JP5670755B2 - 翻訳プロファイリング及び分子表現型解析のための方法及び組成物 - Google Patents

翻訳プロファイリング及び分子表現型解析のための方法及び組成物 Download PDF

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Description

（相互参照）
本出願は、２００８年３月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／０３６，０４９号、２００８年３月１２日に出願された第６１／０３６，０５８号、２００８年３月２１日に出願された６１／０７０，３２７号、２００８年１１月１２日に出願された第６１／１９９，１０８号の利益を請求するものであり、これらの出願は参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。
（連邦支援研究に関する記載）
本発明は、以下の助成金番号の米国政府支援下で行われた：国立老化研究所により授与されたＡＧ０９４６４、国立精神衛生研究所により授与されたＭＨ０７４８６６、国立薬害研究所により授与されたＤＡ１００４４及び５Ｆ３２ＤＡ０２１４８７、国立衛生研究所／国立研究資源センターにより授与された５ＵＬ１ＲＲ０２４１４３、及び国立神経疾患脳卒中研究所により授与されたＮＳ３４６９６。米国政府は、本明細書中に提供されている内容に対して特定の権利を有する場合がある。
ヒト疾患及び障害に関する新しい診断法及び療法の開発における理論的枠組は、定義された細胞タイプでの遺伝子発現を特徴付けることである。多数の組織の細胞が複雑であることは、このレベルで遺伝子発現を特徴付けようと努力する者にとっての課題となる。神経系（ニューロン細胞を数で１桁圧倒する非ニューロンの細胞を有する数千のニューロン細胞タイプ）などの組織の膨大な異質性は、個々の細胞タイプに存在する遺伝子転写物の特定及び解析に対する障害である。細胞サブタイプは、高度に異質性であり、混合されていることが多い。単離された細胞での遺伝子発現研究は、細胞の単離手順中に導入されるストレス、細胞生理をｉｎ ｖｉｖｏで制御する組織内因性シグナルの喪失に際して生じる順応、及び固定組織からの再現性の良いｍＲＮＡの精製に関連する技術的な課題により制限を受けている。細胞単離を必要とせずに、定義された細胞タイプ及びサブタイプから翻訳されたｍＲＮＡを単離する方法は、以前は未定義だった細胞タイプを定義し、疾患及び障害の分子標的を特定し、特定の生物学的機能に関して同時制御される遺伝子セットを特定する方法を提供するために必要とされている。本発明をこれから記述する。
（参照による組み込み）
本明細書中で言及される出版物、特許、及び特許出願は全て、あたかも個々の出版物、特許、又は特許出願が具体的に及び個々に提示されて参照により組み込まれたのと同じ程度に、言及により本明細書中に組み込まれる。
本明細書中に記載の発明は、異なる細胞集団の生物学的特性を解明するのに有用な方法、組成物、及びキットを提供する。本明細書中に記載の実施形態は、任意の遺伝学的に定義された細胞タイプにおける、遺伝的変更、疾患、環境的、薬理学的、他の異常に応答した分子的変化の特定に有用な一般化可能な方法である翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ、ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を含む。
１つの態様では、本明細書中に記載の発明は、ある機能に関して同時制御される遺伝子セットを特定する方法であって、その機能に関連する遺伝子を発現する複数の細胞タイプの翻訳プロファイルを決定すること、翻訳プロファイルを比較してどの追加的遺伝子が同様に制御されるかを決定し、それによりその機能に特異的に関与する同時制御された遺伝子セットを特定することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、髄鞘形成に関与する同時制御された遺伝子セットを特定するために提供され、さらなる実施形態では、髄鞘形成に関連する遺伝子はＭｂｐである。１つの実施形態では、同時制御された遺伝子セットは、表９に列挙されている少なくとも２つの遺伝子を含む。関連する実施形態では、遺伝子セットは、Ｐｌｐ１、Ｃｎｐ、Ｍｏｇ、Ｍａｌ、及びＭｏｂｐからなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子を含む。
別の態様では、本明細書中に記載の発明は、全組織マイクロアレイ技術では検出不能である１つ又は複数の細胞タイプにおいて富化された遺伝子を検出するための方法であって、ある細胞タイプの翻訳プロファイルを評価することと、翻訳プロファイルを全組織マイクロアレイの結果と比較することと、全組織マイクロアレイの結果に存在しない翻訳プロファイル中の１つ又は複数の遺伝子の存在を決定することとを含み、それにより全組織マイクロアレイ技術では検出不能である１つ又は複数の細胞タイプで富化された遺伝子を検出する方法を提供する。特定の実施形態では、その細胞タイプにおいて富化された遺伝子の２０％、３０％、又は４０％超は、全組織マイクロアレイ技術では検出不能である。これらの方法は、ニューロン及び非ニューロン細胞タイプを含む任意の目的の細胞タイプに適用することができる。例示的な実施形態では、細胞タイプは、線条体細胞、小脳細胞、皮質細胞、視床下部細胞、海馬細胞、脳幹細胞、及び脊髄細胞からなる群から選択される。
別の態様では、本明細書中に記載の発明は、中型星状神経細胞において富化されたｍＲＮＡを特定する方法であって、中型星状神経細胞で発現される遺伝子に特異的な調節領域により制御されるリボソームタンパク質を生物中で発現させることと、ｍＲＮＡに付随しているリボソームタンパク質を含む複合体を単離することと、複合体中のｍＲＮＡを特定することと、上記ｍＲＮＡを参照試料から特定されたｍＲＮＡと比較することとを含む方法を提供する。１つの実施形態では、発現に使用される調節領域は、線条体黒質ニューロン又は線条体淡蒼球ニューロンで発現される遺伝子に特異的である。幾つかの実施形態では、中型星状神経細胞は、これらに限定されないが、パーキンソン病、依存症、注意欠陥過活動性障害、又はハンチントン病などの疾患又は障害と関連している。さらなる実施形態では、本方法は、疾患又は障害治療用の候補となる標的の選択を誘導し、候補となる標的の潜在的調節因子をさらにスクリーニングするために使用することができる。
さらに別の態様では、本明細書中に記載の発明は、運動ニューロンにおいて富化されたｍＲＮＡを特定する方法であって、運動ニューロンで発現される遺伝子に特異的な調節領域により制御されるリボソームタンパク質を発現させることと、ｍＲＮＡに付随しているリボソームタンパク質を含む複合体を単離することと、複合体中のｍＲＮＡを特定することと、上記ｍＲＮＡを参照試料から特定されたｍＲＮＡと比較することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、調節領域は、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）遺伝子座に由来する調節配列を含む。この方法は、これらに限定されないが、脳幹運動ニューロン、脊髄運動ニューロン、及び上位運動ニューロンなどの任意の運動ニューロンに由来するｍＲＮＡを特定するために使用することができる。
別の態様では、本明細書中に記載の発明は、小脳細胞の翻訳プロファイルを評価するための方法であって、小脳遺伝子に特異的な調節領域により制御されるリボソームタンパク質を上記細胞中で発現させることと、ｍＲＮＡに付随しているリボソームタンパク質を含む少なくとも１つの複合体を上記細胞から単離することと、複合体に由来するｍＲＮＡを特定し、それにより翻訳プロファイルを生成することとを含む方法を提供する。１つの実施形態では、小脳細胞は、運動失調症などの疾患又は障害に関連している。
本発明は、内因性調節領域に作用可能に連結されたリボソームタンパク質及び検出可能なタグをコードする核酸配列を発現するように遺伝子操作された組換えベクターを含む、本明細書中に記載の方法を実施するのに有用なキットも提供する。
本発明の特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
同時制御された遺伝子セットを特定する方法であって、
（ａ）髄鞘形成に関連する遺伝子を発現する複数の細胞タイプの翻訳プロファイルを決定する工程、
（ｂ）前記翻訳プロファイルを比較して、どの追加的遺伝子が同様に制御されるかを決定し、それにより髄鞘形成に関与する同時制御された遺伝子セットを特定する工程を含む方法。
（項目２）
髄鞘形成と関連する前記遺伝子がＭｂｐである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記遺伝子セットが、Ｐｌｐ１、Ｃｎｐ、Ｍｏｇ、Ｍａｌ、及びＭｏｂｐからなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子を含む、項目１にｓ記載の方法。
（項目４）
表９に列挙されている少なくとも２つの遺伝子を含む、髄鞘形成に関与する同時制御された遺伝子セット。
（項目５）
Ｐｌｐ１、Ｃｎｐ、Ｍｏｇ、Ｍａｌ、又はＭｏｂｐの少なくとも１つを含む、項目４に記載の遺伝子セット。
（項目６）
全組織マイクロアレイ技術では検出不能である、細胞タイプで富化された１つ又は複数の遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）細胞タイプについての翻訳プロファイルを評価する工程と、
（ｂ）前記翻訳プロファイルを全組織マイクロアレイの結果と比較する工程と、
（ｃ）前記全組織マイクロアレイの前記結果に存在しない、前記翻訳プロファイル中の１つ又は複数の遺伝子の存在を決定する工程を含み、
それにより前記全組織マイクロアレイ技術では検出不能である、細胞タイプで富化された１つ又は複数の遺伝子を検出する方法。
（項目７）
前記細胞タイプにおいて富化された前記遺伝子の２０％、３０％、又は４０％超が、前記全組織マイクロアレイ技術で検出不能である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記細胞タイプが、線条体細胞、小脳細胞、皮質細胞、視床下部細胞、海馬細胞、脳幹細胞、及び脊髄細胞からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記翻訳プロファイルの評価がマイクロアレイの使用を伴う、項目６に記載の方法。
（項目１０）
中型星状神経細胞で富化されたｍＲＮＡを特定する方法であって、
（ａ）中型星状神経細胞で発現される遺伝子に特異的な調節領域により制御されるリボソームタンパク質を生物中で発現させる工程と、
（ｂ）ｍＲＮＡに付随している前記リボソームタンパク質を含む複合体を単離する工程と
（ｃ）前記複合体中のｍＲＮＡを特定する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡを、参照試料から特定されたｍＲＮＡと比較する工程とを含む方法。
（項目１１）
前記中型星状神経細胞で富化されたｍＲＮＡが差次的に発現される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記調節領域が、線条体黒質ニューロンで発現される遺伝子に特異的である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記調節領域が、線条体淡蒼球ニューロンで発現される遺伝子に特異的である、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記発現が、細菌人工染色体により媒介される、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記調節領域が、Ｄｒｄ１ａ又はＤｒｄ２遺伝子座に由来する調節配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記発現が、細菌人工染色体を生物に導入する工程を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記中型星状神経細胞が、疾患又は障害に関連している、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記疾患又は障害が、パーキンソン病、依存症、注意欠陥過活動性障害、又はハンチントン病のいずれか１つである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記方法が、前記疾患又は障害を治療するための候補となる標的選択の誘導に使用される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記リボソームタンパク質がＬ１０ａである、項目１０に記載の方法。
（項目２１）
前記リボソームタンパク質がｍＲＮＡと直接的に結合しない、項目１０に記載のの方法。
（項目２２）
検出可能なタグを発現する工程をさらに含む項目１０に記載の方法。
（項目２３）
前記検出可能なタグがｅＧＦＰである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単離する工程が架橋試薬を用いずに実施される、項目１０に記載の方法。
（項目２５）
小分子、薬物、抗体、ハイブリッド抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、又はペプチドを前記神経細胞に投与する工程をさらに含む項目１０に記載の方法。
（項目２６）
前記薬物がコカインである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ｍＲＮＡが、マイクロアレイにさらに配置されている、項目１０に記載の方法。
（項目２８）
前記調節領域が、Ｄｒｄ１ａ遺伝子座に由来する調節配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目２９）
翻訳プロファイルが、Ｔａｃ１、Ｐｄｙｎ、Ｓｌｃ３５ｄ３、Ｚｆｐ５２１、Ｅｂｆ１、Ｓｔｍｎ２、Ｇｎｂ４、Ｎｒｘｎ１、Ｅｙａ１、Ｉｓｌ１、Ｇｎｇ２、又はＣｒｙｍを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
運動ニューロンで富化されたｍＲＮＡを特定する方法であって、
（ａ）運動ニューロンで発現される遺伝子に特異的な調節領域により制御されるリボソームタンパク質を生物中で発現させる工程と、
（ｂ）ｍＲＮＡに付随している前記リボソームタンパク質を含む複合体を単離する工程
と
（ｃ）前記複合体中の前記ｍＲＮＡを特定する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡを、参照試料から特定されたｍＲＮＡと比較する工程とを含む方法。
（項目３１）
調節領域が、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）遺伝子座に由来する調節配列を含む、項目１６に記載の方法。
（項目３２）
運動ニューロンが脳幹運動ニューロンである、項目１６に記載の方法。
（項目３３）
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、項目１６に記載の方法。
（項目３４）
運動ニューロンが上位運動ニューロンである、項目１６に記載の方法。
（項目３５）
富化されたｍＲＮＡが、表１９に列挙されているｍＲＮＡの１つ又は複数を含む、項目１６に記載の方法。
（項目３６）
小脳細胞の翻訳プロファイルを評価するための方法であって、
（ａ）小脳遺伝子に特異的な調節領域により制御されるリボソームタンパク質を前記細胞中で発現させる工程と、
（ｂ）ｍＲＮＡに付随している前記リボソームタンパク質を含む少なくとも１つの複合体を前記細胞から単離する工程と、
（ｃ）前記複合体に由来する前記ｍＲＮＡを特定し、それにより翻訳プロファイルを生成する工程を含む方法。
（項目３７）
前記発現させる工程が、細胞又は生物を細菌人工染色体で形質導入する工程を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記小脳細胞が、疾患又は障害を伴っている、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記疾患又は障害が運動失調症である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記方法が、前記疾患又は障害を治療するための候補となる標的選択の誘導に使用される、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記リボソームタンパク質がＬ１０ａである、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記リボソームタンパク質がｍＲＮＡと直接的に結合しない、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
検出可能なタグを発現する工程をさらに含む項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記検出可能なタグがｅＧＦＰである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記単離する工程が架橋試薬を用いずに実施される、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
前記小脳細胞がプルキンエ細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
前記小脳細胞がベルクマングリアである、項目３６に記載の方法。
（項目４８）
小分子、薬物、抗体、ハイブリッド抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、又はペプチドをニューロンに投与する工程をさらに含む項目３６に記載の方法。
（項目４９）
前記ｍＲＮＡが、マイクロアレイにさらに配置されている、項目３６に記載の方法。
（項目５０）
前記調節領域が、Ｐｃｐ２遺伝子座に由来する調節配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目５１）
翻訳プロファイルが、表２２に列挙されている任意の１つ又は複数の遺伝子を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記調節領域が、Ｓｅｐｔｉｎ４遺伝子座に由来する調節配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目５３）
翻訳プロファイルが、表２３に列挙されている任意の１つ又は複数の遺伝子を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
内因性調節領域に作用可能に連結されたリボソームタンパク質及び検出可能なタグをコードする核酸配列を発現するように遺伝子操作された組換えベクターを含むキット。
（項目５５）
前記検出可能なタグがｅＧＦＰである、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
前記リボソームタンパク質がＬ１０ａである、項目５４に記載のキット。
（項目５７）
前記リボソームタンパク質が、前記検出可能なタグとインフレームで融合されている、項目５４に記載のキット。
（項目５８）
前記組換えベクターが細菌人工染色体である、項目５４に記載のキット。
（項目５９）
前記内因性調節領域が、目的遺伝子の５’及び／又は３’非翻訳配列を含む、項目５４に記載のキット。
（項目６０）
前記目的遺伝子が、線条体細胞、小脳細胞、皮質細胞、視床下部細胞、海馬細胞、脳幹細胞、及び脊髄細胞からなる群から選択される細胞で発現される、項目５９に記載のキット。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において独自性をもって示されている。本発明の特徴及び利点に関するより良好な理解は、本発明の原理が使用されている例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び以下の添付の図面への言及により得られるだろう。
図１は、ＣＮＳ疾患に関連するＢＡＣアレイコレクションを例示する図である。 図２は、翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法を表す図である。（ａ）抗ＧＦＰ抗体をコーティングしたビーズを使用したｅＧＦＰタグ化ポリソーム（標的細胞集団に由来する）の親和性精製の模式図。（ｂ）空ベクター（左パネル）又はｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ構築体（右パネル）で形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から採取した抽出物と共にインキュベーションした後の抗ＧＦＰコーティング磁気ビーズの透過型電子顕微鏡写真；画像は５０，０００×の倍率で取得し、挿入部分は２．３×の倍率に拡大されている。 図３は、形質移入細胞に由来する翻訳されたｍＲＮＡの免疫沈降を例示する図である。 図４は、ｉｎ ｖｉｖｏＢＡＣアレイ戦略を例示する図である。 図５は、ＢＡＣベクター遺伝子操作を例示する図である。 図６は、ＢＡＣアレイマウスの生成を例示する図である。 図７は、大脳皮質で特異的発現を示すＢＡＣアレイマウスを生成するために使用される駆動系の例を例示する図である。 図８は、視床下部で特異的発現を示すＢＡＣアレイマウスを生成するために使用される駆動系の例を例示する図である。 図９は、パネル１〜２５は、ＢＡＣ遺伝子導入が、特定のＣＮＳ細胞集団に対するｅＧＦＰ−Ｌ１０ａを標的とすることを例示する図である。各マウス系統での抗ｅＧＦＰ抗体によるＤＡＢ免疫組織化学は、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子の固有で特異的な発現パターンを明らかにする。パネル（１０×）は導入遺伝子を発現する細胞タイプの形態及び局在化を示し、挿入部分は、小脳（１〜９）、脊髄（１０）、線条体／基底前脳（１１〜１４）、脳幹（１５）、及び皮質（１６〜２５）細胞タイプのパネルの部位を示している。破線（パネル１６〜２５）は脳梁を示す。細胞タイプの符号は全て図１１Ａにある。 図１０は、ＧＥＮＳＴＡＴ ｅＧＦＰ及びＢＡＣアレイ皮質錐体細胞系統が、同じ層分布を示すことを例示する図である。Ａ）各錐体細胞ＢＡＣ駆動系についてのＢＡＣアレイ及びＧＥＮＳＡＴ ｅＧＦＰ系統における、軟膜表面とｅＧＦＰ＋細胞体との距離のグラフ（平均値±標準誤差）。細胞の深さは、各駆動系について両方系統間で一致していた。Ｂ）１００ミクロン範囲中の細胞のパーセンテージが、Ａの各系統の細胞深度の分布ヒストグラムとして示されている。各駆動系についてのＢＡＣアレイ系統及びｅＧＦＰ系統は、細胞深度の分布が重なり合っていた。 図１１は、研究した細胞タイプ及び系統の特徴付けの要約を例示する図である。Ａ）図９に対応する、ＢＡＣアレイを用いて研究した全細胞集団の表。Ｂ）カルビンジン陽性プルキンエ細胞のＰｃｐ２ ＢＡＣ制御下にあるｅＧＦＰ−Ｌ１０ａの検出。Ｃ）ＮｅｕＮ陽性核を有する顆粒細胞のＮｅｕｒｏｄ１ ＢＡＣ制御下にあるｅＧＦＰ−Ｌ１０ａの検出。Ｄ）パルブアルブミン陽性プルキンエ細胞線維ではなく、分子層のパルブアルブミン陽性外側星状及び深部星状（かご）ニューロンのＬｙｐｄ６ ＢＡＣ制御下にあるｅＧＦＰＬ１０ａの検出（矢印）。Ｅ）Ｇｒｍ２／３陽性糸球体ではなく、顆粒細胞層のＧｒｍ２／３の陽性介在ニューロン（ゴルジ細胞）のＧｒｍ２ ＢＡＣ制御下にあるｅＧＦＰ−Ｌ１０ａの検出（矢印）。Ｆ）Ｇｒｍ１陽性刷毛を有する単極刷毛細胞のＧｒｐ ＢＡＣ制御下で検出されたｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ（矢印）。Ｇ）ｓ１００陽性ベルイマングリアのＳｅｐｔ４ ＢＡＣ制御下で検出されたｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ。 図１２は、導入遺伝子発現が高ければ高いほど、より良好な信号対雑音がもたらされることを示す図である。Ａ）ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａのＤＡＢ免疫組織化学は、同じ細胞集団を標的とする２つのＢＡＣアレイ系統での導入遺伝子発現の強度差を明らかにする。Ｂ）陽性及び陰性対照の平均ＩＰ／ＵＢ倍数変化により評価されたＢＡＣアレイデータの品質は、より高い導入遺伝子発現を有する系統でより良好である。 図１３は、ＢＡＣアレイ系統からのタンパク質及びｍＲＮＡの精製を例示する図である。（ａ）ｅＧＦＰタグ化Ｌ１０ａの精製、及び野生型同腹仔からではなく、Ｄ１ ＢＡＣアレイ動物からの非タグ化リボソームタンパク質Ｌ７の共精製（Ｄ１、Ｄ１ ＢＡＣアレイマウスに由来する試料；ＷＴ、野生型同腹仔に由来する試料；Ｉｎ、１％投入（ｉｎｐｕｔ）試料；ＵＢ、１％未結合試料；ＩＰ、６．５％免疫親和性精製試料）。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａシグナルは、ＩＰ試料がＩｎ及びＵＢと比べてより富化されているため、Ｄ１ ＩＰレーンにのみ存在する。（ｂ）バイオアナライザーＰｉｃｏＣｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で検出した、野生型同腹子（下段パネル）からではなく、Ｄ１ ＢＡＣアレイトランスジェニック動物（上段パネル）からの１８Ｓ ｒＲＮＡ及び２８Ｓ ｒＲＮＡの精製。２８Ｓ ｒＲＮＡは約４７秒で検出され（ｒｕｎ）、１８Ｓ ｒＲＮＡは約４３秒で検出され、マーカーピークは約２３秒で検出される。 図１４は、免疫沈降したリボソーム複合体の電子顕微鏡写真を例示する図である。 図１５は、マイクロアレイシグナル強度が、転写の長さと共に増加しないことを示す図である。Ａ〜ＤＤ：より長いｍＲＮＡがより短い転写物より効率的に免疫沈降されたどうかを評価するために、３０個の試料について、試料転写の長さ（Ｙ軸、底が２の対数）を、ＧＣＲＭＡ正規化シグナル強度（Ｘ軸、底が２の対数）対してプロットした。免疫沈降及び未結合（全組織ＲＮＡ）の試料はどちらも、長さとシグナルとの間に正の相関性を示さない。 図１６は、ＢＡＣアレイが、希少な細胞タイプ及び一般的な細胞タイプから効率的に一貫してＲＮＡを精製できることを例示する図である。Ａ）Ｓ２０画分、通過画分（ＵＢ）、並びに小脳の希少な細胞タイプ（単極刷毛細胞）、一般的な細胞タイプ（プルキンエ細胞）、及び非常に一般的な細胞タイプ（顆粒細胞）からの免疫沈降物に由来するｅＧＦＰのウエスタンブロット。タンパク質が検出不能の場合でさえ、マイクロアレイ増幅用に十分な良質のＲＮＡが存在することに留意されたい。Ｂ）ＲＮＡの収率は、各系統内の反復試料にわたって一貫している。Ｃ）３つの細胞タイプ全ての全ＲＮＡは良質であり、完全１８ｓ及び２８ｓバンド並びに標準的プロトコールに従って増幅及び断片化することができるｍＲＮＡを有する。 図１７は、ＢＡＣアレイデータは再現性があり、細胞タイプ特異的であることを例示する図である。 図１８は、ＢＡＣアレイが、公知のマーカーを特定することができ、様々な細胞タイプの新しいマーカーを発見することができることを示す図である。 図１８は、ＢＡＣアレイが、公知のマーカーを特定することができ、様々な細胞タイプの新しいマーカーを発見することができることを示す図である。 図１９は、ＢＡＣアレイが、細胞をタイプによりクラスター化し、全組織アレイより高い感度を提供することを示す図である。 図２０は、細胞タイプ多様性が、受容体及びイオンチャネルなどの細胞表面上のタンパク質により推進されることを示す図である。 図２０は、細胞タイプ多様性が、受容体及びイオンチャネルなどの細胞表面上のタンパク質により推進されることを示す図である。 図２０は、細胞タイプ多様性が、受容体及びイオンチャネルなどの細胞表面上のタンパク質により推進されることを示す図である。 図２１は、比較分析が、各細胞タイプの固有な翻訳プロファイルを明らかにすることを示す図である。 図２１は、比較分析が、各細胞タイプの固有な翻訳プロファイルを明らかにすることを示す図である。 図２２は、脊髄運動ニューロンの転写の略図を例示する図である。 図２３は、Ｃｈａｔ及びプルキンエ細胞ＢＡＣアレイ系統でのｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現を例示する図である。（Ａ）Ｃｈａｔ ＢＡＣアレイ系統ＤＷ１６７に由来する成体矢状切片でのｅＧＦＰに対する免疫組織化学。（Ｂ）Ｃｈａｔ ＢＡＣアレイ系統ＤＷ１６７脳幹顔面運動核の間接免疫蛍光特徴付け：ｅＧＦＰ染色（左パネル）；Ｃｈａｔ染色（中央パネル）、及び重ね合わせ（右パネル、２０μｍスケールバーが示されている）。（Ｃ）Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイ系統ＤＲ１６６に由来する成体矢状切片でのｅＧＦＰに対する免疫組織化学。（Ｄ）Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイ系統ＤＲ１６６プルキンエ細胞ニューロンの間接免疫蛍光特徴付け：ｅＧＦＰ染色（左パネル）；カルビンジン−Ｄ２８Ｋ染色（中央パネル）、及び重ね合わせ（右パネル、２０μｍスケールバーが示されている）。 図２４は、ＢＡＣアレイプロファイルが、既知の細胞特異的マーカーを反復し、４つの異なる細胞タイプの新しいマーカーを明らかにすることを示す図である。参照ｍＲＮＡ試料と比較したＤ１、Ｄ２、Ｃｈａｔ、及びＰｃｐ２ ＢＡＣアレイデータの散布図は、各細胞タイプで富化された数百の遺伝子を明らかにする（Ａ〜Ｄ）。対角線の両側の直線は、２倍の富化を示す。図軸は、発現を１０の累乗で標示している。各細胞タイプにつき上位１，０００の富化されたプローブセット（表１７〜２０）のベン図（発現値のカットオフは＞１００）は、各細胞タイプが、富化された遺伝子の固有なパターンを示すことを明らかにする（Ｅ〜Ｈ）。 図２５は、Ｄ１及びＤ２ ＢＡＣアレイ系統でのｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現を例示する図である。（ａ）Ｄ２ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ１０１に由来する成体矢状切片でのｅＧＦＰに対する免疫組織化学。（ｂ）Ｄ２ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ１０１線条体ＭＳＮ細胞の特徴付け：直接ｅＧＦＰ蛍光（左パネル、高倍率画像が挿入されている）；エンケファリン免疫組織化学的染色（中央パネル）；重ね合わせ（右パネル、２０μｍスケールバーが示されている）。（Ｃ）Ｄ１ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ７３に由来する成体矢状切片でのｅＧＦＰに対する免疫組織化学。（ｄ）Ｄ１ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ７３線条体ＭＳＮ細胞の特徴付け：直接ｅＧＦＰ蛍光（左パネル）；エンケファリン免疫組織化学的染色（中央パネル）；重ね合わせ（右パネル）。 図２６は、Ｄ２ ＢＡＣアレイマウス線条体抽出物のポリソームプロファイルを例示する図である。 図２７は、メッセージ存在量及び長さと比較した線条体ＭＳＮ ＩＰ値の解析を例示する図である。転写の長さは、入手可能なマウスの管理された（ｃｕｒａｔｅｄ）ＲｅｆＳｅｑＲＮＡ配列全てに基づいていた（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｍ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／ＲＮＡ）。単一遺伝子の転写改変体が複数入手可能だった場合、最長の転写改変体を選択した。ＲｅｆＳｅｑの長さを、Ｄ１（ａ）又はＤ２（ｂ）ＢＡＣアレイＩＰ標準化発現値に対してプロットした。転写の長さとＩＰ値との間に相関性は観察されなかった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製Ｇｅｎｅｃｈｉｐプローブセット全ての線条体発現値は、野生型線条体組織に由来する全ＲＮＡアレイにより取得した（データ非表示）。これらの値を、（ｃ）Ｄ１ ＢＡＣアレイ又は（ｄ）Ｄ２ ＢＡＣアレイのＩＰ標準化値に対してプロットした。予想通り、線条体全体におけるより高い発現は（ＩＰ、野生型マウスでは発現しない）、より高いＤ１又はＤ２ ＢＡＣアレイＩＰ値と相関している。線条体全体で中程度の発現を示すが低ＩＰ値を示す少数の遺伝子には、公知の非ニューロン遺伝子が含まれる。 図２８は、ＢＡＣアレイ精製ｍＲＮＡの遺伝子発現解析を示す図である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製マウスゲノム４３０ ２．０アレイからの正規化発現値を、Ｄ１及びＤ２ ＢＡＣアレイ試料についてプロットする。中央の対角線は等しい発現を表し、両側の直線はいずれかの細胞集団での１．５倍の富化を表す。 図２９は、中型星状神経細胞（ＭＳＮ）で富化された遺伝子の発現解析を例示する図である。ＭＳＮで富化された本研究で特定された上位１００（ａ）又は１，０００〜１，１００（ｂ）の遺伝子中にあった遺伝子の矢状切片における発現解析を示しており、各遺伝子の順位序列が遺伝子名の下に記されている。重複したプローブセットを除外し、各遺伝子に対応する最高順位のプローブセットを使用して、非重複遺伝子順位を算出した。左パネル、Ａｌｌｅｎ脳地図（Ａｌｌｅｎ脳地図（Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓ）、［インターネット］。シアトル（米国ワシントン州）：Ａｌｌｅｎ脳科学研究所。（著作権）２００６年。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ ｍａｐ．ｏｒｇから入手可能）から取得したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像（３）；右パネル、脳遺伝子発現地図（ＢＧＥＭ、Ｂｒａｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｐ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｏｒｇ／）から取得したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像（４）。Ａｌｌｅｎ脳地図画像は全て成体脳に対応しており、ＢＧＥＭ画像は、最も年齢の高い利用可能なデータが生後７日目（Ｐ７）だった以下のものを除き全て成体脳に対応する：Ｄｒｄ２、Ｐｐｐ１ｒ１ｂ、Ｄｌｘ６、Ｇｄｎｆ、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｏｘｇ１、Ｌｉｍｄ２、Ｆｅｍ１ｂ、Ｄｙｎｌｌ１、Ａｔｂｆ１、Ｆｏｘｏ３ａ、Ｄｎａｌｃ４、Ｍｔｍｒ７、Ｄｎｍｔ３ａ。 図２９は、中型星状神経細胞（ＭＳＮ）で富化された遺伝子の発現解析を例示する図である。ＭＳＮで富化された本研究で特定された上位１００（ａ）又は１，０００〜１，１００（ｂ）の遺伝子中にあった遺伝子の矢状切片における発現解析を示しており、各遺伝子の順位序列が遺伝子名の下に記されている。重複したプローブセットを除外し、各遺伝子に対応する最高順位のプローブセットを使用して、非重複遺伝子順位を算出した。左パネル、Ａｌｌｅｎ脳地図（Ａｌｌｅｎ脳地図（Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓ）、［インターネット］。シアトル（米国ワシントン州）：Ａｌｌｅｎ脳科学研究所。（著作権）２００６年。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ ｍａｐ．ｏｒｇから入手可能）から取得したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像（３）；右パネル、脳遺伝子発現地図（ＢＧＥＭ、Ｂｒａｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｐ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｏｒｇ／）から取得したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像（４）。Ａｌｌｅｎ脳地図画像は全て成体脳に対応しており、ＢＧＥＭ画像は、最も年齢の高い利用可能なデータが生後７日目（Ｐ７）だった以下のものを除き全て成体脳に対応する：Ｄｒｄ２、Ｐｐｐ１ｒ１ｂ、Ｄｌｘ６、Ｇｄｎｆ、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｏｘｇ１、Ｌｉｍｄ２、Ｆｅｍ１ｂ、Ｄｙｎｌｌ１、Ａｔｂｆ１、Ｆｏｘｏ３ａ、Ｄｎａｌｃ４、Ｍｔｍｒ７、Ｄｎｍｔ３ａ。 図３０は、機能的Ｇｐｒ６受容体は、ＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンには見出されるが、ＢＡＣ Ｄ１線条体黒質中型星状神経細胞には見出されないことを例示する図である。（ａ）ＢＡＣ Ｄ２マウスに由来するｅＧＦＰ標識中型星状神経細胞の突起。視覚化用にＡｌｅｘａ５９４（５０μＭ）を、及び細胞内Ｃａ２＋の変化を測定するためにＦｌｕｏ４（２００μＭ）を含有するピペットで細胞をパッチした（右）。細胞を−７０ｍＶで電圧固定した。スフィンゴシン１リン酸塩（Ｓ１Ｐ、１０μＭ）を含有するパフピペット（ｐｕｆｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅ）を、細胞体から６０ ８０μｍの樹状突起付近に配置した（左／カーツーン）。（ｂ）樹状突起セグメントの高倍率画像（対照、左パネル）は、Ｓ１Ｐ添加に伴うＣａ２＋増加を示し（Ｓ１Ｐパフ、中央パネル）、この増加は洗浄により逆転した（洗浄、右パネル）。Ｃａ２＋の変化は、Ａｌｅｘａ５９４の蛍光に対するＦｌｕｏ４の蛍光のパーセント変化（ΔＧ／Ｒ）を算出することにより決定した。（ｃ）Ｓ１Ｐが、ｂ（オレンジ色のトレース）からのＲＯＩにおける細胞内Ｃａ２＋増加を誘導したことを示す時間的経過；ＢＡＣ Ｄ１中型星状神経細胞（黒色トレース）又はタプシガルジンを負荷したＢＡＣ Ｄ２中型星状神経細胞の同様の測定は、Ｓ１Ｐ添加による樹状突起Ｃａ２＋レベルにいかなる変化も明らかにしなかった。（ｄ）Ｓ１Ｐ効果を要約するボックスプロット。ＢＡＣ Ｄ２中型星状神経細胞（中央値＝１４６％、範囲４４〜２９４％、ｎ＝６）；ＢＡＣ Ｄ１中型星状神経細胞（中央値＝１７％、範囲１３〜２２％、ｎ＝４）；及びタプシガルジンを負荷したＢＡＣ Ｄ２中型星状神経細胞（中央値＝４％、範囲−９〜１０％、ｎ＝４）における蛍光のパーセント増加（ΔＧ／Ｒ）。 図３１は、コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンにおける小振幅ＧＡＢＡ作動性ｍＩＰＳＣの周波数を増加させることを例示する図である。（ａ）生理食塩水又は（ｂ）コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）で１５日間処置したマウスから採取したＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロン（Ｄ１プロモーター下で可溶性ｅＧＦＰを発現する）の代表的な自発性ｍＩＰＳＣトレース。（ｃ）コカイン治療後のＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンｍＩＰＳＣ周波数の増加を示す平均ｍＩＰＳＣ周波数の要約的棒グラフ（マン−ホイットニー順位和検定、ｐ＜０．０５、生理食塩水中央値＝０．８２Ｈｚ、ｎ＝２２；コカイン中央値＝１．０３Ｈｚ、ｎ＝２６）。（ｄ）同じ長さの測定（７分間）での小振幅ｍＩＰＳＣ（＜７５ｐＡ）の数が、コカイン処置後にＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンで増加したことを示す要約的棒グラフ（ｔ検定、ｐ＜０．０５、生理食塩水＝７９．４±８．２、ｎ＝２２；コカイン＝１０４．２±６．３、ｎ＝２６）。（ｅ）生理食塩水で処置したＢＡＣ Ｄ１ニューロン及びコカインで処置したＢＡＣ Ｄ１ニューロンの代表的な分散−平均電流プロットであり、１シナプス当たりより少数のＧＡＢＡＡ受容体（Ｎ）を有するが、単一受容体コンダクタンス（ｇ）が不変である受容体を有するシナプスから、コカイン誘導性小振幅事象が生じることを示唆する（生理食塩水 Ｎ＝３３、ｇ＝３１ｐＳ；コカイン Ｎ＝２７、ｇ＝３０ｐＳ；平均は図Ｓ６ｃ ｄを参照）。（ｆ）生理食塩水で１５日間処置した後のＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロン、及び（ｇ）コカインで１５日間処置した後のＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンからの代表的な自発性ｍＩＰＳＣトレース。（ｈ）生理食塩水で処置したニューロン及びコカインで処置したニューロンの平均ｍＩＰＳＣ周波数の要約的棒グラフであり、処置条件の影響がなかったことを示す（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝０．７２±０．０５Ｈｚ、ｎ＝１２；コカイン＝０．７８±０．０７Ｈｚ、ｎ＝１６）。（ｉ）同じ長さの測定（７分間）での小振幅ｍＩＰＳＣ（＜７５ｐＡ）の数が、ＢＡＣ Ｄ２ニューロンの処置条件により変化しなかったことを示す要約的棒グラフ（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝６８．１±９．７、ｎ＝１２；コカイン＝７１．７±７．５、ｎ＝１６）。（ｊ）コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ２ニューロンの１シナプス当たりの受容体の数又は単位受容体コンダクタンスを変化させなかったことを示す代表的な分散−平均電流プロット（生理食塩水 Ｎ＝２９、ｇ＝３３ｐＳ；コカイン Ｎ＝３１、ｇ＝２９ｐＳ）。 図３２は、コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンの１シナプス当たりのＧＡＢＡＡチャネルの数を減少させることを例示する図である。生理食塩水で処置した対照及び１５日間処置したコカインＢＡＣ Ｄ１マウスから採取した個々の線条体黒質ニューロンの平均ｍＩＰＳＣ動態及び非定常ノイズ解析測定を示すボックスプロット要約。（ａ）平均１０−９０％の立ち上がり時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝０．６４±０．００８、ｎ＝２２；コカイン＝０．６５±０．００６、ｎ＝２６）も（ｂ）平均減衰時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝１７．３±０．５、ｎ＝２２；コカイン＝１７．０±０．５、ｎ＝２６）も、群間での差はなかった。ｍＩＰＳＣの非定常ノイズ解析は、（ｃ）線条体黒質ニューロンのＧＡＢＡＡ受容体の平均単位コンダクタンス（ｇ）が群間で変化しないこと（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水 ｇ＝３１．１±１．６、ｎ＝２２；コカイン ｇ＝３０．８±１．２、ｎ＝２６）、及び（ｄ）コカインで処置したＢＡＣ Ｄ１マウスから採取した線条体黒質ニューロンの１シナプス当たりの平均チャネル数が減少したこと（ｔ検定、ｐ＜０．０５、生理食塩水 Ｎ＝３３．１±１．４、ｎ＝２２；コカイン Ｎ＝２９．３±１．０、ｎ＝２６）を実証した。 図３３は、コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンのＧＡＢＡ作動性ｍＩＰＳＣ動態又は１シナプス当たりのＧＡＢＡＡ受容体数又は単一受容体コンダクタンスを変化させないことを例示する図である。生理食塩水で処置した対照及び１５日間処置したコカインＢＡＣ Ｄ２から採取した個々の線条体淡蒼球ニューロンの平均ｍＩＰＳＣ動態及び非定常ノイズ解析測定を示すボックスプロット要約。（ａ）平均１０−９０％の立ち上がり時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝０．６５±０．００７、ｎ＝１２；コカイン＝０．６４±０．０１０、ｎ＝１６）も（ｂ）平均減衰時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝１８．０±１．０、ｎ＝１２；コカイン＝１８．０±０．５、ｎ＝１６）も、群間での差異はなかった。ｍＩＰＳＣの非定常ノイズ解析は、（ｃ）線条体淡蒼球ニューロンのＧＡＢＡＡ受容体の平均単位コンダクタンス（ｙ軸でｇと記されている）が群間で変化しないこと（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水 ｇ＝３０．７±１．５、ｎ＝１２；コカイン ｇ＝３０．３±１．２、ｎ＝１６）、又は（ｄ）コカインで処置したＢＡＣ Ｄ２マウスから採取した線条体淡蒼球ニューロンの１シナプス当たりの平均チャネル数が変化しないこと（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水 Ｎ＝３３．８±２．７、ｎ＝１２；コカイン Ｎ＝３３．０±１．６、ｎ＝１６）を実証した。 図３４は、ＡＴＭ ＫＯマウスの小脳細胞タイプのＢＡＣアレイ分子表現型解析を例示する図である。 図３５は、Ｐｃｐ２及びＳｅｐｔ４ ＢＡＣアレイトランスジェニックマウス系統の特徴付けを例示する図である。（Ａ） Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイ系統の小脳にあるプルキンエ細胞でのｅＧＦＰ Ｌ１０ａ融合体の発現。抗ｅＧＦＰ抗血清を使用したＰｃｐ２ ＢＡＣアレイ脳切片の免疫組織化学的染色（上段パネル）。プルキンエ細胞の共標識化を示す（重ね合わせ）、Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイマウスでのカルビンジン（Ｃａｌｂ１）及びｅＧＦＰ Ｌ１０ａ発現の二重免疫蛍光分析（下段パネル）。（Ｂ） Ｓｅｐｔ４ ＢＡＣアレイ系統の小脳にあるベルクマングリアでのｅＧＦＰ Ｌ１０ａ融合体の発現。抗ｅＧＦＰ抗血清を使用したＳｅｐｔ４ ＢＡＣアレイ脳切片の免疫組織化学的染色（上段パネル）。ベルクマングリア細胞の共標識化を示す（重ね合わせ）、Ｓｅｐｔ４ ＢＡＣアレイマウスでのグルタミン合成酵素（Ｇｌｎｓ）及びｅＧＦＰ Ｌ１０ａ発現の二重免疫蛍光分析。 図３６は、Ｓｅｐｔｉｎ４及びＰｃｐ２系統のＢＡＣアレイデータの散布図解析を例示する図である。Ｓｅｐｔｉｎ４（Ａ、Ｃ）及びＰｃｐ２（Ｂ、Ｄ）ＢＡＣトランスジェニック系統に由来する免疫沈降（ＩＰ）ｍＲＮＡを、小脳全体に由来するｍＲＮＡ試料と散布図解析で直接的に比較した。この解析は、数千の遺伝子が、小脳全体と比べて免疫沈降試料中で富化されていることを明白に実証する。散布図（Ｃ）及び（Ｄ）は、ベルクマングリア細胞及びプルキンエニューロンの既知の陽性対照遺伝子を用いた同じ実験を示す。ベルクマングリア陽性対照は、Ｓｅｐｔｉｎ４ ＩＰ試料（Ｃ）で明白に富化されている一方で、プルキンエ細胞陽性対照遺伝子は、Ｐｃｐ２ ＩＰ試料（Ｄ）で富化されている。 図３７は、Ａｔｍ−／−小脳における遺伝子発現の細胞タイプ特異的な差次的制御を例示する図である。（Ａ〜Ｃ）Ａｔｍ−／−ＩＰデータを、Ａｔｍ＋／＋ＩＰデータと、Ｓｅｐｔｉｎ４（Ａ）、Ｐｃｐ２（Ｂ）、及び小脳全体（Ｃ）実験の散布図解析で比較した。上方制御及び下方制御された遺伝子の両遺伝子のリストを、２５を超える発現値、１．５を超える倍数変化値でフィルタリングし、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０５を実施することにより生成した。散布図は、各実験で制御された遺伝子の分布を表示する。色はベン図解析（Ｄ）を示す。ベルクマングリア及びプルキンエ細胞に共通する遺伝子は黄色に色付けされており、プルキンエ細胞及び小脳全体に共通する遺伝子は青緑色であり、ベルクマングリア及び小脳全体に共通の遺伝子は、深紅色に色付けされている。３つの条件全てで特定された遺伝子は白色としている。（Ｄ） 制御された遺伝子全てのベン図解析。小脳全体では、４０／６９個の遺伝子が排他的に小脳全体で差次的に制御されたことが見出され、Ｓｅｐｔｉｎ４実験では、９４／１１６個の遺伝子がＳｅｐｔｉｎ４データで特異的に制御され、Ｐｃｐ２実験では、Ｐｃｐ２データに特異的な６２／８９個の制御された遺伝子が特定された。 図３８は、ＢＡＣアレイにより明らかにされた腹側被蓋野及び黒質野特異的マーカーを例示する図である。 図３９は、６−ＯＨＤＡの使用によるげっ歯動物黒質中のドーパミン作動性細胞消失を例示する図である。 図４０は、Ｇｐｒ６のアンタゴニストを使用することで視床下核を刺激する新戦略を開発することによるパーキンソン病の治療機会を例示する図である。
翻訳プロファイリング及び分子表現型解析
本開示は、異質性組織及び細胞タイプの翻訳プロファイリング及び分子表現型解析に有用な方法及び組成物を提供する。１つの実施形態では、本方法を使用して、以前は未定義だった細胞タイプを定義し、疾患及び障害の分子標的を特定し、特定の生物学的及び／又は医学的関連機能に関して同時制御された遺伝子セットを特定する方法を提供することができる。
翻訳プロファイリングとは、翻訳されたｍＲＮＡのプロファイリング、特定、又は単離である。幾つかの実施形態では、そのようなプロファイリングは、発生プロテオームの尺度である。他の実施形態では、このプロファイリングにより、活発に翻訳されているか又はそうでなければ細胞翻訳機構に関連しているｍＲＮＡの特定が可能になる。分子表現型解析とは、器官、組織、及び細胞タイプの分子及び／又は遺伝子発現を記述することである。
本開示は、翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）プロファイリング法を実施するための方法及び組成物を提供する。１つの実施形態では、これらのプロファイリング法は、形態学的に、解剖学的に、発生的に、又は他の点で区別不能な細胞を、細胞サブタイプにさらに区別し、細胞集団及び亜集団をさらに定義するために使用される。ある場合には、これらの他の点で区別不能な細胞は混合されている。他の場合では、これらの細胞は空間的に離れている。ある場合には、これらの細胞は、翻訳プロファイル及び分子表現型解析によってのみ区別可能な中枢又は末梢神経系の細胞、例えばニューロン又はグリアである。他の場合では、これらは神経系の外側にある細胞である。別の実施形態では、これらのプロファイリング法を使用して、全組織マイクロアレイなどの技術によっては達成できない可能性のある感度で、単一細胞タイプで翻訳されたｍＲＮＡを特定する。さらに他の実施形態では、これらのプロファイリング法を使用して、空間に離れているか若しくは混合されているか、形態学的に区別できるか若しくは区別できないか、異なる発生段階にあるか、異なる組織若しくは組織の領域に関連するか、又は同じ疾患、障害、若しくは状態を有する異なる個体に由来する細胞の特定の生物学的機能に関する同時制御された遺伝子セットを特定する。
本明細書中に提供される方法は、リボソーム又はポリソーム（リボソームのクラスター）に付随しているｍＲＮＡを特定の細胞タイプから単離することを可能にし、細胞タイプ及びサブタイプの細胞翻訳プロファイリング及び分子表現型解析が可能になる。ある場合には、細胞が遺伝子的に標的とされる。
本明細書中に記載の方法は、任意の目的細胞サブタイプで翻訳されたｍＲＮＡを特定することを可能にする。この方法には、ｍＲＮＡ精製用に特定の細胞集団中でポリソームのタグ化を可能にする機能的タグ化リボソームタンパク質の発現が伴う。幾つかの実施形態では、ポリソームの精製は、親和性又は免疫親和性精製による。幾つかの実施形態では、細胞サブタイプが遺伝子的に標的とされる。幾つかの実施形態では、タグ化リボソームをトランスジェニック動物中で発現させる。
翻訳プロファイリング及び分子表現型解析用の翻訳中リボソーム親和性精製法（ＴＲＡＰ）には、親和性に基づく、場合によっては免疫親和性に基づくｍＲＮＡ精製用に特定の細胞集団中でポリソームのタグ化を可能にするタグ化リボソームタンパク質の発現が伴う。ある場合には、動物又はトランスジェニック動物を使用してこれが達成され、動物全体の翻訳プロファイリング及び分子表現型解析が可能になる。本明細書中で提供されている方法は、密接に関連する又は重要な細胞タイプの特徴的な分子特性の区別を明確にすることを可能にする。複数の方法で、特定の細胞タイプの生理学的適応をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｓｉｔｕで解析するために本明細書中に記載の方法を使用することができることも実証される。
リボソームの分子タグ化
本発明の実施形態では、細胞タイプ又は細胞サブタイプ特異的ポリソームｍＲＮＡを単離するための方法が提供される。上記方法は、翻訳を支援しポリソーム複合体を構築することができる機能的タグ化リボソーム又はリボソーム複合体に帰着する分子タグ化リボソームタンパク質を使用することを含む。リボソームは、分子的にタグ化することができ、１つ又は複数の目的の細胞タイプ又は細胞サブタイプで発現させることができる。本開示の目的のための分子タグ化リボソームタンパク質は、「融合タンパク質」又は「タグ化タンパク質」又は「分子タグ化融合タンパク質」又は「分子タグ化リボソームタンパク質」と置き換え可能に参照される。種々の実施形態では、これらの融合タンパク質は、リボソームタンパク質の全て又は部分を含有している。ある実施形態では、リボソームのタグ化は、タグ化タンパク質の天然機能又は分布の異常を引き起こすことはなく、したがってその結果として機能的リボソーム、機能的リボソーム複合体、又は機能的ポリソームがもたらされる。すなわち、分子的にタグ化されているが、天然リボソームタンパク質の生物活性を有する部分が保持されており、完全リボソーム中で機能してｍＲＮＡの翻訳又はｍＲＮＡとの結合を実行することができる。幾つかの実施形態では、分子タグ化リボソームは、選択した細胞タイプ又は細胞サブタイプでの発現を指図する調節エレメント又は転写ユニットの制御下にある分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸を、細胞、培養物、切片、又は生物全体に導入することにより、目的の器官、組織、細胞タイプ、又は細胞サブタイプで発現される。幾つかの実施形態では、タグ化されるリボソームタンパク質は、分子タグ化タンパク質を発現する細胞と同一の種に由来してもよく又は異なる種に由来してもよい。
ある実施形態では、リボソーム又はリボソームタンパク質は、遺伝子操作されていないリボソーム又はリボソームタンパク質が結合しない低分子、タンパク質、又はペプチドに融合又は結合するようにリボソームタンパク質を遺伝子操作することにより、分子的にタグ化される。ある実施形態では、タグと融合したリボソームタンパク質をコードする核酸は、タグ配列のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、リボソームタンパク質をコードするヌクレオチド配列とインフレームで遺伝子操作される日常的な遺伝子工学法により生成することができる。これは、当技術分野で公知である任意の方法により、例えばオリゴヌクレオチドを媒介とした部位特異的変異誘発又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び他の日常的な分子生物学のプロトコールにより達成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．を参照、これらは両方とも本明細書によりそれらの全体が参照により組み込まれる）。
例示的な実施形態では、リボソームタンパク質はＬ１０ａであり、タグはｅＧＦＰである。
１）リボソームタンパク質
タグ化タンパク質をコードする核酸は、当技術分野で周知の遺伝子工学法並びにクローニング及び発現ベクターを使用して生成することができる。幾つかの実施形態では、天然に存在するか又は合成的に生成された核酸又は遺伝子は、リボソームタンパク質として機能して、翻訳を支援するか又はポリソーム性の翻訳中リボソームｍＲＮＡとの結合（直接的又は間接的）若しくは付随を支援するように遺伝子操作することができる。分子的にタグ化されるリボソームタンパク質をコードする核酸は、当技術分野で公知である任意の方法を使用して取得することができる。核酸は、例えば、公表されている配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲにより取得することができる。他の関連リボソーム（例えば、他の種に由来する）は、手持ちのリボソームをプローブとして使用して、適切な核酸ライブラリーを低度、中程度、又は高度なストリンジェンシーでハイブリダイゼーションすることにより取得することができる。
本発明の種々の実施形態で使用される例示的なリボソームタンパク質は、表１に提供されているが、列挙されているものに限定されない。
例示的な実施形態では、リボソームタンパク質はＬ１０ａである。幾つかの実施形態では、タグ化リボソームタンパク質は、リボソーム複合体に組み込まれており、１つ又は複数のｍＲＮＡに付随しているが、ｍＲＮＡと直接的には結合していない。
ある実施形態では、分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸は、特定の発現系を対象としており、そこでは、コドン頻度が、タンパク質が発現される宿主細胞又は生物のｔＲＮＡ頻度を反映している。コドン最適化は、目的遺伝子の翻訳効率を増加させることにより最大限のタンパク質発現を可能にすることができる。他の実施形態では、分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸は、それが産生される宿主細胞での発現を増加させるためにコドンが最適化されている合成核酸であってもよい。
２）分子タグ
分子タグは、目的細胞（又はタグ化リボソームをそこから単離することになる細胞画分、又はタグに結合する試薬と接触することになる他の細胞）に存在しないか又は目的細胞に到達可能ではない任意のタンパク質（又はその断片、部分、類似体、又は誘導体）であってよく、タグを認識し、溶液に（それによりタグに）到達可能である試薬（抗体など）又は方法（光学的、蛍光的、又は磁気的な選別など）が分子タグのために存在する。
レポーター遺伝子として伝統的に使用されているタグによる分子タグ化は、当技術分野で周知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．６．１， “Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ” （２００４））。エピトープによる分子タグ化も、当技術分野で周知である（Ｆｒｉｔｚｅ Ｃ Ｅ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｔ Ｒ． Ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ： ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０００；３２７：３−１６で概説されている「エピトープタグ化（ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ）」；Ｊａｒｖｉｋ Ｊ Ｗ， Ｔｅｌｍｅｒ Ｃ Ａ． Ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． １９９８；３２：６０１−１８）。
タグには、タグ化タンパク質の容易な特定及び単離を可能にするが、タグ化タンパク質の機能を最小限に又は無視できる程度にしか阻害又は干渉しない方法／試薬／デバイスがそれらのタグに存在するものが含まれていてもよい。タグは、天然に存在するか又は合成的に生成された完全タンパク質であってもよく、対応する結合試薬／方法への結合を可能にする任意の長さのその断片、類似体、又は誘導体であってもよい。ある実施形態では、タグは、約８、１０、１２、１５、１８、又は２０個のアミノ酸であり、１５、２０、２５、３０、４０、又は５０個未満のアミノ酸であるが、長さが１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００個、又はそれを超えるアミノ酸であってもよい。タグは、タグがなければ以下のいずれの成分とも結合しない試薬と特異的に結合することができる：（１）目的細胞、又は（２）目的ポリソーム調製物、又は（３）タグと結合する試薬と接触しているあらゆる目的細胞画分。
ある実施形態では、タグをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質のこれらの部分が検出用試薬、親和性試薬、免疫学用試薬、又は精製用試薬に到達可能である場合が多いため、タグは、好ましくはリボソームタンパク質のＮ末端又はＣ末端に配置されるようにインフレームで挿入される。或いは、タグは、融合タンパク質が完全リボソームに組み込まれる場合、リボソーム機能が損なわれず、タグが検出、単離、及び／又は精製に使用される試薬／方法に到達可能であるように、リボソームタンパク質の任意の部分に挿入することができる。すなわち、タグ化は、リボソームが依然として機能的であることを可能にする。他の実施形態では、リボソームタンパク質は、複数のタグで分子的にタグ化されていてもよい。
幾つかの実施形態では、タグは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰは、光学的又は免疫親和性タグとして様々な応用のために使用することができ、それらは全て当技術分野で周知である。ＧＦＰは、２３８個のアミノ酸（２６．９ｋＤａ）で構成された、青色光に曝露されると緑色蛍光を発するクラゲから最初に単離されたタンパク質である（Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ Ｆ， Ｍａｎｎ Ｋ （１９７８）．“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｅｑｕｏｒｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｆｏｒｓｋａｌｅａ”． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７ （１７）：３４４８−５３；Ｔｓｉｅｎ Ｒ （１９９８）． “Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ”． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７： ５０９−４４）。オワンクラゲ（Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のＧＦＰは、３９５ｎｍの波長に主要な励起ピークを有し、４７５ｎｍに小励起ピークを有する。その発光ピークは、可視スペクトルのより低い緑色部分である５０９ｎｍである。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧＦＰは、４９８ｎｍに単一の主要な励起ピークを有する。細胞及び分子生物学では、ＧＦＰ遺伝子は、発現のリポーターとして頻繁に使用されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｇ （２００１）． “Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−−ａ ｂｒｉｇｈｔ ｉｄｅａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ”． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２０４ （１）： ９−１８．）。改変された形態のＧＦＰを使用してバイオセンサーが作製されており、ＧＦＰを発現する多数の動物が作製されている。ＧＦＰ遺伝子は、生物に導入して育種により生物のゲノム中で維持することができ、又は遺伝子を導入するためにウイルスベクターによる局所注射を使用することができる。現在まで、多数の細菌、酵母、及び他の真菌細胞、植物、ハエ、並びに哺乳動物細胞が、ＧＦＰをマーカーとして使用して作製されている。
他の実施形態では、タグは、ＧＦＰ変異体、その改変体、類似体、断片、又は誘導体である。様々なＧＦＰ変異体が人工的に作り出されている（Ｓｈａｎｅｒ Ｎ， Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ Ｐ， Ｔｓｉｅｎ Ｒ （２００５）． "Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ"． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２ （１２）： ９０５−９）。１つの改良は、Ｒｏｇｅｒ Ｔｓｉｅｎにより１９９５年にＮａｔｕｒｅで報告されている単一点変異（Ｓ６５Ｔ）であった（Ｈｅｉｍ Ｒ， Ｃｕｂｉｔｔ Ａ， Ｔｓｉｅｎ Ｒ （１９９５）． "Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ"． Ｎａｔｕｒｅ ３７３ （６５１６）： ６６３−４）。３７℃フォールディング効率化（Ｆ６４Ｌ）点変異をスキャフォールドに付加することにより、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）が産出された。ｅＧＦＰは、９．１３×１０−２１ ｍ２／分子の吸光係数（εと示される）（その光学断面積としても知られている）を有し、それは５５，０００Ｌ／（ｍｏｌ×ｃｍ）としても引用される（Ｓｈｅｌｌｅｙ Ｒ． ＭｃＲａｅ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｌ． Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｉａｎ Ｒ． Ｂｕｓｈｅｌｌ （Ｍａｙ ２００５））． "Ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＧＦＰ， ＥＹＦＰ， ａｎｄ ＥＣＦＰ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ"． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４１ （１）： １２１−１２７．）。スーパーフォールダーＧＦＰ、すなわちＧＦＰが完全にフォールディングしていないペプチドに融合されたとしても、迅速にフォールディング及び成熟化することを可能にする一連の変異が、２００６年に報告された（Ｐｅｄｅｌａｃｑ Ｊ， Ｃａｂａｎｔｏｕｓ Ｓ， Ｔｒａｎ Ｔ， Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ Ｔ， Ｗａｌｄｏ Ｇ （２００６）． "Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ"． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４ （１）： ７９−８８）。例示的な実施形態では、タグは高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）である。
他の変異がなされており、それらには発色変異体、特に青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、及び黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）が含まれる。ＢＦＰ誘導体（ｍＫａｌａｍａ１は除く）は、Ｙ６６Ｈ置換を含有している。シアン誘導体の変異は、Ｙ６６Ｗ置換である。ＹＦＰ誘導体の赤方偏移波長は、Ｔ２０３Ｙ変異により達成される（Ｔｓｉｅｎ Ｒ （１９９８）． "Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ"． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７： ５０９−４４）。
分子タグには、両蛍光、磁性、エピトープ、放射性、又は他の検出可能なタグ、例としては、限定ではないが表２に列挙されているものが含まれていてもよい。
表２に関する文献は以下に提供されており、これらは参照により本明細書中に組み込まれる：Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５（１２）：３６１０−３６１６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅ １６９（１）：５３−５８；Ｂｏｒｎｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２６：２４５−５４；Ｗｉｌｓｏｎ Ｉ Ａ， Ｎｉｍａｎ Ｈ Ｌ， Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｒ Ａ， Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ Ａ Ｒ， Ｃｏｎｎｏｌｌｙ Ｍ Ｌ， Ｌｅｍｅｒ Ｒ Ａ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ． １９８４ Ｊｕｌｙ；３７（３）：７６７−７８；Ｅｖａｎ Ｇ Ｉ， Ｌｅｗｉｓ Ｇ Ｋ， Ｒａｍｓａｙ Ｇ， Ｂｉｓｈｏｐ Ｊ Ｍ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃ−ｍｙｃ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９８５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５（１２）：３６１０−６；Ｗａｎｇ Ｌ Ｆ， Ｙｕ Ｍ， Ｗｈｉｔｅ Ｊ Ｒ， Ｅａｔｏｎ Ｂ Ｔ． ＢＴａｇ： ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇ ｆｏｒ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｇｅｎｅ． １９９６ Ｆｅｂ． ２２；１６９（１）：５３−８；１９８７年１０月２７に交付されたＨｏｐｐらの「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ」と題する米国特許第４，７０３，００４号明細書；Ｂｒｉｚｚａｒｄ Ｂ Ｌ， Ｃｈｕｂｅｔ Ｒ Ｇ， Ｖｉｚａｒｄ Ｄ Ｌ． Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇｇｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｌｕｔｉｏｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １９９４ Ａｐｒｉｌ；１６（４）：７３０−５；Ｋｎａｐｐｉｋ Ａ， Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ． Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １９９４ Ｏｃｔｏｂｅｒ； １７（４）：７５４−７６１；１９９６年４月９日に交付されたＳｋｅｒｒａらのＦｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎと題する米国特許第５，５０６，１２１号明細書；Ｓｋｅｒｒａ Ａ， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ Ｇ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ： ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ． Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ． １９９９ Ｄｅｃ． ３１；１６（１−４）：７９−８６；Ｓｋｅｒｒａ Ａ， Ｓｃｈｎｕｄｔ Ｔ Ｇ． Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０００；３２６：２７１−３０４；Ｓｈａｎｅｒ Ｎ， Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ Ｐ， Ｔｓｉｅｎ Ｒ （２００５）． "Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ"． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２ （１２）： ９０５−９． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ８１９． ＰＭＩＤ １６２９９４７５．；；Ｓｈａｎｅｒ Ｎ， Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ Ｐ， Ｔｓｉｅｎ Ｒ （２００５）． “Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２ （１２）： ９０５−９． ＰＭＩＤ １６２９９４７５；Ｈｅｉｍ Ｒ， Ｃｕｂｉｔｔ Ａ， Ｔｓｉｅｎ Ｒ （１９９５）． “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”． Ｎａｔｕｒｅ ３７３ （６５１６）： ６６３−４． ＰＭＩＤ ７８５４４４３；Ｓｈｅｌｌｅｙ Ｒ． ＭｃＲａｅ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｌ． Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｉａｎ Ｒ． Ｂｕｓｈｅｌｌ （Ｍａｙ ２００５）． “Ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＧＦＰ， ＥＹＦＰ， ａｎｄ ＥＣＦＰ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ”． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４１ （１）： １２１−１２７；Ｐｅｄｅｌａｃｑ Ｊ， Ｃａｂａｎｔｏｕｓ Ｓ， Ｔｒａｎ Ｔ， Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ Ｔ， Ｗａｌｄｏ Ｇ （２００６）． “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ”． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４ （１）： ７９−８８． ＰＭＩＤ １６３６９５４１；Ｍｉｅｓｅｎｂｏｃｋ Ｇ， Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ Ｄ， Ｒｏｔｈｍａｎ Ｊ （１９９８）． “Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”． Ｎａｔｕｒｅ ３９４ （６６８９）： １９２−５． ＰＭＩＤ ９６７１３０４。
リボソーム、ポリソーム、ｍＲＮＡの単離
１） リボソームの単離
細胞、培養細胞、及び組織から、リボソーム／タグ化リボソーム、特にポリソーム（ｍＲＮＡと結合したリボソームのクラスター）／タグ化ポリソームを単離するための種々の方法が存在する（例えば、Ｂｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｏｌｙｓｏｍｅｓ， ｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｒｉｃｋｗｏｏｄ （ｅｄｓ．）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ． ２８０−２８５を参照；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。ポリソームは、ポリリボソーム、リボソーム複合体、又はリボソームクラスターと置き換え可能に参照される。好ましい実施形態では、単離されたポリソーム（リボソーム−ｍＲＮＡ複合体）は、翻訳を支援することができ、ｍＲＮＡに付随することができ、及び／又は翻訳因子に付随することができる機能的リボソームを含有している。
ある実施形態では、使用される単離法は、以下の態様のうちの１つ以上を有する：
ａ 単離中はリボソームサブユニットをｍＲＮＡ上で維持すること：エメチン又はシクロヘキシミドなどの翻訳停止化合物を添加して翻訳を停止させることができ、それによりｍＲＮＡがリボソームから脱離することを低減又は防止する。好ましい実施形態では、単離は、架橋及び架橋試薬を用いずに達成される；
ｂ 内因性ＲＮＡａｓｅ活性を阻害すること：ＲＮＡａｓｅ阻害剤を緩衝液に添加して、ｍＲＮＡの完全性を維持することができる；
ｃ ポリソームを単離すること：組織又は細胞均質化の後、全ポリソームを、少なくとも高塩濃度緩衝液、例えば約１００〜１５０ｍＭ ＫＣｌの存在下でポストミトコンドリア上清を調製することにより単離する；
ｄ 非変性条件下で粗ＥＲ結合ポリソームを可溶化すること：表面活性剤を添加して小胞体膜から膜結合型ポリソームを放出することもでき、全ポリソームを、通常は例えばスクロースクッションによる遠心分離により収集する。
他の実施形態では、上述の一般的方法の変法を使用して、ポリソームの全貯留から膜結合型ポリソームを単離する。これにより、分泌型又は膜貫通型タンパク質をコードするｍＲＮＡのさらなる富化が可能になる。種々の方法を使用して、培養細胞及び組織から膜結合型ポリゾームを単離することができ、例えば分画遠心法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（Ｈａｌｌ Ｃ， Ｌｉｍ Ｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ， ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． １９８１ Ａｐｒ． １５；１９６（１）：３２７−３６）、レートゾーン遠心分離法（ｒａｔｅ−ｚｏｎａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌｅ， １９８６， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｄｅｇｒａｄｅｄ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｐｏｌｙｓｏｍａｌ ｍＲＮＡ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｂｒａｉｎ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４７（３）：９５３−９５７）、等密度遠心法（Ｍｅｃｈｌｅｒ， １９８７， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｐｏｌｙｓｏｍｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２： ２４１−２４８）、及び微分抽出（Ｂｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｏｌｙｓｏｍｅｓ， ｉｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｒｉｃｋｗｏｏｄ （ｅｄｓ．）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ． ２８０−２８５；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）を使用して膜結合型ポリソームを単離する方法を使用することができる（Ｈｅｉｎｔｚ、米国特許公開第２００５０００９０２８号明細書、その全体が組み込まれる）。
他の実施形態では、親和性法が、クロマトグラフィー、固相クロマトグラフィー、析出、マトリックス、共免疫沈降などを含むがそれらに限定されない、当技術分野で周知の方法を使用してタグ化タンパク質を単離又は精製するために使用される。
特定の実施形態では、ｍＲＮＡに結合しており、分子タグ用の試薬に結合することができる分子タグ化機能的リボソームが提供される。他の実施形態では、分子タグ化リボソームは、ビーズ、レジン、又はクロマトグラフィーレジン、例えばアガロース及びセファロースなどの固体表面に共有結合又は非共有結合で結合されている特異的試薬又は親和性試薬と結合する。他の実施形態では、他の方法が、親和性精製と共に又はその代りに使用される。他の実施形態では、特定のポリソームは、光学的選別法及びデバイス、蛍光に基づく選別法及びデバイス、又は磁気に基づく選別法及びデバイスを使用して単離することができる。
ある実施形態では、ポリソームは、親和性精製にかけるまでは、ポストミトコンドリア上清から又は細胞若しくは組織の溶解産物からでさえ単離されない。
図２ａは、抗ＧＦＰ抗体がコーティングされたビーズを使用したｅＧＦＰタグ化ポリソームの親和性精製を例示するための模式図を表示する。
２）リボソームからのｍＲＮＡの単離
タグ化リボソームが単離されると、当技術分野で周知の化学的方法、機械的方法、又は他の方法を使用して、タンパク質と複合体化した付随ｍＲＮＡを単離することができる。例えば、ｍＲＮＡの溶出は、緩衝液にＥＤＴＡを添加することにより達成され、これによりポリソームが分断され、解析用の結合ｍＲＮＡの単離が可能になる（Ｓｃｈｕｔｚ， ｅｔ ａｌ． （１９７７）， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４：７１−８４； Ｋｒａｕｓ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ （１９８２）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：４０１５−４０１９）。加えて、単離されたポリソーム（単離マトリックスに結合しているか又は単離マトリックスから分離されている）は、Ｔｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ社製）又はトリアゾール（Ｓｉｇｍａ社製）などの試薬を使用するＲＮＡ単離手順に直接投入することができる。特定の実施形態では、ｐｏｌｙ Ａ．ｓｕｐ．＋ｍＲＮＡは、ｏｌｉｇｏｄＴセルロースとのハイブリダイゼーションにより優先的に単離される。ｍＲＮＡ単離法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．に記載されており、本明細書によりそれらは両方とも参照によりそれらの全体が組み込まれる）。
タグ化リボソームのクローニング、発現、及び制御用の核酸配列
１） 一般
当業者に周知である方法を使用して、発現に必要である適切な転写及び翻訳制御シグナルに作用して結合されたタグ化リボソームタンパク質コード配列を含有するベクターを構築することができる。これらの方法には、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子換えが含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．に記載されている技術を参照されたい。
２）調節配列
本発明のある実施形態では、調節配列の制御下にあるタグ化リボソームタンパク質のコード配列を含む核酸構築体を含有するベクター、細胞系統、及び生物系統が提供される。本明細書中に記載の方法により、タグ化リボソームタンパク質を、天然に存在するか又は所望の発現パターンを反復するように遺伝子操作された調節エレメントを使用して、特定の選択された細胞タイプ、細胞サブタイプ、分子経路又は回路において選択的に発現させる。そのような発現は、選択した細胞タイプ、サブタイプ、経路、回路、及び／又は発生ポイントで発現された特徴的な又は内因性に制御された遺伝子に由来する調節配列又は転写ユニットを使用して、タグ化リボソームタンパク質の発現を駆動することにより達成される。ある実施形態では、特定の細胞タイプは、共通の特徴を共有する識別できる細胞群を含む混合細胞集団内に存在する細胞タイプである。この群は、形態学的に、解剖学的に、遺伝学的に、又は機能的に特定可能であってもよい。他の実施形態では、この群は、形態学的に、遺伝学的に、及び発生的に区別不能であるが、遺伝学的には区別可能であってもよい。この細胞集団は、選択的に発現されるため、内因性に制御された特徴的遺伝子（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ）の正の発現に基づいて特徴付け又は認識することができる。調節配列／エレメントの幾つか又は全てを核酸（導入遺伝子を含む）に組み込んで、タグ化リボソームタンパク質コード配列の発現を制御することができる。調節配列又はエレメントの例には、これらに限定されないが、エンハンサー配列、インスレーター配列、サイレンサー配列、又は前記配列の組み合わせが含まれる。ある実施形態では、構成的に発現されない（つまり、その発現パターンがある種の空間的又は時間的な制限を示す）遺伝子を、調節配列の供給源として使用する。他の実施形態では、構成的に発現される遺伝子を、調節配列の供給源として使用する。他の実施形態では、調節配列は、所望の発現特徴及びパターンを達成するように遺伝子操作又は改変されている。
調節領域は、目的遺伝子の遺伝子座に由来する調節配列の全体又は部分であってもよい。例えば、中型星状神経細胞においてタグ化リボソームタンパク質（例えば、ｅＧＦＰタグ化Ｌ１０ａ）の特異的発現を駆動するためには、中型星状神経細胞特異的遺伝子座、例えばＤｒｄ１ａ又はＤｒｄ２に由来する調節配列を使用することができる。別の例では、運動ニューロンにおいてタグ化リボソームタンパク質（例えば、ｅＧＦＰタグ化Ｌ１０ａ）の特異的発現を駆動するためには、運動ニューロン特異的遺伝子座、例えばコリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）遺伝子座に由来する調節配列を使用することができる。同様に、小脳細胞においてタグ化リボソームタンパク質（例えば、ｅＧＦＰタグ化Ｌ１０ａ）の特異的発現を駆動するためには、小脳細胞特異的遺伝子座に由来する調節配列を使用することができる。例えば、Ｐｃｐ２、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｇｒｍ２、Ｇｒｐ、Ｓｅｐｔｉｎ４、又はＡｌｄｈ１ｌ１に由来する遺伝子座を使用して、それぞれプルキンエ細胞、顆粒細胞、ゴルジニューロン、単極刷毛細胞、ベルクマングリア細胞、及び星状細胞での特異的発現を駆動することができる。遺伝子座全体、遺伝子座の非コード領域全体、遺伝子座の部分、又は改変遺伝子座を調節配列として使用して、遺伝学的に標的とされた細胞サブタイプに特異的な様式でタグ化ボソームタンパク質の発現を駆動することができる。
タグ化リボソーム遺伝子コード配列は、タグ化リボソームタンパク質遺伝子コード配列の発現により特徴付けられる細胞集団を含有する形質転換された生物又は少なくとも生物の解剖学的領域又は組織（例としては、動物の脳、脊髄、心臓、皮膚、骨、頭部、肢、血液、筋肉、末梢神経系など）において、タグ化リボソーム遺伝子が、その遺伝子座に見出される内因性に制御された遺伝子と実質的に同じ発現パターンで発現されるように、特定の遺伝子座に由来する調節配列の幾つか又は全ての転写制御下に配置されていてもよい。「実質的に同じ発現パターン」とは、タグ化リボソームタンパク質遺伝子コード配列が、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、他の遺伝子発現検出法、又は当業者によく知られている機能的方法により内因性の特徴的遺伝子を発現することが示されている細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び約１００％で発現されることを意味する。
調節配列は、例えば、特徴的遺伝子のプロモーター若しくはエンハンサー、又は他のシス若しくはトランス活性化エレメント、又は転写ユニットである。幾つかの実施形態では、この特徴的遺伝子は、宿主細胞又は宿主生物に内因性であり（又は内因性遺伝子のオルソログである）、その生物の特定の選択された細胞集団で発現される。調節配列は、特定のニューロン経路、細胞経路、及び代謝経路に関連するヒト、ラット、若しくはマウス、又は任意の哺乳動物の遺伝子に由来していてもよい。ある実施形態では、非哺乳動物調節配列を使用することができる。幾つかの既知の経路に由来するシス及びトランス、５’及び３’調節配列及び転写ユニットは、細胞タイプ特異的、細胞サブタイプ特異的、発生段階特異的、時間特異的、組織特異的、経路特異的、又は回路特異的な導入遺伝子の発現に適用することができる。既知の経路の例には、これらに限定されないが、アドレナリン作働性若しくはノルアドレナリン作働性神経伝達物質経路、ドーパミン作働性神経伝達物質経路、ＧＡＢＡ作働性神経伝達物質経路、グルタミン作働性神経伝達物質経路、グリシン作働性神経伝達物質経路、ヒスタミン作働性神経伝達物質経路、神経ペプチド作動性神経伝達物質経路、セロトニン作動性神経伝達物質経路、ヌクレオチド受容体特異的経路、イオンチャネル、転写因子、未分化又は不完全分化細胞のマーカー、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路、カルシウム結合、又は神経栄養因子受容体（米国特許出願公開第２００５／０００９０２８号明細書中の表、参照により本明細書中に組み込まれる）が含まれる。
ある実施形態では、発現を制御するために使用することができる調節配列は、これらを含むがこれらに限定されない、組織特異性を示し細胞培養及びトランスジェニック動物で使用されてきた以下の動物転写制御領域に由来してもよい。転写制御領域の例は、エラスターゼＩ遺伝子制御領域、エノラーゼプロモーター、インスリン遺伝子制御領域、免疫グロブリン遺伝子制御領域、マウス乳腺腫瘍ウィルス制御領域、アルブミン遺伝子制御領域、アルファ胎児タンパク質遺伝子制御領域、アルファ１抗トリプシン遺伝子制御領域、ベータグロビン遺伝子制御領域、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、ミオシン軽鎖２遺伝子制御領域、及び性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子制御領域である。他の実施形態では、調節配列が由来する遺伝子配列は、プロテインキナーゼＣ、ガンマ、ＴＨエラスチン、Ｐａｘ７、Ｅｐｈ受容体、ｉｓｌｅｔ−１、及びソニックヘッジホッグであってもよい。
発現の制御に使用される核酸は、選択した遺伝子の天然に存在するか又は改変された遺伝子座に由来する上流及び／又は下流並びに５’及び／又は３’調節配列の全て又は部分を含んでいてもよい。調節配列は、好ましくは、トランスジェニック生物又はそれに由来する組織内で内因性の特徴的遺伝子と実質的に同じパターンで、タグ化リボソームタンパク質配列の発現を指図する。これにより、内因性の制御様式でタグ化リボソームタンパク質の発現を指図する可能性のある、ありとあらゆるシス及びトランス作用性調節配列及び転写ユニットが提供されることになる。調節配列は、長さが１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、５００ｋｂ、又は１Ｍｂでさえあってもよい。
ある実施形態では、分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸を、Ｆｅｎｇら（２０００， Ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ＧＦＰ， Ｎｅｕｒｏｎ ２８（１）：４１−５１、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）に記載されているように、無作為だが識別可能な細胞のサブセット中で選択的に発現させることができる。そのような方法を使用して独立して生成されたトランスジェニック系統では、分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸を、固有のパターンで恐らくは経路特異的又は回路特異的に発現することができ、空間的に離れているが、全て同一の調節エレメントが組み込むまれることになる。
３）調節配列及び導入遺伝子の配置及び構築
ある実施形態では、タグ化リボソームタンパク質産物をコードするヌクレオチド配列で、特徴的遺伝子のゲノムクローン／遺伝子座にある特徴的遺伝子コード配列の全て又は部分を置換し、特徴的遺伝子非コード制御配列の全て又は一部のみを残してもよい。
他の実施形態では、タグ化リボソーム遺伝子コード配列は、ゲノム特徴的遺伝子配列の転写コード配列又は非コード配列に挿入されるか又はそれらを置換し、例えば、特徴的遺伝子ゲノム配列のエキソン領域又は３’ＵＴＲ領域に挿入されるか又はそれらを置換する。
１つの実施形態では、タグ化リボソームタンパク質遺伝子コード配列は、特徴的遺伝子ゲノム配列の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の部分に挿入されるか又はそれを置換する。別の実施形態では、特徴的遺伝子のコード配列は、タグ化融合タンパク質遺伝子の発現に影響を与えずに核酸構築体由来の特徴的遺伝子発現を消滅させるように変異又は分断される。ある実施形態では、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列は、それ自体の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する。
幾つかの実施形態では、特徴的遺伝子の先頭にあるＡＴＧ配列に隣接して（又は特徴的遺伝子タンパク質産物の最初の２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に隣接して）インフレームでタグ化リボソームタンパク質遺伝子コード配列が挿入される５’直接融合を使用して、タグ化リボソームタンパク質遺伝子コード配列が挿入され、その結果として挿入配列が翻訳されると、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子タンパク質に融合された特徴的遺伝子配列に由来する最初のメチオニン（又は最初の少数アミノ酸）の融合タンパク質が産生される。
他の実施形態では、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子は、特徴的遺伝子ゲノム配列の５’領域にある別々のシストロンに挿入されており、独立したＩＲＥＳ配列を有する。ある実施形態では、ＩＲＥＳは、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列に作用可能に連結されており、タグ化融合タンパク質遺伝子の翻訳を指図する。ＩＲＥＳは、内因性転写調節配列の制御下で幾つかのタンパク質を合成することができる多シストロン性ｍＲＮＡの作製を可能にする。そのような構築体は、内因性遺伝子を発現する同じ細胞でのマーカータンパク質の産生を可能にするため、有利である（（Ｈｅｉｎｔｚ， ２０００， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９（６）： ９３７−４３；Ｈｅｉｎｔｚら、国際公開第９８／５９０６０号パンフレット；Ｈｅｉｎｔｚら、国際公開第０１／０５９６２号パンフレット；これらは参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）。
ある実施形態では、例えばＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルは、特徴的遺伝子又は他の幾つかの異種性遺伝子により提供することができる。開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するために、通常は、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子の所望のコード配列のリーディングフレームと同相にある。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、由来が様々であってもよく、天然及び合成の両方であってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの介在により増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５１６−４４を参照）。
この構築体は、組換えベクターの特定及び／又は選択を可能にする１つ又は複数の選択可能なマーカーを含むこともできる。選択可能なマーカーは、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子産物自体又は特徴的遺伝子の発現に必ずしも結び付かない追加的な選択可能なマーカーであってもよい。
タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子が条件的に発現されるある実施形態では、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列は、特徴的遺伝子のゲノム配列に埋込まれており、トランス活性化因子又はリコンビナーゼで作用されない限り不活性であり、それによりその後タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子の発現を、特徴的遺伝子調節配列により駆動することができる。そのような系では、トランス活性化因子遺伝子の発現は、特徴的遺伝子調節配列により制御されると共に、タグ化融合タンパク質遺伝子の発現を活性化する。
特定の実施形態では、本発明の核酸は、当技術分野で公知である遺伝子の条件的発現に利用可能な任意のタイプの誘導可能又は抑制可能な系、例えばテトラサイクリン（「ｔｅｔ系」）；インターフェロン；エストロゲン、エクジソン、又は他のステロイド誘導可能な系；Ｌａｃオペレーター、プロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６、又はラパマイシン（ＦＫ５０６）により誘導可能又は抑制可能な系を使用して条件的に発現される。例えば、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子（及び、随意にはさらに特徴的遺伝子）のコード領域が、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子の発現をさらに制御することができるように遺伝子スイッチに作用可能に連結されている、条件的に発現可能な本発明の核酸を生成することができる。このタイプのスイッチの一例は、テトラサイクリンに基づくスイッチである。
幾つかの実施形態では、本発明の核酸は、特徴的遺伝子の内因性対応物と同じ発現パターン（時間的及び／又は空間的）で、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列の発現を指図するために、特徴的遺伝子座のゲノム配列の全て又は重要な部分、少なくとも特徴的な内因性に制御された遺伝子の５’及び／又は３’調節配列の全て又は部分、少なくとも特徴的遺伝子コード配列の十分な配列５’及び／又は３’を含む。ある実施形態では、本発明の核酸は、特徴的な内因性に制御された遺伝子の、少なくとも１つのエキソン、少なくとも２つのエキソン、少なくとも３つのエキソン、１つのエキソン以外の全て、又は２つのエキソン以外の全てを含む。
４）バイナリー系を使用する発現
細胞内でのタグ化リボソームタンパク質の発現レベルが単離手順の効率化に必要である場合があるため、本発明のある実施形態では、プロモーターなどの内因性調節配列が、第２の発現構築体をその後に活性化するタンパク質の発現を駆動するバイナリー系を使用することができる。この第２の発現構築体は、プロモーターなどの強力な調節配列を使用して、内因性調節領域自体を使用して可能であるよりも高いレベルで、タグ化リボソーム融合タンパク質の発現を駆動する。
ある実施形態では、特定の集団特異的遺伝子が、集団特異的な様式で分子スイッチ（例えばリコンビナーゼ、トランス活性化因子）の発現を駆動する。その後、このスイッチは、タグ化リボソームタンパク質の発現を制御する第２の調節エレメントを介して、高レベル発現を活性化する。
例えば、分子タグ化リボソームタンパク質コード配列を、遺伝子発現の活性化因子又は抑制因子である分子スイッチ遺伝子の活性を介して条件的に発現させることができる。この場合、第２の遺伝子は、その発現が特徴的遺伝子調節配列により制御されるトランス活性化因子、例えばｔｅｔＲ、リコンビナーゼ、又はＦＬＰをコードする。分子タグ化リボソームタンパク質をコードする遺伝子は、条件的エレメント、例えばｔｅｔプロモーターに連結されているか、又はリコンビナーゼ部位、例えばＦＲＴ部位により隣接されており、ゲノム内のどこに位置していてもよい。そのような系では、分子スイッチ遺伝子の発現は、特徴的遺伝子調節配列により制御されて、分子タグ化リボゾームタンパク質の発現を活性化する。
５）転写調節系
ある実施形態では、少なくともタグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子のコード領域を、特徴的遺伝子のゲノム遺伝子座に由来する調節配列の全て又は部分に作用可能に連結し、その後タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列及び特徴的遺伝子配列を、誘導可能又は抑制可能な転写調節系に作用可能に連結することにより、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子を条件的に発現させることができる。
これらの誘導可能又は抑制可能な転写調節系のトランス活性化因子は、ベクターに遺伝子操作された配列と特異的に相互作用するように設計されている。そのような系には、テトラサイクリン（「ｔｅｔ系」）、インターフェロン、エストロゲン、エクジソン、Ｌａｃオペレーター、プロゲステロンアンタゴニストＲＵ４８６、及びラパマイシン（ＦＫ５０６）により制御される系が含まれており、ｔｅｔ系が特に好ましい（例えば、Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｏｄｅｒ， １９９８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１： ３７７−４０５を参照；その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。これらの薬物又はホルモン（又はそれらの類似体）は、天然又は変異体リガンド結合ドメイン、並びに内因性又は外因性のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインで構成されるモジュール型トランス活性化因子に作用する。ある実施形態では、検出可能な又は選択可能なマーカーの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは培地中の、又はｉｎ ｖｉｖｏでは形質転換された生物の食餌中の薬物又はホルモンの濃度を変化させることにより制御することができる。
誘導可能又は抑制可能な遺伝子系は、検出可能又は選択可能なマーカーの発現を時間的、空間的のいずれか、又は時間的及び空間的の両方で制限することができる。
他の実施形態では、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子の発現は、マーカー遺伝子が挿入されているゲノムの適切な領域における組換えによりタグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子発現を開始する又は止めるために使用されるリコンビナーゼ系を使用することにより制御される。そのようなリコンビナーゼ系は、リコンビナーゼをコードする遺伝子を使用して、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子の発現を開始する又は止めることができる（リコンビナーゼを使用した時間的遺伝子スイッチ及び「組織ハサミ」の概説は、Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ ａｎｄ Ｆｕｒｔｈ， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７： １０６２−６３を参照）。選択された細胞タイプにおける排他的な組換えは、Ｃｒｅ、ＦＬＰ野生型（ｗｔ）、ＦＬＰ−Ｌ、又はＦＬＰｅなどの部位特異的リコンビナーゼの使用により媒介することができる。組換えは、任意の当技術分野で公知の方法、例えば、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎらの方法（１９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３３０： ５７６−７８；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）；Ｔｈｏｍａｓらの方法（１１９８６， Ｃｅｌｌ ４４： ４１９−２８； 参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）；Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系；（Ｓｔｅｍｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０： ４６７−８６；Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６２３２−３６；それらは参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： １３５１−５５）；Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−テトラサイクリン制御スイッチ（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ５５４７−５１）；及びリガンド制御リコンビナーゼ系（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８５： １７５−８２；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）により達成することができる。好ましくは、リコンビナーゼは高度に活性であり、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰｅ系であり、熱安定性の強化を示す（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５： １３９−４０；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
ある実施形態では、リコンビナーゼ系を、第２の誘導可能又は抑制可能な転写調節系に連結することができる。例えば、細胞特異的Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ媒介性組換え系（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ５５４７−５１）を、上記で詳述されている細胞特異的テトラサイクリン依存性時間スイッチに結合することができる（Ｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３： １３８４−１３８６；Ｆｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１： ９３０２−０６ （１９９４）；Ｓｔ−Ｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１９）： ３８７５−７７；これらは参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる）。
１つの実施形態では、哺乳動物細胞での発現を増強する改変ｃｒｅ遺伝子が使用される（Ｇｏｒｓｋｉ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， １９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７（９）： ２０５９−６１；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
特定の実施形態では、Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら（１９９９， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８５： １７５−８２；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）のリガンド制御リコンビナーゼ系を使用することができる。この系では、受容体（例えばプロゲステロン又はエストロゲン受容体）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、リコンビナーゼの特異性を増加させるためにＣｒｅリコンビナーゼに融合されている。
６）核酸の供給源
特徴的遺伝子配列及びタグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列を含む核酸は、任意の利用可能な供給源から取得することができる。ほとんどの場合、特徴的遺伝子配列及び／又はタグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列の全て又は部分は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅ、及びマウスゲノムインフォマティクス（ＭＧＩ、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ）データベースなどの公表されている利用可能なデータベースにおいて公知である。ハイブリダイゼーションプローブは、手持ちの配列の部分を用いて、当技術分野で非常に日常的な方法（例えばフィルターハイブリダイゼーション又はＰＣＲ増幅）を使用して設計して、適切な配列を含有するクローンを例えば核酸のライブラリー又は他の供給源中で特定することができる。ある種に由来する目的遺伝子の配列が既知であり、別の種に由来する対応遺伝子が所望の場合、既知の配列に基づいてプローブを設計することは当技術分野で日常的である。プローブは、配列が所望な種に由来する核酸にハイブリダイズし、例えば、目的の種に由来するゲノム又はＤＮＡライブラリーに由来する核酸にハイブリダイゼーションする。 限定ではなく例として、ゲノムクローンは、探索されているゲノムＤＮＡとプローブとの関連性に依存して、適切なハイブリダイゼーション条件、例えば高ストリンジェンシー条件、低ストリンジェンシー条件、又は中程度のストリンジェンシー条件下でゲノムＤＮＡライブラリーを探索することにより特定することができる。
７）ベクター
手短に言えば、特徴的遺伝子ゲノム配列は、好ましくは、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及び細菌人工染色体（ＢＡＣ）などの配列の長さ（例えば１０ｋｂの配列）を収容することができ、特徴的遺伝子配列の全て又は部分を含む少なくとも５０、７０、８０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、又は１０００ｋｂの配列を包含することができるベクターに存在する。ベクターインサートが大型であればあるほど、目的の特徴的遺伝子シス及びトランス配列を含有するベクターを特定する可能性がより高くなる。幾つかの実施形態では、特徴的な内因性に制御された遺伝子のゲノム配列全体（つまりゲノム遺伝子座）を含有するベクターが存在する。他の実施形態では、ゲノム配列全体を単一ベクターに収容することができないか、又はそのようなクローンが利用可能ではない。これらの場合（又はクローンがゲノム配列全体を含有するかどうか判明していない場合）、ベクターは、ゲノム配列を含有するベクターインサートのほぼ中央にコード配列の開始部位、つまり最も５’側の末端を有する特徴的遺伝子配列を少なくとも含有しており、及び／又は特徴的遺伝子コード配列の開始部位のいずれかの側に、少なくとも２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、８０ｋｂ、１００ｋｂ、又は２００ｋｂのゲノム配列を有する。これは、当技術分野で公知である任意の方法により、例えば限定ではないが、配列決定法、制限酵素マッピング法、ＰＣＲ増幅アッセイ法などにより決定することができる。
調節領域／調節遺伝子配列を含有する適切なベクターが作製されれば、ＤＮＡを操作するための当技術分野で公知である任意の方法により、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子を特徴的遺伝子配列に組み込むことができる。１つの実施形態では、細菌内での相同組換えを使用して、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子配列を、特徴的な内因性に制御された遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ及びその内因性発現パターンの遺伝子発現を促進するのに十分な調節配列に標的指定的に挿入し、上記特徴的遺伝子配列はベクターに挿入されている。その後、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子及び調節遺伝子配列を含むベクターを、当技術分野で周知の方法、例えば本明細書中に記載の方法を使用して、形質転換生物の系統を生成するために潜在的創始体生物（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｕｎｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｍ）のゲノムに導入する。その後、そのような形質転換生物を、内因性の特徴的遺伝子の発現とよく似たタグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列の発現についてスクリーニングする。本発明の核酸を含有する幾つかの異なる構築体を、幾つかの潜在的創始体生物に導入してもよく、次いでその結果生じた形質転換生物を、タグ化リボソーム融合タンパク質遺伝子コード配列の最も良好で（例えば最高レベルの）最も正確な（内因性の特徴的遺伝子と最もよく似た発現）発現についてスクリーニングする。
核酸構築体は、周知の方法、例えば本明細書中に記載の方法を使用して、宿主又は受容細胞若しくは生物を形質転換するために使用することができる。形質転換は、恒久な遺伝的変化又は一過性の遺伝的変化のいずれであってもよい。本発明の１つの態様では、細胞ゲノムへの核酸構築体の安定的組み込みにベクターを使用する。別の態様では、ベクターはエピゾームで維持される。
８）細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び他のベクター
本明細書中に記載の方法は、選択した細胞タイプ内でタグ化リボソームタンパク質を発現する形質転換生物、例えばトランスジェニックマウスを提供する。幾つかの実施形態では、ＢＡＣ媒介性組換え（Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５（９）：８５９−８６５）を使用して、形質転換生物を作製する。そのような発現は、特定の遺伝子の内因性調節配列及び転写ユニットを使用することにより達成され、この遺伝子の発現は、選択した細胞タイプの明確な特徴である（参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる、２００２年８月２２日に国際公開第０２／０６４７４９号パンフレットとして公開された「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｌｉｎｅｓ （Ｌｉｖｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ）」と題する、ＳｅｒａｆｉｎｉによるＰＣＴ／ＵＳ０２／０４７６５にも記載されているように）。一組の選択した細胞タイプ内でタグ化リボソームタンパク質を発現するトランスジェニック動物のコレクションを収集し、多くの場合これをＢＡＣアレイコレクション（ＢＡＣａｒｒａｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と呼ぶ。
別の実施形態では、本発明の核酸は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６： ８０６−１２；及びＰｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １３： ６１）に挿入されている。一組の選択した細胞タイプまたはサブタイプ内でタグ化リボソームタンパク質を発現するトランスジェニック動物のコレクションを収集し、多くの場合これをＹＡＣアレイコレクション（ＹＡＣａｒｒａｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と呼ぶ。
他の実施形態では、本発明の核酸は、コスミド又はバクテリオファージＰ１（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： １０３−０７）などの、哺乳動物ＤＮＡの大型セグメントのクローニング用に開発された別のベクターに挿入されている。おおよそのインサートサイズは、コスミドの場合は約３０〜３５ｋｂ、バクテリオファージＰ１の場合は１００ｋｂである。
別の実施形態では、本発明の核酸は、Ｐ−１由来の人工染色体（ＰＡＣ）（Ｍｅｊｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−ｂａｓｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ （ＰＡＣｓ ａｎｄ ＢＡＣｓ） ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７（２）：１７９−８６）に挿入されている。最大インサートサイズは、約３００ｋｂである。
本明細書に記載の方法で使用されるＢＡＣ及び他のベクターは、多くの場合、ゲノム配列などの異種性ＤＮＡの大型断片を収容でき、ある実施形態ではそれらを含むことができる。そのようなベクターは、ゲノム遺伝子座全体、又は内因性に制御された発現パターンを付与し、ゲノムの核酸の組み込み部位を取り囲む調節配列の影響からコード配列の発現を隔離して、より良好に野生型発現を模倣するのに十分な配列を少なくとも含有することができる。ゲノム遺伝子座全体又はその部分を使用する場合、より小型の配列に核酸を挿入する場合と異なり、部位特異的発現の問題に直面することは、あったとしても稀である。核酸の挿入があまりにも大型である場合、他の問題に直面する場合がある。幾つかの実施形態では、ベクターは、細菌中での部位指定相同組換え（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、例えば参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれるＨｅｉｎｔｚの国際公開第９８／５９０６０号パンフレット；Ｈｅｉｎｔｚらの国際公開第０１／０５９６２号パンフレット；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： ８５９−８６５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２： ３２７−３５の方法により分子タグをコードする選択した配列が挿入されているゲノム配列を含有するＢＡＣである。
そのような方法を使用して、組換え欠損大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主菌株、つまり相同組換えを独立して支援することができない細胞、例えばＲｅｃ Ａ．ｓｕｐ．−中での相同組換えにより、ＢＡＣを直接改変することができる。１つの実施形態では、細菌中での相同組換えを使用して、特徴的遺伝子の内因性発現パターンにおけるタグ化リボソームタンパク質発現を促進するのに十分な調節配列（「特徴的遺伝子配列」称する）をコードするゲノムＤＮＡに、分子タグ化リボソームタンパク質をコードする配列を標的指定的に挿入する。それらの配列はＢＡＣに挿入されている。その後、所望の特徴的遺伝子のゲノム遺伝子座に由来する配列を含む調節領域の制御／調節下にあるタグ化融合タンパク質配列を含むＢＡＣを回収し、形質転換生物の系統用の潜在的創始体生物のゲノムに導入する。１つの態様では、相同組換えを起こすように選択された特定のヌクレオチド配列は、宿主細胞内に導入又は含有された無関係の系統（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｒｉｇｉｎ）に基づくクローニングベクターに含有されており、無関係の系統に基づくクローニングベクター単独でも、宿主細胞と組み合わせた無関係の系統に基づくクローニングベクターでも、独立して相同組換えを支援することができない（例えば、ＲｅｃＡである）。タグ化リボソームタンパク質コード配列を導入し、ＲｅｃＡ（又は他の適切な組換え酵素）を除去する（又はしない）ために使用される方法が厳密に何であるかは、使用されるＢＡＣライブラリーの性質（例えば、ＢＡＣベクターに存在する選択マーカー）に依存することになり、そのような改変は当技術分野の技術内にある。
特徴的遺伝子調節配列及び分子タグ化リボソームタンパク質コード配列を所望の配置で含有するＢＡＣは、いったん特定されれば、日常的な方法を使用して宿主大腸菌細胞から単離することができ、この中に記載されているような形質転換生物を作製するために使用することができる。
或いは、ＢＡＣを、Ｍｕｙｒｅｒｓら（１９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７（６）： １５５５−５７、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）により記載されているように、「Ｅ−Ｔクローニング」により遺伝子操作又は改変することができる。これらの方法を使用して、特定のＤＮＡを、好適な制限部位の存在とは無関係にＢＡＣへと遺伝子操作することができる。この方法は、ｒｅｃＥ及びｒｅｃＴタンパク質により媒介される相同組換えに基づく（「ＥＴクローニング」）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２０（２）： １２３−２８；参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
分子タグ化リボソームを発現するように遺伝子操作された宿主細胞及び生物
１）宿主細胞へのベクターの導入
１つの態様では、調節配列及び分子タグ化融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターを、宿主細胞のゲノムに一過性に又は安定的に導入することができる。別の態様では、ベクターを一過性に形質移入することができ、その場合ベクターは組み込まれないがエピソームとして維持される。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中では置き換え可能に使用される。
そのような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すと理解される。ある改変は変異によって次世代に生じる場合もあり又は環境的影響によって生じる場合もあるため、そのような子孫は、実際のところ親細胞と同一でない場合があるが、本明細書中で使用される場合は、この用語の範囲内に依然として含まれる。
宿主細胞は、少数の例を挙げれば、任意の原核細胞（例えば大腸菌などの細菌）であってもよく又は真核細胞（例えば、酵母、植物、昆虫（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、両生動物、有羊膜類、又は哺乳動物に由来する細胞）であってもよい。ある実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞、げっ歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、哺乳動物細胞、不死化培養細胞、又は初代ヒト若しくはげっ歯動物細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒト又はげっ歯動物の胚性幹細胞、ニューロン幹細胞、海馬幹細胞、海馬前駆細胞、又は部分的に分化した多能性細胞、又は腫瘍細胞若しくは癌細胞（特に、白血病及び他の血液系癌から生ずるものなどの循環癌細胞）である。宿主細胞におけるコード配列の発現を指図する調節エレメント（好ましくは、上述のように特徴的遺伝子に由来する）に場合により作用して結合された先述のタグ化リボソームタンパク質コード配列のいずれかを含有する遺伝子操作された宿主細胞を、複数の方法で使用することができる。ｃＤＮＡ配列及びゲノム配列の両方をクローニング及び発現することができる。
１つの態様では、宿主細胞は、組換え欠損、つまりＲｅｃ．ｓｕｐ．−であり、ＢＡＣ組換えに使用される。特定の実施形態では、宿主細胞は、複数のタイプのリボソーム融合体を含有していてもよく、その場合、異なるリボソームの融合は、同一又は異なるタグに対してである。或いは、単一のリボソームが、例えばＮ末端及びＣ末端端部の両方で、複数のタグに融合していてもよい。
ヌクレオチド配列を含有するベクターは、当技術分野で公知である方法、例えば形質移入、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、リソソーム融合、合成陽イオン性脂質、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体により所望の宿主細胞に導入することができ、その結果ヌクレオチド配列は系統の子孫へと伝えられる。哺乳動物細胞の形質転換又は形質移入用の種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５： ５２７−３７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
ある実施形態では、ベクターは培養細胞に導入される。他の実施形態では、ベクターは、増殖細胞（又は細胞集団）、例えば、腫瘍細胞、幹細胞、血液細胞、骨髄細胞、組織生検に由来する細胞などに導入される。
２）トランスジェニック動物を作製するベクターの導入
特定の実施形態は、マウス胚の単一核への前核マイクロインジェクション又は構築体を含むウイルスベクターによる感染を使用して、核酸を含有するベクターを導入する方法を包含する。マウス胚への前核インジェクション法は、当技術分野で周知であり、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ． １９８６， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．及び１９８９年１０月１０日に交付されたＷａｇｎｅｒらの米国特許第４，８７３，１９１号明細書に記載されており、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。核酸を挿入するウイルス法は、当技術分野で公知である。標的化送達には、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウィルス、アデノ随伴ウイルス、又は遺伝子送達に適用できる任意の別のウイルスを使用することができる。
３）トランスジェニック生物
当技術分野で周知の方法を使用して、任意のモデル生物を遺伝子操作し、分子タグ化リボソームを発現させことができる。これらには、限定的ではないが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生動物、魚類、ゼブラフィッシュ（ゼブラダニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））、ハエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、蠕虫（線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））、又は酵母（又は他の真菌）を含むことができる。トランスジェニック動物とは、動物の細胞の１つ又は複数が、非内因性（つまり異種性）であり、その細胞の部分にある染色体外エレメントとして存在するか、又はその生殖細胞系ＤＮＡに（つまり、その細胞の大部分又は全てのゲノムの配列に）安定的に組み込まれている核酸を含む非ヒト動物である。ある実施形態では、トランスジェニック動物は、生殖細胞系配列の安定的変化を含む。異種性核酸は、例えば宿主動物の胚又は胚性幹細胞の遺伝子操作により、そのようなトランスジェニック動物の生殖細胞系に導入される。
異種性核酸は、ランダム組み込みにより創始体生物のゲノムに組み込むことができる。ランダムの場合、組み込みは、好ましくは、内因性遺伝子が発現されないか又は誤発現されるように内因性遺伝子（複数可）をノックアウト、例えば挿入しない。
他の実施形態では、核酸は、部位指定法により、例えば部位指定相同組換え（「ノックイン」）により組み込むことができる（Ｃｈａｐｐｅｌ、米国特許第５，２７２，０７１号明細書；及び１９９１年５月１６日に公開された国際公開第９１／０６６６７号パンフレット；米国特許５，４６４，７６４号明細書；Ｃａｐｅｃｃｈｉら、１９９５年１１月７日に交付された；Ｃａｐｅｃｃｈｉら、１９９７年５月６日に交付された米国特許第５，６２７，０５９号明細書；Ｃａｐｅｃｃｈｉら、１９９６年１月３０日に交付された米国特許第５，４８７，９９２号明細書）。
形質転換生物、例えばトランスジェニック動物は、例えば上述のような動物接合体への前核インジェクションにより、ベクターを生物のゲノムにランダム組み込みすることにより生成することができる。他の方法には、当技術分野で周知のインジェクション法又はエレクトロポレーション法を使用して、培養胚細胞、例えばＥＳ細胞にベクターを導入し、その後形質転換細胞を動物胚盤胞に導入し、それにより細胞のサブセットのみが変更されたゲノムを有する「キメラ」又は「キメラ動物」を生成することが伴う。キメラは、所望のトランスジェニック動物を生成するために繁殖目的に使用されることが多い。ヘテロ接合性の変更を有する動物は、キメラの繁殖により生成される。典型的には雄雌ヘテロ接合体を繁殖させてホモ接合動物を生成する。
胚操作及びマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を生成するための方法は、当技術分野でありふれたものになっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号明細書及び第４，８７０，００９号明細書、米国特許第４，８７３，１９１号明細書、Ｈｏｇａｎ， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）、及びＷａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：１４９８４−８９に記載されている。同様の方法が他のトランスジェニック動物の生成に使用される。
トランスジェニック創始体動物は、そのゲノムに導入された核酸の存在及び／又はその動物の組織又は細胞におけるｍＲＮＡの発現に基づいて特定することができる。その後、トランスジェニック創始体動物を使用して、その核酸を保持するさらなる動物を繁殖させることができる。これらのトランスジェニック動物は、他の異種性核酸を保持する他のトランスジェニック動物へとさらに繁殖させることができる。それらの生殖細胞系細胞に相同的に組換えられた又は組み込まれたＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物の全細胞が目的核酸の生殖細胞系伝達により相同的組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。
本明細書中に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８５： ８１０−１３及び国際公開第９７／０７６６８号パンフレット及び国際公開９７／０７６６９号パンフレットに記載の方法により生成することもできる。
トランスジェニックマウスは、いったん生成されれば、当技術分野で周知の方法を使用して繁殖及び維持することができる。例として、マウスは、１０時間の暗期：１４時間の明期の周期で維持されている、環境的に管理された施設に収容することができる。マウスは、性的に成熟した時（６〜８週齢）に交配させる。ある実施形態では、遺伝子導入創始体又はキメラを、未改変の動物と交配させる。１つの実施形態では、遺伝子導入創始体又はキメラを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と交配させる。核酸がＥＳ細胞に導入され、キメラマウスが生成される特定の実施形態では、キメラを、胚性幹細胞と同じ遺伝子型を有する１２９／Ｓｖマウスと交配させる。トランスジェニックマウスの作製及び繁殖を成功させるためのプロトコールは、当技術分野で公知である（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｂ． Ｈｏｇａｎ， Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．， Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ， Ｆ． ａｎｄ Ｌａｃｙ， Ｅ．， ｅｄｓ． １９９４． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．）。
ヘテロ接合性又はホモ接合性を確立する方法は、当技術分野で周知であり、ＰＣＲ及びサザンブロッティングを使用する。
幾つかの実施形態では、トランスジェニックマウスは、非常に高度に同系であり、性差を除いて遺伝的に同一である。ホモ接合体は、ホモ接合性を保証するために戻し交配及び異種交配分析を使用して試験される。複数の組み込みを有する創始体の各組み込み部位に関するホモ接合型系統も確立される。２０世代以上の兄弟／姉妹の交配が近交系を特徴付ける。別の好ましい実施形態では、トランスジェニック系統は、ヘミ接合体として維持される。
代替的な実施形態では、個々の遺伝子改変マウス系を、繁殖ではなく凍結保存もする。創始体動物及びトランスジェニック系統を維持するために胚を凍結する方法は、当技術分野で公知である。凍結胚を再構成し、胚を満期（ｔｅｒｍ）へと導くための方法は、当技術分野で公知である。
分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸は、当技術分野で公知の方法を使用して創始体植物（または創始体植物を生成する胚）のゲノムに導入することができる（Ｎｅｗｅｌｌ， ２０００， Ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（１）：５３−６５；Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｆｌａｄｕｎｇ， ２００１， Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ （４）： １５５−１５９）。分子タグ化リボソームタンパク質をコードする核酸は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．、それぞれ１章及び１３章に記載の方法を使用して、細菌及び酵母のゲノムに導入することができる。
４）トランスジェニック生物でのタグ化リボソームタンパク質発現のスクリーニング
形質転換生物系統の潜在的な創始体生物を、内因性の特徴的遺伝子の発現を特徴とする細胞の集団中でのリボソームによる分子タグ化融合タンパク質コード配列の発現についてスクリーニングすることができる。
１つの実施形態では、それにより活性化又は抑制される分子タグ又はマーカーに特異的な抗体を使用する免疫組織化学法を使用して、分子タグの発現を検出する。別の実施形態では、光学に基づく選別又は磁気に基づく選別などの、他の方法及びデバイスを使用してタグを検出する。
適切な発現（例えば、対応する非トランスジェニック生物又はその解剖学的領域で内因性の特徴的遺伝子と実質的に同じ発現パターンを有する検出可能な発現、つまりｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより内因性遺伝子を発現することが示されている細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は好ましくは９５％での検出可能な発現）を示す形質転換生物を、形質転換生物系統として選択する。
ＢＡＣアレイ系統
幾つかの実施形態では、分子タグ化リボソームを発現する選択した細胞サブセット又は細胞集団を含有する形質転換生物系統のコレクションが提供される。幾つかの態様では、ＢＡＣに関連する方法を使用して形質転換生物が作成された場合、これをＢＡＣアレイコレクションと呼ぶ。このコレクションは、少なくとも２つの個々の系統、好ましくは少なくとも５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、５０００、１０，０００、１５，０００、又は３０，０００の個々の系統を含む。個々の系統は各々、分子タグ化リボソームが発現される細胞サブセットの特定に基づいてコレクション用に選択される。
１つの実施形態では、ニューロン疾患（神経変性疾患、神経精神疾患、行動疾患など）と関係するＢＡＣアレイ系統を作製することができる。これらには、限定的ではないが、うつ病、肥満、不安症、てんかん、睡眠、パーキンソン病、ＡＤＨＤ、ハンチントン病、依存症、認知症、アルツハイマー病、及びＡＬＳなどのような疾患プロセスに関与する細胞の発現に特異的なＢＡＣアレイ系統が含まれる。例えば、中枢神経系疾患に特異的な代表的ＢＡＣアレイコレクションについては、図１を参照されたい。
１つの実施形態では、組織のサブ領域、例えば中枢神経系の領域に関係するＢＡＣアレイコレクションを作製することができる。これらには、限定的ではないが、線条体細胞のみにおける発現（例えば、中型星状神経細胞、線条体黒質及び／又は線条体淡蒼球ニューロンにおける発現）、小脳細胞のみにおける発現（例えば、プルキンエニューロン、星状細胞、ベルクマングリア、顆粒細胞などにおける発現）、海馬細胞のみにおける発現（例えば、ＣＡ１ニューロン、ＣＡ２ニューロン、ＣＡ３／４ニューロン、グリア、星状細胞、ＤＧニューロンにおける発現）、視床下部細胞のみにおける発現、脊髄細胞のみにおける発現、及び松果腺細胞のみにおける発現などに特異的なＢＡＣアレイ系統が含まれる。
別の関連実施形態では、特定の生物学的機能に関係するＢＡＣアレイコレクションを作製することができる。これらには、限定的はないが、髄鞘形成、興奮性神経性伝達、運動機能、遊走、接着、浸潤、侵害刺激のプロセシング、感覚刺激のプロセシング、視覚プロセシング、聴覚プロセシング、嗅覚プロセシング、前庭制御、摂食及び満腹の制御、覚醒及び睡眠の制御、並びに報酬行動の制御（例えば、それがどのように常習行為に関連するかのような）などと関係する機能に特異的なＢＡＣアレイ系統が含まれる。
ｍＲＮＡ種の解析
本明細書中に記載の実施形態は、特定の細胞及び／又は組織の翻訳プロファイリング及び分子表現型解析を提供する。タグ化リボソームタンパク質を有するポリソーム中で複合体化したｍＲＮＡを単離し、当技術分野で公知である任意の方法により解析することができる。１つの態様では、タグ化リボソームタンパク質を発現する細胞の翻訳プロファイルは、ｍＲＮＡを単離しｃＤＮＡライブラリーを構築することにより、又は遺伝子発現解析用にＲＮＡを標識することにより、例えばマイクロアレイにｍＲＮＡを配置することにより解析することができる。本発明の実施形態では、その全体が本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０００９０２８号明細書に記載の技術が使用される。
１つの態様では、タグ化リボソームタンパク質と結合したｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを生成することができ、実際そのような細胞タイプ特異的、細胞サブタイプ特異的、組織特異的、生物特異的、疾患特異的、機能特異的なｃＤＮＡライブラリーのコレクションを、単離された細胞の異なる集団から生成することができる。そのようなｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子発現を解析し、細胞タイプ特異的遺伝子、スプライスバリアント、及び非コードＲＮＡを単離し特定すると共に、機能又は疾患状態と関係する特定細胞の同時制御された遺伝子セットを特定するのに有用である。別の態様では、治療及び未治療の細胞／動物又はトランスジェニック又はそうでなければ操作された細胞／動物に由来するタグ化リボソームタンパク質と結合しており、それらから単離されたｍＲＮＡから調製されたそのような細胞タイプ特異的ライブラリーを、例えばサブトラクティブハイブリダイゼーション手順で使用して、未治療動物と比較して特定の治療に応じて又は疾患状態でより高いか又はより低レベルで発現された遺伝子を特定することができる。タグ化リボソームタンパク質から単離したｍＲＮＡは、当技術分野で周知の方法により作製及び解析された特定のマイクロアレイを使用して解析することもできる。マイクロアレイ技術を使用した遺伝子発現解析は、当技術分野で周知である。マイクロアレイを作製するための方法は、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎによる米国特許第５，７００，６３７号明細書、Ｆｏｄｏｒらによる米国特許第５，５１０，２７０号明細書、及びＡｌｂｒｅｃｈｔらによる国際公開第９９／３５２９３号パンフレットに教示されており、それらは参照によりそれらの全体が組み込まれる。ｍＲＮＡの種々の集団を有するマイクロアレイを探索することにより、ある細胞集団の転写された遺伝子を特定することができる。さらに、異なる細胞タイプの細胞状態での遺伝子発現のパターンを、容易に比較することができる。
タグ化リボソームタンパク質に結合したｍＲＮＡは、例えば、ノーザンブロット解析、ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションなどにより、操作に依存してあるタンパク質産物をコードするｍＲＮＡの存在について及びこれらのｍＲＮＡの存在又はレベルの変化について解析することができる。
さらに別の実施形態では、潜在的な分子タグ化リボソームタンパク質を発現する特異的細胞又は細胞集団を、コレクションから単離し、当技術分野で公知のプロテオミクス法、例えばクロマトグラフィー、質量分析法、２Ｄゲル解析などを使用して、特定のタンパク質間相互作用又はタンパク質プロファイル全体について解析する。
他のタイプのアッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで、外植片若しくは切片組織で、又は単離された細胞のいずれかで分子タグ化リボソームタンパク質を発現する細胞集団を分析し、例えば、ある操作／治療又は候補の作用剤（例えば小分子、抗体、ハイブリッド抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、又はペプチド）に対する細胞の応答をモニターし、又はその標的若しくは阻害剤の発現に対する動物、組織、若しくは細胞の応答を、その標的若しくは阻害剤を発現しない動物、その動物に由来する組織若しくは細胞と比較することができる。細胞を、例えば、限定ではないが、電気生理の変化、生理の変化（例えば、細胞内又は細胞外カルシウム又は他のイオン濃度、ｐＨの変化、二次伝達物質の存在又は量の変化、細胞形態、細胞生存率、アポトーシスの指標、分泌因子の分泌、細胞複製、接触阻害などのような細胞の生理学的パラメータの変化）、形態の変化などについてモニターすることができる。
特定の実施形態では、単離されたｍＲＮＡを使用して、包括的な発現ライブラリー（例えば２０００年８月２９日に交付されたＳｅｒａｆｉｎｉらの米国特許第６，１１０，７１１号明細書を参照、これは参照により本明細書中に組み込まれる）を探索する。ライブラリーは、マイクロアレイなどの高密度アレイで標準化し、提供することができる。
特定の実施形態では、分子タグ化リボソームタンパク質を発現する細胞の亜集団を特定し、及び／又は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ」と題するＳｅｒａｆｉｎｉらの国際公開第９９／２９８７７号パンフレットの方法を使用して遺伝子発現を解析する。
そのような解析からのデータを使用して、動物又は特定の組織若しくは解剖学的領域、例えば脳の様々な細胞集団に関する遺伝子発現解析のデータベースを生成することができる。階層的及び非階層的クラスター化分析及び主成分分析などのバイオインフォマティクスツールと一緒にそのようなデータベースを使用して、健常及び疾患モデル動物又は組織に由来する特定の示標及び特定の機能に関して同時制御された遺伝子セットなどについて、細胞を「フィンガープリンティング」する。
応用及び考慮すべき事項
１）感度
本明細書中で提供される方法は、任意の細胞、組織、又は生物、並びに任意の疾患又は障害に応用可能である。複雑な異質性組織又は器官系の個々の細胞サブタイプを照合する（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）能力によりもたらされる感度は、全組織マイクロアレイ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの他の技術より高い可能性がある解像度を提供する。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の細胞サブタイプに特異的なｍＲＮＡ／遺伝子を検出するＴＲＡＰ法により、全組織マイクロアレイ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの他の方法で検出不能な、その細胞タイプで富化されたｍＲＮＡ／遺伝子の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、及び５０％をさえ超える特定が可能になる。
２）疾患及び障害
本明細書中で提供される方法は、任意の細胞、組織、又は生物、並びに任意の疾患又は障害に応用可能である。幾つかの疾患は、単に「メルクマニュアル」（２００６年）と呼ばれることが多い「メルクマニュアル 診断と治療」に引用されているが、それに見出されるものに限定されない。疾患及び障害は、中枢神経系障害、末梢神経系障害、及び非神経系障害であり得る。
神経変性疾患／障害の例には、これらに限定されないが以下のものが含まれる：アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイアー−フォークト−シェーグレン−バッテン病（Ｓｐｉｅｌｍｅｙｅｒ−Ｖｏｇｔ−Ｓｊｏｇｒｅｎ−Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）としても知られている）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病（Ｋｅｎｎｅｄｙ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド−ジョーゼフ病（脊髄小脳失調症３型）、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコレプシー、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス−メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する脊髄亜急性連合変性、統合失調症、シュピールマイアー−フォークト−シェーグレン−バッテン病（またバッテン病としても知られている）、脊髄小脳失調症（様々な特徴を有する複数のタイプ）、脊髄性筋萎縮症、スティール−リチャードソン−オルシェフスキー疾患、及び脊髄ろう（Ｔａｂｌｅｓ ｄｏｒｓａｌｉｓ）。
神経精神疾患／障害の例には、これらに限定されないが、うつ病、双極性障害、躁病、強迫性障害、依存症、ＡＤＨＤ、統合失調症、幻聴、摂食障害、ヒステリー、自閉症スペクトラム障害、及び人格障害が含まれる。
神経発達疾患／障害の例には、これらに限定されないが以下のものが含まれる：注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、統合失調症、強迫性障害（ＯＣＤ）、精神遅滞、自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）、脳性麻痺、脆弱Ｘ症候群、ダウン症候群、レット症候群、アスペルガー症候群、ウィリアムズ−ビューレン症候群、小児期崩壊性障害、構音障害、学習障害（つまり、読むこと又は算数）、失読症、表出性言語障害及び受容−表出混合性言語障害、言語又は行動適性。異常な神経発達プロセスに起因する場合のある疾患には、これらに限定されないが以下のものも含まれていてよい：双極性障害、食欲不振、一般うつ病、癲癇、強迫性障害（ＯＣＤ）、不安症、歯ぎしり（ｂｒｕｉｘｉｓｍ）、アンジェルマン症候群（Ａｎｇｌｅｍａｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、攻撃性、爆発性感情突発（ｅｘｐｌｏｓｉｖｅ ｏｕｔｂｕｒｓｔ）、自傷、心的外傷後ストレス、行為障害、トゥレット障害、常同性運動障害、気分障害、睡眠時無呼吸、不隠下肢症候群、睡眠異常（ｄｙｓｏｍｎｉａｓ）、妄想性人格障害、統合失調質人格障害、統合失調型人格障害、反社会的人格障害、境界人格障害、演技性人格障害、自己愛性人格障害、回避的人格障害、依存性人格障害、反応性愛着障害；分離不安障害；反抗挑戦性障害；性交疼痛症、放火癖、窃盗癖、抜毛癖、賭博、異食症、神経症性障害、アルコール関連障害、アンフェタミン関連障害、コカイン関連障害、マリファナ乱用、オピオイド関連障害、フェンシクリジン乱用、喫煙障害、神経性過食症、妄想性障害、性障害、恐怖症、身体化障害、遺尿症、遺糞症、書字表出障害、表出性言語障害、精神遅滞、算数障害、一過性チック障害、吃音、選択的無言症、クローン病、潰瘍性大腸炎、細菌過剰症候群、糖質不耐性、セリアックスプルー、感染及び寄生、腸リンパ管拡張症、短腸症候群、熱帯性スプルー、ホウィップル病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、脊髄性筋萎縮症、及びハンチントン病。神経発達障害に関するさらなる例、考察、及び情報は、例えば国立精神衛生研究所（ワールドワイドウエブサイトアドレス、ｎｉｈｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｐｔｒ／ｂ２−ｎｄ．ｃｆｍ）の神経発達障害部門に見出すことができる。
３）ｍＲＮＡ種のプロファイリング
１つの実施形態では、本発明は、目的の細胞タイプの翻訳プロファイルを取得する方法を提供する。この方法は、目的の細胞タイプで発現される遺伝子に特異的な調節配列の制御下でタグ化リボソームタンパク質を発現させることと、リボソームタンパク質と複合体化したｍＲＮＡを細胞から単離することと、ｍＲＮＡを特定して、それにより目的の細胞タイプの翻訳プロファイルを取得することとを含む。
１つの例示的な実施形態では、目的の細胞タイプは、線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞である。Ｄｒｄ１ａ又はＤｒｄ２特異的調節配列の制御下にあるｅＧＦＰに融合したＬ１０ａが発現され、翻訳プロファイルが取得される。表１０、１３、１７、及び１８には、線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞で翻訳プロファイリングされる遺伝子が特定されている。
別の例示的な実施形態では、目的の細胞タイプは、コリン作動性運動ニューロンである。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈａｔ）特異的調節配列の制御下にあるｅＧＦＰに融合したリボソームタンパク質Ｌ１０ａが発現され、翻訳プロファイルが取得される。表１９には、コリン作動性運動ニューロンで翻訳プロファイルされる遺伝子が特定されている。この実施形態では、コリン作動性運動ニューロンは空間的に離れている。
別の例示的な実施形態では、目的の細胞タイプは、小脳ニューロン及びグリア、具体的にはプルキンエニューロン及びベルクマングリアである。Ｐｃｐ２又はＳｅｐｔｉｎ４特異的調節配列のいずれかの制御下にあるｅＧＦＰに融合したリボソームタンパク質Ｌ１０ａが発現され、翻訳プロファイルが取得される。表２０には、小脳プルキンエニューロン及びベルクマングリアで翻訳プロファイリングされる遺伝子が特定されている。
別の実施形態では、細胞、組織、又は生物の操作後の遺伝子翻訳プロファイルが取得される。この方法は、細胞、組織、又は生物を操作する工程と、ＴＲＡＰ法を使用して翻訳プロファイルを取得する工程と、そのプロファイルを非操作細胞、組織、又は生物に由来する参照プロファイルと比較する工程とを含む。操作には、これらに限定されないが以下が含まれる：
ａ）薬理学的：例えば、小分子アンタゴニスト又はアゴニストなどの候補作用剤の投与；動物モデル又は細胞培養物にＭＰＴＰ又はＯＨＤＡを投与してパーキンソン病様状態を誘導するなど、疾患を再現する（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）薬理学的作用剤の投与；又は乱用薬物若しくは乱用物質、例えばコカイン又はアルコールの投与；
ｂ）遺伝子的：例えば、運動失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自閉症スペクトラム障害などの疾患又は障害の動物又は細胞モデルを再現するための、生殖細胞系若しくは非生殖細胞系変異又は導入遺伝子の導入；
ｃ）機械的：例えば、外科処置；及び／又は
ｄ）環境的：例えば、住居環境の変化、気候の変化、昼夜周期の逆転；例えば、うつ病様表現型の異常を再現するための、当技術分野において承認されている慢性軽度ストレスプロトコールの誘導。候補作用剤の例は、これらに限定的されないが、小分子、抗体、ハイブリッド抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、又はペプチドである。例示的な実施形態では、細胞は、ニューロン細胞又はグリア細胞、線条体細胞、小脳細胞、海馬細胞、視床下部細胞、皮質細胞、ドーパミン作動性細胞、脊髄細胞などの神経系の細胞である。他の実施形態では、細胞は、ドーパミン作動性ニューロン又は中型星状神経細胞などのニューロンである。
例示的な実施形態では、ドーパミン作動性線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞の翻訳プロファイルに対するコカインの影響が取得される。関連する実施形態では、コカイン急性投与の影響及びコカイン慢性投与の影響が取得される。特定の実施形態では、コカイン急性処置後の遺伝子翻訳の変化は、表１５で特定されているものを含む。関連する特定の実施形態では、コカイン慢性処置後の遺伝子翻訳の変化は、表１６で特定されているものを含む。
４）疾患スクリーニング、診断、予後予測（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓ）、及びセラノスティクス（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）
本発明の１つの実施形態は、本明細書中に記載の方法を使用して特定の疾患又は障害についてスクリーニングされたか、それらを有する疑いがあるか、又はそれらを呈している被験体から採取された組織又は細胞タイプの翻訳プロファイル及び分子表現型を確立することである。この態様では、特定の疾患又は障害に関連する及び／又はそれらを示すマーカーが特定される。１つの実施形態では、生検と同様の様式で、被験体の組織を試料用に取り出すことができる。別の実施形態では、脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料が被験体から取得されることになる。他の実施形態では、任意の体液を被験体から取得することができる。所望の組織又は液体を分離した後、分子タグ化リボソームタンパク質を、細胞タイプ特異的な発現に必要な調節エレメントを用いて誘導する。翻訳プロファイル及び分子表現型は、本明細書中に記載の方法を使用して確立する。その後、その結果生じたプロファイル及び表現型を、特定の疾患又は障害を有していないか又は呈していない被験体（複数可）、つまり参照細胞、参照組織、又は参照被験体から前記方法を使用して取得したプロファイル及び表現型と比較する。その結果は、疾患又は障害に関する診断、予後予測、セラノスティクスの目的に使用することができる。検出、診断、予後予測、又はセラノスティクスされる疾患又は障害は、本明細書中に記載の任意の疾患であってもよく、又は以前に述記されていない疾患及び障害であってもよい。
ある実施形態では、ＢＡＣ媒介性発現を使用して、分子タグ化リボソームタンパク質の発現を特定の細胞タイプにおいて駆動することができる。内因性に制御された遺伝子の発現に基づいて、幾つかの疾患又は障害と直接的に関係する限定的な発現パターンを有する幾つかのＢＡＣアレイを生成及び収集した（図１）。
５）調節作用剤のスクリーニング
本発明の別の実施形態は、所望の調節（アンタゴニスト的、アゴニスト的、相乗効果的な調節）活性の調節のための候補作用剤についてスクリーニングをすることである。ある実施形態では、ビヒクル又は候補作用剤を、単回用量で又は反復用量で細胞タイプ又は被験体のいずれかに投与する。投与後、本明細書中に記載の方法に基づいて、翻訳プロファイルを目的の細胞タイプについて確立する。候補作用剤を投与したものに由来するプロファイル及び表現型を、ビヒクル（つまり参照試料）を投与したものに由来するプロファイル及び表現型と比較及び関連付ける。候補作用剤が、目的の細胞タイプから単離された１つ又は複数のｍＲＮＡの翻訳及び表現型を調節するかどうかを決定し、それにより翻訳調節に対し前記候補作用剤をスクリーニングする。幾つかの実施形態では、候補作用剤は、候補治療薬又は候補薬物であってもよい。他の実施形態では、候補作用剤は毒素であってもよい。幾つかの実施形態では、候補作用剤は、これらに限定されないが、小分子、抗体、ハイブリッド抗体若しくは抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、タンパク質治療薬、又はペプチドであってよい。
６）治療標的スクリーニング及び選択
本発明の別の態様は、疾患又は障害に対する候補の治療標的を特定することである。ある実施形態では、これには、細胞を形質転換すること又は分子タグ化リボソームタンパク質を発現する生物を作製すること、及び細胞又は生物を異常（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）又は刺激に曝露することが伴うだろう。選択的に下方制御又は上方制御されるｍＲＮＡ転写物は、異常を改善するための潜在的な標的であろう。他の実施形態では、疾患又は障害を有する被験体に由来する細胞又は異常をきたした細胞などからの翻訳プロファイルを、他の正常な又は異常をきたしていない細胞と比較することになる。翻訳プロファイルの差異により、潜在的な治療標的の特定が可能になる。
１つの実施形態では、疾患又は障害に関連する目的の細胞タイプで、例えばこれらに限定されないが、線条体細胞、海馬細胞、皮質細胞、小脳細胞、脊髄細胞、視床下部細胞、松果体細胞、網膜細胞、聴覚細胞、嗅覚細胞、前庭細胞、又は脳幹細胞で上方制御されることが見出された任意のｍＲＮＡは、アンタゴニズムの標的を意味し得る。すなわち、特定されたｍＲＮＡによりコードされたタンパク質は、そのアンタゴニストを開発することができる治療標的であろう。１つの例示的な実施形態では、目的の標的はＧｐｒ６である。Ｇｐｒ６は、そのアンタゴニストをスクリーニングすることができ、その過剰発現によりパーキンソン病の治療薬として開発することができる標的である。
同様の様式で、上記のように、疾患又は障害に関連する目的の細胞タイプで下方制御されることが見出されたｍＲＮＡは、アゴニズムの標的を意味し得る。すなわち、特定されたｍＲＮＡによりコードされたタンパク質は、そのアゴニストを開発することができる治療標的であろう。
７）個別化医療
１つの実施形態では、その必要性のある被験体が治療薬に向いているかどうかを評価するための方法であって、被験体に由来する細胞タイプ、細胞サブタイプ、又は組織の翻訳プロファイルを決定する工程と、翻訳プロファイルが１つ又は複数の治療薬による治療を予測するかどうか決定する工程と、被験体に投与する１つ又は複数の治療薬を特定する工程とを含む方法が提供される。
別の実施形態では、１つ又は複数の治療薬をその必要性のある被験体中でスクリーニングするため方法であって、１つ又は複数の治療薬を被験体に投与する工程と、被験体に由来する細胞タイプ、細胞サブタイプ、又は組織の翻訳プロファイルを決定すること、得られた翻訳プロファイルを、正又は負の予後を示す１つ又は複数の参照プロファイルと比較する工程と、その比較に基づいて治療を継続すべきか又は変更すべきかを決定する工程とを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、異なる治療法（例えば、第一選択薬で観察された翻訳プロファイルで向いていることが示されている第二選択薬などの異なる治療薬が投与されるべきであること）が決定される。
８）同時制御された遺伝子セット
１つの実施形態では、新規遺伝子の公知の機能又は候補となる機能に関する同時制御された遺伝子セットを特定する方法が提供される。この方法は、特定の機能に関連する遺伝子を発現する複数の細胞タイプの翻訳プロファイルを決定する工程と、翻訳プロファイルを比較してどの追加的遺伝子が同様に制御されるかを決定し、それによりその機能に関与する同時制御された遺伝子セットを特定する工程とを含む。
さらなる実施形態では、機能は、細胞機能又は細胞プロセスであってもよい。他の関連する実施形態では、この方法を応用して、髄鞘形成、興奮性神経伝達、運動機能、細胞遊走、細胞接着、細胞浸潤、侵害刺激のプロセシング、感覚刺激のプロセシング、視覚プロセシング、聴覚プロセシング、嗅覚プロセシング、前庭制御、摂食及び満腹の制御、覚醒及び睡眠の制御、又は報酬行動の制御に関与する同時制御された遺伝子セットを決定する。
１つの例示的な実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質（Ｍｂｐ）を発現する複数の細胞の翻訳プロファイルを決定することを含むこの方法を応用して、髄鞘形成に関与する同時制御された遺伝子セットを決定する。関連する実施形態では、遺伝子セットは、表９に列挙されている遺伝子の１つ又は複数を含む。
この方法は、同時制御された遺伝子のコホートは、多くの場合、周知の機能を有する遺伝子を含み得るため、新規遺伝子産物の公知機能又は候補となる機能の遺伝子セットを特定するのに有用であり得る。
キット
さらなる態様では、本発明はキットを提供する。ある実施形態では、キットは、疾患、障害、及び／又は薬理学的、遺伝学的、又は環境的操作を示す１つ又は複数のマーカーの存在、非存在、及び／又は存在の差異を決定するための試薬を含有する。疾患は、限定されないが神経変性障害、神経精神障害、神経発達障害であり得る（そのような疾患又は障害に対する感受性を有する疑いのある個体に由来する試料において）。別の実施形態では、疾患又は障害は、癌などの増殖性疾患である。他の実施形態では、キットは、特定の生物学的機能に関して同時制御された遺伝子セットを特定するために使用される。生物学的機能は本明細書中に記載されている。
１つの実施形態では、キットは、カスタマイズされた一組のクローン、ベクター、分子標識用に選択できる複数の分子タグ、並びにＣＤ、使用説明書、及び選択した細胞タイプ、組織、分子経路又は回路用に正しいクローン／ベクターを個人が選ぶことを可能にするだろう他の参照ガイドなどの内容物を含有する。別の実施形態では、キットは、調節領域に作用可能に連結されたリボソームタンパク質及び検出可能なタグをコードする核酸配列をコードする組換えベクターを含有する。特定の実施形態では、キットは、特定の疾患又は障害に関係するカスタマイズされたＢＡＣアレイクローンコレクションを含有することができる。
１つの実施形態では、キットは、目的遺伝子のゲノム遺伝子座に内因性である配列を含有する調節領域に作用可能に連結されたリボソームタンパク質及び検出可能なタグをコードする核酸配列を発現するように遺伝子操作された組換えベクターを含む。関連する実施形態では、リボソームタンパク質は、検出可能なタグにインフレームで融合されている。ある実施形態では、組換えベクターはＢＡＣである。目的遺伝子は、これらに限定されないが、線条体細胞、小脳細胞、皮質細胞、視床下部細胞、海馬細胞、脳幹細胞、及び脊髄細胞で発現するものから選択することができる。例示的な実施形態では、タグはｅＧＦＰであり、リボソームタンパク質はＬ１０ａである。
本明細書中で報告されている方法は、翻訳プロファイリング及び分子表現型解析の実現技術を提供する。実施例により、密接に関連した又は重要な細胞タイプの特徴的な分子的特性を明確にすることが可能になる。実施例は、本明細書中に記載の方法を使用して、特定の細胞タイプの生理学的適応をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｓｉｔｕで解析することができることも実証する。
種々の実施形態では、組成物及び方法は、任意の目的の細胞タイプ又は組織で翻訳されたｍＲＮＡを容易に及び再現性よく特定する方法を特色とする。この方法には、特定の集団で分子タグ化リボソーム導入遺伝子を発現させることを伴い、これによりｍＲＮＡを単離、精製、及び特定するためのポリソームのタグ化が可能になる。幾つかの実施形態では、細菌人工染色体（ＢＡＣ）トランスジェニックマウスを使用してこれを達成することができ、動物全体の翻訳プロファイリング及び分子表現型解析が可能になる。
以下の例は例示のために提供されているが、請求されている発明を限定するためではない。本発明の幾つかの実施形態が本明細書中に示されており、記述されているが、当業者であれば、そのような実施形態が単なる例として提供されていることは明白だろう。当業者であれば、本発明から逸脱しない多数の変形、変更、及び置換を直ちに思いつくだろう。本明細書中に記載されている本発明の実施形態の種々の代替形態が、本発明を実施する際に使用できることが理解されるべきである。
実施例１ リボソームタンパク質の分子タグ化
タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡは、通常ある時点で、リボソーム又はポリリボソーム複合体（ポリソーム）に結合する。本明細書中に記載のものに限定されないが、リボソームタンパク質に融合された任意のタグにより、結合ｍＲＮＡの単離が可能になる。大型サブユニットリボソームタンパク質Ｌ１０ａのＮ末端に融合されたｅＧＦＰ（以降はｅＧＦＰ−Ｌ１０ａと呼ぶ）を、この実施例及びその後の実施例に使用したが、使用することができる数十、数百、数千、又はそれより多くのタグ−タンパク質の組み合わせにさえ限定されることは全くない。
図２：（ａ）模式図は、抗ＧＦＰ抗体をコーティングしたビーズを使用したｅＧＦＰタグ化ポリソーム（標的細胞集団に由来する）の親和性精製を例示するために示されている（ａの模式図）。高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）とリボソームタンパク質との融合物を、ポリソームへの効率的な組み込みについてスクリーニングして、翻訳された細胞ｍＲＮＡ全てにタグを提供した。（ｂ）ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質を保持するＢＡＣを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質の核内及び細胞質内局在性は、完全リボソームへの組み込みと一致しており、免疫電子顕微鏡データは、ポリソーム複合体にｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質が存在することを実証した。この図には、空ベクター（左パネル）又はｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ構築体（右パネル）で形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から採取した抽出物と共にインキュベーションした後の抗ＧＦＰコーティング磁気ビーズの透過型電子顕微鏡写真が表示されており、画像は５０，０００×の倍率で取得し、挿入部分は２．３×の倍率に拡大されている。
細胞生理又は増殖速度の全体的変化は、細胞内ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現の蛍光顕微鏡で分かるように、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ形質移入細胞では明らかではなかった。カバーガラス上で増殖させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性に形質移入し、２日間増殖させ、パラホルムアルデヒドで固定し、４’，６−ジアミジノ−２フェニルインド（ＤＡＰＩ、４'，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏ）を含有する培地を用いて顕微鏡標本を作製してＤＮＡを染色した。
実施例２ ｉｎ ｖｉｒｏでのリボソーム−ｍＲＮＡ複合体の単離、精製、及び解析
ポリソームの迅速な免疫親和性精製を、擬似形質移入細胞ではなく、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子で一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から達成した。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａで形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、溶解緩衝液中で均質化した。可溶化及び清澄化した溶解産物を、線形密度（２０〜５０％重量／重量）勾配のスクロースに負荷し、Ｂｅｃｋｍａｎ社製ＳＷ４１ローターを使用して、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．（２００，０００×ｇ）で２時間４℃で遠心分離した。２５４ｎｍの吸光度をＩＳＣＯ社製ＵＡ−６ＵＶ検出器でモニターしながら、７５０μｌ画分を収集した。
形質移入した細胞培養物（細胞のおよそ３０％がｅＧＦＰ−Ｌ１０ａを発現した）からのポリソームの免疫親和性精製は、およそ１０％の非タグ化リボソームタンパク質及びリボソームＲＮＡの全体的な共精製をもたらし、翻訳されたｍＲＮＡのみの回収に結びついた（表３）。
図３では、形質移入細胞に由来する翻訳されたｍＲＮＡの免疫沈降が表示されている。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ（擬似）又はｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ構築体で一過性に形質移入し（約３０％の効率）、培地のみ（未処理、ＮＴ）又は１００μｇ／ｍｌのクエン酸第ニ鉄アンモニウム［ｐＨ７．０］（鉄）で補完された培地で３６時間増殖させた。（ａ）鉄貯蔵タンパク質フェリチンの誘導は、鉄処理の３６時間後に見られた。（ｂ）未処理細胞又は鉄処理細胞のポストミトコンドリア上清を、線形スクロース勾配（２０〜５０％重量／重量）に負荷した。速度沈降の後、ＵＶ吸光度（２５４ｎｍ）を測定しながら、画分（沈降方向は矢印で示されている）を収集した。未処理溶解産物及び鉄処理溶解産物のプロファイルはほぼ同一とみなされたため、代表的なトレースが示されている。非ポリソーム及びポリソーム勾配画分を、表示のように生成した。ｍＲＮＰに結合したフェリチンｍＲＮＡを回避するために、より重いポリソーム（４つを超えるリボソームを有する）のみをポリソーム画分に含めた。（ｃ）鉄処理の後、予想通り、非ポリソーム及びポリソーム勾配画分から精製した全ＲＮＡを定量ＰＣＲすることにより追跡した逆転写により決定された、非ポリソーム画分からポリソーム画分へのフェリチン重鎖ｍＲＮＡ（Ｆｔｈ１）の移動が観察された（非ポリソーム画分の変化倍数の範囲：０．１６〜０．２２；ポリソーム画分の変化倍数の範囲：１．８３〜２．１５）。（ｄ）非ポリソーム又はポリソーム勾配画分からの免疫沈降を実施し、０．２％の投入（ＩＮ）試料、０．０２％の未結合（ＵＢ）試料、及び１％の結合（ＩＰ）試料を、免疫ブロット解析用のゲルにｅＧＦＰ又はＲｐｌ７抗体と共に負荷した；＊は、非常に長時間露光させた際の微弱なＲｐｌ７バンドの存在を示す。鉄処理した又はしていない非ポリソーム及びポリソーム画分から、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａを同じように良好に回収した。未処理又は鉄処理したポリソーム画分から、Ｒｐｌ７を同じように良好に回収した。Ｒｐｌ７は、恐らくは過剰発現されたｅＧＦＰ−Ｒｐｌ１０ａとは異なりポリソームに全て組み込まれため、非ポリソーム画分中には存在しなかった。非ポリソーム画分にはＲｐｌ７（及びしたがって構築されたリボソーム）が欠如していたことから予想される通り、非ポリソーム画分からの免疫沈降では、バックグラウンドを超えるいかなるＲＮＡも沈降せず、免疫沈降が、翻訳されたメッセージに特異的だったことを示した。（ｅ）翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法が、ｃで観察された変化を忠実に反映できるかどうかを決定するために、ポストミトコンドリア上清（全細胞溶解産物、未分画）の直接ｅＧＦＰ免疫沈降を実施した。０．５％の投入（ＩＮ）試料、０．５％の未結合画分（ＵＢ）試料、及び１．０％の結合（ＩＰ）試料を、ｅＧＦＰ抗体（上段）、Ｒｐｌ１０ａ抗体（中段）、又はＲｐｌ７抗体（下段）と共に免疫ブロット解析用のゲルに負荷した。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ並びに擬似試料に由来する全てのｅＧＦＰを、未処理及び鉄処理試料から同じように良好に回収した；＊は、より長時間露光させた際の微弱なｅＧＦＰ−Ｌ１０ａバンドの存在を示す。内因性Ｒｐｌ１０ａ又はＲｐｌ７は、擬似試料の結合（ＩＰ）画分中では回収されなかったが、内因性Ｒｐｌ１０ａ及びＲｐｌ７は両方とも、未処理及び鉄処理試料の結合（ＩＰ）画分中で回収された。免疫沈降において内因性Ｒｐｌ７と対比して内因性Ｒｐｌ１０ａの回収が低減することは、内因性Ｒｐｌ１０ａとｅＧＦＰ−Ｌ１０ａとがリボソームへの組み込みに対して競合していることを反映している可能性が高い。（ｆ）ポリソーム又は全細胞溶解産物のいずれかからの免疫沈降（ＩＰ）試料における、Ａｃｔｂ ｍＲＮＡレベルに対するＦｔｈ１ ｍＲＮＡレベルの鉄誘導性の倍数変化（ポリソームＩＰ試料の倍数変化の範囲：２．０１〜２．４３、直接ＩＰ試料の倍数変化の範囲：１．８０〜１．９３）は、免疫沈降（ｃ）前のポリソーム勾配画分において観察される変化と類似していた。
方法
イムノブロッティングの標準的方法を使用した。抗体を以下のように使用した：ＧＦＰ検出：ＪＬ−８、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製（マウンテンビュー、米国カリフォルニア州）、５％脱脂乳／ＰＢＳＴ（リン酸塩緩衝食塩水−０．０５％ツイーン２０）で１：２，０００；Ｒｐｌ７検出：ＮＢ２００−３０８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製（リトルトン、米国コロラド州）、５％無ＩｇＧウシ血清アルブミン／ＰＢＳ−Ｔで１：２，０００；Ｒｐｌ１０ａ検出：Ｈ００００４７３６−Ｍ０１、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製（台北市、台湾）、５％無ＩｇＧウシ血清アルブミン／ＰＢＳ−Ｔで１：２，０００；フェリチン検出：６５０７７、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製（ソロン、米国オハイオ州）、０．２％Ｉ−ブロック（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、米国カリフォルニア州）／ＰＢＳ−Ｔで１：１，５００；β−アクチン検出：Ａｂ８２２４、Ａｂｃａｍ社製（ケンブリッジ、米国マサチューセッツ州）、５％脱脂乳／ＰＢＳ−Ｔで１：２，５００。
実施例３ ＢＡＣアレイトランスジェニックマウスの特徴付け及び解析
１）概観
ＢＡＣアレイデータの比較解析は、複雑な生体系に対する重要な機構の洞察を提供することができる。ＢＡＣアレイ翻訳プロファイリングは、遺伝学的に定義済の細胞集団で翻訳されたｍＲＮＡ、及び生理学的な異常に対するそれらの応答に関する包括的な研究を可能にする。この手法の普遍性を確立するために、２４種の異なる多様なＣＮＳ細胞集団のＢＡＣアレイ翻訳プロファイルを本明細書中に提示する。全組織マイクロアレイ研究において以前には特定されなかった、細胞特異的に富化された転写物の特定を、これら大型データセットの比較解析の付加価値を例示するための例として提供する。ＢＡＣトランスジェニック戦略は、ＣＮＳの形態学的に定義済の特異的な細胞の遺伝学的研究の設計用の高解像度の解剖学的データ及びＢＡＣベクター（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３）（ｗｗｗ．ｇｅｎｓａｔ．ｏｒｇ）を提供するために応用されている（Ｈｅｉｎｔｚ， ２００４； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。Ｈｅｉｍａｎらは、任意の遺伝学的に定義済の細胞集団で合成されるタンパク質の補足物の発見に使用するためのＢＡＣアレイ翻訳プロファイリング法の開発を報告している。本明細書中では、本方法を使用して、哺乳類脳の多種多様な解剖学的及び遺伝学的に定義済の細胞タイプのＢＡＣアレイトランスジェニックマウスを生成する。幾つかの実施形態では、そのようなコレクションは、指定した発生段階のＣＮＳ細胞タイプ、及び多種多様な薬学的、遺伝学的、又は行動的変化に応答したＣＮＳ細胞タイプの詳細な分子表現型解析を可能にすることになる資源を提供することができる。提示されているマウス及びデータは、ＢＡＣアレイ手法の普遍性を確認し、哺乳類脳の細胞多様性の分子的基盤に関する研究用の資源を提供する。
特定のＣＮＳ細胞タイプのＢＡＣアレイ翻訳プロファイルの生成には、所望のＣＮＳ細胞タイプに対するｅＧＦＰ−Ｌ１０ａリボソームタンパク質融合物の標的化、これらの細胞タイプからのポリソームＲＮＡの親和性精製、及びその結果生じたｍＲＮＡ集団を大規模並列解析技術を使用して照合することが必要とされる。多様なＣＮＳ細胞タイプの比較解析の資源を提供するために、この実施例で説明されているのは、さらなるＢＡＣアレイトランスジェニック系統を生成及び特徴付けし、これらの系統で標的とされた２４種の細胞タイプからｍＲＮＡ集団を単離及び特徴付けし、これらのデータを互いに比べて解析し、ＢＡＣアレイトランスジェニック系統及びそれらの関連解剖学的データ及びマイクロアレイデータを保存及び提示するためにこの戦略を応用することである。
２）特定のＣＮＳ細胞タイプを標的化するための駆動系の選択
翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法の普遍的な応用可能性を確認し、この手法により複数の細胞タイプに渡って取得することができる情報の深さに関する初期データを取得するために、遺伝子発現神経系地図（ＧＥＮＳＡＴ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｔｌａｓ）プロジェクト（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００３；Ｓ． Ｆａｌｃｏｎ， Ｒ． Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３， ２５７−８ （２００７）；両方ともそれらの全体が組み込まれる）により報告されているＢＡＣを選択して、ＣＮＳ全体にわたって、異なる構造に由来する広範囲のニューロン及びグリアを特異的に標的として選択した。
３）ＢＡＣアレイマウス
定義済のＣＮＳ細胞集団に対して遺伝学的に標的としてｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現させるために、ＢＡＣトランスジェニックマウスを作製した（図４は、ＢＡＣアレイ戦略を表し、図５及び６は、ＢＡＣベクターの遺伝子操作及びＢＡＣを保持するマウスの作製を表す）。マウスの特定細胞タイプのｍＲＮＡをタグ化するために、細胞特異的シス及びトランス調節エレメント及び既知の転写ユニットを、本明細書及び（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ ４２５， ２００３）に記載のように使用した。ＢＡＣアレイ系統に由来する大脳皮質（図７）又は視床下部（図８）の異なる細胞サブセットで特異的発現を示すマウス系統を、例として提示する。選択したＢＡＣアレイトランスジェニックマウス系統の詳細な解剖学的特徴付けを下記に提示する。
４）ＢＡＣアレイトランスジェニックマウス系統の解剖学的特徴付け
ＢＡＣアレイトランスジェニックマウス系統に関する詳細な解剖学的研究を、図９に提示されているように実施した。各系統について、導入遺伝子発現を、ｅＧＦＰに対する抗体を使用して免疫組織化学法（ＩＨＣ）によりアッセイした。全脳の連続冠状切片からＩＨＣデータを収集し、高解像度で走査し、検査するために顕微鏡標本にした。染色強度の見かけ上の差が導入遺伝子発現レベルの差を正確に反映するように、切片を全て等しく処理した（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）。この図は、マイクロアレイ解析用に選択した２４種の細胞集団の各々のサムネイル画像、及びｅＧＦＰＬ１０ａ発現のＩＨＣ解析から明らかになった形態を例示する高解像度データを示す。この特徴付けに包含されている領域には、小脳（パネル１〜９）、脊髄（１０）、基底前脳及び線条体（１１〜１４）、脳幹（１５）、並びに大脳皮質（１６〜２５）が含まれる。
十分に特徴付けられた細胞タイプの場合、ＢＡＣアレイ解析用に標的とした細胞の解剖学的確認は容易だった。例えば、小脳の細胞構造が十分に記述されていたため、プルキンエ細胞（Ｐｃｐ２、パネル１）、顆粒細胞（Ｎｅｕｒｏｄ１、パネル２）、ゴルジニューロン（Ｇｒｍ２、パネル３）、単極刷毛細胞（Ｇｒｐ、パネル５）、ベルクマングリア（Ｓｅｐｔ４、パネル８）、及び星状細胞（Ａｌｄｈ１ｌ１、パネル９）のＢＡＣアレイ系統は、提示されたＩＨＣデータから容易に特定された。プルキンエ細胞は、それらの大型細胞体及び分子層樹状突起により、顆粒細胞は、それらの小さなサイズ、高密度パッキング、及び顆粒層中での位置により、並びにベルクマングリア細胞は、それらの形態、放射状の突起、及びプルキンエ細胞との緊密な隣接により、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ ＩＨＣデータ中で認識することができる。これらの調節領域を使用してこれらの周知の細胞タイプでｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質をＩＨＣ解析することにより、周知の細胞タイプ及び以前は未知だった細胞タイプを特定することが可能になる。各ＢＡＣ駆動系に由来するｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子の発現は、領域的に正確であり、文献、及びＧＥＮＳＴＡＴに提示されている解剖学的データからもたらされる予測の両方に一致しており、これらの細胞タイプの場合、ｅＧＦＰＬ１０ａ融合タンパク質の分布は、可溶性ｅＧＦＰの分布より限定的であるが、これらの十分に記述されているＣＮＳ細胞タイプを明白に特定するために十分な解剖学的詳細を提供するのに十分である。
多数のＢＡＣアレイ系統、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質は、脳内の複数の構造で検出される。一例は、Ｃｈａｔ ＢＡＣアレイ系統で標的としたコリン作動性細胞集団での融合タンパク質ＩＨＣの特徴付けである。この場合、発現は、脳幹運動ニューロン、脊髄運動ニューロン、線条体のニューロン、基底前脳投射ニューロン、及び内側手綱のニューロンにおいて明らかである。下記で詳述されているように、これらのコリン作動性細胞集団のうち４つのＢＡＣアレイ翻訳プロファイルを、ｅＧＦＰＬ１０ａタグ化ポリソーム集団の親和性精製に先立って、脊髄、脳幹、線条体、及び基底前脳を別々に解剖することにより収集した。特異的に発現された遺伝子は、物理的に分離可能な脳構造中の異なる細胞タイプに見出されることが多いため、幾つかの系統は、この例に含まれていない多数の細胞タイプを解析する機会を提供する。したがって、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質は、Ｃｃｋ ＢＡＣアレイ系統の海馬ＣＡ１細胞に豊富であり、この細胞タイプで発現されるｍＲＮＡの翻訳プロファイリングを可能にする（パネル２５）。ＢＡＣアレイ解剖学的データベースを作製することにより、ユーザが、本明細書中に提示されている系統の各々の連続脳切片を閲覧して、この例に提示されているＢＡＣアレイ系統の１つで目的の細胞タイプを分析することができるかどうかを判断することが可能になる。
この図は、大脳の投射ニューロンをそれらの錐体形状により特定することができ、それらの層の特異性、樹状突起の分枝、及び軸索の標的により大まかに分類することができることも示す。層６（Ｎｔｓｒ１、パネル１６）、層５ｂ（Ｇｌｔ２５ｄ２、パネル１７）、及び層５ａ（Ｅｔｖ１、パネル１８）の大型錐体細胞を明白に標識する系統も再生産させた。形態計測研究は、ＧＥＮＳＡＴ ｅＧＦＰ系統及びｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ ＢＡＣアレイ系統が、類似の皮質錐体細胞集団を標的にすることを示す追加的なデータを提供する。図１０は、ＢＡＣアレイ皮質錐体細胞が、ｅＧＦＰ ＧＥＮＳＴＡＴ系統と同じ層分布を有することを示す。この図は以下を示す：Ａ）各錐体細胞ＢＡＣ駆動系のＢＡＣアレイ及びＧＥＮＳＡＴ ｅＧＦＰ系統の、軟膜表面とｅＧＦＰ＋細胞体との距離のグラフ（平均値±標準誤差）。細胞の深さは、各駆動系の両方系統間で一致していた。Ｂ）１００ミクロン範囲中の細胞のパーセンテージが、Ａの各系統の細胞深度の分布ヒストグラムとして示されている。各駆動系のＢＡＣアレイ系統及びｅＧＦＰ系統は、細胞深度の分布が重なり合っていた。
図１１は、多数のＢＡＣアレイ系統で、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質及びよく特徴付けられている細胞タイプ特異的マーカーの二重免疫蛍光を使用して、標的系統の推定細胞同一性を確認したことを示す。ある場合では、細胞タイプ特異的マーカーは、改変用に選択したＢＡＣ駆動系に対応した（Ｏｌｉｇ２、Ａｌｄｈ１ｌ１、Ｇｒｍ２、Ｃｈａｔ）。他の場合では、パネルＢに見られるように、特定の細胞タイプについてよく特徴付けられている一般的に用いられているマーカーを使用した。ほとんどの場合、これらの研究により、ＢＡＣ駆動系が、明確に定義された細胞集団に発現を限定することが確立された。導入遺伝子が複数の細胞タイプで発現されるＢＡＣアレイ系統も幾つか存在した。例えば、Ｌｙｐｄ６ ＢＡＣアレイ系統の免疫蛍光（ＩＦ）解析により、小脳分子層のＰｖａｌｂ陽性及びＮｅｕＮ陰性介在ニューロン全てにｅＧＦＰ−Ｌ１０ａが見出されることが明らかになり、この系統が、星状細胞及びかご細胞の両方の解析に有用であることが示唆された。最後に、ある系統では、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子が、特定の細胞タイプのサブセットでのみ発現されることは明らかである。例えば、パネルＢに見られるように、Ｇｒｐ ＢＡＣアレイ系統では、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質は、Ｇｒｍ１に免疫反応性であるがＣａｌｂ２（カルレチニン）には免疫反応性でない単極刷毛細胞（Ｎｕｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２）の亜集団に限定されている。
その発現が容易に特定された細胞タイプと一致しなかったＢＡＣアレイ系統も、ＩＦ解析により解析して、標的とした細胞集団の大まかな分類に関するデータを提供した。例えば、Ｃｏｒｔ ＢＡＣアレイ系統の大脳皮質では、Ｃａｌｂ１は、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ陽性細胞のほぼ５０％で検出されたが、Ｐｖａｌｂはこれらの細胞の５％未満に見出され、Ｃａｌｂ２は検出されなかった。Ｐｎｏｃ ＢＡＣアレイマウスの皮質中の融合タンパク質を特徴付けることにより、皮質のより深層にある幾つかの細胞はＧＡＢＡ陰性であり、単一の先端突起を有すると考えられるが、大脳皮質の浅層にある大多数のｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ陽性細胞は、多極性でありＧＡＢＡ陽性であることが明らかになった。この場合、多極細胞は、Ｃａｌｂ２陽性であるが、Ｃａｌｂ１又はＰｖａｌｂ陽性ではないことが多い。Ｃｃｋ ＢＡＣアレイ系統の皮質に関するＩＨＣ及びＩＦ研究は両方とも、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａが、Ｃａｌｂ１陽性であるがＰｖａｌｂ又はＣａｌｂ２陽性ではない小型ニューロン、並びに錐体細胞（データ非表示）で検出されることを明白に実証し、以前のＩＳＨデータ（ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ）（Ｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｍａｇｄａｌｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６）と一致する。
ニューロン細胞タイプに加えて、グリア細胞タイプの３つのＢＡＣアレイ系統を生成し、小脳組織及び皮質組織の両方で解析した。これらのグリア細胞タイプには、星状細胞、成熟乏突起膠細胞、並びに成熟乏突起膠細胞及び乏突起膠細胞前駆体（シナントサイト（ｓｙｎａｎｔｏｃｙｔｅ）又はポリデンドロサイト（ｐｏｌｙｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）とも呼ばれる）を含む混合乏突起膠細胞系統が含まれる（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。星状細胞に特異的であると以前に記述されている遺伝子Ａｌｄｈ１ｌ１のＢＡＣを使用して、星状細胞を標的とした（Ａｎｔｈｏｎｙ ａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ， ２００７； Ｃａｈｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。このＢＡＣは、Ｇｆａｐ＋（反応性）及びＧｆａｐ−星状細胞の両方、並びにベルクマングリアで導入遺伝子発現を駆動した。それは、Ｎｇ２＋乏突起膠細胞前駆体でも、Ｃｎｐ＋ミエリン形成乏突起膠細胞でも発現しなかった。対照的に、Ｏｌｉｇ２転写因子のＢＡＣは、Ｎｇ２＋及びＣｎｐ＋乏突起膠細胞系統細胞の両方に特異的に発現を指図した。最後に、Ｃｍｔｍ５のＢＡＣアレイ系統は、微弱ながら成熟（Ｃｎｐ＋）乏突起膠細胞で特異的に発現した。これら３つの系統を用いて、ＣＮＳを横断した３つの主要クラスのグリアに関する翻訳プロファイルを調査することができる。
Ｃｍｔｍ５などの比較的微弱に発現する系統の場合は、新しい駆動系を選択して、より効果的に同じ細胞タイプを標的とすることができる。成熟乏突起膠細胞系統（Ｃｎｐ ＪＤ３６８）を用いた研究は、より強力に発現する導入遺伝子からのＲＮＡ収率及びデータ品質の向上を実証している（図１２）。
５）方法
ＢＡＣ改変、遺伝子導入、及び動物の飼育：
表４は、記載されているように改変して、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質を駆動系遺伝子の翻訳開始部位に挿入した。創始体及びその後の世代は、Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス又はｃ５７ｂｌ／６野生型マウスのいずれかで繁殖させた。系統をトランスヘテロ接合体として維持した。
免疫組織化学：６〜１２週齢のマウスをＣＯ２で安楽死させ、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で、その後ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで経心的に（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流した。ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）免疫組織化学の場合、凍結アーティファクトを防止するために、固定した脳を２０％グリセロール及び２％ジメチルスルホキシドで終夜処理した。複数の脳（１ブロック当たり２５個まで）を、ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（商標）技術を使用して、ゼラチンマトリックスに包埋した（ＮｅｕｒｏＳｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製、ノックスビル、米国テネシー州）。硬化させた後、イソペンタン及び粉砕ドライアイスの混合物に浸漬させることにより、ブロックを−７０℃に急速凍結させ、ＡＯ８６０滑走式ミクロトームの凍結試料台に設置した。ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（商標）ブロックを、４０ミクロンの冠状切片にした。切片は全て、抗原保存溶液（５０％ＰＢＳ ｐＨ７．０、５０％エチレングリコール、１％ポリビニルピロリドン）で満たされた４×６プレートのウェルに順次収集した。
過酸化水素及び血清でブロッキングした後、切片を、ヤギ抗ｅＧＦＰ血清の１：７５，０００溶液（Ｈｅｉｍａｎら）と共に室温で終夜インキュベートした。よく洗浄した後で、切片を、製造業者の説明書に従ってビオチン化二次抗体（抗ヤギＩｇＧ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社製、バーリンゲーム、米国カリフォルニア州）と共にインキュベートし、再び洗浄し、アビジン−ビオチンＨＲＰ（ベクタステインエリートＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社製、バーリンゲーム、米国カリフォルニア州）と共にインキュベートした。切片を再び洗浄し、完全に発色するまでＤＡＢ及び過酸化水素と共にインキュベートした。最後に、発色した切片を、ゼラチンで覆われた（サブベッド）スライドガラスに設置し、空気乾燥させ、アルコールで脱水し、キシレンで清澄化し、カバーグラスをかけた。画像は、Ｚｅｉｓｓ社製ＫＳ４００ソフトウェアのカスタムマクロが実行されているＰＣにより制御された自動ｘ、ｙ試料台（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ ｓｃａｎ８）を使用して、１０×（１．５ＮＡ）対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｓｋｏｐ２型顕微鏡で取得した。野生型の脳は標識化を示さなかった。
蛍光免疫組織化学の場合は、固定した脳を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中３０％スクロースで寒冷保護して凍結し、４０ミクロンで切断して順次低温槽に浮遊させ、使用まで０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に４℃で保管した。切片を、５％正常ロバ血清、０．２５％トリトンを有するＰＢＳで３０分間ブロックし、その後一次抗体と共に終夜インキュベートした（表５）。切片をＰＢＳで洗浄し、適切なＡｌｅｘａ色素結合二次抗体（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）と９０分間接触させ、洗浄し、顕微鏡標本を作製した。画像は全て、Ｚｅｉｓｓ社製倒立型ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡でＺの厚みを２ミクロンにして取得した。切片全体のＺスタックを取得して共局在を確認した。
固定切片：固定切片の場合、ＢＡＣアレイトランスジェニックマウスを、ペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔｏｌ）又は５０ｍｇ／ｍｌのネンブタールで深く麻酔をかけ、１０ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、その後４０ｍｌのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流した。脳を解剖し、ＰＢＳ中４％ＰＦＡで正確に１時間室温で後固定した。固定した後、脳をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中５％重量／容積（ｗ／ｖ）スクロース中で穏やかに攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした。その後、脳を、ＰＢＳ中１５％ｗ／ｖスクロース中で穏やかに攪拌しながら４℃で２４時間、ＰＢＳ中３０％ｗ／ｖのスクロース中で穏やかに攪拌しながら４℃で２４時間インキュベートした。脳を、Ｎｅｇ−５０包埋剤（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カラマズー、米国ミシガン州）で満された包埋型に室温で１時間置いておき、その後ドライアイス上で１時間インキュベートして包埋剤を凍結させた。その後、脳を移動させ、切片化まで−８０℃で保管した。１２μｍの矢状切片を切断し、スライドガラスに載せ、−２０℃で終夜保管し、その後免疫組織化学に使用するまで−８０℃に移動させた。
使用前に切片を２０分間室温で解凍及び乾燥させ、ＰＢＳで洗浄し、０．２％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳ中で３０分間室温でインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を反応停止させた。切片をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で透過化し、Ｉｍａｇｅ−ｉｔ ＦＸシグナルエンハンサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）で３０分間室温でブロックした。切片をＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で洗浄し、２％ロバ血清／０．１％フィッシュゼラチン（ｆｉｓｈ ｇｅｌａｔｉｎ）／ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で再びブロックした。その後、切片を一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。翌日、切片をＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で洗浄し、抗ウサギスーパーピクチャーＨＲＰポリマー検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）と共に室温で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で洗浄し、蛍光性ＨＲＰ基質、Ｔｙｒａｍｉｄｅ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６複合体（ＴＳＡキット＃１３から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）をスライドに添加した。スライドをＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で再び洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）を用いて顕微鏡標本を作製し、終夜乾燥させ、蛍光は、Ｚｅｉｓｓ社製ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、ソーンウッド、米国ニューヨーク州）で視覚化した。
新鮮凍結切片：核免疫組織化学の場合は全て（抗Ａｔｒｘ、抗ＰＭＬ、抗γＨ２Ａ．Ｘ）、新鮮な凍結脳切片を使用した。新鮮凍結脳切片のため、ＢＡＣアレイマウスをＣＯ２で安楽死させ、断頭し、それらの脳を取り出して氷冷ＰＢＳに入れた。その後、脳をＮｅｇ５０に包埋し、１時間ドライアイス上に置いておき、必要とされるまで−８０℃で保管した。切片化前に、組織の冷凍ブロックを−２０℃で平衡化し、１６μｍ切片をＬｅｉｃａ社製低温槽上で切断した。新鮮凍結脳切片を有するスライドを、さらなる使用時まで−８０℃又は−２０℃で保管した。
使用に先立って、切片を１５分間室温で空気乾燥させ、その後新しく作った１×ＰＢＳ中１％ＰＦＡで１０分間室温で固定した。次に、スライドを１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中０．０５％トリトンＸ１００で１０分間室温で透過化した。透過化した後、組織切片を、ＰＢＳ中５％ウマ血清又は５％ヤギ血清のいずれかを使用して少なくとも１時間ブロックした。切片を、４℃の加湿チャンバーで一次抗体と共に終夜インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、適切な二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。二次抗体と共にインキュベーションした後、切片を、核染色剤ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）と共に１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ封入剤（Ｌｅｒｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ピッツバーグ、米国ペンシルベニア州）を用いてカバーガラスを被せた。画像は、４０×／１．２、水浸型対物レンズ、６３×／１．４油浸型レンズ、及び１００×／１．４油浸型レンズを使用し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｐｌａｎ ＬＳＭ５１０レーザー走査型直立共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ， Ｉｎｃ．製、ソーンウッド、米国ニューヨーク州）で収集した。
皮質錐体細胞の層位置の定量化：ＤＡＢを用いた抗ｅＧＦＰ免疫組織化学を、（Ｇｏｎｇら）に記載されているように、Ｅｔｖ１ ＴＳ８８、Ｇｌｔ２５ｄ２ ＤＵ９、及びＮｔｓｒ１ ＴＳ１６ ＢＡＣアレイ系統に由来する２０ミクロンの矢状切片で実施し、画像を上記のように取得した。同一ＢＡＣ由来のｅＧＦＰ発現系統の対応する成体矢状切片のデジタル画像を、ｇｅｎｓａｔ．ｏｒｇからダウンロードした。運動皮質を含有する切片（Ｐａｘｉｎｏｓ氏の切片１１１に対応する）（Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ２００１）を、ＩｍａｇｅＪ（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）にインポートした。細胞体の頂端先端から軟膜表面の距離は、「直線選択」ツールを使用して測定した。頂端先端は、先端突起と細胞体とが収束する部位として定義した。明確に視認できる先端突起及び均一に染色された細胞体を有する細胞だけを測定した。少なくとも５０個の細胞を各画像から測定した。その後、測定は全て以下のスケールを使用してピクセルからミクロンに変換した：１ピクセル＝１．３３ミクロン。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：目的遺伝子由来の配列を含有するＩＭＡＧＥコンソーシアムクローンをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した（表６）。適切な制限酵素を用いてプラスミドを線形化し、Ｑｉａｇｅｎ社製ＰＣＲ精製キットを用いてテンプレートを精製し、その後ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ社製、バーゼル、スイス）を使用して、適切な酵素（Ｔ３又はＴ７）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写することにより、プローブを合成した。標識ＲＮＡを、ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ−５０マイクロカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製し、製造業者の説明書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）に従ってバイオアナライザーを用いて品質及び量をアッセイした。
成体マウスを上記のように処置し、低温槽上で脳を２０ミクロンの切片に切断し、Ｆｉｓｈｅｒ社製Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドに顕微鏡標本を作製した。組織を洗浄し、その後４％パラホルムアルデヒドＰＢＳで２０分間後固定し、０．０５％トリトンＸ１００で透過化し、ＴＥ中５０ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで１０分間消化し、０．２５％無水酢酸を有する０．１Ｍ ＴＥＡで１０分間アセチル化した。切片を、Ａｔｌａｓハイブリダイゼーションチャンバー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、マウンテンビュー、米国カリフォルニア州）の中で、５００ｕｇ／ｍｌのせん断変性サケ精子と共に、５×ＳＳＣ、２．５×デンハルト溶液で３０分間プレハイブリダイズさせ、その後標識リボプローブと共に終夜ハイブリダイズさせた。スライドを、６５℃で５分間５×ＳＳＣで洗浄し、その後０．２×ＳＳＣで１時間６８℃で、及び室温で５分間洗浄した。スライドを、ＴＢＳ（１００ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で５分間、２回洗浄し、ＴＢＳ中１０％Ｒｏｃｈｅ社製ブロッキング溶液で１時間ブロックし、同じ溶液（ヒツジ抗Ｄｉｇ、アルカリホスファターゼ結合、Ｒｏｃｈｅ社製１１ ０９３ ２７４ ９１０）中で一次抗体と、及び必要に応じてヤギ抗ｅＧＦＰ共に１時間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄し、製造業者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ社）に従って、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ又はＨＮＰＰ／Ｆａｓｔ Ｒｅｄで発色させた。ｅＧＦＰ／ＩＳＨ二重蛍光のために、その後、切片をａｌｅｘａ−４８８ロバ抗ヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と共に１時間インキュベートした後、ＤＡＰＩで逆染色し、洗浄し、カバーガラスを被せた。画像は、Ｚｅｉｓｓ社製倒立型ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡で取得した。
実施例４ ｉｎ ｖｉｖｏでのリボソーム−ｍＲＮＡ複合体の単離および精製
ｅＧＦＰタグ化機能的ポリゾーム複合体をｉｎ ｖｉｖｏのインタクトな脳組織から迅速に抽出及び免疫親和性精製するための改良手順を開発及び至適化した（Ａ． Ａｌｅｘａ， Ｊ． Ｒａｈｎｅｎｆｕｈｒｅｒ， Ｔ． Ｌｅｎｇａｕｅｒ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２， １６００−７ （２００６））。高度に精製されたＲＮＡ及びタンパク質を、ＢＡＣアレイマウスから一貫して取得した。精製プロトコールの重要な工程には、対象の組織を迅速に手作業で解剖及びホモジナイズする工程と、溶解緩衝液にマグネシウム及びシクロヘキシミドを含ませて、精製中にｍＲＮＡ上のリボソームサブユニットを維持する工程と、内因性ＲＮａｓｅ活性を阻害する工程と、非変性条件下で粗小胞体結合ポリソームを可溶化する工程と、高親和性抗ｅＧＦＰ抗体を使用する工程と、免疫親和性精製後に高塩濃度での洗浄を加えてバックグラウンドを低減する工程とが含まれていた。図１３は、（ａ）では、Ｄ１ ＢＡＣアレイ動物に由来するが野生型同腹子には由来しないｅＧＦＰタグ化Ｌ１０ａの精製及び非タグ化リボソームタンパク質Ｌ７の共精製を表示している（Ｄ１、Ｄ１ ＢＡＣアレイマウス由来の試料；ＷＴ、野生型同腹子由来の試料；Ｉｎ、１％投入試料；ＵＢ、１％未結合試料；ＩＰ、６．５％免疫親和性精製試料）。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａシグナルは、ＩＰ試料がＩｎ及びＵＢと比べてより高濃度であったため、Ｄ１ ＩＰレーンにのみ存在する。（ｂ）では、バイオアナライザーＰｉｃｏＣｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で検出した、Ｄ１ ＢＡＣアレイトランスジェニック動物（上段パネル）に由来するが野生型同腹子（下段パネル）には由来しない１８Ｓ及び２８Ｓ ｒＲＮＡの精製が示されている。２８Ｓ ｒＲＮＡは約４７秒で検出され（ｒｕｎ）、１８Ｓ ｒＲＮＡは約４３秒で検出され、マーカーピークは約２３秒で検出される。
リボソーム複合体を免疫沈降した後、電子顕微鏡を使用してリボソームを視覚化した。等量の抗ＧＦＰコーティング磁気ビーズを、氷上で２．５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍカコジル酸塩［ｐＨ７．４］中で固定した。ビーズペレットを、同一の緩衝液中１％四酸化オスミウムを用いて氷上で後固定した。０．５％酢酸ウラニル水溶液を用いて室温で処理した後、標本を、段階的アルコール（７０、９０、及び１００％）で脱水し、プロピレンオキシドで処理した後、Ｅｍｂｅｄ８１２樹脂中に包埋した。樹脂を、２〜３日間６０℃のオーブンで重合させた。銀切片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社製ＵｌｔｒａＣｕｔ Ｅウルトラミクロトーム上で、Ｄｕｐｏｎｔ社製ダイヤモンドナイフを用いて切断した。切片を銅グリッドに収集し、飽和酢酸ウラニル水溶液及びクエン酸鉛水溶液で２重染色した後、８０ｋＶで作働させたＪｅｏｌ社製１００ｃｘ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ社製、ピーボディー、米国マサチューセッツ州）を用いて試験した（図１４）。
１）モノクローナル抗体の産生
後述の実施例に記載されているヤギ抗ｅＧＦＰを使用した、Ｄｒｄ１及びＤｒｄ２系統を除く全ての免疫沈降は、メモリアル−スローン−ケタリング癌センターのモノクローナル抗体コア施設（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ａｔ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｎｔｅｒ）で本目的用に特別に産生された２つのモノクローナル抗ｅＧＦＰ抗体（クローン１９Ｃ８及び１９Ｆ７）を使用して実施した。マウスを精製ＧＳＴ−ｅＧＦＰ融合タンパク質で免疫し、数ラウンドのスクリーニングを実施して、免疫沈降アッセイで十分に機能したクローンを特定した。最初に、一過性に形質移入した２９３Ｔ細胞から精製したｅＧＦＰでコーティングした９６ウェルプレートを使用して、モノクローナル上清をＥＬＩＳＡにより試験した。次に、形質移入した２９３Ｔ細胞から精製したｅＧＦＰを再び使用して、陽性クローンを免疫沈降アッセイでスクリーニングした。最後に、目的のＢＡＣ駆動系下でｅＧＦＰを発現するトランスジェニックマウス系統に由来する溶解産物からｅＧＦＰを強力に免疫沈降させた陽性クローンを特定した。
２）ポリゾームの免疫沈降
ポリゾームの免疫沈降及びｍＲＮＡの単離を、ヤギ抗ｅＧＦＰ抗体が２つのモノクローナルｅＧＦＰ抗体（１９Ｃ８、１９Ｆ７）の混合物に置換された以外は下記に詳述されているように行った。各反復試料につき３〜６匹のマウスをＣＯ２で安楽死させ、異なる脳領域（小脳、皮質、線条体、基底前脳、脳幹、又は脊髄）を解剖した。各細胞集団を三重反復でアッセイした。ＲＮＡの品質管理、増幅、及びハイブリダイゼーションは、Ｈｅｉｍａｎらにより記載されているように行った。複数の細胞タイプに渡って一貫性を保つために、各試料につき１５ｎｇの全ＲＮＡを増幅した。
実施例５ ＢＡＣアレイマウスに由来するｍＲＮＡの解析
１）ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡを精製するため、マウスを断頭し、マウス脳から目的の特定組織を素早く解剖した。プールした組織を直ちに氷冷解剖緩衝液に収集し、モーター駆動テフロン（登録商標）−ガラスホモジナイザーを使用して、氷冷ポリソーム抽出緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオトレイトール、１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド、プロテアーゼ阻害剤、及び組換えＲＮａｓｅ阻害剤）中で均質化した。ホモジネートを２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、大きな細胞残屑をペレットにし、ＮＰ−４０又はＩＧＥＰＡＬ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、サンディエゴ、米国カリフォルニア州；Ｓｉｇｍａ社製、セントルイス、米国ミズーリ州）及びＤＨＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製、アラバスター、米国アラバマ州）を、それぞれ１％及び３０ｍＭの終濃度で上清に添加した。５分間氷上でインキュベーションした後、清澄化した溶解産物を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質をペレットにした。ヤギ抗ＧＦＰ（カスタム仕様）をコーティングしたプロテインＧ Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）を上清に添加し、その混合物を転倒式回転（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ ｒｏｔａｔｉｏｎ）させて３０分間４℃でインキュベートした。その後ビーズを磁気ラックに収集し、高塩濃度ポリソーム洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、３５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＮＰ−４０、０．５ｍＭジチオトレイトール、１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド）で３回洗浄し、直ちにＴｒｉＺｏｌ−ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、カールズバッド、米国カリフォルニア州）及びクロロホルムに浸けて、ポリソームから結合ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡを抽出した。抽出した後、ＲＮＡを、イソプロパノール中の酢酸ナトリウム及びＧｌｙｃｏｂｌｕｅ（Ａｍｂｉｏｎ社製、オースティン、米国テキサス州）を用いて−８０℃で終夜沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄し、水に再懸濁し、Ｒｎｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、バレンシア、米国カリフォルニア州）を使用してさらに精製し、ＤＮａｓｅでカラム内消化した。ｒＲＮＡレベル及び完全性により反映されるようなｍＲＮＡの量及び品質を評価するために、精製した試料を、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して分析した。
ＲＮＡ試料を精製した後、１．５μｌを使用し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ウィルミントン、米国デラウェア州）を使用して定量化した。各試料をバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）でさらに分析して、各ＲＮＡ試料の品質が標準の基準を満たし、互いに同程度であったことを保証した。具体的には、ＲＮＡ試料は全て、少なくとも１．８の２６０／２８０比（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を示し、少なくとも７のＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）（バイオアナライザー）を示した。さらにバイオアナライザーの表示を使用して試料の品質を視覚的に評価し、各試料の潜在的分解又は不純物のレベルを評価した。
２）ｍＲＮＡのマイクロアレイ解析
これらの基準が満たされた後、各試料に由来する合計１５ｎｇのＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製２サイクル増幅キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）で、増幅し、ビオチン化し、及び断片化した。増幅した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で試料を再び定量化し、２０μｇの増幅ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプロトコールに従って断片化した。増幅及び断片化した試料をバイオアナライザーで分析した後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製マウス４３０ ２．０マイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは全て、ロックフェラー大学ゲノムアレイセンター（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ Ｃｅｎｔｅｒ）の標準的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社プロトコールにより行った。
全試料についての組織取扱い及びＲＮＡ精製は記載の通りだった。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ３’増幅試薬２サイクルｃＤＮＡ合成キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）及びＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して、精製ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴ７キット（Ａｍｂｉｏｎ社製、オースティン、米国テキサス州）を使用するｃＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成用に使用した。ｃＲＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ試料クリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して精製した。６００ｎｇ以下のクリーンアップされたｃＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ３’増幅試薬２サイクルｃＤＮＡ合成キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）及びランダムプライマー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用した第２のサイクルのｃＤＮＡ合成反応に使用した。ｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ試料クリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して精製した。精製ｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＩＶＴ標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用したビオチン標識ｃＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成用に使用した。ｃＲＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ試料クリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して精製し、酢酸マグネシウム緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して３５〜２００塩基対断片に断片化した。
対照として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製標準物質スパイクイン対照（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｐｉｋｅ−ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）（真核生物ハイブリダイゼーションキット）を使用した。
ハイブリダイゼーションの手順及びパラメーターについては、１０マイクログラムの標識ｃＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０ ２．０アレイ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｒｒａｙｓ／ｓｐｅｃｉｆｉｃ／ｍｏｕｓｅ４３０＿２．ａｆｆｘ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを洗浄し、製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、サンタクララ、米国カリフォルニア州）の推薦に従い、ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して染色した。この手順には、フィコエリトリン−ストレプトアビジンでチップを染色する工程と、ビオチン化抗ストレプトアビジンで２回目の染色をすることによりシグナルを増幅する工程と、フィコエリトリン−ストレプトアビジンで３回目の染色をする工程とが含まれていた。
アレイの設計については、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製マウスゲノム４３０ ２．０アレイを全ての実験で使用した。アレイの設計及び特徴に関する情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍに見出すことができる。
測定データ及び仕様については、マウスゲノム４３０ ２．０アレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）を使用して走査した。各実験につき３回の生物学的反復測定を実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＣＥＬファイルをハッシュライト（Ｈａｒｓｈｌｉｇｈｔ）解析にかけ、任意の斑点がＧｅｎｅＣｈｉｐに存在したかどうかを検出した（ｈｔｔｐ：／／ａｓｔｅｒｉｏｎ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／Ｈａｒｓｈｌｉｇｈｔ／ｉｎｄｅｘ２．ｈｔｍｌ）（Ｍ． Ｓｕａｒｅｚ−Ｆａｒｉｎａｓ， Ｍ． Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ， Ｋ． Ｍ． Ｗｉｔｔｋｏｗｓｋｉ， Ｍ． Ｏ． Ｍａｇｎａｓｃｏ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６， ２９４ （２００５））。目立った斑点のないＧｅｎｅＣｈｉｐｓのみを使用した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＣＥＬファイルを、、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３．１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）にインポートし、ＧＣ−ＲＭＡアルゴリズムで処理し、各チップの発現値をそのチップの第５０分位数に対して正規化した。データをフィルタリングし、より低い範囲の強度を有する遺伝子を除去した。複数の試料が１６（ｌｏｇ２スケールでは４）より大きな正規化強度を示した遺伝子だけを解析に含めた。様々な条件下でどの遺伝子が差次的に発現されるかを決定するための統計分析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のＬｉｍｍａパッケージを使用して実施した。
マイクロアレイ正規化及び解析
ＭＩＡＭＥ対応生データは、ＡＰＮＲＲサーバー及びＧＥＯから入手可能である。反復アレイ試料を、分位数正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）で標準化した（ＧＣＲＭＡ）。データをフィルタリングし、低シグナル（＜５０）を示すプローブセット並びにモノクローナルバックグラウンドであると特定されたプローブセット（表７）を解析から除外し、反復試料を平均した。
その後、各ＩＰを、同じ組織に由来する未結合試料と比較して、ＩＰ／ＵＢの比率を「富化」の尺度として算出した。ＵＢ試料は、一般的にＩＰに次いで細胞特異的なＲＮＡの枯渇をほとんど又はまったく示さず、同じ組織に由来する幾つかの異なるＩＰに由来するＵＢ試料を、各比較用に平均した。線条体（Ｃｈａｔ系統）及び新線条体（Ｄｒｄ１及びＤｒｄ２系統）に由来するＵＢ試料を、一緒に正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ビオチン化スパイクイン対照を使用して、ＩＰをＵＢに対して全体的に正規化して、走査及びハイブリダイゼーションにおけるあらゆる広範なバイアスを補正した。各細胞タイプについて、表９には、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸバージョン７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で算出した、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ多重検定補正を用いたウェルチｔ検定による倍数変化が＞２でｐ＜．０５を有する全ての遺伝子についてのＩＰ／ＵＢ値が挙げられている。
３つの細胞集団について、「補正された富化」をさらに算出した。成熟乏突起膠細胞でも低レベル発現を示すベルクマングリアグリア系統Ｓｅｐｔ４の場合、補正された富化は、上述のＩＰ／ＵＢ分析が、上記で適用した同じ倍数変化及び統計的基準を使用したベルクマングリアグリア系統と成熟乏突起膠細胞系統Ｃｍｔｍ５との比較線と交差する点である。幾つかのベルクマングリアでも発現を示す単極刷毛細胞系統Ｇｒｐの場合、補正された富化は、上述のＩＰ／ＵＢ富化が、同じ基準を使用したＧｒｐとベルクマングリア系統との比較線と交差する点である。最後に、小脳のＲＮＡのかなり部分は顆粒細胞により生成されており、したがってＵＢ試料は、顆粒細胞ＲＮＡで高度に富化されている。したがって、顆粒細胞遺伝子を特定するために、「補正された富化」を、上記と同じ基準を使用して顆粒細胞ＩＰを他の全ての小脳細胞タイプＩＰの平均と比較することにより算出した。
階層的クラスター化は、最も高い変動係数を有するプローブセットの２０％についてのＧＣＲＭＡ正規化データに対して、平滑化相関メトリック（ｓｍｏｏｔｈｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｒｉｃ）を用いた「条件ツリー」機能を使用してＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇで実施した。
シャノンエントロピーを、下記の手順を用いてＧＣＲＭＡ正規化値からエクセルで算出した：少なくとも１つの試料で１００を超えるシグナルを有しないプローブセットを除外した後、各データセットの正規化発現測定値を、底が１０の対数値で５つの範囲（ｂｉｎ）に分類し（１〜９、１０〜９９、１００〜９９９、１０００〜９９９９、１００００〜９９９９９）、シャノンエントロピーを、各遺伝子について、１）ＩＰ試料のみに渡って、２）ＵＢ試料のみに渡って、及び３）全試料に渡って、下記式（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， ２００７）を使用して算出した。
Ｍ
Ｈ＝−ΣＰｉ ｌｏｇ２ Ｐｉ
ｉ＝１
全試料に渡って最高及び最低エントロピーを有するプローブセットの１０％を、ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフウェアのＢＩＮＧＯプラグインを使用し、完全マウスジーンオントロジー、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ多重検定補正を用いた超幾何検定（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｉｃ ｔｅｓｔ）（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｍａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５）でのｐ＝．０１の閾値を使用して解析した。この解析の結果は、ジーンオントロジー及びＥＡＳＥ統計のＥＡＳＥオンライン実装を使用して取得されたものと実質的に類似する（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。
ＭＢＰとのピアソン相関をＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇで算出した。
全細胞タイプの比較解析及びヒートマップを、Ｒ統計ソフトウェアで生成した。データを上記のように正規化した。その後、各細胞タイプについて、全プローブセットリストをフィルタリングして、５０未満のシグナル、又は関連陰性対照遺伝子のＩＰ／ＵＢ値の平均値プラス２標準偏差未満若しくは１未満、どちらか小さい方のＩＰ／ＵＢを有するプローブセットを除外した。その後、このフィルタリングした遺伝子リストを用いて、他の全ての試料に対するこの細胞タイプの倍数変化を反復して算出した。各比較について倍数変化を最高から最低まで順位付けし、これらの順位を、細胞タイプの比較に渡って平均した。この平均順位の上位１００のプローブセットを、さらなる解析用に選択した。
リボソーム免疫沈降がより長い転写に偏っているかどうかを評価するために、シグナル強度を全プローブセットの転写の長さに対してプロットした。シグナル強度と長さとの間に正の相関性は、どの試料でも検出されなかった（図１５）。
実施例６ ＢＡＣアレイポリソーム精製、ＲＮＡ抽出、及び対照マイクロアレイ実験
１）概観
合計で、５つの領域の２４種の細胞集団を、Ｈｅｉｍａｎら（２００８年）の翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法を使用する免疫沈降（ＩＰ）によるアッセイ及びマイクロアレイによるゲノム全域翻訳プロファイル用に選択した。各細胞タイプについて、３〜６匹のトランスジェニックマウスに由来する顕微解剖したプール組織を使用した。図１６に示されているように、この手順により、細胞特異的ｍＲＮＡと共にｅＧＦＰ−リボソーム融合タンパク質の精製がもたらされた。最初のＩＰからの全ＲＮＡの収量は、組織中の標識細胞数及び各細胞内の導入遺伝子発現の強度に依存し、ＲＮＡ回収量は、１ＩＰ当たり数十から数千ナノグラムに及ぶ。免疫沈降の未結合（ＵＢ）画分に由来するＲＮＡを回収して、解剖領域全体で発現された遺伝子を測定した。その後、ＩＰ及びＵＢ ｍＲＮＡを、標準的プロトコールを使用して標識ｃＲＮＡへと増幅した。
その後ＩＰ及びＵＢ画分に由来する標識ｃＲＮＡｓを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製マウス４３０ ２．０マイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。マウスの複数の独立プールに由来する試料（反復試料）を、各細胞タイプについてアッセイした。図１７はこれらのデータを示しており、ＢＡＣアレイデータは高度に再現性が高く、細胞タイプ特異的であることを示している。
パネルＡに示されるように、同じ細胞タイプの反復試料は、ほぼ同一のゲノム全域翻訳プロファイルをもたらし、Ｈｅｉｍａｎらの結果を確認し、この知見は多数の他の細胞タイプに拡張される。独立して単離された試料に由来する所与の細胞集団についての反復試料間の平均ピアソン相関は、全ての細胞タイプに渡って．９８を超えていた。ＢＡＣアレイ構築体の組み込み位置がデータに影響を及ぼす可能性があるかどうかを判断するために、同一遺伝子操作ＢＡＣを用いて準備した独立ＢＡＣアレイ創始体系統から得られた結果も、Ｄに示されているように試験した。この解析により、同一細胞集団を標的とする独立創始体系統の場合、翻訳プロファイルの系統間変動は低く、同一ＢＡＣアレイ創始体系統から単離された反復試料に見られた変動より広範ではなかったことが明らかになった（パネルＤ）。したがって、導入遺伝子をゲノムに挿入する位置は、翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法から得られたデータに全体的な影響をほとんど及ぼさなかった。最後に、ｅＧＦＰに対する４つの異なるモノクローナル抗体及び１つのヤギポリクローナル抗体を試験した。各抗体は、試験したＢＡＣアレイ系統について同程度のレベルのｍＲＮＡを免疫沈降させ、同様の全体的な遺伝子翻訳プロファイルが、特定のＢＡＣアレイ系統に由来するＩＰで試験された各抗体から取得された。少数のプローブセットが、解析された全てのＢＡＣアレイデータセットで一貫して富化されていた。これらの同じプローブセットは、導入遺伝子発現を示さない対照マウスに由来する免疫沈降物にも富化されているため、それらはバックグラウンドを表すと結論付け、さらなる解析から系統的に除外した。
解析用に解剖した組織試料（ＵＢ）での発現に対する、標的細胞タイプから免疫沈降させた各ｍＲＮＡ（ＩＰ）の富化を測定した。ＩＰ／ＵＢ比率を算出し、それにより各細胞タイプで高度に富化される遺伝子を特定した。パネルＢは、小脳の３つの代表的な細胞タイプの散布図を示す。組織全体（ＵＢ）と比較して、ＩＰ試料のゲノム全域翻訳プロファイル間での差異は明白であり、各細胞集団は、数千の特異的に富化された遺伝子の固有なプロファイルをマイクロアレイに示している。パネルＣのように、各細胞タイプの最も富化されたプローブセットの上位１０００から構築したベン図を使用してこの点を例示することができる。したがって、これらの富化されたプローブセットのおよそ７５％は、小脳プルキンエ細胞、顆粒細胞、及び単極刷毛細胞の間で共有されておらず、小脳全体に対してこれら３つの細胞タイプで富化されたプローブセットのうちの５２種だけが、それらの間で共有されている。さらに、これらの実験から収集した一次データは、遺伝子発現オムニバス（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）（Ｅｄｇａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２）に寄託されている。
図１８は、細胞特異的遺伝子を富化するこの方法の正確さを示す。各細胞タイプの既知の細胞特異的マーカー（陽性対照）のＢＡＣアレイデータ、及び他の細胞タイプで排他的に発現されることが知られている遺伝子（陰性対照）のＢＡＣアレイデータを調査した。パネルＡは、脊髄運動ニューロンのＩＰ対ＵＢの散布図を示す。アレイ上で測定可能なシグナルを有する運動ニューロンの公知マーカー用のプローブセットは、ＩＰ試料で明らかに富化されているが、これらの細胞に存在すべきではないグリア細胞特異的ＲＮＡ用のプローブセットは、ＵＢ試料で富化されている。この知見の普遍性を確立するために、ＩＰ又はＵＢ試料中での富化を、少なくとも３つの陽性対照を文献中に見出すことができた各細胞タイプの陽性及び陰性対照の平均ＩＰ／ＵＢ比率を算出することにより定量化した。パネルＢに示されているように、ＩＰは全て、適切な公知マーカーについて明白な富化を示した（パネルＢ、底が２の対数でプロットされている）。１つの既知マーカーしか有していない細胞タイプ（Ｐｎｏｃ陽性介在ニューロン、及びＧｒｐ発現単極刷毛細胞）でさえ、これらの遺伝子のプローブセットは、一貫して及び高度にＩＰで富化されていた。成熟乏突起膠細胞（パネルＢ）及びＣｏｒｔ発現介在ニューロンのＩＰなど、ＲＮＡの相対的収量が最低であるＩＰでは、バックグラウンドが比例的により高く、富化はそれほどロバストではなかった。
ＢＡＣアレイ手法を使用して、希少細胞タイプの新規な細胞特異的マーカーを特定した。顆粒細胞層（ゴルジ細胞）のＧｒｍ２発現介在ニューロン又は大脳皮質のＰｎｏｃ発現細胞のいずれかで富化されることがＢＡＣアレイにより予測された１１個の遺伝子をスクリーニングした。共焦点顕微鏡を使用して、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質及びＩＳＨプローブの両方の二重免疫蛍光を評価した。ＩＳＨが明白な結果を示した９個の遺伝子の場合、全てがｅＧＦＰ−Ｌ１０ａと明らかに重複していた。
パネルＣは、小脳ゴルジ細胞の場合、ＢＡＣアレイ系統でのｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現とこの解析用に選択した遺伝子発現との間に多くの重複が存在することを示している。この重複により、この細胞タイプ及び他の細胞タイプについて得られた結果の特異性が確認される。にもかかわらず、ＩＰ試料での特定のｍＲＮＡの富化は、それがＢＡＣアレイトランスジェニック系統で標識された細胞タイプで排他的に発現されるのか、又はそのタイプの全ての細胞で発現されるのかを結論付けるために使用することはできない。例えば、ＩＳＨデータベース（ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ）は、成体小脳の顆粒層及び分子層の両方に散在する細胞でＰｅｎｋ１が発現されることを明白に示している。さらに、パネル１に示されているように、Ｐｅｎｋ１ ｍＲＮＡは、Ｇｒｍ２を発現する細胞で排他的に発現するとは考えられない。最後に、ゴルジ細胞から収集したＢＡＣアレイデータに富化された幾つかのｍＲＮＡは、蛍光ＩＳＨ技術を使用しては検出されず、恐らくは低発現遺伝子に対するＩＳＨ感度に限界があること、又はより正確なプローブを設計する必要性があることを反映している。したがって、顆粒層介在ニューロンでのＣｅａｃａｍ１０発現の明白な結果は、どのＩＳＨデータベース（ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ）でも明らかではないが、両方の場合で、この区域に散在するシグナルを見出すことができ、これはこのｍＲＮＡが小脳ゴルジニューロンでの発現を示し得る。
ＢＡＣアレイデータセットをさらに検証するために、Ｃｈａｔ（運動ニューロン）及びＰｃｐ２（プルキンエ細胞）ＢＡＣアレイトランスジェニック系統から単離した様々なｍＲＮＡの富化を、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で測定した（パネルＤ）。試験した対照遺伝子の全てについて、この方法によりＢＡＣアレイの結果が確認された。特定の細胞タイプで発現されることが以前に知られていなかった遺伝子の場合、ｑＲＴＰＣＲの結果により、アッセイした８つのｍＲＮＡのうちの７つが実際に細胞タイプに富化されていたことが実証された（パネルＤ）。さらに、陰性のＩＳＨ結果にもかかわらず、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、小脳でのＣｅａｃａｍ１０の発現及びゴルジ細胞でのその富化が検証された（パネルＤ）。したがって、ある場合では、翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法は、ＩＳＨより感度が高いと考えられる。
２）精製ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
幾つかの実験では、２０ｎｇの精製ＲＮＡを使用し、ＮｕＧＥＮ社製ＷＴ Ｏｖａｔｉｏｎキット（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンカルロス、米国カリフォルニア州）を用いてｃＤＮＡを生成し、その結果生じたｃＤＮＡを精製及び定量した。１０ｎｇのｃＤＮＡを、各リアルタイム遺伝子発現アッセイに使用した。製造業者の説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製７９００型配列検出システムを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（フォスターシティ、米国カリフォルニア州）のＴａｑＭａｎプレデザイン遺伝子発現アッセイを使用した。
或いは、幾つかの実験では、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、米国マサチューセッツ州）のＭ−ＭｕｌＶ逆転写酵素（Ｍ０２５３Ｌ）を使用し、オリゴｄＴ２３ＶＮをプライマーとして使用して、３つの反復ＩＰ及びＵＢ試料に由来する２０ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、その後製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ社製、バレンシア、米国カリフォルニア州）に従って、Ｑｉａｇｅｎ迅速ＰＣＲクリーンアップを用いて精製した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ用のほとんどのプライマー配列（表８）は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｂａｎｋ（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｅｅｄ， ２００３）から取得した。製造業者のプロトコール（Ｂｉｏｒａｄ社製、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）に従って、Ｂｉｏｒａｄ ｉＱ ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘを、終濃度が５００ｎｍの各プライマーと共に使用して、ＰＣＲを実施した。サイクル及び定量化は、Ｂｉｏｒａｄ ｉＱ５多重リアルタイム検出ハードウェアを使用して実施した。ＰＣＲを、４５サイクル（９４°、３０秒、６３°、３０秒、７２°、３０秒）で実施し、それを融解曲線で追跡した。各反復試料を三重反復でアッセイした。融解曲線及び／又はゲル電気泳動法により示された二量体を産生する条件を、さらなる分析から除外した。３５サイクルまでに３つの反復試料のうち少なくとも２つで産物を産出しなかったプライマーを、さらなる分析から除外した。データを、ｉＱ５の光学システムソフトウェアバージョン２により、ｄｄＣＴ法を用いてＢ−アクチン（Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に対して正規化し、反復試料に渡って平均した。全てのｑＰＣＲ産物をサブクローニング及び配列決定して、ＰＣＲの正確性を確認した。マイクロアレイデータも、比較のためにＢ−アクチンに対して正規化した。
実施例７ 多数の細胞タイプから収集されたＢＡＣアレイデータの比較解析
上記の実施例は、ＢＡＣアレイデータが各細胞タイプの既知の陽性対照及び陰性対照の発現を正確に反映しており、これらの結果を独立した実験解析により確認することができることを示している。この実施例は、この大規模マイクロアレイデータセットの比較解析から推論することができる、これらの細胞の広範な特性を例示する。この解析の結果は図１９に示されている。パネルＡに示されているように、最も高い変動係数を有するプローブセットの２０％を使用して、２４個のＩＰ試料及び６個のＵＢ試料全てのＧＣＲＭＡ正規化データの階層的クラスター化を実施した。この教師なしクラスター化は、ＣＮＳ細胞タイプの既知の生物学を本質的に再現する。したがって、皮質投射ニューロンの３つの集団は、皮質介在ニューロン、プルキンエ細胞、又は運動ニューロンに類似するよりも、互いにより類似している。脳の異なる領域から収集したアストログリアＢＡＣアレイデータは、予想通り、乏突起膠細胞に類似するよりも、互いに及びベルクマングリアにより類似している。乏突起膠細胞は、任意のニューロン集団などに類似するより、互いにより類似している。これらの知見は、類似した遺伝子発現パターンを有する細胞は類似の機能を共有するという概念を支持し、ＢＡＣアレイデータの解析が、各細胞タイプの際立った特徴に関与するそれらの遺伝子産物の特定を可能にすることを示唆する。
ニューロンタイプに渡る翻訳プロファイルの多様性は、ニューロンとグリアと間の多様性にほぼ匹敵する。様々な運動ニューロン又はＤｒｄ１及びＤｒｄ２中型星状神経細胞などの関連細胞サブタイプは、明らかに密接にクラスター化されているが、多数のニューロンタイプ（例えば、プルキンエ細胞）は、他のどの細胞タイプとも強くはクラスター化されていない。これは、高度に特化した細胞タイプから得られるＢＡＣアレイ翻訳プロファイルの比較解析が、それらの生化学的特性に対する洞察をもたらし得ることを示唆する。最後に、個々の細胞タイプは、一般的にそれらの原発組織に由来するＵＢ試料とは密接にクラスター化しなかった。実際、様々な脳領域に由来するＵＢ試料のプロファイルは、特定のＣＮＳ細胞タイプから得られたデータと比べて緩やかに一緒にクラスター化しており、解剖した脳領域全体からもたらされたマイクロアレイデータは、個々の細胞タイプのＢＡＣアレイ分析ほどの情報価値を提供しないことを示唆する。
この点をより詳細に調査するため、小脳全体に由来するマイクロアレイデータを、この研究で解析した小脳細胞タイプのマイクロアレイデータと比較した。パネルＢに見ることができるように、小脳全体の試料が様々な細胞タイプの集合体であるため、任意の単一細胞タイプは、小脳全体の試料よりも保有する検出可能なプローブセットが少ない。しかしながら、６つの個々の小脳細胞タイプの各々で検出可能なプローブセットの合計の比較解析及び小脳組織全体から得られる結果は、小脳全体に由来するマイクロアレイでは検出不能な４０００個を超えるプローブセットを明らかにする。これらの検出不能なプローブセットは、細胞タイプに富化された遺伝子である傾向がある。実際、希少細胞タイプの場合、その細胞に富化された遺伝子の４２％までは、組織全体のマイクロアレイ研究では全く検出可能ではない可能性がある。したがって、複雑な脳領域内の特定の細胞タイプで発現された遺伝子を検出する場合、翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法は、解剖した脳領域のマイクロアレイ解析よりも高感度であり得る。
翻訳中リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法の感度が高いことにより、その結果として各細胞タイプでより多くのｍＲＮＡが特定されることになり、各細胞タイプに関する翻訳プロファイルのより完全な全体像、より多くの情報がもたらされる。この感度の増加が実際により良好な情報をもたらすかどうかを評価するために、シャノンエントロピーを、６つの組織全体の試料に渡って各プローブセット及び２４種の個々の細胞集団に渡る各プローブセットについて算出した（Ｆｕｈｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｓｈａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｗｅａｖｅｒ， １９６９）。シャノンエントロピーは、試料に渡るシグナルの複雑さを記述する情報量の尺度であり、その値は０（低情報）から２（高情報）の範囲である。データは図２０に示されている。低情報のプローブセット及び高情報のプローブセットの例は、パネルＢに示されている。これらの試料の情報量のシャノンエントロピー測定値は、細胞タイプ特異的実験（ＩＰの）の平均シャノンエントロピーが、組織全体の試料のマイクロアレイデータから算出したシャノンエントロピーより２倍を超えて高いことを明らかにする（ｔ検定、ｐ＜．０００１、全ＩＰに渡る平均エントロピー：０．８８＋／−．００２、組織全体：．４１＋／−．００３）。この解析は、ＢＡＣアレイ戦略を使用して特定細胞タイプから収集したマイクロアレイデータが、解剖した脳組織に関する従来のマイクロアレイ研究より良好な情報を提供することができることを実証する。
全試料に渡って高エントロピー測定値を有する遺伝子は、細胞タイプ間で最も複雑な様式で変動する遺伝子であるため、このエントロピー測定値を適用して、神経系の細胞タイプ間の差異を根本的に決定するものを評価した。パネルＣに見られるように、エントロピーが最も高いプローブセット及びエントロピーが最も低いプローブセットの１０パーセントを、ジーンオントロジーで分類し、その後過剰出現する機能別カテゴリーを探索した（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｍａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。この解析によると、神経系における細胞タイプの多様性は、チャネル及び受容体などの細胞表面タンパク質の発現により主に促進されており、転写因子及びカルシウム結合タンパク質の特異的発現によってもある程度は促進されている。情報量がより少ない遺伝子は、リボソーム及びミトコンドリアタンパク質などのより遍在的に発現される遺伝子である傾向がある。これはそれらが変動しないとまで言うものではなく、それらの発現は、多くの場合、細胞タイプに渡って２倍〜５倍に及ぶが、多くの受容体及びチャネルの数十〜数千倍の変化ほど劇的には変動しない。
表９は、個々の細胞タイプの高度に特化した特性をコードし得る同時制御された遺伝子を特定するための翻訳プロファイリングの比較解析である。この解析は、同時制御された遺伝子のこれらのコホートが、多くの場合周知の機能を有する遺伝子を含むことになるため、新規遺伝子産物の公知の機能又は候補となる機能に関する遺伝子セットを特定しようとする際に有用であり得る。提供されたＢＡＣアレイデータが、このようなクエリーで生産的な結果をもたらすことができるかどうかを試験するために、髄鞘形成に関与することが知られている遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（Ｍｂｐ）のプローブセットを選択した。その最も高い相関物を、全ＩＰ及びＵＢ試料に渡って調査した。Ｍｂｐ発現と相関する上位３５の遺伝子（最小相関係数：．８６）では、Ｐｌｐ１、Ｃｎｐ、Ｍｏｇ、Ｍａｌ、及びＭｏｂｐを含む、髄鞘形成に関与することも知られている６つの遺伝子が特定され、別の３つの遺伝子は、ミエリン構成要素のプロテオミクススクリーニングで以前に特定されていた（表９）。
図２１は、各集団に最も高度に特異的な遺伝子のみを特定するための、個々の細胞試料の比較解析を示す。反復比較を実施した：各試料をデータセット中の他の試料の各々と１つずつ比較し、各集団について、プローブセットをこれらの比較全体に渡って平均順位により分類した。その後データを混合し、発現によりクラスター化し、各集団の上位１００のプローブセットをヒートマップに順位付けした（パネルＡ）。このヒートマップには、異なる細胞タイプが遺伝子の特定コホートにより特徴付けられる程度が容易に図示されている。例えば、小脳プルキンエ細胞は、他のいかなる細胞タイプにも見られない一群の遺伝子により明白に区別される（パネルＡ）。したがって、プルキンエ細胞試料に観察された上位２５の最も特異的なプローブセットは、他のいずれの細胞タイプの上位２５の最も特異的なプローブセットのいずれにも全く見出されない。対照的に、２つの密接に関連する細胞タイプであるＤｒｄ１及びＤｒｄ２中型星状神経細胞は、解析した他の細胞集団に見出されない多数の遺伝子を共発現するが、それらを区別する遺伝子の異なるサブセットも発現する（Ｈｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ）。したがって、ＢＡＣアレイデータの比較解析を使用して、固有の生化学的及び生理学的特性を有するＣＮＳ細胞集団を特徴付けし、分子レベル及び生化学レベルで密接に関連する細胞タイプ間の区別をつけることができる。
パネルＢの表に示されているように、各細胞タイプの上位２５の最も特異的なプローブセットには、周知の細胞特異的マーカー及び以前は特徴付けられていない新規遺伝子の両方に関するプローブセットが含まれる。例えば、Ｐｃｐ２、カルシウム結合タンパク質Ｃａｌｂ１、骨格／シナプスタンパク質Ｈｏｍｅｒ３、及び転写因子Ｅｂｆ２は、それらの全てがプルキンエ細胞で特異的に発現されることが知られているが（Ｍａｌｇａｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７；Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイリストで最も高く順位付けされたプローブセットの中にある。ＣＮＳミエリン鞘の最も豊富な構成要素のうちの１つであるＭｏｂｐ（Ｍｏｎｔａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）は、Ｃｍｔｍ５ミエリン形成乏突起膠細胞のリストで顕著である。深層皮質ニューロンでのＴｃｒｂの発現（Ｎｉｓｈｉｙｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）は、Ｎｔｓｒ１ ＢＡＣアレイデータで確認されている。本明細書中で特定された細胞特異的翻訳を示す多数の特徴付けられていない遺伝子は、これらの細胞タイプで作用する新規の生化学経路を発見するための、又は周知の経路で作用する新しいタンパク質を同定するための重要な資源を提供する。最後に、比較解析は、解剖学的研究では明白ではない差異を明らかにすることができる。例えば、Ｅｔｖ１系統の最も特異的なプローブセットは、リンパ球細胞で発現されることが周知である幾つかの遺伝子を特定し、この系統では、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子は、ＣＮＳ脈管構造の循環細胞でも発現され得ることを示唆する。まとめると、上で示したデータは、ＢＡＣアレイデータの大規模比較解析の２つの重要な強みを実証する。第１に、細胞タイプ間の分子的関係性を、階層的クラスター化で容易に確立することができ、第２に、特定細胞タイプの生化学機能をコードする遺伝子群を、この種の系統的比較手法を使用して特定することができる。
実施例８ 脊髄運動ニューロンから収集したＢＡＣアレイデータの解析
脊髄運動ニューロン（ＭＮ）は、様々な深刻な神経学的障害及び深刻な急性傷害に関与するため、最もよく研究されているＣＮＳの細胞タイプの１つである。そのため、それらは、この細胞タイプについて入手可能な深い知識を用いてＢＡＣアレイデータを評価する機会を提供する。特に、ＭＮについて入手可能である豊富な解剖学的及び生理学的データ、及びそれらの発生に関与する転写因子の包括的な研究により、本明細書中で提示されているＢＡＣアレイデータを公開文献と比較することが可能になる。図２２に示されているように、単一のＢＡＣアレイ実験で、先行研究に記載されているＭＮで発現される分子のほとんどが再発見される。この解析を実施するために、ＢＡＣアレイの結果を、本方法に記載のように「発現した」、「富化した」、又は「発現なし」と色分けした。その後、この分類を、成体げっ歯動物文献で報告されている結果と比較し、単に「発現した」又は「発現なし」のいずれかに色わけするか、又は研究データがない場合若しくは矛盾するデータが存在する場合は色付けせずにしておいた。マイクロアレイプローブセットが存在し情報価値があったほとんどの場合で、ＢＡＣアレイの結果は、文献とよく一致する。したがって、ＭＮは、ＡＭＰＡ、カイニン酸、及びＮＭＤＡに感受性であるグルタミン酸受容体を発現することが報告されている（Ｒｅｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。これらの結果は、これらの応答を媒介する特異的受容体サブユニットには、Ｇｒｉａ３及び４、Ｇｒｉｋ２及び４、並びにＧｒｉｎ１、３ａ、及び３ｂが含まれることを示唆する。ＭＮの阻害は、Ｇｌｒα２及びＧｌｒＢグリシン受容体サブユニット、並びに潜在的にＧａｂｒα２、α５、及びβ３サブユニットからなる代謝調節型（Ｇａｂｂｒ１）及びイオンチャネル型の両方のＧＡＢＡ作動性受容体の作用によるはずである。これらのデータにより、ＭＮが、Ｃｈｒｎα４／β２及び／又はＣｈｒｎα７受容体を介するアセチルコリン、並びにＨｔｒ１ｄ受容体を介するセロトニンを含む全ての古典的神経伝達物質に応答するはずであると予測される。ＭＮにおけるＤｒｄ１又はＤｒｄ２の発現は検出されず、従来の免疫組織化学の知見（Ｒｅｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）とは一致しなかった。さらに、Ｄｒｄ１及びＤｒｄ２のトランスジェニックマウスは、ＭＮで導入遺伝子の発現を示さず、Ａｌｌｅｎ脳地図ＩＳＨも、脳幹ＭＮでの発現を示しておらず、ＢＡＣアレイの結果を支持している。
ＭＮは、新たに特徴付けられた様々な受容体及びオーファン受容体も発現する。例えば、ＢＡＣアレイデータは、Ｇｒｉｎ３ｂを、ＮＭＤＡサブユニットをコードするＭＮ特異的遺伝子と特定することに成功している。この受容体は、最近になってＭＮで固有のグリシン開口型チャネルを生成すると特徴付けられた（Ｃｈａｔｔｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２；Ｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。ＭＮにおいて以前に特徴付けられていないか又は全く研究されていないＭＮ特異的受容体を潜在的にコードする、ＭＮで富化された他の幾つかの遺伝子も特定された。特に関心のある２つは、ビタミンＤ受容体及びオーファン受容体Ｐ２ｒｘｌ１である。ＭＮの挙動におけるこれらの受容体の役割を調査する将来の研究により、ビタミンＤ欠乏症を有する患者の可逆的筋力低下（Ｗｈｉｔａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００；Ｚｉａｍｂａｒａｓ ａｎｄ Ｄａｇｏｇｏ−Ｊａｃｋ， １９９７）の症例が説明されるか、又はＭＮの機能に重要な新しい経路が示唆され得る。
実施例９ コリン作動性運動ニューロン及びプルキンエニューロンの分子表現型解析及び翻訳プロファイリング
ＢＡＣアレイ技術を他のタイプのニューロンの特徴付けに使用することができるかどうかを決定するために、コリン作動性細胞特異的ＢＡＣアレイ系統及びプルキンエ細胞特異的ＢＡＣアレイ系統を、図２３に示されているように生成した。コリン作動性細胞ＢＡＣアレイ系統を、ＣＮＳにおけるコリン作動性細胞で特異的に発現されるコリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）遺伝子座の制御下にｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子を配置することにより生成した。公開されているラットＣＮＳでのＣｈａｔ発現パターン（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， １９９２）から予想される通り、ＣｈａｔＢＡＣアレイ系統ＤＷ１６７は、背側線条体及び腹側線条体（側座核、嗅結節、及びカレハ島）、基底前脳、脳幹、脊髄、及び内側手綱のコリン作動性細胞で最も高いｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現を示した（パネルａ）。ｅＧＦＰ発現は、脳幹の運動ニューロン（パネルｂ）を含むこれらの構造の全てのコリン作動性細胞に限定されることが、Ｃｈａｔの間接免疫蛍光染色により示された。この共局在化の１つの例外は、脚橋被蓋核及び外背側被蓋核にあり、そこでは少数のコリン作動性細胞のみがｅＧＦＰで標識されていた。
プルキンエ細胞ＢＡＣアレイ系統ＤＲ１６６を、ＣＮＳの小脳プルキンエ細胞で特異的に発現される（Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８８）プルキンエ細胞タンパク質２（Ｐｃｐ２）遺伝子座の制御下にｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子を配置することにより生成した。Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイ系統は、特徴的なプルキンエ細胞形態を有した細胞に限定されたｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現を示した（パネルｃ）。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現が小脳プルキンエ細胞に限定されていたことは、小脳ではプルキンエ細胞で特異的に発現される（Ｎｏｒｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９８８）カルビンジンＤ２８Ｋの間接免疫蛍光染色（パネルＤ）により確認された。アレイデータを、ＣｈａｔＢＡＣアレイ系統を使用して脳幹コリン作動性運動ニューロンから、及びＰｃｐ２ ＢＡＣアレイ系統を使用してプルキンエ細胞から収集した。反復Ｃｈａｔ ＢＡＣアレイ試料は、反復Ｐｃｐ２の場合のＢＡＣアレイ試料の場合と同様に（平均ピアソン相関＝０．９９７）、ほぼ同一のゲノム全域翻訳プロファイルをもたらした（平均ピアソン相関＝０．９８２）。
参照試料（免疫沈降で未結合）でのその発現に対する、標的細胞タイプ（ＩＰ）から免疫沈降した各ｍＲＮＡの富化の尺度を提供するために、各ＩＰ試料対参照試料の発現比率を算出した。この比較により、共通の参照試料に対する各細胞タイプで高度に富化された遺伝子を特定した。脳全体マイナスに対するＤ１及びＤ２混合ＢＡＣアレイデータの解析から予想される通り、解析した個々の試料全て：線条体黒質細胞（Ｄ１）、線条体淡蒼球細胞（Ｄ２）、脳幹コリン作動性細胞（Ｃｈａｔ）、及びプルキンエ細胞（Ｐｃｐ２）についての参照試料と比較して、ＩＰ試料のゲノム全域翻訳プロファイル間に差異があることは明白である。図２４は、細胞特異的陽性対照遺伝子の富化及び公知の陰性対照遺伝子（グリア遺伝子）の除外は、各比較で明白だったことを示す（パネルａ〜ｄ）。この解析からの上位１，０００の富化されたプローブセット（表１７〜２０）から構築したベン図により、線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞の翻訳プロファイルが、脳幹コリン作動性細胞又はプルキンエ細胞のいずれかの翻訳プロファイルに類似するよりも、互いにより大きな類似性を示すことが確認された（パネルｅ〜ｈ）
実施例１０ 線条体の分子表現型解析及び翻訳プロファイリング
１）概観
この例は、線条体の特異的特性に関する研究を表す。この例では、密接に関連しており空間的に隣接するＣＮＳ細胞集団での予期せぬ分子及び生理学的複雑さを明らかにすることができる１つの実施形態が例示されている。線条体とは、終脳の皮質下の部分である。線条体は、基底核系の主要な投入部位である。この例では、線条体の線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞に分子タグ化リボソームタンパク質を含有するトランスジェニックマウスを、標準的ＢＡＣアレイ技術を使用して作製した。線条体黒質及び線条体淡蒼球中型星状神経細胞（ＭＳＮ）は混合されており、細胞体樹状突起の（ｓｏｍａｔｏ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）形態では識別不能であり、パーキンソン病、統合失調症、注意欠陥過活動性障害、薬物依存症、及びハンチントン病を含む種々の神経系疾患の病因において役割を果たしているため、多大な関心の対象である。線条体黒質ＭＳＮは、基底核、つまり黒質及び淡蒼球の内部セグメント（げっ歯動物の脳脚内核）の出力核に直接投射軸索（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｘｏｎ）を送るが、線条体淡蒼球ＭＳＮは、淡蒼球の外部セグメントに投射軸索を送る。線条体黒質ＭＳＮは、ドーパミンＤ１受容体（Ｄｒｄ１；Ｄｒｄ１ａ）及び神経ペプチドのサブスタンスＰ（Ｔａｃ１）、及びダイノルフィン（Ｐｄｙｎ）を優先的に発現することが知られているが、線条体淡蒼球ＭＳＮは、ドーパミンＤ２受容体（Ｄｒｄ２）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａｄｏｒａ２ａ）、及び神経ペプチドのエンケファリン（Ｐｅｎｋ）を優先的に発現する（Ｓ． Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２５， ９１７−２５ （２００３））。
２）ＢＡＣアレイ線条体マウスの生成
線条体の線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞に分子タグ化リボソームタンパク質を含有するマウスを作製した。細菌での相同組換えを使用して、適切なＢＡＣのＤ２受容体（線条体淡蒼球）又はＤ１受容体（線条体黒質）遺伝子座のいずれかの制御下にｅＧＦＰ−Ｌ１０ａを配置した。遺伝子操作したＢＡＣアレイＤＮＡ構築体を受精卵母細胞に前核注入することにより、マウス系統を生成した。
公知のＤ１及びＤ２受容体の発現パターンにより判断して、導入遺伝子の適切な発現について免疫組織化学法によりマウス系統をスクリーニングした。Ｄｒｄ２系統では、プロエンケファリンとｅＧＦＰ−Ｌ１０ａとの７５．８％共局在化が観察され（ｎ＝２０４／２６９）、Ｄｒｄ１ａ系統では、０％の共局在化が観察された（ｎ＝０／３２５）。Ｄｒｄ２系統の場合、プロエンケファリン抗体を使用する染色の至適化には、クエン酸緩衝液中での熱誘導エピトープ検索が必要であるため、この数は過小評価である可能性が高い。しかしながら、ｅＧＦＰ蛍光及び種々のＧＦＰ抗体のｅＧＦＰ認識能力は両方とも、これらのエピトープ検索法の使用に際して実質的に減少するため、熱誘導エピトープ検索を共局在化実験に使用しなかった。ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ（直接ｅＧＦＰ蛍光）及びプロエンケファリン発現（免疫組織化学的染色）の共局在化データが示されている（図２５）：（ａ）Ｄ２ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ１０１に由来する成体矢状切片でのｅＧＦＰに対する免疫組織化学。（ｂ）Ｄ２ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ１０１線条体ＭＳＮ細胞の特徴付け：直接ｅＧＦＰ蛍光（左パネル、高倍率画像が挿入されている）；エンケファリンの免疫組織化学的染色（中央パネル）；重ね合わせ（右パネル、２０μｍスケールバーが示されている）。（ｃ）Ｄ１ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ７３に由来する成体矢状切片でのｅＧＦＰに対する免疫組織化学。（ｄ）Ｄ１ ＢＡＣアレイ系統ＣＰ７３線条体ＭＳＮ細胞の特徴付け：直接ｅＧＦＰ蛍光（左パネル）；エンケファリン免疫組織化学的染色（中央パネル）；重ね合わせ（右パネル）。
Ｄ２ ＢＡＣアレイ系統は、背側線条体及び腹側線条体、嗅結節、並びに海馬で、最も高いトランスジェニックｅＧＦＰ−Ｌ１０ａの発現を示した。加えて、ドーパミン作動性細胞でのＤ２自己受容体の発現により予想される通りに、この系統の黒質緻密部及び腹側被蓋野でｅＧＦＰの発現が見られた（パネルａ）。Ｄ１ ＢＡＣアレイ系統は、背側線条体及び腹側線条体、嗅球、嗅結節、並びに皮質層５及び６で、最も高いトランスジェニックｅＧＦＰ−Ｌ１０ａの発現を示した。予想通り、リボソームタンパク質融合体の場合、ｅＧＦＰ蛍光を直接的に視覚化することにより、トランスジェニックｅＧＦＰ−Ｌ１０ａが核小体及び細胞質に局在化していることが明らかになった（パネルｂ）。ｅＧＦＰのエンケファリン発現（線条体淡蒼球細胞マーカー）との共局在化は、Ｄ２ ＢＡＣアレイ系統に由来する線条体細胞で観察されが、Ｄ１ ＢＡＣアレイ系統では観察されず（パネルｂ及びｄ）、正しいＢＡＣ媒介性細胞タイプ発現が検証された。
Ｄ２ ＢＡＣアレイマウス線条体抽出物のポリソーム特性を下記のように図２６に示す：上段：ポストミトコンドリア線条体抽出物（Ｓ２０）を、線形スクロース勾配（２０〜５０％重量／重量）に負荷した。速度沈降の後、ＵＶ吸光度（２５４ｎｍ）を測定しながら、画分（沈降方向は矢印で示されている）を回収した。下段：勾配画分をエタノールで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液に再懸濁し、Ｒｐｌ７及びｅＧＦＰ Ｌ１０ａ含量をウエスタンブロッティングでアッセイした。両系統のＢＡＣアレイマウスの線条体抽出物から単離したポリソーム複合体の速度沈降分析により、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質が機能的ポリソームにｉｎ ｖｉｖｏで組み込まれことを確認した。
３）線条体黒質及び線条体淡蒼球ＭＳＮのＢＡＣアレイプロファイリング
以前に知られている全てのマーカーを含む、線条体黒質及び線条体淡蒼球ＭＳＮを特徴付ける差次的に発現される複数の遺伝子を特定することができる。翻訳プロファイリング及び分子表現型解析を、成体線条体黒質又は線条体淡蒼球ＢＡＣアレイマウスから免疫親和性精製したｍＲＮＡを用いて実施した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を２回行った後、ビオチン標識アンチセンスＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０ ２．０アレイで照合した。各細胞タイプについて、各々が７匹の動物コホートから調製された３つの独立した生物学的反復試料からデータを収集した。免疫親和性精製した試料の解析により、ｍＲＮＡの長さ又は存在量にバイアスがかかっていないことが明らかになった（図２７）。転写産物の長さは、入手可能なマウスの管理されたＲｅｆＳｅｑＲＮＡ配列全てに基づいた（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｍ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／ＲＮＡ）。単一遺伝子の転写改変体が複数入手可能だった場合、最長の転写改変体を選択した。ＲｅｆＳｅｑの長さを、Ｄ１（ａ）又はＤ２（ｂ）ＢＡＣアレイＩＰ正規化発現値に対してプロットした。転写産物の長さとＩＰ値との間に相関性は観察されなかった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製Ｇｅｎｅｃｈｉｐプローブセット全てについての線条体発現値を、野生型線条体組織に由来する全ＲＮＡアレイにより取得した（データ非表示）。これらの値を、（ｃ）Ｄ１ ＢＡＣアレイ又は（ｄ）Ｄ２ ＢＡＣアレイのＩＰ正規化値に対してプロットした。予想通り、線条体全体でのより高い発現は（ＩＰ、野生型マウスでは無し）、より高いＤ１又はＤ２ ＢＡＣアレイＩＰ値と相関する。線条体全体で中程度の発現を示したがＩＰ値は低かった少数の遺伝子には、公知の非ニューロン遺伝子が含まれている。
これらのデータの比較解析により、よく特徴付けられた差次的に発現されるＭＳＮマーカーのうち８つが全て、富化されたことがＢＡＣアレイ手法を使用して明らかになった：Ｄ２（Ｄｒｄ２）（３６．６×）、アデノシン２ａ受容体（Ａｄｏｒａ２ａ）（１３．２×）、及びエンケファリン（Ｐｅｎｋ）（７．５×）は、線条体淡蒼球ＢＡＣアレイ試料において富化されていたが、Ｄ１（Ｄｒｄ１ａ）（３．９×）、サブスタンスＰ（Ｔａｃ１）（３．６×）、及びダイノルフィン（Ｐｄｙｎ）（５．６×）は、線条体黒質ＢＡＣアレイ試料にいおて富化されていた（図２８及び表１０）。
ＦＡＣＳで選別したＭＳＮに関するマイクロアレイ研究で報告されているように（Ｓ． Ｍａｇｄａｌｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ４， ｅ８６ （２００６））、４つの富化した線条体淡蒼球ｍＲＮＡ（Ａｄｋ、Ｐｌｘｄｃ１、ＢＣ００４０４４、及びＨｉｓｔ１ｈ２ｂｃ）及び６つの富化した線条体黒質ｍＲＮＡ（Ｓｌｃ３５ｄ３、Ｚｆｐ５２１、Ｅｂｆ１、Ｓｔｍｎ２、Ｇｎｂ４、及びＮｒｘｎ１）を確認した。しかしながら、このデータでは、およそ７０個の富化した追加的な線条体淡蒼球転写物及び１５０個を超える富化した追加的な線条体黒質転写物が特定された（表１０）。
このデータの初期試験を提供するために、独立した生物学的ＢＡＣアレイＤ１及びＤ２試料並びに異なるｃＤＮＡ増幅手順（Ａ． Ａｌｅｘａ， Ｊ． Ｒａｈｎｅｎｆｕｈｒｅｒ， Ｔ． Ｌｅｎｇａｕｅｒ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２， １６００−７ （２００６））を使用して、定量ＰＣＲ研究を実施した。線条体黒質ＭＳＮでのＥｙａ１、Ｉｓｌ１、Ｇｎｇ２、及びＣｒｙｍの差次的発現、並びに線条体淡蒼球ＭＳＮでのＧｐｒ６、Ｌｈｘ８、Ｇｐｒ８８、Ｔｒｐｃ４、及びＴｐｍ２の差次的発現を確認した（表１１及び表１２）。使用したｑＰＣＲアッセイは、Ｇａｐｄｈ：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１、Ｄｒｄ２：Ｍｍ００４３８５４１＿ｍ１、Ｇｐｒ６：Ｍｍ０１７０１７０５＿ｓ１、Ｌｈｘ８：Ｍｍ００８０２９１９＿ｍ１、Ｇｐｒ８８：Ｍｍ０２６２０３５３＿ｓ１、Ｔｒｐｃ４：Ｍｍ００４４４２８４＿ｍ１、Ｔｐｍ２：Ｍｍ００４３７１７２＿ｇ１、Ｅｙａ１：Ｍｍ００４３８７９６＿ｍ１、Ｔａｃ１：Ｍｍ００４３６８８０＿ｍ１、Ｉｓｌ１：Ｍｍ００６２７８６０＿ｍ１、Ｇｎｇ２：Ｍｍ００７２６４５９＿ｓ１、Ｃｈｒｍ４：Ｍｍ００４３２５１４＿ｓ１、Ｄｒｄ１ａ：Ｍｍ０２６２０１４６＿ｓ１、Ｃｒｙｍ：Ｍｍ０１２８１２５８＿ｍ１、Ａｃｔｂ：Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１、及びＦｔｈ１：Ｈｓ０１６９４０１１＿ｓ１であった。各アッセイを４回反復で実施し、比較Ｃｔ法で富化倍数を導出し（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の推奨に従った）、各標的増幅をＧａｐｄｈ又はＡｃｔｂ参照増幅と比較した。
４）線条体黒質及び線条体淡蒼球ＭＳＮのＢＡＣアレイプロファイリングの大規模検証
公的に入手可能な遺伝子発現データベースを使用してデータの大規模検証を実施した。Ｄ１及びＤ２ ＢＡＣアレイ実験からのデータをプールしてＭＳＮで富化されたサブタイプを代表させ、１つの脳全体（線条体を除く）の全ＲＮＡから収集したデータと比較した（表１３）。
この解析により、脳全体と比べて線条体で富化された数千の翻訳されたｍＲＮＡの検出がもたらされ、これらには以前に知られていた以下の線条体で富化された遺伝子が全て含まれている：Ｐｐｐ１ｒ１ｂ／Ｄａｒｐｐ−３２（Ｓ． Ｉ． Ｗａｌａａｓ， Ｐ． Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ４， ８４−９８ （Ｊａｎ， １９８４））、Ｐｔｐｎ５／Ｓｔｅｐ（Ｐ． Ｊ． Ｌｏｍｂｒｏｓｏ， Ｊ． Ｒ． Ｎａｅｇｅｌｅ， Ｅ． Ｓｈａｒｍａ， Ｍ． Ｌｅｒｎｅｒ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３， ３０６４−７４ （Ｊｕｌ， １９９３））、Ａｒｐｐ−１９（Ｊ． Ａ． Ｇｉｒａｕｌｔ， Ａ． Ｈｏｒｉｕｃｈｉ， Ｅ． Ｌ． Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｎ． Ｌ． Ｒｏｓｅｎ， Ｐ． Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １０， １１２４−３３ （Ａｐｒ， １９９０））、Ａｒｐｐ−２１／ＲＣＳ（Ｃ． Ｃ． Ｏｕｉｍｅｔ， Ｈ． Ｃ． Ｈｅｍｍｉｎｇｓ， Ｊｒ．， Ｐ． Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９， ８６５−７５ （Ｍａｒ， １９８９））、Ｇｎａｌ／Ｇｏｌｆ（Ｄ． Ｈｅｒｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３， ２２３７−４８ （Ｍａｙ， １９９３））、Ｒｈｅｓ／Ｒａｓｄ２（Ｊ． Ｄ． Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ５７， ７８２−８ （Ｓｅｐ １５， １９９９））、Ｒｇｓ９（Ｓ． Ｊ． Ｇｏｌｄ， Ｙ． Ｇ． Ｎｉ， Ｈ． Ｇ． Ｄｏｈｌｍａｎ， Ｅ． Ｊ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ８０２４−３７ （Ｏｃｔ １５， １９９７））、Ａｄｃｙ５（Ｃ． Ｅ． Ｇｌａｔｔ， Ｓ． Ｈ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６１， ５３６−８ （Ｆｅｂ １１， １９９３））、Ｇｎｇ７（Ｊ． Ｂ． Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３９， １０８−１６ （Ｓｅｐ １， １９９４））、Ｒａｓｇｒｐ２（Ｈ． Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５， １３２７８−８３ （Ｏｃｔ ２７， １９９８））、Ｐｄｅ１ｂ（Ｊ． Ｗ． Ｐｏｌｌｉ， Ｒ． Ｌ． Ｋｉｎｃａｉｄ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９， １１０７９−８３ （Ｎｏｖ １５， １９９２））、Ｐｄｅ１０ａ（Ｋ． Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ， Ｊ． Ｋｏｔｅｒａ， Ｋ． Ｏｍｏｒｉ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６６， １１１８−２７ （Ｄｅｃ， １９９９））、Ｇｐｒ８８（Ｋ． Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６９， ３１４−２１ （Ｎｏｖ １， ２０００））、Ｒａｒｂ（Ｗ． Ｋｒｅｚｅｌ， Ｐ． Ｋａｓｔｎｅｒ， Ｐ． Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８９， １２９１−３００ （１９９９））、及びＳｔｒｎ４（Ｆ． Ｃａｓｔｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３４， １０５１−６２ （Ａｕｇ， １９９６））、並びに転写因子Ｆｏｘｐ１、Ｆｏｘｐ２（Ｒ． Ｊ． Ｆｅｒｌａｎｄ， Ｔ． Ｊ． Ｃｈｅｒｒｙ， Ｐ． Ｏ． Ｐｒｅｗａｒｅ， Ｅ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓｅｙ， Ｃ． Ａ． Ｗａｌｓｈ， Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ４６０， ２６６−７９ （Ｍａｙ ２６， ２００３））、Ｅｂｆ１（Ｓ． Ｍａｇｄａｌｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ４， ｅ８６ （２００６））、及びＺｆｐ５０３／Ｎｏｌｚ（Ｃ． Ｗ． Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１， ２６１３−８ （Ｆｅｂ ２４， ２００４））（表１３）。
これらのデータの独立した確認として、ｍＲＮＡ発現パターンを、ＧＥＮＳＡＴ／脳遺伝子発現地図（ＢＧＥＭ）及びＡｌｌｅｎ脳地図（ＡＢＡ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｓａｔ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｏｒｇ／）にあるＭＳＮで発現される候補遺伝子のサブセットについて調査した。発現データが両方の遺伝子発現地図で入手可能だった遺伝子のみを選択した。データは図２９に示されている。ＭＳＮで富化されたデータセットに出現した最初の１００遺伝子のうち、２６個は、ＢＧＥＭ及びＡＢＡ公開ＩＳＨ地図の両方に存在していた。富化された線条体での発現は、これらの遺伝子のうちの２２個で明白である（（表１３）、パネルａ）。
ＭＳＮで富化されたリストの１，０００番〜１，１００番の間に出現した１６遺伝子のＩＳＨデータが、ＧＥＮＳＡＴ／ＢＧＥＭ及びＡＢＡで入手可能だった。この場合、線条体で富化された発現は、これらの遺伝子のうちの７個で明白である（（表１３）；パネルｂ）。
上位１００（ａ）又は１，０００〜１，１００（ｂ）の遺伝子中にあった遺伝子の矢状切片における発現解析は、本研究においてＭＳＮで富化されると特定され、各遺伝子の順位序列が遺伝子名の下に記載されている。重複プローブセットを除外し、各遺伝子に対応する最高順位のプローブセットを使用して、非重複遺伝子の順位を算出した。左パネル、Ａｌｌｅｎ脳地図から取得したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像（Ａｌｌｅｎ脳地図［インターネット］。シアトル（米国ワシントン州）：Ａｌｌｅｎ脳科学研究所。（著作権）２００６年。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ ｍａｐ．ｏｒｇから入手可能；Ｅ． Ｓ． Ｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４４５， １６８−７６ （Ｊａｎ １１， ２００７））；右パネル、脳遺伝子発現地図（ＢＧＥＭ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｂｇｅｍ．ｏｒｇ／）から取得したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像（Ｓ． Ｍａｇｄａｌｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ４， ｅ８６ （Ａｐｒ， ２００６））。Ａｌｌｅｎ脳地図画像は全て成体脳に対応し、ＢＧＥＭ画像は、最も年齢の高い利用可能なデータが生後７日目（Ｐ７）だった以下のものを除き全て成体脳に対応する：Ｄｒｄ２、Ｐｐｐ１ｒ１ｂ、Ｄｌｘ６、Ｇｄｎｆ、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｏｘｇ１、Ｌｉｍｄ２、Ｆｅｍ１ｂ、Ｄｙｎｌｌ１、Ａｔｂｆ１、Ｆｏｘｏ３ａ、Ｄｎａｌｃ４、Ｍｔｍｒ７、Ｄｎｍｔ３ａ。
５）生物学的機能による富化遺伝子のグループ化
線条体黒質及び線条体淡蒼球で富化された遺伝子を生物学的機能によりグループ化するために、これらの遺伝子に関連した統計的に過剰出現するジーンオントロジー（ＧＯ）及び京都遺伝子およびゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）の経路用語を検索した。ＧＯ用語は、既知の分子機能、生物学的プロセス、並びに特定遺伝子の細胞局在化（構成要素）（Ｒ． Ｂｅｒｎａｒｄｉ， Ｐ． Ｐ． Ｐａｎｄｏｌｆｉ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８， １００６ （２００７））を記述する一方で、ＫＥＧＧ経路は既知の分子相互作用及び反応ネットワークを要約する。最も富化された線条体黒質ＫＥＧＧ経路には、神経活動性（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ）リガンド受容体相互作用、長期抑制、及びＭＡＰＫシグナル伝達経路が含まれていた。最も富化された線条体淡蒼球ＫＥＧＧ経路には、ピリミジン代謝、プリン代謝、及び神経活動性リガンド受容体相互作用が含まれていた。線条体黒質及び線条体淡蒼球細胞データを脳全体と比較することにより、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、長期増強、及びインスリンシグナル伝達経路を含む多数の線条体で富化されたＫＥＧＧ経路が明らかになった。線条体黒質で富化されたＧＯ分子機能用語には、ＧＴＰアーゼ活性、カルシウムイオン結合、及びレチナール結合が含まれており、線条体淡蒼球で富化されたＧＯ分子機能用語には、アドレナリン作用性受容体活性、カルシウムチャネル活性、及びロドプシン様受容体活性が含まれており、線条体で富化されたＧＯ用語には、亜鉛イオン結合、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ活性、及びユビキチンタンパク質リガーゼ活性が含まれていた。
実施例１１ 線条体黒質細胞と線条体淡蒼球細胞との間の生理学的差異
上記の実施例で発見された差次的に翻訳されたｍＲＮＡにより、線条体黒質細胞と線条体淡蒼球細胞との間の生理学的差異が直ちに予測される。例えば、線条体淡蒼球ニューロンで選択的で富化されたｍＲＮＡは、Ｇｐｒ６である（Ｓ． Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２５， ９１７−２５ （Ｏｃｔ ３０， ２００３））。Ｇｐｒ６は、リゾリン脂質スフィンゴシン１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）のＧタンパク質共役受容体をコードする（Ａ． Ｉｇｎａｔｏｖ， Ｊ． Ｌｉｎｔｚｅｌ， Ｈ． Ｊ． Ｋｒｅｉｅｎｋａｍｐ， Ｈ． Ｃ． Ｓｃｈａｌｌｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１１， ３２９−３６ （Ｎｏｖ １４， ２００３））。異種性発現系では、Ｇｐｒ６受容体のＳ１Ｐ活性化は、細胞内貯蔵からのＣａ２＋放出を誘導する。細胞内Ｃａ２＋は神経生理学の重要な調節因子であるため、線条体淡蒼球ニューロンでＧｐｒ６が選択的に富化されることが、Ｓ１Ｐに対する差次的応答と相関するかどうかを調査した。機能的Ｇｐｒ６受容体が、線条体淡蒼球ニューロンで選択的に発現されたかどうかを決定するために、ＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球中型星状神経細胞又はＢＡＣ Ｄ１線条体黒質中型星状神経細胞（可溶性ｅＧＦＰを発現する）を、脳切片及びパッチクランプで特定した（Ｍ． Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９， ２５１−９ （Ｆｅｂ， ２００６））。ニューロンを、Ａｌｅｘａ５９４（５０μＭ）と共に負荷して樹状突起の視覚化を可能にし、Ｆｌｕｏ−４（２００μＭ）と共に負荷して、細胞内Ｃａ２＋濃度を二光子レーザー走査型顕微鏡（２ＰＬＳＭ）を使用してモニターすることを可能にした。色素を平衡化させた後、ニューロンを画像化し、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）を含有する第２のピペットを、細胞体から６０〜８０ミクロンと、樹状突起に対して物理的に非常に接近させた（ａおよびｂ）。体細胞性膜電位を−７０ｍＶで固定してＳ１Ｐに限局的に印加すると、ＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンの樹状突起Ｃａ２＋レベルは、一貫して及び可逆的に増加したが（クラスカル−ワリスＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１、ｎ＝６）、ＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンでは増加しなかった（クラスカル−ワリスＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．０１、ｎ＝４）。Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤タプシガルジン（１０μＭ）による細胞内Ｃａ２＋貯蔵の枯渇は、ＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンでのＳ１Ｐに対する応答を消失させ（クラスカル−ワリスＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．０１、ｎ＝４；ｃ及びｄ）、Ｇｐｒ６受容体が細胞内Ｃａ２＋貯蔵を動員することを示す以前の研究と一致した（Ｄ． Ｓ． Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０４， ６１３ （２０００））。線条体淡蒼球細胞で見られる細胞質ゾルＣａ２＋のＧｐｒ６依存性上昇は、その結果として、Ｃａ２＋及びカルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンの活性化（Ａ． Ｎｉｓｈｉ， Ｇ． Ｌ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ａ． Ｃ． Ｎａｉｒｎ， Ｐ． Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７２， ２０１５−２１ （Ｍａｙ， １９９９））及び／又はアデニリルシクラーゼ５型（ＡＣ５；Ａｄｃｙ５）の阻害（Ｃ． Ｅ． Ｇｌａｔｔ， Ｓ． Ｈ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６１， ５３６−８ （Ｆｅｂ １１， １９９３）；Ｙ． Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７， １３５５３−７ （Ｊｕｌ ５， １９９２））により、中枢的に重要な調節タンパク質ＤＡＲＰＰ−３２の３４位トレオニンのリン酸化の減少をもたらすことが予測されるだろう。これは、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化状態を測定することにより、Ｓ１Ｐ誘導性の細胞質ゾルＣａ２＋増加の生理学的帰結を実証した。３４位トレオニンでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の減少は、線条体切片のＳ１Ｐ処理の５分後に見られ（０分では１．０４±０．１７正規化ユニット；Ｓ１Ｐ添加の５分後では０．５８正規化ユニット±０．２４、片側マン−ホイットニー検定、ｐ＝０．０５、ｎ＝１２）、Ｄ２細胞（それらは中型星状神経細胞のおよそ半分を構成する）での細胞質ゾルＣａ２＋上昇と一致した。これらのデータは、ＢＡＣアレイ翻訳プロファイリングに基づく予測を確認し、スフィンゴシン１−リン酸に対する線条体淡蒼球ニューロンの強力で細胞タイプ特異的な応答を実証し、線条体黒質中型星状神経細胞のではなく線条体淡蒼球中型星状神経細胞の新規で重要なシグナル伝達構成要素として、Ｇｐｒ６を特定する。
実施例１２ 薬理学的に誘導された転写変化の検出
１）概観
ある実施形態では、遺伝的、薬理学的、又は環境的変化に対する応答を、本明細書中に記載の翻訳プロファイリング及び分子表現型解析法を使用して、単一細胞タイプで効率的に解析することができる。線条体ニューロンの明らかにされた新規な生理学的特性を明確にするために、ドーパミン作動性シグナル伝達に薬理学的異常が起きた際の、ＭＳＮでのｍＲＮＡ発現に起こる可能性のある変化を調査した。
ドーパミン輸送体の競合的阻害剤であるコカインは、シナプスのドーパミンレベル上昇させることにより、精神刺激薬として作用する（Ｍ． Ｃ． Ｒｉｔｚ， Ｒ． Ｊ． Ｌａｍｂ， Ｓ． Ｒ． Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ｍ． Ｊ． Ｋｕｈａｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７， １２１９−２３ （Ｓｅｐ ４， １９８７）；Ｇ． Ｄｉ Ｃｈｉａｒａ， Ａ． Ｉｍｐｅｒａｔｏ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５， ５２７４−８ （Ｊｕｌ， １９８８））。成体マウスを、コカイン又は生理食塩水で急性的又は慢性的に処置し、線条体黒質（Ｄ１）ＭＳＮ及び線条体淡蒼球（Ｄ２）ＭＳＮのＢＡＣアレイプロファイリング用に使用した。
２）実験計画
実施した品質管理ステップ：各実験につき３回の生物学的反復測定を実施した。その実験の他のアレイ間のスピアマン相関が７５％を超えた場合にのみアレイを使用したが、生物学的な変動により調整する場合があった。独立した生物学的供給源及び増幅方法を使用して定量ＰＣＲ反応を実施し、アレイの結果を検証した。実験には、本明細書中の表１４に記載されているように、同じ日に実施した各Ｄ１対Ｄ２反復測定との５つの比較が含まれていた。
３）動物及び試料調製
生体試料の由来：７匹の成熟ＢＡＣアレイマウス（雌４匹、雄３匹）を各反復測定用にプールした。線条体組織を７〜９週齢で採取した。以下のマウス系統を各実験に使用した：（Ｄｒｄ１ａ／ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ）及び（Ｄｒｄ２／ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ）。
生体試料の操作：マウスは全て１２時間の暗期／１２時間の明期の条件下で飼育し、１ケージ当たり５匹のマウスを収容し、餌及び水は自由に摂取させた。本研究で使用したマウスは全て、ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子についてヘテロ接合であり、各系統に由来するマウスは、野生型Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社製）と４回交配させた。４匹のヘテロ接合性成体ＢＡＣアレイ雌マウス及び３匹のヘテロ接合性成体ＢＡＣアレイ雄マウスを、各研究に使用した。Ｄ１細胞対Ｄ２細胞のベースライン比較用に使用したマウスは、ホームケージから直接使用した。コカイン研究の場合は全て、７〜９週齢のＢＡＣアレイマウスを、ロックフェラー大学実験動物研究センター（ＬＡＲＣ、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）で単独収容及び腹腔内注射し、最終注射のおよそ１６時間前に実験室に移動させた。急性コカイン研究の場合、１００μｌ生理食塩水（ビヒクル）を８日間１日１回全マウスに注射して、マウスを取扱いに順化させた。９日目に、試験用量の２０ｍｇ／ｋｇコカイン又は１００μｌ生理食塩水をマウスに注射し、この試験注射の４時間後に線条体を回収した。慢性コカイン研究の場合、２０ｍｇ／ｋｇコカイン又は１００μｌ生理食塩水を１５日間１日１回マウス注射し、最終注射の４時間後に線条体を回収した。
実験因子の値：Ｄ１；Ｄ２；急性コカインＤ１；急性生理食塩水Ｄ１；急性コカインＤ２；急性生理食塩水Ｄ２；慢性コカインＤ１；慢性生理食塩水Ｄ１；慢性コカインＤ２；慢性生理食塩水Ｄ２。
結果：
線条体黒質細胞対線条体淡蒼球細胞のベースライン比較のために、調整両側対応のあるｔ検定（ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を実施した。調整ｔ検定のｐ値を多重仮説検定用に調整し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用して偽発見率（ＦＤＲ）を制御した。その後、０．１（１０％）未満のＦＤＲ及び１．５より大きな倍数変化を示した遺伝子を選択した。
線条体黒質及び線条体淡蒼球ＢＡＣアレイ試料と、線条体を除く脳全体を比較するために、ＧｅｎｅＣｈｉｐのＣＥＬファイルを、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３．１にインポートし、ＧＣ−ＲＭＡアルゴリズムを用いて正規化し（ＢＡＣアレイ試料及び線条体を除く脳全体試料を別々に）、各チップでの発現値を、幾つかの陽性対照遺伝子の発現値及び０．０１の定数に対してさらに正規化した。その後、調整両側対応のあるｔ検定を実施した。調整ｔ検定のｐ値を多重仮説検定用に調整し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用して偽発見率（ＦＤＲ）を制御した。その後、０．０５（５％）未満のＦＤＲ及び２より大きな倍数変化を示した遺伝子を選択した。
クラスター化すると、コカインデータは全て、試料を調製した日に関する強い効果を示した。日にち効果（ｄａｙ ｅｆｆｅｃｔ）を考慮及び調整することができるより複雑なモデルを使用した。線形モデルを、処置（生理食塩水対コカイン）、細胞タイプ要因（Ｄ１対Ｄ２）、及び日にち（急性及び慢性実験の異なる３実験日）の因子を用いて各遺伝子に適合させた。この分析では、多数の遺伝子が実際に日にち因子を示した。このモデルに適合させて、全仮説を検定した（急性及び慢性両方のコカイン対生理食塩水及び細胞タイプとの交互作用）。目的とする比較において差次的発現を評価するために、調整ｔ統計法を使用した（Ｇ． Ｋ． Ｓｍｙｔｈ， Ｓｔａｔ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３， Ａｒｔｉｃｌｅ３ （２００４））。この評価では、経験的ベイズ法を使用して、推定ｌｏｇ２倍数変化の標準誤差を調整した。この方法は、より安定した推定及び向上した検出力をもたらすため、各条件の３回反復測定のみを用いた解析に特に有用だった。調整ｔ検定のｐ値を多重仮説検定用に調整し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用して偽発見率（ＦＤＲ）を制御した。その後、０．１（１０％）未満のＦＤＲ及び１．４より大きな倍数変化を示した遺伝子を選択した。
遺伝子発現データを機能的特性に移しかえるために、ジーンオントロジー（ＧＯ）分析及び経路分析を使用して、差次的に発現された遺伝子のセット中で富化されたＧＯ用語及び経路を探索した。ＧＯアノテーションの分析は、ＲパッケージＧＯｓｔａｔｓ及びＧＯｔｏｏｌｓを使用して実施した。問題の遺伝子リストで過剰出現したＧＯ用語を見出すために、所与のオントロジーの各特定用語（生物学的プロセス、分子機能、細胞構成要素）について、条件付超幾何検定を使用して、ＧＯ用語に当てはまるリスト中の遺伝子の割合を、マウスゲノム４３０ ２．０アレイの全遺伝子セットにおける割合と比較した。古典的な超幾何検定ではなく条件付超幾何検定を使用して、ＧＯ用語の階層構造に関する懸念に対処した（Ｓ． Ｆａｌｃｏｎ， Ｒ． Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３， ２５７−８ （２００７）；Ａ． Ａｌｅｘａ， Ｊ． Ｒａｈｎｅｎｆｕｈｒｅｒ， Ｔ． Ｌｅｎｇａｕｅｒ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２， １６００−７ （２００６））。条件付検定は、ＧＯ用語中の関係性を使用して結果を非相関化する。ｐ値が＜０．１であり複数の遺伝子を有するＧＯを考慮した。過剰出現した経路を見出すために、古典的超幾何検定を使用して、ある経路に属する差次的に発現された（上方及び下方共に）ものの中の遺伝子の割合を、全マウスゲノム４３０ ２．０アレイ遺伝子セットを比較用母集団として使用して比較した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇで入手可能な経路アノテーションパッケージ（バージョン１．１６．０）を使用した。そのパッケージ中のＫＥＧＧ経路用語は、ＫＥＧＧ：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｐｕｂ／ｋｅｇｇ／ｔａｒｆｉｌｅｓ／ｐａｔｈｗａｙ．ｔａｒ．ｇｚ、ビルドリリース４１．１、２００７年２月１日から取得した。
この分析で、その発現が、各細胞タイプでコカインに応答して増加又は減少する数百個の遺伝子が特定された（表１５及び表１６）。
その発現がコカイン投与により影響を受けると報告されている種々の遺伝子が特定され、それらには以下のものが含まれていた：Ｃａｒｔｐｔ（Ｊ． Ｄｏｕｇｌａｓｓ， Ａ． Ａ． ＭｃＫｉｎｚｉｅ， Ｐ． Ｃｏｕｃｅｙｒｏ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １５， ２４７１−８１ （Ｍａｒ， １９９５）（急性Ｄ１で上方、表Ｓ１２）；Ｆｏｓｂ（Ｂ． Ｈｏｐｅ， Ｂ． Ｋｏｓｏｆｓｋｙ， Ｓ． Ｅ． Ｈｙｍａｎ， Ｅ． Ｊ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９， ５７６４−８ （Ｊｕｌ １， １９９２））（急性Ｄ１、急性Ｄ２、及び慢性Ｄ１で上方；表１５及び表１６）；Ｈｏｍｅｒ１（Ｐ． Ｒ． Ｂｒａｋｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８６， ２８４−８ （Ｍａｒ ２０， １９９７））（急性Ｄ１、急性Ｄ２、慢性Ｄ１、及び慢性Ｄ２で上方；表１５及び表１６）；Ｐｅｒ２（Ｖ． Ｙｕｆｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎａｐｓｅ ４８， １５７−６９ （Ｊｕｎ １５， ２００３））（急性Ｄ２、慢性Ｄ１、慢性Ｄ２で上方；表１５及び表１６）；Ｖａｍｐ２（Ｃ． Ａ． ＭｃＣｌｕｎｇ， Ｅ． Ｊ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ６， １２０８−１５ （Ｎｏｖ， ２００３））（慢性Ｄ１で上方；表Ｓ１３）；Ｋｃｎｄ２（Ｃ． Ａ． ＭｃＣｌｕｎｇ， Ｅ． Ｊ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ６， １２０８−１５ （Ｎｏｖ， ２００３））（慢性Ｄ１で上方；表１６）；及びＺｆｐ６４（Ｃ． Ａ． ＭｃＣｌｕｎｇ， Ｅ． Ｊ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ６， １２０８−１５ （Ｎｏｖ， ２００３））（急性Ｄ２で上方、慢性Ｄ２で下方；表１５及び表１６）。
その発現が急性又は慢性コカイン投与の際に変化した遺伝子に関連する統計的に過剰出現したジーンオントロジー（ＧＯ）及び京都遺伝子およびゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）経路用語を探索した（下記の表）。慢性コカイン投与の際にＤ１発現線条体黒質ニューロンで変更された最大のＧＯ生物学的プロセスの中には、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）シグナル伝達経路（Ｇａｂｒｂ３、Ｇａｂｒａ１、Ｃａｃｎｂ４、及びＧａｂｒａ４）があった。慢性コカイン乱用者ではベンゾジアゼピン ロラゼパム（ＧＡＢＡ受容体に結合する）に対する感受性が増強されることを記載した陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）研究（Ｎ． Ｄ． Ｖｏｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １５５， ２００−６ （Ｆｅｂ， １９９８））を考慮すると、この知見は有意義である。
実施例１３ ＴＲＡＰ法の結果の生理学的評価
１）概観
コカインで処置したマウスのＤ１線条体黒質のＧＡＢＡＡ受容体に関連する遺伝子の差次的発現の生理学的重要性を評価するために、マウスを、コカイン又はビヒクル（生理食塩水）で慢性的に処置し、その後ＧＡＢＡＡ受容体機能を電気生理学的に分析した。
２）光学的／電気生理学的研究用の脳切片調製
３２〜３７日齢のＢＡＣ Ｄ１又はＢＡＣ Ｄ２可溶性ｅＧＦＰ発現トランスジェニックマウスから、切片を取得した（Ｓ． Ｆａｌｃｏｎ， Ｒ． Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３， ２５７−８ （２００７））。動物は全て、ノースウェスタン大学ＡＣＵＣ及びＮＩＨガイドラインに従って取り扱った。慢性コカイン研究の場合、ｍＲＮＡ研究の場合と同様に、２０ｍｇ／ｋｇコカイン又は１００μｌ生理食塩水を１５日間１日１回マウスに注射し、最終注射の４時間後に脳切片を調製した。線条体を含有する冠状切片を、２５０μｍの厚さに調製した。ケタミン及びキシラジンでマウスに深く麻酔をかけ、酸素化した氷冷人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で経心的に灌流し、断頭した。脳を迅速に摘出し、Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓビブラトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ドイツ）を使用して、酸素化した氷冷ＡＣＳＦ中で切片を作製した。ＡＣＳＦは以下のものを（ｍＭで）含有していた：１２６ ＮａＣｌ、３ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ２、１ ＭｇＣｌ２、２５ ＮａＨＣＯ３、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ４、及び１５．６ Ｄ（＋）グルコース。別に記載がない限り、化学物質及び試薬は全てＳｉｇｍａ社（セントルイス、米国ミズーリ州）から取得した。切片を保持チャンバーに移動し、そこで切片を３５℃で１時間ＡＣＳＦに完全に浸漬させ、その後細胞全体が測定されるまで室温（２２℃〜２３℃）で保管した。ＡＣＳＦ溶液は全て、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で連続的に通気して、酸素化及び約ｐＨ７．４を維持し、定期的に検査して約３００ｍＯｓｍ／ｌを保証した。
３）ＧＡＢＡ作動性シナプス事象の電気生理学的分析
全細胞電圧固定測定を標準的技術を使用して実施した。個々の切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ社製（メルヴィル、米国ニューヨーク州）ＢＸ５０ＷＩ顕微鏡の浸水型測定チャンバーに移し、２〜３ｍｌ／分の流速で２２℃〜２３℃のＡＣＳＦを用いて連続的に切片の上面に流した。全細胞電圧固定測定を、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＯＬＹ−１５０カメラ／コントローラーシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、日本）を備えた赤外線微分干渉コントラスト（ＩＲ−ＤＩＣ、ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ）ビデオ顕微鏡を使用して、切片に検出された線条体中型星状神経細胞に対して実施した。全ての実験において、切片の上面に流す培地に以下のものを添加してｍＩＰＳＣを分離した：ＮＭＤＡグルタミン酸受容体をブロックするための５０μＭ ２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（ＡＰ−５、Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ社製、エリスビル、米国ミズーリ州）、ＡＭＰＡ／カイナイトグルタミン酸受容体をブロックするための５μＭ １，２，３，４−テトラヒドロ−６−ニトロ２，３−ジオキソ−ベンゾ２キノキサリン−７−スルホンアミド（ＮＢＱＸ）、及びナトリウムチャネルをブロックするための１μＭテトロドトキシン（ＴＴＸ、Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ社製、エルサレム、イスラエル）。パッチ電極は、Ｓｕｔｔｅｒ社製ＢＦ１５０−８６−１０ガラスを、Ｐ−９７Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、ノバート、米国カリフォルニア州）で引張することにより作製し、測定前に火炎仕上げした。ピペット抵抗は、以下のものを（ｍＭで）含有する内部溶液を充填した後で、典型的には２．５〜４ＭΩだった：１４０ ＣｓＣｌ、１．５ ＭｇＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ、０．１ ＢＡＰＴＡ−Ｃｓ、５ ＱＸ−３１４、２ ＡＴＰ−Ｎａ２、０．４ ＧＴＰ−Ｎａ２、ｐＨはＣｓＯＨで７．２５〜７．３に調整、２７０〜２８０ｍＯｓｍ／Ｌだった。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ａ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２２Ａ型１６ビットデータ取得システム、及びｐＣｌａｍｐソフトウェアバージョン８．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ユニオンシティー、米国カリフォルニア州）をギャップフリーモードで用いて、微弱ＩＰＳＣを測定した。ニューロンを−８０ｍＶで電圧固定し、ベースラインを安定させ（約５分間）、その後ｍＩＰＳＣを７分間測定した。Ｍｉｎｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ Ｉｎｃ．製、フォートリー、米国ニュージャージー州）を使用して、ｍＩＰＳＣ振幅、周波数、１０〜９０％立ち上がり時間、減衰時間、及び非定常ノイズ解析を分析した。二乗平均平方根ベースラインノイズレベルの５倍の閾値（一般的に、約２０〜２５ｐＡ）を、事象検出用に設定した。その後、測定記録を視覚的に検査し、ノイズが引き金となって起きた事象を全て廃棄した。周波数解析を、閾値基準を満たした全てのｍＩＰＳＣで実施した。その後、以下の基準に従って、振幅、１０〜９０％立ち上がり時間、及び減衰時間解析について、事象を選択した：１）１ｍｓより速い１０〜９０％立ち上がり時間を示す事象を選択して、空間的電圧固定誤差及び電気フィルタリング（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を最小限にした；２）５０ｍｓより速い減衰時間を示す事象を選択して、複数事象により正確な減衰時間の測定が妨げられた事象を最小限に抑えた。非定常ノイズ解析のために、振幅及びｍＩＰＳＣ動態と同じ基準を使用し、以下の追加的な基準に従った：３）減衰がベースラインに戻らなかった複数事象がないこと、４）事象は、立ち上がりの前及び減衰の終了後に安定的なベースラインを示さなければならなかった。ｍＩＰＳＣ測定の平均値を、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ３．０（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．製、リッチモンド、米国カリフォルニア州）を使用して、ｔ検定又はマン−ホイットニー順位和検定により群間で比較した。プールしたデータは、ＩＧＯＲ５．００（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社製、レークオスウィーゴ、米国オレゴン州）を使用して、平均値±標準誤差及びボックスプロットとして示されている。
４）二光子レーザー走査型顕微鏡（２ＰＬＳＭ）
２７５μｍの厚さの皮質線条体切片で可溶性ｅＧＦＰ（Ｓ． Ｆａｌｃｏｎ， Ｒ． Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３， ２５７−８ （２００７））を発現する線条体黒質（ＢＡＣ Ｄ１）又は線条体淡蒼球（ＢＡＣ Ｄ２）ニューロンを、体細胞ｅＧＦＰ蛍光により特定した。ｅＧＦＰ ２ＰＬＳＭ緑色シグナル（５００〜５５０ｎｍ）を、８１０ｎｍでの励起を使用してｅＧＦＰ＋ＢＡＣ Ｄｒｄ２ニューロンから取得した一方で、ｅＧＦＰ＋ＢＡＣ Ｄｒｄ１ニューロンは９００ｎｍでの励起を必要とした。その後、Ｈａｍａｍａｔｓｕ社製Ｃ２４００型Ｎｅｗｖｉｃｏｎカメラ／コントローラーシステム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社製、日本）及び６０Ｘ／０．９ＮＡ水没型レンズを備えた赤外線微分干渉コントラスト（ＩＲ−ＤＩＣ）ビデオ顕微鏡を使用して、ｅＧＦＰ＋ＭＳＮをパッチした。 パッチ電極は、ＢＦ１５０−８６−１０ガラスを、Ｐ−９７Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー（両方ともＳｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．製、ノバート、米国カリフォルニア州）で引張することにより作製した。ピペット溶液には、以下のものを（ｍＭで）含有した：１３５ ＫＭｅＳＯ４（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、オローラ、米国オハイオ州）、５ ＫＣｌ、１０ ＨＥＰＥＳ、２ ＭｇＡＴＰ、０．２ Ｎａ２ＧＴＰ、及び０．１ スペルミン、ＫＯＨによりｐＨ＝７．２５〜７．３、２７０ｍＯｓｍ／ｌ。浴中で測定すると、ピペット抵抗は約４ＭΩだった。直列抵抗が＞１ＧΩの細胞体で電圧固定モードの密閉を形成した。全細胞配置の密閉が破られた後、直列抵抗は１０〜１５ＭΩに減少した。樹状突起を視覚化するためにＡｌｅｘａ５９４（５０μＭ、Ｃａ２＋非感受性赤色色素）を、及び細胞内樹状突起におけるＣａ２＋の変化を測定するためにＦｌｕｏ−４（２００μＭ、Ｃａ２＋感受性緑色色素）を、内部ピペット溶液に溶解した。ｅＧＦＰ蛍光は、樹状突起での検出用閾値未満であり、カルシウム画像化中のバックグラウンドシグナルに寄与しなかった。幾つかの実験では、タプシガルジンも内部溶液に添加して、ＥＲ媒介性Ｃａ２＋放出をブロックした。タプシガルジンは、最初は１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解した。その後、この原液を内部測定液で１０００×に希釈した。挿入後、画像化に先立って、内部溶液を少なくとも１５分間拡散平衡に近づけた。細胞を−７０ｍＶで電圧固定し、体細胞の脱分極をモニターした。
録画している間は、２ＰＬＳＭの緑色及び赤色シグナル（５７０〜６２０ｎｍ）を、試料平面において９０ＭＨｚのパルス反復周波数及び約２５０ｆｓのパルス時間で、８１０ｎｍでの励起を使用して取得した。スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ、１０μＭ）を含有する第２のパフピペットを、限局的樹状突起印加用に配置した。Ｓ１Ｐは、最初は１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解した。この原液を、４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ＝７．４を含有するＨＥＰＥＳ緩衝化ＡＣＳＦで１０００×に希釈した。樹状突起Ｃａ２＋の変化を、細胞体から５０〜１００μｍの樹状突起セグメントの高倍率最大投影画像を取得することにより測定した。これらの画像は、０．１７μｍ２ピクセル及び２．２μｓ滞留時間で取得し、０．５μｍの焦点ステップで撮影した１０〜２０画像で構成されていた。Ｃａ２＋の変化は、赤色色素に対して正規化された緑色色素の蛍光のパーセント変化（ΔＧ／Ｒ）を算出することにより決定した。Ｃａ２＋画像化の後、細胞体領域及び樹状突起領域の最大投影画像は、０．２７μｍ２ピクセル及び２．６μｓピクセル滞留時間で取得し、０．７μｍの焦点ステップで撮影した約８０画像で構成されていた。
二光子励起光源は、ＣｈａｍｅｌｅｏｎＸＲ波長可変レーザーシステムであった（７０５ｎｍ〜９８０ｎｍ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｌａｓｅｒ Ｇｒｏｕｐ製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）。レーザー平均出力の減衰は、２つのポッケルスセル電気光学モジュレーター（３５０−８０型及び３５０−５０型、Ｃｏｎ Ｏｐｔｉｃｓ社製、ダンベリー、米国コネティカット州）を用いて達成した。この２つのセルは、直列に整列しており、励起量を微調整するための高感度モジュレーション範囲（０．１％ステップで４０ステップを超える）を提供する。レーザー走査画像は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ輝度ＭＰＤシステム（Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ社製、イングランド、英国）で取得した。蛍光発光は、外部型又は非デスキャン型（ｎｏｎ−ｄｅ−ｓｃａｎｎｅｄ）光電増倍管（ＰＭＴ）で収集した。緑色蛍光（５００〜５５０ｎｍ）は、バイアルカリ陰極ＰＭＴで検出し、赤色蛍光（５７０ｎｍ〜６２０ｎｍ）は、マルチアルカリ陰極（Ｓ２０）ＰＭＴで収集した。蛍光は、１６ビット光子計数モードで取得した。試料を通過して伝達されたレーザー光を集光レンズで収集し、別のＰＭＴに送って、蛍光画像と重ね合わせた明視野透過像を提供した。刺激、表示、及び解析ソフトウェアは、特別にプログラムされたシェアウェアパッケージ、ＷｉｎＦｌｕｏｒ及びＰｉｃＶｉｅｗｅｒ（Ｊｏｈｎ Ｄｅｍｐｓｔｅｒ氏、ストラスクライド大学、グラスゴー、スコットランド、英国）だった。
５）慢性コカイン処置後のＤ１及びＤ２におけるＧＡＢＡＡ受容体機能の差異の評価
コカイン処置は、以下の図に示されているように、線条体黒質ニューロンのＧＡＢＡＡ受容体微弱阻害性シナプス電流（ｍＩＰＳＣ）の周波数を増加させた。
図３１は、コカイン処置がＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンの小振幅ＧＡＢＡ作動性ｍＩＰＳＣｓの周波数を増加させたことを示した。（ａ）生理食塩水又は（ｂ）コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）で１５日間処置したマウスから採取したＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロン（Ｄ１プロモーター下で可溶性ｅＧＦＰを発現する）の代表的な自発性ｍＩＰＳＣトレース。（ｃ）コカイン処置後のＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンのｍＩＰＳＣ周波数の増加を示す平均ｍＩＰＳＣ周波数の要約的棒グラフ（マン−ホイットニー順位和検定、ｐ＜０．０５、生理食塩水中央値＝０．８２Ｈｚ、ｎ＝２２；コカイン中央値＝１．０３Ｈｚ、ｎ＝２６）。（ｄ）同じ長さの測定（７分間）での小振幅ｍＩＰＳＣ（＜７５ｐＡ）の数が、コカイン処置後にＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンで増加したことを示す要約的棒グラフ（ｔ検定、ｐ＜０．０５、生理食塩水＝７９．４±８．２、ｎ＝２２；コカイン＝１０４．２±６．３、ｎ＝２６）。（ｅ）１シナプス当たりより少数のＧＡＢＡＡ受容体（Ｎ）を有するが、単位受容体コンダクタンス（ｇ）が不変である受容体を有するシナプスから、コカイン誘導性小振幅事象が生じたことを示唆する、生理食塩水で処置したＢＡＣ Ｄ１ニューロン及びコカインで処置したＢＡＣ Ｄ１ニューロンの代表的な分散−平均電流プロット（生理食塩水 Ｎ＝３３、ｇ＝３１ｐＳ；コカイン Ｎ＝２７、ｇ＝３０ｐＳ）。（ｆ）生理食塩水で１５日間処置した後の、及び（ｇ）コカインで１５日間処置した後のＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンの代表的な自発性ｍＩＰＳＣトレース。（ｈ）処置条件の影響がなかったことを示す、生理食塩水で処置したニューロン及びコカインで処置したニューロンの平均ｍＩＰＳＣ周波数の要約的棒グラフ。（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝０．７２±０．０５Ｈｚ、ｎ＝１２；コカイン＝０．７８±０．０７Ｈｚ、ｎ＝１６）。（ｉ）同じ長さの測定（７分間）での小振幅ｍＩＰＳＣ（＜７５ｐＡ）の数が、ＢＡＣ Ｄ２ニューロンの処置条件により変化しなかったことを示す要約的棒グラフ（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝６８．１±９．７、ｎ＝１２；コカイン＝７１．７±７．５、ｎ＝１６）。 （ｊ）コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ２ニューロンの１シナプス当たりの受容体の数又は単一受容体コンダクタンスを変化させなかったことを示す代表的な分散−平均電流プロット（生理食塩水 Ｎ＝２９、ｇ＝３３ｐＳ；コカイン Ｎ＝３１、ｇ＝２９ｐＳ）。
要約すると、図３２は、コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ１線条体黒質ニューロンの１シナプス当たりのＧＡＢＡＡチャネルの数を減少させたことを示した。生理食塩水で処置した対照及び１５日間処置したコカインＢＡＣ Ｄ１マウスから得られた個々の線条体黒質ニューロンの平均ｍＩＰＳＣ動態及び非定常ノイズ解析測定値を示す要約的ボックスプロット。（ａ）平均１０〜９０％立ち上がり時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝０．６４±０．００８、ｎ＝２２；コカイン＝０．６５±０．００６、ｎ＝２６）も（ｂ）平均減衰時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝１７．３±０．５、ｎ＝２２；コカイン＝１７．０±０．５、ｎ＝２６）も、群間での差異はなかった。ｍＩＰＳＣの非定常ノイズ解析は、（ｃ）線条体黒質ニューロンのＧＡＢＡＡ受容体の平均単位コンダクタンス（ｇ）が群間で変化しないこと（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水 ｇ＝３１．１±１．６、ｎ＝２２；コカイン ｇ＝３０．８±１．２、ｎ＝２６）、及び（ｄ）コカインで処置したＢＡＣ Ｄ１マウスから得られた線条体黒質ニューロンの１シナプス当たりの平均チャネル数が減少したこと（ｔ検定、ｐ＜０．０５、生理食塩水 Ｎ＝３３．１±１．４、ｎ＝２２；コカイン Ｎ＝２９．３±１．０、ｎ＝２６）を実証した。
要約すると、図３３は、コカイン処置が、ＢＡＣ Ｄ２線条体淡蒼球ニューロンのＧＡＢＡ作動性ｍＩＰＳＣの動態又は１シナプス当たりのＧＡＢＡＡ受容体数又は単位受容体コンダクタンスを変化させなかったことを示した。生理食塩水で処置した対照及び１５日間処置したコカインＢＡＣ Ｄ２から採取した個々の線条体淡蒼球ニューロンの平均ｍＩＰＳＣ動態及び非定常ノイズ解析測定値を示す要約的ボックスプロット。（ａ）平均１０〜９０％立ち上がり時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝０．６５±０．００７、ｎ＝１２；コカイン＝０．６４±０．０１０、ｎ＝１６）も（ｂ）平均減衰時間（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水＝１８．０±１．０、ｎ＝１２；コカイン＝１８．０±０．５、ｎ＝１６）も、群間での差異はなかった。ｍＩＰＳＣの非定常ノイズ解析は、（ｃ）線条体淡蒼球ニューロンのＧＡＢＡＡ受容体の平均単位コンダクタンス（ｇ）（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水 ｇ＝３０．７±１．５、ｎ＝１２；コカイン ｇ＝３０．３±１．２、ｎ＝１６）、又は（ｄ）コカインで処置したＢＡＣ Ｄ２マウスから採取した線条体淡蒼球ニューロンの１シナプス当たりの平均チャネル数（ｔ検定、ｐ＞０．０５、生理食塩水 Ｎ＝３３．８±２．７、ｎ＝１２；コカイン Ｎ＝３３．０±１．６、ｎ＝１６）が群間で変化しないことを実証した。
実施例１４ 小脳細胞の分子表現型解析及び翻訳プロファイリング
１）概観
小脳は、感覚認知及び運動制御の統合に役割を果たす脳の領域である。運動制御を協調させるために、大脳運動皮質（情報を筋肉に送って筋肉を運動させる）及び脊髄小脳路（空間における身体の姿勢について固有受容フィードバックを提供する）と小脳を関連付ける幾つかの神経経路が存在する。小脳は、身体姿勢に関する定期的なフィードバックを使用してこれらの経路を統合して、運動を微調整する（Ｆｉｎｅ ＥＪ， Ｉｏｎｉｔａ ＣＣ， Ｌｏｈｒ Ｌ （２００２）． "Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ"． Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２２ （４）： ３７５−８４． ｄｏｉ：１０．１０５５／ｓ−２００２−３６７５９））。研究により、小脳が、注意力並びに言語、音楽、及び他の知覚的な一過性の刺激の処置を含む認知機能などの他の機能にも寄与することが示されている（Ｒａｐｐ， Ｂｒｅｎｄａ （２００１）． Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ： Ｗｈａｔ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ Ｒｅｖｅａｌ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｎｄ． Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ， ４８１）。
小脳の損傷は、典型的には麻痺を引き起こすほどには衰弱しないが、むしろフィードバック欠損として現れ、その結果として細かい運動、平衡感覚、姿勢、及び運動学習の障害がもたらされる。運動失調症は、一般的に、小脳に影響を与える疾患プロセスで見出されることが多い協調障害を伴う複合的な症状である。小脳の問題を特定するための神経学的検査には、歩調の評価（歩隔の拡大は運動失調症を示す）、指差し検査、及び姿勢評価が含まれる。小脳の構造的異常（出血、梗塞、新生物、変性）は、断面画像診断で特定することができる。コンピューター断層撮影法には小脳の構造的異常を検出するのに十分な感度がないため、磁気共鳴画像法が検出法として選択される（Ｇｉｌｍａｎ Ｓ （１９９８）． "Ｉｍａｇｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ． Ｓｅｃｏｎｄ ｏｆ ｔｗｏ ｐａｒｔｓ"． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３８ （１３）： ８８９−９６）。
２）個々の小脳細胞タイプでｅＧＦＰを発現するＢＡＣアレイマウス
複数の細胞層及び幾つかの小脳細胞タイプが存在する。最も内側の顆粒層は、３つの細胞タイプの細胞体、すなわち多数の微小な顆粒細胞、より大型のゴルジ細胞、及び中型のニューロン単極刷毛細胞を含有する。中央のプルキンエ層は、１つのタイプのニューロンであるプルキンエ細胞のみを含有する。プルキンエ細胞は、小脳皮質の一次統合ニューロンであり、小脳皮質の唯一の出力を提供する。放射状の上皮細胞としても知られている一種のグリアであるベルクマングリアは、プルキンエ細胞層に自身の細胞体を有し、分子層に伸張し軟膜表面の球状エンドフィートで終了する突起を有する小脳の星状細胞である（Ｅｃｃｌｅｓ Ｊ．Ｃ Ｉｔｏ， Ｍ ａｎｄ Ｓｚｅｎｔａｇｏｔｈａｉ Ｊ． （１９６７）． "Ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ ａｓ ａ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍａｃｈｉｎｅ"． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｌｌｉｎａｓ， Ｒ．， Ｂａｋｅｒ， Ｒ． ａｎｄ Ｓｏｔｅｌｏ， Ｃ． （１９７４）． "Ｅｌｅｃｔｒｏｔｏｎｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｃａｔ ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｏｌｉｖｅ"． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ３７： ５６０−５７１）。小脳皮質の最外層は、２つのタイプの抑制性介在ニューロン、すなわち星状細胞及びかご細胞を含有する。小脳皮質の最外層は、顆粒細胞からのプルキンエニューロン及び平行線維束の樹状突起分岐も含有する。特定の小脳細胞タイプで以下の特異的な発現パターンを示すＢＡＣアレイマウスを作製することができる：小脳顆粒細胞を標識する、Ｎｅｕｒｏｄ１遺伝子座に由来する調節領域の制御下でのタグ化リボソームタンパク質の発現；小脳内部ゴルジニューロンを標識する、Ｇｒｍ２遺伝子座に由来する調節領域の制御下でのタグ化リボソームタンパク質の発現；単極刷毛細胞を標識する、Ｇｒｐ遺伝子座に由来する調節領域の制御下でのタグ化リボソームタンパク質の発現；小脳星状細胞を標識する、Ｐｔｔｇ３遺伝子座に由来する調節領域の制御下でのタグ化リボソームタンパク質の発現；及び星状細胞、かご細胞を標識する、Ｌｙｐｄ６遺伝子座に由来する調節領域の制御下でのタグ化リボソームタンパク質の発現。
３）ＡＴマウス由来の細胞の翻訳プロファイリング及び分子表現型解析
毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）は、その原理的特徴が運動失調症、リンパ球腫瘍の発生、及び小脳変性を含む疾患である（Ｐ． Ｊ． ＭｃＫｉｎｎｏｎ， ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ５， ７７２ （２００４）；Ｆ． Ｇｕｍｙ−Ｐａｕｓｅ， Ｐ． Ｗａｃｋｅｒ， Ａ． Ｐ． Ｓａｐｐｉｎｏ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８， ２３８ （２００４）；Ｌ． Ｆａｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｓｓｉｓｔ Ｔｏｍｏｇｒ １８， ７２４ （１９９４）；Ｆ． Ｔａｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ ４５， ３１５ （２００３））。ＡＴは、毛細血管拡張性運動失調変異（ＡＴＭ）をコードする遺伝子、ＤＮＡ損傷応答及び細胞周期制御に関与する遍在的に発現される核タンパク質キナーゼの劣性機能喪失型変異により引き起こされる（Ｋ． Ｓａｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８， １７４９ （１９９５）；Ｒ． Ｔ． Ａｂｒａｈａｍ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５， ２１７７ （２００１）；Ｙ． Ｓｈｉｌｏｈ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３， １５５ （２００３）；Ｍ． Ｆ． Ｌａｖｉｎ， Ｓ． Ｋｏｚｌｏｖ， Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ６， ９３１ （２００７）；Ｓ． Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６， １１６０ （２００７））。Ａｔｍノックアウトマウスは、拡延（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）に対する感受性及びリンパ球腫瘍形成を含むヒト障害の多くの特徴を示す（Ｃ． Ｂａｒｌｏｗ， Ｋ． Ｄ． Ｂｒｏｗｎ， Ｃ． Ｘ． Ｄｅｎｇ， Ｄ． Ａ． Ｔａｇｌｅ， Ａ． Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １７， ４５３ （１９９７）；Ｋ． Ｈ． Ｈｅｒｚｏｇ， Ｍ． Ｊ． Ｃｈｏｎｇ， Ｍ． Ｋａｐｓｅｔａｋｉ， Ｊ． Ｉ． Ｍｏｒｇａｎ， Ｐ． Ｊ． ＭｃＫｉｎｎｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０， １０８９ （１９９８）；Ａ． Ｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３， １３０８４ （１９９６）；Ｙ． Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １０， ２４１１ （１９９６）； Ｐ． Ｒ． Ｂｏｒｇｈｅｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７， ３３３６ （２０００））。しかしながら、ＡＴの際立った特徴の１つ、小脳プルキンエ細胞の変性は、この疾患のマウスモデルには生じない。ＡＴ患者でプルキンエ細胞が実質的に消失したという臨床的証拠は、罹児が数歳に成長するまで見られないため（Ｒ． Ａ． Ｇａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０， ８７ （２００１））、及びマウスの平均寿命が２歳未満であるため、ＡＴマウスモデルでは、プルキンエ細胞変性がもたらされるのに十分な時間が発症プロセスにないだけである可能性がある。１つの実施形態では、ＡＴのマウスモデルにおける特定の小脳細胞タイプにあるリボソームを、分子的に標識化することができる（Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．、投稿済）。
Ａｔｍノックアウトマウス、（これ以降はＡｔｍ−／−マウスと表す）のプルキンエ細胞の分子表現型解析及び翻訳プロファイリングは、変異に応答した幾つかの変化を明らかにすることができ得る。これにより、ＢＡＣアレイ戦略及びＴＲＡＰ法を使用することにより、細胞タイプ特異的様式で差次的に制御される遺伝子の特定が可能になる。Ａｔｍ変異に応答した変化を、プルキンエ細胞及びベルクマングリア、プルキンエ細胞と同様の存在量及び解剖学的分布を有する特化したグリア細胞集団で分析した。
ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合タンパク質を発現するトランスジェニックＢＡＣアレイマウスを、ＧＥＮＳＡＴプロジェクト（ｗｗｗ．ｇｅｎｓａｔ．ｏｒｇ；Ｓ． Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２５， ９１７ （２００３））に記載されているプルキンエ細胞タンパク質２（Ｐｃｐ２）及びＳｅｐｔｉｎ４（Ｓｅｐｔ４）ＢＡＣベクターを使用して調製した（図３４）。ＢＡＣトランスジェニック動物を、以前に記載されているように改変ＢＡＣ構築体を使用し（Ｊ． Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ， Ｂ． Ｓ． Ｂａｌｉｇａ， Ｈ． Ｎ． Ｍｕｎｒｏ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７３， ８５７−６１ １９７６））、それぞれプルキンエ細胞及びベルクマングリアにおけるリボソームタンパク質Ｌ１０高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ）構築体用の駆動系としてＰｃｐ２遺伝子又はＳｅｐｔｉｎ４遺伝子のいずれかを使用して生成した。他の実施形態では、細胞タイプ特異的遺伝子発現の他の駆動系を使用することができ、そして決して限定することを意味しない。トランスジェニック系統を生成し、遺伝子型解析を従来技術を使用して確認した。その後、Ｐｃｐ２及びＳｅｐｔ４ＢＡＣアレイトランスジェニック動物をＡｔｍ＋／動物と交配させた。２世代後に、Ｐｃｐ２及びＳｅｐｔ４ＢＡＣアレイ構築体を、Ａｔｍ＋／＋又はＡｔｍ−／−動物で回収することができた。ヘテロ接合体Ａｔｍ＋／同腹仔を飼育して、野生型＋／＋及びノックアウト動物を生成した。ＢＡＣアレイマウスに由来する切片の免疫組織化学染色及び二重免疫蛍光染色は、図３５に示されている。パネルＡは、Ｐｃｐ２系統の小脳プルキンエ細胞の細胞体及び一次樹状突起に特異的なｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ融合体の発現を実証しており、パネルＢは、Ｓｅｐｔ４系統のベルクマングリアでのその発現を実証した。
プルキンエ細胞及びベルクマングリア細胞のｍＲＮＡを、Ｐｃｐ２及びＳｅｐｔ４ ＢＡＣアレイトランスジェニック系統から富化できることを保証するために、マイクロアレイデータを、ＢＡＣアレイ系統の各々からｅＧＦＰ−Ｌ１０ａ含有ポリソームの親和性精製により三重反復で収集した。各々の場合、免疫沈降（ＩＰ）したｍＲＮＡの発現レベルを未結合画分におけるそれらの発現レベルと比較して、プルキンエ細胞又はベルクマングリアでのそれらの富化を決定した。これらのデータの散布図（図３６）は、Ｐｃｐ２又はＳｅｐｔ４ ＢＡＣアレイ小脳のいずれに由来するポリソームの親和性精製によっても、数千のｍＲＮＡを富化することができることを明らかにした。予想通り、既知のプルキンエ細胞特異的ｍＲＮＡは、Ｐｃｐ２ ＢＡＣアレイマウスに由来するＩＰ試料で特異的に富化され（表２２）、ベルグマングリアで富化される既知のｍＲＮＡは、Ｓｅｐｔ４ ＢＡＣアレイマウスに由来するＩＰ試料で特異的に富化された（表２３）。これらのデータにより、これら２つの小脳細胞タイプの翻訳プロファイル及び分子表現型が確立される。
マイクロアレイデータを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＣＥＬファイルとして、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３．１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンタクララ、米国カリフォルニア州）にインポートした。各実験のためにＡｔｍ＋／＋及びＡｔｍ−／−データセットを一緒にインポートし、ＧＣ ＲＭＡを使用して正規化した。小脳全体の実験の場合、各条件（Ａｔｍ＋／＋又はＡｔｍ−／−）につき４つの反復測定を使用し、Ｓｅｐｔｉｎ４実験の場合、各条件につき５つの反復測定を使用し、Ｐｃｐ２実験の場合、各条件につき６つの反復測定を使用した。インポートすると、実験は、さらなる解析用の散布図として捉えられた。ＰＣＰ２及びＳｅｐｔｉｎ４の実験の場合、Ａｔｍ＋／＋及びＡｔｍ−／−データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ハイブリダイゼーション対照を陽性対照遺伝子として使用してチップごとにさらに正規化し、０．００１の定数で除算した。制御された遺伝子のリストを作成するために、発現の場合は２５のカットオフ値で、倍数変化の場合は１．５のカットオフ値でデータをフィルタリングした。一元配置ＡＮＯＶＡ解析を使用して、ｐ値を≦０．０５として統計的有意差を決定した。
４）ＡＴＭ機能の喪失
その後、Ｐｃｐ２及びＳｅｐｔ４ ＢＡＣアレイトランスジェニック動物をＡｔｍ＋／−動物と交配させた。２世代後に、Ｐｃｐ２及びＳｅｐｔ４ ＢＡＣアレイ構築体を、Ａｔｍ＋／＋又はＡｔｍ−／−動物で回収することができた。ＡＴＭ機能の喪失に対する応答がプルキンエ細胞とベルクマングリアとで異なるかどうかを決定するために、マイクロアレイデータを、６〜８週齢のＰｃｐ２及びＳｅｐｔ４ ｗｔ及びＡｔｍ−／−ＢＡＣアレイマウスを使用して、小脳全体、プルキンエ細胞、及びベルクマングリア細胞から収集した。Ａｔｍ−／−動物で制御された遺伝子のリストを、２５より大きな発現値、及びｗｔ動物とＡｔｍ−／−動物との間で少なくとも１．５倍の発現差を示す全ての遺伝子を特定することにより生成した。０．０５のｐ値カットオフを用いた一元配置ＡＮＯＶＡ解析を使用して有意性について選択した。散布図解析及びベン図解析を使用して、その発現がＡｔｍ変異に応答して小脳全体、プルキンエ細胞、又はベルクマングリアで変化した遺伝子を特定した（図３７）。個々の遺伝子のデータは表２４〜２９に示されている。
その発現がＡｔｍ−／−マウスのプルキンエ細胞で変更される大多数の遺伝子（６５／８９）は、小脳全体のｍＲＮＡのマイクロアレイ解析では検出することができない。さらに、その発現がＡｔｍ−／−動物のプルキンエ細胞で変化した８９個のｍＲＮＡのうちの１７個だけが、ベルクマングリア細胞でも変化した。最後に、９４個の遺伝子の発現レベルが、プルキンエ細胞に対してＡｔｍ−／−ベルクマングリアで特異的に変化する。Ａｔｍ変異に対する特定細胞タイプの応答は大きく異なっており、ＢＡＣアレイ戦略を使用した特定細胞タイプの翻訳プロファイリング及び分子表現型解析は、組織学的に複雑な組織の分析では観察することができない応答を明らかにすることができる。
遺伝子の機能群の特定
ノックアウト小脳及び各細胞タイプに富化される遺伝子の機能群を特定するために、ＤＡＶＩＤ（Ｇ． Ｄｅｎｎｉｓ， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ４， Ｐ３ （２００３））及びＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇの両方を使用して、ジーンオントロジー（ＧＯ）解析を実施し、各プログラムは本質的に同じ結果をもたらした。ＧＯデータベースが不完全なため、データを完全に解析するためには遺伝子リスト及び適切な文献を比較することも必要だった。Ａｔｍ−／−動物の小脳全体で富化された遺伝子には、細胞周期制御に関与するもの（Ｔａｃｃ１、Ｃｄｋｎ１ａ（ｐ２１））及びアポトーシスに関与するもの（Ｃｄｋｎ１ａ（ｐ２１））が含まれる。Ａｔｍ−／−動物に由来するベルクマングリア細胞では、ＢＭＰ５を含む発生及び細胞分化と関係する遺伝子が富化される。Ａｔｍ−／−動物に由来するプルキンエ細胞では、クロマチン構成、ヌクレオチド代謝、及び転写制御に関与する遺伝子中が富化される。これらには、Ｔｅｘ１２、Ｚｆｐ１９１、Ｒｏｒａ、Ｍｔｆ２、及びＭｊｄなどの転写因子、及びＣｃｒｎ４ｌ及びＤｄｘ６などのｍＲＮＡ代謝に関与する遺伝子が含まれる。これらの差次的に制御された遺伝子の幾つかは、直接的又は間接的に運動失調症に関連している。Ｒｏｒａは、ｓｔａｇｇｅｒｅｒマウス変異体で変異しているレチノイン酸オーファン受容体である（（Ｂ． Ａ． Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７９， ７３６ （１９９６））。Ｍｊｄ（Ａｔｘｎ３、Ｓｃａ３）は、マシャド−ジョーゼフ病の原因遺伝子である（Ｙ． Ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ８， ２２１ （１９９４））。Ｄｄｘ６は、Ｐボディ、ｍＲＮＡ分解に関与する多タンパク質複合体におけるＡｔａｘｉｎ−２に結合することが知られている（Ｕ． Ｎｏｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １８， １３８５ （２００７）；Ｎ． Ｃｏｕｇｏｔ， Ｓ． Ｂａｂａｊｋｏ， Ｂ． Ｓｅｒａｐｈｉｎ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６５， ３１ （２００４））。Ｃｃｒｎ４ｌは、Ｐボディにも見出されるデアデニラーゼであり（Ｎ． Ｃｏｕｇｏｔ， Ｓ． Ｂａｂａｊｋｏ， Ｂ． Ｓｅｒａｐｈｉｎ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６５， ３１ （２００４））；脱アデニル化は、ＰボディによるｍＲＮＡ分解の重要な第１ステップである。これらの遺伝子の過剰発現は、プルキンエ細胞の神経変性を潜在的に増強することができるか又はそれを防御することができるかのいずれかである。
実施例１５ パーキンソン病のスクリーニング法
１） ＶＴＡ及びＳＮｃニューロンの翻訳プロファイル
ドーパミンを産生する（ドーパミン作動性）ニューロンは、主として中脳、黒質緻密部（ＳＮｃ）の腹側被蓋野（ＶＴＡ）及び視床下部の弓状核に存在する。ＳＮｃのドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病（ＰＤ）及びＰＤの薬理学的誘導モデルにおける神経変性に特に感受性がある。黒質緻密部でのドーパミン作動性ニューロンの選択的変性はＰＤに結びつくが、この黒質細胞消失の正確な原因は未だに不明である。腹側被蓋野ドーパミン作動性ニューロンは、比較すると比較的残されている。ＰＤ患者で見られる震え、運動緩慢、及び硬直は、大部分は線条体ドーパミン神経支配の喪失により引き起こされる。その発現がＳＮｃ及びＶＴＡ特異的遺伝子調節領域により制御される検出可能なタグと融合したリボソームタンパク質（例えば、Ｌ１０ａ）の発現を使用して、ＰＤの動物モデル又はＰＤ若しくはパーキンソン病様症状と診断された被検体のＳＮｃ細胞及びＶＴＡ細胞の差次的脆弱性を調査することができる。本明細書中に記載のＢＡＣアレイ及びＴＲＡＰ法を使用することにより、分子タグ化リボソームタンパク質を有するマウスを生成する。これらは、ＳＮｃ又はＶＴＡのいずれかで細胞タイプ特異的発現用の調節配列により駆動される（図３８）。ＳＮｃ細胞で差次的に発現されるｍＲＮＡが、ＰＤを改善させるための潜在的な治療標的として特定されることが期待されている。
２） ＰＤにおけるＶＴＡ及びＳＮｃニューロンの翻訳プロファイル
ＰＤで見られるものとよく似たドーパミン作動性細胞の消失を、げっ歯動物（マウス又はラットのいずれでも）への、神経毒６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）又は１−メチル４−フェニル１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の両側性又は片側性いずれかの大脳内注射により誘導する。本明細書中に記載のＢＡＣアレイ及びＴＲＡＰ法を使用することにより、分子タグ化リボソームタンパク質を有するマウスを生成する。これらは、ＳＮｃ又はＶＴＡのいずれかで細胞タイプ特異的発現用の調節配列により駆動される（図３９）。６−ＯＨＤＡで処置（両側性又は片側性の処置）した３週間後、ＳＮｃ及びＶＴＡニューロンからの遺伝子翻訳プロファイルを取得する。これらの翻訳プロファイルを、生理食塩水ビヒクルで処置したマウスからの参照プロファイルと比較する。ＰＤと関連する治療標的が取得されることが期待される（図４０）。
３）線条体淡蒼球細胞におけるアンタゴニズム又は刺激用治療標的のスクリーニング
視床下核（ＳＴＮ）の高周波刺激は、ＰＤの運動症状の緩和及びこの疾患に伴うことが多い消耗性の薬剤誘発ジスキネジアに現在利用可能な１つの神経外科的処置である。ＳＴＮの刺激は、深部脳刺激（ＤＢＳ）電極を核に正確に埋め込むことにより達成される。線条体の線条体淡蒼球細胞は、淡蒼球外節（ＧＰｅ）及び視床下核（ＳＴＮ）を強直性に阻害する（図４１）。小分子で又は他の非電気的で外科手術を必要としない方法で線条体淡蒼球細胞の活性を阻害することにより、深部脳刺激と同じように、強直性に阻害されたＳＴＮニューロンを緩和し、ＰＤ症状を緩和することが可能となる。本明細書中に記載されており、Ｄ２ ＢＡＣアレイマウスを使用して例示されている方法を使用することにより線条体の線条体淡蒼球ニューロンで選択的に富化されることが見出された１つのｍＲＮＡは、Ｇｐｒ６である（表１２）。Ｇｐｒ６は、そのアンタゴニストをスクリーニングすることができ、ＰＤの治療として開発することができる標的である。同様の様式で、線条体淡蒼球細胞で下方制御されることが見出されたあらゆるｍＲＮＡは、ＰＤの治療としてのアゴニズムの標的である。
実施例１６ 肥満のスクリーニング法
視床下部は、血圧、体温、睡眠、体液及び電解質均衡、並びに体重を含む幾つかの調節及び恒常性プロセスに中心的な役割を果たす。特に外側視床下部は、摂食及び満腹中枢に関わっている。食物摂取は、末梢性シグナルに応答する視床下部神経ペプチドにより制御される。恒常性異常は、肥満のような疾患に結びつく摂食及び代謝障害に結びつく場合がある。オレキシンは、ヒポクレチンとも呼ばれ、外側視床下部により放出される興奮性神経ペプチドホルモンである。オレキシン放出は、摂食行動、覚醒状態、及びエネルギー消費を調節する。視床下部のＨｃｒｔ（オレキシン）ＢＡＣアレイ系統は、外側視床下部での発現を示す。
本明細書中に記載のＢＡＣアレイ及びＴＲＡＰ法を使用することにより、分子タグ化リボソームタンパク質を有するマウスを生成する。これらは、Ｈｃｒｔ（オレキシン）遺伝子座に由来する調節配列の制御下で外側視床下部細胞タイプ特異的に発現させるための調節配列により駆動される。これらの動物からの翻訳プロファイルを取得することにより、特に摂食を制御するための、肥満に関係する標的が特定されると期待される。
本発明の幾つかの実施形態が本明細書中に提示され記述されているが、当業者であれば、そのような実施形態が単なる例として提供されていることは明白だろう。今後は、当業者であれば、本発明から逸脱しない多数の変化形、変更、及び置換を想起するだろう。本明細書中に記載されている本発明の実施形態の種々の代替形態が、本発明の実施に使用できると理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義され、特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの等価物がこれにより包含されることが意図されている。

Claims (23)

  1. ニューロンｍＲＮＡのプロファイルを作成する方法であって、
    （ａ）ニューロンで選択的に発現される遺伝子の調節領域により発現が制御されるタグ化リボソームＬ１０ａタンパク質を発現する第１の非ヒト生物からリボソーム複合体を単離する工程であって、前記複合体は、前記タグ化リボソームＬ１０ａタンパク質およびそれに付随する活発に結合しかつ／または翻訳されるｍＲＮＡを含む、工程と
    （ｂ）前記活発に結合しかつ／または翻訳されるｍＲＮＡのうちの１つ以上のレベルを定量化する工程と、
    を含む方法。
  2. 工程ａ〜ｂが、前記非ヒト生物の少なくとも第１の個体および第２の個体に対して実施され、そして前記方法が、
    前記少なくとも第１の個体と第２の個体とにおいて観察された、定量化された前記レベルを比較し、定量化された前記レベルの間の差異を決定する工程、
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 異なる個体に対する工程ａ〜ｂの実施が、異なる時間に行われる、請求項１に記載の方法。
  4. 少なくとも１つの個体に対する工程ａ〜ｂのより早期の実施により、少なくとも１つの活発に結合しかつ／または翻訳されるｍＲＮＡについての参照定量化レベルが確立される、請求項２に記載の方法。
  5. 非ヒト生物において密接に関連するニューロン細胞タイプの特徴的な分子特性を規定するための方法であって、
    （ａ）ニューロンで選択的に発現される遺伝子の調節領域により発現が制御されるタグ化リボソームＬ１０ａタンパク質を発現する前記非ヒト生物からリボソーム複合体を単離する工程であって、前記複合体は、前記タグ化リボソームＬ１０ａタンパク質およびそれに付随する活発に結合しかつ／または翻訳されるｍＲＮＡを含む、工程と
    （ｂ）前記活発に結合しかつ／または翻訳されるｍＲＮＡのうちの１つ以上のレベルを定量化する工程と、
    （ｃ）ｍＲＮＡの生成されたプロファイルに基づいて、前記密接に関連するニューロン細胞タイプの前記特徴的な分子特性を規定する工程と
    を含む方法。
  6. 前記リボソームＬ１０ａタンパク質が、２００アミノ酸よりも長いポリペプチドによってタグ化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＲＮＡが、参照試料と比較して、ニューロンにおいて差次的に発現される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記調節領域が、中型星状神経細胞において発現される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記調節領域が、線条体黒質ニューロン、線条体淡蒼球ニューロン、脳幹運動ニューロン、脊髄運動ニューロン、上位運動ニューロン、内側手綱のコリン作動性ニューロン、プルキンエ細胞、ベルクマングリア、介在ニューロン、星状細胞またはかご細胞で選択的に発現される遺伝子の調節領域である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記調節領域が、Ｄｒｄ１ａ遺伝子座、Ｄｒｄ２遺伝子座、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）遺伝子座、Ｐｃｐ２遺伝子座、Ｌｙｐｄ６遺伝子座、プレプロノシセプチン（Ｐｎｏｃ）遺伝子座またはＳｅｐｔｉｎ４遺伝子座に由来する調節配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記中型星状神経細胞が、パーキンソン病、依存症、注意欠陥過活動性障害、統合失調症、ハンチントン病又は運動失調症のいずれか１つから選択される疾患又は障害に関連している、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記リボソームタンパク質が検出可能なタグを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記検出可能なタグがｅＧＦＰである、請求項１２に記載の方法。
  14. ｍＲＮＡの前記プロファイルが、Ｇｐｒ６、Ｈｔｒ３ａ、Ｈｔｒａ３、Ｇｐｒ８８、Ｓｖ２Ｃ、Ａｄｒａ２ｃ、Ｈｒｈ２、Ｏｐｒｄ１、ＴｒｈｒまたはＵｔｓ２に由来するｍＲＮＡを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記単離する工程が架橋試薬を用いずに実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ニューロン疾患を処置するための１以上の候補治療薬を同定するための方法であって、請求項１に記載の方法を使用して、１つ以上のニューロンｍＲＮＡを調節する１つ以上の候補治療薬をスクリーニングする工程を含み、前記スクリーニングする工程は、単離された複合体においてｍＲＮＡプロファイルを分析して、前記１つ以上の候補治療薬による翻訳の調節を評価することを含む、方法。
  17. 前記１以上の候補治療薬に曝露された１個体の非ヒト生物からリボソーム複合体を単離する工程、および前記１以上の候補治療薬に曝露されていない１個体の非ヒト生物に対して、前記ｍＲＮＡプロファイルを比較する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. １以上の治療薬への曝露の影響をモニタリングするための方法であって、請求項１に記載の方法を使用して、前記１以上の治療薬へ曝露された１個体の非ヒト生物からリボソーム複合体を単離し、ｍＲＮＡプロファイルを同定する工程、および前記１以上の治療薬に曝露されていない１個体の非ヒト生物に対して、前記ｍＲＮＡプロファイルを比較する工程を含む、方法。
  19. 前記ｍＲＮＡが、マイクロアレイにさらに配置されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. リボソームタンパク質及び検出可能なタグを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを含むキットであって、該ヌクレオチド配列は、ニューロンにおいて選択的に発現される遺伝子の調節領域をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結され、前記リボソームタンパク質は、Ｌ１０ａである、キット。
  21. 前記検出可能なタグが、２００アミノ酸よりも長いポリペプチドである、請求項２０に記載のキット。
  22. 前記検出可能なタグがｅＧＦＰである、請求項２０または２１に記載のキット。
  23. 中型星状神経細胞、コリン作動性ニューロンまたは小脳細胞において選択的に発現される遺伝子の前記調節領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記中型星状神経細胞、前記コリン作動性ニューロンまたは前記小脳細胞において選択的に発現される前記遺伝子の５’又は３’非翻訳配列を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のキット。
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