DE69330227T2

DE69330227T2 - Zur ortsspezifischen rekomination fähige agrobakterium stämme

Info

Publication number: DE69330227T2
Application number: DE69330227T
Authority: DE
Inventors: Jan Hooykaas; Teresa Mozo
Original assignee: Zeneca Mogen BV
Current assignee: Syngenta Mogen BV
Priority date: 1992-02-26
Filing date: 1993-02-25
Publication date: 2001-10-25
Anticipated expiration: 2013-02-26
Also published as: ES2157217T3; EP0628082A1; WO1993017116A1; DE69330227D1; EP0628082B1; US5635381A; ATE201236T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Agrobacterium-Stämme, die rekombinante DNA beherbergen und die zur ortsspezifischen Rekombination befähigt sind, auf ein Verfahren zum Erhalt der besagten Agrobacterium-Stämme und auf Verfahren zur Verwendung der besagten Agrobacterium-Stämme.

Hintergrund der Erfindung

Agrobacterium ist eine Gattung gram-negativer Bodenbakterien, die in dikotyledonen Pflanzen mittels des natürlichen Systems zur Übertragung von phytohormonbildender DNA auf Pflanzen, das sie besitzen, neoplastisches Zellwachstum bewirken. Das T-(transferierte)Gebiet ist ein Segment des grossen sogenannten Ti-(tumorinduzierenden)Plasmids (200 kb), das von allen virulenten Agrobacterium-Stämmen beherbergt wird. (Gelegentlich wird das T-Gebiet auch als T-DNA bezeichnet). Die Übertragung des T-Gebiets auf die Pflanzenzellen wird durch ein anderes Gebiet des Ti-Plasmids, das als das vir-(Virulenz)Gebiet bezeichnet wird, in einem Verfahren bewirkt, das der bakteriellen Konjugation ähnelt (für Übersichtsartikel siehe: Melche rs LS und Hooykaas PJJ (1987), in: Miflin BJ (Hg.), "Oxford surveys of plant and cell biology", Bd. 4. Oxford Univ. Press, London/New York, Seiten 167-220; Zambryski P (1988) Annu. Rei. Genet. 22: 1- 30; Zambryski P, Tempe J, Schell J (1989) Cdl 56 : 193-201. Dieses natürliche Gentransferaystem kann verwendet werden, um DNA, die nicht natürlicherweise im T-Gebiet vorhanden ist, zu ko-transferieren. Das T-Gebiet wird von zwei unvollkommenen direkten Repeats (T-DNA-Ränder) von 24 bp flankiert, die die einzigen cis-essentiellen Elemente für den Transferprozess sind; d. h. die Ränder müssen an die auf die Pflanzenzelle zu übertragende DNA geknüpft sein. Ein ideales Vektorsystem zum Übertragen der DNA auf Pflanzenzellen sollte die zu übertragende DNA in auf beiden Seiten von T-DNA-Rändern flankierter Art enthalten, obwohl festgestellt wurde, dass der rechte T-DNA-Rand, vorzugsweise in Verbindung mit einem Gebiet unmittelbar ausserhalb des T- Gebietes, das als "Overdrive" bezeichnet wird, für den Transfer der DNA ausreicht. Obwohl nicht unerlässlich, erhöht die Anwesenheit dieses "Overdrives" die Effizienz des Transfers der DNA, die den rechten Rand flankiert.
Das zweite essentielle Element, das vir-Gebiet, kann in trans, d. h. nicht physisch an das T-Gebiet geknüpft, bereitgestellt werden. Dieser Befund führte zur Entwicklung eines binären Vektorsystems, in dem das T-Gebiet, das die auf die Pflanzenzelle zu kotransferierende DNA umfasst, in ein Plasmid mit breitem Wirtsspektrum, das zur Vermehrung in Agrobacterium und E. coli befähigt ist, kloniert wird, während die vir-Funktionen von dem inaktivierten Helferplasmid, das kein T-Gebiet enthält, bereitgestellt werden (Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Nature 310 : 115-120; Europäisches Patent EP-B-0 120 516); Bevan M (1984) Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721). Ein binäres Vektorsystem, worin das T-Gebiet auf dem Chromosom des Agrobacterium-Stamms liegt, wurde auch offenbart (EP-B- 0 176 112).
Obwohl ein binäres Vektorsystem sehr vielfältig ist, sind Plasmide mit breitem Wirtsspektrum als Routine-Klonierungsvektoren weniger geeignet; sie sind gross und weisen in der Regel eine niedrige Kopienanzahl auf. Ausserdem sind sie in der Regel in Abwesenheit von Selektionsdruck in Agrobacterium nicht stabil.
Als eine Alternative zu einem binären Vektorsystem kann man ein sogenanntes kointegriertes System verwenden. Typisch liegen die vir-Funktionen auf einem Ti-Plasmid und die zu kotransferierende DNA muss in dieses Ti-Plasmid rekombiniert werden. Alle Klonierungsschritte können unter Verwendung eines E. coli-Vektors durchgeführt werden, wonach dieser Vektor in Agrobacterium eingeführt wird, beispielsweise mittels Dreielternverschmelzung oder Elektroporation. Anschliessend muss die homologe Rekombination zwischen dem Vektor und dem Akzeptor-Ti-Plasmid über ein einzelnes oder doppeltes Crossing Over unter Verwendung grosser Gebiete der Homologie zwischen dem E. coli-Vektor und dem Akzeptor-Ti-Plasmid stattfinden. Die Gebiete der Homologie können beispielsweise in das Akzeptor-Ti-Plasmid eingeführt werden, indem die ursprünglich in diesem Plasmid zwischen den T-DNA-Rändern enthaltene DNA durch Klonierungsvektorsequenzen wie etwa pBR322 ersetzt werden (Van Haute E, Joos H, Maes M, Warren G, Van Montagu M, Schell J. (1983) EMBO J. 2 : 411-418; Zambryski P, Joos H, Genetello C, Leemans J, Van Montagu M, Schell J. (1983) EMBO J. 12 : 2143- 2150; Deblaere R, Bytebier B, De Greve H, Deboeck F, Schell J, Van Montagu M, Leemans J (1985) Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788.) Es ist auch möglich, als Akzeptorplasmide Helferplasmide zu verwenden, die frei von T-DNA-Rändern sind; in diesem Fall wird es notwendig sein, mindestens den rechten T-DNA-Rand in einer operabel an die auf dem Klonierungsvektor in die Pflanzenzelle einzuführende DNA geknüpften Form bereitzustellen. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass die homologe Rekombination, insbesondere das bevorzugte doppelte Crossing Over, bei Agrobacterium-Stämmen kein sehr effizienter und genauer Prozess ist, was die langwierige Selektion der Zellen, die die gewünschten Kointegrate beherbergen, erforderlich macht, bevor sie in der Pflanzentransformation eingesetzt werden können. Ein zusätzlicher Nachteil der erhaltenen kaintegrierten Plasmide liegt in der Tatsache, dass grosse Gebiete repetitiver Sequenzen vorkommen, was Unstabilität bewirken kann.
Es ist möglich, die Rekombinationsschritte in E. coli anstelle von Agrobacterium durchzuführen, wie in EP-B-0 120 515 beschrieben, und anschliessend die kointegrierten Plasmide zur Verwendung in der Pflanzentransformation auf Agrobacterium zu transferieren.
Es wäre vorteilhaft, wenn die Rekombination in Agrobacterium durchgeführt werden könnte, ohne Bedarf an langen Gebieten der Homologie zwischen dem Akzeptorplasmid und dem Klonierungsvektor.

Stand der Technik

Die genetische Rekombination kann breit in zwei Kategorien unterteilt werden. Die homologe Rekombination und die ortsspezifische Rekombination. Bei der homologen Rekombination kann der tatsächliche Ort der Rekombination nicht vorhergesagt werden; es sind grosse Gebiete der Homologie notwendig, um Rekombination in vernünftiger Häufigkeit zu erzielen, während bei der ortsspezifischen Rekombination der Rekombinationsort genau bekannt ist; ausserdem werden keine ausgedehnten Gebiete der Homologie benötigt (für einen Übersichtsartikel: Craig et al., (1988) Annu. Rev. Genet. 22, 77-105.)
Ein Cre-loxP ortsspezifisches Rekombinationssystem des E. coli-Phagen P1 wurde offenbart (Sternberg N und Hamilton D (1981) J. Mol. Biol. 150: 467-486.); (lox: Ort der Rekombination - P - vom Phagen P1; Ore: bewirkt Rekombination). Die Cre-Rekombinase erkennt die loxP-DNA-Sequenz mit 34 Bp, die aus den zwei invertierter, durch eine nichtsymmetrische Sequenz von 8 Bp getrennten Repeats von 13 Basenpaaren besteht, und bewirkt ihre Rekombination mit einer anderen loxP-Sequenz. Wenn sich die beiden loxP-Orte auf verschiedenen kreisförmigen DNA-Molekülen befinden, bewirkt das Rekombinationsereignis ihre Kointegration, während wenn die beiden loxP-Orte sich auf dem selben Molekül befinden, die dazwischen liegende DNA je nach ihrer relativen Orientierung (direkt oder invertiert) entweder ausgeschnitten oder invertiert wird (Abremski K, Hoess R, Sternberg N (1983) Cell 32: 13011-1311; Hoess RH, Wierzbicki A, Abremski K (1986} Nucl. Acids Res. 14 : 2287-2300).
Von dem System wurde gezeigt, dass es in Hefen (Sauer B (1987) Mol. Cell Biol. 7: 2087-2096) und kultivierten Mauszellen (Sauer B und Henderson N (1989) Nucl. Acids Res. 17: 147-161) funktioniert, und kürzlich wurde es für die ortsspezifische Rekombination im Genom von transgenem Tabak verwendet (Odell J, Caimi P, Sauer 13, Russel S (1990) Mol. Gen. Genet. 203: 3669-378; Internationale Patentanmeldung WO-A-91/09957).
Ähnliche Rekombinationssysteme, die nur ein einziges Polypeptidenzym und kurze spezifische DNA-Sequenzen (Rekombinationsorte) benötigt, wurden von Craig et al. (siehe oben) in einem Übersichtsartikel zusammengestellt.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, Agrobacterium- Stämme und Vektoren zur Verwendung in diesen, die zur ortsspezifischen Rekombination befähigt sind, bereitzustellen, was die Einfügung von DNA, die in den besagten Agrobacterium-Stämmen nicht natürlicherweise vorkommt, in diese ermöglicht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt Agrobacterium-Stämme zur Verfügung, die zur Bildung einer ortsspezifischen Rekombinase, die die ortsspezifische Rekombination eines ersten und eines zweiten Rekombinationsortes in Agrobacterium-Stämmen, sofern sie darin vorhanden sind, bewirken kann, befähigt sind, und die eine strukturelle DNA-Sequenz, die die besagte Rekombinase codiert, und eine DNA-Sequenz, die die Expression in Agrobacterium-Stämmen steuern kann, umfassen.
Die Erfindung umfasst auch Agrobacterium-Stämme, die des Weiteren einen ersten Rekombinationsort enthalten.
Die Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines ortsspezifischen Kointegrates zur Verfügung, umfassend die Schritte
- Einführung eines DNA-Moleküls in einen Agrobacterium- Stamm, der einen ersten Rekombinationsort enthält, wobei das DNA-Molekül einen zweiten, mit dem besagten ersten Rekombinationsort kompatiblen Rekombinationsort beherbergt, und
- Bewirken der Bildung der ortsspezifischen Rekombinase in dem besagten Agrobacterium-Stamm.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beherbergt der besagte Agrobacterium-Stamm vir-Funktionen, und das besagte DNA-Molekül, das einen zweiten Rekombinationsort beherbergt, umfasst DNA, die in einer Pflanzenzelle nicht natürlicherweise vorkommt und die an einem rechten T- DNA-Rand oder zwischen einen linken und einen rechten T- DAN-Rand positioniert ist, um den Kotransfer der besagten DNA mit dem besagten rechten T-DNA-Rand zu ermöglichen. Die Erfindung umfasst des Weiteren ortsspezifische Kointegrate und Agrobacterium-Stämme, die die besagten ortsspezifischen Kointegrate umfassen.
Die Erfindung umfasst des Weiteren ein Verfahren zum Erhalt einer Pflanzenzelle, die nicht natürlicherweise darin enthaltene DNA enthält, umfassend die Schritte:
- Inkontaktbringen von Pflanzenzellen mit einem Agrobacterium-Stamm, der ein ortsspezifisches Kointegrat beherbergt, das Virulenzfunktionen und in der Pflanzenzelle nicht natürlicherweise vorkommende, an einen rechten T-DNA-Rand positionierte oder zwischen einem rechten und einem linken T-DNA-Rand positionierte DNA umfasst, so dass der Kotransier der besagten DNA mit dem besagten T-DNA-Rand ermöglicht wird, und
- Selektionieren einer Pflanzenzelle, die die besagte, nicht natürlicherweise darin vorhandene DNA erhalten hat.
Die Erfindung stellt des Weiteren Pflanzenzellen und Pflanzen sowie Produkte und Extrakte unter Verwendung eines erfindungsgemässen Verfahrens zur Verfügung.
Die Erfindung umfasst des Weiteren Agrobacterium-Stämme, die zwei kompatible Rekombinationsort umfassen, die in der selben Orientierung und im selben Molekül sind, so dass bei der Bildung der Rekombinase in den besagten Agrobacterium- Stämmen die Rekombination bewirkt wird und die DNA zwischen den Rekombinationsorten aus dem besagten Vektor ausgeschnitten wird.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen letztere Agrobacterium-Stämme zwei kompatible Rekombinationsorte, die in entgegengesetzter Orientierung und auf dem selben Molekül sind, so dass bei der Bildung der Rekombinase in den besagten Agrobacterium-Stämmen die Rekombination bewirkt wird und die von den Rekombinationsorten flankierte DNA in dem besagten Molekül invertiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die besagte strukturelle DNA-Sequenz eine Cre-codierende Gensequenz oder eine funktionale Variante oder Portion davon und der besagte DNA-Rekombinationsort isst ein loxP-Ort oder eine funktionale Variante oder Portion davon.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt schematisch die Konstruktion von pRL756, das die strukturelle codierende Cre-Sequenz unter der Steuerung des Promotors aus dem lac-Operon von E. coli, ein Tetracyclinresistenzgen und ein Carbenicillinresistenzgen auf einem Plasmid beherbergt, das in Agrobacterium in Abwesenheit von Selektion unstabil ist.
Fig. 2 zeigt die relevanten Merkmale von pMOG621 und pMOG579.
Fig. 3 zeigt schematisch die Konstruktion von pAL1166, das die vir-Funktionen von pTiB6 beherbergt und in dem das T- Gebiet (einschliesslich der T-DNA-Ränder) über homologe Rekombiantion durch ein DNA-Fragment ausgetauscht wurde, das ein Spectinomycin-Resistenzgen und einen loxP-Rekombinationsort enthält. Dieses Plasmid ist zum Erhalt ortsspezifischer Kointegrate nützlich, die anschliessend für den Transfer von DNA auf Pflanzenzellen verwendet werden können. Da pAL1166 nicht mehr T-DNA-Ränder enthält, sollte ein zweites DNA-Molekül, das die in die Pflanzenzelle einzuführende DNA enthält, auch mindestens Einen operabel daran geknüpften rechten T-DNA-Rand bereitstellen.
Fig. 4 zeigt schematisch die Kointegration von pAL1166 und pRL754 über ortsspezifische Rekombination der loxP-Orte auf beiden Plasmiden (oberer rechter Teil); der untere Teil zeigt die auf die Anwesenheit von Gebieten von Homologie zwischen diesen beiden Plasmiden zurückzuführende potentielle Kointegration von pRL754 und pRL756 über homologe Rekombination. Das letztere Ereignis kann, sofern es überhaupt merkbar ist, verhindert werden, wenn das Cre-Plasmid und das Plasmid, das die einzuführende DNA enthält, keine oder so wenig wie mögliche Homologie gemeinsam haben.
Fig. 5 stellt ein verallgemeinertes Schema zum Erhalt von Kointegraten dar, die ein manipuliertes T-Gebiet für den Transfer auf Pflanzenzellen enthalten; die T-DNA umfasst ein interessierendes Gen und, sofern gewünscht, ein Markergen, das die Selektion oder die Reihenuntersuchung transformierter Pflanzenzellen ermöglicht. Chr = Agrobacterium- Chromosom; M1 Markergen 1 für die Selektion in Agrobacterium; pTi(δT-DNA) ein inaktiviertes (T-DNA deletiert) Ti- Plasmid, das vir-Funktionen beherbergt; M2 Nlarkergen 2 für die Selektion in Agrobacterium; M3 Markergen 3 für die Selektion in Agrobacterium; M1rM3 = (M2s) Phänotyp mit Resistenz gegen Marker 1 und 3 und mit Empfindlichkeit auf Marker 2;
LB = linker Rand; RB = rechter Rand; incP = Plasmid der Inkompatibilitätsgruppe P.
Fig. 6 ist ein Diagramm von pMOG23, das ein chimäres Kanamycin-Resistenzgen zur Selektion in Pflanzen beherbergt, das das Promotorgebiet aus dem Nopalinsynthase- (nos-)gen von Agrobacterium tumefaciens, das zur SteuYung der Genexpression in Pflanzenzellen befähigt ist, eine strukturelle codierende Sequenz, die die Neomycin-Posphotranferase codiert, und das Terminatorgebiet des nos-Gens umfasst.
Fig. 7 zeigt schematisch die Konstruktion von pAL1766, eines ortsspezifischen Kointegrates, das das chimäre, in Pflanzen exprimierbare und an beiden Seiten con T-DNA-Rändern flankierte Kanamycin-Resistenzgen und die Virulenzfunktionen von pAL1166 beherbergt. Dieses Plasmid wurde verwendet, um das Kanamycinresistenzgen auf Tabakzellen zu transferieren und transformierte Tabakpflanzen zu regenerieren.
Fig. 8 zeigt eine - nicht erschöpfende - Übersicht der verschiedenen Möglichkeiten, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden. Die Spalten A, B und C stellen Agrobacterium-Stämme dar, die den Cre&spplus;-Ehänotyp aufweisen, z. B. als Folge der Anwesenheit des Cre-Rekombinasegens auf einem incP-Plasmid (nicht gezeichnet) oder auf einem stabilen DNA-Molekül in Agrobacterium, mit der Massgabe, dass die Expression durch einen Repressor, einen Induzierer oder beides reguliert werden kann; römische Zahlen bedeuten Verfahrensschritte; Spalte B stellt Agrobacterium-Stämme dar, die durch einen der Verfahrensachritte I-VI erhalten wurden. Schritt VII zeigt drei Alternativen (a)-(c) zur Änderung des Cre&spplus;-Phänotyps in einen Cre&supmin;-Phänotypen (Fehlen der Rekombinase); (a) zeigt das Hinzufügen eines Repressors, um die andernfalls konstitutive Expression des Rekombinasegens zu unterdrücken; (b) zeigt die Entfernung eines Induziereres einer ansonsten unterdrückten Expression des Rekombinasegens; und (c) zeigt die Entfernung des Rekombinasegens durch Entfernung eines Plasmides, das in den besagten Agrobacterium-Stämmen unstabil ist.
Fig. 9 ist eine Autoradiographie eines Southern Blots, das mit den Kointegrationsversuchen erhaltenen Ergebnisse zeigt; für eine genauere Erklärung siehe Beispiel III-B.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Schritte, die zu den Befunden der vorliegenden Erfindung führten, sowie eine Reihe verschiedener Arten der Ausübung der Erfindung sind unten in mehr Einzelheiten ausgearbeitet.
Um zu klären, ob es möglich war, Agrobacterium-Stämme zu erhalten, die zur ortsspezifischen Rekombination befähigt sind, wurden die ortsspezifische Cre-Rekombinase und der loxP-Rekombinationsort in Agrobacterium tumefaciens getestet.
Ein DNA-Fragment, das die strukturelle codierende Sequenz des Cre-Gens codiert, wurde kloniert und unter die Steuerung des Promotors aus dem lac-Operon aus E. coli gestellt. Dieser Promotor ist in E. coli induzierbar, aber in Agrobacterium in Abwesenheit des Repressors bekanntermassen konstitutiv. Dieses Cre-Genkonstrukt wurde in ein incP- Plasmid, pNJ5000, kloniert, was pRL756 ergab, das in Agrobacterium tumefaciens Stamm MOG101 in Abwesenheit von Tetracyclin oder Carbenicillin unstabil erschien.
Als erstes Substratmolekül für die Cre-vermittelte ortsspezifische Rekombination wurde aus pTißG ein deaktiviertes (ohne T-Gebiet) Helferplasmid konstruiert. Dies wurde im Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA1010 durchgeführt, indem das T-Gebiet aus pTiB6 ersetzt wurde durch ein DNA-Fragment, enthaltend einen loxP-Ort und ein Spectinomycin-Markergen, über homologe Rekombination (doppeltes Crossing Over) und unter Verwendung von Homologiegebieten ausserhalb der T-DNA-Ränder auf pTiB6. Dieses Plasmid, abgeleitet von pTiB6, das nun die vir-Funktionen für den T-DNA-Transfer auf Pflanzenzellen, einen loxP-Ort, den Spectinomycinmarker und keine T-DNA-Ränder enthielt, wurde pAL1166 genannt. Um festzustellen, ob Cre-vermittelte ortsspezifische Rekombination zwischen dem loxP-Ort von pAL1166 und einem loxP-Ort eines zweiten DNA-Moleküls in Agrobacterium tumefaciens tatsächlich stattfinden kann, wurde ein zweites DNA-Molekül, pRL754, das einen loxP-Ort und ein unter der Steuerung eines Promotors stehendes Kanamycin--Resistenzgen auf einem von PIC20H abgeleiteten Plasmid liegend beherbergt, in den Agrobacterium-Stamm, der sowohl pRLY56 als auch pAL1166 beherbergte, eingeführt, und die Bildung des Kointegrates wurde durch Selektionieren nach Kanamycinresistenz überprüft. In Abwesenheit des Cre-Plasmides pRL756, das in Abwesenheit der Selektion nach Carbenicillin und Tetracyclin entfernt wurde, erschien das Kointegrat stabil.
Aus diesen Versuchen wurde geschlossen, dass Cre-vermittelte ortsspezifische Rekombination zwischen einem, ersten und zweiten loxP-Ort ein sehr effizienter Prozess in Agrobacterium tumefaciens ist, und dass die Kointegrate stabil bleiben, was neue Perspektiven für die Einführung von DNA in Agrobacterium eröffnet, welche DNA in diesem nicht natürlicherweise vorkommt.
Um herauszufinden, ob über Cre-vermittelte ortsspezifische Rekombination erhaltene Kointegrate auch zur Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, wurde der obige Versuch in einer leicht abgeänderten Weise wiederholt. In das Plasmid pRL754, von dem im obigen Versuch gezeigt wurde, dass es in pAL1166 kointegriert wurde, wurde ein DNA-Fragment, das einen linken T-DNA-Rand, ein pflanzenexprimierbares Kanamycin-Resistengen unter der Steuerung des Promotors des Nopalinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens und einen rechten T-DNA-Rand enthielt, eingeführt. Dieses Plasmid wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm, der das Cre- Plasmid pRL756 und das Plasmid pAL1166 beherbergte, eingeführt, und Stämme, die Cre-vermittelte ortsspezifische Kointegrate beherbergten, wurden wie oben selektioniert. Um festzustellen, ob Agrobacterium-Stämme, die diese ortsspezifischen Kointegrate beherbergen, fähig sind, das pflanzenexprimierbare, zwischen den T-DNA-Rändern liegende Kanamycin-Resistengen auf Pflanzenzellen zu übertragen, wurden die Km-resistenten Agrobacterium-Stämme verwendet, um Tabakpflanzen zu transformieren. Es wurde gefunden, dass Agrobacterium-Stämme, die diese ortsspezifische Kointegrate beherbergen, zum effizienten Transfer von T-DNA auf Pflanzenzellen gleich fähig waren wie vergleichbare Stämme, die da s selbe manipulierte T-Gebiet auf binärer Vektoren beherbergten.
Transformierte Tabakpflanzen werden nun zur Reife herangezogen und die Samenbildung wurde zugelassen. Es wird vorhergesagt, dass die Stabilität des Kanamycin-Resistenzphänotypen nicht von herkömmlich transformierten Pflanzen verschieden ist und dass dieser Wesenszug auf die Nachkommenschaft übertragen wird.
Es wird aus den obigen Versuchen ersichtlich sein, dass die ortsspezifische Rekombination Agrobacterium zu einem vielseitigeren System macht, sowohl wenn es als Pflanzentransformierungssystem als auch wenn es als Wirt zur Expression fremder DNA per se eingesetzt wird.
In Agrobacterium einzuführende DNA, z. B. modifizierte T-Gebiete zur Pflanzentransformation, die auf Pflanzenzellen zu übertragende Genkassetten, oder Gene, die zur Expression in Agrobacterium selber vorgesehen sind, beherbergen, können geeigneterweise in kleine und hochentwickelte Klonierungsvektoren für jeden geeigneten Wirt kloniert werden, wobei von den besagten Vektoren nur gefordert wird, dass sie einen Rekombinationsort, der leicht in den besagten Vektor als kleines DNA-Fragment eingefügt werden kann, umfassen sollen.
Da dieses ortsspezifische Rekombinationssystem von herkömmlicher homologer Rekombination völlig unabhängig ist, sind zur Rekombination nicht grosse Gebiete der Homologie erforderlich, und man kann sogar in einem Agrobacterium-Stamm arbeiten, der nicht homolog rekombiniert (rec), wodurch die Häufigkeit ungewollter Umlagerungen, die durch zufällige Gebiete der Homologie bewirkt sein können, weiter verringert wird.
Wie in Fig. 8 als Diagramm gezeigt ist, soll die erfindungsgemässe ortsspezifische Rekombination sowohl die Kointegration als auch die Excision und die Inversion umfassen. Die Kointegration, bei der mindestens zwei DNA-Moleküle rekombinieren, um mindestens ein grösseres DNA-Molekül zu bilden, ist in den Schritten I, II und III caiedergegeben. Schritt I zeigt die Möglichkeit, in Agrobacterium gleichzeitig mindestens zwei zur ortsspezifischen Rekombination befähigte Moleküle einzuführen. In dieser besonderen Situation sollte mindestens eines der beiden DNA-Moleküle einen Replikationsursprung enthalten, der in Agrobacterium funktional ist, wenn gewünscht werden sollte, dass das Kointegrat darin stabil gehalten wird; die Schritte II und III zeigen die Bildung eines Kointegrates, bei dem mindestens ein DNA-Molekül resident ist und ein anderes DNA-Molekül neu eingeführt wird, wobei in Schritt II das residente DNA- Molekül ein Chromosom von Agrobacterium ist und in Schritt III das residente Molekül ein Plasmid ist. Offensichtlich - dies ist nicht angegeben - wäre es möglich, DNA-Moleküle in Cre&supmin;-Agrobacterium-Stämme einzuführen, und die Cre-Rekombinase beispielsweise durch gleichzeitiges oder an die Einführung der besagten DNA-Moleküle anschliessendes Einführen eines Plasmides, das das Gen enthält, bereitzustellen. Schritt. VLI ist ein bevorzugter Schritt zur Stabilisierung eines gebildeten ortsspezifischen Kointegrates, das nach Schritten wie etwa I-III erhalten wurde; (a) bezieht sich auf die Zugabe eines Repressors für das Cre-Gen zu Agrobacterium, und als Alternativen, kann zusätzlich (b) der Induzierer des normalerweise unterdrückten Gens entfernt werden oder (c) das Gen, das die Cre-Rekombinase codiert, kann in seiner Gesamtheit entfernt werden, indem zugelassen wird, dass ein unstabiles Plasmid aus den Agrobacteriüm-Stämmen verloren geht.
Die Schritte IV-VI zeigen die Möglichkeit, DNA-Fragmente zwischen den beiden Rekombinationsorten auszuschneiden oder zu invertieren.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemässen Agrobacterium-Stämme als Transfersystem für DNA auf Pflanzenzellen verwendet.
Bevorzugte auf Pflanzenzellen zu übertragende DNA sind proteincodierende Gene und eine die Expression steuernde DNA- Sequenz dergestalt, dass bei der Expression des Gens das Protein in einer Pflanze oder Pflanzenzelle im gewünschten Stadium und am gewünschten Ort in der Pflanze gebildet wird. Das interessierende Gen kann auch Gene umfassen, die in Form einer RNA-Sequenz exprimiert werden, die kein Protein codiert, wie etwa Antisinn-Gene, Ribozym-Gene und Ähnliches. Das interessierende Gen muss nicht notwendigerweise transkribierbar sein; es kann auch eine Erkennungssequenz sein, die von Proteinen, z. B. einer Rekombinase, einer Nuclease oder Ähnlichem erkannt werden kann, oder vom Menschen, so dass sie als genetische Erkennungsmarke dient. Spezifischere Beispiele für die Verwendung eines interessierenden Gens schliessen diejenigen, die mit der Pilzresistenz (EP-A-0 392 225, internationale Patentanmeldung WO- A-90/07001; EP-A-0 440 304), der Insektenresistenz (EP-A-0 193 259), der Nematodenresistenz (EP-A-0 352 052), der Virusresistenz (EP-A-0 223 452), der geänderten Kohlenhydratzusammensetzung (WO-A-90/12876; EP-A-0 438 904), der geänderten Ölzusammensetzung (EP-A-0 225 377), den Samen-Speicherproteinen mit geänderter Aminosäurezusammensetzung (EP- A), der männlichen Sterilität (EP-A-0 329 308), der geänderten Blütenfarbe (EP-A-0 335 451), der verzögerten Fruchtreifung (WO-A-91/01375), der Salzresistenz (WO-A- 91/06651), der Herbizidresistenz (EP-A-0 218 571; EP-A-0 369 637), der Bildung von pharmazeutischen Produkten (EP-A- 0 436 003) und Ähnlichem zu tun haben, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Geeignete DNA-Sequenzen zur Steuerung der Expression von interessierenden Genen oder Markergene wie etwa Promotoren, Verstärker, nichttranskribierte Leader und Ähnliches können von jedem Gen, das in einer Pflanzenzelle exprimiert wird, abgeleitet werden, einschliesslich von Pflanzengenen (EP-A- 0 122 791), von Genen, die auf einer Wildtyp-T-DNA von Agrobacterium liegen (EP-A-0 126 546), von Pflanzenvirengenen (EP-B-0 131 623), und einschliesslich funktionaler Portionen, Hybride oder synthetischer Kopien davon.
Um nach transformierten Zellen zu selektionieren oder sie in Reihe zu untersuchen ist es bevorzugt, Markergene einzuschliessen, die im T-Gebiet an das interessierende Gen, das auf die Pflanzenzelle transferiert werden soll, geknüpft sind. Die Wahl eines geeigneten Markergens in der Pflanzentransformation gehört zu den Fähigkeiten des durchschnittlichen Fachmanns; einige Beispiele von üblicherweise verwendeten Markergenen sind die Neomycin-Phosphotransferasegene, die Resistenz gegen Kanamycin verleihen (EP-B-0 131 623), das Glutathion-S-Transferasegen aus Rattenleber, das Resistenz gegen von Glutathion abgeleiteten Herbiziden verleiht (EP-A-0 256 223), die Glutaminsynthetase, die bei Überexpression Resistenz gegen Glutaminsynthetaseinhibitoren wie etwa Phosphinotricin verleiht (WO-A-87/05327), das Acetyltransferasegen aus Streptomyces viridochromogenes, das Resistenz gegen das selektive Agens Phosphinotricin verleiht (EP-A-0 275 957), das Gen, das eine 5-Enolshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) codiert, wodurch Toleranz gegen N-Phosphonomethylglycin verliehen wird, das bar-Gen, das Resistenz gegen Bialaphos verleiht (z. B. WO-A-91/02071) und Ähnliches. Die tatsächliche Wahl des Markers ist nicht kritisch, solange es in Kombination mit den gewählten Pflanzenzellen funktional (d. h. selektiv) ist.
Das Markergen und das interessierende Gen müssen nicht verknüpft sein, da die Kotransformation von nicht verknüpften Genen (U. S. Patent 4 399 216) in der Pflanzentransformation ebenfalls ein effizienter Prozess ist.
Transformierte Zellen, die erfindungsgemäss erhalten und selektioniert wurden, können als solche, bespielsweise zur Herstellung einer pharmazeutischen Verbindung in Zellsuspensionskulturen, oder zur Bildung Einer ganzen neuen Pflanze verwendet werden.
Die Wahl des Pflanzenmaterials zum Erhalt von transformierten Zellen und/oder Bildung von ganzen neuen transformierten Pflanzen ist nicht kritisch für die Erfindung, solange es dem T-DNA-Transfer durch Agrobacterium-Stämme zugänglich ist.
Besonders bevorzugtes Pflanzenmaterial, insbesondere für dikotyledone Sorten, sind Blattscheiben, die leicht transformiert werden können und die gute Regenerationsfähigkeit zeigen (Horsch R. B. et al., (1985) Science 227, 1229-1231. Monokotyledone Pflanzen sind dem DNA-Transfer durch Agrobacterium-Stämme zugänglich (EP-B-0 159 418), einschliesslich kommerziell wichtige Sorten wie Mais (Gould J, Michael D, Hasegawa 0, Ulian EC, Peterson G, Smith RH, (1991) Plant. Physiol. 95, 426-434).
Neuere Berichte legen nahe, dass der durch Agrobacterium vermittelte DNA-Transfer mit Geweben kombiniert werden kann, die mittels Mikroprojektil-Beschuss verletzt wurden (Bidney D, Scelonge C, Martich J, Burrus M, Sims L, Huffamn G, (1992), Plant Mol. Biol. 18, 301-313).
Es sollte klar sein, dass die erfindungsgemässen Agrobacterium-Stämme gleich wie 'herkömmliche' Agrobacterium-Stämme unter Verwendung der gleichen Techniken, wie sie bei herkömmlichen Agrobacterium-Stämmen verwendet werden, für die Pflanzentransformation verwendet werden können. Es ist daher klar, dass alternative, hier nicht ausdrücklich erwähnte Wege der Verwendung von Agrobacterium für die Pflanzentransformation nicht ausserhalb des Schutzbereichs der Erfindung liegen.
Die unten angegebenen Beispiele werden nur zum Zwecke der ausreichenden Offenbarung angegeben und sind nicht dazu gedacht, den Schutzbereich der Erfindung in irgend einer Weise zu beschränken.

Experimenteller Teil

Bakterielle Stämme, Plasmide und Bakteriophage

E. coli MH1 (Goddard JM, Caput D, Williams SR, Martin Jr DW (1983) Proc. Natl. Sci. USA 80 : 4281-4285) und JM101 (Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J (1985) Gene 33: 103-119) wurden für die Klonierung verwendet. Die Agrobacterium tumefaciens-Stämme waren: LBA1010 (C58, pTiB6, Rif) (Koekman et al., (1982) Plasmid 7, 119-132), MOG1010 (abgeleitet von LBA1010 durch Substitution der T-DNA durch einen Spectinomycinmarker) und UIA143 (C58 recA-Mutante, pTi-geheilt, Ery) (Farrand SK, O'Morchoe SP, McCutchan J (1989) J. Bacteriol. 271: 5319-5321). Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide waren: pUCl9 (Yanisch-Perron et al., 1985, oben), pIC20H (Nlarsh JL, Erfle M, Wykes EJ (1984) Gene 32: 481-485; Fig. 3), pHP45ΩKm (pBR322-Derivat, enthaltend ein Kanamycingen) (Fellay R, Frey J, Krisch H (1987) Gene 52: 147- 154), pMOG621 (pBR322-Derivat, enthaltend zwei pTiB6 T-DNAflankierende Fragmente), pMOG579 (pNfOG621 mit einer Spectinomycinkassette, die die zwei pTiB6-Fragmente trennt; Fig. 2), pNJ5000 (instabiles RP4-Derivat, Tc; Fig. 1) (Grinter NJ (1983) Gene 21: 133-143), pBINl9 (binärer incP-Vektor, Km) (Bevan, 1984, oben) und pRK2013 (Ditta G, Stanfield S. Corbin D, Helinski D (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 7347-7351). Der verwendete P1-Phage war Plclr100Cm.

Kulturbedingungen

E. coli-Zellen wurden in LC-Medium bei 37ºC gezüchtet (Hooykaas PJJ, Klapwijk PM, Nuti MP, Schilperoort RA, Rorsch A (1977) J. Gen. Microbiol. 98 : 477-484) (P1-Eindämmungszellen).
Antibiotika wurden in den folgenden Konzentrationen zugegeben: Carbenicillin, 100 ug/ml; Kanamycin 25 ug/ml; Spectinomycin, 50 ug/ml; Tetracyclin, 5 ug/ml, Chloramphenicol, 50 ug/ml. Agrobacterium-Stämme wurden in LC-Medium bei 29ºC gezüchtet (Hooykaas et al., 1977, oben). Die verwendeten Antibiotikakonzentrationen waren: Carbenicillin, 75 ug/ml; Kanamycin, 100 ug/ml; Spectinomycin, 250 ug/ml; Tetracyclin, 2 ug/ml; Rifampicin, 20 ug/ml; E rythromycin, 100 ug/ml.

DNA-Verfahren

Die DNA-Isolierung aus E. coli, die Restriktion, Ligasierung, Transformierung, Nick-Translation der Sonden und das Southern Blotting auf Nitrocellulosefilter wurden nach üblichen Verfahren durchgeführt (Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe. Cold. Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Plasmid-DNA wurde mittels einer Modifikation des alkalischen Lyseverfahrens von Birnboim und Doly (Birnboim HC, Doly J (1979) Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523) aus Agrobacterium isoliert, wobei ein zusätzlicher Deanturierungsschritt unter Zugabe einer NaOH-Phenol-Lösung (2x 0,2 N NaOH, 1x TRIS-c; esättigtes Phenol) zu dem alkalische Lysat (1/10 des Volumens) hinzugefügt wurde. Die Hybridisierung wurde bei 42ºC in 50% Formamid und 5x gesättigter Kochsalzlösung durchgeführt und die hybridisierten Filter wurden bei 42ºC in 2x gesättigter Kochsalzlösung mit 0,1% Natriumdodecylsulfat gewaschen.

Plasmidtransfer auf Agrobacterium-Stämme

Die Plasmide wurden wie üblich in die Agrobacterium-Stämme mittels Elektroporation eingeführt, wie beschrieben (Mozo T, Hooykaas PJJ (1991) Plant Mol. Biol. 16: 917-918). Falls ein doppeltes Crossing Over beabsichtigt war wurden Dreielternverschmelzungen gemäss Ditta et al. (oben) verwendet.

PCR-Amplifizierung des Cre-Gens

Die PCR wurde in einem Biozym-PREM-Prozessor durchgeführt. Die DNA, die aus 0,5 ml einer über Nacht angesetzten P1- Kultur, die E. coli-Zellen enthielt, isoliert wurden, wurde mit EcoRI abgebaut (das Cre-Gen hat keine EcoRI-Orte (Sternberg N, Sauer B, Hoess R, Abremski K (1986) J. Mol. Biol. 187 : 197-212) und für die PCR.in einem schlussendlichen Volumen von 100 hcl eingesetzt. Die Reaktionsmischung enthielt: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8, 8), 1,5 mM MgCl&sub2;, 100 ug/ml BSA, 50 uM jedes Nukleotides (Pharmacia), 0,45 mM jedes Primers und 5 U Tag-Polymerase (Promega). Die Reaktionen wurden mit 75 ul Paraffinöl überschichtet. Die Mischung wurde während 2 min auf 93ºC erhitzt, um die DNA zu denaturieren, während 1 min auf 55ºC gekühlt, um die Primer zu befestigen, und erneut während 1 min auf 72ºC erhitzt, um die Amplifizierung zu starten. Die eigentliche Amplifizierung fand während 20 Zyklen von 93ºC - 1 min. 55ºC - 1 min. 72ºC - 1 min statt, gefolgt von einem schlussendlichen Verlängerungsschritt von 5 min bei 72ºC. Schliesslich wurde die Mischung zwei mal mit Chloroform extrahiert, um das Öl zu entfernen. Die Primer waren so entworfen, dass ein schlussendliches 5'-Sphl -3' EcoRI-·Cre-Gen ohne nativen Promotor erhalten wurde (Sternberg et al., oben). Die Sequenz des stromaufwärts liegenden Primers war 5'- GGGCATGCGGAGTGTTAAATGTCC-3' (SEQ ID NO: 1), und der stromabwärts liegende Primer war 5'-GGGAATTCATGGCTAATCGCCATC- 3'(SEQ ID NO: 2) (die Start- und Stopcodons sind unterstrichen).

LoxP-Sequenz.

Eine synthetische BamHI-EcoRI-loxP-Sequenz von 41 Basenpaaren wurde aus den Oligonucleotiden: P1, 5'- GGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATG-3' (SEQ ID NO: 3), und P2, 5'-GAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATG-3' (SEQ ID NO: 4) konstruiert.

Beispiel 1

Erhalt des Agrobacterium-Stamms MOG101

Es wurde ein von dem Octopin-Ti-Plasmid pTiB6 abgeleitetes Helferplasmid, das die Agrobacteriurn tumefaciens-Virulenzfunktionen verleiht, wurde konstruiert, MOG101. MOG101 ist ein Agrobacterium tumefaciens-Starnm, der ein nicht onkogenes Plasmid trägt, in dem das gesamte T-Gebiet durch einen bakteriellen Spectinomycin-Resistenzmarker aus dem Transposon Tn 1831 (Hooykaas et al., 1980 Plasmid 4, 64-75) ersetzt war.
Das Ti-Plasmid pTiB6 enthält zwei aneinanderliegende T-Gebiete, TL (T-links) und TR (T-rechts). Um ein Derivat zu erhalten, dem die TL- und TR-Gebiete fehlen, konstruierten wir einen Zwischenvektor pMOG579. Das Plasmid pMOG621 ist ein pBR322-Derivat, das die zwei Ti.-Plasmide enthält, die links und rechts ausserhalb der T-Gebiete angeordnet sind (Fig. 2) - In pMOG579 waren die zwei Fragmente (in dunkel gezeigt) durch ein BamHI-HindIII-Fragment von 2,5 kb aus dem Transposon Tn1831 (Hooykaas et al., 1980 Plasmid 4, 64- 75) getrennt, das den Spectinomycinmarker trägt (Fig. 2). Das Plasmid wurde in den Agrobacterium tumeaciens-Stamm LBA1010 [C58-C9 (pTiB6) = ein geheilt er C58-Stamm, in den von E. coli pTiB6 eingeführt war (Koekman et al. (1982), Plasmid 7, 119-132), wobei Dreielternverschmelzung unter Verwendung von HB101 8pRK2013 eingesetzt wurde] als Helfer eingeführt. Die Transkonjuganten wurden nach Resistenz gegen Rifampicin (20 mg/ml) und Spectinomycin (250 mg/l) selektioniert. Eine doppelte Rekombination zwischen pMOG579 und pTiB6 ergab den Verlust der Carbenicillinresistenz (der pBR322-Marker) und die Deletion des gesamten T-Gebiets. Von 5000 spectinomycinresistenten Transkonjuganten, die auf Carbenicillin (100 mg/l) replika-plattiert wurden, wurden 2 empfindliche festgestellt. Southern-Analyse ergab, dass ein doppeltes Crossing Over das gesamte T-Gebiet (nicht gezeigt) deletiert hatte. Der erhaltene Stamm wurde MOG101 genannt. Dieser Stamm und seine Konstruktion ist analog zu Stamm GV2260 (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13, 4777-4788)

Beispiel II

Konstruktion von pRL756, der das Cre-Gen auf einem in Agrobacterium unstabilen Plasmid trägt

Das PCR-Fragment, das das Cre-Gen enthält, wurde mit Sphl und EcoRI abgebaut und in den Polylinker-Ort des Plasmides pUC19 (Fig. 1) kloniert. Das erhaltene Konstrukt enthält das Cre-Gen unter der Steuerung des lac-Promotors. Das erhaltene pUC19-Cre-Plasmid wurde anschliessend in den einzigen EcoRI-Ort des incP-Plasmides pNJ5000 kloniert. Der Cb- Marker des pUC19-Plasmides, der positive Selektion nach den rekombinanten Klonen erlaubt, machte einen unter Berücksichtigung der Grösse (44 kb) und der niedrigen Kopienzahl des Plasmides pNJ5000 sonst sehr schwierigen Klonierungsschritt leicht. Die Stabilität des schlussendlichen Cre-Konstruktes (pRL756) wurde in dem Agrobacterium-Stamm MOG1010 geprüft. In diesen Versuchen verloren zwischen 50% und 70% der Population das Plasmid nach 24 Stunden Wachstum in flüssigem Medium in Abwesenheit von sowohl Carbenicillin als auch Tetracyclin, während pRL756 in den Agrobacterium- Zellen stabil gehalten wurde, wenn dem Kulturmedium beide Antibiotika zugegeben wurden (Daten nicht gezeigt).

Beispiel III

Konstruktion eines deaktivierten pTi--loxP-Helfers

Eine EcoRI-loxP-Spc-Kassette wurde in zwei Schritten in dem Plasmid pIC20H konstruiert (Einzelheiten des Klonierungsverfahrens sind in Fig. 3 gezeigt). Diese Kassette wurde anschliessend in den EcoRI-Ort des Plasmides pMOG621 kloniert. Dieses Plasmid enthält zwei Fragmente aus pTiB6, die die T-DNA ausserhalb der rechten und linken Ränder im ursprünglichen pTiB6 flankieren und die daher als Zwischenprodukte zur T-DNA-Eliminierung oder -Substitution unter Einsatz der doppelten homologen Rekombination an diesen beiden pTi-Fragmenten verwendet werden können. Das erhaltene Plasmid pMOG622 wurde mittels Dreielternverschmelzung in den Agrobacterium-Stamm LBA1010 eingeführt und doppelte Rekombinanten, bei denen die T-DNA durch die loxP-Spc-Kassette ausgetauscht war, wurden nach Resistenz gegen Spectinomycin und Empfindlichkeit gegen Carbenicillin selektioniert (dies zeigt den Verlust des pBR322-Vektorteils von pMOG622 an). Die Anwesenheit der loxP-Spc-Kassette in dem erhaltenen deaktivierten Helfer pLBA1010 (8T-DNA): loxP-Spc wurde mittels Southern Blot geprüft (Fig. 9). Dieses Plasmid wurde pAL1166 genannt (siehe Fig. 3).

Beispiel III-A

Versuche zur Cre-vermittelten Kointegration

Um zu bestimmen, ob die beiden oben beschriebenen Plasmide tatsächlich die loxP-ortsspezifische Rekombination vermitteln können, wurde ein drittes Plasmid konstruiert, indem ein Kanamycinresistenzgen in den EcoRI-Ort des Plasmides pRL753 kloniert wurde (Fig. 3). Das erhaltene Plasmid pRL754 wurde verwendet, um die Bildung des Kointegrates nach Elektroporation der Agrobacterium-Stämme, die das loxP-System enthielten, zu prüfen, wobei nach kanamycinresistenten Kolonien selektioniert wurde, was anzeigte, dass die ortsspezifische Rekombination stattgefunden hatte. Die Ergebnisse sind in Beispiel III-B genauer diskutiert.

Beispiel III-B

Vergleichsversuche und Anzeichen für die ortsspezifische Cre-vermittelte Kointegration

Es wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um Hinweise zu finden, dass die Cre-loxP-vermittelte ortsspezifische Rekombination zur Bildung von Kointegraten führte.
Neben dem Stamm, der sowohl den inaktivierten pTi-loxP-Helfer pAL1166 und das Cre-Plasmid pRL756 enthielt, wurden Stämme, die nur pAL1166 oder einen normalen pTi-Helfer plus pRL756 enthielten, als Vergleich verwendet. Zusätzlich wurde ein Stamm, bei dem pRL757 in MOG101 mittels einfacher Rekombination beim Spc-Markergen integriert worden war, in die Versuche miteinbezogen, um die Effizienz der loxP-Crevermittelten und der normalen homologen Rekombinationsprozesse zu vergleichen. In einem parallelen Versuch und um festzustellen, ob alle verwendeten Agrobacterium-Stämme gleichermassen zur Aufnahme von DNA befähigt waren, wurden die selben Stämme auch mit dem Kmr-Plasmid pBIN19 elektroporiert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1A gezeigt. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, waren die verwendeten Stämme hinsichtlich der Fähigkeit der DNA-Aufnahme aus dem Kontrollplasmid pBIN19 nicht wesentlich verschieden. Wurde jedoch pRL754 in die Stämme elektroporiert, die keines der loxP-Elemente oder nur den loxP-Ort als homologe Rekombination zwischen den gemeinsamen pIC20H-loxP- Sequenzen enthielten, was ersichtlich wurde, wenn pRL754 den Stamm eingeführt wurde, der pRL756 in das pTi-Plasmid integriert enthielt, wurde kein oder nur gerade ein einziger Kmr-Transformant erhalten. Eine ähnliche Häufigkeit der homologen Rekombination wurde für den Stamm, der pRL756 und keinen loxP-Ort enthielt, beobachtet. In diesem Fall haben das eintretende Plasmid und das vorhandene pRL756 die Replikations- und Cb-Gebiete aus pUC gemeinsam (Fig. 4). Die Homologie zwischen diesen beiden Plasmiden stellte ein gewichtiges Problem in der Bestimmung der loxP-Cre-ortsspezifischen Rekombination in dem Stamm, der sowohl den pAL1166-Helfer wie auch pRL756 enthielt, dar. Obwohl eine leicht höhere Transformationshäufigkeit über Elektroporation von pRL754 in diesen Stamm erhalten wurde, war diese Zunahme nicht gross genug, um sie dem Hinzukommen von Ereignissen der loxP-Cre spezifischen Rekombination zu der bereits bekanntermassen höchst effizienten pUC-Cb-vermittelten homologen Rekombination zuzuschreiben, wobei berücksichtigt wurde, dass dieser Stamm auch mehr Kmr-Transformanten ergab, wenn er mit pBINl9 elektroporiert wurde. Es wurde eine indirekte Vorgehensweise gewählt, um festzustellen, ob tatsächlich loxP-Cre ortsspezifische Rekombination stattgefunden hatte. Die durch Elektroporation von pRL754 in die Stämme, die pRL756 und entweder den normalen Helfer pMOG101 oder den pTi-loxP-Helfer pAL1166 enthielten, erhaltenen Kmr-Transformanten wurde separat gesammelt, über Nacht in flüssigen Kulturen mit und ohne Kanamycin gezüchtet und auf Medien ohne Antibiotika, mit Kanamycin und mit Tetracyclin plattiert, um die Stabilität der Marker zu bestimmen (Tabelle 2). Diese Versuche zeigten, dass im Falle der Zellen, die keinen loxP-Ort enthielten, bei Züchtung in antibiotikafreiem Medium kM und Tc im gleichen Ausmass verloren wurde (12%), was anzeicrte, dass im unstabilen Plasmid Km an TC geknüpft ist. Im Gegensatz dazu wurde im Falle der Transformanten, die mit dem den pAL1166-Helfer enthaltenden Stamm erhalten wurden, Tc bei 91% der Zellen verloren, während das Ausmass des Verlusts bei Km nur 38% betrug. In Übereinstimmung damit behielten im Falle, wo die zweite Gruppe von Transformanten auf Km gezüchtet wurde, nur 13,5% der Zellen den Te-Marker. Diese Ergebnisse, die zeigen, dass in den durch Elektroporation von pRL753 erhaltenen Transformanten keine Verknüpfung zwischen den Km- und Tc-Markern besteht, beweisen, dass das eintretende Plasmid nicht mit pRL756 kointegriert wird und legen nahe, dass die Km-Resistenz auf die Integration von pRL754 in pAL1166 über loxP-Cre-vermittelte Transformation zurückzuführen ist. Die Kointegration zwischen dem eintretenden Plasmid und pRL756 konnte ebenfalls eingetreten sein, aber da dies zu verschiedenen loxP-haltigen Plasmiden in der selbe Zelle führen würde, wäre die Situation nicht stabil, ausser wenn das Cre-Plasmid pRL756 oder ein vermutetes Kointegrationsplasmid pRL756::pRL754 verloren gegangen wäre. Diese Instabilität wird auch durch das höhere Ausmass an Kmr-Verlust aus dieser Gruppe von Transformanten (38% gegenüber 12% in den loxP-freien Transformanten), wenn diese in antibiotikafreiem Medium gezüchtet werden, nahegelegt. Um die loxP-Cre ortsspezifische Rekombination in unserem System endgültiger zu bestimmen wurden die oben beschriebenen Elektroporationsversuche in einem RecM-Hintergrund wiederholt (Tabelle 1B), wobei keine Ereignisse homologer Rekombination vorkommen sollten. Wie erwartet war die Transformationshäufigkeit im Falle des Stammes, der pRL757 in das pTi integriert enthielt, auf dasjenige Ausmass reduziert, das erhalten wurde, wenn keine homologen Sequenzen beteiligt waren oder nur der kleine loxP-Ort beteiligt war (dieses Ausmass kann mit der Häufigkeit spontaner Mutationen in Verbindung gebracht werden). Trotz des RecA waren die Transformationshäufigkeiten in den beiden Stämmen, die pRL756 enthielten, wiederum ähnlich, unabhängig von der Anwesenheit des loxP-Ortes. Dieses unerwartete Ergebnis zeigt, dass das Cre-Protein die Rekombination an Orten vermitteln kann, die von der loxP-Sequenz verschieden sind. In einem Versuch, zwischen diesen beiden Typen von Cre-vermittelten Rekombination zu unterscheiden, wurden die Kmr- Transformanten, die mit sowohl den loxP-haltigen als auch den loxP-freien Stämmen erhalten wurden, direkt, ohne weitere Züchtung, auf die Anwesenheit der Km- und Tc-Resistenzmarker untersucht. Während alle MOG101(pRL756)-Transformanten Kmr Tcr waren, waren 50% der pAL1166-Transformanten Km = Tc9, was anzeigte, dass pRL7.56 kurz nach der loxP- Cre-vermittelten Kointegration von pRL754 in pAL1166 verloren gegangen war. Die restlichen 50% Km = Tcr-Transformanten würden, wie diskutiert, aufgrund der Stabilitätsprobleme, die die Koexistenz verschiedener loxP-haltiger Plasmide in der selben Zelle in Gegenwart des Cre-Proteins verursachen könnte, vermutlich nur pRL754::pRL756-Kointegrate enthalten. Die Rekombinationsereignisse wurden mittels Southern Blot-Analyse von vier Vertretern jeder Art von Transformanten (Tcr und Tc5) überprüft (Fig. 4). Die Plasmid-DNA, die aus diesen Transformanten isoliert wurde, wurde Hindlil-abgebaut und mit markiertem pRL754 hybridisiert. Im Falle aller untersuchten Tc = -Transformanten wurden drei Banden, die zu den HindIII-Fragmenten eines vermuteten pPL757::pRL754- Kointegrates gehörten (Fig. 8), beobachtet, zusammen mit dem HindIII-pAL1166-Fragment, das die loxP-Sequenz enthält (Fig. 3). Das stärkere Hybridisierungssignal in der oberen Bande, das zu pRL756 mit 44 kb gehört, ist vermutlich auf die Anwesenheit von nicht kointegrierten Kopien dieses Plasmides zurückzuführen, da incP-Plasmide in mehreren Kopien pro Zelle vorliegen können und die Kointegration des eintretenden Km-haltigen Plasmides in nur eine von diesen ausreichen sollte, um Km-Resistenz zu verleihen. Bei den Tcs-Transformanten fehlte diese obere Bande, genau wie das pAL1166-Fragment, das den loxP-Ort enthielt. Drei Banden wurden in diesem Fall beobachtet, die zu den erwarteten HindIII-Fragmenten eines pAL1166::pRL754-Kointegrates, erhalten durch Rekombination am loxP-Ort, gehörten (Fig. 4). Wiederum ist ein Unterschied in der relativen Intensität der Hybridisierungsbanden vorhanden, was der Integration mehrerer Kopien des eintretenden Plasmides in das pTi-loxP- Helferplasmid (pAL1166) zugeschrieben werden kann.
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Bildung von loxP- Cre-vermittelten ortsspezifischen Kointegraten in den Agrobacterium-Zellen effizient abläuft und eine nützliche Alternative zum Erhalt von Kointegraten unter Verwendung homologer Rekombination darstellt.

Beispiel IV

Konstruktion eines pTi::T-DNA-Kointegrates

Nachdem wir den Prozess der loxP-Cre-vermittelten Bildung von Kointegraten in Agrobacterium oreklärt hatten führten wir Versuche aus, um ein abgeändertes T-Gebiet in das inaktivierte loxP-Helferplasmid pAL116Ei einzuführen. Hierzu subklonierten wir das T-Gebietsfragment, wie es in dem binären Vektor pMOG23 vorhanden war (im E.coli-Stamm K-12 DHSα, beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures am 29. Januar 1990 unter der Zugangsnummer CBS 102.90 hinterlegt). Wie in Fig. 6 gezeigt, ist das gesamte T-Gebiet von pMOG23, das ein chimäres NPTII-Gen zwischen seinen linken und rechten Rändern trägt, auf einem BglII-Restriktionsfragment enthalten. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pRL754 subkloniert (Beispiel III-A3), das mit dem Enzym BamHI linearisiert worden war.
Das erhaltene Plasmid pMOG623 wurde wie in Fig. 7 gezeigt in pAL1166 integriert. Der Agrobacterium-Stamm, der pAL1166 und pRL756 trägt (Beispiel II), wurde mit dam Plasmid pMOG623 elektroporiert, wobei nach Kanamycinresistenz selektioniert wurde. Dies wurde gefolgt von Reihenuntersuchung auf Verlust von Tc = , was den Verlust von PRL756 zeigte. Dieser Prozess führte zur Bildung eines pAL1166::pMOG623-Kointegrates, das pAL1766 genannt wurde. Seine Struktur ist in Fig. 7 gezeigt.

Beispiel V

Pflanzentransformation

Der Agrobacterium-Stamm pAL1766 wurde für die Transformation von Tabakpflanzen verwendet, zusammen mit dem Agrobacterium-Stamm MOG1101, der pMOG23 trägt. Dies wurde gemacht, um die Transformationsfähigkeiten von Stämmen, die über loxP-Cre-vermittelte Kointegratbildung konstruiert waren, und von Stämmen, die binäre Vektoren trugen, zu vergleichen.
Die Transformation von Tabak (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) wurde über Kokultivierung von 50 Blattscheiben nach dem Verfahren von Horsch et al. (Horsch et al., (1985), Science 227, 1229-1231) durchgeführt. In Versuchen mit beiden Stämmen wurden die Blattscheiben mit Bakterien, die auf OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,5 während 48 Stunden gezüchtet waren, kokultiviert und auf Selektionsmedien (100 mg/l Kanamycin) transferiert. Nach 4-6 Wochen wurden Schösslinge erhalten und auf richtiges Wurzelschlagen auf Kanamycin (100 mg/l) überprüft, sie wurden auf Boden übertragen und es wurde ihre Selbstbestäubung und Absamung zugelassen. Die Samen der einzelnen Transformanten wurden gesammelt und auf Kanamycin (200 mg/l) gekeimt. Aus diesen Versuchen wurde eine Gesamtzahl von 25-30 transgenen Pflanzen von 50 Blattscheiben gewonnen. Es wurden keine Unterschiede in der Zahl oder dem Aussehen der von den beiden Vektorsystemen erhaltenen Pflanzen beobachtet.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA1166, der pAL1166 beherbergt, caurde beim NCC, Julianalaan 67, Delit, die Niederlande, am 26. Februar 1992 unter der Zugangsnummer CBS 147.92 hinterlegt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: MOGEN International N. V.
(B) STRASSE: Einsteinweg 97
(C) ORT: LEIDEN
(D) PROVINZ: Zuid-Holland
(E) LAND: Niederlande
(F) POSTLEITZAHL: NL-2333 C8
(G) TELEFON: (0)31.71.258282
(H) TELEFAX: (0)31.71.221471
(I) TELEX:
(A) NAME: Rijksuniversiteit te Leiden
(B) STRASSE: Stationsweg 46
(C) ORT: LEIDEN
(D) PROVINZ: Zuid-Holland
(E) LAND: Niederlande
(F) POSTLEITZAHL: NL-2312 AV
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: AGROBACTERIUM BACTERIA CAPABLE OF SITE SPECIFIC RECOMBINATION
(iii) ANZAHL DER SEQUENZED1 : 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRAEGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(vi) DATEN DER FRUEHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: EP 92200558.2
(B) ANMELDEDATUM: 26-FEB-1992
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1::
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRADIGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ABGGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 41 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 41 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Claims

1. Agrobacterium-Stamm, der zur Bildung einer ortsspezifischen Rekombinase befähigt ist, die die ortsspezifische Rekombination eines ersten und eines zweiten Rekombinationsortes in dem besagten Agobacterium-Stamm, wenn diese darin vorhanden sind, bewirken kann, umfassend eine strukturelle DNA-Sequenz, die die besagte Rekombinase codiert, und eine DNA-Sequenz, die zur Steuerung der Expression in dem besagten Agrobacterium-Stamm befähigt ist.

2. Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 1, umfassend des Weiteren einen ersten Rekombinationsort.

3. Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 2, worin der besagte Rekombinationsort auf einem Plasmid vorhanden ist.

4. Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 3, worin das besagte Plasmid ein Helferplasmid ist, das vir-Funktionen beherbergt.

5. Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 4, worin das besagte Helferplasmid keine T-DNA-Ränder enthält.

6. Agrobacterium-Stamm nach einem der Ansprüche 1- 5, worin die besagte strukturelle DNA-Sequenz eine Cre-Rekombinase oder eine funktionelle Portion oder Variante davon codiert.

7. Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 2-6, worin der besagte Rekombinationsort ein loxP-Ort ist.

8. Agrobacterium nach Anspruch 6, worin die besagte strukturelle DNA, die Cre codiert, oder die funktionelle Portion oder Variante davon, auf einem Plasmid ist, das in dem besagten Agrobacterium-Stamm unstabil ist.

9. Agrobacterium-Stamm nach Anspruch 8, worin die besagte strukturelle codierende DNA-Sequenz unter der Steuerung des lac-Promotors von E. coli steht.

10. Verfahren zur Herstellung eines ortsspezifischen Kointegrates in einem Agrobacterium-Stamm, umfassend die Schritte:

- Einführen eines DNA-Nloleküls, das einen zweiten, mit dem besagten ersten Rekombinationsort kompatiblen Rekombinationsort beherbergt, in einen Agrobacterium- Stamm nach einem der Ansprüche 2-9, und

- Bewirken der Bildung der ortsspezifischen Rekombinase in dem besagten Agrobacterium-Stamm.

11. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend des Weiteren die Schritte:

- Bewirken einer verminderten Bildung der ortsspezifischen Rekombinase, und

- Selektionieren von Agrobacterium-Stämmen, die das ortsspezifische Kointegrat beherbergen.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin der besagte Agrobacterium-Stamm vir-Funktionen beherbergt, und worin das besagte DNA-Molekül, das einen zweiten Rekombinationsort beherbergt, DNA umfasst, die in einer Pflanzenzelle nicht natürlicherweise vorkommt und die zu einem rechten T-DNA-Rand positioniert ist, so dass der Kotransfer der besagten DNA mit dem besagten T-DNA-Rand ermöglicht wird.

13. Ortsspezifisches Agrobacterium-Kointegrationsplasmid, erhältlich unter Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 10.

14. Ortsspezifisches Agrobacterium-Kointegrationsplasmid, erhältlich unter Verwendung eins Verfahrens nach Anspruch 11.

15. Ortsspezifisches Agrobacterium-Kointegrationsplasmid, erhältlich unter Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 12.

16. Agrobacterium-Stämme, die eine ortsspezifisches Kointegrat nach Anspruch 13-15 umfassen.

17. Verfahren zum Erhalt einer Pflanzenzelle, die nicht natürlicherweise darin vorkommende DNA enthält, umfassend die Schritte:

- Inkontaktbringen von Pflanzenzellen mit einem Agrobacterium-Stamm, der ein ortsspezifisches Kointegrat nach Anspruch 16 beherbergt,

- Selektionieren einer Pflanzenzelle, die die besagte, nicht natürlicherweise darin vorhandene DNA erhalten hat.