DE69623057T2

DE69623057T2 - Rekombinatorische klonierung in vitro unter verwendung genmanipulierter rekombinationsorte

Info

Publication number: DE69623057T2
Application number: DE69623057T
Authority: DE
Inventors: A. Brasch; L. Hartley
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2003-03-27
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: EP0937098B1; ES2181900T3; JP4020429B2; EP1227147A3; US5888732A; CA2226463A1; EP1227147A2; JPH11507236A; US20100267118A1; DK0937098T3; EP2322614A1; EP0937098A1; EP1229113A3; AU6384196A; NZ312332A; WO1996040724A1; AU724922B2; JP2006087445A; JP2009100776A; EP1229113A2

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Technologie. Es werden DNA und Vektoren mit genmanipulierten Rekombinationsstellen zur Verwendung in einem rekombinanten Klonierungsverfahren bereitgestellt, das eine effiziente und spezifische Rekombination von DNA-Segmenten unter Verwendung von Rekombinationsproteinen ermöglicht. Die DNAs, Vektoren, und Verfahren sind für eine Vielzahl von DNA-Auswechselungen, wie das Subklonieren von DNA in vitro nützlich.

Stand der Technik

Mutationsart- bzw. Stellen-spezifische Rekombinasen. Stellen-spezifische Rekombinasen sind Enzyme, die in einigen Viren und Bakterien vorhanden sind und sie wurden charakterisiert, daß sie sowohl Endonuclease- als auch Ligase-Eigenschaften aufweisen. Diese Rekombinasen (zusammen mit zugehörigen Proteinen in einigen Fällen) erkennen spezifische Basensequenzen in der DNA und wechseln die DNA-Segmente aus, die diese Segmente flankieren. Die Rekombinasen und zugehörigen Proteine werden gemeinsam als "Rekombinationsproteine" bezeichnet (siehe, z. B. Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993)).
Es wurden zahlreiche Rekombinationssysteme für verschiedene Organismen beschrieben. Siehe, z. B., Hoess et al., Nucleic Acids Research 14(6): 2287 (1986); Abremski et al., J Biol. Chem. 261(1): 391 (1986); Campell, J. Bacteriol. 174(23): 7495 (1992); Quian et al., J. Biol. Chem. 267(11): 7794 (1992); Araki et al., J. Mol. Biol. 225(1): 25 (1992); Maeser und Kahnmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
Viele von ihnen gehören zu der Integrase-Familie von Rekombinasen (Argos et al. EMBO J. 5: 433-440 (1986)). Die am meisten untersuchten von ihnen sind vielleicht das Integrase/att- System von Bacteriophage λ (Landy, A. Current Opinions in Genetics and Devel 3: 699-707 (1993)), das Cre/loxP-System von Bakteriophage P1 (Hoess und Abremski (1990) in Nucleic Acids and Molecular Biology, Bd. 4, Eds.: Eckstein und Lilley, Berlin-Heidelberg: Springer- Verlag; Seiten 90-109) und das FLP/FRT-System von dem Saccharomyces cerevisae 2 u Ringplasmid (Broach et al. Cell 29: 227-234 (1982)).
Weil diese Rekombinationssysteme für besondere Organismen charakterisiert wurden, lehrte der Stand der Technik lediglich das Verwenden von rekombinanter DNA, die durch Rekombinationsstellen flankiert ist, für in vivo Rekombination.
Backman (U. S. Patent Nr. 4,673,640) offenbart die in vivo Verwendung von λ Rekombinase, um ein Protein erzeugendes DNA-Segment durch enzymatische Stellen-spezifische Rekombination unter Verwendung von den Wild-Typ Rekombinationsstellen attB und attP zu rekombinieren.
Hasan und Szybalski (Gene 56: 145-151 (1987)) offenbaren die Verwendung von λ Int Rekombinase in vivo für intramolekulare Rekombination zwischen Wild-Typ attP- und attß- Stellen, die einen Promoter flankieren. Weil die Orientatierung dieser Stellen relativ zueinander umgekehrt sind, verursacht dies ein irreversibles Umlegen der Promoterregion zu dem Gen von Interesse.
Palazzo et al. Gene 88: 25-36 (1990) offenbart Phage Lambda Vektoren mit Bakteriophage λ Armen, die Restriktionsstellen enthalten, die außerhalb einer klonierten DNA-Sequenz und zwischen Wild-Typ loxP-Stellen positioniert sind. Eine Infektion von E. coli Zellen, die die Cre Rekombinase mit diesen Phage-Vektoren exprimiert, führt zur Rekombination zwischen den loxP-Stellen und der in vivo Excision des Plasmid-Replicons, einschließlich der klonierten cDNA.
Pósfai et al. (Nucl. Acids Res. 22: 2392-2398 (1994)) offenbart ein Verfahren zum Insertieren von Teil-Expressionsvektoren mit einem selektierfähigen Marker in Genom-DNA, der durch zwei Wild-Typ FRT Erkennungssequenzen flankiert ist. FLP-Stellen-spezifische Rekombinase, wenn in den Zellen vorhanden, wird verwendet, um die Vektoren in das Genom bei vorbestimmten Stellen zu integrieren. Unter Bedingungen, wo das Replicon funktionell ist, kann diese klonierte Genom-DNA verstärkt werden.
Bebee et al. (U. S. Patent Nr. 5,434,066) offenbart die Verwendung von Stellen-spezifischer Rekombinasen wie Cre für DNA, die zwei lowP-Stellen enthält, die für in vivo Rekombination zwischen den Stellen verwendet werden.
Boyd (Nucl. Acids Res. 21: 817-821 (1993)) offenbart ein Verfahren, um das Klonieren von DNA mit glatten Enden unter Bedingungen zu erleichtern, die eine intermolekulare Ligation an einen entphosphorierten Vektor unterstützen, der eine Wild-Typ loxP-Stelle enthält, die durch eine Cre Stellen-spezifische Rekombinase einwirkt, die in E. coli Wirtszellen vorhanden ist.
Waterhouse et al. (PCT Nr. 93/19172 und Nucleic Acids Research 21 (9): 2265 (1993)) offenbaren ein in vivo Verfahren, wo leichte und schwere Ketten eines besonderen Antikörpers in verschiedenen Phagen-Vektoren zwischen loxP und loxP 551 Stellen kloniert wurden und verwendet wurden, um neue E. coli Zellen zu transfektieren. Cre, das in Wirtszellen auf die zwei Elternmoleküle (ein Plasmid, ein Phage) wirkt, stellte vier Produkte im Gleichgewicht her: zwei verschiedene Cointegrate bzw. Fusionsprodukte (die durch Rekombination an entweder loxP oder loxP 511 Stellen hergestellt werden) und zwei Tochtermoleküle, von denen eines das gewünschte Produkt war.
Im Gegensatz zu dem anderen Stand der Technik offenbart Schlake & Bode (Biochemistry 33: 12746-12751 (1994)) ein in vivo Verfahren, um Expressionkassetten an definierten chromosomalen Orten auszuwechseln, wobei jede durch eine Wild-Typ und eine Spacermutatierte FRT Rekombinationsstelle flankiert ist. Ein doppelt-gegenseitiges Crossover wurde in kultivierten Säugetierzellen durch Verwenden dieses FLP/FRT-Systems für Stellen-spezifische Rekombination vermittelt.
Transposasen. Die Familie von Enzymen, die Transposasen, wurden ebenfalls verwendet, um genetische Informationen zwischen Replicons zu transferieren. Transposons, die als Grundform oder Verbindung beschrieben sind, sind strukturell variabel, aber kodieren typischerweise das Rekombinasegen, das durch DNA-Sequenzen flankiert ist, die in umgekehrten Orientierungen organisiert sind. Eine Integration der Transposons kann zufällig oder hoch spezifisch sein. Vertreter wie Tn7, die hoch Stellen-spezifisch sind, wurden auch auf die in vivo Bewegung von DNA-Segmenten zwischen Replicons angewendet (Lucklow et al., J. Virol. 67: 4566-4579 (1993)).
Devine und Boeke Nucl. Acids Res. 22: 3765-3772 (1994) offenbart die Konstruktion von künstlichen Transposons für die Insertion von DNA-Segmenten, in vitro, in Rezeptor-DNA- Moleküle. Das System verwendet die Integrase von Hefe TY1 Virus-artigen Partikeln. Das DNA-Segment von Interesse wird unter Verwendung von Standardverfahren zwischen den Enden des Transposon-artiken Elements TY1 kloniert. In der Gegenwart von TY1 Integrase integriert das resultierende Element zufällig in ein zweites Target-DNA-Molekül.
DNA-Klonieren. Das Klonieren von DNA-Segmenten findet laufend als eine Tagesroutine in vielen Forschungslaboren und als ein notwendiger Schritt in vielen genetischen Analysen statt. Der Zweck dieser Klonierungen ist verschieden, aber zwei allgemeine Zwecke können betrachtet werden: (1) das initiale Klonieren von DNA von großen DNA- oder RNA-Segmenten (Chromosomen, YACs, PCR-Fragmenten, mRNA usw.), das in einer relativen Handvoll von bekannten Vektoren wie pUC, pUem, pBlueScript durchgeführt wird, und (2) das Subklonieren von diesen DNA-Segmenten in spezialisierten Vektoren zur funktionelle Analyse. Einge große Menge an Zeit und Kraft wird sowohl auf das initiale Klonieren von DNA-Segmenten und auf den Tranfer von DNA-Segmenten von den initialen Klonierungsvektoren zu mehr spezialisierten Vektoren aufgewendet. Dieser Transfer wird Subklonieren genannt.
Die Grundverfahren zum Klonieren sind seit vielen Jahren bekannt und haben sich in dieser Zeit wenig verändert. Ein typisches Klon-Protokoll ist folgendermaßen:
(1) Verdauen der DNA von Interesse mit einem oder zwei Restriktionsenzymen;
(2) Gel-Reinigen der DNA-Segmente von Interesse, wenn bekannt;
(3) Herstellen des Vektors durch Schneiden mit geeigneten Restriktionsenzymen, Behandeln mit alkalischer Phosphatase, Gel-Reinigen usw., wie geeignet;
(4) Ligieren des DNA-Segments an den Vektor mit geeigneten Kontrollen, um den Background von ungeschnittenen und selbst-ligierten Vektor zu bewerten;
(5) Einführen des resultierenden Vektors in eine E. coli Wirtszelle;
(6) Aussortieren von selektierten Kolonien und Züchten von kleinen Kulturen über Nacht;
(7) Herstellen von DNA-Minipreps; und
(8) Analysieren des isolierten Plasmids auf Agarose-Gelen (oft nach diagnostischen Restriktionsenzym-Verdauungen) oder durch PCR.
Die spezialisierten Vektoren, die für das Subklonieren von DNA-Segmenten verwendet werden, sind funktionell verschieden. Diese umfassen: Vektoren zum Exprimieren von Genen in verschiedenen Organismen; zum Regulieren von Genexpression; zum Bereitstellen von Markierungen, um die Proteinreinigung zu unterstützen oder um das Verfolgen von Proteinen in Zellen zu erlauben; zum Modifizieren des klonierten DNA-Segments (z. B. Erzeugen von Deletionen); zur Synthese von Proben (z. B. Riboproben); zur Herstellung von Matrizen bzw. Templaten zum Sequenzieren von DNA; zur Identifizierung von Protein-kodierenden Regionen; für die Fusion von verschiedenen Protein-kodierenden Regionen; zur Fusion von verschiedenen Protein-kodierenden Regionen; um große Mengen der DNA von Interesse bereitzustellen usw., sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist alltäglich, dass eine besondere Untersuchung das Subklonieren des DNA-Segments von Interesse in einigen verschiedenen spezialisierten Vektoren involviert.
Es ist in dem Fachgebiet bekannt, dass einfache Subklonierungen in einem Tag durchgeführt werden können (z. B. das DNA-Segment ist nicht groß und die Restriktionsstellen sind mit denen des Subklonierungsvektors kompatibel). Viele andere Subklonierungen können jedoch mehrere Wochen dauern, insbesondere jene, die unbekannte Sequenzen, lange Fragmente, toxische Gene, eine ungeeignte Anordnung von Restriktionsstellen, hohe Hintergründe, unreine Enzyme, usw. involvieren. Das Subklonieren von DNA-Segmenten wird oft als eine unangenehme Arbeit angesehen, die in so wenig Zeit wie möglich getan werden muss.
Einige Verfahren zum Erleichtern des Klonierens von DNA-Segmenten wurden, wie z. B. in den folgenden Dokumenten, beschrieben.
Ferguson, J. et al. Gene 16: 191 (1981) offenbart eine Familie von Vektoren zum Subklonieren von Hefe-DNA-Fragmenten. Die Vektoren kodieren Kanamycin-Resistenz. Klone von längeren Hefe-DNA-Segmenten können teilweise verdaut werden und in die Subklonierungsvektoren ligiert werden. Wenn der ursprüngliche Klonierungsvektor Resistenz gegen Ampicillin fördert, ist keine Reinigung vor der Transformation notwendig, wenn die Selektion für Kanamycin sein wird.
Hashimoto-Gotoh, T., et al. Gene 41: 152 (1986) offenbart einen Subklonierungsvektor mit einzigartigen Klonierungsstellen in einem Streptomycin-Sensitinvitäts-Gen; in einem Streptomycin-resistenten Wirt werden nur Plasmide mit Inserts oder Deletionen in dem dominanten Sensitivitätsgen eine Streptomycin-Selektion überleben.
Demgemäß sind herkömmliche Subklonierungsverfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligase zeitraubend und relativ unzuverlässig. Beträchtliche Arbeitskräfte werden aufgewendet und wenn zwei oder mehrere Tage später der gewünschte Subklon nicht unter den Kandidatenplasmiden gefunden werden kann, dann muss der ganze Prozess mit alternativen Versuchsbedingungen wiederholt werden. Obwohl Stellen-spezifische Rekombinasen verwendet wurden, um DNA in vivo zu rekombinieren, wurde erwartet, dass die erfolgreiche Verwendung von solchen Enzymen in vitro an einigen Problemen leiden würde. Es wurde zum Beispiel erwartet, dass sich die Stellen-Spezifitäten und -Wirkungsfähigkeiten in vitro unterscheiden, es wurden topologisch-verknüpfte Produkte erwartet; und es wurde erwartet, dass sich die Topologie der DNA-Substrate und Rekombinationsproteine deutlich in vitro unterscheiden (siehe, z. B., Adams et al. J. Mol. Biol. 226: 661-73 (1992)). Es wurde erwartet, dass Reaktionen, die in vivo viele Stunden fortfahren können, in bedeutend weniger Zeit in vitro stattfinden, bevor die Enzyme inaktiv werden. Es wurden in dem verwendeten biologischen Wirt multiple DNA-Rekombinationsprodukte erwartet, was zu einer unzufriedenstellenden Unzuverlässigkeit, Spezifität oder Wirkungsfähigkeit vom Subklonieren führt. Es wurde nicht erwartet, dass in vitro Rekombinationsreaktionen ausreichend effizient sind, um die gewünschten t Produktgrade zu ergeben.
Demgemäß besteht ein lange empfundener Bedarf, ein alternatives Subklonierungssystem bereitzustellen, das Vorteile gegenüber der bekannten Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligasen bereitstellt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuren, Vektoren und Verfahren zum Erhalten von chimärer Nukleinsäure unter Verwendung von Rekombinationsproteinen und genmanipulierten Rekombinationsstellen in vitro bereit. Diese Verfahren sind hoch spezifisch, schnell und weniger Arbeitskraft-intensiv als jene, die im Stand der Technik offenbart oder angedeutet wurden. Die verbesserte Spezifizität, Geschwindigkeit und Ausbeuten der vorliegenden Erfindung erleichtern die DNA- oder RNA-Subklonierung, -Regulierung, oder -Auswechselung, die für einen zugehörigen Zweck nützlich sind. Solche Zwecke umfassen in vitro Rekombination von DNA- Segmenten und in vitro Insertion oder Modifikation von transkibierter, replizierter, isolierter oder Genom-DNA oder -RNA.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Vektoren und Verfahren zum Bewegen oder Auswechseln von DNA-Segmenten unter Verwendung von wenigstens einer genmanipulierten Rekombinationsstelle und wenigstens einem Rekombinationsprotein, um chimäre DNA- Moleküle bereitzustellen, die die gewünschte Charakteristik(en) und/oder DNA-Segmente(n) aufweisen. Im Allgemeinen werden ein oder mehrere Eltern-DNA-Moleküle rekombiniert; um ein Tochtermolekül oder mehrere Tochtermoleküle zu ergeben, von denen wenigstens eins das gewünschte Produkt-DNA-Segment oder Vektor ist. Die Erfindung betrifft folglich DNA, RNA, Vektoren und Verfahren, um die Auswechselung zu bewirken und/oder eine oder mehrere gewünschte Produkte zu selektieren.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von chimärer DNA, das umfasst
(a) Kombinieren in vitro:
(i) ein Insertion-Donor-DNA-Molekül, das ein gewünschtes DNA-Segment umfasst, das durch eine erste Rekombinationsstelle und eine zweite Rekombinationsstelle flankiert ist, wobei die erste und die zweite Rekombinationsstelle nicht miteinander rekombinieren;
(ii) ein Vektor-Donor-DNA-Molekül, das eine dritte Rekombinationsstelle und eine vierte Rekombinationsstelle enthält, wobei die dritte und die vierte Rekombinationsstelle nicht miteinander rekombinieren; und
(iii) wenigstens ein spezifisches Rekombinationsprotein, das fähig ist, oder mehrere spezifische Rekombinationsproteine, die fähig sind, die erste und dritte Rekombinationsstelle und/oder die zweite und vierte Rekombinationsstelle zu rekombinieren;
wobei es dadurch das Stattfinden einer Rekombination erlaubt, um wenigstens ein Fusionsprodukt-DNA-Molekül, wenigstens ein gewünschtes Produkt-DNA-Molekül zu erzeugen, das das gewünschte DNA-Molekül und wahlweise ein Nebenprodukt-DNA- Molekül umfasst; und dann wahlweise,
(b) Selektieren zu dem Produkt- oder Nebenprodukt-DNA-Molekül.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit, der einen Träger oder Behälter umfasst, der unterteilt ist und in dichter Begrenzung darin wenigstens eine Kammer hält, wobei eine erste Kammer ein DNA-Molekül enthält, das einen Vektor umfasst, der wenigstens zwei Rekombinationsstellen aufweist, die eine Klonierungsstelle oder einen selektierfähigen Marker flankieren, wie hier beschrieben. Der Kit enthält weiterhin:
Eine Kammer, die wenigstens ein Rekombinationsprotein enthält, das wenigstens eine der Rekombinationsstellen erkennt und fähig ist, wenigstens eine der Rekombinationsstellen zu rekombinieren; und wahlweise eine Kammer, die ein Vektor-Donor-Plasmid enthält, das einen Subklonierungsvektor und/oder selektierfähigen Marker enthält, von denen eins oder beide durch ein oder mehrere genmanipulierte Rekombinationsstellen flankiert sind.
Andere Ausführungsformen umfassen die Verwendung von DNA und Vektoren, wie hier beansprucht, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Insbesondere wird in einer Ausführungsform die Verwendung von Vektor-Donor-Molekülen bereitgestellt, wobei DNA-Segmente in dem Vektor-Donor entweder (i) in einem ringförmigen Vektor-Donor durch wenigstens zwei Rekombinationsstellen, oder (ii) in einem linearen Vektor, durch wenigstens eine Rekombinationsstelle getrennt sind, wobei die Rekombinationsstellen vorzugsweise genmanipuliert sind, um die Rekombinationsspezifizität oder -effizienz zu verbessern.
Eine Ausführungform eines Vektor-Donors umfasst ein erstes DNA-Segment und ein zweites DNA-Segment, wobei das erste oder zweite Segment einen selektierfähigen Marker enthält. Eine zweite Ausführungform eines Vektor-Donors umfasst ein erstes DNA-Segment und ein zweites DNA-Segment, wobei das erste oder zweite DNA-Segment ein toxisches Gen enthält. Eine dritte Ausführungform eines Vektor-Donors umfasst ein erstes DNA-Segment und ein zweites DNA- Segment, wobei das erste oder zweite DNA-Segment ein inaktives Fragment von wenigstens einem selektierfähigen Marker enthält, wobei das inaktive Fragment des selektierfähigen Markers fähig ist, einen funktionellen selektierfähigen Marker zu rekonstituieren, wenn es durch die erste oder zweite Rekombinationsstelle mit einem anderen inaktiven Fragment von wenigstens einem selektierfähigen Marker rekombiniert ist.
Das vorliegende rekombinatorische Klonierungsverfahren besitzt einige Vorteile gegenüber vorhergehenden in vivo Verfahren. Weil einzelne Moleküle von Rekombinationsprodukten in einen biologischen Wirt eingeführt werden können, wird die Vermehrung der gewünschten Produkt-DNA in der Abwesenheit von anderen DNA-Molekülen (z. B. Ausgangsmaterialien, Zwischenprodukten, und Nebenprodukten) schneller realisiert. Die Reaktionsbedingungen können frei in vitro eingestellt werden, um Enzymaktivitäten zu optimieren. Die DNA-Moleküle können mit dem gewünschten biologischen Wirt inkompatibel sein (z. B. YACs, Genom-DNA, usw.) können verwendet werden. Es können Rekombinationsproteine aus verschiedenen Quellen zusammen oder sequentiell verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein allgemeines Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei dem die Ausgangs(Eltern-) DNA-Moleküle entweder ringförmig oder linear sein können. Es ist das Ziel, den neuen Subklonierungsvektor D gegen den ursprünglichen Klonierungsvektor B auszuwechseln. Es ist in einer Ausführungform wünschenswert, für AD und gegen all die anderen Moleküle, einschließlich des Fusionsprodukts, zu selektieren. Die Quadrate und Kreise sind Rekombinationsstellen: z. B. loxP-Stellen, att-Stellen usw. Segment D kann zum Beispiel Expressionssignale, neue Medikamentenmarker, neue Replikationsursprünge oder spezialisierte Funktionen zum kartographischen Erfassen bzw. Zuordnen oder Sequenzieren von DNA enthalten.
Fig. 2A zeigt ein in vitro Verfahren zum Rekombinieren eines Insert-Donor-Plasmids (hier, pEZC705) mit einem Vektor-Donor-Plasmid (hier, pEZC726) und Erhalten von Produkt-DNA und Nebenprodukt-Tochter-Molekülen. Die zwei Rekombinationsstellen sind att und loxP auf dem Vektor-Donor. Auf einem Segment, das durch diese Stellen definiert ist, ist ein Kanamycin- Resistenz-Gen, dessen Promoter durch den tetOP-Operator/Promoter von Transposon Tn10 ersetzt wurde. Siehe Sizemore et al., Nucl. Acids Res. 18(10): 2875 (1990). In der Abwesenheit vom tet-Repressorprotein transkribiert E. coli RNA-Polymerase das Kanamycin-Resistenz-Gen von dem tetOP. Wenn der tet-Repressor vorhanden ist, bindet sie an tetOP und blockiert die Transkription des Kanamycin-Resistenz-Gens. Das andere Segment von pEZC726 weist das tet- Repressorgen auf, das durch einen konstitutiven Promoter exprimiert wird. Zellen, die durch pEZC726 tranformiert wurden, sind folglich resistent gegen Chloramphenicol, weil das Chloramphenicol-Acetyl-Transferasegen auf dem gleichen Segment ist wie tetR, aber sensitiv zu Kanamycin. Die Recombinase-vermittelten Reaktionen führen zur Trennung des tetR-Gens von dem regulierten Kanamycin-Resistenz-Gen. Diese Trennung führt zur Kanamycin-Resistenz in Zellen, die nur die gewünschten Rekombinationsprodukte aufnehmen. Die erste Rekombinationsreaktion wird durch die Zugabe der Recombinase angetrieben, die Integrase genant wird. Die zweite Rekombinationsreaktion wird durch Zugeben der Recombinase Cre zu dem Fusionsprodukt (hier pEZC7 Fusionsprodukt) angetrieben.
Fig. 2B zeigt eine Restriktionskarte von pEZC705.
Fig. 2C zeigt eine Restriktionskarte von pEZC726.
Fig. 2D zeigt eine Restriktionskarte von pEZC7-Fusionsprodukt
Fig. 2E zeigt eine Restriktionskarte von Intprod bzw. dem Zwischenprodukt.
Fig. 2F zeigt eine Restriktionskarte von Intbypro bzw. dem Zwischennebenprodukt.
Fig. 3A zeigt ein in vitro Verfahren zum Rekombinieren eines Insert-Donor-Plasmids (hier, pEZC602) mit einem Vektor-Donor-Plasmid (hier, pEZC629) und Erhalten von Produkt- (hier, EZC6prod) und Nebenprodukt- (hier, EZC6Bypr bzw. EZC6Nbpr)) Tochtermolekülen. Die zwei Rekombinationsstellen sind loxP und loxP511. Ein Segment von pEZC629, das durch diese Stellen definiert ist, ist ein Kanamycin-Resistenz-Gen, dessen Promoter durch den tetOP- Operator/Promoter von Transposon Tn10 ersetzt wurde. In der Abwesenheit vom tet- Repressorprotein transkribiert E. coli RNA-Polymerase das Kanamycin-Resistenz-Gen von dem tetOP. Wenn der tet-Repressor vorhanden ist, bindet sie an tetOP und blockiert die Transkription des Kanamycin-Resistenz-Gens. Das andere Segment von PEZC629 weist das tet-Repressorgen auf, das durch einen konstitutiven Promoter exprimiert wird. Zellen, die durch pEZC629 tranformiert wurden, sind folglich resistent gegen Chloramphenicol, weil das Chloramphenicol- Acetyl-Transferasegen auf dem gleichen Segment ist wie tetR, aber sensitiv zu Kanamycin. Die Reaktionen führen zur Trennung des tetR-gens von dem regulierten Kanamycin-Resistenz-Gen. Diese Trennung führt zur Kanamycin-Resistenz in Zellen, die das gewünschte Rekombinationsprodukt aufnehmen. Das erste und zweite Rekombinationsereignis werden durch die Zugabe der gleichen Recombinase, Cre, angetrieben.
Fig. 3B zeigt eine Restriktionskarte von EZC6Bypr bzw. EZC6Nbpr.
Fig. 3C zeigt eine Restriktionskarte von EZC6prod.
Fig. 3D zeigt eine Restriktionskarte von pEZC602.
Fig. 3E zeigt eine Restriktionskarte von pEZC629.
Fig. 3F zeigt eine Restriktionskarte von EZC6coint bzw. ECZ6Fusion.
Fig. 4A zeigt eine Anwendung des in vitro Verfahrens zum rekombinanten Klonieren, um das Chloramphenicol-Acetyl-Transferasegen in einen Vektor zum Exprimieren in eukariotischen Zellen zu subklonieren. Das Insert-Donor-Plasmid, pEZC843, umfasst das Chloramphenicol- Acetyl-Transferasegen von E. coli, das zwischen loxP- und attB-Stellen kloniert ist, so dass die loxP-Stelle an dem 5'-Ende des Gens positioniert ist. Das Vektor-Donor-Plasmid, pEZC1003, enthält den eukariotischen Zytomegalievirus-Promoter, der an einer loxP-Stelle appositioniert ist. Die supercoilten Plasmide wurden mit lambda Integrase und Cre Recombinase in vitro vereinigt. Nach der Inkubation wurden funktionsfähige E. coli Zellen mit der rekombinanten Reaktionslösung transformiert. Aliquote von Transformationen wurden auf Agar-Platten verteilt, die Kanamycin enthielten, um für das Produktmolekül (hier CMVProd) zu selektieren.
Fig. 4B zeigt eine Restriktionskarte von pEZC843.
Fig. 4C zeigt eine Restriktionskarte von pEZ1003.
Fig. 4D zeigt eine Restriktionskarte von CMVBypro bzw. CMVNbprod.
Fig. 4E zeigt eine Restriktionskarte von CMVProd.
Fig. 4F zeigt eine Restriktionskarte von CMVcoint bzw. CMVFusion.
Fig. 5A zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1301.
Fig. 5B zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1305.
Fig. 5C zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1309.
Fig. 5D zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1313.
Fig. 5E zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1317.
Fig. 5F zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1321.
Fig. 5G zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1405.
Fig. 5H zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1502.
Fig. 6A zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1603.
Fig. 6B zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1706.
Fig. 7A zeigt ein Vektordiagramm von pEZC2901.
Fig. 7B zeigt ein Vektordiagramm von pEZC2913.
Fig. 7C zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3101.
Fig. 7D zeigt ein Vektordiagramm von pEZC1802.
Fig. 8A zeigt ein Vektordiagramm von pGEX-2TK.
Fig. 8B zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3501.
Fig. 8C zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3601.
Fig. 8D zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3609.
Fig. 8E zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3617.
Fig. 8F zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3606.
Fig. 8G zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3613.
Fig. 8H zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3621.
Fig. 8I zeigt ein Vektordiagramm von GST-CAT.
Fig. 8J zeigt ein Vektordiagramm von GST-phoA.
Fig. 8K zeigt ein Vektordiagramm von pEZC3201.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Es wurde in der vorliegenden Erfindung unerwartet entdeckt, dass Subklonierungsreaktionen unter Verwendung von rekombinanter Klonierung bereitgestellt werden können. Die Rekombinationsklonierung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet DNAs, Vektoren und Verfahren, in vitro, zum Bewegen und Auswechseln von Segmenten von DNA-Molekülen unter Verwendung von genmanipulierten Rekombinationsstellen und Rekombinationsproteinen. Diese Verfahren stellen chimäre DNA-Moleküle bereit, die die gewünschte(n) Charakteristik(en) und/oder das bzw. die gewünschte(n) DNA-Segmente enthält.
Die vorliegende Erfindung verwendet folglich Nukleinsäure, Vektoren und in vitro Verfahren zum Erhalten von chimären Nukleinsäuren unter Verwendung von Rekombinationsproteinen und genmanipulierten Rekombinationsstellen. Diese Verfahren sind hochspezifisch, schnell und weniger Arbeitskraft-intensiv als jene, die im Stand der Technik offenbart oder angedeutet wurden. Die verbesserte Spezifizität, Geschwindigkeit und Ausbeuten der vorliegenden Erfindung erleichtert die DNA- oder RNA-Suklonierung, -Regulierung oder -Auswechselung, die für irgendeinen zugehörigen Zweck nützlich ist. Solche Zwecke umfassen in vitro Rekombination von DNA-Segmenten und in vitro Insertion oder Modifikation von transkribierter, replizierter, isolierter oder Genom-DNA oder -RNA.

Definitionen

In der Beschreibung, die folgt, werden eine Anzahl an Ausdrücken, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, häufig verwendet. Um ein klares und konsistentes Verständnis für die Beschreibung und Ansprüche, einschließlich des den Ausdrücken zu gebenden Umfangs bereitzustellen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
Nebenprodukt: ist ein Tochtermolekül (ein neuer Klon, der nach dem zweiten Rekombinationsereignis während dem rekombinanten Klonierungsverfahren erzeugt wird), dem die DNA fehlt, die gewünscht ist, subkloniert zu werden.
Fusionsprodukt: ist wenigstens ein Rekombinations-Zwischenprodukt-DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung, das beide Eltern- (Ausgangs-) DNA-Moleküle enthält. Es wird im Allgemeinen ringförmig sein. In einigen Ausführungsformen kann es linear sein.
Wirt: ist irgendein prokaryotischer oder eukaryotischer Organismus, der ein Empfänger des rekombinanten Klonierungsprodukts ist. Ein "Wirt", wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfasst prokaryotische und eukaryotische Organismen, die genmanipuliert sein können. Für Bespiele von solchen Wirten, siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).
Insert: ist das gewünschte DNA-Segment (Segment A von Fig. 1), welches man durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu manipulieren wünscht. Das Insert kann ein oder mehrere Gene enthalten.
Insert-Donor: ist eins der zwei Eltern-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung, die das Insert trägt. Das Insert-Donor-DNA-Molekül enthält das Insert, das an beiden Seiten mit Rekombinationssignalen flankiert ist. Der Insert-Donor kann linear oder ringförmig sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Insert-Donor ein rringförmiges DNA-Molekül und enthält weiterhin eine Klonierungsvektorsequenz außerhalb der Rekombinationssignale (siehe Fig. 1).
Produkt: ist eins oder beide der gewünschten Tochtermoleküle, die die A- und D- oder B- und C- Sequenzen enthalten, die nach dem zweiten Rekombinationsereignis während dem rekombinanten Klonierungsprozess erzeugt werden (siehe Fig. 1). Das Produkt enthält die DNA, die kloniert oder subloniert werden soll.
Promoter: ist eine DNA-Sequenz, die im Allgemeinen als die 5'-Region eines Gens beschrieben wird; die in der Nähe des Startcodons angeordnet ist. Die Transcription eines benachbarten DNA-Segments wird durch die Promoter-Region initiiert. Die Transcriptionsgeschwindigkeit eines reprimierbaren Promoters nimmt als Antwort auf ein reprimierendes Agens ab. Die Transcriptionsgeschwindigkeit eines induzierbaren Promoters steigt als Antwort auf ein induzierendes Agens an. Die Transcriptionsgeschwindigkeit eines konstitutiven Promoters wird nicht spezifisch reguliert, auch wenn sie unter dem Einfluss von allgemeinen metabolischen Bedingungen variieren kann.
Erkennungssequenz: Erkennungssequenzen sind besondere DNA-Sequenzen, die ein Protein, DNA- oder RNA-Molekül (z. B. Restriktionsendonuklease, eine Modifikationsmethylase oder eine Recombinase) erkennt und bindet. Zum Beispiel ist die Erkennungssequenz für Cre Recombinase loxP, die eine Sequenz mit 34 Basenpaaren ist, die aus zwei 13 Basenpaarinvertierten Wiederholungen zusammengesetzt ist (die als die Recombinase-bindende Stellen dienen), die eine 8 Basenpaar-Kernsequenz flankieren. Siehe Fig. 1 von Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5: 521-527 (1994). Andere Beispiele von Erkennungssequenzen sind attB-, attP- attL- und attR-Sequenzen, die durch das Recombinaseenzym λ Integrase erkannt werden. attB ist eine Sequenz mit etwa 25 Basenpaaren, die zwei Kern-Typ Int Bindungsstellen mit 9 Basenpaaren und eine Überlappungs-Region mit 7 Basenpaaren enthält. attP ist eine Sequenz mit etwa 240 Basenpaaren, die Kern-Typ Int Bindungsstellen und Arm-Typ Int Bindungsstellen sowie Stellen für Hilfsproteine IHF, FIS und Xis enthält. Siehe Landry, Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993). Solche Stellen werden gemäß der Erfindung ebenfalls manipuliert, um Verfahren und Produkte zu verbessern.
Recombinase: ist ein Enzym, das die Auswechselung von DNA-Segmenten bei spezifischen Rekombinationsstellen katalysiert.
Rekombinate Klonierung: ist ein hier beschriebenen Verfahren, in dem Segmente von DNA- Molekülen ausgewechselt, insertiert, ersetzt, substituiert oder modifiziert werden in vitro oder in vivo.
Rekombinationsproteine: umfassen Exzisions- oder Integrationsproteine, Enzyme, Cofaktoren, und zugehörige Proteine, die in Rekombinationsreaktionen involviert sind, die eine oder mehrere Rekombinationsstellen involvieren. Siehe, Landy (1994), infra.
Repressionskassette: ist ein DNA-Segment, das einen Repressor eines selektierfähigen Markers enthält, der in dem Subklonierungsvektor vorhanden ist.
Selektierfähiger Marker: ist ein DNA-Segment, das einem erlaubt, für oder gegen ein Molekül oder eine Zelle, die es enthält, oft unter besonderen Bedingungen zu selektieren. Diese Marker können eine Aktivität kodieren, wie die Herstellung von einer RNA, einem Peptid oder einem Protein, aber nicht darauf beschränkt, oder können eine Bindungsstelle für RNA, Peptide, Proteine, organische oder anorganische Verbindungen oder Zusammensetzungen oder dergleichen bereitstellen. Beispiele von selektierfähigen Markern umfassen (1) DNA-Segmente, die Produkte kodieren, die Resistenz gegen andere toxische Verbindungen (z. B. Antibiotika) bereitstellen; (2) DNA-Segmente, die Produkte kodieren, die ansonsten in der Empfängerzelle fehlen (z. B. tRNA-Gene, auxotrophe Marker); (3) DNA-Segmente, die Produkte kodieren, die die Aktivität eines Genprodukts unterdrücken; (4) DNA-Segmente, die Produkte kodieren, die sofort identifiziert werden können (z. B. phänotypische Marker wie β-Galactosidase, Grün- Fluoreszenz-Protein (GFP) und Zelloberflächen-Proteine); (5) DNA-Segmente, die Produkte binden, die ansonsten für das Zell-Überleben und/der -Funktion schädlich sind; (6) DNA- Segmente, die ansonsten die Aktivität von irgendeinem der DNA-Segmente hemmen, die vorstehend in Nummern 1-5 beschrieben sind (z. B. Antisense-Oligonukleotide); (7) DNA- Segmente, die Produkte binden, die ein Substrat modifizieren (z. B. Restriktionsendonukleasen); (8) DNA-Segmente, die verwendet werden können, um ein gewünschtes Molekül zu isolieren (z. B. spezifische Protein-Bindungsstellen); (9) DNA-Segmente, die eine spezifische Nukleotid- Sequenz kodieren, die ansonsten nicht-funktionell sein kann (z. B. für PCR-Verstärkung oder Subpopulationen von Molekülen); und/oder (10) DNA-Segmente, die bei Abwesenheit besonderen Verbindungen direkt oder indirekt Sensitivität verleihen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Selektionschema: ist irgendein Verfahren, das Selektion, Anreicherung oder Identifikation eines gewünschten Produkts oder Produkt(en) aus einer Mischung erlaubt, die den Insert-Donor, Vektor-Donor, und/oder irgendwelche Zwischenprodukte (z. B. ein Fusionsprodukt), Nebenprodukte umfasst. Die Selektionsschemen von einer bevorzugten Ausführungsform weisen wenigstens zwei Komponenten auf, die während der rekombinanten Klonierung entweder verknüpft oder unverknüpft sind. Eine Verbindung ist ein selektierfähiger Marker. Die andere Verbindung steuert die Expression in vitro des selektierfähigen Markers oder das Überleben der Zelle, die das Plasmid beherbergt, das den selektierfähigen Marker trägt. Im Allgemeinen wird dieses Steuerelement ein Repressor oder Inducer des selektierfähigen Markers sein, aber andere Mittel zum Steuern der Expression des selektierfähigen Markers können verwendet werden. Ob ein Repressor oder Aktivator verwendet werden wird, wird davon abhängen, ob der Marker für eine positive oder negative Selektion ist, und von der genauen Anordnung der verschiedenen DNA-Segmente, wie es dem Fachmann sofort klar sein wird. Ein bevorzugter Anspruch ist, dass das Selektionsschema zur Selektion oder Anreicherung nur eines oder mehrerer gewünschter Produkte führt. Wie hier definiert, umfasst das Selektieren für ein DNA-Molekül (a) Selektieren oder Anreichern für das Vorhandensein des gewünschten DNA-Moleküls und (b) Selektieren oder Anreichern gegen das Vorhandensein von DNA-Molekülen, die nicht das gewünschte DNA-Molekül sind.
In einer Ausführungsform werden die Selektionsschemen (die umgekehrt ausgeführt werden können) eine von drei Formen annehmen, die im Hinblick auf Fig. 1 diskutiert werden. Die erste, die hier durch ein Beispiel mit einem selektierfähigen Marker und einem Repressor dafür erläutert sind, selektiert für Moleküle, die Segment D aufweisen und denen Segment C fehlt. Die zweite selektiert gegen Moleküle mit Segment C und für Moleküle mit Segment D. Mögliche Ausführungsformen der zweiten Form wird ein DNA-Segment aufweisen, das ein Gen trägt, das für Zellen toxisch ist, in denen die in vitro Reaktionsprodukte eingeführt werden müssen. Ein toxisches Gen kann eine DNA sein, die als ein toxisches Gen-Produkt (ein toxisches Protein oder RNA) exprimiert wird, oder kann in sich oder von sich aus toxisch sein. (In dem letzteren Fall ist es klar, dass das toxische Gen seine klassische Definition "Erbmerkmal" trägt.)
Beispiele eines derartigen toxischen Gens sind in dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen Restriktionsendonukleasen (z. B. DpnI) und Gene, die Wirte in der Abwesenheit einer unterdrückenden Funktion töten, z. B. kicB, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein toxisches Gen kann alternativ in vitro selektierfähig, z. B. eine Restriktionsstelle, sein.
In der zweiten Form trägt Segment D einen selektierfähigen Marker. Das toxische Gen wird Transformanten ausschließen, die die Vektor-Donor-, Fusionsprodukt- und Nebenprodukt- Moleküle beherbergen, während der selektierfähige Marker verwendet werden kann, um für Zellen, die das Produkt enthalten, und gegen Zellen zu selektieren, die nur den Insert-Donor beherbergen.
Die dritte Form selektiert für Zellen, die sowohl Segment A als auch D in cis auf dem selben Molekül enthalten, aber nicht für Zellen, die beide Segmente in trans auf verschiedenen Molekülen aufweisen. Dies kann durch einen selektierfähigen Marker ausgeführt werden, der in zwei inaktive Fragmente gespalten ist, wobei ein jedes auf Segment A und D ist.
Die Fragmente sind derart relativ zu den Rekombinationsstellen angeordnet, dass, wenn die Segmente durch das Rekombinationsereignis zusammen gebracht werden, sie einen funktionellen selektierfähigen Marker bilden. Zum Beispiel kann das Rekombinationsereignis einen Promoter mit einem Strukturgen verknüpfen, kann zwei Fragmente eines Strukturgens verknüpfen oder kann Gene verknüpfen, die ein heterodimeres Genprodukt kodieren, das zum Überleben benötigt wird, oder kann Abschnitte eines Replicons verknüpfen.
Stellen-spezifische Recombinase: ist ein Recombinasetyp, der typischerweise wenigstens die folgenden vier Aktivitäten aufweist: (1) Erkennen von einer oder zwei spezifischen DNA- Sequenzen; (2) Spalten der DNA-Sequenz oder -Sequenzen; (3) in Strang-Auswechselung involvierte DNA-Topoisomerase-Aktivität; und (4) DNA-Ligase-Aktivität zum Rekonstituieren der gespaltenen DNA-Stränge. Siehe Sauer, B., Current Opinions in Biotechnology 5: 521-527 (1994). Erhaltende Stellen-spezifische Rekombination wird von homologer Rekombination und Transposition durch einen Grad an Spezifizität für beide Partner unterschieden. Der Strang- Auswechselungs-Mechanismus involviert die Spaltung und das Wiederverbinden von spezifischen DNA-Sequenzen in der Abwesenheit von DNA-Synthese (Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 913-949).
Subklonierungsvektor: ist ein Klonierungsvektor, der ein ringförmiges oder lineares DNA- Molekül enthält, das ein geeignetes Replicon umfasst. In der vorliegenden Erfindung kann ein Subklonierungsvektor (Segment D in Fig. 1) ebenfalls funktionelle oder regulatorische Elemente enthalten, die gewünscht sind, in das Endprodukt eingebaut zu werden, um auf das oder mit dem klonierten DNA-Insert (Segment A in Fig. 1) zu wirken. Der Subklonierungsvektor kann ebenfalls einen selektierfähigen Marker (der in Segment C in Fig. 1 enthalten ist) enthalten.
Vektor: ist eine DNA, die eine nützliche biologische oder biochemische Eigenschaft für ein Insert bereitstellt. Beispiele umfassen Plasmide, Phagen und andere DNA-Sequenzen, die fähig sind, in vitro oder in einer Wirtszelle zu replizieren oder repliziert zu werden oder ein gewünschtes DNA-Segment zu einem gewünschten Ort in einer Wirtszelle zu befördern. Ein Vektor kann eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen-Erkennungsstellen auf weisen, bei denen die DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors geschnitten werden können und in denen ein DNA-Fragment gespleißt werden kann, um seine Replikation und Klonierung zu verursachen. Vektoren können weiterhin Primerstellen bereitstellen, z. B. für PCR, Transkriptions- und/oder Translationslationsinitiation und/oder- Regulierungsstellen, Rekombinationssignalen, Replicons, selektierfähige Marker, usw. Natürlich können Verfahren zum Insertieren eines gewünschten DNA-Fragments, die nicht die Verwendung von homologen Rekombinations- oder Restriktionsenzymen erfordern (wie UDG-Klonierung von PCR-Fragmenten (U. S. Patent Nr. 5,334,575, T:A-Klonierung und dergleichen, aber nicht darauf beschränkt) ebenso angewendet werden, um ein DNA-Fragment in einen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Klonierungsvektor zu klonieren. Der Klonierungsvektor kann weiterhin einen selektierfähigen Marker enthalten, der zur Verwendung bei der Identifizierung von Zellen geeignet ist, die mit dem Klonierungsvektor transformiert werden.
Vektor-Donor: ist eins der zwei Eltern-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung, das die DNA-Segmente trägt, die den DNA-Vektor kodieren, der Teil des gewünschten Produkts werden soll. Der Vektor-Donor enthält einen Subklonierungsvektor D (oder er kann der Klonierungsvektor genannt werden, wenn der Insert-Donor nicht bereits einen Klonierungsvektor enthält) und ein Segment C, der durch Rekombinationsstellen flankiert ist (siehe Fig. 1). Segment C und/oder D kann bzw. können Elemente enthalten, die zur Selektion des gewünschten Produkt-Tochtermoleküls beitragen, wie vorstehend für die Selektionsschemen beschrieben wurde. Die Rekombinationssignale können die gleichen oder verschieden sein und können durch die gleichen oder verschiedene Recombinasen bewirkt werden. Zudem kann der Vektor-Donor linear oder ringförmig sein:

Beschreibung

Ein allgemeines Schema für eine in vitro Verfahren der Erfindung ist in Fig. 1 gezeigt, wo ein Insert-Donor und der Vektor-Donor entweder ringförmige oder lineare DNA sein können, aber als ringförmig gezeigt ist. Vektor D wird gegen den ursprünglichen Klonierungsvektor A eingewechselt. Es ist wünschenswert, für den Tochtervektor, der Elemente A und D enthält, und gegen andere Moleküle, einschließlich ein oder mehrerer Fusionsprodukte(e) zu selektieren. Die Quadrate und Kreise sind verschiedene Sätze von Rekombinationsstellen (z. B. loxP-Stellen oder att-Stellen). Segment A oder D kann wenigstens einen Selektionsmarker, Expressionssignale, Replikationsursprünge oder spezialisierte Funktionen zum Detektieren, Selektionieren, Exprimieren, Zuordnen oder Sequenzieren von DNA enthalten, wobei D in diesem Beispiel verwendet wird.
Beispiele von gewünschten DNA-Segmenten, die ein Teil von Element A oder D sein können, umfassen PCR-Produkte, große DNA-Segmente, Genom-Klone oder -Fragmente, cDNA-Klone, funktionelle Elemente usw. und Gene oder Teilgene, die nützliche Nukleinsäuren oder Proteine kodieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Zudem kann die rekombinante Klonierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ex vivo und in vivo Gentransfervehikel für die Proteinexpression und/oder Gentherapie herzustellen.
In Fig. 1 stellt das Schema das gewünschte Vektoren D- und A-haltige Produkt wie folgt bereit. Der Insert-Donor (der A und B enthält) wird zuerst bei den Quadrat-Rekombinationsstellen durch Rekombinationsproteine mit dem Vektor-Donor (der C und D enthält) rekombiniert, um ein Fusionsprodukt mit jedem von A-D-C-B zu bilden. Dann findet bei den Kreis- Rekombinationsstellen Rekombination statt, um Produkt-DNA (A und D) und Nebenprodukt- DNA (C und B) zu bilden. Wenn gewünscht, können jedoch zwei oder mehrere verschiedene Fusionsprodukte gebildet werden, um zwei oder mehrere Produkte zu erzeugen.
In einer Ausführungsform des vorliegenden in vitro oder in vivo Rekombinations-Klonierungs- Verfahrens wird ein Verfahren zum Selektieren von wenigstens einer gewünschten Produkt- DNA bereit gestellt. Dies kann in Anbetracht der Zuordnung von Plasmid pEZC726 verstanden werden, die in Fig. 2 gezeigt ist. Die zwei beispielhaften Rekombinationsstellen sind attP und loxP. Auf einem durch diese Stellen definiertem Segment ist ein Kanamycin-Resistenz-Gen, dessen Promoter durch den tetOP Operator/Promoter von Transposon Tn10 ersetzt wurde. In der Abwesenheit vom tet-Repressor-Protein transkribiert E. coli RNA-Polymerase das Kanamycin- Resistenz-Gen von dem tetOP. Wenn der tet-Reperessor vorhanden ist, bindet er an tetOP und blockiert die Transkription des Kanamycin-Resistenzgens. Das andere Segment von pEZC726 weist das tet Repressorgen auf, das durch einen konstitutiven Promoter exprimiert wird. Durch pECZ726 transformierte Zellen sind folglich aufgrund des Chloramphenicolacetyltransferasegens auf dem gleichen Segment wie tetR zu Chloramphenicol resistent, aber zu Kanamycin sensitiv. Die Rekombinationsreaktionen führen zur Trennung des tetR-Gens von dem regulierten Kanamycin-Resistenzgens. Diese Trennung führt zur Kanamycin-Resistenz in Zellen, die das gewünschte Rekombinationsprodukt aufnehmen.
Zwei verschiedene Plasmidsätze wurden konstruiert, um das in vitro Verfahren zu demonstrieren. Ein Satz zur Verwendung nur mit Cre Recombinase (Klonierungsvektor 602 und Subklonierungsvektor 629 (Fig. 3)) enthielt loxP- und loxP 511-Stellen. Ein zweiter Satz zur Verwendung mit Cre und Integrase (Klonierungsvektor 705 und Subklonierungsvektor 726 (Fig. 2)) enthielt loxP- und att-Stellen. Die Produktionseffizienz des gewünschten Tochterplasmids war unter Verwendung von beiden Enzymen etwa 60-fach höher als unter Verwendung von Cre alleine. Neunzehn von vierundzwanzig Kolonien von der nur-Cre-Reaktion enthielten das gewünschte Produkt, während achtunddreißig von achtunddreißig Kolonien von der Integrase plus Cre-Reaktion das gewünschte Produkt-Plasmid enthielten.
Andere Selektionsschemen. Es können eine Vielfalt von Selektionsschemen verwendet werden, die in dem Fachgebiet bekannt sind, wenn sie für einen besonderen Zweck geeignet sind, für den die rekombinante Klonierung durchgeführt wird. In Abhängigkeit von individuellen Vorzügen und Bedürfnissen kann eine Anzahl von verschiedenen Typen von Selektionsschemen in dem rekombinanten Klonierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Fachmann kann einen Vorteil von der Verfügbarkeit der vielen DNA-Segmente oder Verfahren zu ihrer Herstellung und den verschiedenen Selektionsverfahren ziehen, die routinemäßig in dem Fachgebiet verwendet werden. Solche DNA-Segmente umfassen jene, die eine Aktivität wie die Herstellung von einer RNA, einem Peptid oder einem Protein kodieren, oder die Nereitstellung einer Bindungsstelle für derartige RNA, Peptid oder Protein, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele von DNA-Molekülen, die beim Planen eines Seletionsschemas verwendet werden, sind vorstehend unter der Definition "Selektionsschema" gegeben.
Zusätzliche Beispiele umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt:
(i) Erzeugung von neuen Primerstellen für PCR (z. B. Juxtaposition von zwei DNA- Sequenzen, die vorher nicht nebeneinandergestellt waren);
(ii) Einschluss einer DNA-Sequenz, die durch eine Restriktionsendonuklease oder andere DNA-modifizierende Enzyme, Chemikalien, Ribozyme usw. wirkt;
(iii) Einschluss einer DNA-Sequenz, die durch ein DNA-bindendes Protein, RNA, DNA, Chemikalie usw. erkannt wird) (z. B. zur Verwendung als ein Affinitäts-Etikett zum Selektieren für oder Ausschließen von einer Population) (Davis, Nucl. Acids Res. 24: 702- 706 (1996); J. Virol. 69: 8027-8034 (1995));
(iv) In vitro Selektion von RNA-Liganden für das ribosomale L22 Protein, das der Epstein- Barr-Virus-exprimierten RNA unter Verwendung von zufälligen und cDNA-abgeleiteten RNA-Bibliotheken zugeordnet ist;
(vi) Das Positionieren von funktionellen Elementen, deren Aktivität eine spezifische Orientierung oder Juxtaposition erfordert (z. B. (a) eine Rekombinationsstelle, die schlecht in trans reagiert, aber wenn sie in cis angeordnet ist, in der Gegenwart der geeigneten Proteine zur Rekombination führt, die gewisse Populationen von Molekülen zerstört; (z. B. Rekonstitution einer Promotersequenz, die in vitro RNA-Synthese erlaubt). Die DNA kann direkt verwendet werden oder kann revers transkribiert werden, um das gewünschte DNA-Konstrukt zu erhalten;
(vii) Selektion des gewünschten Produkts durch Größe (z. B. Fraktionieren) oder anderen physikalischen Eigenschaften des Moleküls bzw. der Moleküle; und
(viii) Einschluss einer DNA-Sequenz, die für eine spezifische Modifikation (z. B. Methylierung) erforderlich ist, die ihre Identifizierung erlaubt.
Nach Bildung des Produkts und Nebenprodukts in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann der Selektionsschritt entweder in vitro oder in vivo durchgeführt werden, in Abhängigkeit des besonderen Selektionsschemas, das wahlweise in der besonderen rekombinanten Klonierungsprozedur geplant wurde.
Ein in vitro Selektionsverfahren kann zum Beispiel für die Insert-Donor- und Vektor-Donor- DNA-Moleküle geplant werden. Ein derartiges Schema kann das Manipulieren einer seltenen Rekombinationsstelle in den ringförmigen Ausgangsvektoren derart involvieren, dass die seltenen Schnittstellen nach den Rekombinationsereignissen in dem Nebenprodukt enden. Wenn das Restriktionsenzym, das die seltene Restriktionsstelle bindet und schneidet, zu der Reaktionsmischung in vitro zugegeben wird, werden folglich alle der DNA-Moleküle, die die seltene Schnittstelle tragen, d. h. die Ausgangs-DNA-Moleküle, das Fusionsprodukt und das Nebenprodukt, geschnitten und in der beabsichtigten Wirtszelle nicht-replizierbar gemacht. Schnittstellen B und C (siehe Fig. 1) können zum Beispiel verwendet werden, um gegen alle Moleküle mit Ausnahme des Produkts zu selektieren. Alternativ wird nur eine Schnittstelle in C benötigt, wenn man in der Lage ist, für Segment D, z. B. durch ein nicht auf B gefundenes Medikament-Resistenzgen zu selektieren.
Genauso kann ein in vitro Selektionsverfahren bei der Handhabung mit linearen DNA- Molekülen geplant werden. Zu einer PCR-Primer-Sequenz komplementäre DNA-Sequenzen können so manipuliert werden, dass sie durch das rekombinante Klonierungsverfahren nur auf das Produktmolekül übertragen werden. Nachdem die Reaktionen vollendet waren, werden die geeigneten Primer zu der Reaktionslösung zugegeben und die Probe wird PCR unterworfen. Das ganze oder ein Teil des Produkts wird folglich verstärkt.
Andere in vivo Selektionsschemen können mit einer Vielfalt von E. coli Zell-Linien verwendet werden. Eins ist ein Repressorgen auf ein Segment des Subklonierungsplasmids und ein Medikament-Marker, der durch den Repressor gesteuert wird, auf das andere Segment des gleichen Plasmids anzuordnen. Ein anderes ist, ein Killergenauf Segment C des Subklonierungsplasmids anzuordnen (Fig. 1). Natürlich muss ein Weg existieren, um solch ein Plasmid zu züchten, d. h. es müssen Umstände existieren, unter denen das Killergen nicht töten wird. Es gibt eine Anzahl von diesen bekannten Genen, die besondere Arten von E. coli erfordern. Ein solches Schema ist, das Restriktionsenzym DpnI zu verwenden, das nicht spalten wird, bis seine Erkennungssequenz GATC methyliert wird. Viele weitverbreitete allgemeine E. coli Arten methylieren GATC-Sequenzen, aber es gibt Mutanten, in denen kloniertes DpnI ohne Schaden exprimiert werden kann.
Analoge Selektionsschemen können natürlich für andere Wirtsorganismen geplant werden. Der tet Repressor/Operator von Tn10 wurde zum Beispiel angepasst, um Gen-Expression in Eukaryoten zu steuern (Gossen, M. und Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Die gleiche Steuerung von Medikamenten-Resistenz, die hier durch den tet Repressor beispielhaft erläutert ist, kann angewendet werden, um für das Produkt in eukaryotischen Zellen zu selektieren.

Rekombinationsproteine

In der vorliegenden Erfindung wird die Auswechselung von DNA-Segmenten durch die Verwendung von Rekombinationsproteinen, einschließlich von Recombinasen und zugeordneten Co-Faktoren und Proteinen erreicht. Verschiedene Rekombinationsproteine sind in dem Fachgebiet beschrieben. Beispiele von solchen Recombinasen umfassen:
Cre: Ein Protein von Bakteriophage P1 (Abremski und Hoess, J. Biol. Chem. 259(3): 1509-1514 (1984)) katalysiert die Auswechselung (d. h. verursacht Rekombination) zwischen 34 bp DNA- Sequenzen, die loxP-Stellen (Kreuzungsort bzw. Crossing-over-Ort) genannt werden (siehe Hoess et al. Nucl. Acids Res. 14(5): 2287 (1986)). Cre ist kommerziell erhältlich (Novagen, Katalog Nr. 69247-1). Eine Rekombination, die durch Cre vermittelt wird, ist ungehindert reversibel. Es ist aus thermodynamischen Betrachtungen nicht überraschend, dass Cre-vermittelte Integration (Rekombination zwischen zwei Molekülen, um ein Molekül zu bilden) sehr viel weniger effizient ist, als Cre-vermittelte Exzision (Rekombination zwischen zwei loxP-Stellen in dem gleichen Molekül, um zwei Tochtermoleküle zu bilden). Cre arbeitet in einfachen Puffern mit entweder Magnesium oder Spermidin als ein Cofaktor, wie in dem Fachgebiet wohlbekannt ist. Die DNA-Substrate können entweder linear oder supercoilt sein. Eine Anzahl von mutanten loxP-Stellen wurde beschrieben (Hoess et al., supra). Eine von diesen, loxP 511, rekombiniert mit einer anderen loxP 511-Stelle, aber wird nicht mit einer loxP-Stelle rekombinieren.
Integrase: Ein Protein von Bakteriophage lambda, das die Integration des lambda Genoms in das E. coli Chromosom vermittelt. Die Bakteriophage λ Int Rekombinationsproteine fördern die irreversible Rekombination zwischen seinen Substrat-att-Stellen als ein Teil der Bildung oder Induktion eines lysogenen Zustands. Die Reversibilität der Rekombinationsreaktionen resultieren aus zwei unabhängigen Wegen für Intergrations- und Exzisions-Rekombination. Jeder Weg verwendet einen einmaligen, aber überlappenden Satz der 15-Proteinbindungsstellen, die att- Stellen-DNAs enthalten. Kooperative und kompetitive Wechselwirkungen, die vier Proteine (Int, Xis, IHF und FIS) involvieren, bestimmen die Rekombinationsrichtung.
Eine Integrationsrekombination involviert die Int- und IHF-Proteine und Stellen attP (240 bp) und attB (25 bp). Die Rekombination führt zu der Bildung von zwei neuen Stellen: attL und attR. Eine Exzisionsrekombination erfordert Int, IHF und Xis und Stellen attL und attR, um attP und attB zu erzeugen. Unter bestimmten Bedingungen stimuliert Fis Exzisionsrekombination. Zusätzlich zu diesen normalen Reaktionen sollte es klar sein, dass attP und attB, wenn sie in dem selben Molekül angeordnet sind, Exzisionsrekombination fördern können, um zwei Exzisionsprodukte zu erzeugen, eins mit attL und eins mit attR. Genauso kann eine intermolekulare Rekombination zwischen Molekülen, die attL und attR enthalten, in der Gegenwart von Int, IHF und Xis zu Integrationsrekombination und der Erzeugung von attP und attB führen. Durch Flankieren von DNA-Segmenten mit geeigneten Kombinationen von manipulierten att-Stellen in der Gegenwart der geeigneten Rekombinationsproteine kann man Exzisions- oder Integrationsrekombination als reverse Reaktionen voneinander lenken.
Jede der att-Stellen enthält eine 15 bp Kernsequenz; individuelle Sequenzelemente von funktioneller Bedeutung liegen in, außerhalb und durch den Rand dieses gemeinsamen Kerns (Landy, A. Ann. Rev. Biochem. 58: 913 (1989)). Eine effiziente Rekombination zwischen den verschiedenen att-Stellen erfordert, dass die Sequenz der zentralen allgemeinen Region zwischen den rekombinierenden Partnern identisch sein muss, es wird jedoch nun festgestellt, dass die genaue Sequenz modifizierbar ist. Es ist nun folglich entdeckt worden, dass Derivate der att- Stelle mit Änderungen in dem Kern wenigstens so effizient wie die nativen Kernsequenzen sind.
Integrase wirkt, um die attP-Stelle auf Bakteriophage lambda (etwa 240 bp) mit der attB-Stelle auf dem E. coli Genom (etwa 25 bp) zu rekombinieren, (Weisberg, R. A. und Landy, A. in Lambda II, S. 211 (1983), Cold Spring Harbor Laboratory)) um das integrierte lambda Genom herzustellen, das durch die attL- (etwa 100 bp) und attR- (etwa 160 bp) Stelle flankiert ist. In der Abwesenheit von Xis (siehe nachstehend) ist diese Reaktion im Wesentlichen irreversibel. Die Integrationsreaktion, die durch Integrase und IHF vermittelt wird, arbeitet in vitro mit einem einfachen Puffer, der Spermidin enthält. Integrase kann wie von Nash, H. A., Methods of Enzymology 100: 210-216 (1983) beschrieben, erhalten werden. UlF kann wie durch Filutowicz, M. et al., Gene 147: 149-150 (1994) beschrieben, erhalten werden.
In der Gegenwart des X-Proteins Xis katalysiert (exzidiert) Integrase die Reaktion von attR und attL, um attP und attB zu bilden, d. h. sie fördert die Umkehr der vorstehend beschriebenen Reaktion. Diese Reaktion kann auch auf die vorliegende Erfindung angewendet werden.
Andere Rekombinationssysteme. Zahlreiche Rekombinationssysteme aus verschiedenen Organismen können ebenfalls, basierend auf der hier bereitgestellten Lehre und Anleitung, verwendet werden. Siehe, z. B. Hoess et al., Nucleic Acids Research 14(6) (1986); Abremski et al., J. Biol. Chem. 261(1): 391 (1986); Campbell, J. Bacteriol. 174(23): 7495 (1992); Quian et al., J. Biol. Chem. 267(11): 7794 (1992); Araki et al., J. Mol. Biol. 225(1): 25 (1992)). Viele von diesen gehören zu der Integrease-Familie von Recombinasen (Argos et al. EMBO J. 5: 433-440 (1986)). Die am besten untersuchten Systeme von diesen sind vielleicht das Integrase/att-System von Bakteriophage λ (Landy, A. (1993) Current Opinions in Genetics and Devel. 3: 699-707), das Cre/loxP-System von Bakteriophage P1 (Hoess und Abremski (1990) in Nucleic Acids and Molecular Biology, Bd. 4, Edss.: Eckstein und Lilley, Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, Seiten 90-109) und das FLP/FRT-System des Saccharomyces cerevisae 2 u Ringplasmids (Broach et al. Cell 29: 227-234 (1982)).
Mitglieder einer zweiten Familie von Stellen-spezifischen Recombinasen, der Resolvase-Familie (z. B., γδ, Tn3 Resolvase; Hin, Gin und Cin) sind ebenfalls bekannt. Mitglieder dieser hochzugehörigen Familie von Recombinasen sind typischerweise zu intramolekularen Reaktionen (z. B. Inversionen und Exzisionen) gezwungen und können Wirt-kodierende Faktoren erfordern. Es wurden Mutanten isoliert, die einige der Erfordernisse für Wirtsfaktoren (Maeser und Kahnmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176) ebenso wie einige der intramolekularen Rekombinationszwänge abnehmen.
Andere, zu λ Int und ähnliche und zu P1 Cre ähnliche Stellen-spezifische Recombinasen können für Int und Cre substituiert werden. Solche Recombinasen sind bekannt. In vielen Fällen wurde die Reinigung von solchen anderen Recombinasen in dem Fachgebiet beschrieben. In Fällen, in denen sie nicht bekannt sind, können Zellextrakte verwendet werden oder die Enzyme können teilweise unter Verwendung von Prozeduren gereinigt werden, die für Cre und Int beschrieben sind.
Während Cre und Int aus beispielhaften Gründen detailliert beschrieben sind, existieren viele zugeordnete Recombinase-Systeme und ihre Anwendung auf die beschriebene Erfindung ist gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Die Integrase-Familie von Stellen- spezifischen Recombinasen kann verwendet werden, um alternative Rekombinationsproteine und Rekombinationsstellen für die vorliegende Erfindung bereitzustellen, wie Stellen-spezifische Rekombinationsproteine, die durch Bakteriophage lambda, phi 80, P22, P2, 186, P4 und P1 kodiert werden. Diese Gruppe von Proteinen zeigt eine unerwartet große Diversität an Sequenzen. Trotz dieser Diversität können alle der Recombinasen in ihren C-End-Hälften ausgerichtet werden.
Eine Region mit 40 Resten in der Nähe des C-Endes wird in allen Proteinen besonders gut erhalten und ist zu einer Region in der Nähe des C-Endes des Hefe 2 mu Plasmid Flp Proteins homolog. Drei Positionen werden in dieser Familie perfekt erhalten: Histidin, Arginin und Tyrosin werden bei jeweiligen Ausrichtungspositionen 396, 399 und 433 in der wohl-erhaltenen C-End-Region gefunden. Diese Reste tragen zu der Wirkstelle dieser Familie von Recombinasen bei und suggerieren, dass Tyrosin-433 eine vorübergehende kovalente Bindung zur DNA während der Strangspaltung und -wiederverbindung bildet. Siehe, z. B. Argos, P. et al., EMBO J. 5: 433-40 (1986).
Alternativ können IS231 und andere Bacillus thuringienis transponierbare Elemente als Rekombinationsproteine und Rekombinationsstellen verwendet werden. Bacillus thuringiensis ist ein entomopathogenes Bakterium, dessen Toxizität sich auf der Gegenwart in dem Sporangium von delta-Endotoxin-Kristallen begründet, die gegen landwirtschaftliche Plagen und Vektoren von humanen und animalen Krankheiten aktiv ist. Die meisten der Gene, die für diese Toxinproteine kodieren, sind Plasmid-übertragen und sind im Allgemeinen strukturell mit den Insertionssequenzen (IS231, IS232, IS240, ISBT1, und ISBT2) und Transposons (Tn4430 und Tn5401) verwandt. Es wurde gezeigt, dass einige diese mobilen Elemente aktiv sind und an der Kristall-Gen-Mobilität teilhaben, wobei sie dadurch zu der Variation der bakteriellen Toxizität beitragen.
Eine strukturelle Analyse der iso-IS231 Elemente zeigt an, dass sie mit IS1151 von Costridium perfringens verwandt sind und mit IS4 und IS186 von Escherichia coli entfernt verwandt sind. Wie die anderen IS4 Familien-Mitglieder enthalten sie ein erhaltenes Transposase-Integrase- Motiv, das in anderen IS-Familien und Retroviren gefunden wird.
Zudem zeigen funktionelle Daten, die von IS231A in Escherichia coli gesammelt wurden einen nicht-replikativen Transpositionsmodus mit einer Bevorzugung für spezifische Targets. Ähnliche Resultate wurden in Bacillus subtilis und B. thuringiensis erhalten. Siehe, z. B. Mahillon, J. et al., Genetica 93: 13-26 (1994); Campbell, J. Bacteriol. 7495-7499 (1992).
Die Recombinasemenge, die zugegeben wird, um die Rekombinationsreaktion anzutreiben, kann unter Verwendung von bekannten Assays bestimmt werden. Im Speziellen wird ein Titrationsassy verwendet, um die geeignte Menge von einem gereinigten Recombinaseenzym oder die geeignete Menge von einem Extrakt zu bestimmen.
Manipulierte Rekombinationsstellen. Die vorstehenden Recombinasen und entsprechenden Rekombinationsstellen sind zur Verwendung bei der Rekombinationsklonierung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Wild-Typ Rekombinationsstellen enthalten jedoch Sequenzen, die die Effizienz oder Spezifizität von Rekombinationsreaktionen, wie sie in Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden, reduzieren. Multiple Stop-Codons in attB-, attR-, attL- und loxP-Rekombinationsstellen treten zum Beispiel in multiplen Leserahmen auf beiden Strängen auf, so dass dass Rekombinationseffizienzen reduziert, z. B., wenn die Kodierungssequenz die Rekombinationsstellen kreuzen muss (nur ein Leserahmen ist auf jedem Strang von loxP- und attB-Stellen erhältlich) oder unmöglich sind (in attP, attR oder attL).
Demgemäß verwendet die vorliegende Erfindung manipulierte Rekombinationsstellen, die diese Probleme überwinden. att-Stellen können zum Beispiel manipuliert werden, um eine oder multiple Mutationen aufzuweisen, um die Spezifizität oder Effizienz der Rekombinationsreaktion und die Eigenschaften von Produkt-DNAs (z. B. att1-, att2- und att3- Stellen) zu verbessern; um Umkehrreaktion zu vermindern (z. B. Entfernen von P1 und H1 von attB). Das Testen dieser Mutanten bestimmt welche Mutanten eine ausreichende Rekombinationsaktivität ergeben, um zur Rekombinationssubklonierung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet zu sein.
Mutationen können deshalb in Rekombinationsstellen eingeführt werden, um die Stellen- spezifische Rekombination zu verbessern. Solche Mutantionen umfassen: Rekombinationsstellen ohne Translations-Stop-Codons, die Fusionsproteinen erlauben, kodiert zu werden; Rekombinationsstellen, die durch die gleichen Proteine erkannt werden, aber sich in der Basensequenz unterscheiden, so dass sie allgemein oder ausschließlich mit ihren Partnern reagieren, wobei sie multiple, zu erwartende Reaktionen erlauben, sind aber nicht darauf beschränkt. Welche besonderen Reaktionen stattfinden, kann dadurch spezifiziert werden, welche besonderen Partner in der Reaktionsmischung vorhanden sind. Ein dreiteiliges Fusionsprotein kann zum Beispiel mit Eltern-Plasmiden ausgeführt werden, die Rekombinationsstellen attR1 und attR2; attL1 und attL3; und/oder attR2 und attL2 enthalten.
Es gibt wohlbekannte Verfahren zum Einführen von spezifischen Mutationen in Nukleinsäuresequenzen. Eine Anzahl von diesen ist in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1989-1996) beschrieben. Mutationen können in Oligonukleotiden, die verwendet werden können, um vorhandene klonierte Sequenzen zu modifizieren, oder in Verstärkungsreaktionen ausgelegt werden. Zufällige Mutagenese kann auch verwendet werden, wenn geeignete Selektionsverfahren verfügbar sind, um die gewünschte mutante DNA oder RNA zu isolieren. Die Gegenwart der gewünschten Mutationen kann durch Sequenzieren der Nukleinsäure durch wohlbekannte Verfahren bestätigt werden.
Die folgenden, nicht-einschränkenden Verfahren können verwendet werden, um eine Kern- Region einer gegebenen Rekombinationsstelle zum Bereitstellen von mutierten Stellen zu manipulieren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind:
1. Durch Rekombination von zwei Eltern-DNA-Sequenzen durch Stellen-spezifische (z. B. attL und attR, um attB zu ergeben) oder anderen (z. B. homologen) Rekombinationsmechanismen. Die DNA-Eltern-DNA-Segmente, die eine oder mehrere Basenwechsel enthalten, führen zu der End-Kemsequenz;
2. durch Mutation oder Mutagenese (Stellen-spezifisch, PCR, zufällig, spontan usw.) direkt von der gewünschten Kernsequenz;
3. durch Mutagenese (Stellen-spezifisch, PCR, zufällig, spontan usw.) von Eltern-DNA- Sequenzen, die rekombiniert werden, um eine gewünschte Kernsequenz zu erzeuge; und
4. durch reverse Transcription einer RNA, die die gewünschte Kernsequenz kodiert.
Die Funktionalität der mutanten Rekombinationsstellen können auf Wegen demonstriert werden, die von der besonderen Charakteristik abhängt, die gewünscht ist. Das Fehlen eines Translations- Stop-Codons in einer Rekombinationsstelle kann zum Beispiel durch Exprimieren der passenden Fusionsproteine demonstriert werden. Die Rekombinationsspezifizität zwischen homologen Partnern kann durch Einführen der passenden Moleküle in in vitro Reaktionen und Testen auf Rekombinationsprodukte demonstriert werden, wie hier beschrieben ist oder in dem Fachgebiet bekannt ist. Andere gewünschte Mutationen in Rekombinationsstellen können die Gegenwart oder Abwesenheit von Restriktionsstellen, Translations- oder Transcriptions-Startsignalen, Prvteinbindungsstellen und anderen bekannten Funktionalitäten von Nukleinsäure-Base- Sequenzen umfassen. Genetische Selektionsschemen für besondere funktionelle Merkmale in den Rekombinationsstellen können gemäß bekannten Verfahrensschritten verwendet werden. Die Modifikation von Stellen zum Bereitstellen (von einem Paar von Stellen, die nicht miteinander wechselwirken) von Partnern, die nicht wechselwirken, kann zum Beispiel durch Erfordern von Deletion, durch Rekombination zwischen den Stellen, einer DNA-Sequenz erreicht werden, die eine toxische Substanz kodiert. Die Selektion von Stellen, die Translations-Stop-Sequenzen entfernen, die Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinbindungsstellen usw. kann genauso einfach durch den Fachmann geplant werden.
Demgemäß verwendet die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das wenigstens ein DNA-Segment mit wenigstens zwei manipulierten Rekombinationsstellen, die durch einen selektierfähigen Marker flankiert sind, und/oder ein gewünschtes DNA-Segment enthält, wobei wenigstens eine der Rekombinationsstellen eine Kernregion mit wenigstens einer manipulierten Mutation enthält, die Rekombination in vitro bei der Bildung einer Fusionsprodukt-DNA oder einer Produkt-DNA verbessert.
Das Nukleinsäuremolekül kann wenigstens eine Mutation aufweisen, die wenigstens eine Verbesserung der Rekombination verleiht, wobei die Verbesserung aus der Gruppe ausgewählt ist von im Wesentlichen (i) Bevorzugen von exzisiver Integration; (ii) Bevorzugen von exzisiver Rekombination; (ii) Erleichtern der Anforderung für Wirtsfaktoren; (iii) Steigern der Effizienz der Fusionsprodukt-DNA- oder Produkt-DNA-Bildung.
Das Nukleinsäuremolekül enthält vorzugsweise wenigstens eine Rekombinationsstelle, die von attB, attP, attL oder attR abgeleitet ist. Noch bevorzugter ist die att-Stelle aus att1, att2 oder att3 ausgewählt, wie hier beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Kernregion eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
und einer entsprechenden oder komplementären DNA- oder RNA-Sequenz, wobei R = A oder G; K = G oder T/U; Y = C oder T/U; W = A oder Im; N = A oder C oder G oder T/U; S = C oder G; und B = C oder G oder T/U, wie in 37 C. F. R. § 1.822 dargestellt ist, wobei die Kernregion nicht einen Stop-Codon in einem oder mehreren Leserahmen enthält.
Die Kernregion enthält ebenfalls vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
oder einer entsprechenden oder komplementären DNA- oder RNA-Sequenz.
Die vorliegende Erfindung verwendet folglich ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäuremoleküls, welches Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls mit wenigstens einer manipulierten Rekombinationsstelle umfasst, die wenigstens eine DNA-Sequenz mit wenigstens 80-99% Homologie (oder irgendeinen Bereich oder Wert darin) zu wenigstens einer der SEQ ID Nummern: 1-16 oder irgendeine geeignete Rekombinationsstelle oder die unter strengen Bedingungen dazu hybridisiert, wie in dem Fachgebiet bekannt ist, enthält.
Natürlich gibt es verschiedene Typen und Permutationen von solchen wohlbekannten in vitro und in vivo Selektionsverfahren, wobei um der Kürze willen nicht jedes von ihnen hier beschrieben ist. Es wird jedoch beabsichtigt und erwägt, dass solche Variationen und Permutationen die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind.
Es ist wichtig zu bemerken, dass als eine Folge der bevorzugten Ausführungsform, die in vitro Rekombinationsreaktionen sind, nicht-biologische Moleküle wie PCR-Produkte durch das vorliegende rekombinante Klonierungsverfahren manipuliert werden können. In einem Beispiel ist es möglich, lineare Moleküle in ringförmige Vektoren zu klonieren.
Es gibt eine Anzahl von Anwendungen für die vorliegende Erfindung. Die Verwendungen umfassen Ändern von Vektoren, Appositionieren von Promotoren mit Genen, Konstruieren von Genen für Fusionsproteine, Ändern der Kopienanzahl, Ändern von Replikons, Klonieren in Phagen oder Klonieren von, z. B. PCR-Produkten (mit einer attB-Stelle an einem Ende und einer loxP-Stelle an dem anderen Ende), Genom-DNA's oder cDNA's, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Beispiele bestimmte bevorzuge Ausführungsformen der Erfindung weiterhin veranschaulichen, aber es, ist nicht beabsichtigt, dass sie eine einschränkende Natur aufweisen.

Beispiele

Das vorliegende rekombinante Klonierungsverfahren in vitro verwirklicht die Auswechselung von Nukleinsäuresegmenten, um sie für den Benutzer etwas nützlich zu machen, wie eine Auswechselung von Klonierungsvektoren. Diese Segmente müssen an beiden Seiten durch Rekombinationssignale flankiert sein, die in der passenden Orientierung in Bezug zueinander sind. In den nachstehenden Beispielen werden die zwei Eltern-Nukleinsäure-Moleküle (z. B. Plasmide) der Insert-Donor und der Vektor-Donor genannt. Der Insert-Donor enthält ein Segment, das mit einem neuen Vektor verbunden wird, der durch den Vektor-Donor beigetragen wird. Das bzw. die Rekombinations-Zwischenprodukt(e), das bzw. die beide Ausgangsmoleküle enthält bzw. enthalten, wird das bzw. die Fusionsprodukt(e) genannt. Das zweite Rekombinationsereignis erzeugt zwei Tochtermoleküle, die das Produkt (der gewünschte neue Klon) und das Nebenprodukt genannt werden.

Puffer

Verschiedene bekannte Puffer können in den Reaktionen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für Restriktionsenzyme ist es empfehlenswert, die von dem Hersteller empfohlenen Puffer zu verwenden. Alternative Puffer können sofort in der Literatur gefunden werden oder können durch den Fachmann geplant werden.
Beispiele 1-3. Ein beispielhafter Puffer für lambda Integrase umfasst 50 mM Tris-HCl bei pH 7,5-7,8, 70 mM KCl, 5 mM Spermidin, 0,5 mM EDTA und 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin und wahlweise 10% Glycerol.
Ein bevorzugter Puffer für P1 Cre Recombinase umfasst 50 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 33 mM NaCl, 5 mM Spermidin und 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin.
Der Puffer für andere Stellen-spezifische Recombinasen, die zu lambda Int und P1 Cre ähnlich sind, sind entweder im Fachgebiet bekannt oder können empirisch durch den Fachmann, insbesondere im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Puffer, bestimmt werden.

Beispiel 1: Rekombinante Klonierung unter Verwendung von Cre und Cre & Int

Zwei Paare von Plasmiden wurden konstruiert, um das in vitro rekombinante Klonierungsverfahren auf zwei verschiedene Weisen durchzuführen. Ein Paar, pEZC705 und pECZ726 (Fig. 2A), war mit loxP- und att-Stellen konstruiert, um mit Cre und λ Integrase verwendet zu werden. Das andere Paar, pEZC602 und pEZC629 (Fig. 3A), enthielt die loxP- (Wild-Typ) Stelle für Cre und eine zweite mutierte lox-Stelle, loxP 511, die sich von loxP in einer Base (von insgesamt 34) unterscheidet. Die minimale Anforderung für die rekombinante Klonierung der vorliegenden Erfindung sind zwei Rekombinationsstellen in jedem Plasmid, im Allgemeinen X und Y und X' und Y'. Die rekombinante Klonierung findet statt, wenn einer oder beide Stellentypen rekombinieren können, um ein Fusionsprodukt (z. B. X und X') zu bilden und wenn einer oder beide (aber notwendigerweise eine Stelle, die von dem Typen verschieden ist, der das Fusionsprodukt bildet) rekombinieren können, um das Produkt und Nebenprodukt- Plasmid aus dem Fusionsprodukt (z. B. Y und Y') zu exzidieren. Es ist wichtig, dass die Rekombinationsstellen auf dem gleichen Plasmid nicht rekombinieren. Es wurde festgestellt, dass die vorliegende rekominante Klonierung nur mit Cre alleine durchgeführt werden kann.

Nur Cre

Es wurden zwei Plasmide konstruiert, um diese Idee zu demonstrieren (siehe Fig. 3A). pECZ629 war das Vektor-Donor-Plasmid. Es enthielt einen konstitutiven Medikamenten-Marker (Chloramphenicol-Resistenz), einen Replikationsursprung, loxP- und loxP 511-Stellen, einen bedingten Medikamenten-Marker (Kanamycin-Resistenz, dessen Expresion durch den Operator/Promoter des Tetracyclin-Operons von Transposon Tn10 gesteuert wird) und ein konstitutiv exprimiertes Gen für das tet Repressor Protein tetR. E. coli Zellen, die pECZ629 enthielten, waren zu Chloramphenicol bei 30 ug/ml resistent, aber zu Kanamycin bei 100 ug/ml sensitiv. PEZC602 war das Insert-Donor-Plasmid, das einen verschiedenen Medikamenten- Marker, einen Ursprung und loxP- und loxP 511-Stellen enthielt, die eine multiple Klonierungsstelle flankieren.
Dieses Experiment war folgendermaßen aus zwei Teilen zusammengesetzt:
Teil I: Etwa 75 ng von jedem von pEZC606 und pEZC629 wurden in einem Gesamtvolumen von 30 ul Cre-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 33 mM NaCl, 5 mM Spermidin-HCl, 500 ug/ml Rinderserumalbumin) gemischt. Zwei 10 ul Aliquote wurden in zwei neue Rohre überführt. Ein Rohr empfing 0,5 ul Cre-Protein (etwa 4 Einheiten pro ml; teilweise gemäß Abremski und Hoess, J. Biol. Chem. 259: 1509 (1984) gereinigt). Beide Rohre wurden 30 Minuten lang bei 37ºC, dann 10 Minuten lang bei 70ºC inkubiert. Aliquote von jeder Reaktion wurden verdünnt und in DH5α überführt. Im Anschluss an die Expression wurde die Aliquote auf 30 ug/ml Chloramphenicol; 100 ug/ml Ampicillin plus 100 ug/ml Methicillin; oder 100 ug/ml Kanamycin plattiert. Resulate: Siehe Tabelle 1. Die Reaktion ohne Cre ergab 1,11 · 10&sup6; Ampicillin-resistente Kolonien (von dem Insert-Donor-Plasmid pEZC602); 7,8 · 10&sup5; Chloramphenicol-resistente Kolonien (von dem Vektor-Donor-Plasmid pEZC629); und 140 Kanymycin-resistente Kolonien (Background). Die Reaktion mit zugesetztem Cre ergab 7,5 · 10&sup5; Ampicillin-resistente Kolonien (von dem Insert-Donor-Plasmid pEZC602); 6,1 · 10&sup5; Chloramphenicol-resistente Kolonien (von dem Vektor-Donor-Plasmid pEZC629); und 760 Kanymycin-resistente Kolonien (Mischung von Background-Kolonien und Kolonien von dem rekombinanten Klonierungsprodukt-Plasmid). Analyse: Weil die Anzahl von Kolonien auf den Kanamycin-Platten in der Gegenwart von Cre viel höher war, wurde vorhergesagt, dass viele oder die meisten von ihnen das gewünschte Produkt-Plasmid enthielten.
Teil II: Vierundzwanzig Kolonien von den "+Cre" Kanamycin-Platten wurden gewählt und in ein Medium inokuliert, das 100 ug/ml Kanamycin enthielt. Minipreps wurden hergestellt und die Miniprep-DNAs, die ungeschnitten oder mit Smal oder HindIII geschnitten waren, wurden elektrophoresiert. Resultate: 19 der 24 Minipreps zeigten supercoiltes Plasmid von der Größe, die für das Produkt-Pkasmid vorhergesagt war. Alle 19 zeigten die vorhergesagten Smal und HindIII Restriktionsfragmente. Analyse: Das Nur-Cre-Schema wurde demonstriert. Insbesondere wurde bestimmt, dass es etwa 70% (19 von 24) Produktklone ergab. Die Effizienz war etwa 0,1% (760 Kanamycin-resistente Klone, die von 6,1 · 10&sup5; Chloeamphenicol-resistenten Kolonien resultierten).

Cre plus Integrase

Die Plasmide, die zum Demonstrieren dieses Verfahren verwendet wurden, sind exakt analog zu den vorstehend verwendeten, mit der Ausnahme, dass pEZC726, das Vektor-Donor-Plasmid, eine attP-Stelle anstelle von loxP 511 enthielt und pEZC705, das Insert-Donor-Plasmid, eine attB-Stelle anstelle von loxP 511 enthielt (Fig. 2A).
Dieses Experiment war folgendermaßen aus drei Teilen zusammengesetzt:
Teil I: Etwa 500 ng pEZC705 (das Insert-Donor-Plasmid) wurde mit Scal geschnitten, welche das Plasmid in dem Ampicillin-Resistenz-Gen linearisierte. (Dies wurde getan, weil die λ Integrase-Reaktion historisch mit dem attB-Plasmid in einem linearen Zustand durchgeführt wurde (H. Nash, persönliche Mitteilung). Es wurde jedoch später festgestellt, dass die Integrase- Reaktion gut mit beiden supercoilten Plasmiden fortschreitet. Dann wurde das lineare Plasmid mit Ethanol ausgefällt und in 20 ul Integrase-Puffer (50 mM Tris-HCl, etwa pH 7,8, 70 mM KCl, 5 mM Spermidin-HCl, 0,5 mM EDTA, 250 ug Rinderserumalbumin) gelöst. Es wurden ebenfalls etwa 500 ng des Vektor-Donor-Plasmids pEZC726 mit Ethanol ausgefällt und in 20 ul λ Integrase-Puffer gelöst. Genau vor der Verwendung, wurde λ Integrase (2 ul, 393 ug/ml) getaut und durch Zugeben von 18 ul kalten λ Integrase-Puffer verdünnt. Ein ul IHF (Integrations- Wirtsfaktor, 2,4 mg/ml, ein Hilfsprotein) wurde in 150 ul kalten λ Integrase Puffer verdünnt. Aliquote (2 ul) von jeder DNA wurden mit λ Integrase-Puffer, mit oder ohne 1 ul von jeweils λ Integrase und IHF, zu insgesamt 10 ul gemischt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei 25ºC, dann 10 Minuten lang bei 70ºC inkubiert. Die Hälfte von jeder Reaktion wurde auf ein Agarosegel aufgebracht. Resultate: In der Gegenwart von Integrase und IHF wurden etwa 5% der Gesamt-DNA in eine lineare Fusionsprodukt-Form umgewandelt. Analyse: Die Aktivität von Integrase und IHF wurde bestätigt.
Teil II: Drei Mikroliter von jeder Reaktion (d. h., mit oder ohne Integrase und LHF) wurden in 27 ul Cre-Puffer (vorstehend) verdünnt, dann wurde jede Reaktion in zwei 10 ul Aliquote (insgesamt vier) aufgeteilt. Zu zwei dieser Reaktionen wurden 0,5 ul Cre-Protein (vorstehend) zugegeben und alle Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37ºC, dann 10 Minuten lang bei 70ºC inkubiert. TE-Puffer (90 ul; TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA)wurde zu jeder Reaktion zugegeben und 1 ul von jeder wurde in E. coli DH5α überführt. Die Transformationsmischungen wurden auf 100 ug/ml Ampicillin plus 200 ug/ml Methicillin; 30 ug/ml Chloramphenicol; oder 100 ug/ml Kanamycin plattiert. Resultate: Siehe Tabelle 2.
* Integrase-Reaktionen enthielten ebenfalls IHF.
Analyse: Das Cre-Protein beeinträchtigte die Transformation. Wenn es auf diesen Effekt eingestellt war, erhöhte sich die Anzahl von Kanamycin-resistenten Kolonien im Vergleich zu den Kontrollreaktionen um mehr als das 100-fache, wenn sowohl Cre als auch Integrase verwendet wurden. Dies suggeriert eine Spezifizität von größer als 99%.
Teil III: 38 Kolonien wurden von den Integrase plus Cre-Platten gewählt, Miniprep-DNAs wurden hergestellt und mit HindIII geschnitten, um diagnostische Mapping-Informationen zu geben. Resultat: Alle 38 hatten genau die erwarteten Fragmentgrößen. Analyse: Es wurde beobachtet, dass das Cre plus λ Integrase Verfahren eine sehr viel größere Spezifizität als das nur-Cre aufwies. Schlussfolgerung: Das Cre plus λ Integrase Verfahren wurde demonstriert. Die Effizienz und Spezifizität waren sehr viel höher als nur für Cre.

Beispiel 2: Verwenden von in vitro rekombinanter Klonierung zum Subklonieren des Chloramohenicol-Acetyl-Transferasegens in einen Expressionsvektor in eukaryotischen Zellen (Fig. 4A)

Es wurde ein Insert-Donor-Plasmid, pEZC843, konstruiert, dass das Chloramphenicol-Acetyl- Transferasegen von E. coli enthielt, das zwischen loxP- und attB-Stellen kloniert war, so dass die loxP-Stelle an dem 5'-Ende des Gens positioniert war (Fig. 4B). Es wurde ein Vektor-Donor- Plasmid, pEZC1003, konstruiert, das den eukaryotischen Zytomegalovirus-Promoter enthielt, der an einer loxP-Stelle appositioniert war (Fig. 4C). Ein Mikroliter Aliquote von jedem supercoilten Plasmid (etwa 50 ng Roh-Miniprep-DNA) wurden in einer Zehn-Mikroliter- Reaktion vereinigt, die gleiche Teile lambda Integrase Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 70 mM KCl, 5 mM Spermidin, 0,5 mM EDTA, 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin) und Cre- Recombinase-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 33 mM NaCl, 5 mM Spermidin, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin), zwei Einheiten Cre-Recombinase, 16 ng Integrations-Wirtsfaktor und 32 lambda Integrase enthielt. Nach Inkubation bei 30ºC für 30 Minuten und 75ºC für 10 Minuten wurde ein Mikroliter in einen funktionsfähigen E. coli Strang DH5α (Life Technologies, Inc.) überführt. Aliquote von Transformationen wurden auf Agarplatten verteilt, die 200 ug/ml Kanamycin enthielten und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Eine ansonsten identische Kontrollreaktion enthielt nur das Vektor-Donor-Plasmid. Die Platte, die 10% der Kontrollreaktionstransformation empfing, ergab eine Kolonie; die Platte, die 10% der rekombinanten Klonierungsreaktion empfing, ergab 144 Kolonien. Diese Anzahlen suggerierten, dass mehr als 99% der rekombinanten Klonierungs-Kolonien das gewünschte Produkt-Plasmid enthielten. Miniprep-DNA, die aus sechs rekombinanten Klonierungs-Kolonien hergestellt warn, ergaben das Plasmid mit der vorhergesagten Größe (5026 Basenpaare), CMVProd. Die Restriktionsverdauung mit Ncol ergab die Fragmente, die für die Chloramphenicol-Acetyl- Transferase vorhergesagt war, die stromabwärts des CMV-Promoters für alle sechs Plasmide kloniert wurde.

Beispiel 3: Subklonierte DNA-Segmente, die durch attB-Stellen ohne Stop-Codons flankiert sind

Teil I: Hintergrund

Die vorstehenden Beispiele sind für Transkriptionsfusionen geeignet, in denen eine Transkription Rekombinationsstellen kreuzt. Sowohl attR- als auch loxP-Stellen enthalten multiple Stop- Codons auf beiden Strängen, so können Translationsfusionen schwierig sein, wo die kodierende Sequenz die Rekombinationsstellen kreuzen muss (nur ein Leserahmen ist auf jedem Strang von loxP-Stellen verfügbar), oder unmöglich sein (in attR oder attb).
Ein Hauptgrund für die Subklonierung ist, Proteindomänen zu verschmelzen. Eine Fusion der Glutathion-S-Transferase- (GST)-Domäne mit einem Protein von Interesse erlaubt zum Beispiel dem Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie auf Gluthathion-Agarose (Pharmacia, Inc., 1995 Katalog) gereinigt zu werden. Wenn das Protein von Interesse mit Chargen von fortlaufenden Histidinen (zum Beispiel His6)verschmolzen wird, kann das Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie auf chelatisierenden Harzen gereinigt werden, die Metallione enthalten (Qiagen, Inc.). Es ist oft wünschenswert, Amino-terminale und Carboxy-terminale Fusionen für Aktivität, Löslichkeit, Stabilität und dergleichen zu vergleichen.
Die attB-Stellen des Bakteriophage λ Integrationssystems wurden als eine Alternative zu den loxP-Stellen untersucht, weil die klein sind (25 bp) und etwas Sequenzflexibilität aufweisen (Nash, H. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4049-4053 (1987). Es wurde vorher nicht suggeriert, dass multiple Mutationen zur Entfernung von allen Stop-Codons zu nützlichen Rekombinationsstellen für rekombinantes Subklonieren führen würden.
Unter Verwendung der Standard-Nomenklatur für Stellen-spezifische Rekombination in lambda Bakteriophage (Weisber, in Lambda III, Hendrix, et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989)) sind die Nukleotid-Regionen, die an der Rekombinationsreaktion in E. coli Wirtszellen teilnehmen, folgendermaßen dargestellt:
worin: O die Kern-DNA-Sequenz mit 15 bp darstellt, die sowohl in der Phage als auch in E. coli Genomen gefunden wird; B und B' etwa 5 Basen benachbart zu dem Kern in dem E. coli Genom darstellen; und P1, H1, P2, X, H2, C, C', H', P'1, P'2 und P1 bekannte DNA-Sequenzen darstellen, die Protein-Bindungs-Domänen in dem Bakteriophage λ Genom kodieren.
Die Reaktion ist in der Gegenwart von dem Protein Xis (Exzisionase) reversibel; die Rekombination zwischen attL und attR exzidiert genau das λ Genom aus seinem integriertem Zustand, wobei das ringförmige, attP-haltige λ Genom und das lineare attB-haltige E. coli Genom regeneriert wird.

Teil II: Konstruktion und Testen von Plasmiden, die mutante att-Stellen enthalten

Es wurden mutante attL- und attR-Stellen konstruiert. Landy et al. (Ann. Rev. Biochem. 58: 913 (1989)) beobachteten wichtigerweise, dass eine Deletion der P1- und H1-Domänen von attP die Exzisionreaktion erleichterten und die Integrationsreaktion ausschlossen, wobei dadurch die Exzisionreaktion irreversibel gemacht wird. Deshalb wurden, als Mutationen in attR eingeführt wurden, ebenfalls die P1- und H1-Domänen gelöscht bzw. deletiert. Den attR-Stellen fehlen in dem vorliegenden Beispiel die P1- und H1-Regionen, die NdeI-Stelle ist entfernt (Base 27630 änderte von C zu G) und sie enthalten Sequenzen, die den Bakteriophage λ Koordinaten 27619- 27738 entsprechen (GenBank Freigabe 92,0, bg:LAMCG, "Complete Sequence of Baceriophage Lambda").
Die durch Rekombination von Wild-Typ attL- und attR-Stellen erzeugte Sequenz von attB ist:
Die Stop-Codons sind kursiv und unterstrichen. Bemerke, dass Sequenzen von attL, attR und attP aus der attB-Sequenz abgeleitet werden können und die Ränder von Bakteriophage λ in attL und attR enthalten waren (Koordinaten 27619 bis 27818).
Wenn mutante attR1- und attL1-Stellen rekombiniert wurden, wurde die Sequenz attB1 hergestellt (Mutationen in fettem, großem Schriftsatz):
Bemerke, dass die vier Stop-Codons verschwunden sind.
Wenn eine zusätzliche Mutation in die attR1- und attL1-Sequenzen (fett) eingeführt wurde, resultieren attR2- und attL2-Stellen. Die Rekombination von attR2 und attL2 erzeugte die attB2- Stelle:
Die Rekombinationsaktivitäten der vorstehenden attL- und attR-Stellen wurden folgendermaßen untersucht. Die attB-Stelle von Plasmid pEZC705 (Fig. 2B) wurde durch attLwt, attL1 oder attL2 ersetzt. Die attP-Stelle von Plasmid pEZC726 (Fig. 2C) wurde durch attRwt (der Regionen P1 und H1 fehlten), attR1 oder attR2 ersetzt. Die resultierenden Plasmide können folglich rekombinieren durch ihre loxP-Stellen, durch Cre vermittelt, und durch ihre attR- und attL-Stellen rekombinieren, durch Int, Xis und IHF vermittelt. Paare von Plasmiden wurden mit Cre, Int, Xis und IHF gemischt und zur Reaktion gebracht, in funktionsfähige E. coli Zellen überführt und auf Kanamycin-haltigem Agar plattiert. Die Resulate sind in Tabelle 3 dargestellt: Tabelle 3
(*1% von jeder Transformation wurde auf einer Kanamycin-Platte verteilt)
Die vorstehenden Daten zeigen, dass während die Wild-Typ att- und att1-Stellen zu einem kleinen Ausmass rekombinieren, die att1- und att2-Stellen nicht detektierbar miteinander rekombinieren.
Teil III. Es wurde eine Rekombination demonstriert, wenn die Kernregion von beiden attB- Seiten, die das DNA-Segment von Interesse flankierten, keine Stop-Codons enthielten. Es wurde entdeckt, dass der physikalische Zustand der teilnehmenden Plasmide die Rekombinationseffizienz beeinflusst.
Die passenden att-Stellen wurden in pEZC705 und pEZC726 bewegt, um die Plasmide pEZC1405 (Fig. 5 G) (attR1 und attR2) und pEZC1502 (Fig. 5H) (attL1 und attL2) herzustellen. Das gewünschte DNA-Segment in diesem Experiment war eine Kopie des Chloramphenicol-Resistenz-Gens, das zwischen die zwei att1-Stellen von pEZC1502 kloniert war. Paare von Plasmiden wurden unter Verwendung von Int, Xis und IHF (nicht Cre, weil keine loxP-Stellen vorhanden waren) in vitro rekombiniert. Der Ertrag an gewünschten Kanamycin- resistenten Kolonien wurde bestimmt, wenn beide Eltern-Plasmide ringförmig waren, oder wenn ein Plasmid ringförmig war und das andere linear war, wie in Tabelle 4 dargestellt: Tabelle 4
¹DNAs wurden mit Qiagen-Säulen gereinigt, die Konzentrationen wurden durch A260 bestimmt, und mit Xba I (pEZC1405) oder AlwN I (pEZC1502) linearisiert. Jede Reaktion enthielt 100 ng der angezeigten DNA. Alle Reaktionen (10 ul insgesamt) enthielten 3 ul Enzymmischung (Xis, Int und IHF). Nach der Inkubation (45 Minuten bei 25ºC, 10 Minuten bei 65ºC) wurde ein ul verwendet, um E. coli DH5α-Zellen zu transformieren.
²Anzahl von erwarteten Kolonien, wenn die ganze Transformationreaktion (1 ml) plattiert wurde. Entweder 100 ul oder 1 ul von der Transformationen wurde tatsächlich plattiert.
Analyse: Die rekombinante Klonierung unter Verwendung von mutanten attR- und attL-Stellen wurde bestätigt. Das gewünschte DNA-Segment wird zwischen attB-Stellen subkloniert, die nicht irgendwelche Stop-Codons in jedem von beiden Strängen enthalten. Der verbesserte Ertrag an Produkt-DNA (wenn ein Elternteil linear war) war aufgrund von früheren Beobachtungen unerwartet, dass die Exzisionsreaktion effizienter war, wenn beide teilnehmende Moleküle supercoilt waren und Proteine einschränkend waren (Nunes-Duby et al., Cell 50: 779-788 (1987).

Beispiel 4: Demonstration von rekombinanter Klonierung ohne inverse bzw. invertierte Wiederholungen

Teil I: Gedankengänge

Das vorstehende Beispiel 3 zeigte, dass Plasmide, die inverse bzw. invertierte Wiederholungen von passenden Rekombinationsstellen (zum Beispiel attL1 und attL2 in Plasmid pEZC1502) (Fig. 5H) enthalten, rekombinieren können, um das gewünschte DNA-Segment, das durch attB- Stellen ohne Stop-Codons flankiert ist, also in inverser bzw. invertierter Orientierung zu ergeben. Ein Anteil war der in vivo und in vitro Einfluss von inversen bzw. invertierten Wiederholungen. Die Transkription eines gewünschten DNA-Segment, das durch attB-Stellen in inverser bzw. invertierter Orientierung flankiert ist, könnte zum Beispiel ein Einzel-Strang-RNA-Molekül ergeben, das eine Haarnadel-Struktur bilden kann, wobei dadurch die Translation inhibiert wird.
Eine inverse bzw. invertierte Orientierung von ähnlichen bzw. gleichen Rekombinationsstellen kann durch Anordnen der Stellen in att-Stellen mit direkter Wiederholungsanordnung vermieden werden. Wenn jedes Eltern-Plasmid eine Wildtyp attL- und Wild-Typ attR-Stelle aufweist, werden in der direkten Wiederholung die Int-, Xis- und IHF-Proteine einfach das DNA-Segment entfernen, das durch jene Stellen in einer intramolekularen Reaktion flankiert wird. Die in dem vorstehenden Beispiel 3 beschriebenen mutanten Stellen suggerierten, dass es möglich sein könnte, die intramolekulare Reaktion zu inhibieren, während der intermolekularen Rekombination erlaubt ist, wie gewümscht fortzufahren.

Teil II: Struktur von Plasmiden ohne inverse bzw. invertierte Wiederholungen für rekombinante Klonierung

Die attR2-Sequenz in Plasmid pEZC1405 (Fig. 5G) wurde durch attL2 in entgegengesetzter Orientierung ersetzt, um pEZC1603 (Fig. 6A) herzustellen. Die attL2-Sequenz von pEZC 1502 (Fig. 5H) wurde durch attR2 in entgegengesetzter Orientierung ersetzt, um pEZC1706 (Fig. 6B) herzustellen. Jedes dieser Plasmide enthielt Mutationen in der Kernregion, die intramolekulare Reaktionen zwischen att1- und att2-Kernen sehr ineffizient machen (siehe Beispiel 3, vorstehend).
Plasmide pEZC 1405, pEZC 1502, pEZC 1603 und pEZC 1706 wurden auf Qiagen-Säulen (Qiagen, Inc.) gereinigt. Aliquote von pEZC1405 und pEZC1603 wurden mit Xba I linearisiert. Aliquote von pEZC1502 und pEZC1706 wurden mit AlwN I linearisiert. Einhundert ng Plasmide wurden in Puffer (gleiche Volumen von 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 70 mM KCl, 5 mM Spermidin, 0,5 mM EDTA, 250 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin), 10% Glycerol), welcher Int (43,5 ng), Xis (4,3 ng) und IHF (8,1 ng) enthielt, auf ein Endvolumen von 10 ul gemischt. Die Reaktionen wurden 45 Minuten lang bei 25ºC, 10 Minuten lang bei 65ºC inkubiert und 1 ul wurde in E. coli DH5α überführt. Nach der Expression wurden Aliquote auf Agar-Platten verteilt, die 200 ug/ml Kanamycin enthielten, und bei 37ºC inkubiert.
Als die Anzahl von Kolonien pro 1 ul der Rekombinationsreaktion ausgedrückte Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt: Tabelle 5
Analyse: In allen Konfigurationen, d. h. ringförmig oder linear, war das pEZC 1405 · pEZC 1502 Paar (mit att-Stellen in inverser bzw. invertierter Wiederholungs-Konfiguration) effizienter als das pEZC1603 · pEZC1706 Paar (mit mutierten att-Stellen, um Haarnadel-Bildung zu vermeiden). Das pEZC1603 · pEZC1706 Paar ergab höhere Hintergründe und geringere Effizienzen als das pEZC1405 · pEZC1502 Paar. Obwohl sie weniger effizient waren, wurde erwartet, dass 80% oder mehr der Kolonien von den pEZC1603 · pEZC1706 Reaktionen das gewünschte Plasmid-Produkt enthalten. Das Linearisieren eines Partners stimulierte die Reaktionen in allen Fällen.

Teil III: Bestätigung der Struktur des Produkt Plasmids

Sechs Kolonien von jeder der Reaktionen lineares pEZC1405 (Fig. 5 G) · ringförmiges pEZC1502 (Fig. 5H), ringförmiges pEZC1405 · lineares pEZC1502, lineares pEZC1603 (Fig. 6A) · ringförmiges pEZC1706 (Fig. 6B) und ringförmiges pEZC1603 · lineares pEZC1706 wurden in einem reichhaltigen Medium gewählt und Miniprep-DNAs wurden hergestellt. Diagnostische Schnitte (?) mit Ssp I ergab die vorhergesagten Restriktionsfragmente für alle 24 Kolonien.
Analyse: Rekombinationsreaktionen zwischen Plasmiden mit mutanten attL- und attR-Stellen auf den gleichen Molekülen ergab die gewünschten Plasmid-Produkte mit einem hohen Grad an Spezifizität.

Beispiel 5: Rekombinante Klonierung mit einem toxischen Gen

Teil I: Hintergrund

Restriktionsenzym Dpn I erkennt die Sequenz GATC und schneidet diese Sequenz nur, wenn das A durch die dam-Methylase methyliert ist. Allgemein verwendete E. coli Stränge sind dam&spplus;. Die Expression von Dpn I in dam&spplus;-Strängen von E. coli ist letal, weil das Chromosom der Zelle in viele Stücke zerhackt ist. In dam&supmin; Zellen ist die Expression von Dpn I jedoch unschädlich, weil das Chromosom gegen das Schneiden von Dpn I immun ist.
In dem allgemeinen rekombinanten Klonierungsschema, in dem der Vektor-Donor zwei Segmente C und D enthält, die durch Rekombinationsstellen getrennt sind, hängt die Selektion für das gewünschte Produkt von der Selektion für die Gegenwart von Segment D und die Abwesenheit von Segment C ab. In dem ursprünglichen Beispiel enthielt Segment D ein Medikamenten-Resistenz-Gen (Km), das durch ein Repressorgen, das auf Segment C gefunden wird, negativ kontrolliert wird. Wenn C vorhanden war, waren D-haltige Zellen nicht zu Kanamycin resistent, weil das Resistenzgen ausgeschaltet war.
Das Dnp I Gen ist ein Beispiel eines toxischen Gens, das das Repressorgen der vorstehenden Ausführungsform ersetzten kann. Wenn Segment C das Dpn I Genprodukt exprimiert, tötet das Überführen des Plasmids CD in einen dam+ Wirt die Zelle. Wenn Segment D in ein neues Plasmid überführt wird, zum Beispiel durch rekombinanten Klonierung, dann wird das Selektieren für den Medikamenten-Marker erfolgreich sein, weil das toxische Gen nicht länger vorhanden ist.

Teil II: Konstruktion eines Vektor-Donors unter Verwendung von Dpn I als toxisches Gen

Das Dpn I kodierende Gen wurde durch PCR unter Verwendung von Primern
Nr.: 17) und
Nr.: 18) und eines Dpn I-Gen-haltiges Plasmid (abgeleitet von Plasmiden, die von Sanford A, Lacks, Brookhaven National Laboratory, Upton, New York erhalten werden; auch erhältlich von American Type Culture Collection als ATCC 67494) als die Matrize bzw. das Templat verstärkt.
Zusätzliche Mutationen wurden in die B und B'-Regionen von attL bzw. attR durch Verstärken von vorhandenen attL- und attR-Domänen mit Primern eingeführt, die die gewünschten Basenauswechselungen enthalten. Die Rekombination der mutanten attL3 (mit Oligo-Xis115 hergestellt) und attR3 (mit Oligo-Xis112 hergestellt) ergab attB3 mit den folgenden Sequenzen (Unteschiede zu attB1 in fetter Schrift):
Die attL3-Sequenz wurde anstelle von attL2 in einem vorhandenen Gen-Donor-Plasmid kloniert, um das Plasmid pEZC2901 zu ergeben (Fig. 7A). Die attR3-Sequenz wurde anstelle von attR2 in einem vorhandenen Gen-Donor-Plasmid kloniert, um das Plasmid pEZC2913 zu ergben (Fig. 7B). Das Dnp I Gen wurde in Plasmid pEZC2913 kloniert, um das tet-Repressorgen zu ersetzen. Das resultierende Vektor-Donor-Plasmid wurde pEZC3101 genannt (Fig. 7C). Wenn pEZC3101 in den dam&supmin; Strang SCS110 (Stratagen) überführt wurde, resultierten Hunderte Kolonien. Wenn das gleiche Plasmid in den dam&spplus; Strang DH5a überführt wurde, wurde nur eine Kolonie hergestellt, auch wenn die DH5α Zellen etwa 20-fach funktionsfähiger sind als die SCS110 Zellen. Wenn ein verwandtes Plasmid, das nicht das Dnp I Gen enthielt, in die gleichen zwei Zell-Linien überführt wurde, wurden 28 Kolonien aus den SCS110 Zellen hergestellt, während 448 Kolonien aus den DH5α Zellen resultierten. Es ist offensichtlich, dass das Dnp I Gen von dem Plasmid pEZC3101 exprimiert wird (Fig. 7C) und dass es die dam&spplus; DH5α Zellen, aber nicht die dam&supmin; SCS110 Zellen tötet.

Teil III: Demonstration von rekombinanter Klonierung unter Verwendung von Dnp I Selektion

Es wurde ein Paar von Plasmiden untersucht, um die rekombinante Klonierung mit Selektion für das Produkt in Abhängigkeit von dem toxischen Gen Dnp I zu demonstrieren. Plasmid pEZC3101 (Fig. 7C) wurde mit Mlu I linearisiert und mit dem ringförmigen Plasmid pEZC2901 zur Reaktion gbracht (Fig. 7A). Ein zweites Paar Plasmide wurde unter Verwendung von Selektion, die auf der Steuerung der Medikamentenresistenz durch ein Repressorgen basiert, als eine Kontrolle verwendet: Plasmid pEZC1802 (Fig. 7D) wurde mit Xba I linearisiert und mit dem ringförmigem Plasmid pEZC1502 zur Reaktion gebracht (Fig. 5H). Reaktionen mir acht Mikroliter, die den gleichen Puffer und Proteine Xis, Int und IHF wie in den vorhergehenden Beispielen enthielten, wurden 45 Minuten lang bei 25ºC, dann 10 Minuten lang bei 75ºC inkubiert und 1 ul Aliquote wurden in DH5α (d. h. dam&spplus;) funktionsfähige Zellen überführt, wie in Tabelle 6 dargestellt ist. Tabelle 6
Es wurden von vier Kolonien aus Reaktion #2 Miniprep-DNAs hergestellt, die mit Restriktionsenzym Ssp I geschnitten wurden. Alle ergaben die vorhergesagten Fragmente.
Analyse: es wurde die Subklonierung unter Verwendung von Selektion mit einem toxischen Gen demonstriert. Es wurden Plasmide mit der vorhergesagten Struktur hergestellt.

Beispiel 6: Klonierung von Genen mit Uracil DNA Glycosylase und Subklonierung der Gene mit rekombinanter Klonierung zur Herstellung von Fusionsproteinen

Teil I: Umwandeln eines vorhandenen Expressions-Vektors in einen Vektor-Donor für die rekombinante Klonierung

Es wurde eine zum Umwandeln von vorhandenen Vektoren in funktionelle Vektor-Donoren nützliche Kassette folgendermaßen hergestellt. Plasmid pEZC3101 (Fig. 7C) wurde mit Apa I und Kpn I verdaut, mit T4 DNA Polymerase und dNTPs behandelt, um die Enden glatt herzustellen, weiterhin mit Sma I, Hpa I und AIwN I verdaut, um die ungewünschten DNA- Fragmente klein zu machen und die 2,6 kb Kassette, die attR1 - CMR - Dnp I - attR3- Domänen enthielt, wurde mittels eines Gels gereinigt. Es wurde festgestellt, dass die Konzentration dieser gereinigten Kassette etwa 75 ng DNA/ul betrug.
Plasmid pGEX-2TK (Fig. 8A) (Pharmacia) erlaubte Fusionen zwischen der Protein-Gutathion S Transferase und irgendeiner zweiten kodierenden Sequenz, die in seiner multiplen Klonierungsstelle eingeführt sein kann. PGEX-2TK DNA wurde mit Sma I verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Etwa 75 ng der vorstehenden gereinigten DNA-Kassette wurde mit etwa 100 ng des pGEX-2TK-Vektors 2,5 Stunden lang in einer 5 ul Ligatur ligiert, dann wurde 1 ul in funktionsfähige BRL 3056 Zellen (ein dant Derivat von DH10B; kommerziell erhältliche dam Stränge umfassen DM1 von Life Technologies, Inc., und SCS 110 von Stratagene) überführt. Aliquote der Transformationsmischung wurde auf LB Agar plattiert, das 100 ug/ml Ampicillin (auf pGEX-2TK vorhandenes Resistenzgen) und 30 ug/ml Chloramphenicol (auf der DNA-Kassette vorhandenes Resistenzgen) enthielt. Es wurden Kolonien gewählt und Miniprep-DNAs wurden hergestellt. Die Orientierung der Kassette in pGEX-2TK wurde durch diagnostische Schnitte mit EcoR I bestimmt. Ein Plasmid mit der gewünschten Orientierung wurde pEZC3501 genannt (Fig. 8B).

Teil II: Klonierung von Reportergenen in ein rekombinatnten Klonierungsgen-Donor- Plasmid in drei Leserahmen

Die Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) Klonierung ist ein Verfahren zum Klonieren von PCR- Verstärkungs-Produkten in Klonierungsvektoren (U. S. Patent Nr. 5,334,515, welches unter Bezugnahme hier vorllständig mit einbezogen ist). Kurz, die PCR-Verstärkung des gewünschten DNA-Segments wird mit Primern durchgeführt, die Uracil-Basen anstelle von Thymidin-Basen in ihren 5'-Enden enthalten. Wenn solche PCR-Produkte mit dem Enzym UDG inkubiert werden, werden die Uracil-Basen spezifisch entfernt. Der Verlust dieser Basen schwächt die Basen-Paarung in den Enden der PCR-Produkt-DNA und beim Inkubieren bei einer geeigneten Temperatur (z. B. 37ºC) werden die Enden solcher Produkte größtenteils einzelsträngig. Wenn derartige Inkubationen in der Gegenwart von linearen Klonierungsvektoren durchgeführt werden, die vorstehende 3'-Schwänze (hintere Enden) enthalten, die zu den 3'-Enden der PCR-Produkte komplementär sind, tempert die Basenpaarung die PCR-Produkte effizient zu dem Klonierungsvektor an. Wenn das getemperte Produkt in E. coli Zellen durch Transformation eingeführt wird, wandeln es in vivo Prozesse effizient in ein Rekombinationsplasmid um.
UDG Klonierungsvektoren, die die Klonierung irgendeines PCR-Produkts in allen drei Leserahmen ermöglichen, wurden aus pEZC3201 (Fig. 8K) folgendermaßen hergestellt. Acht Oligonukleotide wurden von Life Technologies, Inc. erhalten (alle 5 '→3' geschrieben):
Nr.: 26). Die oberen Lr1, 2 und 3 Stränge und die unteren Carboxy-Stränge wurden an ihren 5'- Enden mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und dann wurden die komplementären Stränge von jedem Paar hybridisiert. Das Plasmid pEZC3201 (Fig. 8K) wurde mit Not I und Sal I geschnitten und Aliquote von geschnittenem Plasmid wurden mit dem Carboxy-Oligo- Doppelstrang (Sal I Ende) und entweder dem Lr1, Lr2 oder Lr3 Doppelstrang (Not I Enden) gemischt (10 ug geschnittenes Plasmid (etwa 5 umol) wurde mit 250 umol Carboxy-Oligo- Doppelstang gemischt, in drei 20 ul Volumen geteilt, 5 ul (250 umol) von Lr1, Lr2 oder Lr3 Doppelstrang und 2 ul = 2 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zu jeder Reaktion zugesetzt). Nach 90-minütiger Ligatur bei Raumtemperatur wurde jede Reaktion auf ein präparatives Agarosegel aufgetragen und die 2,1 kb Vektorbanden wurden in 50 ul TE eluiert und gelöst.

Teil III: PCR von CAT und phoA Genen

Von Life Technologies, Inc. wurden Primer erhalten, um das Chloramphenicol-Acetyl- Transferase (CAT)-Gen von Plasmid pACY184 und phoA, das alkalische Phosphatasegen von E. coli zu verstärken. Die Primer wiesen 12-Basen 5'-Ausdehnungen auf, die Uracil-Basen enthielten, so dass die Behandlung von PCR-Produkten mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) die Basenpaarung an jedem Ende der DNAs schwächen würde und den 3'-Strängen erlaubt, mit den vorstehenden 3'-Enden der vorstehend beschriebenen Lr1, 2 und 3-Vektoren einen Doppelstrang zu bilden. Die Sequenzen der Primer (alle 5'→3' geschrieben) waren:
Die Primer wurden dann für PCR-Reaktionen unter Verwendung von bekannten Verfahrensschritten verwendet (siehe, z. B., U. S. Patent Nr. 5,334,515, das hier vollständig unter Bezugnahme mit einbezogen ist) und die durch diese erhaltenen Polymerase-Ketten-Reaktion- Verstärkungsprodukte enthielten das CAT- oder phoA-Gen mit den Initiations-ATGs, aber ohne irgendwelche Transkriptionssignale. Zudem kodierten die Uracil-haltigen Sequenzen auf dem Amino-terminalen Ende die Spaltungsstelle für die TEV-Protease (Life Technologies, Inc.) und jene auf dem Carboxy-terminalen Ende kodierten fortlaufende TAA-Terminations-Codons.
Ungereinigte PCR-Produkte (etwa 30 ng) wurden mit den mittels eines Gel gereinigten, linearen Lr1, Lr2 oder Lr3 Klonierungsvektoren (etwa 50 ng) in einer 10 ul Reaktion gemischt, die 1X REact 4 Puffer (LTI) und 1 Einheit UDG (LTI) enthielt. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurden 1 ul Aliquote von jeder Reaktion in funktionsfähige E. coli DH5α Zellen überführt (LTI) und auf 50 ug/ml Kanamycin-haltiges Agar plattiert. Kolonien wurden gewählt und eine Miniprep DNA Analyse zeigte, dass das CAT-Gen in Leserahmen 1 (pEZC3601) (Fig. 8C), Leserahmen 2 (pEZC3609) (Fig. 8D) und Leserahmen 3 (pEZC3617) (Fig. 8E) kloniert wurde und dass das phoA-Gen in Leserahmen 1 (pEZC3606) (Fig. 8F), Leserahmen 2 (pEZC3613) (Fig. 8G) und Leserahmen 3 (pEZC3621) (Fig. 8H) kloniert wurde.

Teil IV: Subklonierung von CAT oder phoA von Klonierungsvektoren in einen GST Fusionsvektor

Es wurden Plasmide, die Fusionen zwischen GST und entweder CAT oder phoA in allen drei Leserahmen kodierten, durch rekombinante Klonirung folgendermaßen konstruiert. Eine Miniprep DNA von GST Vektor-Donor pEZC3501 (Fig. 8B) (von Pharmacia Plasmid pGEX- 2TK wie vorstehend abgeleitet) wurde mit Cla I linearisiert. Etwa 5 ng Vektor-Donor wurden mit etwa 10 ng von jedem der passenden ringförmigen, CAT- oder phoA-haltigen Gen-Donor- Vektoren in 8 ul Reaktionen gemischt, die Puffer und Rekombinationsproteine Int, Xis und IHF (vorstehend) enthielten. Nach der Inkubation wurde 1 ul jeder Reaktion in E. coli Strang DH5α überführt und auf Ampicillin plattiert, wie in Tabelle 7 dargestellt ist.

Tabelle 7

DNA Kolonien (10% jeder Transformation)
Linearer Vektor-Donor (EZC3501/Cla) 0
Vektor-Donor + CAT Lr1 110
Vektor-Donor + CAT Lr2 71
Vektor-Donor + CAT Lr3 148
Vektor-Donor + phoA Lr1 121
Vektor-Donor + phoA Lr2 128
Vektor-Donor + phoA Lr3 31

Teil V: Expression von Fusionproteinen

Zwei Kolonien von jeder Transformation wurden in 2 ml reichhaltigem Medium (CircleGrow, Bio101 Inc.) in 17 · 100 mm Kunststoffrohre (Falcon 2059, Becton Dickinson) gewählt, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, und 4 Stunden lang bei 37ºC kräftig geschüttelt, zu welcher Zeit die Kulturen sichtbar trübe waren. Ein ml jeder Kultur wurde in ein neues Rohr überführt, das 10 ul 10% (w/v) IPTG enthielt, um die Expression von GST zu induzieren. Nach 2 Stunden zusätzlicher Inkubation wiesen alle Kulturen etwa die gleiche Trübung auf; die A600 von einer Kultur war 1,5. Zellen von 0,35 ml jeder Kultur wurden entnommen und mit Probenpuffer (der SDS bzw. Natriumdodecylsulfat und β-Mercaptoethanol enthielt) behandelt und zu etwa 0,15 A600 Einheiten von Zellen equivalente Aliquote wurden auf ein Novex 4-20% Gradient Polyarylamidgel aufgetragen. Im Anschluß an die Elektrophorese wurde das Gel mit Agalma gefärbt.
Resulate: Es wurde eine verbesserte Expression von einzelnen Proteinbanden für alle 12 Kulturen gesehen. Die beobachtete Größe dieser Proteine korrelierte gut mit den Größen, die für GST vorhergesagt waren, die (durch attB Rekombinationsstellen ohne Stop-Codons) mit CAT oder phoA in drei Leserahmen verschmolzen sind: CAT Lr1 = 269 Aminosäuren; CAT Lr2 = 303 Aminosäuren; CAT Lr3 = 478 Aminosäuren; phoA Lr1 = 282 Aminosäuren; phoA Lr2 = 280 Aminosäuren; und phoA Lr3 = 705 Aminosäuren.
Analyse: Sowohl CAT- als auch phoA-Gene wurden in einem GST-Fusions-Vektor in allen drei Leserahmen subkloniert und die Expression der sechs Fusionproteine wurde demonstriert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsprodukt-DNA-Moleküls, umfassend Kombinieren in vitro:

(i) ein Insertion-Donor-DNA-Molekül, das ein gewünschtes DNA-Segment umfasst, das durch eine erste Rekombinationsstelle und eine zweite Rekombinationsstelle flankiert ist, wobei die erste und die zweite Rekombinationsstelle nicht miteinander rekombinieren;

(ii) ein Vektor-Donor-DNA-Molekül, das eine dritte Rekombinationsstelle und eine vierte Rekombinationsstelle enthält, wobei die dritte und die vierte Rekombinationsstelle nicht miteinander rekombinieren; und

(iii) wenigstens ein spezifisches Rekombinationsprotein, das fähig ist, die erste und dritte Rekombinationsstelle und die zweite und vierte Rekombinationsstelle zu rekombinieren;

wobei es dadurch das Stattfinden einer Rekombination erlaubt, um ein Fusionsprodukt-DNA- Molekül zu erzeugen, das die erste und dritte oder die zweite und vierte Rekombinationsstelle umfasst.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem ein Produkt-DNA-Molekül aus der Fusionsprodukt- DNA durch Rekombinieren von wenigstens einer von (i) der ersten und dritten, oder (ii) der zweiten und vierten Rekombinationsstelle erzeugt wird, wobei die Produkt-DNA das gewünschte DNA-Segment umfasst.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Verfahren ebenfalls ein Nebenprodukt-DNA- Molekül erzeugt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, das weiterhin Selektieren zu dem Produkt-DNA-Molekül umfasst.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, das Selektieren zu dem Produkt-DNA-Molekül in vitro umfasst.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Vektor-Donor-DNA-Molekül ein Vektorsegment umfasst, das durch die dritte und vierte Rekombinationsstelle flankiert ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das Produkt-DNA-Molekül wenigstens einen selektierfähigen Marker, ein Expressionssignal oder einen Replikationsursprung enthält, der bzw. das Selektion des Produkt-DNA-Moleküls ermöglicht.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem das Vektor-Donor-DNA-Molekül weiterhin (a) ein toxisches Gen und (b) einen selektierfähigen Marker umfasst, wobei das toxische Gen und der selektierfähige Marker auf verschiedenen DNA-Segmenten sind, wobei die DNA- Segmente entweder (i) in einem ringförmigen DNA-Molekül durch zwei Rekombinationsstellen oder (ii) in einem linearen DNA-Molekül durch eine Rekombinationsstelle getrennt sind.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem das Vektor-Donor-Molekül (a) weiterhin eine Repressionskassette und (b) einen selektierfähigen Marker umfasst, der durch den Repressor der Repressionskassette reprimiert wird, und wobei der selektierfähige Marker und die Repressionskassette auf verschiedenen DNA-Segmenten sind, wobei die DNA-Segmente entweder (i) in einem ringförmigen DNA-Molekül durch zwei Rekombinationsstellen oder (ii) in einem linearen DNA-Molekül durch eins Rekombinationsstelle getrennt sind.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem wenigstens eines von dem Insertion-Donor-DNA Molekül und dem Vektor-Donor-DNA-Molekül ein ringförmiges DNA-Molekül ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem wenigstens eines von dem Insertion-Donor-DNA- Molekül und dem Vektor-Donor-DNA-Molekül ein lineares DNA-Molekül ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem der Selektierschritt in vitro oder in vivo durchgeführt wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Rekombinationsprotein wenigstens ein erstes Rekombinationsprotein und ein zweites Rekombinationsprotein umfasst, wobei das zweite Rekombinationsprotein von dem ersten Rekombinationsprotein verschieden ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem das erste Rekombinationsprotein die erste und dritte Rekombinationsstelle rekombiniert und das zweite Rekombinationsprotein die zweite und vierte Rekombinationsstelle rekombiniert.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das erste und das zweite Rekombinationsprotein aufeinanderfolgend verwendet werden.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Rekombinationsprotein Int ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem das Rekombinationsprotein Int und IHF, und wahlweise Xis, umfasst.

18. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein erstes DNA-Segment und ein zweites DNA- Segment umfasst, wobei das erste oder zweite Segment durch wenigstens eine erste und eine zweite genmanipulierte Rekombinationsstelle flankiert ist, die nicht miteinander rekombinieren, in einem in vitro Verfahren gemäß Anspruch 1.

19. Verwendung gemäß Anspruch 18; bei der die erste und zweite genmanipulierte Rekombinationsstelle genmanipuliert wurden, um eine oder mehrere Eigenschaften aufzuweisen, ausgewählt aus:

(a) verbesserter Spezifizität oder Rekombinationseffizient

(b) verringerter reverser Rekombination;

(c) Abwesenheit von Translationsstopcodons; und

(d) Abwesenheit von invertierten Wiederholungen, um Haarnadelbildung zu vermeiden.

20. Verwendung gemäß Anspruch 19, bei der die verbesserte Spezifizität oder Rekombinations¬ effizienz durch eine oder mehrere Eigenschaften übertragen werden, ausgewählt aus:

(a) bevorzugte exzisive Integration;

(b) bevorzugte exzisive Rekombination; und

(c) erleichterte Anforderung für Wirtsfaktoren.

21. Verwendung gemäß Anspruch 19 oder 20, bei der die Rekombinationsstellen genmanipuliert sind, um verbesserte Spezifizität oder Rekombinationseffizient in vitro zu übertragen.

22. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 18-22, bei der die erste Rekombinationsstelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer att-Stelle und einer lox-Stelle.

23. Verwendung gemäß Anspruch 22, bei der die zweite Rekombinationsstelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer att-Stelle und einer lox-Stelle.

24. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 18-21, bei der eine Kernregion von wenigstens einer der Rekombinationsstellen eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

und einer entsprechenden oder komplementären DNA- oder RNA-Sequenz, wobei R = A oder G; K = G oder T/U; Y = C oder T/U; W = A oder T/U; N = A oder C oder G oder T/U; S = C oder G; und B = C oder G oder T/U.

25. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 18 bis 21, bei der eine Kernregion von wenigstens einer der Rekombinationsstellen eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

und einer entsprechenden oder komplementären DNA- oder RNA-Sequenz.

26. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 18-25, bei der die Nukleinsäure ein Vektor- Donor-DNA-Molekül ist und einen selektierfähigen Marker umfasst.

27. Verwendung gemäß Anspruch 26, bei der der selektierfähige Marker wenigstens ein DNA- Segment ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(i) einem DNA-Segment, dass ein Produkt kodiert, das Resistenz gegen andere toxische Verbindungen bereitstellt;

(ii) einem DNA-Segment, das ein Produkt kodiert, das ansonsten in der Empfängerzelle fehlend ist;

(iii) einem DNA-Segment, das ein Produkt kodiert, das die Aktivität eines Genprodukts unterdrückt;

(iv) einem DNA-Segment, das ein Produkt kodiert, das sofort identifiziert werden kann;

(v) einem DNA-Segment, das ein Produkt kodiert, das nachteilig für ein Zellüberleben und/oder für eine Zellfunktion ist;

(vi) einem DNA-Segment, das die Aktivität von irgendeinem der DNA-Segmente von vorstehenden (i) bis (v) hemmt;

(vii) einem DNA-Segment, das ein Produkt bindet, das ein Substrat modifiziert;

(viii) einem DNA-Segment, das zur Isolierung eines gewünschten Moleküls vorsorgt;

(ix) einem DNA-Segment, das eine spezifische Nukleotidsequenz kodiert, die ansonsten nicht-funktionell sein kann; und

(x) einem DNA-Segment, das, bei Abwesenheit, direkt oder indirekt besonderen Verbindungen Sensitivität überträgt.

28. Verwendung gemäß Anspruch 26, bei der der selektierfähige Marker wenigstens einer ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antibiotikaresistenzgen, einem tRNA Gen, einem auxotrophen Marker, einem toxischen Gen, einem phänotypischen Marker, einem Antisense-Oligonukleotid, einer Restriktionsendonuklease; einer Restriktionsendonukleasespaltstelle, einer Enzymspaltstelle, einer Proteinbindungsstelle; und einem Sequenz- Komplementär-PCR-Primer.

29. Verwendung gemäß Anspruch 26, bei der der selektierfähige Marker wenigstens ein inaktives Fragment eines selektierfähigen Markers umfasst, wobei das inaktive Fragment fähig ist, einen funktionellen selektierfähigen Marker zu rekonstituieren, wenn es über die erste oder zweite Rekombinationsstelle mit einem weiteren DNA-Segment rekombiniert ist, das ein anderes inaktives Segment des selektierfähigen Markers umfasst.

30. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 18-25, bei der die Nukleinsäure ein Insertion-Donor-DNA-Molekül ist und ein gewünschtes DNA-Molekül umfasst.

31. Verwendung gemäß Anspruch 30, bei der das gewünschte DNA-Segment für wenigstens eines kodiert, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Klonierungsstelle, einer Restriktionsstelle, einem Promoter, einem Operon, einem Replikationsursprung, einer funktionellen DNA, einer Antisense-RNA, einem PCR-Fragment, einem Protein oder einem Proteinfragment.

32. Verwendung gemäß Anspruch 30, bei der die erste und zweite genmanipulierte Rekombinationsstelle genmanipuliert wurden, um Rekombinationseffizienz zu verbessern.

33. Kit, welcher ein Gefäß umfasst, das unterteilt ist und in dichter Begrenzung darin eine erste Kammer, die eine wie in irgendeinem der Ansprüche 18-32 definierte Nukleinsäure enthält, und wenigstens eine zusätzliche Kammer einschließt, die wenigstens ein Rekombinationsprotein enthält, das fähig ist, ein DNA-Segment zu rekombinieren, das wenigstens eine der Rekombinationsstellen umfasst.

34. Kit gemäß Anspruch 33, welcher eine erste Kammer, die eine Nukleinsäure enthält, die eine Vektor-Donor-DNA ist, und eine zweite Kammer umfasst, die eine Nukleinsäure enthält, die ein Insertion-Donor-DNA-Molekül ist, wobei die zusätzliche Kammer das wenigstens eine Rekombinationsprotein enthält.

35. In vitro Verfahren zum Appositionieren eines Expressionssignals und eines Gens oder partiellen Gens, das umfasst:

(a) Mischen eines ersten Nukleinsäuremoleküls, das das Expressionsignal und wenigstens eine erste Rekombinationsstelle umfasst, und eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, das das Gen oder partielle Gen und wenigstens eine zweite Rekombinationsstelle umfasst; und

(b) Inkubieren der Mischung in der Gegenwart von wenigstens einem Rekombinationsprotein unter ausreichenden Bedingungen, um Rekombination von wenigstens der ersten und zweiten Rekombinationsstelle zu veranlassen, wobei dadurch das Expressionssignal und das Gens oder partielle Gen appositioniert werden.

36. Verfahren gemäß Anspruch 35, bei dem das wenigstens eine Rekombinationsprotein durch einen Bakteriophage kodiert wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakteriophage Lambda, phi80, P22, P2, 186, P4 und P1.

37. Verfahren gemäß Anspruch 35, bei dem das wenigstens eine Rekombinationsprotein durch Bakteriophage Lambda kodiert wird.

38. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 35-37 unter Verwendung einer ersten, wie in irgendeinem der Ansprüche 18-32 definierten Nukleinsäure und einer zweiten, wie in irgendeinem der Ansprüche 18-32 definierten Nukleinsäure.

39. Zusammensetzung, die ein wie in irgendeinem der Ansprüche 18-32 definiertes Nukleinsäuremolekül und ein erstes Rekombinationsprotein umfasst.

40. Zusammensetzung gemäß Anspruch 39, die Nukleinsäuremoleküle, die Vektor-Donor- DNA's und Insertion-Donor-DNA's sind, und das erste Rekombinationsprotein umfasst.

41. Zusammensetzung gemäß Anspruch 39 oder 40, die weiterhin ein zweites, zu dem ersten verschiedenes Rekombinationsprotein umfasst.

42. Verwendung eines Verfahrens gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-17 zum Ändern von Vektoren, Appositionieren von Promotoren mit Genen, Konstruieren von Genen für Fusionsproteine, Ändern der Kopienanzahl, Ändern von Replikons, Klonieren in Phagen oder Klonieren von PCR-Produkten, Genom-DNA's oder cDNA's.