CN114350705A

CN114350705A - 一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用

Info

Publication number: CN114350705A
Application number: CN202111355654.2A
Authority: CN
Inventors: 马宁; 卢荆澳; 黄春燕; 林芷茵; 彭昱轩; 唐政; 林宇
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明公开了一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用。本发明发现斑马鱼cd99l2基因具有与斑马鱼原始红系造血相一致的时空表达谱，仅在斑马鱼原始造血阶段的红细胞中高表达。本发明通过构建Tg(cd99l2‑4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼进一步发现，利用cd99l2作为标记时标记的细胞类型为未成熟的红系前体细胞，且不影响红细胞生成。因此，可将该转基因斑马鱼用于制备特异标记原始红系造血过程的动物模型，用于研究原始造血过程以及原始红细胞发育过程，还可用于制备用于筛选治疗红细胞增多或者减少性疾病药物的模型。

Description

一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用。

背景技术

斑马鱼造血发育由两次截然不同但在时间轴上重叠的两个过程组成：原始造血阶段和定向造血阶段。原始造血阶段在胚胎早期快速生长发育时，通过产生血红细胞协助组织快速氧化产生能量；原始造血阶段持续时间短暂，在胚胎发育过程中，只通过分化产生原始红细胞以及少量巨噬细胞。发育后期的定向造血阶段则可以产生具有分化潜能的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，造血干细胞通过分化产生个体组织需要的所有造血谱系细胞。在以往的研究中，由于原始造血阶段和定向造血阶段是时空交错，且目前发现的所有标记红细胞的基因在原始造血阶段和定向造血阶段中都有表达，难以区分，这让研究原始造血阶段变得困难。因此，亟需提供一种能有效标记原始红细胞的斑马鱼模型。

人源以及鼠源的CD99L2蛋白由位于X号染色体的MIC2L基因编码，是位于细胞膜上的O-连接糖基化细胞跨膜蛋白。CD99L2蛋白结构简单，为I型跨膜蛋白，分为一个跨膜结构域，一个小的含有脯氨酸富集序列(EPPP-PEPPR)胞内域和一个100个氨基酸左右的胞外域。CD99L2蛋白分布广泛，主要表达在血管内皮细胞之间的连接处、中心粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞膜的表面，但在不同细胞表达水平有差异。小鼠体内、外研究证实：CD99L2可招募中性粒细胞和淋巴细胞到炎症区域的血管，介导中性粒细胞穿过血管内皮细胞间隙以及间底膜，即炎症时白细胞渗出过程，但不介导淋巴细胞渗出。Vestweber D等研究证实：cd99l2基因的失活导致中性粒细胞在血管内皮细胞和基底膜之间腔隙聚集，在白细胞渗出过程的第三阶段受阻。此外，Zhao T等成功地从小鼠B淋巴细胞瘤细胞株中克隆了鼠源性cd99l2，体外和体内实验均证实鼠源型CD99L2与 B细胞淋巴瘤发生相关，表明cd99l2基因在髓系细胞的迁移以及白细胞在炎症免疫中发挥功能起到不可替代的重要作用。例如，专利《通过干扰CD99L2阻断白细胞迁出和炎症》中就通过干扰CD99L2阻断白细胞迁出和炎症。但关于cd99l2 基因在原始红细胞中的表达还未见报道，其在原始红细胞发生中的作用也不明确。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提供一种转基因斑马鱼，使其可用于制备特异标记原始红系造血过程的动物模型，用于原始红细胞发育研究、红细胞增多或减少症研究及其大规模备选药物筛选。

本发明的第一个目的是提供cd99l2基因在制备特异标记原始红系造血过程的转基因斑马鱼中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述Tg转基因斑马鱼在制备用于筛选治疗红细胞增多或者减少性疾病药物的模型中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述Tg转基因斑马鱼在制备用于研究原始红细胞发育过程的模型中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明利用整体原位杂交(whole-mount in situ hybridization，WISH)在野生型斑马鱼中观察了cd99l2基因的时空表达谱，同时通过抗体染色(antibody staining)与原位杂交相结合的方法确定了cd99l2基因在斑马鱼原始造血阶段表达细胞类型与αe1、βe1表达细胞一致。本发明利用流式细胞术(FACS)以及荧光定量PCR观察比较发现，斑马鱼cd99l2基因在不同造血谱系(红系、髓系和淋系)以及血管中表达量不同，其在原始造血阶段原始红系中高表达，原始髓系血细胞和血管中表达显著降低，在定向造血阶段红系、髓系、淋系表达均显著降低。在此基础上，本发明以斑马鱼基因组DNA为模板，克隆了cd99l2基因起始密码子(ATG)前4705bp(包含439bp的5’UTR)及起始密码子后34bp区域 (命名为cd99l2 4.7k启动子区域)，通过酶切后连接将cd99l2 4.7k启动子区域连入Tol2-eGFP空载体中获得转基因质粒，并利用显微注射的方式将 pTol2-cd99l2 4.7k promoter eGFP质粒注射进单细胞(one-cell)阶段的WT胚胎以及Tg(gata1:dsred)胚胎中获得转基因F0代，待F0代长大后通过自交筛选获得稳定转基因谱系。

本发明通过观察获得的Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼，发现其具有以下表型：(1)cd99l2：eGFP标记的细胞所在位置与cd99l2探针原位杂交是时空表达位置一致；(2)cd99l2：eGFP⁺细胞与已知gata1：dsred⁺细胞存在共定位。此外，本发明通过原位杂交实验检测cd99l2^SMU40突变体原始造血阶段红细胞珠蛋白βe1表达，证实了转基因斑马鱼中，红细胞的生成不受影响；邻联二茴香胺(O-dianisidine)染色也证实同时期血红蛋白生成不受影响；通过取外周血吉姆萨染色观察红细胞形态证实原始红细胞形态正常。因此，斑马鱼 cd99l2基因可作为特异性标志物用于研究原始造血阶段原始红系造血过程，可通过检测cd99l2基因的表达量用于检测原始造血阶段原始红系造血过程，或通过将cd99l2基因与荧光蛋白联用，进行可视化表达，用于制备特异标记原始红系造血过程的转基因斑马鱼。因此，本发明申请保护以下应用：

本发明申请保护cd99l2基因在制备特异标记原始红系造血过程的转基因斑马鱼中的应用。

本发明还申请保护一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用，所述转基因斑马鱼为Tg转基因斑马鱼，Tg转基因序列中包含有cd99l2基因启动子序列和荧光蛋白基因。

本发明还申请保护所述Tg转基因斑马鱼在制备用于筛选治疗红细胞增多或者减少性疾病药物的模型中的应用。

本发明还申请保护所述Tg转基因斑马鱼在制备用于研究原始红细胞发育过程的模型中的应用。

具体地，所述特异标记原始红系造血过程中特异标记的细胞为原始造血阶段未成熟红系前体细胞。

具体地，所述原始红系造血过程为斑马鱼早期造血过程，通过cd99l2时空表达谱确定cd99l2在斑马鱼原始造血特定时间与位置表达。

更具体地，所述cd99l2基因仅在斑马鱼原始造血阶段的红系造血中高表达，而在定向造血过程中以及原始造血其它谱系中表达显著降低。

具体地，所述cd99l2基因启动子序列为斑马鱼cd99l2基因起始密码子前 4705bp及起始密码子后34bp区域。

更具体地，所述斑马鱼cd99l2基因起始密码子为ATG，起始密码子前4705bp 中包含439bp的5’非翻译区。

具体地，所述Tg转基因序列中cd99l2基因启动子序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明发现斑马鱼cd99l2基因具有与斑马鱼原始红系造血相一致的时空表达谱，且cd99l2基因仅在斑马鱼原始造血阶段的红细胞中高表达。同时，本发明通过取外周血发现本发明所述Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼中标记的细胞类型为未成熟的红系前体细胞。且与红细胞发育关键基因 globin，gata1基因突变体会造成红细胞生成和发育障碍不同，本发明通过 cd99l2^SMU40突变体证实了斑马鱼原始造血阶段红细胞未受影响，更加证实了 cd99l2基因作为原始红细胞的标记物起到了研究原始红细胞生成、发育和成熟的良好指示作用。因此，该斑马鱼模型或可成为研究原始红系造血阶段原始红细胞发育过程的新载体，成为研究原始造血过程的良好模型。

2、本发明所述Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼模型可以存活至成年并可繁殖下一代。其还具有以下优点：(1)新突破：目前尚未出现有效的标记原始红细胞的斑马鱼模型，而本发明通过将Tg转入斑马鱼，提供了一种有效的标记原始红细胞的斑马鱼模型；(2)高通量：斑马鱼产卵数量多，养殖方便容易，可以同时进行多种药物筛选，以及进行多批次同时进行药物筛选；(3) 低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于老鼠，平均每天每只消费约为老鼠的 1/100；(4)给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至成年斑马鱼吸收，所需化合物的量仅为老鼠的1/100～1/1000。

附图说明

图1为地高辛标记斑马鱼cd99l2反义探针整体原位杂交结果；其中，图A～ F分别为cd99l2在斑马鱼发育4～18体节时期的表达情况；图G～K分别为cd99l2 在斑马鱼受精后第22～36小时的表达情况；图L～O分别为cd99l2在斑马鱼受精后第2～4天的表达情况；图G’～M’分别为图G～M的局部放大图；图片的放大倍数依次为：A～F，5x；G～J，4x；K～O，3.2X；G’～M’，20X。

图2为cd99l2原位杂交与αe1抗体染色双染色结果；其中，图A为斑马鱼受精第26小时(26hpf，原始造血时期)中间细胞层(原始造血组织)的共聚焦显微镜图(放大倍数为400X)；图B为26hpf时卵黄囊区域共聚焦显微镜图(放大倍数400X)，绿色荧光标记为cd99l2mRNA，红色荧光标记为αe1蛋白。

图3为Tg转基因斑马鱼的构建过程。

图4为Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼的时空表达结果，以及Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼与Tg(gata1-dsred)转基因斑马鱼荧光共定位结果。

图5为流式分选斑马鱼原始造血与定向造血各谱系细胞的分选结果以及 cd99l2在各谱系细胞中的qRT-PCR结果(t-检验，P<0.05；均数±标准误)。

图6为断尾取Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼28hpf外周血细胞形态观察结果。

图7为利用TALEN技术制备cd99l2^SMU40突变体的靶点设计图及突变体筛选结果；其中，图A靶点设计图，图B为突变体筛选结果，图C为推测cd99l2^SMU40突变体提前终止产生的21个氨基酸的截短蛋白质。

图8为28hpf时期cd99l2^SMU40纯合突变体(cd99l2^-40/-40)红细胞发育观察结果；其中，图A和B为珠蛋白βe1原位杂交与野生型斑马鱼对比结果；图C和 D为开展28hpf时期的O-dianisidine染色结果；图E和F为外周血细胞吉姆萨染色结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明所使用的术语“野生型”或者“WT”都是指野生型斑马鱼。

本发明所使用的术语“eGFP”是指具有增强性绿色荧光的细胞；“dsred”是指具有红色荧光的细胞。

本发明所使用的术语“s”指胚胎发育的体节，例如，“12s”指12体节时期；“hpf”指受精后的小时数，例如，“22hpf”指受精后第22小时；“dpf”指受精后的天数，例如，“2dpf”指受精后第二天。

本发明中用到的品系包括：AB野生型斑马鱼、Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼、Tg(globin：dsred)转基因斑马鱼、Tg(gata1：dsred) 转基因斑马鱼、Tg(coronin1a：eGFP)转基因斑马鱼、Tg(rag2：dsred)转基因斑马鱼、Tg(fli1a：eGFP)转基因斑马鱼。Tg(globin：dsred)转基因斑马鱼和Tg(gata1：dsred)转基因斑马鱼由香港科技大学温子龙教授实验室馈赠，Tg (coronin1a：eGFP)转基因斑马鱼由西南大学李礼教授实验室馈赠，Tg(rag2：dsred)转基因斑马鱼由Steiner LA馈赠，Tg(fli1a：eGFP)转基因斑马鱼由Brant M Weinstein馈赠。

实施例1

1、斑马鱼养殖

本发明中斑马鱼的养殖方法参考文献(Westerfield M:The zebrafish:guidefor the laboratory use of zebrafish(Brach danio rerio).Edition by Eugene,OR,M. Westerfield，1993)中的方法进行。

2、地高辛标记斑马鱼cd99l2基因反义RNA探针的制备

本发明根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中提供的斑马鱼cd99l2基因(NM_194369.1)序列，应用primer 5软件进行引物设计，设计的引物如下所示：

上游引物：5’-TGCTGGTAGTGAAAGGCTTGAGTGATGG-3’；

下游引物：5’-GAGTTTGTTGAACTTGTGGCTCCTGTGC-3’。

扩增片段大小为612bp。

本发明利用Thermo Scientific公司的TranscriptAid T7 kit试剂盒合成反义RNA探针，体外合成反义RNA探针的反应体系为：

3、整体原位杂交(WISH)

收取野生型斑马鱼胚胎用4％PFA室温固定2h或者4℃固定过夜；用PBST 漂洗胚胎2次，5min/次；再分别用50％、100％甲醇溶液胚胎脱水，各1次，5min/ 次；更换新鲜100％甲醇，将胚胎储存在-20℃过夜；分别用甲醇∶PBST体积比为3∶1，1∶1和1∶3的溶液漂洗胚胎(复水)，各1次，5min/次；用PBST漂洗胚胎2次，5min/次；proteinase K(10μg/mL)处理胚胎，24hpf胚胎5min， 36hpf胚胎8min，3dpf胚胎15min，4dpf胚胎20min，5dpf胚胎24min。处理过后用，4％PFA后固定，室温20min；用PBST漂洗胚胎2次，10min/次；吸除PBST后，加入HB溶液，60℃，5min之后，更换新鲜HB溶液，60℃，至少 1h；取出cd99l2探针(dig标记)，68℃变性至少8min，取出迅速置于冰上；回收HB溶液，加入探针，60℃，过夜；回收探针(可以重复使用多次)，储存在 -20℃，将50％甲酰胺/2×SSCT溶液放入杂交炉预热，用其漂洗胚胎，60℃，2次，20min/次；分别用2×SSCT和0.2×SSCT溶液在60℃漂洗胚胎，各2次，20min/ 次；用PBST漂洗胚胎，2次，5min/次；

封闭：现配2％羊血清用做封闭，室温至少1h；

抗体：用2％羊血清稀释抗体(anti-dig-AP)工作浓度为1∶2000，4℃，过夜；PBST室温下漂洗胚胎，6次，20min/次；用buffer9.5T溶液孵育胚胎，目的是提供碱性条件；加入NBT/BCIP染液，染色适当时间，待信号显现，加PBST 终止反应，漂洗2次，10min/次；用4％PFA固定胚胎，室温固定1h后，PBST 漂洗2次，10min/次；将胚胎储存在70％甘油中，4℃保存，准备拍照。

4、抗体染色

利用4％PFA室温固定胚胎两小时，1X PBST室温润洗胚胎3次，每次5分钟。依次用25％、50％、75％以及100％甲醇室温对胚胎进行梯度脱水，更换新鲜100％甲醇于-20°脱水两小时。依次用75％、50％、25％的甲醇室温对胚胎进行复水，一抗1：2000稀释于封闭液(2％LS in PBST)4°孵育过夜，1X PBST室温润洗胚胎3次，每次15分钟。二抗1∶2000稀释于封闭液室温避光孵育2小时，然后1X PBST室温润洗胚胎3次，每次15分钟。

本发明利用整体原位杂交(whole-mount in situ hybridization，WISH)在野生型斑马鱼中观察了cd99l2基因的时空表达谱，同时通过抗体染色(antibody staining)与原位杂交相结合的方法确定了cd99l2基因在斑马鱼原始造血阶段表达细胞类型与αe1、βe1表达细胞一致。

地高辛标记斑马鱼cd99l2反义探针整体原位杂交结果如图1所示，表明了 cd99l2mRNA表达情况。如图1所示，cd99l2在斑马鱼发育12体节(somite，s) 时期开始在神经系统表达(见图1D)，18hpf时期在原始造血区域中间细胞层 (intermedium cell mass，ICM)部位表达(见图1F)，26hpf时期表达高峰期(见图1H，H’)，从30hpf时期表达量逐渐降低(见图1I，I’)，36hpf时期在造血组织表达消失(见图1K，K’)，之后在神经系统中持续表达(见图1L～O)，表明cd99l2仅参与斑马鱼的原始造血阶段。

cd99l2原位杂交与αe1抗体染色双染色结果如图2所示。其中，图A为26hpf 时期(原始造血时期)中间细胞层(原始造血组织)的共聚焦显微镜图(放大倍数为400X)，图B为26hpf卵黄囊区域的共聚焦显微镜图(放大倍数为400X)，绿色荧光标记cd99l2 mRNA，红色荧光标记αe1蛋白。由图2可知，在斑马鱼的原始造血时期，cd99l2 mRNA标记的细胞与αe1蛋白标记的细胞相一致，αe1是胚胎珠蛋白的一种，作为成熟的红系标记基因存在。上述结果表明在斑马鱼原始造血阶段，cd99l2特异性地表达在红细胞上。

实施例2制备Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼

Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼是指cd99l2基因起始密码子(ATG)前4705bp(其中包含5’UTR439 bp)及起始密码子后34bp区域所构成的4.7k启动子调控转录翻译加强绿色荧光蛋白(eGFP)表达的转基因斑马鱼。 Tg(cd99l2 4.7k promoter-eGFP)转基因斑马鱼的制备过程如图3所示，其中左图为重组质粒的构建示意图，右图为转基因斑马鱼的筛选过程。

1、cd99l2 4.7k promoter的克隆

本发明根据ensemble(http://grch37.ensembl.org/)提供的斑马鱼cd99l2基因的启动子序列，应用primer 5软件进行引物设计，设计的引物如下所示：

上游引物：5’-acgcGTCGACCAGCCGCTGAGCATGTTCTTGAC-3’；

下游引物：5’-tgACCGGTGTCCATGTCCAGAGCGTCTTCT-3’。

引物下划线部分为酶切位点，小写碱基为保护碱基，拟扩增的片段大小为4739bp。具体地，扩增的cd99l2基因启动子序列为斑马鱼cd99l2基因起始密码子(ATG)前4705bp及起始密码子后34bp区域，前4705bp中包含5’UTR 439 bp。所述cd99l2基因启动子序列如SEQ ID NO.1所示。

2、Tol2-cd99l2 4.7k promoter-eGFP重组质粒的构建

本发明通过特异引物PCR克隆出cd99l2 4.7k promoter后，分别利用Sal I和 AgeI(NEB)于37℃过夜酶切启动子片段，用T4连接酶(NEB)将酶切后片段与Tol2-eGFP空载体16℃连接过夜。

酶切反应体系如下表所示：

连接反应体系如下表所示：

3、pTol2-cd99l2 4.7k promoter-eGFP转基因质粒显微注射

选取受精后(post-fertilization)单细胞(one-cell)阶段的斑马鱼胚胎进行显微注射。本发明利用显微注射的方式将pTol2-cd99l2 4.7k promoter-eGFP质粒注射进单细胞(one-cell)阶段的WT胚胎以及Tg(gata1:dsred)胚胎中获得转基因F0代，待F0代长大后通过自交筛选获得稳定转基因谱系。

4、激光共聚焦显微镜(confocal)拍照

本发明利用获得的Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼，利用三卡因麻醉Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼胚胎、Tg(cd99l2-4.7k promotereGFP；gata1：dsred)和Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP；globin：dsred) 双转基因斑马鱼胚胎，麻醉后胚胎固定于1％琼脂糖(Agarose，Sigma)中，激光共聚焦显微镜(LSM800,Zesis)对上述转基因斑马鱼胚胎拍照，滤光镜参数为eGFP(488，Zesis)以及dsred(561，Zesis)。

本发明通过获得的Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼，发现其具有以下表型：(1)cd99l2：eGFP标记的细胞所在位置与cd99l2探针原位杂交是时空表达位置一致；(2)cd99l2：eGFP+细胞与已知gata1：dsred⁺细胞存在共定位。

Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼的时空表达结果如图4所示。由图4可知，Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼在原始造血阶段早期，即18s时期在ICM可以看见绿色荧光(见图4A)，之后荧光强度逐渐增强 (见图4B～D)，在28hpf达高峰(见图4E)，之后荧光信号逐渐开始减弱(见图4F～G)，2dpf时已经观察不到绿色荧光(见图4H)。

Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼与Tg(gata1-dsred)转基因斑马鱼荧光共定位结果如图4I和4J所示，其中绿色荧光为cd99l2荧光信号，红色荧光为gata1荧光信号。gata1作为熟知的调控红细胞的转录因子，常作为红细胞前体细胞的标记基因。荧光信号观察发现，Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP) 转基因斑马鱼在26hpf时，卵黄囊(图4J)处以及ICM区域(图4I)与gata1 信号相一致，说明此时cd99l2表达细胞与gata1表达细胞相同，都在红细胞上表达。

实施例3

本发明利用流式细胞术(FACS)以及荧光定量PCR(qRT-PCR)观察比较了斑马鱼cd99l2基因在不同造血谱系(红系、髓系和淋系)以及血管中表达量的差异。

1、流式细胞术

本发明分别利用成年转基因系斑马鱼Tg(globin：dsred)和Tg(coronin1a：eGFP)，Tg(rag2：dsred)和Tg(fli1a：eGFP)自交获得的不同阶段胚胎标记不同造血阶段的各个谱系细胞以及血管细胞，研磨胚胎进行流式细胞术进行检测，通过FITC-A和PE-TexasRed-A通道分别分选单细胞悬液中绿色荧光蛋白 GFP和红色荧光蛋白dsred荧光细胞，对于分选所得细胞提取RNA进行逆转录获得cDNA，通过qRT-PCR确定cd99l2在不同造血阶段各谱系细胞中表达量。

2、实时荧光定量PCR检测不同谱系细胞中cd99l2表达量变化

本发明通过提取RNA，利用逆转录制备cDNA，再通过qRT-PCR比较不同谱系细胞中cd99l2基因的表达差异。

总RNA利用RNAeasy Kit(Qiagen,Maryland,USA；74004)提取，继而利用反转录试剂盒(Promega，Madison，USA，M1701)合成cDNA。实时荧光定量 PCR利用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Applied Biosystems，Austin, USA；4472908)染料在LightCyclerNano SW1.0机器上进行。具体操作步骤参照说明书。

引物序列如下所示：

引物	序列5′-3′
		cd99l2-FP(上游引物)	AATGATGCAAGGCAGAGGA
cd99l2-RP(下游引物)	CAATGATGCCCACATCCC

流式分选斑马鱼原始造血阶段与定向造血阶段各谱系细胞的分选结果分别如图5A和5B所示，方框圈出部分Wie各种谱系荧光阳性细胞群，其中globin 红色荧光阳性细胞代表红细胞，coronin1a绿色荧光阳性细胞代表髓系细胞，rag2 红色荧光阳性细胞代表淋系细胞，fli1a绿色荧光阳性细胞代表血管内皮细胞。 cd99l2在上述各谱系细胞中表达量的qRT-PCR结果如图5C所示。qPCR结果表明，cd99l2仅在斑马鱼原始造血阶段的红系细胞中高表达，而在其他谱系细胞以及血管中表达量低，且这种表达差异均具有统计意义(t-检验，P<0.05；均数±标准误)。

实施例4

本发明通过断尾获取Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼外周血后，利用细胞薄层制片机制备Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼外周血甩片，通过荧光显微镜标记cd99l2：eGFP⁺细胞位置，再采用吉姆萨(Giemsa) 染色法观察cd99l2：eGFP⁺细胞形态特点确定细胞类型。

斑马鱼外周血细胞的分离、细胞甩片以及血细胞吉姆萨染色

斑马鱼用三卡因麻醉，约10条胚胎以尾巴向着圆心围成一圈，吸干胚胎饲养液，加100uL血液收集液(5％FBS in 0.9X PBS)，用锋利的显微手术剪逐一在卵黄囊延伸处横断胚胎，由于心泵作用，血液自然流出。剪切完毕，移液枪收集血液，放置在冰上。分离出的PB用含5％的FBS重悬，接着将重悬的细胞400 转3分钟离心至玻片上。最后用吉姆萨(Merck,Germany；1.09204.0500)染色。根据细胞形态对Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼中荧光标记细胞类型观察。

断尾取Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼28hpf外周血细胞甩片后观察荧光细胞并联合吉姆萨染色观察细胞形态结果如图6所示。本发明通过取血制备细胞甩片(图6A)，观察荧光(图6B)定位cd99l2：eGFP⁺细胞，吉姆萨(May-Grunwald/Giemsa)后可以观察到Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)转基因斑马鱼28hpf血液中荧光细胞形态表现为未成熟红系前体细胞形态(图6C)，说明此时Tg(cd99l2-4.7k promoter eGFP)中cd99l2：eGFP⁺细胞为红系细胞形态，且为未成熟红系细胞。

实施例5

为检测cd99l2转基因是否会影响红细胞生成，本发明通过原位杂交实验检测cd99l2^SMU40突变体原始造血阶段红细胞珠蛋白βe1表达仅了了验证。

1、利用TALEN方法构建cd99l2^SMU40基因突变体

cd99l2^SMU40基因突变斑马鱼是利用TALEN技术以斑马鱼cd99l2基因 (NC_007118.7)第一个外显子为靶点，产生的增加了34个碱基，删除了74个碱基的突变，即cd99l2^(+34，-74)，命名为cd99l2^SMU40突变体。最终导致cd99l2蛋白形成只有21个氨基酸的截短蛋白，正常cd99l2蛋白不能表达，丧失cd99l2基因正常功能的突变体斑马鱼。

利用TALEN技术制备cd99l2^SMU40突变体的靶点设计如图7A所示，突变体筛选如图7B所示，最终获得cd99l2^SMU40突变体基因型。而本发明根据测序结果推测cd99l2^SMU40突变体提前终止，产生21个氨基酸的截短蛋白质，如图7C所示。

2、邻联二茴香胺(O-dianisidine)染色：

本发明通过O-dianisidine染色鉴定全鱼胚胎血红蛋白活性。血红蛋白具有过氧化物酶活性，催化过氧化氢介导O-dianisidine氧化，使得血红蛋白阳性细胞产生暗红色染色。破膜后胚胎置于O-dianisidine染色工作液(0.6mg/mL o-dianisidine，0.65％H₂O₂，10mM醋酸钠，40％乙醇)中避光染色15分钟，去除染液后PBST漂洗一次，放入4％PFA固定30分钟，置于70％甘油中4°保存。

28hpf时期cd99l2^SMU40纯合突变体(cd99l2-40/-40)的红细胞珠蛋白βe1原位杂交与野生型斑马鱼对比结果如图8所示。由图8可知，28hpf时期cd99l2^SMU40纯合突变体(cd99l2^-40/-40)的红细胞珠蛋白βe1原位杂交与野生型斑马鱼对比结果无异常(见图8A和B)。同时，本发明分别开展28hpf时期的O-dianisidine 染色(图8C和D)和外周血细胞吉姆萨染色(图8E和F)，结果显示cd99l2^SMU40纯合突变体血红蛋白生成正常，红细胞形态正常。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4739

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgcgtcgac cagccgctga gcatgttctt gacagtgtga cggcagagct tcctgtcata 60

tactgtgtta tgtgtggtca cacgtaagca tatattgtta cactagagag agggatgttt 120

atgttgtatt aatatctgaa aactatataa aaaatttgat taaaaacctc tctgggacgc 180

ttatcagata ttttatgaat gtccatgtgt gctttctcga agcttgtgtt cttcaaatga 240

acagcacatt gtagttccac ttacacacac ttttccctat aatgctctga tgatctggta 300

gaatgacctt cccaattcaa cctgagtcat ttgcaagaat caattaaaga tttttttttc 360

atcaacactt aactgcagca gtatatgatt gactttacat tgctttcatc tcttttgtgg 420

tgttgggaaa aaggaatata tttttctatt atgtttgtct ctttcttttc attaaacaat 480

tatttctatt ggtcattaaa aggttatata ttaacagaat tttttctcga atctgatatg 540

ttttgcatat taacaaagca tttttgcaga cgtagataaa tgctggtgca aaagttactt 600

tagctctgca gaaacttcct ctcagcagag aggtgttaaa actgaacaca aaaagtctta 660

cgcttttaat gttgtgccga gaattcgtag aaaaagagta tgtatggatg ggtgcagcca 720

atggaggact ggacaatgat tgtcatcaaa tgacgaattt cactaaactc catctgttaa 780

tatcagctgt caggaaatga aaactgttgc gcacctccta attgtaactt ttgcattgca 840

ttgaggataa cagaattctg tgaatcgaat tattaatttg tatccaataa attgctaata 900

tgttaaacat tgaagaaaaa tctctcctga ccttctttat ggaacacgca tggaattgat 960

tgaatattcc aaaagtggaa acaaatcaaa tcgatttaat caaactgtac aaagtgagct 1020

accgggtaaa ctgacgtcac cagaaaactt gtccatatgg agatagatac gtgaggcaaa 1080

tattttacat tacaaatcac agacatctta agagacagtt attttaaaca gttatttatt 1140

cacaaacagt tatttttgtt ttttatttgg tgttggggat gaaaataatc ctttagttat 1200

tgatatggta atataagtag tatgaaaagg aacaaaatct gatggcgtct gccctcttag 1260

aatttatttt acctaaactg cagtcaaaca tatgtttaag tttgcagttt cacaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 1380

tatatatata tatatatata tatatatata tatatacctt taaaatgagc atttttaaat 1440

aaaaaatttt ggggtgaatt taaagacttg gaagaaggct tggaaagatt ctcagggata 1500

aaacctggac tggttttttt ctttaatata gtgactaaat taaccttgaa tttgttttga 1560

tatttagtag tgactgaatc aactccgaga gttttataat gtccaccact gctttattcc 1620

tgcttcacag gcaagggcat gcccggcttt gagaatagtg tgggtcagtt tatcaaggaa 1680

agaaataatt caataaaaat aaccaaaata aaacaaaaca acccggcaga ttgtctaata 1740

atagacatta attataaaac tggaatactt tgtctgtgta ttctattcct ttgtggatca 1800

attcacaggt ctggggtcag atcctaacag ttcagaggct gactgtctga tgtttaaatg 1860

cttgagatat tgaaatattg ttcagaattg tacgcacata cccacatgga attttttgtg 1920

gacaatctgt attttaacca atcagtttaa aacacttatt ttttatgatg cagttaatga 1980

cgctatgttg acgtgtaatt gttgatgttt tgtgattgta agctgagcgg cctacaaact 2040

catttgcaag tgttgaagct ggcttctgct gatgaaactg caaactatct tcagtaaact 2100

ttcttcattt ttattgcatc tccgactctg agtcttctct tcacctgaca cactagactt 2160

tttatctgtt aatcttcatc tccaacacga cataatatta aacagttata tccattaaaa 2220

taagagtttg ttcagctaaa atctttagga atagaagaat aatacattta aattcaaaca 2280

agttattgca aaaaacatta caaactaaaa aatctcatct aaatgttttt ttatttttca 2340

tgtttgtctt gatttgtcct gtttattaaa ttttatttag tattttccct taatgtatca 2400

atttgggtgt actaattttt ggactttatc ttctgttttt tgttagatta gctccagttt 2460

tagtttcagt acatccctga atattccaca gtcggctgtt agtggtatta ttacaaagtg 2520

ggagcattta ggaacaacag caacaacagc atgtggtagg ccacattaaa tcacagagag 2580

gggtcagtgt tggctgaggt gcacagaagt caacaatttt caagagctac tgaccttcta 2640

gccttcagat aaaattaaat caacaattta agtgttaaat tgactgttta gtttattgtg 2700

gatgctcact ccaggtgtag gcacttctct gccgtcaagt gtctagacaa tgcaagtgag 2760

caggcttaca gtgttatgaa ctattcatca ccattctgtg tttgtgtcct tgtgtcgata 2820

tacatgggaa caagttaaga gtctggtagt acattacatg ttttagagat gagttacaga 2880

tccacaaatt tgtttttaaa aaagttttaa aatatctaat taatattttt agataaaagg 2940

gttgcattta agtggttgtt taacaagttt aaaaagtagg attagattca attgttagta 3000

gaatgttaag agtatattgt taggcattta tttgggcaca gtgcaataaa gcgcctgaat 3060

gaacatttat attatacatg gtaacacttt tcaatagttt cagtaattaa tgttagctat 3120

tgtatttact aacatgaaca aagtttctcc agagttaaac agagtttatc caacttatgt 3180

taacattagt taataaaagt tgttcattgt tagttaacta atgtcaacaa gcataccctt 3240

taataatttt aataatgcat agtaaatgtt aaactgatta gtgatagctg tgaaatattt 3300

ttccatagtt catgttatta cattaactaa tattaactta tcgtaaagtc tgcccttaat 3360

tagttccatg ttagcaaaaa cagtatgtgc ttgagttatt ctttatatga aagtacacaa 3420

attgttaaca aacatttaga atctaaaaaa atctcaaaaa cacacgtcga atatgtacca 3480

taaacatcaa tttctgtttt gccgctaagc ataattagaa catattgaaa ttatgctgtg 3540

ttaacacatt tgttttggga cgtacttaat acgtttgtca tatttagatt ttattgtagt 3600

atgtcctaac aacatgatcg gattacgctt agaggcaaaa cagaaattga tgtttatgct 3660

acatatttca tgtgtgtatt acatgtagga tatctaacaa gactttggga ttctaaatgt 3720

ttgttagcaa ttaacaatta ggttgttaac agaccttttt gtctagtttg acgttatatt 3780

gttggtttac tcactgcttc gctgagtagt tttaattatg tatatatttt taaacacaaa 3840

ggatttctgt gtgcttaaaa cattttggta ataatttgga ataatgtttc ttttgttaat 3900

gttagttcaa agagcaatac aattgttttt gtatttcaca atcttataac cttcttaaga 3960

aagttaactt tggttatgtt agctcaagtc tgtaaaccat gattgacaaa tataactttc 4020

catgtgaaag tatacactat aagaggtggt ttaactgatt tacttaccaa tcttgttaga 4080

ttaccacatc cttttttcaa aattgttttg taaataatta ccaattccga ataaactgct 4140

agagcacata aacccgagat gtgccaaaac atatcaatta ttaacagaag tcaattgtgc 4200

gagtcactta attattcaga gacgcacaat tatcctaatt cagtcattct gagtgaatgg 4260

ccaaatgcac gagaggaggt catcttatct gctcgagcag cagttcttca ccagcactgt 4320

aaacacgctc ttatcgcgcc catattctac atccagctgg tcgcaaagtc cattagcgag 4380

ttcacataac tgttatttat ttgtagggga gcaagtaaca ctggaaggct cgtctgttta 4440

taaaaagctg tgttacagcg tgctaaaaag ctgagctgaa tgaggaaccg ccctaaagcc 4500

ggtcttgtaa cgtgatctaa cacgcggctg tgaatccagc gctgctcatt cgcactgcag 4560

atcgtctcgc aggctttttc ggctcgacta gtaactgcga cccttaaaac tcccgttagg 4620

ccccaaggac aaatagccat aaatacatca tctgctgcca atatttaata tcgcagcaac 4680

ccagttgcca tttcggagtt ttaacatgga gaagacgctc tggacatgga caccggtca 4739

Claims

1.cd99l2基因在制备特异标记原始红系造血过程的转基因斑马鱼中的应用。

2.一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用，其特征在于，所述转基因斑马鱼为Tg转基因斑马鱼，Tg转基因序列中包含有cd99l2基因启动子序列和荧光蛋白基因。

3.权利要求2所述Tg转基因斑马鱼在制备用于筛选治疗红细胞增多或者减少性疾病药物的模型中的应用。

4.权利要求2所述Tg转基因斑马鱼在制备用于研究原始红细胞发育过程的模型中的应用。

5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述特异标记原始红系造血过程中特异标记的细胞为原始造血阶段未成熟红系前体细胞。

6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述原始红系造血过程为斑马鱼早期造血过程，通过cd99l2时空表达谱确定cd99l2在斑马鱼原始造血特定时间与位置表达。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述cd99l2基因仅在斑马鱼原始造血阶段的红系造血中高表达，而在定向造血过程中以及原始造血其它谱系中表达显著降低。

8.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述cd99l2基因启动子序列为斑马鱼cd99l2基因起始密码子前4705bp及起始密码子后34bp区域。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述斑马鱼cd99l2基因起始密码子为ATG，起始密码子前4705bp中包含439bp的5’非翻译区。

10.根据权利要求2～9任一所述应用，其特征在于，所述Tg转基因序列中cd99l2基因启动子序列如SEQ ID NO.1所示。