwiD1- und pwiD2-DNAs, (iii) pwiBarRBLuc-, pwiD1-, pwiD2-und pwiE2-DNAs, (iv) pBarRBLuc-DNA und (v) pBarRBLuc-, pwiD1- und pwiD2-DNAs erhalten wurden.
Die Analyse der Blots zeigte 3 Gruppen von transgenen Kalluslinien, wie in Tabelle 9 zusammengefaßt: (i) Kalluslinien, die sowohl mit der bar- als auch mit der neo-Sonde hybridisierten; (ii) Kalluslinien, in denen einige Inserte nur mit der bar-Sonde hybridisierten und einige Inserte mit beiden Sonden hybridisierten; (iii) Kalluslinien mit Inserten, die nur mit der Bar-Sonde hybridisierten. Die erste Gruppe von Kalli enthielt wahrscheinlich keine agrolistischen Ereignisse. Die zweite Gruppe von Kalli enthielt wahrscheinlich zwei Typen von Ereignissen: agrolistische Ereignisse und biolistische Ereignisse. Die dritte Gruppe von Kalli wies nur mutmaßliche agrolistische Ereignisse auf. Zum Beispiel enthielten unter den 10 transgenen Maislinien, die aus dem pwiBarRBLuc-, pwiD1- und pwiD2-Transformationsexperiment analysiert wurden, 3 biolistische Ereignisse, 6 enthielten mutmaßliche agrolistische Ereignisse und eine hatte beide. Die Hybridisierungsmuster der separaten Linien waren einzigartig, was zeigt, daß die Kalluslinien unabhängige Transformationsereignisse waren.
Molekulare Analyse von mutmaßlichen agrolistischen Ereignissens Die Natur der mutmaßlichen agrolistischen Ereignisse wurde durch Bestimmung der Sequenz der Verbindung zwischen integrierter DNA und pflanzlicher DNA verifiziert. Die Nukleotidsequenz zeigte, daß jedes dieser Fragmente eine rechter Rand/Pflanzen-DNA-Verbindung enthielt. Der rechte Endpunkt des inserierten Fragments war identisch mit dem Bruchort der rechten Randsequenz der T-DNA, wie für ein agrolistisches Ereignis erwartet.
Tabelle 8: Aktivität von virD1 und virD2 in Maiszellen
DNA wurde auf Maiszellen durch die Biolistic-Vorrichtung übertragen. Zahlen in Klammern geben das Verhältnis der Plasmide an. Nach Inkubation für 24 h wurden die Gewebe homogenisiert und Enzymaktivitäten bestimmt. Ein Plasmid, das die β-Glucuronidase (GUS) exprimiert, pGUS, wurde in jeder Bombardierung als Kontrolle für die Effizienz des DNA-Transfers eingeschlossen, und die Aktivität des Reportergens wird als Verhältnis der Luciferase-zu-GUS-Aktivität ausgedrückt. Unabhängige Bombardierungen wurden analysiert, und Daten sind als Mittelwerte von drei Wiederholungen plus oder minus Standardabweichung dargestellt.
Tabelle 9: Analyse von Basta-resistenden Kalli, die aus der Bombardierung von BMS-Zellen mit dem Zielplasmid allein und/oder mit Vir-Genen gewonnen wurden.
Zahlen in Klammern geben die Konzentration der für die Transformationsexperimente verwendeten DNA an.
B = biolistisches Ereignis; A = mutmaßliches agrolistisches Ereignis; Southern = Zahl der durch Southern analysierten Kalli; Kallus = Anzahl der für die Luciferaseaktivität analysierten Kalli.
Beispiel 6: Expression von VirD1 und VirD2 aus einem einzelnen Promotor in Mais- und Tabakzellen
Zum Erreichen der Expression von bakteriellen Genen in Pflanzenzellen müssen die individuellen codierenden Regionen der bakteriellen Gene an getrennte Pflanzenpromotoren fusioniert werden, weil prokaryontische Promotoren nicht die Transkription in Pflanzenzellen erlauben werden. Obwohl es machbar ist, jedes Gen an einen getrennten Promotor zu fusionieren, könnte dies mehrere Schwierigkeiten darstellen: Zum Beispiel Silencing, falls der gleiche Promotor für die unterschiedlichen Gene verwendet wird. Die in diesem Beispiel gezeigte Strategie besteht darin, im Tandem zwei Gene an nur einen Pflanzenpromotor zu binden. Die polygene Botschaft enthält die zwei codierenden Sequenzen von virD1 und virD2, die zum virD-Operon von Agrobacterium gehören.
Diese zwei Polypeptid, die durch die 5'-Hälfte des virD-Operons codiert werden, spielen eine Schlüsselrolle in der Einleitung der DNA-Reifung für den DNA-Transfer aus Agrobacterium auf Pflanzenzellen. VirD2 ist eine strangspezifische Endonuklease, die, unterstützt durch virD1, die T-DNA-Randsequenzen zwischen der dritten und vierten Base spaltet. VirD2 bleibt kovalent am 5'-Ende der T-DNA gebunden, und es wird angenommen, daß es die T-DNA in die Pflanzenzellen lenkt und an der Ligation des 5'-Endes der T-DNA in das pflanzliche Genom teilnimmt. Es wurde gezeigt, daß diese zwei Proteine in Pflanzenzellen funktionsfähig sind, wenn sie an einen Pflanzenpromotor gebunden sind.
In diesem Beispiel wurde eine Expressionseinheit, die aus virD1- und virD2-Genen zusammengesetzt ist, angetrieben durch einen einzelnen Pflanzenpromotor, konstruiert, die eine funktionelle Expression in der Pflanze zeigte. Die individuellen Gene wurden entweder als Transkriptionsfusion oder als Translationsfusionen gebunden, und im letzteren Fall wurde gezeigt, daß sie ihre enzymatischen Aktivitäten in Pflanzenzellen bewahren.
Materialien und Methoden
Konstruktion von D1-D2- oder D2-D1-Funktionen:
Zwei Fusionstypen wurden konstruiert:
1) Transkriptionsfusion:
Die Sequenz der virD1- und virD2-codierenden Region mit dem zwischen der virD1- und virD2-codierenden Region vorhandenen kleinen Zwischenraum (33 nt) wurde verwendet. Das 1,1 kb NotI-PstI-Fragment von p35SD1 und das 1,5 kb PstI-XbaI-Fragment von p35D2 wurden in die NotI-SpeI-Orte von pSK+ kloniert, was zu p35StpDID2 führte.
2) Translationsfusionen
Die Virulenzgene virD1 und virD2 wurden auch über eine dazwischenliegende Sequenz fusioniert, projiziert um eine freie Bewegung beider Proteine zu erlauben, und die anfällig für posttranslationale Spaltung ist. Für p35SD1D2 ist die virD1-codierende Region am 5'-Ende der Fusion, wohingegen p35SD2D1 die virD2-Region direkt hinter dem Promotor enthielt. Alle Modifikationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Konstruktion von p35SD1D2: Zur Schaffung einer Fusion virD1-virD2, die virD1 und virD2 codierte, wurden das Stoppcodon von D1 und das Startcodon von virD2 entfernt. Dies erfolgte durch Klonierung eines verschmolzenen Paares von DNA-Oligonukleotiden in das EcoRI-HindIII von pUC21, flankiert von BanI-kohäsiven und pvuI-kohäsiven Enden zum 0,48 kb EcoRI-BanI von p35SD1 und dem 0,25 kb PvuI-HindIII-Fragment von p35SD2. Das verschmolzene Paar war aus den folgenden Oligonukleotiden zusammengesetzt:
5'-GTGCCTTGCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACACCTAGCCCCG AT-3' (SEQ ID NO: 15)
und
5'-CGGGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAGGGAGTTGGGGGAGTAGAAGGCAAG-3' (SEQ ID NO: 16).
Das EcoRI-PstI-Fragment dieses Konstrukt, das die virD1-codierende Region, den Linker und das 5'-Ende der virD2-codierenden Region umfaßt, wurde dann in die EcoRI-PstI-Orte von p35SD2 inseriert, was zu p35SD1D2 führte.
Konstruktion von p35SD2D1: In ähnlicher Weise enthält Plasmid pD2D2 die virD2-codierende Region am 5'-Ende von pD2D1, gebunden im Raster an die virD1-codierende Region durch die gleiche dazwischenliegende Sequenz. Die N-terminale codierende Sequenz von virD1 wurde zuerst aus überlappenden Oligonukleotiden rekonstruiert, um einen EcoRI-Ort am 5'-Ende bereitzustellen und das erste Codon von virD1 zu deletieren
(5'-AATTCTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACTGCCATCAACCAGCAT-3'; SEQ ID NO: 17).
Diese verschmolzenen Oligonukleotide wurden in pBluescript KS+ (Stratagene, Inc.) kloniert, um pKS5'D1 zu liefern. Das 1,3 kb-SacII-BfaI-Fragment aus p35SD2 und die SacII-EcoRI-geschnittene pKS5'D1-Plasmid-DNA wurden dann mit einem Linker verbunden, der am 5'-Ende eine Veränderung des BfaI-Orts enthielt, so daß ihm das native Stoppcodon von virD2 fehlt
(5'-TATCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACAC-CTAGC-3' (SEQ ID NO: 18)
und
5'-AATTGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAGGGAGTTGGGGGAGTAGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 19))
Das EcoRI-ClaI-Fragment, das die virD2-codierende Region, den Linker und das 5'-Ende der virD1-codierenden Region umfaßt, wurde dann in die EcoRI-ClaI-Orte von p35SD1 kloniert, was zu p35SD2D1 führte.
Konstruktion der Testplasmide
Die Konstruktion von pwBarRBLuc, pRBLuc wurde in Beispiel 5 beschrieben.
Pflanzenmaterial:
Die Herstellung von Mais- (B73-Derivat) und Tabak (NT-1)-Suspensionszellen zur Bombardierung durch die Biolistic-Vorrichtung wurde in den vorhergehenden Beispiele beschrieben.
Bombardierung von Pflanzenzellen:
Gewebe wurden mit Goldmikroprojektilen bombardiert, auf die eine Mischung aus Plasmiden ausgefällt war. Für Co-Transformationsexperimente trugen die Goldpartikel 0,5 μg oder 1 μg des Testplasmids mit insgesamt 2 μg oder 4 μg der Helferplasmide für Tabak- bzw. Maiszellen. Eine geeignete Menge von DNA aus pUC18-Plasmid wurde vermischt, um eine gleiche Masse von Plasmid-DNAs in der Mischung zu bewahren (siehe Tabelle 10 und Tabelle 11). DNAs wurden mit 2,5 M CaCl₂ und 0,1 M Spermidin freie Base auf 50 μl von 0,3 μm-Goldmikroträgern (60 mg/ml) ausgefällt. Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit der PDS-1000 He-Biolistikvorrichtung (DuPont) unter Verwendung von 1550 psi-Berstscheiben durchgeführt, wobei sich die Probe 8 cm unterhalb der Bremsschirmhalterung befand.
Transiente Expressionsassays:
Luciferase wurde in Gewebeextrakten gemäß Herstellerempfehlung getestet (Luciferase Assay System, Promega). Die Luciferaseaktivität wird als Lichteinheiten ausgedrückt, detektiert durch ein Luminometer "Analytical Luminescence" Modell 2001, integriert über 10 s bei 25°C. Für die Berechnung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration unter Verwendung des BioRad-Proteinassaykit bestimmt.
Ergebnisse und Diskussion:
Fusionsschemastrategie:
Die virD1- und virD2-Gene stammten aus dem Octopin-pTiA6-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Die von p35StpD1D2 getragene Transkriptionsfusion enthält die codierende Region von virD1 und virD2, wobei die native dazwischenliegende Sequenz im virD-Operon vorhanden ist.
Die von p35SD1D2 und p35SD2D1 getragenen Translationsfusionen enthalten die virD1- und virD2-codierenden Regionen, fusioniert über eine dazwischenliegende Sequenz, die projiziert ist, um die freie Bewegung beider Proteine zu erlauben, und die anfällig für posttranslationale Spaltung ist.
Funktionelle Expression des Polygens in der Pflanze Zur Untersuchung der funktionellen Expression der Transkriptions- und der Translationsfusionen wurden p35StpD1D2, p35SD1D2 und p35SD2D1 gleichzeitig auf Pflanzenzellen mit einem Testplasmid durch die Biolistic- Vorrichtung übertragen. Das Testplasmid enthielt eine rechte Randsequenz, die zwischen dem Promotor und der codierenden Region des Luciferasegens in einer solchen Weise inseriert war, daß eine strangspezifische Spaltung innerhalb dieser Sequenz zur Abnahme der Luciferaseexpression führen würde. Zwei Typen von Testplasmiden wurden in Maiszellen untersucht: ein aus pUC-stammendes Plasmid (pRBLuc) und eine aus dem Weizenzwerg-Geminivirus stammendes Plasmid (pwBarRBLuc).
Mais- und Tabakzellen wurden zuerst transient mit dem Testplasmid transformiert, gleichzeitig übertragen mit virD1- und virD2-Genen, jeweils angetrieben durch einen getrennten Promotor, um auf ihre Fähigkeit zur Beeinflussung der Transkription durch die T-DNA-Randsequenz zu testen. Nach gleichzeitiger Übertragung von p35SD1-DNA und p35SD2-DNA mit pRBLuc- oder pwBarRBLuc-DNA wurden 0,3 % und 1 % der Kontrollstärke der Luciferaseaktivität in Tabak- und Maisgeweben beobachtet. (Tabelle 10, Tabelle 11 und Tabelle 12).
Die zwei vir-Gene zusammen in einer Transkriptionsfusion schienen schwach aktiv zu sein. Gleichzeitige Übertragung durch die Biolistic-Vorrichtung von gleichen Mengen von pRBLuc- und p35StpD1D2-DNAs (Verhältnis 1:1) reduzierte die Luciferaseaktivität auf ca. 57 % der Kontrolle in Tabak- (Tabelle 12) und 60–80 % in Maiszellen (Tabelle 10 und Tabelle 11). Bei einem höheren Verhältnis von p35StpD1D2-Plasmid zu Testplasmid (2:1) gab es keine signifikante weitere Reduzierung der Luciferaseaktivität.
Analoge Experimente unter Verwendung des p35SD1D2-Plasmids, das die Translationsfusion trug, zeigten eine Reduzierung der Luciferaseaktivität auf ca. 12 % der Kontrolle in Tabak- (Tabelle 12) und 22–47 % in Maiszellen (Tabelle 10 und Tabelle 11). Bei einem höheren Verhältnis von p35SD1D2-Plasmid zu Testplasmid (2:1) wurde die Luciferaseaktivität weiter auf ca. 2–5 % in allen Fällen reduziert.
Eine Umkehrung der nativen Orientierung der Virulenzgene in der Translationsfusion p35SD2D1 ergab Ergebnisse ähnlich denjenigen mit p35SD1D2 (Tabellen 10, 11 und 12).
Diese Beobachtungen weisen stark darauf hin, daß die Translationsfusionen funktionell in der Pflanze waren.
Tabelle 10: Aktivität von Transkriptions- und Translationsfusionen in Maiszellen mit einem aus pUC stammenden Vektor als Testplasmid.
Tabelle 10: DNA wurde auf Maiszellen durch die Biolistic-Vorrichtung übertragen. Zahlen in Klammern geben das Verhältnis von Plasmiden an. Nach Inkubation für 24 h wurden die Gewebe homogenisiert und die Luciferaseaktivitäten bestimmt und als Lichteinheiten/μg Proteine ausgedrückt. Unabhängige Bombardierungen wurden analysiert und Daten sind als Mittelwerte von 3 Wiederholungen plus oder minus Standardabweichung dargestellt.
Tabelle 11: Aktivität von Transkriptions- und Translationsfusionen in Maiszellen mit einem aus Geminivirus stammenden Vektor als Testplasmid
Tabelle 11: siehe Fußnote für Tabelle 10
Tabelle 12: Aktivität von Transkriptions- und Translationsfusionen in Tabakzellen
Tabelle 12: siehe Fußnote für Tabelle 10
Farbstoff 7: Rolle von VirE2 in der Transformationseffizienz
Ein "heilender" Vektor wurde in Maiszellen auf seine Fähigkeit zur Erhöhung der Häufigkeit von agrolistischen Ereignissen getestet. Dieser verwendete Vektor enthielt ein Polyadenylierungssignal innerhalb der T-DNA-Struktur zur Linken des rechten Randes.
In einem zweiten Teil des Experiments wurde virE2 mit virD1- und virD2-Genen gleichzeitig übertragen. Es wurde gezeigt, daß dieses Protein für den effizienten Transfer von T-DNA erforderlich ist, aber nicht für die T-DNA-Erzeugung (Stachel et al., 1986). VirE2 bindet an einsträngige DNA in vitro cooperativ und unspezifisch. VirE2 kann am Schutz des T-Strangs teilnehmen. Das virE2-Protein ist das häufigste in Agrobacterium tumefaciens nach Induktion der Virulenzgene erzeugte Protein (Stachel et al., 1986). Da virE2 Kernlokalisierungssignale besitzt und diese in Pflanzen erkannt werden (für eine Übersicht siehe Zupan und Zambryski, 1995), werden höhere Transformationsraten erwartet, wenn dieses Gen in die Pflanze eingeführt wird.
Materialien und Methoden:
Konstruktion von pAVM1: Ein Vektor, der Polyadenylierungssignal am rechten Rand enthält (siehe 6–15)
Teil A. Konstruktion von pCIB1711-HN
pCIB1711 wurde mit BamHI verdaut und zur Bildung von 1711deltaB religiert, in dem der EcoRI-Ort (jetzt einzigartig) geschnitten und durch Insertion eines Oligonukleotids zerstört wurde, das gleichzeitig HindIII- und NotI-Orte schaffte. Durch Sequenzanalyse wurde ein Klon identifiziert, in dem diese Orte in der Orientierung (nach dem SacI-Ort) KpnI und dann HindIII waren. Zur Wiederherstellung der fehlenden Teile des ursprünglichen Plasmids inserierten wir zuerst das große BamHI-Fragment, das die Luc-codierende Region in der korrekten Orientierung trägt, unter Bildung von 1711-HN-B; wir ersetzten dann sein XbaI-Insert durch den entsprechenden Teil des ursprünglichen pCIB1711, wodurch die fehlende Leitsequenz wiedereingeführt wurde.
Teil B. Einführung einer synthetischen Oligonukleotid-Randsequenz zwischen den EcoRI- und BamHI-Orten am Ende der Luc-codierenden Region.
Wir subklonierten das NotI/ClaI-Fragment in pBluescript, wodurch die EcoRI- und BamHI-Orte im Insert einzigartig gemacht wurden. Nach Insertion des Randoligonukleotids zur Bildung von pBS-NC-RB brachten wir sein modifiziertes NotI/ClaI-Insertfragment zurück zum pCIB1711-HN-Gerüst, wodurch pCIB1711-HN-RB gebildet wurde.
Teil C. Insertion eines linken T-DNA-Rands in pUbiPATdeltaI
Zur Eliminierung eines unerwünschten EcoRI-Orts im Intron von pUCIAC verdauten wir das Plasmid (gezüchtet im dam-minus-Stamm SCS110) mit ClaI unter Entfernung von zwei SmaII-Fragmenten, einschließlich eines EcoRI-Orts. Wir führten dann ein Oligonukleotid ein, das den ClaI-Ort entfernte und einen SphI-Ort erzeugte, wodurch Plasmid pUbiPATdeltaI gebildet wurde. In den jetzt einzigartigen EcoRI-Ort am Ende des chimären PAT-Gens klonierten wir EcoRI-Fragment 29 von pTiT37, ein Ti-Plasmid vom Nopalin-Typ, das den linken Rand von T-DNA in einer Position 68 Basenpaare einwärts von einem Ende trägt (N.S. Yadav, J. Vanderleyden, D. Bennet, W.M. Barnes und M.-D. Chilton, 1982; "Short direct repeats flank the T-DNA on a nopaline Ti plasmid", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6322–6326), wodurch LB-UbiPATdeltaI gebildet wurde.
Teil D. Zusammenbau von pAVM1
Das HindIII-Insertfragment von pCIB1711-HN-RB wurde ausgeschnitten in den HindIII-Ort von LB-UbiPATdeltaI ligiert. Durch Kartierung identifi zierten wird ein Konstrukt, in dem die linken und rechten Ränder das PAT-Gen in korrekter Orientierung für den Transfer flankieren. Das resultierende Plasmid weist den Luc-Genpromotor und die codierende Region außerhalb der T-DNA auf, aber seinen Terminator gerade innerhalb des rechten Randes.
Mais-Suspensionszellen:
Die Suspensionskultur von Zea Mays Sorte Black Mexican Sweet (MBS) wurde in N6-Medien (Chu et al., 1975) gehalten, ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Für die Bombardierungsexperimente verwendete Maiszellsuspensionen wurden aus 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen entnommen. Vor Bombardierung wurden ca. 0,5 ml Packed-Volume-Zellen an 7 cm-Filtern (Whatman Nr. 4) vakuumfiltriert. Ausplattierte Zellen wurden 4 Stunden bei 25°C vor der Bombardierung auf Phytoagar-verfestigtem 2N6-Medium gehalten, das 120 g/l Saccharose enthielt. Für die stabile Transformation wurden Filter auf 2N63S-verfestigtes Medium 24 Stunden nach der Bombardierung übertragen. Anschließende Übertragungen von Filtern auf frisches Medium mit zunehmender Konzentration von Basta erfolgten in 8-tägigen Intervallen, bis die Mehrzahl der Zellen in der Kultur zu wachsen aufhörte. Dies erfolgte allgemein nach 4 bis 6 Wochen Selektion auf Platten, die 8 bis 10 mg/l Basta enthielten. Auf dem Filter entwickelte unabhängige Kalli wurden dann auf Phytoagar-verfestigtes Medium übertragen, ergänzt mit Basta (10 mg/l). Nach zwei Subkulturen auf dem gleichen Medium wurden Suspensionskulturen durch Überimpfen von ca. 100 mg Maiszellen in 25 ml Flüssigmedium, ergänzt mit Basta (10 mg/l), zur DNA-Isolierung eingeleitet.
Bombardierung von Pflanzenzellen:
Gewebe wurden mit Goldmikroprojektilen bombardiert, auf die eine Mischung aus Plasmiden ausgefällt war. Co-Transformationsmischungen enthielten ein 1:1,3-Verhältnis von Plasmiden, die die Virulenzgene trugen, zum bar-Selektionsplasmid. Jede Teilmenge von Plasmidmischung, die pro Zielplatte bombardiert wurde, bestand aus 0,6 μg des Selektionsmarkers und jeweils 0,8 μg von p35SAdhD1- und 35SAdhD2- und/oder p35SAdhE2-Plasmid-DNAs. Geeignete Mengen von jeder DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl vermischt und mit 50 μl 2,5 M CaCl₂ und 20 μl 0,1 M Spermidin freie Base ausgefällt, um die Ausfällung auf 50 μl 0,3 μm-Goldmikroträgern (60 mg/ml) zu bewirken. Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit der PDS-1000 He-Biolistikvorrichtung (DuPont) unter Verwendung von 1100 psi- Berstscheiben durchgeführt, wobei sich die Probe 8 cm unterhalb der Bremsschirmhalterung befand.
DNA-Extraktion und Southern-Blot-Hybridisierung
Zellkulturen wurden durch Filtration 10 Tage nach der Impfung geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. DNA wurde wie beschrieben isoliert (Hall et al., 1991).
Ca. 10 μg genomische DNA wurden für den Verdau mit EcoRI verwendet. Nach Trennung an einem 0,7%igen Agarosegel wurde die DNA auf Amersham Hybond plus-Membran übertragen und die Hybridisierung wurde gemäß den vom Hersteller (Amersham) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. DNA-Sonden wurden mit [a-³²P]dCTP unter Verwendung des Oligo-Labelling-Kits von Pharmacia markiert. Die PAT-Sonde entsprach einem 0,7 kb Pst-Fragment des pat-Gens. Die luc-Sonde entsprach einem 0,7 kb XbaI-EcoRI-Fragment des Luciferase-Gens. Zur Entfernung der Sonden wurden die Membranen mit einer Lösung aus 0,1 % SDS bei 100°C für 5 min gestrippt.
Ergebnisse
Analyse von stabilen Transformanten
Die stabile Transformation von Mais-Suspensionszellen wurde unternommen, um die Wirkung des pAVM1-Vektors auf die Effizienz der Transformation nach gleichzeitiger Übertragung eines solchen Vektors mit den Virulenzgenen durch die Biolistic-Vorrichtung zu bewerten. Ersterer Vektor hatte einen 35S-Promotor innerhalb des rechten Randes in einer solchen Orientierung, daß er leicht ein Mittel zur Expression des Antisense des Gens liefern konnte, in das der T-Strang inseriert wurde. In diesem neuen Vektortyp war der 35S-Promotor durch einen 35S-Terminator innerhalb des rechten Randes ersetzt, so orientiert, um das Zielgen zu "heilen", sollte es am 3'-Ende inserieren.
Für dieses Experiment wurde pAVM1 verwendet, das einen linken T-DNA-Rand, PAT als selektierbaren Marker, einen 35S-Terminator, einen rechten T-DNA-Rand und das Luciferase-Gen außerhalb der T-DNA-artigen Struktur enthält. Wir bezeichnen diejenigen DNA-Insertionen in das Maisgenom als "agrolistische Ereignisse", die nach der Aktivität der vir-Genprodukte an Randsequenzen resultieren würden, wodurch ein T-Strang erzeugt wird. Im Gegensatz bezeichnen wir diejenigen DNA-Inserte als "biolistische Ereignisse", die den Prozeß darstellen, der normalerweise nach Genübertragung in Pflanzenzellen durch die Biolistic-Vorrichtung erfolgt. Das anfängliche Kriterium zur Unterscheidung von biolistischen Ereignissen und mutmaßlichen agrolistischen Ereignissen war das Fehlen von Luciferase aktivität im transformierten Klon, das aus dem Ausschluß der Luc-codierenden Region durch T-DNA-Ausschneiden aus pAVM1 entsteht.
Mais-Suspensionszellen wurden mit Mikroprojektilen bombardiert, die mit pAVM1-Plasmid-DNA zusammen mit p355AdhD1-, p35SAdhD2- und/oder p35SAdhE2-DNAs beschichtet waren. Als Kontrolle wurde auch pAVM1 allein bombardiert. Stabile Transformanten wurden durch Wachstum auf Bastahaltigem Medium selektiert. Ca. 5 bis 8 Kalli konnten pro Filter nach Bombardierung mit pAVM1 allein gewonnen werden. Im Durchschnitt 10 Bastaresistente Klone konnten pro Filter 4 bis 5 Wochen nach der Bombardierung von Maiszellen mit pAVM1-, p355AdhD1-, p35SAdhD2- und p35SAdhE2-DNAs gewonnen werden. Nur einige wurden weiter pro Platte analysiert. Ca. 2 bis 3 Kalli erschienen auf dem mit pAVM1-, p35SAdhD1- und p35SAdhD2-DNAs bombardierten Filter. Dieser Unterschied kann der Gegenwart des virE2-Gens zugeordnet werden, das für einsträngige DNA bindendes Protein codiert, das am Schutz des T-Strangs beteiligt ist. Es wurde gezeigt, daß dieses Protein für den effizienten Transfer der T-DNA erforderlich ist, aber nicht für die T-DNA-Erzeugung (Stachel et al., 1986).
Die Häufigkeit von agrolistischen Ereignissen konnte durch das Verhältnis der Gesamtanzahl von analysierten Basta-resistenten Kalli, die nicht Luciferase exprimieren, zu den gesamten Basta-resistenten Kalli abgeschätzt werden. Gemäß diesem Kriterium war die Häufigkeit von agrolistischen Ereignissen ca. 25 %, wenn pAVM1 gleichzeitig mit p35SAdhD1- und p35SAdhD2-DNA übertragen wurde. Die Häufigkeit erhöhte sich geringfügig auf ca. 50 %, wenn pwiE2 ebenfalls gleichzeitig mit den oben beschriebenen Plasmiden übertragen wurde.
Southern-Analyse
Auf der molekularen Ebene sollten die Transgene, die ein agrolistisches Ereignis darstellen, mit der Bar-Sonde und nicht mit der luc-Sonde hybridisieren. Beide Typen von Ereignissen können in der gleichen Pflanzenzelle auftreten, aber solche Klone würden genetisch als biolistische Ereignisse auf Basis der Gegenwart von Luciferaseaktivität bewertet werden. Sowohl biolistische als auch mutmaßliche agrolistische Ereignisse wurden durch Southern-Hybridisierung zur Messung der Häufigkeit jedes Insertionstyps untersucht.
Southern-Blot-Hybridisierung wurde an DNA aus Basta-resistenten Kalluslinien durchgeführt, die nach Bombardierung mit (i) pAVM1-DNA und (ii) pAVM1-, p355AdhD1-, p35SAdhD2- und p35SAdhE2-DNAs erhalten wurden. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 13 zusammengefaßt.
Tabelle 13: Analyse von Basta-resistenten Kalli, die nach Bombardierung von Maiszellen mit pAVM1 mit oder ohne die vir-Gene gewonnen wurden.
Schlußfolgerungen:

a) Das Verhältnis von agrolistischen Ereignissen zu biolistischen Ereignissen ist ca. 35 % bei pAVM1 und ist im Bereich des gewöhnlich gefundenen Prozentwertes von 20–40 %.
b) Die Gegenwart von VirE2 kann die Transformationseffizienz verbessern.

Da virE2 Kernlokalisierungssignale besitzt und diese in Pflanzen erkannt werden (für eine Übersicht siehe Zupan und Zambryski, Plant Physiol. 107:1041–1047 (1995)), wurden höhere Transformationsraten erwartet, wenn dieses Gen in der Pflanze eingeführt war. Transgene Pflanze, die das virE2-Gen exprimieren, können virE2-Mutanten von Agrobacterium ergänzen, was einen Nachweis liefert, daß VirE2-Protein eine wichtige Rolle in den Pflanzenzellen spielt.
Beispiel 8: Bombardierung von VirD1- und VirD2-mRNA in Maiszellen
Dieses Beispiel beschreibt die Übertragung von virD1- und virD1-Genen als mRNA auf Pflanzenzellen und ihre Aktivität auf T-DNA-Randsequenzen.
Materialien und Methoden:
Maiszellen:
Suspensionskulturen von Mais (Zea mays L.), gestartet aus gefrierkonserviertem embryogenem Kallus Typ II, selektiert aus unreifen Embryos einer mit B73 verwandten Elitelinie, wurden in N6-Flüssigmedium (Chu et al., 1975) kultiviert, ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Die Kulturen wurden bei 25°C in der Dunkelheit auf einem Rundschüttler mit 150 U/min inkubiert. Suspensionskulturen wurden alle 7 Tage durch Übertragen von 1 ml Packed-Cell-Volumen in 50 ml frisches 2N63S-Flüssigmedium subkultiviert. Die für die Bombardierungsexperimente verwendeten Maiszellsuspensionen wurden aus 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen entnommen. Vor der Bombardierung wurden ca. 0,5 ml Packed-Volume-Zellen auf 7 cm-Filter (Whatman Nr. 4) vakuumfiltriert.
Tabakzellen:
Die Nicotiana tabacum-Zellinie NT-1 wurde in Murashige-Skoog-Medium kultiviert, ergänzt mit 2 mg/l 2,4-D und Saccharose (30 g/l). Die Zellen wurden einmal pro Woche durch Zugabe von 5 ml Inokulum auf 100 ml frisches Medium in 500 ml-Kolben subkultiviert. Die Kolben wurden bei 27°C auf einem Rundschüttler mit 125 U/min inkubiert. Teilmengen von 0,5 ml aus Zellen vier Tage nach der Subkultur wurden auf einem sterilen Filter (Whatman Nr. 4) ausgebreitet. Die Filter wurden dann auf MS-Medium übertragen.
Plasmidkonstruktion:
Konstruktion eines Vektors, der den T7-Promotor und den polyA-Schwanz enthält
Ein Polylinker, der die folgenden Restriktionsorte enthielt (SphI-EcoRI-NheI-ClaI-BglII-Asp718-HindIII-XhoI-Hind*III, mit dem letzten HindIII als Abtötungsort), wurde in die Sph2-HindIII-Orte von pT7RecA40 inseriert. Ein als Asp718-A(50)-DraI-HindIII bezeichnetes Oligomer wurde dann in die entsprechenden Orte inseriert, um zu pT7-A50 zu führen. Die komplementären Stränge dieses Oligomers haben die folgende Sequenz:
Konstruktion von pT7D1A50:
EcoRI-BglII-Fragment der D1-codierenden Region, zuvor kloniert in EcoRI-BamHI von pSG5 (aus dem EcoRI-BamHI-Fragment von p35SAdh1D1).
Konstruktion von pT7D2polyA: (siehe 16–26)
A. Isolierung von maßgeschneiderten Fragmenten
Die virD2-codierende Region wurde aus p35SD2 mit EcoRI geschnitten und durch präparative Gelelektrophorese und Extraktion von DNA aus Agarose isoliert. Interne Orte erforderten, daß das Maßschneidern der 5'- und 3'-Enden von virD2 an Subfragmenten unternommen wurde. Das aus dem 5'-Ende isolierte HindIII/EcoRI-Fragment wurde mit PvuI zurechtgestutzt, um Fragment A zu erzeugen. Das aus dem 3'-Ende isolierte BamHI/EcoRI-Fragment wurde mit HaeIII zurechtgestutzt, um Fragment C zu erzeugen. Das zentrale Fragment B wurde durch HindIII/BamHI-Verdau erhalten.
B. Klonierung der Fragmente A und B
Vektor pTC182 wurde mit HindIII und SphI verdaut, und Fragment A plus Adapter-Oligonukleotide für das SphI-Ende (die das Startcodon wiederherstellten) wurden an die richtige Stelle ligiert, wodurch pTC182-A gebildet wurde. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und BamHI verdaut, und Fragment B wurde an das 3'-Ende von A ligiert. Das kombinierte Fragment AB wurde ausgeschnitten und nach BamHI/SphI-Verdau des resultierenden Plasmids, pTC182-A-B, gelgereinigt.
C. Klonierung der Fragmente AB und C in einem modifizierten pUC21-Vektor
Der Teil des pUC21-Polylinkers zwischen BamHI- und XbaI-Orten wurden entfernt und durch ein Oligonukleotidpaar ersetzt, das den Großteil der Orte wiederhergestellte und einen in unserer Konstruktion erforderlichen BglII-Ort addierte. Das resultierende Plasmid, pUC21-X, wurde mit BamHI und EcoRV verdaut, und Fragment C wurde in den Vektor zur Bildung von pUC21-C ligiert. Als nächstes wurde dieses Produkt mit BamHI und SphI verdaut, und das obige isolierte Fragment AB wurde einligiert, um virD2 zu rekonstruieren. Nach Verdau des resultierenden Plasmids pUC21-virD2 mit SphI und BglII wurde das Fragment ABC gelgereinigt, das maßgeschneidertes virD2-ORF enthielt.
D. Klonierung von virD2 in einen T7-Transkriptionsvektor
T7polyA, ein oben beschriebener Transkriptionsvektor, wurde mit SphI und BglII verdaut, und Fragment ABC (=virD2) wurde in Position unterhalb eines T7-Promotors und oberhalb eines Blocks von 42 A-Resten ligiert.
mRNA-Synthese:
Die T7D1A50- und T7D2A50-Plasmide wurden mit XhoI linearisiert, das unmittelbar stromabwärts des Poly(A)-Abschitts schneidet. Linearisierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann aus Ethanol ausgefällt. Invitro-Transkription von linearisierter DNA wurde unter Verwendung der T7-Polymerase aus dem T7 Cap-Scribe-Kit durchgeführt, das [m⁷G(5')ppp(5')] enthält (Boehringer). Die Integrität und Konzentration von mRNA wurden durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
Sterilisation von biolistischen Geräten:
Goldpartikel (0,3 μm – Heraeus) wurden durch Plazieren von 60 mg von Partikeln in 100 % Ethanol und 0,1 % DEPC sterilisiert. Die Partikel wurden 3-mal mit RNase-freiem Wasser gespült und dann in 1 ml RNAse-freier 50%iger Glycerin-Lösung resuspendiert. Teilmengen von 50 μl hergestellten Partikeln wurden für 6 Schüsse verwendet. Makroträger wurden in 100 % Ethanol und 0,1 % DEPC getaucht, dann 3-mal in 100 % Ethanol gespült und luftgetrocknet. Bremsgitter wurden autoklaviert.
Nukleinsäureausfällung:
DNA (1 μg) und mRNA (ca. 8 μg: 4 μg D1 und 4 μg D2 oder 8 μg unspezifische RNA) wurden auf einer 50 μl-Suspension von Goldpartikeln (60 mg/ml; 0,3 μm) durch aufeinanderfolgende Zugabe von 0,5 μl Tris-Puffer (1 M), 50 μl CaCl₂ und 2,5 μl 0,1 M Spermidin ausgefällt. Nach Zugabe aller Mittel wurde das Verwirbeln für 3 Minuten fortgesetzt, worauf die Partikel durch kurzes Mikrozentrifugieren (1 min) sedimentiert wurden. Der Überstand wurde entfernt, und die Partikel wurden einmal mit kaltem 100%igem Ethanol gewaschen und in 60 μl 100%igem Ethanol resuspendiert. Diese Mischung wurde verwirbelt und 10 μl Teilmengen wurden auf eine Makroträgerscheibe pipettiert und in einem Abzug mit laminarem Strom luftgetrocknet.
Mikroprojektilübertragung in Pflanzenzellen
Mikroprojektile wurden auf Pflanzenzellen durch einen Partikelbeschleuniger (PDS-He1000; DuPont) unter Verwendung von 1550 psi-Berstscheiben übertragen, wobei sich die Probe 5,5 cm entfernt von der Startvorrichtung befand. Ein Gitter mit 100 μm mesh aus rostfreiem Stahl wurde auf halber Strecke zwischen der Bremsplatte und dem Gewebe plaziert. Zielplatten wurden zweimal bombardiert.
Luciferaseassays:
Luciferase und Gus wurden in Gewebeextrakten mit dem Luciferaseassay-System von Promega gemäß Herstellerempfehlung getestet. Luciferase und R-Glucuronidase-Aktivitäten werden als Lichteinheiten ausgedrückt, detektiert durch ein Luminometer "Analytical Luminescence" Modell 2001 für 10 s bei 25°C.
Ergebnisse:
Luciferaseassays wurden 24 h nach der Bombardierung durchgeführt. mRNA von D1 und D2 wurde mit p35SRBLuc co-bombardiert, das eine rechte Randsequenz enthält, die zwischen dem 35S-Promotor und der Luciferasecodierenden Sequenz inseriert ist. In den Kontrollexperimenten wurde p35SRBLuc mit unspezifischer mRNA bombardiert, oder D1- und D2-mRNA wurde gleichzeitig mit pLUC-DNA übertragen, die keine Randsequenzen enthält. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 14 gezeigt.
Tabelle 14: Gleichzeitige Übertragung von D1- und D2-mRNA mit Zielplasmid in Maiszellen
Nach Inkubation für 24 h wurden die Gewebe homogenisiert und die Enzymaktivitäten bestimmt. Ein Plasmid, das die β-Glucuronidase (GUS) exprimiert, pGUS, wurde in jeder Bombardierung als Kontrolle für die Effizienz des DNA-Transfers eingeschlossen, und die Aktivität des Reporters wird als Verhältnis von Luciferase- zu GUS-Aktivität ausgedrückt. Unabhängige Bombardierungen wurden analysiert und die Daten sind als Mittelwerte von 3 Wiederholungen plus oder minus Standardabweichung dargestellt. Prozentuale Kontrollwerte werden aus dem Verhältnis der Luciferase- zu R-Glucuronidase-Aktivitäten zu denjenigen Aktivitäten bestimmt, die mit Kontrollplasmid beobachtet werden.
Schlußfolgerung:
Nach gleichzeitiger Übertragung von D1-mRNA und D2-mRNA mit pRB(+)Luc-DNA wurde eine 10-fache Abnahme der Luciferaseaktivität beobachtet. Die als mRNA auf die Pflanzenzelle übertragenen zwei vir-Gene schienen eine synergistische Wirkung zu haben. Diese Beobachtungen weisen sehr darauf hin, daß die beobachtete Abnahme der Luciferaseaktivität das Ergebnis eines strangspezifischen Bruchs an der rechten Randsequenz durch vir-Genprodukte war.
Der Vorteil der mRNA-Übertragung besteht darin, daß ihre Wirkung notwendigerweise vorübergehend ist. Deshalb gibt es keine Fremd-DNA der Helferplasmide.
Beispiel 9: "Agrolistik" bei Protoplasten
Transformationstechnologien sind ein wichtiges Werkzeug für die genetische Manipulation und Verbesserung von Nutzpflanzenarten (Raskin, 1996). Verschiedene Systeme der Transformation erlauben den direkten Transfer von fremdem genetischem Material in Zellen, die zu fruchtbaren Pflanzen führen können. Diese Systeme schließen die Übertragung von DNA auf Protoplasten mittels Elektroporation oder direkter DNA-Aufnahme, die Mikroinjektion in Zellen und den Gentransfer durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen ein (für eine Übersicht siehe Morrish und Fromm, 1992). In den bestehenden Übertragungssystemen gibt es eine Tendenz hin zur Integration von mehrfachen Kopien des Fremdgens. Es besteht ein Bedarf an einem Ansatz, der zu einem einfachen Muster der Integration des Fremdgens ohne Vektorsequenzen führen würde.
Das hier beschriebene Transformationsverfahren, als "Agrolistik" bezeichnet, hat das Potential, zu transgenem Material mit einem einfachen Insertionsmuster des Fremdgens und zum Ausschluß von Vektorsequenzen zu führen. Der Ansatz besteht in der Verwendung von Pflanzenexpressionskassetten für Virulenzgene, die eine Schlüsselrolle in der Bildung und im Schutz der T-DNA spielen (virD1, virD2 und virE2), gleichzeitig übertragen mit einem Plasmid, das T-DNA-Randsequenzen enthält, die einen selektierbaren Marker flankieren. In den vorhergehenden Beispielen wurde gezeigt, daß diese Technologie funktioniert, wenn all diese Elemente auf die Pflanzenzelle durch die Biolistic-Vorrichtung übertragen werden.
In diesem Beispiel setzen wir Verfahren zur direkten DNA-Übertragung auf Protoplasten ein, um all diese Elemente zu übertragen. Wir haben festgestellt, daß virD1- und virD2-Genprodukte, die auf diese Weise übertragen werden, tatsächlich Insertionsereignisse vom T-DNA-Typ erzeugen können und daß der Einschluß des virE2-Genproduktes die Häufigkeit der Transformation erhöhen kann.
Materialien und Methoden
Plasmide
pCIB1711 ist ein pUC-Derivat, das das Leuchtkäferluciferasegen enthält, angetrieben durch den Blumenkohlmosaikvirus-35S-(CaMV35S)-Promotor, und wird in Beispiel 3 beschrieben. Zur Einführung von T-DNA-Rändern wurden zwei synthetische Oligonukleotide, die der rechten Randsequenz von LBA5269 entsprechen (Van Haaren et al., 1989), verschmolzen, um den Duplex:
5'-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3' (SEQ ID NO: 22)
zu liefern. Dieser Duplex, flankiert von BamHI-Pst2-Orten, wurde in die entsprechenden Orte in pCIB1711 zwischen dem Promotor und der Luciferasecodierenden Sequenz inseriert, was pRBLuc lieferte (siehe 2).
pNeoRBLuc enthält eine linke Randsequenz, das Neomycinphosphotransferase-Gen (nptII) und das Luciferase-Gen, wobei der rechte Rand zwischen dem Promotor und der Luciferase-codierenden Region aus pRB(+)Luc inseriert ist. Das durch den nos- (Nopalinsynthase)-Promotor angetriebene nptII-Gen wurde aus dem Plasmid pBin19 als 2,2 kb-SacII-HindIII-Fragment ausgeschnitten. Die linke Randsequenz wurde aus pBin19 als BglII-EcoRI-Fragment ausgeschnitten. Diese beiden Fragment wurden in XbaI-HindIII-Orte von pRB(+)Luc inseriert. pNeoLuc ist das Äquivalent von pNeoRBluc, wobei keine rechte Randsequenz zwischen dem CaMV35S-Promotor und der Luciferase-codierenden Region inseriert ist.
Die virD1- und virD2-Gene aus pTiA6 wurden in den Expressionsvektor pMF6 subkloniert (Callis et al., 1987), der aus dem CaMV35S-Promotor (0,5 kb), dem ersten Adh1-Intron (0,5 kb) und der Nopalinsynthase-(nos)-Polyadenylierungsregion (0,25 kb) besteht (1). Das 0,6 kb EcoRI-PstI-Fragment aus pAD1187, das der virD1-codierenden Sequenz entspricht, wurde in pMF6 kloniert, was p35SAdhD1 lieferte. Die virD2-codierende Sequenz wurde als 1,8 kb EcoRI-Fragment aus pAD1190 ausgeschnitten (Ghai & Das, 1989) und in pMF6 kloniert, was zu p35SAdhD2 führte.
Die virE2-codierende Region wurde aus pw108 kloniert, das ein 3 kb XhoI-Fragment von Agrobacterium Ti-Plasmid pTiA6 (Eingangs-Nr. X04784) (Winans et al., 1987) enthält. Das 687 bp SacI-SmaI-Fragment von pw108 wurde zuerst in die entsprechenden Orte von pKS(–) kloniert, um zu pKS3'E2 zu führen. Das 924 bp HaeIII-SacI-Fragment aus pw108 wurde mit dem SacI-PstI-Fragment von pKS3'E2 und einem verschmolzenen Paar von DNA-Oligonukleotiden kombiniert, flankiert von EcoRI-Kohäsiven und abgestumpften Enden
(5'-AATTCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3'; SEQ ID NO: 23),
und in die EcoRI-PstI-Orte von pBluescript KS- (Stratagene, Inc.) kloniert, um zu pKSE2 zu führen. XhoI-PstI-Fragment, das die gesamte virE2-codierende Region umfaßte, wurde dann in Xhol-PstI von pMF6 subkloniert, um zu p35SAdhE2 zu führen.
Pflanzenmaterial
Mais-Suspensionszellen
Die Suspensionskultur von Zea Mays Sorte Black Mexican Sweet (BMS) wurde in N6-Medien (Chu et al., 1975) gehalten, ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S). Für die Experimente verwendete Maiszellsuspensionen wurden aus 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen entnommen.
Protoplasten wurden aus Zellsuspensionskultur von Mais-Inzucht-BMS (Black Mexican sweet) isoliert, wie beschrieben in "Black Mexican sweet corn: its use for tissue cultures. Maize for biological research", herausgegeben von W.F. Sheridan, Charlottesville, Va., Plant Molecular Biology Association (1982), S. 385–388). Paromomycin (200 mg/l) wurde im Medium 2 Tage nach der Transformation eingeschlossen. Unabhängige Mikrokalli, die ca. 4 Wochen nach der Transformation erschienen, wurden auf frische Platten übertragen, ergänzt mit 200 μg/ml Paromomycin. Nach zwei Subkulturen auf dem gleichen Medium wurden Suspensionskulturen durch Impfen von ca. 100 mg Maiszellen in 25 ml Flüssigmedium, ergänzt mit 20 μg/ml Paromomycin, eingeleitet. Protoplasten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von pNeoRBLuc-DNA mit oder ohne p35SAdhD1, p35SAdhD2 und/oder p35SAdhE2 wie in Tabelle 15 beschrieben transformiert.
DNA-Extraktion und Southern Blot-Hybridisierung
Zellkulturen wurden durch Filtration 10 Tage nach dem Überimpfen geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. DNA wurde wie beschrieben isoliert (Hall et al., 1991).
Ca. 10 μg genomische DNA wurden für den Verdau mit EcoRI verwendet. Nach Trennung an einem 0,7%igen Agarosegel wurde die DNA auf Hybond+ Membran überführt und die Hybridisierung gemäß den vom Hersteller (Amersham) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. DNA-Sonden wurden mit [a-³²P]dCTP unter Verwendung des Oligo-Labelling-Kit von Pharmacia markiert. Die neo-Sonde entsprach einem 0,3 kb PstI-SphI-Fragment des nptII-Gens. Die luc-Sonde entsprach einem 0,7 kb XbaI-EcoRI-Fragment des Luciferase-Gens. Zur Entfernung von Sonden wurden die Membranen mit einer Lösung von 0,5 % SDS bei 100°C für 5 min gestrippt.
Ergebnisse:
Experimenteller Aufbau
Ein Vektor wurde geschaffen, um die Durchmusterung auf VirD1- und VirD2-vermittelte Insertionsereignisse durch einen genetischen Test zu erlauben. Der Vektor pNeoRBLuc enthält einen natürlichen linken Rand aus einem Ti-Plasmid, nos-NPTII-nos (ein chimäres Neomycinphosphotransferase II-Gen mit Nopalinsynthasepromotor und Terminatorsequenzen), einen 35S-Promotor, eine synthetische rechte Randsequenz und die Luciferasecodierende Region. Paromomycin-resistente Maiskalli, die durch den gewöhnlichen Mechanismus transformiert wurden, würden fast unweigerlich das Luciferase-Gen enthalten und Luciferase exprimieren. Im Gegensatz waren Klone, die in der Expression von Luciferase versagen, Kandidatenprodukte für das VirD1- und VirD2-vermittelte Ausschneiden und die T-Strangintegration. Zu Expression von virD1-, virD2- und virE2-Genen in Pflanzenzellen wurden ihre jeweiligen offenen Leseraster (ORFs) unter die Kontrolle des CaMV35S-Promotors gestellt.
Analyse von stabilen Transformanten:
Protoplasten wurden mit pNeoRBLuc-Plasmid-DNA zusammen mit p35SAdhD1- und p35SAdhD2- und/oder p35SAdhE2-DNAs in verschiedenen Verhältnissen transformiert. Als Kontrolle wurde auch pNeoRBLuc-Plasmid allein übertragen. Stabile Transformanten wurden durch Wachstum auf Paromomycinhaltigem Medium selektiert. Durchschnittlich 120 Paromomycin-resistente Klone erschienen pro Platte, wenn pNeoRBluc mit virD1- und virD2-Genen co-transformiert wurde, aber nur 30 Kalli wurden weiter analysiert. Die Anzahl von Paromomycin-resistenten Kalli konnte 250 erreichen, wenn virE2 zur Sammlung von Virulenzgenen hinzugegeben wurde.
30 Paromomycin-resistente Klone wurden aus jedem Satz von Experimenten analysiert, und es wurde festgestellt, daß ca. 10–40 % nicht Luciferase exprimierten, was eine ca. 10 bis 40%ige Häufigkeit von virD1- virD2-vermittelten Integrationsereignissen nahelegt. Dies unterschätzte vermutlich die Häufigkeit von "agrolistischen" Ereignissen, da Klone, die beide Inserte enthalten, in der 90 % Luciferase-positiven Gruppe eingeschlossen würden. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Häufigkeit von Kalli, die nicht Luciferase exprimierten, die aus dem Experiment mit oder ohne das virE2-Gen gewonnen wurden.
Southern-Blot-Analyse von Transformantenklonen:
Southern-Blot-Hybridisierung wurde an DNA aus Paromomycin-resistenten Kontrollkalluslinien durchgeführt, die nach Bombardierung mit (i) pNeoRBLuc allein; (ii) pNeoRBLuc-Plasmid, co-transformiert mit p35SAdhD1- und p35SAdhD2-DNAs, und (iii) pNeoRBLuc-Plasmid, co-transformiert mit p35SAdhD1-, p35SAdhD2- und p35SAdhE2-DNAs, erhalten wurden.
Genomische DNA wurde mit EcoRI verdaut, was ein 3,9 kb-Fragment aus dem pNeoRBLuc-Plasmid erzeugt, das homolog mit beiden neo- und luc-Sonden ist. EcoRI hat einen Ort innerhalb des T-DNA-Strukturteils von pNeoRBLuc und einen anderen in der Luciferase-codierenden Region.
Kontrolltransformanten, die aus der Transformation von Protoplasten mit pNeoRBLuc allein gewonnen wurden, wiesen das erwartete 3,9 kb EcoRI-Fragment auf, das sowohl mit der luc- als auch mit der neo-Sonde hybridisiert. Die Kopiezahl dieses Fragments ist größer als 5, und zusätzlich wurden multiple Kopien von umgelagerter und/oder fragmentierter DNA beobachtet.
Southern-Blot-Analyse von DNA aus Paromomycin-resistenten Kalluslinien, erhalten nach gleichzeitiger Übertragung von pNeoRBLuc mit p35SAdhD1-, p355AdhD2- und/oder p35SAdhE2-Plasmid-DNAs, ist in Tabelle 15 dargestellt. Für die Southern-Blot-Analyse wurden Kalluslinien gewählt, die negativ auf Luciferaseaktivität testeten. Zum Beispiel wiesen unter den 8 transgenen Maislinien, die im Experiment #8 gewonnen und durch Southern-Hybridisierungen analysiert wurden, 4 biolistische Ereignisse auf, und 4 wiesen mutmaßliche agrolistische Ereignisse auf. Die abgeschätzte Anzahl von NPTII-Genkopien war allgemein 1 oder 2 pro Transformantengenom gemäß Bewertung durch einen Vergleich mit Kopiezahlstandards, die im gleichen Hybridisierungsfilter eingeschlossen wurden. Die Kalluslinien, die genomische DNA enthielten, die mit der neo-Sonde und der luc-Sonde hybridisierte, wiesen weniger Kopien als die Kalluslinien auf, die aus der Transformation mit pNeoLuc-DNA allein gewonnen wurden.
Tabelle 15: Transformationsexperimente:
Tabelle 15 (Fortsetzung)
Tabelle 15: Anzahl individueller Kalli, bewertet 4 Wochen nach der Transformation
Schlußfolgerung:
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß diese Technologie das Integrationsmuster des auf Protoplasten übertragenen Fremdgens vereinfachen kann. Die Häufigkeit von VirD1-VirD2-vermittelter Integration betrug ca. 20–30 %. Außerdem verbesserte die Zugabe von virE2 die Transformationseffizienz. Diese Technologie wird in der Gewinnung von transformierten Pflanzen mit einfachem Integrationsmuster des interessierenden Gens und ohne Fremd-DNA helfen.
Beispiel 10: Transformation des CG00526-Genotyps von Mais durch direkte Bombardierung unreifer zygotischer Embryos und Isolierung von transformiertem Kallus unter Verwendung von Phosphinothricin als Selektionsmittel
Vorbereitung von DNA zur Bombardierung unter Verwendung der Biolistic^®-Vorrichtung
Unreife Embryos oder Kallus vom Typ I aus Mais können wie in Koziel et al. beschrieben transformiert werden, Biotechnology 11: 194–200, 1993, dessen relevante Teile hier durch Verweis eingeführt werden.
Die DNA wird zur Mikroprojektilbombardierung durch chemische Ausfällung in Gegenwart von Gold in Mikrometergröße (typischerweise 1,0 oder 0,3 mm Durchmesser) vorbereitet, im wesentlichen gemäß dem veröffentlichten Verfahren. Zusätzlich zu Gold können andere dichte Partikel von Mikrometergröße verwendet werden, wie zum Beispiel Wolfram oder Platin. In einer Modifikation des Verfahrens werden die Partikel selbst zuerst durch Suspendieren in Wasser und Ultraschallbehandlung vorbereitet. Die ultraschallbehandelten Partikel werden dann durch Zentrifugieren pelletiert und in einer wäßrigen Lösung aus 50 % Glycerin resuspendiert. Auf diese Weise hergestellte Partikel werden dann in individuellen Röhrchen, die ca. 3 mg Goldpartikel pro Röhrchen in einem Volumen von 50 μl enthalten, in Teilmengen unterteilt. DNA wird in jedes Röhrchen in verschiedenen Mengen gegeben, abhängig von der Anzahl der zu verwendenden Plasmide, ihrer Größe und der gewünschten Endkonzentration an DNA.
Als nächstes werden ca. 50 μl 2,5 M CaCl₂ und ca. 20 μl 0,1 M Spermidin in dieser Reihenfolge zu jedem Röhrchen unter Verwirbeln für ca. 3 Minuten hinzugegeben. Der DNA/Gold-Komplex wird dann vorsichtig zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt. Die Partikel werden einmal mit 250 μl absolutem Ethanol gewaschen, erneut pelletiert und dann in ca. 75 μl frischem absolutem Ethanol resuspendiert. Jedes auf diese Weise hergestellte Röhrchen hat ausreichend DNA/Goldkomplex für sechs "Schüsse" mit dem PDS-1000/He. 10 μl von gut suspendiertem DNA/Goldkomplex werden jeweils auf jede Makroträgerbahn in einer vibrationsfreien Umgebung pipettiert.
In der PDS-1000/He-Vorrichtung wird ein Schub von Helium durch Bruch einer Kunststoffscheibe freigesetzt, die in unterschiedlichen Druckgraden verfügbar ist. Zum Beispiel können einzelne Scheiben oder Kombinationen aus Scheiben erhalten werde, die bei 200, 450, 650, 900, 1100, 1350, 1550, 1800, 2000 und 2200 Pfund/Quadratzoll Helium bersten. Dieser Schub an Gas beschleunigt die Makroträgerbahn, die durch ein Gitter aus rostfreiem Stahl abgebremst wird. Das Gitter kann unterschiedliche Maschenweiten haben, wie zum Beispiel 10 × 10,16 × 16, 24 × 24 etc. Andere Einstellungen sind die Makroträger-Flugwege, der Zwischenraumabstand und der Partikelflugweg. Diese Einstellungen werden im Detail im Benutzerhandbuch des Herstellers beschrieben. Typischerweise werden ein Zwischenraumabstand von ca. 5,5 mm, ein Makroträger-Flugweg von ca. 10 mm und ein Partikel-Flugweg von ca. 6 bis 9 cm verwendet. Zusätzlich kann ein Gitter oder Prallblech in den Partikel-Flugweg zwischen dem Bremsschirm und die Zielplatte eingefügt werden. Ein solcher Schirm oder ein solches Prallblech stört die Schockwelle aus dem sich ausdehnenden Gas, wodurch die Beschädigung des Ziels reduziert wird. In einem Beispiel wird ein Gitter aus rostfreiem Stahl mit einer Öffnung von ca. 100 μm verwendet. Andere Öffnungsgrößen und Materialzusammensetzungen können verwendet werden.
Die unreifen Embryos oder embryogenen Kalli vom Typ I können auf der Zielplatte in unterschiedlichen Mustern angeordnet werden. Durch eine Reihe von Experimenten werden optimierte Muster für unreife Embryos entwickelt. In einem optimierten Muster werden die unreifen Embryos in einem kreis förmigen Muster angeordnet, wobei der Kreis einen Durchmesser von ca. 2 cm hat. Die unreifen Embryos werden auf dem Umfang des Kreises abgelegt. Ca. 25 unreife Embryos werden auf jeder Zielplatte plaziert. Außerdem kann die Zielplatte in einem Winkel relativ zum Mikroträger-Startaufbau stehen. Dies stellt eine maximale Sättigung des basipetalen Teils des unreifen Embryos durch die Partikelausbreitung sicher. Es ist der basipetale Teil des unreifen Embryos, der zur embryogenen Reaktion führt.
In einem Beispiel für die Bombardierung des embryogenen Kallus vom Typ I wird der Kallus auf den Umfang eines Kreises mit einem Durchmesser von ca. 1 cm auf einem Nährmittelmedium plaziert. Die mechanischen Einstellungen der Bombardierungsvorrichtung können in Positionen ähnlich oder identisch zu den oben aufgeführten Einstellungen für die Bombardierung von unreifen Embryos plaziert werden.
Es sollte bemerkt werden, daß das Zielmuster und die Kanoneneinstellungen voneinander abhängig sind. Mit anderen Worten kann die Verwendung von anderen mechanischen Einstellungen an der Mikroprojektilbombardierungsvorrichtung andere optimale Anordnungen des Empfängergewebes auf der Zielplatte erzeugen. Andere Kombinationen von mechanischen Einstellungen und Zielmustern sind im Umfang der Erfindung.
Transformation
Unreife Embryos werden ca. 14 Tage nach der Selbstbestäubung erhalten. Die unreifen zygotischen Embryos werden zu 25 pro Platte auf unterschiedliche Zielplatten verteilt, die Medium enthalten, das die embryogene Kallusbildung induzieren und stützen kann. Die unreifen zygotischen Embryos werden mit einer Mischung aus den Plasmiden p35SAdhD1, p35SAdhD2 und dem T-DNA-Zielplasmid (pbarRBluc oder pAVM1) unter Verwendung der PDS1000/He-Vorrichtung von BioRad bombardiert. Exprimierbare DNA für das virE2-Gen kann auch eingeschlossen werden. Die Plasmide werden auf 0,3 oder 1 μm Goldpartikeln im wesentlichen gemäß dem wie oben beschrieben veröffentlichten Verfahren ausgefällt. Jede Zielplatte wird zweimal mit der Plasmid- und Gold-Zubereitung unter Verwendung eines Berstdrucks von 1100–1300 psi beschossen.
Da das Plasmid pbarRBluc ein chimäres Gen enthält, das für Resistenz gegen Phosphinothricin codiert, wird diese Substanz zur Selektion von transformierten Zellen in vitro verwendet. Diese Selektion wird mit 3 mg/l einen Tag nach der Bombardierung angewendet und für insgesamt 8–12 Wochen aufrechterhalten. Der so erhaltene embryogene Kallus wird in Gegenwart von 1 mg/l Phosphinothricin regeneriert.
Alle Kalli werden durch den Chlorphenolrot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT untersucht, wie beschrieben in US-Patentanmeldung 07/759,243, eingereicht am 13. September 1991, dessen relevante Teile hier durch Verweis eingeführt werden. Dieser Test verwendet einen pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Zellen, die wachsen, erzeugen eine pH-Veränderung im Medium und verändern den Indikator Chlorphenolrot zu Gelb (von Rot). Pflanzen, die das Resistenzgen gegen PPT exprimieren, werden leicht in diesem Test identifiziert. Pflanzen, die gemäß CR-Test positiv sind, werden durch PCR auf Gegenwart des bar-Gens getestet.
Pflanzen, die das selektierbare Markergen enthalten, werden auf Expression des Luciferase-Gens getestet. Die Abwesenheit von Luciferaseaktivität ist ein Indikator, daß der Kallus ein agrolistisches Ereignis sein kann. Ein agrolistisches Ereignis ist eines, in dem die DNA in die Mais-DNA in einer Weise integriert wird, die analog zur Insertion einer T-DNA ist, aber ohne die Vermittlung von Agrobacterium. Pflanzen, die negativ für Luciferasegenexpression sind, werden durch Southern-Blot analysiert. Das durch Southern-Blot-Analysen beobachtete Bandenmuster zeigt an, welche Transformanten agrolistisch waren.
Beispiel 11: Transformation des A188-Genotyps von Mais durch direkte Bombardierung von unreifen zygotischen Embryos und Isolierung von transformierten Pflanzen unter Verwendung von Phosphinothricin als Selektionsmittel
Ein Kolben vom Genotyp A188 wird selbstbestäubt, und unreife zygotische Embryos werden ca. 12 bis 14 Tage später erhalten. Unreife zygotische Embryos werden auf 2JMS+5Dc plus AgNO₃-Medium ausplattiert. Nach 16 bis 20 Stunden werden die unreifen zygotischen Embryos auf das gleiche Medium übertragen, das jedoch 12 % Saccharose enthält. Nach 3 bis 5 Stunden werden die unreifen zygotischen Embryos mit einer Mischung aus den Plasmiden p35SAdhD1, p35SAdhD2 und dem T-DNA-Zielplasmid (pbarRBluc oder pAVM1) unter Verwendung der PDS1000/He-Vorrichtung bombardiert. Exprimierbare DNA für das virE2-Gen kann auch eingeschlossen werden. Die Plasmide werden auf 0,3 oder 1 μm Goldpartikeln im wesentlichen gemäß dem von BioRad veröffentlichten Verfahren wie oben beschrieben ausgefällt. Die Partikel werden unter Verwendung eines Berstdrucks von 1100–1300 psi Helium übertragen. Jede Zielplatte wird zweimal mit der Plasmid- und Gold-Partikelzubereitung beschossen. Nach Inkubation über Nacht werden die unreifen Embryos auf frisches Erhaltungsmedium übertragen, das 2 Saccharose und Phosphinothricin mit 5–10 mg/l enthält, und etwa alle zwei Wochen auf das gleiche Medium subkultiviert. Der so erhalten embryogene Kallus wird in Gegenwart von 1 mg/l Phosphinothricin regeneriert.
Alle Pflanzen, die regenerieren, werden durch den Chlorphenolrot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT untersucht. Dieser Test verwendet einen pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Blattstücke, die resistent gegen PPT sind, erzeugen eine pH-Veränderung im Medium und verändern den Indikator zu Gelb (von Rot). Pflanzen, die das Resistenzgen gegen PPT exprimieren, werden leicht in diesem Test identifiziert. Gemäß CR-Test positive Pflanzen werden durch PCR auf Gegenwart des bar-Gens getestet.
Pflanzen, die das selektierbare Markergen enthalten, werden auf Expression des Luciferase-Gens getestet. Die Abwesenheit von Luciferaseaktivität ist ein Indikator, daß Kallus ein agrolistisches Ereignis sein kann. Ein agrolistisches Ereignis ist eines, in dem die DNA in die Mais-DNA in einer Weise integriert wird, die analog zur Insertion einer T-DNA ist, aber ohne die Vermittlung von Agrobacterium. Pflanzen, die negativ für Luciferasegenexpression sind, werden durch Southern-Blot analysiert. Das Bandenmuster im Southern Blot zeigt an, welche Transformanten agrolistisch sind.
Beispiel 12: Transformation des CG00526-Genotyps von Mais durch Bombardierung von Kallus Typ I, der aus unreifen zygotischen Embryos stammt, und Isolierung von transformiertem Kallus unter Verwendung von Phosphinothricin als Selektionsmittel
Kallus vom Typ I wird aus unreifen zygotischen Embryos unter Verwendung von Standardkulturtechniken erhalten. Zur Genübertragung werden ca. 300 mg des Typ I-Kallus durch Zerkleinern mit einer Skalpellklinge, 3-maliges Spülen mit Standardkulturmedium, das 18 % Saccharose enthält, und unmittelbares Plazieren auf halbfestem Kulturmedium, das erneut 18 % Saccharose enthält, hergestellt. Nach ca. 4 Stunden wird das Gewebe unter Verwendung der PDS-1000/He-Biolistic-Vorrichtung von BioRad bombardiert. Plasmide werden auf 0,3 oder 1 μm-Goldpartikel unter Verwendung des Standardprotokolls von BioRad ausgefällt. Ca. 16–20 Stunden nach der Genübertragung wird der Kallus auf Standardkulturmedium übertragen, das 2 Saccharose und 10 mg/l Phosphinothricin als Basta enthält. Der Kallus wird zur Selektion für 8 Wochen subkultiviert, worauf überlebender und wachsender Kallus auf Standardregenerationsmedium für die Erzeugung von Pflanzen überführt wird.
Alle Pflanzen, die regenerieren, werden durch den Chlorphenolrot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT getestet. Dieser Test verwendet einen pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Zellen die wachsen, erzeugen eine pH-Veränderung im Medium und verändern den Farbstoff zu Gelb (von Rot). Pflanzen, die das Resistenzgen gegen PPT exprimieren, werden leicht in diesem Test identifiziert. Gemäß CR-Test positive Pflanzen werden durch PCR auf Gegenwart des bar-Gens getestet.
Kalli, die das selektierbare Markergen enthalten, werden zur Expression des Luciferase-Gens getestet. Die Abwesenheit von Luciferaseaktivität ist ein Indikator, daß der Kallus ein agrolistisches Ereignis sein kann. Ein agrolistisches Ereignis ist eines, in dem die DNA in die Mais-DNA in einer Weise integriert wird, die analog zur Insertion einer T-DNA ist, aber ohne die Vermittlung von Agrobacterium. Pflanzen, die negativ für Luciferasegenexpression sind, werden durch Southern-Blot analysiert. Das Bandenmuster im Southern-Blot zeigt an, welche Transformanten agrolistisch sind.
Beispiel 13: Transformation von Kallus des Genotyps von Mais der aus B73 stammt, durch Bombardierung von bröckeligen Suspensionakulturzellen, die aus unreifen zygotischen Embryos stammen, und Isolierung von transformiertem Kallus unter Verwendung von Phosphinothricin als Selektionsmittel.
Bröckeliger Kallus stammte aus der Ausplattierung von unreifen Embryos vom aus B73 stammenden Genotyp, wie in US-PS 5,350,689 beschrieben, das hier durch Verweis eingeführt wird.
Suspensionskulturen wurden wöchentlich in N6-Medium subkultiviert. 3 bis 5 Tage nach der Subkultur entnommene Zellen wurden durch Filtrieren durch ein 710 μm-Filter aus rostfreiem Stahl und anschließendes Verteilen auf der Oberfläche von Durapore-Membranen (siehe CGC1280/81) geerntet. Ca. 0,4 g Zellen wurden auf der Oberfläche von jeder Membran mit 47 mm Durchmesser verteilt. Die Membranen wurden auf N6-Medium, das 12 % Saccharose enthielt, für 3–5 Stunden vor Bombardierung mit einer Mischung aus den Plasmiden plaziert, die die vir-Gene (35SAdhD1, p35SAdhD2) und das T-DNA-Zielplasmid (pbarRBluc oder pAVM1) tragen, unter Verwendung der PDS1000/He-Vorrichtung. Entweder gleiche Mengen (1:1:1) von VirD1-, VirD2- und 35S-bar-Ziel-T-DNA (jeweils 1,3 μg insgesamt als 2 Schüsse) oder ein Überschuß von vir-Genen (2:2:1 μg als 2 Schüsse) wurden auf die Zellen übertragen. Exprimierbare DNA für das virE2-Gen kann auch in solchen Experimenten eingeschlossen werden.
Die Plasmide wurden auf 0,3 oder 1 μm Goldpartikeln im wesentlichen gemäß dem von BioRad veröffentlichten Verfahren wie oben beschrieben ausgefällt. Die Partikel wurden unter Verwendung eines Berstdrucks von 1100–1300 psi Helium übertragen. Jede Zielplatte erhielt 2 Schüsse. Nach Inkubation über Nacht wurden die Membranen mit dem Kallus auf frisches Erhaltungsmedium übertragen, das 2 % Saccharose und Phosphinothricin mit 3 mg/ml enthielt. Nach 3 Wochen wurden die Zellen aus jedem Filter auf der Oberfläche von 3 Platten aus 2N6-Medium, das 10 mg/l Basta enthielt, ausgebreitet. Vier Wochen später wurden wachsende Kolonien auf frisches 2N6 mit 3 mg/l Basta übertragen, und eine Woche später wurden die so erhaltenen Kalli durch den Chlorphenolrot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT getestet. Dieser Test verwendet einen pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Zellen, die wachsen, erzeugen eine pH-Veränderung im Medium und verändern den Indikator zu Gelb (von Rot). Kalli, die das Resistenzgen gegen PPT exprimieren, wurden leicht in diesem Test identifiziert. Positive Stücke machten das Medium entweder Gelb oder Orange, was zumindest etwas Resistenz gegen PPT anzeigt, und sie wurden auf 2N6-Medium, das 5 mg/l Basta enthielt, plaziert.
Gemäß CR-Test positive Kalli wurden durch PCR auf Gegenwart des bar- oder PAT-Gens getestet.
Tabelle 16: Identifizierung von transformierten Linien von Kallus von Mais
Tabelle 16:

#

(1) und (2) waren zwei doppelte Behandlungen

*

Diese Kolonie war positiv für Luciferase

§

Eine von diesen war ein mutmaßliches agrolistisches Ereignis

Kalluslinien, die das selektierbare Markergen enthielten, wurden auf Expression des Luciferasegens getestet. Die Abwesenheit von Luciferaseaktivität war ein Indikator, daß der Kallus ein agrolistisches Ereignis sein kann. Ein agrolistisches Ereignis ist eines, in dem die DNA in die Mais-DNA in einer Weise integriert wird, die analog zur Insertion einer T-DNA ist, aber ohne die Vermittlung von Agrobacterium. Kalluslinien, die negativ für Luciferasegenexpression waren, wurden durch Southern-Blot analysiert. Das Bandenmuster im Southern-Blot (Figur) zeigte an, welche Transformanten agrolistisch waren.
Tabelle 17: Analyse von Mais-Kalluslinien, gewonnen nach Bombardierung von Maiszellen mit Konstrukten, die zur Übertragung von T-DNA-Inserten auf Mais geeignet sind.
Die Tabelle zeigt, daß von 23 Zellinien, die in diesem Experiment analysiert wurden, 11 Luciferaseaktivität fehlte, und von 9 von den durch Southern-Blot analysierten vier nur T-DNA-artige Inserte enthielten und zwei sowohl T-DNA-artige Inserte als auch typische Inserte enthielten, die nach Verwendung eines nicht-biologischen (in diesem Fall biolistischen) Verfahrens zur Übertragung der DNA gefunden werden.
Beispiel 14: Transformation von Kallus des CG00526-Genotyps von Mais durch Bombardierung von Typ I-Kalluszellen, die aus unreifen zygotischen Embryos stammen, und Isolierung von transformiertem Kallus unter Verwendung von Phosphinothricin als Selektionsmittel
Kallus stammte aus dem Ausplattieren von unreifen Embryos vom Genotyp CG00526 wie in Koziel et al. beschrieben, Biotechnology 11: 194–200, 1993. Kulturen werden wöchentlich auf Erhaltungsmedium (2DG4 + 0,5 mg/l 2,4-D) subkultiviert, und 2–3 Tage nach der Subkultur entnommene Zellklumpen werden auf 2DG4-Medium, das 12 % Saccharose enthält, für 3–5 Stunden plaziert. 16 Zielkallusstücke pro Platte werden in einem Ring mit einem Durchmesser von 8–10 mm angeordnet. Der Kallus wird mit einer Mischung aus den Plasmiden, die die vir-Gene (35SAdhD1, p35SAdhD2) und das T-DNA-Zielplasmid (pbarRBluc oder pAVM1) tragen, unter Verwendung der PDS1000/He-Vorrichtung bombardiert. Entweder gleiche Mengen (1:1:1) von VirD1-,VirD2- und 35S-bar-Ziel-T-DNA (jeweils 1,3 μg insgesamt als 2 Schüsse) oder ein Überschuß von vir-Genen (2:2:1 μg als 2 Schüsse) werden auf die Zellen übertragen. Exprimierbare DNA für das virE2-Gen kann auch eingeschlossen werden.
Die Plasmide werden auf 0,3 oder 1 μm-Godpartikeln im wesentlichen gemäß dem von BioRad veröffentlichten Verfahren wie oben beschrieben aus gefällt. Die Partikel werden unter Verwendung eines Berstdrucks von 650 psi Helium übertragen. Jede Zielplatte erhält zwei Schüsse. Nach Inkubation über Nacht wird der Kallus auf frisches Erhaltungsmedium übertragen, das 2 % Saccharose enthält. Nach weiteren zwei Wochen wird der wünschenswerte Kallus (der eine für Typ I typische Morphologie zeigt) auf Erhaltungsmedium subkultiviert, das 120 mg/l Basta (PPT) enthält. Vier Wochen später wird wachsender Kallus auf frisches Erhaltungsmedium mit 30 mg/l Basta übertragen.
Der Kallus wird zur Selektion für insgesamt 8 Wochen subkultiviert, worauf überlebender und wachsender Kallus auf Standardregenerationsmedium für die Erzeugung von Pflanzen übertragen wird.
Alle Pflanzen, die regenerieren, werden durch den Chlorphenolrot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT getestet. Dieser Test verwendet einen pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Zellen, die wachsen, erzeugen eine pH-Veränderung im Medium und verändern den Indikator nach Gelb (von Rot). Pflanzen, die das Resistenzgen gegen PPT exprimieren, werden leicht in diesem Test identifiziert. Gemäß CR-Test positive Pflanzen werden durch PCR auf Gegenwart des bar-Gens getestet.
Pflanzen, die das selektierbare Markergen enthalten, werden auf Expression des Luciferasegens getestet. Die Abwesenheit der Luciferaseaktivität ist ein Indikator, daß der Kallus ein agrolistisches Ereignis sein kann. Ein agrolistisches Ereignis ist eines, in dem die DNA in die Mais-DNA in einer Weise integriert wird, die analog zur Insertion einer T-DNA ist, aber ohne Vermittlung von Agrobacterium. Pflanzen, die negativ für Luciferasegenexpression sind, werden durch Southern-Blot analysiert. Das Bandenmuster im Southern-Blot zeigt an, welche Transformanten agrolistisch sind.
Beispiel 15: Transformation von Maisprotoplasten mit vir-Genen und einer T-DNA-Zielsequenz
Verfahren zur Herstellung von Protoplasten aus Suspensionskultur von Zea mays und Transformation mit DNA werden in US-PS 5,350,689 beschrieben. Die zur Transformation der Protoplasten verwendete DNA besteht zum Beispiel aus einer Mischung aus den Plasmiden p35SAdhD1, p35SAdhD2 und dem T-DNA-Zielplasmid (pbarRBluc oder pAVM1). Exprimierbare DNA für das virE2-Gen kann auch eingeschlossen werden (siehe Beispiel 7). Kallus wird aus den Protoplasten gewonnen und Pflanzen werden wie beschrieben unter Verwendung von Phosphinothricin als Selektionsmittel regeneriert. Aus transformierten Protoplasten stammende Zellen werden typischerweise durch Anwendung von Selektion mit 3–5 mg/l PPT selektiert, beginnend 10 Tage nach der Behandlung mit der DNA.
Alle Pflanzen, die regenerieren, werden durch den Chlorphenolrot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT getestet. Dieser Test verwendet einen pH-empfindlichen Indikatorfarbstoff um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Zellen, die wachsen, erzeugen eine pH-Veränderung im Medium und verändern den Indikator nach Gelb (von Rot). Pflanzen, die das Resistenzgen gegen PPT exprimieren, werden leicht in diesem Test identifiziert. Gemäß CR-Test positive Pflanzen werden durch PCR auf Gegenwart des bar-Gens getestet.
Pflanzen, die das selektierbare Markergen enthalten, werden auf Expression des Luciferasegens getestet. Die Abwesenheit von Luciferaseaktivität ist ein Indikator, daß der Kallus ein agrolistisches Ereignis sein kann. Ein agrolistisches Ereignis ist eines, in dem die DNA in die Mais-DNA in einer Weise integriert wird, die analog zur Insertion einer T-DNA ist, aber ohne Vermittlung von Agrobacterium. Pflanzen, die negativ für Luciferasegenexpression sind, werden durch Southern-Blot analysiert. Das Bandenmuster des Southern-Blot zeigt an, welche Transformanten ein T-DNA-artiges Insert haben. Die Klonierung und Sequenzierung der Randsequenzen kann durchgeführt werden, um die Natur der Inserte zu bestätigen.
Bibliographie der in den Beispielen zitierten Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer Pflanzenzelle, das das Transformieren der Zelle mit den folgenden Komponenten umfaßt: a) eine DNA von Interesse, die durch T-DNA-Randsequenzen von Agrobacterium gebunden ist; und b) wenigstens ein chimäres DNA- oder RNA-Molekül, das in der Zelle ein oder mehrere Proteine exprimieren kann, die die Integration der DNA von Interesse fördern können, worin das eine oder die mehreren Proteine durch die Virulenzregion eines Agrobacterium Ti- oder Ri-Plasmids codiert werden und worin die Zelle durch ein nicht-biologisches Mittel transformiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Verfahrensschritte a) und b) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das nicht-biologische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Elektroporation, Mikroinjektion, induzierter Aufnahme und Mikroprojektilbombardierung besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, worin das chimäre DNA- oder RNA-Molekül VirD2, VirD1, VirC1, VirC2 oder VirE2 codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das chimäre DNA- oder RNA-Molekül VirD2 allein oder eine Kombination aus VirD1 und VirD2 oder eine Kombination aus VirD1, VirD2 und VirE2 codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das chimäre DNA- oder RNA-Molekül VirD2 codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Pflanzenzelle eine Zelle einer zweikeimblättrigen Pflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die zweikeimblättrige Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tabak, Baumwolle, Ölraps und Sojabohne besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Pflanzenzelle eine Zelle einer einkeimblättrigen Pflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die einkeimblättrige Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen und Reis besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die DNA von Interesse ein chimäres Gen umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin das chimäre Gen ein Protein in der Pflanzenzelle exprimieren kann.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die DNA von Interesse und die chimäre DNA oder RNA Komponenten eines einzelnen DNA- oder RNA-Moleküls sind.
Verfahren zur Erzeugung einer fruchtbaren transgenen Pflanze mit DNA, die durch T-DNA-Randsequenzen von Agrobacterium, die in das Genom integriert sind, gebunden ist, umfassend: a) Transformieren der DNA in das Genom einer Pflanzenzelle gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 und b) Regenerieren der transformierten Pflanzenzelle zu einer fruchtbaren transgenen Pflanze.
Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die fruchtbare transgene Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tabak, Baumwolle, Ölraps, Sojabohne, Mais, Weizen und Reis besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Verfahrensschritt b) vor Schritt a) durchgeführt wird.