KR101793615B1 - 유전자 벡터 - Google Patents

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Abstract

조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC) 내의 miRNA와 상응하는, 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 서열 표적을 포함하며, HSPC 또는 HSC에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지만, 분화된 세포에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않는, 유전자 요법에 사용하기 위한 유전자 벡터.

Description

유전자 벡터{Gene Vector}
본 발명은 유전자 전달 및 유전자 요법 응용에 사용하기 위한 유전자 벡터, 및 그들의 사용 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
정상의 공여자로부터의 조혈 세포 이식(HCT)은 몇몇 선천성 및 후천성 장애에 대한 치료 요법이다. 그러나, 이식은 일치되는 공여자의 낮은 이용가능성 및 동종이계(allogenic) 절차(대부분 이식편대숙주병-GvHD과 관련됨)와 관련된 사멸률에 의해 제한된다. HCT는 리소좀축적병(lysosomal storage disease; LSD)과 같은 몇몇 장애에서 매우 낮은 효능을 갖는다. 동종이계 이식의 안정성 및 효능을 개선시키고, 일치되는 공여자가 없는 환자를 위한 대안적인 프로토콜을 동정하기 위하여, 유전자 수정된, 자가 조혈 줄기 세포(HSC)의 이식을 기반으로 한 유전자 요법이 필요하다.
동종이계 HCT에 대한 대안으로서, 유전자 요법에 의해 환자 자신의 조혈 세포에서 선천성 유전자 결함이 수정될 수 있다. 그러나, 관련 유전자의 기능적 카피(functional copy)를 신체의 모든 이환(affected) 세포로 전달하는 것은 어렵다. 줄기 세포 유전자 요법의 개념은 상대적으로 적은 수의 줄기 세포의 유전적 변형에 기초하며, 이러한 줄기 세포는 자기-재생 분열을 수행하고, 엄청난 수의 유전적으로 수정된 자손(progeny)을 생성하여, 환자의 나머지 일생 동안 수정된 세포의 지속적인 공급을 보장함으로써, 신체 내에 장기간 남아있다. 조혈 줄기 세포(HSC)는 유전자 요법을 위한 뛰어난 표적 집단을 이루는데, 이는 조혈 줄기 세포가 골수(BM) 또는 가동화된(mobilized) 말초 혈액으로부터 용이하고 안전하게 수득될 수 있기 때문이다. 단리된 HSC를 유전적으로 변형시키고, 자가 이식으로서 환자에 복귀시킬 수 있다. 장기간의 혜택에는 충분히 많은 수의 유전자-변형된 HSC의 이식이 필요하며, 이는 조절된 BM에 재분포되어, 모든 조혈 계통의 수정된 혈구를 유발할 수 있다. 자가 동종이계 HSC는 이식 절차가 모든 환자에게 이용가능하게 하며, GvHD를 야기하는 면역학적 적합성 문제를 없앤다. 또한, 원발성 면역결핍과 같은 일부 질환은 HSC 및 그들의 자손의 분획의 수정을 필요로 한다. 전처치요법(conditioning regimen)(소위 "비골수파괴성(non-myeloablative)" 또는 "미니(mini)" 전처치요법)의 강도를 감소시켜, 환자에 대해 더 나은 용인성(tolerability) 및 더 적은 부작용을 야기한다. 감소된 전처치요법은 표준 동종이계 이식과 상용성이 더 낮은데, 이는 혼합된 공여자 키메리즘(chimerism)이 숙주-유래의 면역 세포와의 면역학적 길항작용 때문에, 동종이계 설정에서 보통 불안정하기 때문이다.
HSC 및 그들의 자손의 효율적인 장기간 유전자 변형은 HSC 기능에 영향을 미치지 않고, 수정 DNA의 게놈 내로의 안정적인 통합을 가능하게 하는 기법을 필요로 한다. 가장 효율적인 전달 시스템은 바이러스 벡터이다.
예를 들어, 리소좀 효소 갈락토세레브로시다제(구형세포백색질장애(GLD) 또는 크라베병에서 결여되어 있는)의 조혈 전구 세포(progenitor cell; HSPC)에서의 유전자 전달 및 발현은 형질도입된 세포의 아폽토시스(apoptosis) 및 기능 손상을 야기하여, 장애를 치료하기 위한 HSPC 기반의 유전자 요법 방법의 개발을 저지시킨다(하기 참조). 따라서, 유전자 요법에 사용되는 장래의 발현 카세트는 생리적 발현 패턴과 유사해야 하고, 이소성 및/또는 비-생리적 전이유전자(transgene) 발현을 피해야 하며, 이러한 이소성 및/또는 비-생리적 전이유전자 발현은 독성, 형질도입된 세포의 제거 또는 심지어는 악성 변환을 야기할 수 있다. 특히 유전자 요법의 장기간 효능을 보장하며, 그 생명활동이 유전적 중재에 의해 파괴되지 않아야 하는 것이 주요 표적 세포 유형인 줄기 세포에 중요하다.
약술하면, 현행의 조혈 유전자 요법 전략은 조혈계의 장기간 수정을 보장하기 위하여 HSC의 형질도입을 필요로 하지만, HSC에서 전이유전자 생성물을 이소성으로 발현하지 않으나 유전 질환의 표적, 예컨대, SCID에서 림프구, CGD에서 과립구 및 GLD에서 단핵구/대식구인 분화된 자손에서만 "스위치 온(switch on)"되는 조절된 전이유전자 발현 카세트로부터 상당히 유익할 것이다.
이를 달성하는 한 가지 방법은 벡터 내의 치료 유전자의 발현을 작동시키기 위하여 계통-특이적 전사 조절 인자, 예를 들어, 로커스(locus)의 내인성 프로모터를 사용하는 것이다. 그러나, 프로모터는 종종 넓은 범위의 DNA에 걸쳐 퍼져 있으며, 불충분하게 특성화되어 있으며, 이에 따라 벡터 작제물 내에서 그들 전체가 용이하게 재구성될 수 없다. 또한, 유전자-전달 벡터 내에서 재구성된 조직-특이적 프로모터로부터의 발현 수준은 종종 표현형 수정을 달성하는데 충분하지 않은데, 이는 대부분 불완전한 재구성 및/또는 세미-랜덤(semi-random) 벡터 통합 부위에서 염색질의 해로운 영향 때문일 것이다. 따라서, 전이유전자를 조절하기 위한 추가의 전략이 절실히 필요하다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 조혈 전구 세포(HSPC) 내의 miRNA와 상응하는, 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 서열 표적을 포함하며, HSPC에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지만, 분화된 세포에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않는, 유전자 요법에 사용하기 위한 유전자 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 조혈 줄기 세포(HSC) 내의 miRNA와 상응하는, 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 서열 표적을 포함하며, HSC에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지만, 분화된 세포에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않는, 유전자 요법에 사용하기 위한 유전자 벡터가 제공된다.
바꾸어 말하면, 본 발명은 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포에 유효량으로 존재하는 miRNA에 대한 하나 이상의 miRNA 서열 표적 및 임의로 전이유전자를 포함하는 조혈 유전자 요법에 사용하기에 적합한 유전자 벡터를 제공한다. 유효량은 내인성 miRNA의 농도가 상응하는 miRNA 표적 서열에 작동가능하게 연결된 전이유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는데 충분함을 의미한다. 따라서, 본 발명은 세포, 예컨대 HSPC 및 HSC에서 강력하게 발현되나, 예를 들어 골수 및 림프 계통의 분화된 자손에서는 강력하게 발현되지 않는 miRNA의 사용을 채용하여, 질환에 걸린 자손에서 발현 및 치료적 효능을 유지하면서, 감수성 줄기 세포 집단에서 잠재적으로 독성인 전이유전자의 발현을 방지하거나 감소시킨다.
miRNA는 전이유전자에 "작동가능하게 연결된다". 용어 "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성성분이 그들이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있음을 의미한다.
줄기 세포는 많은 세포 유형으로 분화할 수 있다. 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포는 전능성(totipotent)으로 알려져 있다. 포유 동물에서, 오직 접합체 및 초기 배아 세포만이 전능성이다. 줄기 세포는 모두는 아닐지라도 대부분의 다세포 유기체에서 관찰되는 세포이다. 이들은 세포 유사 분열을 통하여 이들을 재생하고, 다양한 범위의 구체화된 세포 유형으로 분화시키는 능력이 특징이다. 이들 2개의 넓은 유형의 포유동물 줄기 세포는 배반포의 내세포 집단으로부터 단리된 배아 줄기 세포, 및 성체 조직에서 관찰되는 성체 줄기 세포이다. 발생하고 있는 배아에서, 줄기 세포는 모든 구체화된 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성체 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 신체에 대한 회복 시스템으로 작용하여, 구체화된 세포를 보충할 뿐 아니라, 재생 기관, 예컨대 혈액, 피부 또는 장 조직의 정상적인 턴오버(turnover)를 유지한다.
조혈 줄기 세포(HSC)는 골수(단핵구 및 대식구, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프 계통(T-세포, B-세포, NK-세포)를 비롯한 모든 혈액 세포 유형을 야기하는 다능성(multipotent) 줄기 세포이다.
전구 세포는 특정 유형의 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 그러나, 줄기 세포와 반대로, 이들은 이미 훨씬 더 구체적이며, 즉, 이들은 이들의 "표적" 세포로 분화되도록 강요된다. 줄기 세포와 전구 세포의 가장 중요한 차이는 줄기 세포가 영구적으로 복제할 수 있는 한편, 전구 세포는 오직 제한된 횟수만을 분열시킬 수 있다는 점이다. HSPC는 생체 내 검정, 즉 이식과, 이들이 연장된 기간에 걸쳐 모든 혈액 계통을 야기할 수 있음의 증명에 의해서만 HSC로부터 엄격히 구별될 수 있다. 세포 표면 마커, 예컨대 c-Kit(CD117), Sca-1의 검출, 및 SLAM 수용체 패밀리(CD150 및 CD48)에 속하는 최근 기재된 분자 세트와 통합된 계통 마커의 패널의 부재/낮은-발현을 HSC 및 HSPC 하위집단에 대해 농축시켜, 표준 기능 검정(Kiel et al)에 대해 검정시 50%의 순도에 도달하게 할 수 있다.
분화된 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포에 비해 더 구체화된 세포이다. 분화는 유기체가 단일의 접합체에서 조직 및 세포 유형의 복합 시스템으로 변함에 따라 다세포 유기체의 발생 중에 일어난다. 또한, 분화는 성체에서 공동의 과정이며, 성체 줄기 세포는 조직 회복 및 정상 세포 턴오버 중에 분열하고, 완전히 분화된 딸세포를 생성한다. 분화는 세포의 크기, 형상, 막 전위, 대사 활성 및 신호에 대한 반응성을 급격하게 변화시킨다. 이들 변화는 주로 유전자 발현 중의 고도로 조절된 변형 때문이다. 다시 말하면, 분화된 세포는 특정 유전자의 활성화 및 불활성화를 수반하는 발생 과정 때문에, 특이적인 구조를 가지며 특정 기능을 수행하는 세포이다. 본 명세서에서, 분화된 세포는 조혈 계통의 분화된 세포, 예컨대 단핵구, 대식구, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포를 포함한다. 예를 들어, 조혈 계통의 분화된 세포는 미분화 세포 상에서 발현되지 않거나 덜 발현되는 세포 표면 분자의 검출에 의해 HSC 및 HSPC로부터 구별될 수 있다. 적합한 계통 마커의 예에는 예를 들어, CD11b, Gr1, CD19, Ter119 및 CD3이 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 mir-130a, mir-126 및 mir-223을 포함하는 군으로부터 선택되는 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 서열 표적을 포함하는 유전자 요법에 사용하기 위한 유전자 벡터가 제공된다.
miR-126 표적은 더욱 원시의 HSPC 및 (인간에서) 적혈구 계통에서 가장 효율적으로 발현을 차단한다. miR-126은 골수 및 림프 계통에서 강력한 전이유전자 발현에 의존하는 유전자 요법 응용에 특히 적합할 것이다.
miR-130a 표적은 더욱 원시의 HSPC에서 가장 효율적으로 발현을 차단하며(miR-126과 유사), miR-130a는 골수, 림프 및 적혈구 계통에서 강력한 전이유전자 발현에 의존하는 유전자 요법 응용에 특히 가장 적합할 것이다.
miR-126은 인간 CD34 세포에서 miR-130a보다 더 강할 수 있으나, 또한 분화된 자손에서 비-특이적인 활성을 가질 수 있다. miR-130aT 서열(바람직하게는 2 내지 4 카피) 및 "하프(half)" miR-126T(바람직하게는 2 카피)를 포함하는 조합 표적은 HSPC에서의 억제 및 골수 자손에서의 발현의 비에 의해 결정되는 운영 윈도우(operating window)를 최대화한다. 더욱이, 조합 표적을 사용하는 경우, HSPC에서의 전이유전자 하향조절이 2개의 독립적인 miRNA에 의해 보장되며, 내인성 miRNA 조절의 간섭 위험이 감소되어, 표적 서열의 안전성 및 효능을 증가시킨다. miR-223 표적은 골수 수임된 전구세포에서 가장 효율적으로, 그리고 더욱 원시적인 HSPC에서는 적어도 부분적으로 발현을 차단한다. miR-126 및 miR-130a와 불일치하게, miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식구, 골수 수지상 세포를 비롯한 분화된 골수 세포에서 발현을 완전하게 그리고 강력하게 차단한다. miR-223 표적은 림프 또는 적혈구 계통에서 강력한 전이유전자 발현에 의존하는 유전자 요법 응용에 특히 적합할 것이다. 또한, miR-223 표적은 인간 HSC에서 매우 효율적으로 발현을 차단할 수 있다.
바람직하게는 miRNA 서열 표적은 mir-130a 및 mir-126에 상응한다.
일 실시형태에서, 유전자 벡터는 벡터의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다시 말하면, 내인성 마이크로RNA는 특정 세포 유형(HSC 및 HSPC)에서는 바이러스의 발현 또는 증식을 막지만, 다른 세포 유형에서는 발현 또는 증식을 가능하게 한다. 예를 들어, mir-126, mir-130 및 mir-223은 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포에서 유전자 벡터 또는 종양용해(oncolytic) 바이러스의 발현을 막는다.
일 실시형태에서, 유전자 벡터는 전이유전자인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 비-바이러스 유전자 전달 벡터의 형태이다. 이러한 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 miRNA 표적 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 플라스미드를 포함하거나 그 형태일 수 있다.
본 명세서에 기재된 발현 벡터는 전사될 수 있는 서열을 함유하는 핵산의 영역을 포함한다. 따라서, mRNA, tRNA 및 rRNA를 코딩하는 서열이 이러한 정의 내에 포함된다.
본 발명의 유전자 벡터 또는 유전자 전달 벡터는 전이유전자를 대상 부위 또는 대상 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 표적 부위로 전달될 수 있다.
벡터는 하나의 환경으로부터 다른 환경으로 엔티티(entity)의 전달을 가능하게 하거나 이를 용이하게 하는 도구이다. 예로서, 재조합 DNA 기법에 사용되는 몇몇 벡터는 엔티티, 예컨대 DNA의 세그먼트(예컨대, 이종 DNA 세그먼트, 예컨대 이종 cDNA 세그먼트)가 표적 세포 내로 전달되게 한다. 임의로, 일단 표적 세포 내에 있으면, 벡터는 세포 내에서 이종 DNA를 유지하게 할 수 있거나, DNA 복제의 유닛(unit)으로 작용할 수 있다. 재조합 DNA 기법에 사용되는 벡터의 예에는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 또는 바이러스가 포함된다.
비-바이러스 전달 시스템은 DNA 트랜스펙션 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서, 트랜스펙션은 비-바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 표적 포유동물 세포에 전달하는 과정을 포함한다.
전형적인 트랜스펙션 방법은 전기천공법, DNA 바이오리스틱스(biolistics), 지질-매개 트랜스펙션, 컴팩티드(compacted) DNA-매개 트랜스펙션, 리포좀, 이뮤노리포좀, 리포펙틴, 양이온 제제-매개, 양이온 페이셜(facial) 양쪽성물질(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14; 556) 및 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 벡터는 바이러스 벡터이다.
바이러스 전달 시스템은 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 벡터의 다른 예는 생체 외 전달 시스템을 포함하며, 이는 DNA 트랜스펙션 방법, 예컨대, 전기천공법, DNA 바이오리스틱스, 지질-매개 트랜스펙션, 컴팩티드 DNA-매개 트랜스펙션을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "벡터 입자"는 바람직하게는 표적 세포에 결합하고 이에 유입될 수 있는 패키징된(packaged) 레트로바이러스 벡터를 말한다. 벡터에 대해 이미 논의된 바와 같이, 입자의 구성성분은 야생형 레트로바이러스에 대해 변형될 수 있다. 예를 들어, 입자의 단백질성 코트 내의 Env 단백질은 유전적으로 변형되어, 그들이 표적화하는 특이성을 변경시키거나 다른 원하는 몇몇 기능을 달성할 수 있다.
바람직하게는, 바이러스 벡터는 우선적으로 특정 세포 유형(들)을 형질도입시킨다.
더욱 바람직하게는, 바이러스 벡터는 표적화된 벡터이며, 즉, 이는 본래 바이러스에 비해 변경된 조직 향성(tropism)을 가져, 벡터가 특정 세포에 표적화되게 한다.
바람직한 실시형태에서, 유전자 벡터는 렌티바이러스로부터 유도할 수 있다.
일 실시형태에서, 유전자 벡터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 조직 특이적 프로모터는 CD11b 및 c-Fes, 및 사이토크롬 b-245 중쇄(CYBB, gp91 phox) 로커스 및 TEK(Tie2)로부터 유도된 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. TEK(Tie2) 프로모터는 miR-126 표적 서열과 조합될 수 있으며, 이러한 조합은 종양-침윤성 골수 세포의 서브셋(subset)에서의 특정 전이유전자 발현을 가능하게 할 것이다.
일 실시형태에서, 유전자 벡터는 효소를 코딩하는 전이유전자를 포함한다. 바람직하게는 효소는 그룹 리소좀 효소 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase) 및 gp91 phox로부터 선택된다. 본 발명에 따르면, 인터페론-알파와 같은 면역조절 분자를 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이들 벡터는 골수 이식 시에 면역조절 분자를 종양 세포 내로 전달한다. 바람직하게는, 이들 벡터는 Tie2 프로모터에 더하여 miR-126T 서열을 함유한다.
중요하게는 Tie2 프로모터는 조혈 줄기 세포에서 활성을 보유하며, 면역조절 분자, 예컨대 인터페론-알파는 HSC에 독성인 것으로 알려져 있다. 따라서, HSC 기능을 간섭하지 않고, Tie2 발현에 의해 생활성 분자를 종양 침윤성 대식구에 특이적으로 전달하기 위하여, 본 특허 출원서에 기재된 바와 같은 HSC-특이적 miRT-의 사용은 옵션이라기보다는 필수적이게 된다. Tie2 프로모터가 본 연구 내내 사용되는 PGK 프로모터보다 HSC에서 더 약한 점을 감안하여, 본 발명자들은 126T/130aT 서열이 HSC에서 Tie2 프로모터로부터 발현되는 전이유전자의 독성을 완전히 막는 것으로 예상한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 하나 이상의 miRNA 서열 표적 및 임의로 전이유전자를 포함하는 패키징가능한(packagable) 바이러스 벡터 게놈을 코딩하는 DNA 작제물을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 생성하기 위한 DNA 작제물의 세트가 제공된다. 본 발명자들은 패키징가능한 벡터 게놈을 벡터 게놈이 그것이 바이러스 벡터 입자 내로 패키징될 수 있는 환경에 있는 것으로 정의한다. 이는 일반적으로 Gag-Pol 및 Env의 존재를 필요로 한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명의 DNA 작제물의 세트를 숙주 세포 내로 도입하고, 바이러스 벡터 입자를 수득하는 것을 포함하는 바이러스 벡터 입자의 제조 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 상응하는 miRNA를 포함한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 바이러스 벡터 입자가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 유전자 벡터 또는 입자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 유전자 벡터 또는 입자로 감염되거나 형질도입된 세포가 제공된다. 세포는 생체 내 또는 시험관 내 시나리오에서 형질도입되거나 감염될 수 있다. 세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간 또는 마우스로부터 또는 그의 일부로부터 유래할 수 있다. 따라서, 예컨대 질환 모델로 사용하기 위한 트랜스제닉(transgenic) 동물을 제공하는데 본 발명이 유용함이 인식될 것이다. 일 실시형태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물이다.
일 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포이다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, mir-130a, mir-126 및 mir-223을 포함하는 군으로부터 선택되는 miRNA에 상응하는 2개 이상의 상이한 miRNA 서열 표적의 조합물이 제공된다.
일 실시형태에서, miRNA 서열 표적은 동시, 개별 또는 순차적 이용을 위한 것이다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포에서 전이유전자의 발현을 막거나 감소시키기 위한, 본 발명에 따른 유전자 벡터, 본 발명에 따른 입자, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 본 발명의 청구 범위에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 조합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 공세포백색질장애, 만성육아종병 및 중증복합면역결핍증(SCID)으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한, 본 발명에 따른 유전자 벡터, 본 발명에 따른 입자, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 본 발명의 청구 범위에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 조합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 유전자 요법과 관련된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 생존 기회를 증가시키기 위한, 본 발명에 따른 유전자 벡터, 본 발명에 따른 입자, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 본 발명의 청구 범위에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 조합물이 제공된다.
HSC 또는 HSPC의 생존 기회는 이들 세포로부터의 유전자의 발현을 특이적으로 비표적화(detargeting)함으로써 증가될 수 있다. 특히, HSC 또는 HSPC에 독성인 전이유전자의 발현의 비표적화는 이들 세포의 생존에 유익할 수 있다. 또한, 숙주에서 원치않는 면역 반응을 야기할 수 있는 전이유전자의 발현의 비표적화는 증가된 세포 생존 기회를 야기할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 유전자 요법의 안전성 및/또는 효능을 증가시키기 위한, 본 발명에 따른 유전자 벡터, 본 발명에 따른 입자, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 본 발명의 청구 범위에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 조합물이 제공된다.
유전자 요법의 안전성의 증가는 HSC 또는 HSPC와 같은 특정 세포 유형에서 원치않는 전이유전자의 발현 또는 벡터의 발현을 방지 또는 감소시키는 것을 포함한다. 특정 세포 유형으로부터의 전이유전자 또는 벡터의 발현의 비표적화에 의해, 유전자 요법에 동반될 수 있는 원치않는 반응 또는 부작용을 감소시킬 수 있다. 유전자 요법의 효능 증가는 전이유전자가 분화된 조혈 세포와 같은 원하는 세포 유형에서 더 효율적으로 발현되는 것을 포함하는데, 이는 이들 세포가 전이유전자 독성 및 마이크로RNA 표적 서열에 의한 원치않는 면역 반응으로부터 보호된 유전자-변형된 미분화 세포로부터 더 효율적으로 생성되기 때문이다. 특히, HSC 또는 HSPC의 이식을 수반하는 유전자 요법은 세포가 분화될 때까지 전이유전자의 발현이 회피될 수 있다면, 더 안전하고 더 효율적일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 전이유전자의 발현에 의해 야기되는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 아폽토시스를 방지하기 위한, 본 발명에 따른 유전자 벡터, 본 발명에 따른 입자, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 본 발명의 청구 범위에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 조합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 분화 단계를 모니터링하기 위한, 본 발명에 따른 유전자 벡터, 본 발명에 따른 입자, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 본 발명의 청구 범위에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 조합물이 제공된다.
mir-126, mir-223 및 mir-130a의 존재는 HSC 또는 HSPC를 나타낸다. 더욱 자세하게, mir-126은 원시의 HSPC 및 또한 인간에서 적혈구 계통의 세포를 나타낸다. Mir-130a는 더욱 원시의 HSPC를 나타낸다. Mir-223은 골수 수임된 전구 세포 및 더욱 원시의 HSPC를 나타낸다. 또한, Mir-223은 과립구, 단핵구, 대식구 및 골수 수지상 세포를 비롯한 분화된 골수 세포를 나타낸다.
일 실시형태에서, 유전자 벡터는 조혈 세포 요법에 사용하기 위한 것이다. 조혈 세포 요법은 조혈 줄기 세포 이식을 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 유전자 요법에 사용하기 위한 mir-130a, mir-126 및 mir-223의 군으로부터 선택되는 miRNA에 상응하는 miRNA 서열 표적이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 세포 내의 miRNA의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하여, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 분화 단계를 결정하는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 miRNA는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 miRNA 표적 서열에 상응하며, 상기 miRNA는 조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키나, 분화된 세포에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않는다. 예를 들어, mir-130a 및 mir-126의 발현은 세포가 HSPC 또는 HSC임을 나타내나, miR-223의 발현은 그들의 전구체 및 유도체를 포함한 골수 계통, 즉 과립구 및 단핵구로의 소속(affiliation)을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 세포 내의 2개 이상의 상이한 miRNA의 발현 수준을 결정하고 상이한 miRNA의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하여, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 분화 단계를 결정하는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 miRNA는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 miRNA 표적 서열에 상응하며, 상기 miRNA는 조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키나, 분화된 세포에서는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않는다. 더욱이, 2개의 마이크로RNA의 발현은 각각의 것이 상이한 마이크로RNA 표적 서열을 함유하는 2개의 마커 유전자를 발현하는 양방향성 벡터를 사용하여 동시에, 그리고 서로 독립적으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 상이한 마이크로RNA는 상이한 마커, 예컨대 형광 마커에 연결될 수 있다. 상이한 색상은 상이한 분화 단계를 나타내는 상이한 마이크로RNA의 발현 혼합물을 나타낼 것이다(예컨대, 녹색 마커+miR-126T, 적색 마커+miR-223T. 세포가 적색 또는 흑색이면 → HSPC; 세포가 황색이면: → 림프구; 세포가 녹색이면 → 분화된 골수 계통 세포).
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포 내의 전이유전자의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하여, 상기 조혈 줄기 세포 또는 상기 조혈 전구 세포의 분화 단계를 결정하는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 전이유전자는 miRNA 서열 표적에 작동가능하게 연결되며, 이에 의해 상응하는 miRNA가 조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 상기 전이유전자의 발현을 방지하거나 감소시키나, 분화된 세포에서는 상기 전이유전자의 발현을 방지하거나 감소시키지 않는다.
추가로, miR-126, miR-130a 및 miR-223을 포함하는 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 리포터 벡터를 적용하여 유도된 만능성(pluripotent) 세포(iPS) 또는 배아 줄기 세포(ES)로부터 조혈 계통 세포를 수득하려는 목적의 배양 시스템 내의 조혈 줄기 세포 및/또는 그들의 바로 앞단계 전구체를 동정할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 miRNA는 mir-130a, mir-126 및 mir-223을 포함하는 군으로부터 선택된 miRNA를 포함한다.
본 발명의 몇몇 추가의 주요 이점
본 발명은 유전자 요법에 적합한 유전자 벡터가 전이유전자 발현을 조절하기 위하여 HSC 및 HSPC에 대해 내인성인 miRNA에 의해 조절되어, 벡터의 특정 발현 프로파일을 달성하도록 설계될 수 있는 방법을 교시한다. 본 발명은 이들 벡터의 광범위한 적용을 제공하는데, HSC 및 HSPC에서 전이유전자 독성을 방지하는 것을 도와서, 이에 따라 다양한 질환의 치료를 위한 유전자 요법 전략의 개발을 용이하게 하기 때문이다. 벡터는 특히 HSC 또는 HSPC에 대해 독성인 전이유전자의 발현을 수반하는 유전자 요법에 적합하다.
본 발명자들은 희귀 HSPC 집단을 비롯한 다수의 조혈 세포 서브셋에 걸쳐 선택된 miRNA의 활성을 프로파일링하여, 광범위하나 이전에 정제된 벌크(bulk) 집단에 한정된 통상적인 miRNA 발현 프로파일링 방법에 새로운 면을 부가하는 신규한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 유세포 분석으로 동시에 다수 세포 집단에서, 그리고 단일의 세포 수준에서 쉽게 정량화할 수 있는 miRNA의 활성에 대한 살아있는 유전적 지시자로 소용되는 렌티바이러스 miRNA 리포터 벡터를 사용한 HSPC의 형질도입에 기반한다. 이러한 방법을 사용하여, 본 발명자들은 가장 원시의 줄기 세포에 풍부한 서브셋을 포함하는 마우스 및 인간 HSPC에서 고도로 작용성인 2개의 miRNA를 동정하였다. 분화 시에, 하나의 miRNA는 초기 전구 세포 수준에서 빠르게 하향-조절되고, 다른 하나는 과립구생성 및 단핵구생성 동안 추가로 유도되나, 거핵구/적혈구 분화 동안 그리고 림프구에서 급격하게 하향-조절된다.
추가로, 본 발명자들은 HSPC에서 고도로 발현되는 2개의 miRNA 중 하나를 적용하여, 렌티바이러스-기반의 조혈 줄기 세포 유전자 요법에 의하여 뮤린 모델에서 공세포백색질장애(GLD)(리소좀 효소 갈락토세레브로시다제(GALC)의 결함이 있는 활성에 기인한 리소좀축적병)의 효율적인 치료를 막는 주요 이슈를 극복하였다. 다른 리소좀 효소와 반대로, HSPC 내의 GALC 유전자 전달 및 발현은 효소 발현으로 인한 생활성 스핑고지질의 세포내 함량 불균형으로 인하여 형질도입된 세포의 아폽토시스 및 기능 손상을 야기한다. 골수 및 림프 계통의 분화된 세포는 GALC 발현에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 효소 독성에 대한 HSPC의 독특한 감수성을 제시한다. 리포터 벡터에 사용되는 miRNA-반응성 서열은 치료적으로 유의미한 GALC 전이유전자의 발현 프로필을 조절하고, 동족체 miRNA가 발현되는 세포(HSPC)로부터 전이유전자 발현을 비표적화시키는 것을 가능하게 하면서, GALC-발현 독성에 의해 영향받지 않는 분화된 자손에서 완전한 치료적 발현을 가능하게 한다. miRNA-조절된 GALC 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 HSPC는 효소 독성으로부터 보호되고, 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 그들의 기능을 보유하였다. 예비 결과는 마우스 모델에서 질환 소견을 바로잡는 이러한 방법의 치료적 효능을 나타낸다.
바람직하게는, 하기의 miRNA 표적 서열을 사용하여, 인간 조혈계에서 조절된 전이유전자 발현을 달성한다: 골수 계통 내의 발현을 필요로 하는 유전자 요법 응용(예컨대, 만성육아종병, 리소좀축적병, 예컨대 크라베병, 이염색백색질장애, 부신백색질형성장애 등): 126T/130aT(2+2 표적 서열) - HSPC에서의 최대 억제를 위해 최적화; 126T(2 표적 서열) - 골수 자손에서의 최소의 백그라운드(background) 활성을 위해 최적화.
적혈구 계통 내의 발현을 필요로 하는 유전자 요법 응용(예컨대 지중해빈혈, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 결함, 겸상적혈구 질환 등): 130aT(4 표적 서열) 또는 223T(2 또는 4 표적 서열). 후자의 표적은 더욱 원시의 BFU-E 및 CFU-E에서 조금의 활성(5x 미만)을 나타낼 수 있다.
림프 계통 내의 발현을 필요로 하는 유전자 요법 응용(예컨대 RAG1/RAG2 결함, BTK 결함, X-SCID, ADA-SCID): 아마도 126T(2 표적 서열) 또는 126T/130aT(2+2 표적 서열)와 조합된 223T(2 또는 4 표적 서열).
유전자 전달 및 유전자 요법을 위한 전이유전자 발현을 위한, 렌티바이러스 벡터를 비롯한 바이러스 벡터와 같은 벡터는 HSC 및 HSPC에 내재하는 내인성 miRNA 세포에 의해 인식되도록 miRNA 표적 서열과 함께 엔지니어링되어, 세포의 서브셋에서 전이유전자 발현을 조절할 수 있다. 더욱이, miRNA 표적 서열의 조합을 사용하여 고도로 특이적인 세포 발현 패턴을 갖는 벡터를 수득할 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)]; 문헌[B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing : Essential Techniques, John Wiley & Sons]; 문헌[J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization : Principles and Practice]; 문헌[Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, Irl Press]; 문헌[D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology : DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press]; 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7)]; 문헌[Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9)]; 및 문헌[Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3]을 참조하길 바란다. 이들 일반 문서의 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 오직 예시로, 첨부된 도면에서 예시된 바와 같이 그의 바람직한 실시형태를 참조하여 추가로 기재될 것이다:
도 1. 양방향성 miRNA-조절된 렌티바이러스 리포터 벡터의 개략도. miRNA 리포터로서 녹색 형광 단백질(GFP) 및 상시(constitutively) 발현되는 정규화자(normalizer)로서 인간 저 친화성 신경 성장 인자 수용체(NGFR)의 절두(truncated)형을 함유하는 miRNA 조절된 양방향성 벡터(Bd.LV)의 대표적인 구조를 여기에 나타내었다. Bd.LV-대조군은 어떤 miRNA 표적 서열(miRT)도 함유하지 않았으며, Bd.LV-223T 및 Bd.LV-126T는 각각 miR-223 또는 miR-126에 완벽하게 상보적인 21 bp를 함유하는 4개의 연쇄 반복(tandem repeat)의 첨가에 의해 작제하였다.
도 2. 세포주에서의 miRNA 리포터 Bd.LV의 평가. a) HEK293T, U937, 및 편재성(ubiquitous) 프로모터의 조절 하에서 pri-mir-126을 함유하는 LV의 형질도입에 의하여 miR-126을 이소적으로 발현하는 HEK293T 세포(HEK293T.LV.miR-126)에서의 miR-223 및 miR-126 발현 수준(카피/pg)의 정량적 분석. b) 나타낸 miRNA 조절된 Bd.LV가 형질도입된 HEK-293T, U937, HUVEC 및 HEK293T.LV.miR-126 세포의 대표적인 FACS 분석. GFP "miRNA 리포터" 및 NGFR "정규화자" 발현에 대하여 세포를 분석한다. c) 단백질 수준 및 RNA 수준에서 리포터 유전자 발현의 miRNA-매개된 억제 배수의 계산을 위한 식. 막대그래프는 단백질 수준에서 GFP FR 값으로 계산되는 세포주 내의 miR-223 및 miR-126 활성을 나타낸다. 마름모꼴은 RNA 수준에서의 GFP FR을 나타낸다.
도 3. 생체 내에서 miRNA 리포터 BdLV의 평가. 계통-/ low 골수(BM) 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 miR-223 및 miR-126에 대한 양방향성 miRNA 리포터 렌티바이러스 벡터(BdLV)로 형질도입시키고, 수여자 마우스에 이식시켰다. miRNA 리포터를 지니는 세포가 안정적으로 생착(engraft)된 마우스의 말초 혈액 세포를 FACS로 분석하였다. a) 게이팅(gating) 전략을 사용하여 뮤린 말초 혈액으로부터 주요 백혈구 집단을 동정하였다: 과립구(CD11b+, SSChigh), 단핵구(CD11b+, SSClow), B 세포(CD19+) 및 T 세포(CD11b- CD19b-). b) 뮤린 말초 혈액 서브셋 내의 GFP 및 NGFR 발현의 대표적인 FACS 분석. c) Bd.LV-대조군(n=5), Bd.LV-223T(n=6) 또는 Bd.LV-126T(n=4) 중 어느 하나가 형질도입된 HSPC가 이식된 마우스로부터의 말초 혈액 하위집단 내의 GFP FR 값(평균 +/- SD).
도 4. (a) 계통-/ low 골수(BM) 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 양방향 miRNA 리포터 렌티바이러스 벡터(BdLV)로 형질도입시키고, 치사-조사된(lethally irradiated) 마우스에 이식하였다. BdLV는 절두된 NGFR 마커 유전자(DNGFR) 및 완벽하게 상보적인 miRNA 표적(miRT) 서열의 4개의 연쇄 반복에 의하여 특이적인 miRNA에 반응성이게 만든 불안정화된 GFP(d4GFP) 리포터를 공동-발현한다. 마우스를 이식 8-12주 후에 안락사시키고, 다수의 BM HSPC 하위집단을 나타낸 바와 같이 면역표현형확인(immunophenotyping)에 의해 예상하여 동정하였다(HSC: 조혈 줄기 세포; MPP: 다능성 전구 세포; GMLP: 과립구-단핵구-림프구 전구세포; GMP: 과립구-단핵구 전구세포; eMEP: 조기 거핵구-적혈구 전구세포; EP: 적혈구 전구체). (b) 대표적인 FACS 플롯(plot)은 (a)에 기재된 바와 같은 이식된 마우스의 BM으로부터 새로 단리된 HSPC 하위집단에서 miR-126(126T), miR-130a(130aT), miR-196b(196bT), miR-10a(10aT), miR-223(223T), miR-19a(19aT), miR-93(93T), miR-17-5p(17T) 및 let-7a (Let7aT)에 대한 리포터 BdLV 및 대조군-BdLV(miRT 부재, 또는 근육-특이적 miRT 즉 133aT)의 발현을 보여준다. 각 줄은 상술된 분화 단계의 HSPC에서의 지시된 BdLV에 대한 리포터의 대표적인 발현 패턴을 보여준다. 각각의 줄의 우측의 막대 그래프는 리포터 평균 형광 세기로부터 계산된 평균 억제 배수(FR)±sem를 보여준다(대조군: n=9; 126T: n=10; 130aT: n=4; 196bT: n=4; 10aT: n=1이어서, 통계적 해당 없음인 HSC 및 MPP1을 제외하고, n=4, 223T: n=6(그 중 5개는 eGFP 리포터가 있음); 19aT: n=3; 93T: n=2; 17T: n=3; let7aT: n=1(3마리 마우스의 풀)). 참조물질로 각각의 리포터 BdLV 그룹의 EP를 사용하여, HSPC 하위집단 간의 miRNA 활성의 통계적 비교를 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 및 본페로니(Bonferroni) 시험 후 수정에 의해 행하였다(***: p<0.001; **: 0.01>p>0.001; *:p<0.05).
도 5: 이식된 마우스로부터 단리된 다수의 세포 집단 내의 지시된 리포터 BdLV의 평균 억제 배수(FR)에 의해 측정되는 바와 같은 8개 miRNA의 조혈 활성. 계통- BM 서브셋: 도 4에 기재된 바와 같음; 계통+ BM 서브셋: 프로(Pro) B 세포: CD19+CD43+; CD43- B: CD19+CD43-; T 림프구: CD3+; 단핵구: CD11b+CD48+; 과립구: CD11b+CD48lo; 말초 혈액: 과립구: CD11b+ 측방 산란(side scatter)hi; 단핵구: CD11b+ 측방 산란lo; B 림프구: CD19+; T 림프구: CD3. (b) 4 카피의 miR-130aT 및 2 카피의 miR-126T(130a/126T; n=4 마우스)를 함유하는 조합 표적 서열을 4 카피의 miR-126T(126T; n=10 마우스) 또는 4 카피의 miR-130aT(130aT; n=4 마우스) 중 어느 하나와 비교하였다. 막대는 계통 마커 음성 골수 집단(도 4에서와 같은 범례) 및 말초 혈액 림프구에서 이들 miRT 서열에 의해 수득되는 억제 배수 ± sem을 보여준다. 130a/126T가 단독의 126T보다 HSC에서 더 나은 억제를 달성하는 한편, PB 림프구에서의 백그라운드 억제가 감소되는 것을 주목하길 바란다.
도 6: miRNA 표적 서열에 의한 자살 유전자의 발현 조절. (a) miR-142, miR-223, miR-126 또는 miR-130a에 완벽하게 상보적인 miRT 서열을 불안정화된 티미딘 키나아제(dTK) 전사체에 가하였다. 단일방향성 렌티바이러스 자살 벡터(각각의 벡터 도면의 오른쪽 절반)를 (b)를 위해 사용하는 한편, GFP 마커를 miRNA-조절된 TK에 커플링시키거나, NGFR 마커를 대조군-TK에 커플링시키는 양방향성 자살 벡터를 (c)에 사용하였다. (b) 계통-/low HSPC를 지정된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고, 반고체 배지에서 +/- 간시클로비르(GCV)에 플레이팅하였다(LV-GFP: n=2; CTRL-TK: n=8; TK-142T: n=4; TK-223T: n=6; TK-126T: n=4; TK-130aT: n=2). 10일 후에, 골수(CFU-GM, CFU-G, CFU-GM) 및 적혈구(BFU-E, CFU-E) 콜로니의 수를 계수하였다. 박스(Box) 및 휘스커스(whiskers) 플롯은 GCV가 없는 각각의 대조군 배양물 내의 콜로니 계수로 나눈, GCV를 함유하는 배양물 내의 콜로니 수를 보여준다(10-90 백분위수). 'GCV 부재' 데이터 점은 플레이팅 변산도(모든 비-GCV 처리된 배양물의 평균 콜로니 계수로 나눈, 각각의 비-GCV 처리된 배양물의 콜로니 계수; n=26)를 보여준다. GCV-처리군, LV-GFP 군에 대한 통계적 비교를 행하였다; ns, 유의미하게 다르지 않음; **, 0.001<p<0.01: ***, p<0.001. (c) CD45.1+ 마우스로부터의 계통-/low HSPC를 TK 대조군 벡터(NGFR-표시) 또는 miRNA-조절된 TK 벡터(GFP-표시; 실험 #1: TK.126T; 실험 #2: TK.142T) 중 어느 하나로 형질도입시켰다. LV.NGFR/대조군 TK- 및 LV.GFP/TK-miRT-형질도입된 세포를 1:1 비로 혼합하고, CD45.2+ 유사유전자형(congenic) 마우스에 이식시키고, 이식 3일 후에 시작하여 7일 내지 14일 동안 GCV로 처리하거나(실험 #1: n=6 마우스; 실험 #2: n=5 마우스) 미처리되게 남겨두었다(실험 #1: n=4; 실험 #2: n=3). 대표적인 FACS 플롯은 CD45.1+ 공여자 세포 내의 GFP/NGFR 키메리즘(chimerism)을 보여준다. 그래프는 7 내지 8개월 기간에 걸쳐 각각의 혈액 세포 유형에 대하여, GCV 처리된(적색) 및 미처리된(흑색) 마우스에 대한 혈액 내의 형질도입된 공여자-유래의 세포 내의 GFP-발현 세포의 부분을 보여준다. GCV 군에서 유의미하게 더 많은 세포가 GFP+이며(***: p<0.001, 이원배치분산분석(2-way Anova)), 이는 GFP/TK.126T 또는 GFP/TK.142T에 의해 형질도입된 HSC의 선택적 이점 및 자살로부터의 보호를 나타내는 것임을 주목하길 바란다. 따라서, 전이유전자에 부가되는 miR-126T 서열은 심지어 편재성 프로모터로부터 발현되는 경우에도 고도로 독성인 전이유전자로부터 야기되는 HSPC 독성을 극복하며, HSPC-기반의 유전자 요법의 안전성 및 효능을 개선시키기 위한 유의미한 가능성을 지닌다. 더욱이, 이들 결과는 miR-126이 기능적 재분포(repopulation) 검정에 의해 나타나는 바와 같이, 조혈 줄기 세포를 장기간 생착시키는데 활성이 있음을 정식으로 입증한다.
도 7: (a) 유전자 요법을 위한 miR-126 조절을 활용하는 것의 안전성을 다루기 위하여, 예시된 LV의 접합자의 위란강으로의 미세주입(microinjection)에 의하여, miR-126 리포터(Tg.126T)를 함유하는 트랜스제닉 마우스 라인을 생성하였다. 젊은 성체 트랜스제닉 마우스의 골수의 FACS 분석으로, GFP 발현이 Kit+Sca+ 계통 마커-(KSL) 세포(히스토그램 플롯에서 청색 그래프)에서 가장 낮은 한편, GFP 발현이 Kit+Sca-Lin- 전구세포에서 시작되었음(히스토그램 플롯에서 흑색 및 적색 그래프)이 증명되었다. Tg.126T 마우스 및 대조군 GFP 트랜스제닉 마우스의 GFP MFI를 측정하여, 지정된 HSPC 하위집단에서 miR-126 리포터의 FR을 계산하였다(평균 ± sem, n=10 Tg.126T 마우스; EP에 비하여 ***: p<0.001; **: 0.01>p>0.001). (b) miR-126에 대한 2개의 낙아웃 대립형질을 지니는 마우스가 혈관신생 결함에 기인하여 유의미한 배아 치사율을 나타내는 반면, 본 발명자들의 Tg.126T 콜로니의 사육은 정상의 산자수(litter size) 및 부모 세대 중 하나를 반영하는 새끼에서의 예상되는 벡터 카피수(VCN) 분포를 야기하며, 이는 PGK 프로모터로부터의 miR-126T 서열의 적당한 발현이 발생 중에 천연 miR-126 표적의 조절을 간섭하지 않음을 시사한다. (c) CD45.2+ Tg126T 마우스 및 CD45.1+ 야생형(WT) 마우스로부터의 BM 세포를 CD117에 대한 양성의 선별에 의하여 HSPC에 대해 농축시키고, 치사선량 조사된 CD45.2+ 수여자(n=4)로 경쟁적으로 이식시켰다(1:1 비). 이식된 마우스를 규칙적인 간격으로 채혈하였으며, 다양한 말초 혈액 세포 계통에서 CD45.1/CD45.2 키메리즘이 결정되었다(과립구: CD11b+ 측방 산란hi; 단핵구: CD11b+ 측방 산란low; B 세포: CD19+; T 세포: CD3+). 이들 데이터는 miR-126 조절을 안전하게 이용하기 위한 편리한 치료적 윈도우가 있음을 나타낸다.
도 8: (a) CD34+ HSPC를 인간 제대혈(CB)로부터 정제하고, 대조군-BdLV(대조군), 또는 miR-126 (126T), miR-130a(130aT) 또는 miR-223(223T)(n=3 그룹당 생물학적 중복물)에 대한 miRNA 리포터 BdLV로 형질도입시켰다. 세포를 단기간의 HSPC의 유지를 지지하는 조건 하에 액체 배양으로 유지시키고, CD34+CD38- HSPC 및 CD34+CD38+ 전구세포에서 유전자도입 2일 후에, BdLV 마커 발현을 측정하였다(좌측의 첫번째 2개 컬럼). 그 다음, 세포를 6일 동안 액체 배지(CD34-CD38+ 세포; 중간의 컬럼), 또는 16일 동안 반고체 배지(CD13+ 골수 세포, CD235+ 적혈구 세포) 중 어느 하나에서 분화시켰다. 대표적인 FACS 플롯을 나타내었다. 하부의 막대 그래프는 각각의 하위집단 내의 miR-126, miR-130a 및 miR-223 활성의 정량화를 보여준다(n=3; 평균 억제 배수 +/- sem; **, 0.001<p<0.01: ***, p<0.001). (b) 제대혈 CD34+ 세포를 대조군- 또는 miR-223(TK-223T) 또는 miR-126(TK-126T, 또한 도 2 참고)에 대한 miRNA 표적 서열을 함유하는 miRNA 조절된 양방향성 자살 벡터로 형질도입시키고, 프로-드럭(pro-drug) GCV의 존재 또는 부재 하에서 4벌로 CFC 검정에서 플레이팅하였다. GFP+ 적혈구(CFU-E, BFU-E) 또는 골수(CFU-G, CFU-M, CFU-GM) 콜로니의 수를 플레이팅하고 14일 후에 계수하고, 'GCV 부재' 배양물에서 계수된 수로 정규화시켰다. 박스 및 휘스커스 플롯은 10-90 백분위수를 나타낸다. GCV는 CTR-TK 형질도입된 콜로니의 성장을 완전하게 방지한다. (c) miR-126T 및 miR-130aT 서열(각각 4+4 및 2+2 연쇄 반복)의 조합뿐 아니라 2 연쇄 반복의 단독의 miR-126T를 각각 4 연쇄 반복의 miR-126T 또는 miR-130aT를 사용하는 표준 miRT 설계와 비교하였다. 인간 제대혈 세포를 각각의 리포터 BdLV로 형질도입시키고, 형질도입한지 2일 후에, 원시 줄기/전구세포 구획(CD34+CD38-) 및 전구세포 구획(CD34+CD38+)에서 뿐 아니라, 형질도입한지 10 내지 14일 후에, 골수 자손(CD13+) 및 적혈구 자손(CD235+)에서 리포터의 억제 배수를 결정하였다. 126T(4 표적), 126T/130aT(4+4 표적) 및 126T/130aT(2+2 표적)는 줄기/전구세포 구획에서 균등하게 잘 억제한다. 그러나, 126T/130aT(4+4 표적)는 골수 자손에서 더 높은 백그라운드 억제 활성을 갖는다. (d) G-CSF 유도된 시험관 내 분화 시의 원시 구획(C에서와 같음) 및 후기 골수 분화 단계(골수구: CD11b+/CD16-; 후골수구: CD11b+/CD16+/SSClow; 과립구: CD11b+/CD16+/SSChigh)에서의 126T(4 표적), 126T/130aT(2+2 표적) 및 126T(2 표적)의 억제 활성. 배양물로부터의 마이-그루발트/김자(May-Gruewald/Giemsa) 염색된 사이토스핀(cytospin) 샘플에서 분화 단계를 입증하였다. CD34+/CD38- 줄기/다능성 구획에서의 각각의 miRT의 억제 배수를 후골수구에서의 억제 배수로 나눔으로써 조절 인덱스(우측 그래프)를 계산하였다. 골수 자손에서 전이유전자 발현의 최적의 "방출"은 126T(2 표적)에 의해 수득되었으나, 줄기/전구세포 구획에서의 억제는 -130aT(4 표적)와 유사하게- 126T(4 표적) 및 126T/130aT(2+2 표적)에 비해 약간 더 적었다. 후자의 2개의 표적 서열에 관하여, 126T/130aT(2+2 표적)는 126T(4 표적)에 대해 바람직하였는데, 이는 이것이 가장 큰 조절 인덱스를 제공하기 때문이다. 더욱이, 전이유전자 하향조절은 2개의 독립적인 miRNA에 의해 보장되며, 내인성 miRNA 조절의 간섭 위험이 추가로 감소되어, miRT의 안전성 및 효능을 증가시킨다.
도 9. HSPC에서의 리소좀 효소 과-발현. LV 형질도입 시의 mHSPC(A) 및 hHSPC(B)에서의, 야생형에 대해 정규화된 효소 발현 수준. GALC 발현은 ARSA 및 IDUA에 비해 유의미하게 더 낮았다.
도 10. LV-매개의 GALC 발현 시의 뮤린(murine) HSPC의 손상된 기능. (a) GALC 및 대조군 LV가 형질도입된 mHSPC 상에서의 CFC 검정. 콜로니/플레이트의 수(#)(좌측 Y 축, 막대)를 계수하고, 통합된 LV 카피/세포(VCN)의 수(우측 Y 축, 점)의 수를 측정하였다. GALC.LV 형질도입된 -/- mHSPC(n = 12 독립적 실험)는 GFP.LV(n = 10) 및 ARSA.LV(n = 8) 형질도입된 세포에 비해 유의미하게 더 낮은 수의 콜로니를 생성하였다. 이러한 손상은 mHSPC가 mir142T GALC.LV(n = 6)로 형질도입되었을 때는 관찰되지 않았다. * 콜로니/플레이트 및 VCN 둘 모두의 수에 대한 일원배치분산분석에서 p<0.001. 평균값 ± SD를 나타내었다. 유사한 결과가 -/- 및 +/+ mHSPC로 수득되었다. (b) 형질도입된 mHSPC상에서 측정된 GALC 활성. GALC.LV 형질도입 후에, GALC -/-(하기에는 -/-)(n = 5) 및 GALC +/+(하기에는 +/+)(n = 5) mHSPC는 GALC 활성에서 야생형 수준(GFP.LV가 형질도입된 +/+ mHSPC, n = 5)을 초과하여 2배 증가를 보였다. mir142 조절된 GALC.LV(mir142T)(n = 3)로 형질도입된 mHSPC에서는 활성의 증가가 검출되지 않았다.
도 11. LV-매개의 GALC 발현 시의 인간 HSPC의 손상된 기능. (a) GALC 및 대조군 LV가 형질도입된 hHSPC 상에서의 CFC 검정. 콜로니/플레이트의 수(#)(좌측 Y 축, 막대)를 계수하고, 통합된 LV 카피/세포(VCN)의 수(우측 Y 축, 점)의 수를 측정하였다. GALC.LV 형질도입된 정상 공여자(n.d.)(n = 4) 및 GLD hHSPC(n = 4)는 대조군 세포(n = 5)에 비해 유의미한 콜로니 형성 손상을 보여주었으며, 이는 mir142T GALC.LV 형질도입(n = 4) 후에는 관찰되지 않았다. GALC.LV 형질도입된 hHSPC로부터 수득된 콜로니는 GFP/ARSA/GALCmir142T.LV 대조군과 비교할 때 유의하게 더 낮은 벡터 함유량을 보여주었다. * 콜로니/플레이트 및 VCN 둘 모두의 수에 대한 일원배치분산분석에서 p<0.001. 평균값 ± SD를 나타내었다. (b) 형질도입된 hHSPC상에서 측정된 GALC 활성. GALC.LV 형질도입은 GLD hHSPC(n = 3)에서 정상 공여자 수준으로 GALC 활성의 재구성을 가능하게 하였으나, 정상 공여자 hHSPC(CB에 대해서는 n = 4 및 BM에 대해서는 n = 3)의 형질도입은 GFP.LV 형질도입된 수준(n = 3)을 초과하는 효소의 과발현을 야기하였다. mir142 조절된 GALC.LV(mir142T)(n = 3)로 형질도입된 hHSPC에서는 활성의 증가가 검출되지 않았다.
도 12. HSCT 시의 twi 마우스의 생존. (a) GFP.LV 및 GALC.LV의 개략도. (b) HSCT를 받은 twi 마우스의 평균 생존. 전체 BM(TBM)(n = 12) 또는 GFP.LV 형질도입된 +1+ mHSPC 및 형질도입되지 않은 Scal-전구세포(GFP.LV +1+ Lin- & +1+ Scal-, n = 7) 또는 GFP.LV 형질도입된 +1+ mHSPC 및 GFP.LV 형질도입된 Scal-전구세포(GFP.LV +1+ Lin- & GFP.LV +1+ Scal-, n = 5)를 이식한 twi 마우스에서는 미처리 대조군(UT)(n = 10)에 비해 더 긴 생존을 달성하였다. GFP.LV 형질도입된 -I- mHSPC 및 +1+ Scal-전구세포(n = 7)를 받은 마우스는 TBM 또는 +1+ Lin- & Scal- 이식된 마우스에 비해 유의미하게 더 높은 수명을 보여주었다. 반면, GALC.LV 형질도입된 -I- Lin- & -I- Scal-(n = 13)의 이식은 수명의 연장을 야기하지 않았다. 대조군: GFP.LV 형질도입된 +1+ HSPC(+1+ Lin-)를 이식한 마우스(n = 10); GFP.LV 형질도입된 +1+ Scal- 전구세포(n = 8)를 이식한 마우스. * 일원배치분산분석에서 p<0.01. (C) GFP.LV 형질도입된 +1+ mHSPC 및 Scal- 전구세포를 이식한 twi 마우스의 말초 혈액에서의 GFP+ 생착된 세포의 백분율을 나타내는 대표적인 플롯.
도 13. FVB/twi 마우스에서 mHSPC의 손상된 생체 내 기능. 지시된 바와 같은, mHSPC 이식을 받은 마우스의 평균 수명. GFP.LV 형질도입된 +/+ mHSPC(n = 11)를 이식한 -/- 마우스는 미처리 대조군(UT)에 비해 더 긴 생존을 달성하였으나; 반면, GALC.LV 형질도입된 -/- mHSPC를 이식한 -/-(n = 9) 및 +/-(°)(n = 5) 마우스는 치사선량 조사 후에 생존하지 않았다. 표 2. 열거된 mHSPC(GALC.LV 또는 GFP.LV로 형질도입된)를 이식한 -/- 또는 +/- 마우스의 BM에서 이식 20일 후 및 120일 후(n = 3 시점)에 검출된 평균 VCN SD. (°)+/- 숙주. (§) +/+ mHSPC를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다.
도 14. GALC를 발현하는 뮤린 및 인간 HSPC의 아폽토시스. (a-b) 유전자 전달 2일 후 및 5일 후에, -/- mHSPC(좌측) 및 hHSPC(우측)(정상 공여자 CB 및 GLD BM으로부터)에서의 TUNEL 검정. 유핵 세포의 전체 수에 대한 TUNEL+핵의 백분율을 기록하였다. 8개의 필드(field) 및 100개의 세포가 계수된 조건이었다. +/+ mHSPC를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. (a) GALC.LV 형질도입된 m- 및 hHSPC의 대부분은 형질도입 후 2일 및 5일째 둘 모두에서 TUNEL 양성이었다. (b) 지정된 LV로의 형질도입 2일 후의, m- 및 hHSPC 상에서 핵에 대한 TUNEL 검정(적색) 및 ToPro(TPIII, 청색) 염색: 대표 이미지(이미지를 3-레이저 공초점 현미경(Radiance 2100, BioRad)으로 수집하였고; 단일의 광학 섹션으로부터의 형광 신호를 연속적으로 획득하고, 어도브 포토샵(Adobe Photoshop) CS 소프트웨어로 분석하였음; 배율 100x). (c) m-(상부 패널)(-/- 공여자 마우스로부터의) 및 hHSPC(하부 패널)(정상 공여자 CB로부터의) 상에서의 아넥신 V 염색의 세포형광측정(Cytofluorimetric) 분석. 아폽토시스 세포의 부분이 GFP-형질도입된 대조군에 비해 GALC.LV 형질도입된 mHSPC 및 hHSPC에서 더 높다. CMT = 캄프토테신 처리된 양성 대조군. FACS Calibur 2, 벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson)을 사용하여 수집을 수행하였다. 10,000개 이상의 사건을 점수화하였으며, 데이터를 플로우조(FlowJo) 8.5.3 소프웨어로 처리하였다. -/- mHSPC 및 정상 공여자 CB(및 TUNEL에 대하여 GLD BM)로부터의 데이터를 나타내었으나, -/- 세포에 비해 +/+ mHSPC의 GALC 형질도입 후, 그리고 CB 세포에 비해 정상 공여자 BM(TUNEL 및 아넥신 V) 및 GLD BM(아넥신 V) hHSPC에서 유사한 관찰을 얻었다.
도 15. IGF1 처리는 GALC 발현 HSPC의 아폽토시스를 방지한다. (a) IGF1으로 처리되거나, 이로 처리되지 않은 GALC.LV 및 ARSA.LV 형질도입된 mHSPC상에서의 CFC 검정. 콜로니/플레이트의 수(#)(좌측 Y 축, 막대)를 계수하고, 통합된 렌티바이러스 카피/세포(VCN)의 수(우측 Y 축, 점)의 수를 측정하였다. IGF 1 처리는 GALC.LV 형질도입된 미처리 세포(n = 4 독립적 실험)에 비해 더 많은 수의 콜로니의 성장을 유도하였다. 항-아폽토시스 처리 시에, GALC.LV 형질도입된 세포의 VCN은 ARSA.LV 형질도입된 대조군 세포의 VCN에 가까웠다(CFC 수 및 VCN 일원배치분산분석 둘 모두에 대하여: * = 처리된 GALC 형질도입된 mHSPC와 미처리된 GALC.LV 형질도입된 세포의 비교에 대해서는 p<0.001; 처리된 GALC.LV 형질도입된 mHSPC와 ARSA.LV 형질도입된 세포의 비교에 대해서는 p>0.05). (b) 처리된 mHSPC로부터 성장한 콜로니는 또한 크기의 증가를 나타내었다(우측에 도시, 배율 5x). (c) IGF 1으로 처리되거나 처리되지 않은 GALC.LV 및 ARSA.LV-형질도입된 mHSPC상에서의 TUNEL 검정. 8개의 필드 및 100개의 세포가 계수된 조건이었다. 처리된 대부분의 세포는 TUNEL에 대해 음성이었다(일원배치분산분석: 미처리된 GALC.LV 형질도입된 세포와의 비교에 대해서는 p<0.001; ARSA.LV 형질도입된 세포와의 비교에 대해서는 p>0.05). (d) -/- 또는 +/+ 마우스로부터의 형질도입된 mHSPC상에서 측정된 GALC 활성. IGF1 처리는 형질도입된 미처리 대조군(n = 6)에 비해, GALC 발현 수준(n = 3)에 유의미하게 영향을 미치지 않았다. 평균값 SD를 나타내었다.
도 16. 형질도입된 세포에서의 카텝신 D 활성화의 분석. 지정된 바와 같이, 유전자 전달 후 상이한 간격으로 GFP.LV 또는 GALC.LV 형질도입된 mHSPC 및 U937 세포상에서의 카텝신 D에 대한 웨스턴 블롯 분석. 활성화된 형태는 화살표로 나타낸 바와 같이, 30kDa 막 결합 아이소형에 상응한다. 유전자 전달 후에, GFP.LV 형질도입된 세포에 비해 GALC.LV 형질도입된 세포에서 카텝신 D의 활성 형태의 유의미한 축적이 관찰되지 않았다. 전구체(48kDa, 화살표)는 배양 7일 후에 GFP-형질도입된 세포에서 축적되었으나(GFP 7일), GALC의 존재 하에서 전구체의 축적은 덜 표명되었으며(GALC 5일), 7일 후에는 전구체 및 성숙 형태 둘 모두의 소실로 끝이 났다. 항 -액틴을 단백질 로딩(loading)을 위한 대조군으로 사용하였다.
도 17. 상이한 세포 유형에서의 기저 GALC 활성. 기저 GALC 활성을 야생형 mHSPC 수준으로 정규화시켰다. 일차 야생형 희소돌기아교세포(n = 4) 및 미세아교세포(n = 4) 둘 모두는 mHSPC에 비해 더 높은 GALC 활성을 나타내었다.
도 18. 골수 세포에서의 GALC 드 노보(de novo) 발현에 대한 감수성. (A) 형질도입 5일 후에, (a) 인간 단핵구, (b) 인간 단핵 세포주 U, (c) 뮤린 대식구 및 (d) 뮤린 미세아교세포에서 수행한 TUNEL 검정(전체 유핵 세포에 대한 TUNEL+ 세포%, 좌측 Y 축, 막대), GALC 활성 결정(우측 Y 축, 점) 및 가능한 경우 전용의 염색으로부터의 결과. 모든 시험 조건에서, 효율적인 형질도입((c)에서 대식구상에서의 항-HA 염색으로 평가) 및 모든 다른 샘플(ARSA.LV- 또는 GFP.LV-형질도입된 세포)에서 기저 수준을 초과하여 지속된 GALC 발현에도 불구하고, TUNEL 염색은 적은 아폽토시스의 발생/아폽토시스 미발생(조건당 6개 이상의 필드 및 250개 이상의 세포를 계수하였다)이 수득되었음을 증명하였다. 평균값 ± SD를 나타내었다. (c 및 d) GALC/GALC-HA.LV 또는 GFP.LV 형질도입된 대식구(c) 및 미세아교세포(d)에서의 TUNEL 검정의 대표 이미지. 이미지를 3-레이저 공초점 현미경(Radiance 2100, BioRad)으로 수집하였다. 단일의 광학 섹션으로부터의 형광 신호를 연속적으로 획득하고, 어도브 포토샵 CS 소프트웨어로 분석하였다. 배율: c에서는 80x, d에서는 100x.
도 19. 림프구에서의 GALC 드 노보 발현에 대한 감수성. 형질도입 5일 후에, T 및 B 림프구에서 수행한 TUNEL 검정(전체 유핵 세포에 대한 TUNEL+ 세포%, 좌측 Y 축, 막대), GALC 활성 결정(우측 Y 축, 점)으로부터의 결과. 효율적인 형질도입에도 불구하고(기저 수준을 초과하는 지속된 GALC 발현 참고), TUNEL 염색은 적은 아폽토시스의 발생/아폽토시스 미발생을 나타냈다(조건당 6개 이상의 필드 및 250개 이상의 세포를 계수하였다). 평균값 ± SD를 나타내었다.
도 20. 희소돌기아교세포에서의 GALC 드 노보 발현에 대한 감수성. (a) 형질도입 5일 후에 수행한 TUNEL 검정(전체 유핵 세포에 대한 TUNEL+ 세포%, 좌측 Y 축, 막대), GALC 활성 결정(우측 Y 축, 점). 효율적인 형질도입에도 불구하고(기저 수준을 초과하는 지속된 GALC 발현 참고), TUNEL 염색은 적은 아폽토시스의 발생/아폽토시스 미발생을 나타냈다(조건당 6개 이상의 필드 및 250개 이상의 세포를 계수하였다). 평균값 ± SD를 나타내었다. (b) GALC.LV 또는 GFP.LV 형질도입된 희소돌기아교세포에서의 TUNEL 검정의 대표 이미지. 희소돌기아교세포 제제의 순도를 미-형질도입 세포(UT) 상에서의 NG2 및 Gal-Cer 염색에 의해 입증하고, 미세아교세포를 GALC.LV-형질도입된 세포상에서 F4/80으로 염색하고; ToPro(TPIII)를 사용하여 핵을 염색하였다. 이미지를 3-레이저 공초점 현미경(Radiance 2100, BioRad)으로 수집하였다. 단일의 광학 섹션으로부터의 형광 신호를 연속적으로 획득하고, 어도브 포토샵 CS 소프트웨어로 분석하였다. 배율: 40x.
도 21. miRNA 126에 의한 GALC 발현의 조절. (a) GALC.miRNA126Tag.LV의 개략도. (b-c) GALC.miRNA126Tag.LV(GALC.126miT), 또는 GALC.LV 또는 GFP.miRNA126Tag.LV로 형질도입된 -I- mHSPC 상에서 수행한 GALC 활성 검정 및 CFC 검정. (b) 활성을 +1+ 수준(첫번째 막대)에 대해 정규화시켰다. GALC.miRNA126Tag.LV를 형질도입한 세포는 상위생리학적(supraphysiological) 수준으로 GALC를 과발현한다. (c) 콜로니/플레이트의 수(#)(좌측 Y 축, 막대)를 계수하고, 통합된 렌티바이러스 벡터 카피/세포(VCN)의 수(우측 Y 축, 점)를 측정하였다. miRNA126에 의한 GALC 발현의 억제는 GALC.LV 형질도입된 세포에 비해 더 많은 콜로니 수의 성장을 가능하게 하였다(n = 4 독립적인 실험). * 일원배치분산분석에서 p<0.01.
도 22. GALC 발현의 miRNA126 조절은 mHSPC의 아폽토시스를 막는다. (a) GALC.miRNA126Tag.LV 또는 GALC.LV 및 GFP.miRNA126Tag.LV-형질도입된 mHSPC에서의 TUNEL 검정. 조건당 8개 이상의 필드 및 100개 이상의 세포를 계수하였다. GALC.miRNA126Tag.LV 형질도입된 대부분의 세포는 TUNEL에 대해 음성이었다. (b) 형질도입 5일 후의 GALC.miRNAl26Tag.LV 또는 GALC.LV 형질도입된 mHSPC-/-상의 핵에 대한 TUNEL 검정(적색) 및 ToPro(TPIII, 청색) 염색: 대표적인 이미지(이미지를 3-레이저 공초점 현미경(Radiance 2100, BioRad)으로 수집하고; 단일의 광학 섹션으로부터의 형광 신호를 연속적으로 획득하고, 어도브 포토샵 CS 소프트웨어로 분석하였다; 배율 40x).
도 23. HSPC에서 드 노보 GALC 발현의 독성 및 miR-126 조절에 의한 구출. 지정된 LV(a)를 사용하여, Galc-/-(-/-) 및 야생형(+/+) 마우스뿐 아니라 각각 정상 공여자로부터의 제대혈(CB) 및 골수(BM)로부터 수득된 뮤린 및 인간 HSPC를 형질도입시켰다. GALC 활성(b) 및 벡터 카피수(VCN)(c)를 형질도입된 뮤린(상부 패널) 및 인간(하부 패널) HSPC의 시험관 내 배양 자손에서 측정하였다(-/- 및 +/+ HSPC로부터의 풀링된 데이터를 상부 패널 c에 나타냄). (d) 뮤린 -/-(상부 패널) 및 인간(하부 패널) HSPC 상에서 지정된 LV로의 형질도입 마지막에 수행된 클론형성(clonogenic) 검정(CFC)으로부터 검색한 콜로니의 수(#)를 기록한다. (e) TUNEL 검정을 뮤린 -/- HSPC(상부 패널) 및 정상 공여자의 CB 및 BM으로부터의 CD34+ 세포(하부 패널)상에서 지정된 LV로의 형질도입 2일 후에 수행하였다. 형질도입된 세포 간의 아폽토시스의 빈도를 평가하였다(TUNEL+ 세포%). 각각의 점은 개별 샘플(b-e)을 나타낸다. e에서, 각 샘플에 대하여 8개 이상의 필드 및 100개 이상의 세포를 계수하였다. *: p<0.05 **: p<0.01; ***: p<0.001. (f) GFP LV- 및 GALC LV-형질도입된 HSPC상에서의 대표적인 TUNEL 염색을 나타내었다. 배율: 100X.
도 24. HSC 유전자 요법 후에 GLD 마우스의 생존 향상.
Galc-/- 또는 +/+ 뮤린 HSPC를 지정된 벡터로 형질도입시키고, (a)에서의 실험 계획에 따라 이식 마우스에 정맥내로 이식하였다. 120일 또는 사멸시에, 이식된 마우스의 BM에서 검출된 GFP+ 세포 또는 VCN의 백분율(± SD)로서 측정된, 평균 생존 ± SD 및 형질도입된 세포의 평균 생착을 나타내었다(그룹당 n = 4-26). (§) +/+ mHSPC를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 미처리 GLD 마우스의 생존을 첫번째 줄에 나타내었다(* = 비-조사된; n.a. = 해당 없음). (b) 인간 일차 단핵구, B 및 T 림프구 및 뮤린 미세아교세포를 지정된 벡터로 형질도입시켰다. GALC 활성(미형질도입 세포-UT에 대한 배수로서 표현)을 형질도입 후 5일을 넘어서, 배양된 세포상에서 측정하였고(가운데 패널), TUNEL 검정(TUNEL+ 세포%로 표현)을 형질도입 2일 후에 수행하였다(우측 패널). 비교를 위하여, GALC-형질도입된 뮤린 및 인간 HSPC로부터의 데이터(도 5로부터의) 및 GFP-형질도입된 미세아교세포에서의 TUNEL+ 세포%를 기록하였다. 각 점은 개별 샘플을 나타내며, 여기서, 6개 이상의 필드 및 250개 이상의 세포를 계수하였다. (c) 지정된 바와 같이, GALC LV 또는 GFP LV로 형질도입된 미세아교세포상에서 미세아교세포 마커 F4/80(GALC 형질도입된 세포) 또는 GFP로 염색한 TUNEL 염색의 대표 이미지. 핵을 ToproIII(TPIII)으로 표지하였다. 배율 100X. (d) GALC-126T LV로 형질도입된 Galc-/- HSPC(n = 26) 또는 GFP LV로 형질도입된 Galc+/+ HSPC(n = 10) 중 어느 하나를 이식한 이식 마우스 및 미처리 이환 대조군(UT)(n = 15)의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선. 쌍대(pair wise) 비교를 위한 로그 순위 시험(log rank test)에서의 GALC-126T 대 GFP: p=0.002; GALC-126 대 UT: p<0.0001. (e) GALC-126T 이식된 마우스를 사멸시의 전체 BM 세포상에서 측정된 VCN에 따라 2개의 그룹으로 나누었다. BM 세포에서 5개의 LV 카피보다 더 적게(평균±SD = 67±13일) 또는 더 많이(평균±SD = 117±43일) 지니는 동물에 대한 생존을 나타내었으며, 처리된 마우스의 전체 집단의 BM에서 평균 5의 VCN이 측정되었다. (f-i) GALC 활성(밝은 청색)을 GALC-126T 이식된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 뇌 섹션 상에서 정성적으로 평가하였다. GALC-126T 이식된 마우스의 해마(f, g) 및 교뇌(h, i)로부터의 대표적인 섹션을 야생형 및 미처리 이식 마우스와 비교하여 나타내었다. GALC 검정을 미세아교세포/대식구 Iba1 마커(f, g) 및 조혈 마커 CD45(h, i)와 커플링시켰다. 활성화된 조혈 세포의 뚜렷한 침윤이 미처리 및 GALC-126T 이식된 이식 마우스에서 나타났으며, 후자는 형질도입된 HSPC 조혈 자손(g 및 i에서 화살촉(arrowhead)은 GALC[청색], 및 갈색으로 Iba1[g] 및 CD45[i]의 공동-염색을 나타냄) 및 Iba1-, CD45- 비-조혈 세포 둘 모두에서 GALC 활성을 나타내었다. 배율: (f, h)에서는 20x 및 (g, i)에서는 40x.
마이크로RNA(miRNA)
유전적 정보가 DNA로부터 mRNA로, 단백질로 흐른다는 것은 오랫동안 생물학의 중심 원리였다. 다시 말하면, 유전자는 단백질을 코딩하고, 그 단백질은 유전자 발현 프로그램의 조절을 비롯한 모든 세포 기능을 이행하는 것으로 가정되었다. 그러나, 고등 진핵생물에서는 소수의 RNA 전사체(2-3%)만이 단백질을 코딩하기에, 단백질이 세포 기능의 유일한 이펙터(effector)라는 중심 원리에 의문이 제기되었다(Mercer et al., 2009). 사실상, "마이크로RNA"로 불리는 비-코딩 소 RNA의 분류가 유전자 발현의 조절에서 근본적인 역할을 수행한다는 새로 밝혀진 증거가 있다. 마이크로RNA(miRNA)는 (Biffi et al., 2004; Sadelain M., 2006; Sadelain et al., 2005; Gaziev et al., 2005; Yesilipek MA., 2006; Abonour et al., 2000) 뉴클레오티드 길이이며, RNA 간섭(RNAi, 하기 참조)으로 불리는 과정을 촉발시킴으로써 전사후 수준에서 유전자 발현을 음성적으로 조절하는 비-코딩 RNA이다(Bartel DP., 2004). 마이크로RNA는 먼저 케노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서 lin-4 및 let-7의 형태로 관찰되었으며, 이들은 유충 발생 시기를 조절하는 것으로 관찰되었다(Lee et al., 1993; Reinhart et al.,2000). 이러한 관찰은 고등 진핵생물에서 유전자 발현을 조절하는 유사한 비-코딩 RNA에 대한 검색을 이끌었다. 모든 유기체가 miRNA를 발현하고, 이중 다수가 종들 간에 계통 발생적으로 보존된다는 발견은 생물학 분야에서 대변혁으로 여겨졌다. 참조 마이크로RNA 데이터베이스(http://microrna.sanger.ac.uk/)에 따라, 작성시에는 인간에서 695개의 상이한 miRNA가 동정되었다. 마이크로RNA는 발생, 분화, 증식 및 아폽토시스를 비롯한 거의 모든 생물학적 과정에 연루된다(Xiao and Rajewsky, 2009). 또한, 이들은 암, 심부전 및 대사 장애와 같은 질환에서 중요한 역할을 수행한다(Xiao et al., 2009; Divaka et al., 2008; Krutzfeldt et al., 2006).
마이크로RNA 유전자는 Y 염색체를 제외한 모든 인간 염색체 도처에 산재되어 있다. 이들은 게놈의 비-코딩 영역에 또는 단백질-코딩 유전자의 인트론 내에 위치할 수 있다. 대략 50%의 miRNA가 클러스터로 나타나며, 이는 폴리시스트론 일차 전사체로 전사된다(Lagos-Quintana et al., 2003). 단백질-코딩 유전자와 유사하게, miRNA는 통상 중합효소-II 프로모터로부터 전사되어, 소위 일차 miRNA 전사체(pri-miRNA)를 생성한다. 그 다음, pri-miRNA는 일련의 뉴클레오티드 내부 분해(endonucleolytic) 절단 단계를 통해 처리되며, 이 단계는 RNAse III형 패밀리에 속하는 2개의 효소, 즉 드로샤(Drosha) 및 다이서(Dicer)에 의해 수행된다. pri-miRNA로부터, miRNA 전구체(pre-miRNA)로 불리우는 약 60개 뉴클레오티드 길이의 스템 루프(stem loop)는 드로샤 및 디조지 증후군(DiGeorge syndrome) 중요 영역 유전자(DGCR8)로 이루어진 특이적 핵 복합체에 의해 절단되며, 이는 일차 스템 루프의 베이스 근처에서 2개의 가닥을 자르고, 5' 포스페이트 및 2 bp 길이의 3' 오버행(overhang)을 남긴다. 그 다음, pre-miRNA는 RAN-GTP 및 엑스포틴(Exportin)-에 의해 핵에서 세포질로 활발히 수송된다(Yi et al., 2003; Lund et al., 2004). 그 다음, 다이서는 드로샤 컷에 의해 규정되지 않은 스템 루프의 말단에서 이중 가닥 절단을 수행하여, 19-24 bp 듀플렉스(duplex)를 생성하며, 이러한 듀플렉스는 성숙 miRNA 및 miRNA*로 불리우는 듀플렉스의 대향 가닥으로 이루어진다(Bartel DP., 2004). 열역학적 비대칭 법칙(thermodynamic asymmetry rule)에 따라, 듀플렉스의 오직 하나의 가닥은 선택적으로 RNA-유도된 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex; RISC)에 로딩되고, 성숙 마이크로RNA로서 축적된다. 이러한 가닥은 통상 siRNA 듀플렉스의 각각의 가닥의 5'말단으로 도입한 단일-뉴클레오티드 미스매치(mismatch)에 의해서 입증되는 바와 같이 5' 말단이 그의 상보체와 덜 단단히 쌍을 이루는 것이다(Tomari et al.,2005). 그러나, 듀플렉스 가닥 둘 모두의 유사한 정도로의 축적을 지지하는 일부 miRNA가 있다(Schwarz et al.,2003).
마이크로RNA는 실험상의 유전자 낙다운(knockdown)에 널리 사용되는 작은 간섭 RNA(siRNA)와 대단히 유사하게 RNAi를 촉발시킨다. miRNA와 siRNA 간의 주요한 차이점은 그들의 생체내 생성(biogenesis)이다. 일단 RISC에 로딩되면, 작은 RNA 분자의 가이드(guide) 가닥은 단백질-코딩 유전자의 3' 미번역 영역(3'UTR)에서 우선적으로 관찰되는 mRNA 표적 서열과 상호작용한다. 이는 miRNA의 5' 말단으로부터 카운팅한 뉴클레오티드 2 내지 8개, 소위 씨드(seed) 서열이 RNAi를 촉발시키는데 필수적임을 보여준다(Brennecke et al., 2005). 전체 가이드 가닥 서열이 mRNA 표적에 완벽하게 상보성이 있다면, 보통 siRNA 및 식물 miRNA의 경우에서와 같이, mRNA는 RNA-유도된 침묵화 복합체(RISC)로의 작은 RNA 듀플렉스의 "슬라이서(slicer)"로도 불리는 아르고너트(Argonaute; Ago) 단백질의 개입에 의해 뉴클레오티드 내부 분해로 절단된다. DGRC(디조지 증후군 중요 영역 유전자 8) 및 TRBP(TAR (HIV) RNA 결합 단백질 2)는 각각 드로샤 및 다이서 RNase III 효소에 의한 성숙 miRNA 생체내 생성을 용이하게 하는 이중-가닥 RNA-결합 단백질이다. miRNA 듀플렉스의 가이드 가닥은 이펙터 복합체 RISC로 도입되며, 이는 불완전한 염기-페어링(pairing)을 통하여 특이적인 표적을 인식하며, 전사-후 유전자 침묵화를 유도한다. 이러한 조절 모드에 대해서 몇몇 메커니즘이 제안되었다: miRNA는 전사 개시의 억제를 유도할 수 있고, 탈아데닐화(deadenylation)에 의한 분해에 대하여 표적 mRNA를 표시하거나, 표적을 세포질 P-바디(body)로 격리시킬 수 있다.
반면, 씨드가 표적 mRNA에 완벽하게 상보성이 있으나, 남아있는 염기가 불완전한 페어링을 보인다면, RNAi는 다수의 메커니즘을 통해 작용하여, 번역 억제를 야기한다(Bartel DP., 2004; Pillai RS., 2005; Bartel DP., 2009). 진핵세포 mRNA 분해는 주로 mRNA의 3' 말단에서의 폴리A 테일(tail)의 단축 및 5' 말단에서의 탈-캡핑(de-capping)에 이어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해 및 mRNA 붕괴 경로의 구성성분이 풍부한 분리된 세포질 영역, 소위, P-바디에서의 miRNA의 축적을 통해 발생한다(Lui et al.,2005).
본 발명에 유용한 miRNA는 조혈 줄기 및/또는 전구 세포에서 발현되나, 분화된 세포에서는 널리 발현되지 않는 miRNA이다. 바람직한 예에는 mir-130a, mir-126 및 mir-223이 포함된다. 다른 적합한 마이크로RNA에는 배아 줄기 세포 및 소위 iPS 세포에서 발현되는 마이크로RNA가 포함된다. 예를 들어, miR-302a, miR-373 및 miR-292는 만능성 세포(ES, iPS)에서는 특이적으로 발현되나, 성체형 줄기 세포 또는 분화된 세포에서는 특이적으로 발현되지 않는다. let-7 패밀리 마이크로RNA는 만능성 세포(ES, iPS)로부터를 제외하고, 모든 세포에서 발현된다. miR-124a는 뉴런(neuron)에서 특이적으로 발현된다.
유전자 벡터
miRNA는 적합한 유전자 벡터, 즉 대상 유전자(전이유전자)를 전달하기에 적합한 벡터, 예컨대 바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다. 유전자 요법에 적합한 바이러스 벡터가 당업계에 주지되어 있다. 본 발명에 유용한 바이러스 벡터의 예는 WO2007/000668호에 기재되어 있다.
몇몇 상이한 패밀리로부터의 바이러스를 변형시켜, 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터를 생성하였다. 본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스에는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 피코르나바이러스 및 알파바이러스가 포함된다. 본 발명은 바람직하게는 렌티바이러스를 비롯한 레트로바이러스를 사용한다.
본 발명은 벡터 내에 포함되는 전이유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 벡터의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 mir-RNA에 의해 조절될 수 있는 벡터는 종양용해 바이러스이다.
조혈 줄기 세포 이식
조혈 줄기 세포 이식(HSCT)은 골수(골수 이식으로 알려져 있는 경우) 또는 혈액으로부터 유래된 혈액 줄기 세포의 이식이다. 줄기 세포 이식은 혈액학 및 종양학 분야의 의료적 절차이며, 대부분 혈액, 골수 또는 특정 유형의 암의 질환이 있는 사람들에 대해 수행된다.
줄기 세포 성장 인자 GM-CSF 및 G-CSF의 이용가능성으로, 대부분의 조혈 줄기 세포 이식 절차는 이제 골수보다는 말초 혈액으로부터 수집된 줄기 세포를 사용하여 수행된다. 말초 혈액 줄기 세포를 수집하는 것은 더 많은 이식편을 제공하며, 이식편을 수집하기 위하여 공여자가 일반적인 마취로 처리되는 것을 필요로 하지 않아, 더 짧은 생착 시간을 야기하며, 더 낮은 장기간 재발률을 제공할 수 있다.
조혈 줄기 세포 이식에는 많은 가능한 합병증과 함께 위험한 절차가 남아있으며; 이는 전통적으로 생명을 위협하는 질환이 있는 환자를 위해 확보되어 왔다. 비악성(nonmalignant) 및 비혈액학(nonhematologic) 징후, 예컨대 중증 무력화(disabling) 자가-면역 질환 및 심혈관 질환에서 실험적으로 종종 사용되지만, 치명적인 합병증의 위험은 더 넓은 수용을 얻기에는 너무 높은 것으로 보인다.
HSCT의 많은 수여자는 연장된 치료로부터 혜택을 보지 못했거나, 화학요법에 이미 내성이 있는 다발성 골수종 또는 백혈병 환자이다. HSCT에 대한 후보는 결손 줄기 세포가 있는 선천적 결함, 예컨대 중증복합면역결핍증 또는 선천 호중구감소증을 갖는 소아의 경우, 및 또한 출생 후에 그들의 줄기 세포를 소실한 재생불량빈혈이 있는 아동 또는 성인을 포함한다. 줄기 세포 이식으로 치료되는 다른 병상은 낫-세포 질환, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 림프종, 유윙 육종, 작고 둥근 결합조직형성 세포 종양(Desmoplastic small round cell tumor) 및 호지킨병을 포함한다. 더욱 최근에는 더 적은 용량의 제조용 화학물질 및 방사선을 필요로 하는 비-골수파괴(non-myeloablative) 또는 소위 "미니 이식" 절차가 개발되었다. 이는 노인 및 다르게는 통상적인 치료 요법을 견디기에 너무 약한 것으로 판단되는 다른 환자에서 HSCT가 행해질 수 있게 한다. 본 발명은 이들의 안전성 및/또는 효능을 개선시킴으로써 이러한 치료의 치료적 응용을 넓히는 것이 목적이다.
질환
본 발명은 특히 유전자 요법, 특히, 잠재적으로 독성이 있는 전이유전자의 발현을 수반하는 요법에 유용하다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 질환은 리소좀축적병(LSD), 예컨대 공세포백색질장애(GLD)를 포함한다. 본 발명에 의해 치료가능한 질환의 다른 예로는 만성육아종병(CGD)이 있다.
공세포백색질장애(GLD) 또는 크라베병은 GALC 유전자 내의 돌연변이에 의해 유발되며, 이는 갈락토실세라미다아제로 불리는 효소의 결함을 야기한다. 대사되지 않은 지질의 축적은 신경 보호 미엘린 초(많은 신경을 절연시키는 커버링(covering))의 성장에 영향을 미치며, 운동 능력의 중증 퇴행을 야기한다. 백색질장애로 알려져 있는 장애의 그룹의 일부로서, 크라베병은 미엘린의 불완전한 성장 및 발생으로부터 야기된다. GLD의 유전자 요법 치료는 GALC 유전자를 환자에 유도하는 것을 수반한다. 예를 들어, GALC가 HSPC 또는 HSC로 도입된 다음, 환자 내로 이식될 수 있다. 본 발명자들은 LV-매개된 GALC 유전자 전달 및 발현 후에, 독성, 및 뮤린 및 인간 HSPC의 시험관 내 및 생체 내 기능적 손상을 발견하였다. 이러한 독성은 본 발명의 유전자 벡터를 사용함으로써 극복될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터 시스템에 의한 하나 이상의 치료 유전자들의 운반은 단독으로 또는 다른 치료와 또는 치료의 구성성분과 병용하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터는 WO-A-98/05635호에 그 목록이 나열된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 전이유전자들을 운반하는데 이용될 수 있다. 참조의 편이를 위하여, 상기 목록의 일부가 지금부터 제공된다: 암, 염증 또는 염증성 질환, 피부과 장애, 발열, 심혈관 영향, 출혈, 응고 및 급성기 반응, 악액질, 식욕부진, 급성 감염, HIV 감염, 기절(shock) 상태, 이식편 대 숙주 반응, 자가 면역 질환, 재관류 손상, 수막염, 편두통 및 아스피린-의존성 항-혈전증; 종양 성장, 침입 및 확산, 신생혈관형성, 전이, 악성종양, 복수 및 악성흉막삼출(malignant pleural effusion); 대뇌 허혈, 허혈성 심장질환, 골관절염, 류머티스 관절염, 골다공증, 천식, 다발성 경화증, 신경퇴화(neurodegeneration), 알츠하이머병, 죽상 동맥 경화증, 뇌졸중, 맥관염, 크론병과 궤양성 대장염; 치주염, 치은염; 건선, 아토피성 피부염, 만성 궤양, 수포성 표피박리증; 각막 궤양형성, 망막증과 외과의 상처치유; 비염, 알러지성 결막염, 습진, 아나필락시스; 재협착, 울혈성 심부전, 자궁 내막증, 죽상 동맥 경화증 또는 혈관내경화증(endosclerosis).
이외에, 또는 대안으로, 본 발명의 벡터는 WO-A-98/07859호에 목록이 나열된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 전이유전자(들)를 운반하는데 이용될 수 있다. 참조의 편이를 위하여, 상기 목록의 일부가 지금부터 제공된다: 사이토카인 및 세포 증식/분화 활성; 면역억제 또는 면역자극 활성(예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스에 의한 감염을 포함하는, 면역 결핍 치료를 위한 활성; 림프구 성장 조절을 위한 활성; 암과 다수의 자가면역질환의 치료를 위한 활성; 및 이식 거부반응 방지하거나 종양 면역성을 유도하기 위한 활성); 조혈작용의 조절, 예를 들어, 골수 또는 림프구 질환의 치료; 예를 들어, 상처 치유, 화상, 궤양 및 치주질환 및 신경퇴화의 치료를 위한 뼈, 연골, 힘줄(tendon), 인대(ligament)와 신경조직의 성장 촉진; 여포 자극 호르몬의 억제 또는 활성화(수정력을 변화시킴); 화학주성(chemotactic)/화학운동성(chemokinetic) 활성(예를 들어, 상처 또는 감염 부위로 특이 유형의 세포들을 이동시키는 활성); 지혈성(haemostatic) 및 혈전용해성(thrombolytic) 활성(예를 들어, 혈우병과 뇌졸중을 치료하기 위한 활성); 항염증 활성(예를 들어, 패혈성 쇼크 또는 크론병을 치료하기 위한 활성); 항균제; 예를 들어, 대사 또는 행동 등의 조절제; 진통제; 특이한 결핍 장애의 치료; 인간의학 또는 수의학에서 예를 들어 건선의 치료가 포함된다.
이외에, 또는 대안으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 WO-A-98/09985호에 목록이 나열된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 전이유전자(들)를 운반하는데 이용될 수 있다. 참조의 편이를 위하여, 상기 목록의 일부가 지금부터 제공된다: 대식구 억제 및/또는 T 세포 억제 활성 및 그 결과, 항-염증 활성; 항-면역 활성, 즉 세포성 및/또는 체액성 면역 반응에 대한 억제 효과(염증과 관련이 없는 반응을 포함함): T 세포에서 상향-조절된 fas 수용체 발현뿐만 아니라, 세포외 기질 성분 및 피브로넥틴에 고착되는 대식구 및 T 세포의 활성 억제; 류마티스 관절염을 포함하는 관절염, 과민증과 관련된 염증, 알러지성 반응, 천식, 전신성 홍반 루푸스, 콜라겐병(collagen diseases) 및 그 외 자가면역질환, 아테롬성 동맥경화증과 관련된 염증, 동맥경화, 동맥경화성 심장 질환, 재관류 손상, 심정지, 심근경색증, 맥관 염증성 질환, 호흡 곤란 증후군 또는 그 외 심폐 질환, 소화성 궤양과 관련된 염증, 궤양성 대장염 및 그 외 위장관 질환, 간 섬유증, 간 경화 또는 그 외 간 질환, 갑상선염 또는 그 외 선성(glandular) 질환, 사구체신염 또는 그 외 신장 및 비뇨기과(urologic) 질환, 이염(otitis) 또는 그 외 이비인후과(Oto-rhino-laryngological) 질환, 피부염 또는 그 외 피부 질환, 치주질환 또는 그 외 치아 질환, 고환염 또는 부고환염성 고환염(epididimo-orchitis), 불임, 오키드 트라우마(orchidal trauma) 또는 그 외 면역-관련 고환 질환, 태반 기능부전, 태반 부족, 습관성 유산, 자간증, 임신중독증 및 그 외 면역 및/또는 염증-관련 부인과(gynaecological) 질환, 후포도막염, 중간포도막염, 전포도막염, 결막염, 맥락망막염, 유베오레티니티스(uveoretinitis), 시신경염, 안구 내의 염증, 예를 들어, 망막염 또는 낭포황반부종(cystoid macular oedema), 교감성 안염, 공막염, 색소성 망막염, 퇴행성 퐁듀 질환의 면역 및 염증 성분, 안외상(ocular trauma)의 염증 성분, 감염으로 유발된 안염증, 증식성 유리체-망막병증(proliferative vitreo-retinopathies), 급성 허혈성 시신경변증, 과도한 상흔(예를 들어, 녹내장 여과 수술(glaucoma filtration operation) 후의 상흔), 안구 이식에 대한 면역 반응 및/또는 염증반응 및 그 외 면역-관련 및 염증-관련 안질환, 자가면역질환 또는 병상 또는 장애와 관련된 염증(중추신경계(CNS), 임의의 기타 장기, 또는 상기 둘 모두에서, 면역 및/또는 염증 억제가 이로울 것임), 파킨슨병, 파킨슨병의 치료에 따른 합병증 및/또는 부작용, AIDS-관련 치매 복합체 HIV-관련 뇌질환, 데빅병, 시드넘 무도병, 알츠하이머병과 그 외 퇴행성 질환, CNS의 병상 또는 장애, 뇌졸중의 염증성 성분, 소아마비후 증후군, 정신장애의 면역 및 염증 성분, 척수염, 뇌염, 아급성 경화성 팬뇌염, 뇌척수염, 급성 신경병증, 아급성 신경병증, 만성 신경병증, 귈레인-바레(Guillaim-Barre) 증후군, 시덴함(Sydenham) 무도병, 중증 근무력증, 가성 뇌종양(pseudo-tumour cerebri), 다운 증후군, 헌팅턴 병, 근위축성 측삭경화증, CNS 압박 또는 CNS 트라우마 또는 CNS의 감염의 염증 성분, 근위축증 및 근육실조증의 염증 성분, 및 중추신경계 및 말초신경계의 면역 및 염증 관련 질환, 병상 또는 장애, 트라우마후 염증, 패혈증 쇼크(septic shock), 감염성 질환, 수술의 염증성 합병증 또는 부작용, 골수 이식 또는 그 외 이식 합병증 및/또는 부작용, 유전자 요법(천연 또는 인공 세포, 조직 및 장기(예: 각막, 골수, 장기, 수정체, 페이스메이커, 천연 또는 인공 피부 조직)를 이식하는 경우에 이식 거부반응을 예방 및/또는 치료하기 위하여, 단핵구 또는 림프구의 양을 감소시킴으로써, 단핵구 또는 백혈구 증식성 질환(예를 들어, 백혈병)을 치료하거나 경감시키기 위한, 체액성 면역반응 및/또는 세포성 면역반응을 억제시키거나 저해시키기 위한, 유전자 요법)의 염증성 및/또는 면역성 합병증 및 부작용(예를 들어, 바이러스 운반체에 의한 감염, 또는 AIDS와 관련된 염증에 기인함).
본 발명은 또한 유전자 요법에 의하여 개체를 치료하기 위한 약제 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 하나 이상의 운반가능한 치료 및/또는 진단 전이유전자(들)를 포함하는 본 발명의 벡터 또는 상기 벡터에 의해 생산되거나 이로부터 획득된 바이러스 입자를 치료학적으로 유효한 양으로 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 사람 또는 동물에게 사용하기 위한 것일 수 있다. 일반적으로, 내과의사는 개별 대상에게 가장 적당한 실질적인 투여용량을 결정할 것이고, 이것은 특정 개체의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제 관행에 따라 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이외에, 임의의 적당한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들), 및 표적부위 표적부위로의 바이러스 진입을 보조하거나 증가시킬 수 있는 (예를 들어, 지질 운반 시스템과 같은) 그 외 운반제(carrier agents)를 포함할 수 있다.
적절한 경우, 약제 조성물은 다음 중 어느 하나 이상에 의해 투여될 수 있다: 흡입제, 좌약 또는 페서리의 형태로, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 가루 분말의 형태로 국소적으로, 피부 패치를 사용함으로써, 전분 또는 젖당과 같은 부형제를 함유하는 정제의 형태로 경구로, 또는 단독으로 또는 부형제와 혼합된 캡슐 또는 소란(ovules)으로, 또는 착향제(flavouring agent) 또는 착색제를 포함하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로, 또는 이들은 비경구적으로, 예를 들어, 해면체내로(intracavernosally), 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 조성물은 멸균된 수용성 용액의 형태로 사용되는 것이 가장 좋을 수 있는데, 상기 용액은 기타 물질들, 예를 들어, 상기 용액을 혈액과 등장인 용액으로 만들 수 있는 충분한 염 또는 단당류를 포함할 수 있다. 구강 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방법으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenges)의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터 시스템에 의하여 운반되는 하나 이상의 치료 유전자는 단독으로 또는 기타 치료제 또는 치료제의 성분들과 함께 병용하여 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 질환은 다음을 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다: 암, 신경성 질환, 유전병, 심장 질환, 뇌졸중, 관절염, 바이러스 감염 및 면역체계의 질환. 적당한 치료 유전자는 종양억제단백질, 효소, 프로드럭 활성화 효소, 면역조절 분자, 항체, 엔지니어링된 면역글로불린-유사 분자, 융합 단백질, 호르몬, 막 단백질, 혈관작용성(vasoactive) 단백질 또는 펩티드, 사이토카인, 케모카인, 항-바이러스 단백질, 안티센스 RNA 및 리보자임을 코딩하는 유전자를 포함한다.
실시예
뉴클레오티드 서열: 볼드체: miRNA에 상보적인 표적 서열, 일반적으로, 본 발명자들은 4 내지 6개 뉴클레오티드 링커로 분리된 4 카피의 miRNA 표적을 사용하였다. 그러나 이는 최적화될 수 있다.
miR-126: UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG
miR-126T 서열:
GCATTATTACTCACGGTACGA CGAT GCATTATTACTCACGGTACGA ACGCGT GCATTATTACTCACGGTAC GA TCAC GCATTATTACTCACGGTACGA
miR-130a: CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU
miR-130aT 서열:
ATGCCCTTTTAACATTGCACTG TTCGAA ATGCCCTTTTAACATTGCACTG ACGCGT ATGCCCTTTTAACAT TGCACTG ATGCAT ATGCCCTTTTAACATTGCACTG
miR-223: UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miR-223T 서열:
GGGGTATTTGACAAACTGACA CGAT GGGGTATTTGACAAACTGACA ACCGGT GGGGTATTTGACAAACTGA CA TCAC GGGGTATTTGACAAACTGACA
126T/130aT 2/2 조합:
GCATTATTACTCACGGTACGA CGAT GCATTATTACTCACGGTACGA ACGCGT ATGCCCTTTTAACATTGCA CTG ATGCAT ATGCCCTTTTAACATTGCACTG
126T(2 표적): GCATTATTACTCACGGTACGA CGAT GCATTATTACTCACGGTACGA
3중 조합 표적(126T/130aT/223T, 각각 2 표적):
GCATTATTACTCACGGTACGA CGAT GCATTATTACTCACGGTACGA ACGCGT ATGCCCTTTTAACATTGCACTG ATGCAT ATGCCCTTTTAACATTGCACTG CCCCGGT GGGGTATTTGACAAACTGACA TCAC GGGGTATTTGACAAACTGACA
실시예 1
렌티바이러스 마이크로 RNA 리포터 벡터의 작제 및 입증
HSC와 같은 불충분하게 특성화되는 희귀 집단을 비롯한 조혈 세포에서 miRNA의 활성을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 전이유전자가 내인성 miRNA에 의해 하향조절될 수 있다(여기서 인공 결합 부위(miRT, miRNA 표적 부위)가 전이유전자 카세트에 첨가됨)는 본 발명자들의 이전의 관찰의 이익을 취하였다(Brown BD., 2006). 따라서, 본 발명자들은 단일 세포 분해능으로, 그리고 실시간으로 miRNA 활성을 판독하는 렌티바이러스 miRNA 리포터 벡터를 작제하는 것을 목적으로 하였다. 양방향성 렌티바이러스 벡터(Bd.LV)는 반대의 배향으로 최소 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 형태로 TATA-박스(box)에 융합된 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터로 이루어진, 양방향성 활성을 갖는 구성 프로모터에 의해 추진되는 2개의 리포터 유전자의 대등한 발현을 가능하게 한다(Amendola M., 2005). 이러한 설계는 두 리포터 모두가 2개의 독립적인 전사체로 발현되게 하기 때문에, 이들 중 하나는 miRT를 3'UTR에 첨가함으로써 miRNA 활성에 반응성이 되도록 할 수 있는 한편("miRNA 리포터"), miRT를 구비하지 않은 다른 하나는 miRNA에 의해 영향을 받지 않을 것이며 내부 대조군("정규화자")으로 소용될 것이다. 본 발명자들은 miRNA 리포터로서의 녹색 형광 단백질(GFP) 및 상시 발현되는 정규화자로서의 인간 저-친화성 신경 성장 인자 수용체(NGFR)의 절두 버전을 함유하는 Bd.LV를 클로닝하였다.
본 발명자들은 조혈 조직에서 발현되는 것으로 여겨지는 2개의 miRNA를 조사하기 위하여 miR-223 및 miR-126-3p를 선택하였다. miR-223은 분화된 골수 세포에서 고도로 그리고 특이적으로 발현되나, 림프구에서는 부재인 것으로 보고되어 있어(Fazi F., 2005), 본 발명자들이 잘 특성화된 계통에서 본 발명의 리포터 Bd.LV의 성능을 시험할 수 있게 하였다. 더욱이, 본 발명자들은 miR-223이 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 집단에서 어떻게 발현되는지를 조사하기를 원하였다. 유전자 요법의 견지로부터, 이는 질환에 걸린 자손의 치료적 수정을 완전히 유지하면서, 감수성 줄기 세포 집단에서 오프-표적(off-target) 전이유전자 발현을 방지하기 위하여, HSPC에서 강하게 발현되나 분화된 자손에서는 발현되지 않는 miRNA를 동정하는 것과 매우 관련이 있을 것이다. 대규모 miRNA 클로닝으로, miR-126이 인간 CD34+ HSPC에서는 특이적으로 검출되나 다른 조혈 세포 집단에서는 검출되지 않았기 때문에, miR-126이 이들 기준을 만족시킬 수 있음이 제시되었다(Landgraf et al., 2007).
본 발명자들은 miR-223 및 miR-126-3p(각각 Bd.LV-223T 및 Bd.LV-126T)에 대한 리포터 Bd.LV뿐 아니라 어떠한 miRT도 함유하지 않는 대조군 Bd.LV를 생성하였다(도 1). 그 다음, 이들 벡터를 상이한 세포 유형의 패널에서 평가하였다(도 2). HEK293T 배아 신장 세포, U937 단핵 세포 및 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)를 매치된 용량의 Bd.LV-대조군, Bd.LV-223T 및 Bd.LV-126T로 형질도입시키고, 형질도입 수일 후에, 유세포분석(FACS)에 의해 리포터 발현을 분석하였다. HEK293T 세포는 낮은 수준 내지 검출불가능한 수준의 miR-223 또는 miR-126을 발현하는 한편, U937 세포는 miR-223을 강하게 발현하나 miR-126은 발현하지 않고(도 2a), HUVEC은 miR-126을 발현하나 miR-223을 발현하지 않는다(Kuehbacher et al., 2007). 추가의 대조군으로서, 본 발명자들은 편재성 프로모터의 조절 하에 pri-mir-126을 함유하는 LV로의 형질도입에 의하여, miR-126을 이소적으로 발현시키기 위한(도 2a) HEK293T 세포를 엔지니어링하였다(이제는 야생형 HEK293T 세포와 대조적으로, HEK293T.LV.miR-126로 언급).
HEK293T 세포에서, NGFR을 발현하는 형질도입된 세포의 GFP 평균 형광 강도(MFI)는 모든 3개의 Bd.LV에 대해 동일하였으며(도 2b, 좌측 컬럼), miR-223 또는 miR-126-3p 중 어느 하나가 이들 세포에서 발현되지 않음을 확인하였다. 극명한 대조로, Bd.LV.223T로 형질도입된 U937 세포는 Bd.LV.126T 또는 Bd.LV.대조군에 비해 GFP MFI의 상당한 감소를 나타내었으며, 이는 miR-223이 U937 세포에서 생물학적 활성이 있었으나, miR-126은 생물학적 활성이 없었음을 나타낸다. 반면, HUVEC은 대조군 벡터에 비해 Bd.LV-126T에 대해서 특이적으로 GFP의 억제를 보였다. 유사하게, Bd.LV-126T 리포터가 형질도입된 HEK293T.LV.miR-126 세포는 야생형 HEK293T 세포에 비해 GFP 발현을 강하게 하향 조절시켰다(도 2b의 3번째 줄에서 마지막과 첫번째 플롯 비교).
더욱 정량적인 용어로 miRNA 활성을 기재하기 위하여, 본 발명자들은 대조군 Bd.LV에 비한 miRNA 리포터 Bd.LV의 정규화된 평균 형광 강도(MFI)에 기초하여 "단백질 억제 배수" 값(FR)을 계산하였다(도 2c). 벡터 그룹 간의 상이한 수준의 유전자 전달을 감안하기 위하여, 본 발명자들은 내부 정규화자, 즉 NGFR을 사용하였으며, 이는 miRNA 리포터, GFP와 화학당량으로 전사된다. 따라서, 본 발명자들은 NGFR 양성 세포에서 FACS 분석을 게이팅하고, NGFR MFI를 각각의 Bd.LV에 대한 GFP MFI로 나눔으로써, "전이유전자 비"(TGR)를 계산하였다. 그 다음, miRNA 리포터 벡터(각각 Bd.LV.223T 또는 Bd.LV.126T)에 대해 수득된 TGR을 대조군 Bd.LV의 TGR로 나누었다. 본 발명자들이 이제부터 "억제 배수"로 칭하는 이러한 몫은 벡터 용량 및 형질도입 수준에 독립적이며(적어도 벡터 용량-반응 곡선의 선형 부분 내에서는), 분석된 세포에서 miRNA 활성에 대한 정량적 판독치를 제공한다(도 2c). 본 발명의 miRT는 동족체 miRNA에 완벽하게 상보성이도록 설계하였다. 따라서, 본 발명자들은 miRNA에 의해 인식되는 전사체가 분해되는 것을 예상하였다. 이를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 U937 및 HEK293T.LV.miR-126 세포에서 RT-QPCT에 의해 NGFR 및 GFP mRNA 전사체를 측정하고, 도 2c에 약술된 바와 같이 "RNA 억제 배수"로 계산하였다. 실제로, 각각 7 및 14의 계산된 RNA 억제 배수 값으로 나타낸 바와 같이, U937.Bd.LV.223T 세포뿐 아니라 HEK293T.LV.miR-126.Bd.LV.126T 세포에서 GFP 전사체가 NGFR 전사체에 비해 감소하였다(도 2c, 마름모꼴).
함께 취하여, 이들 결과는 본 발명자들의 이전에 공지된 miRNA 발현 데이터와 일치하게, 본 발명의 miRNA-조절된 Bd.LV가 세포주에서 miRNA 활성을 충실하게 보고함을 나타내었다. 통상적인 miRNA 프로파일링 기법 외에, 본 발명의 벡터는 단지 miRNA의 존재뿐 아니라 그의 생물활성도 또한 보고하였다. 본 발명의 Bd.LV 리포터를 지니는 세포의 FACS 분석은 단일 세포 수준으로 miRNA 활성을 평가하는 것을 가능하게 하며, 이에 따라, 면역표현형으로 추가로 세분될 수 있는 이종 세포 혼합물을 분석하는데 적합하다.
마우스 조혈계에서 miR -223 및 miR -126 활성의 특성화
일단 세포주에서 miRNA 활성을 측정하는 데에서 리포터 Bd.LV의 신뢰성이 증명되면, 본 발명자들은 일차 조혈 세포에서 상술된 miRNA의 활성을 조사하였다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명자들은 뮤린 모델의 이점을 취하였는데, 이는 이러한 모델이 광범위하게 이용가능하며, 실험 세팅에서 용이하게 조작되고, 잘 특성화되어 있기 때문에다. 사실상, 희귀 HSPC 집단에서 miRNA 활성을 규정하려는 목적인 경우, 표면 마커에 의해 잘 특성화된 뮤린 조혈계는 큰 이점을 나타낸다. 본 발명자들의의 실험 방법은 계통-마커 양성 세포를 고갈시켜 골수로부터 뮤린 HSPC를 농축하고, 이들을 렌티바이러스 miRNA 리포터 벡터로 형질도입시키고, 이들 세포를 치사선량 조사된 유사유전자형 수여 마우스에 이식하는 것이었다. 그 다음, 말초 혈액 백혈구에서 시간이 지나면서 마이크로RNA 활성을 모니터링하여, 분화된 세포에서 그들의 활성을 결정하였다. 안정적인 생착에 달성한 후에, 마우스를 안락사시키고, miRNA 활성을 표면 면역표현형에 의해 규정된 다수의 골수 집단에서 결정하였다. 이러한 방법으로, 본 발명자들은 이들 miRNA가 예상하여 동정된 HSPC에서 발현하는지 여부를 평가하고자 하였다. 특히, 본 발명자들은 mir-126이 가장 원시의 HSC 구획에 존재하는지 여부를 결정하고자 하였다. 제1 세트의 마우스를 이전에 기재된 리포터 Bd.LV로 형질도입된 HSPC로 이식시켰다(도 1 참조; Bd.LV-대조군, n=5 이식된 마우스; Bd.LV-223T, n=6 마우스; 또는 Bd.LV-126T, n=4 마우스).
말초 혈액(PB)을 이식 8주 후에 샘플링하고, 백혈구 집단을 표면 마커 및 물리적 파라미터에 따라 과립구(CD11b+ 측방 산란hi SSChi), 단핵구(CD11b+SSClo), B 세포(CD19+) 및 T 세포(CD11b-CD19-)로 분류하였다(도 3a). GFP miRNA 리포터 및 NGFR 정규화자 발현을 FACS에 의하여 이들 백혈구 서브셋 내에서 정량화하였다(도 3b). GFP가 Bd.LV-대조군- 및 Bd.LV-126T-형질도입된 HSPC로부터 유래된 모든 백혈구 세트셋에서 유사하게 발현되지만, 본 발명자들은 Bd.LV-223T 군에서 PB 골수 세포에서는 특이적으로 충분한 GFP의 하향-조절을 보고하였으나, 림프구에서는 그렇지 않았다. miR-223 활성의 정량화는 과립구와 단핵구에서 각각 30-배 및 17-배 억제를 나타내었지만, miR-126은 PB 백혈구에서 활성이 없었다(도 3c). 별개의 HSPC 서브셋에서 miR-223 및 miR-126 프로파일을 특성화하기 위하여, 본 발명자들은 Bd.LV 리포터 마우스를 희생시키고, 이들의 골수를 다색 면역표현형 분석으로 처리하여, 별개의 전구세포- 및 줄기 세포 하위집단을 예상하여 동정하였다. 이는 상술된 마우스에 대해서뿐 아니라, 불안정화된 GFP 변이체에 기초하여 더 감수성인 miRNA 리포터를 발현하는 HSPC를 이식한 마우스 상에서의 이후의 실험에서 행하였다. 이러한 리포터는 GFP의 C-말단에 융합된 프롤린-글루탐산염-세린-트레오닌-풍부(PEST) 서열을 함유한다. PEST 모티브는 빠른 프로테오좀 분해 및 빠른 단백질의 턴오버를 매개하며, 약 26시간 내지 약 4시간의 GFP 반감기를 단축시킨다(Kitsera et al., 2007). 이러한 짧은 dGFP 반감기는 아마도 수임된 전구세포를 향한 HSC의 전이 동안에 발생하는 miRNA 발현의 변화를 더 정확하게 검출하게 한다. 표준 GFP보다 더 낮은 dGFP 신호를 신뢰성있게 결정하기 위하여, GFP 유전자를 함유하지 않았던 Bd.LV-NGFR 벡터를 지니는 마우스의 그룹을 포함시킴으로써, 각각의 개별 하위집단에서 자가형광을 GFP MFI로부터 감산하였다. 하기의 도 4 내의 FACS 플롯을 더 감수성인 Bd.dGFP 벡터가 이식된 마우스의 BM으로부터 수득하였다. 그러나, 표준 GFP 리포터를 지니는 마우스 내의 miRNA 활성의 결정은 매우 유사한 결과를 제공하여, 도 3c의 억제 배수는 수행된 2개의 독립적인 실험으로부터 합한 데이터에서 계산될 수 있게 되었다(Bd-대조군, n=10; Bd-223T, n=9; Bd-126T, n=13 마우스).
뮤린 HSPC 및 그들의 자손에서 마이크로 RNA 활성의 풋프린팅( Footprinting )
그 다음, 본 발명자들은 재구성된 마우스로부터 단리한 다수의, 예상하여 동정된 조혈 하위집단에서 BdLV 리포터 단백질 수준을 정량화하였다. HSPC 구획을 c-Kithi 계통 마커-/ low 면역표현형을 갖는 골수(BM) 세포로 규정하였으며, Sca-1, CD150, CD48 및 CD45의 발현에 기초하여, 상이한 자기-재생 및 분화 능력을 갖는 분획으로 추가 세분하였다. 특히, 면역표현형 c-Kit+ Sca-1+ Lin- (KSL) CD150hi CD48-를 갖는 5개의 세포 중 3개가 단일 세포 이식시에, 장기간의 다계통 재분포능(repopulating potential)을 가지며, 이에 따라 보나 파이드(bona fide) HSC를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Kiel MJ., 2005). 더욱이, 문헌(Pronk CJ., 2007) 및 본 발명자들의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 Kit+Sca-계통 세포를 과립구/단핵구 전구세포(GMP) 대 거핵구 및 적혈구 전구세포(EP)가 풍부한 서브셋으로 세분하고, miRNA 발현을 평가하였다. 흥미롭게도, miR-126, miR-130a 및 miR-196b는 가장 원시의 HSC가 풍부한 분획에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이러한 활성은 초기 분화 단계 중에 소실된다(도 4). 중요하게는, miR-126, miR-130a 및 miR-196b는 어느 정도의 miR-126 활성을 재확립하는 것으로 보이는 최종 분화된 과립구를 제외하고, 림프 및 골수 계통의 분화된 세포에서 대부분 불활성이다. miR-223은 대부분의 KSL 세포 및 모든 골수 전구세포(GMP)에서 발현되었으나, EP에서는 급격하게 하향-조절되었다. 예상된 바와 같이, miR-223은 골수 분화 중에 계속해서 상향조절되나, B- 및 T-림프구는 이것이 없었다(도 5a). 또한, 생성된 miR-17~92 클러스터의 구성원(miR-19, miR-93a, miR-17-5p)은 HSPC에서 고도로 발현된다. 그러나, 이들의 억제 활성은 추가의 분화 중에 유지되며, 최종 분화된 B 세포 및 과립구에서 어느 정도만 감소하였다(도 5a). 마지막으로, let-7a는 그의 편재성 발현 패턴과 일치하게, 보나 파이드 HSC를 비롯한 모든 조혈 세포 유형에서 실질적인 억제 활성을 보유하였다.
miR -126에 의한 조건적 자살로부터의 HSC 의 보호
상술된 miRNA 활성 풋프린트는 면역표현형에 따른 조혈 세포 집단의 예상된 단리에 기초한다. 작용상 규정된 세포 서브셋에서 선택된 miRNA의 활성을 결정적으로 확립하기 위하여, 본 발명자들은 상이한 miRT 서열에 의해 조절되는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터에 기초하여 조건적 자살 시스템을 고안하였다(도 6a). TK가 약 35시간의 반감기로 매우 안정적이기 때문에, 본 발명자들은 d4GFP의 PEST 도메인을 TK의 C-말단에 융합시킴으로써, TK 단백질(이제 dTK로 지칭)을 불안정화시켰다. 지정된 자살 벡터 또는 GFP 대조군 벡터 중 하나로 HSPC를 형질도입시키고, GCV의 존재 또는 부재 중 어느 하나에서 반고체 배지에 플레이팅하였다(도 6b). 대조군 TK 벡터를 형질도입한 HSPC는 GCV의 존재 하에서 콜로니를 생성하지 않았다. miR-142T 서열을 dTK 전사체에 첨가하면, 이러한 miRNA의 범(pan)-조혈 발현을 갖는 라인에서 콜로니 형성이 완전하게 구출되었다(Brown BD., 2006). 대신, miR-223T는 골수 콜로니의 성장을 적어도 부분적으로 구출하는 한편, 적혈구 콜로니 수가 상당히 감소하였고(p<0.001) 대조군 TK-형질도입된 세포와 통계적으로 상이하지 않았다. 또한, 골수 콜로니의 부분적인 구출은 miR-126T로도 수득되었지만, miR-223T로 수득된 것보다 더 낮은 수준이었다. GCV는 초기 분화 단계 동안 mir-130a의 급격한 하향-조절을 갖는 라인에서 miR-130aT 그룹에서 골수 및 전혈구 콜로니 둘 모두의 성장을 완전히 방지하였다.
그 다음, 본 발명자들은 생체 내 자살 검정을 개발하여, 작용상 규명된 HSC에서 miRNA 활성을 증명하였다. TK/GCV 자살 시스템은 독성이 되게 하기 위하여 세포 분열을 필요로 한다. TK-형질도입된 세포와 형질도입되지 않는 BM 지지 세포를 공동-이식시키는 파일럿 실험은 처음 생착 2주 내에 주어진 GCV의 1주의 시간이 TK-형질도입된 장기간 재분포 HSC를 효과적으로 제거함을 나타낸다(데이터 미도시). 그 다음, 본 발명자들은 HSPC를 dTK-126T 또는 dTK-142T 및 GFP를 발현하는 miRNA-조절된 양방향성 자살 벡터 또는 dTK 및 ΔNGFR을 발현하는 대조군 양방향성 자살 벡터 중 어느 하나로 형질도입시켰다. 그 다음, miRNA-조절된 자살 벡터 중 하나 또는 대조군이 형질도입된 세포를 유사유전자형 마우스에 공동-이식시켰으며, 이 마우스는 생착 단계 동안에 GCV를 수여받거나 수여받지 않았다(도 6c). 말초 혈액 키메리즘의 장기간 분석으로, 대부분의 NGFR+ 세포가 GCV-처리된 마우스에서 효과적으로 제거되었으며, GFP+ 세포가 상대적으로 증가된 숫자로 지속됨이 나타났다. 이는 dTK-126T- 및 dTK-142T-형질도입된 세포 둘 모두에 대하여, 다수의 계통(과립구, 단핵구, B- 및 T 림프구)에서, 7개월 초과의 기간에 걸쳐 관찰되었다. 이들 데이터는 miR-126 및 miR-142 둘 모두가 장기간 재분포 HSC에서 충분한 수준으로 발현되어 GCV에 의해 유도되는 세포사 및 TK 단백질 발현을 방지함을 증명한다.
유전자 요법을 위한 miR -126 조절의 이용 안정성
그 다음, 본 발명자들은 상술된 BdLV 연구에서 사용되는 동일한 프로모터로부터 d4GFP.126T 전사체를 발현시키는 렌티바이러스 벡터의 생식계 통합을 품고 있는 트랜스제닉 마우스 라인(Tg.126T 마우스)을 유도하였다. 어린 성체 Tg.126T 마우스의 Lin- BM 세포의 FACS 분석은 이식된 마우스에서 관찰되는 것과 유사한 패턴의 miR-126 활성을 보여주었다(도 7a). 이로써, miR-126이 HSC에서 생리학적으로 발현됨을 확인하였다. miR-126은 내피 세포에서 발현되며, 발생 중에 기능 소실되어, 결함이 있는 혈관신생에 기인한 태아 사망을 야기하는 것으로 알려져 있다(Fish JE., 2008). 전반적인 표현형 비정상이 Tg.126T 마우스에 나타나지 않았다. Tg.126 마우스를 이종 교배시키는 경우, 부모의 평균 수의 벡터 통합물을 유지하는 정상 크기의 새끼를 수득하였다(도 7 b). 이러한 데이터는 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK) 프로모터로부터의 miR-126T 서열의 발현이 마우스 발생을 간섭하지 않았음을 나타내며, miR-126T 발현이 이들 환경 하에서 내피 세포 내의 천연의 miR-126 표적의 조절을 간섭할 수 있다는 가설에 반대 의견을 제시하였다. 이러한 후자의 이슈를 조혈 세포에서 추가로 제외시키기 위하여, 본 발명자들은 경쟁적 재분포 실험을 설정하였다. CD45.1+ HSPC를 Tg.126T 마우스로부터의 동일한 수의 CD45.2+ HSPC를 치사선량 조사된 CD45.1+ 수여자 내로 공동-주입하였다. 말초 혈액 키메리즘은 1년 이상(마지막 분석 시간) 동안 모든 주요 혈액 계통에 대하여 대략 40-50% CD45.2+ 세포(n=4)로 유지되었으며 안정적이었다(도 7c). 이들 데이터는 함께, miR-126이 원시 HSC에서 발현됨을 나타내며, 바이오센서 방법은 miRNA 발현의 기초 하에 단일 세포 수준에서 조혈 세포를 동정하기 위한 강력한 비독성 수단을 제공한다.
인간 조혈 세포에서의 후보물질 miRNA 활성의 특성화
뮤린 조혈계에서의 miR-223, miR-130a 및 miR-126 활성의 본 발명자들의 특성화는 이들 miRNA를 HSPC에서 전이유전자 독성을 제한하기 위한 유망한 내인성 조절자로서 제안하는 한편, 분화된 골수 및 림프 세포에서 치료적 발현을 가능하게 하였다. 본 발명자들은 다음으로, 유전자 요법에 대한 실제 표적인 인간 조혈 세포 내의 이들 miRNA의 활성을 조사하고자 하였다. 본 발명자들은 인간 CB CD34+ 세포를 miR-126, miR-130a, miR-223에 대한 리포터 Bd.LV로 형질도입시켰다(도 8a). 세포를 HSPC의 단기간 유지에 대한 지지를 제공하는 조건 하에서 시험관 내에서 배양하였으며, CD34/CD38 발현에 기초한 하위집단을 유세포분석으로 동정하였다. 메틸셀룰로오스 검정을 사용하여, 골수(CD13+) 및 적혈구(CD235+) 분화를 평가하였다. miR-126, miR-130a 및 miR-223은 모두 CD34+ HSPC 집단에서 그들 각각의 리포터 전사체를 억제하였다. 분화 시에, miR-223은 골수 계통에서 활성을 유지하는 한편, 이는 적혈구 분화 중에 감소되었다. 반면, miR-126은 골수 분화 중에 그의 활성을 소실하였나, 적혈구 자손에서는 활성이 유지되었다. 이들 패턴의 발현은 조건적 자살 검정에 의해 기능적으로 입증하였다(도 8b). miR-130a는 골수 및 적혈구 계통 둘 모두에서 그 활성을 소실하였다. 각각의 집단에서의 miRNA 활성의 정량화(도 8a)는 시험된 miRNA 중에, miR-126이 원시 HSPC가 풍부한 CD34+CD38- CB 분획에서 가장 강력한 miRNA였음을 나타냈다. 도 8c/d는 miR-126T와 miR-130aT 서열을 조합함에 의한 miRT 서열의 추가의 최적화를 나타낸다.
실시예 2
HSPC 에서의 강제 GALC 발현
뮤린 HSPC(mHSPC)에서 GALC 과발현의 실행가능성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 FVB/twi (GALC -/-) 마우스로부터 Lin- 세포를 단리하였다. mHSPC를 최적화된 사이토카인 조합의 존재 하에서 MOI 100으로 GALC.LV로 형질도입시켰다(Biffi et al., 2004). 형질도입 후에, 세포를 시험관 내에서 10 내지 14일 배양하여, Q-PCR에 의해 효소 활성 및 벡터 카피수(VCN)를 평가하였다. 본 발명자들은 GALC의 발현 수준과 mHSPC를 대조군 벡터 ARSA.LV 및 IDUA.LV로 형질도입시킴으로써 수득되는 다른 리소좀 효소, 아릴설파타아제 A(ARSA) 및 -아이듀로니다아제(Iduronidase)(IDUA)의 과발현을 비교하였다. 모든 벡터는 인간 PGK 프로모터를 함유하는 동일한 발현 카세트로부터 전이유전자를 발현하였다. 본 발명자들의 목적이 야생형 HSPC에서의 생리적 효소 수준에 대하여 형질도입된 -/-HSPC에서의 효소 과-발현을 비교하는 것이었기 때문에, ARSA KO 마우스 및 IDUA KO 마우스로부터 수득된 mHSPC를 각각 ARSA.LV 및 IDUA.LV 형질도입을 위하여 사용하였다. mHSPC의 형질도입은 -/- 세포에서 리소좀 효소 활성을 재구성하였으며, 형질도입된 -/- mHSPC의 배양된 자손에서 야생형 수준에 비해 효소 과발현을 야기하였다(도 9a). 그러나, 유사한 VCN에도 불구하고 IDUA.LV 및 ARSA.LV 대조군에 의해 수득된 IDUA 및 ARSA의 증가(야생형을 초과하여 각각 320 및 5.6배)에 비해 GALC 발현의 증가(야생형을 초과하여 2배)는 유의미하게 더 낮았다.
유사한 실험을 정상 공여자(n.d.)로부터 수득된 CB로부터의 CD34+ 선택을 통해 단리한 인간 HSPC(hHSPC)상에서 수행하였다. hHSPC를 이전에 최적화된 형질도입 프로토콜 105를 사용하여 MOI 100에서 GALC.LV, ARSA.LV 및 IDUA.LV로 형질도입시켰다. mHSPC와 유사하게, 본 발명자들은 형질도입된 세포의 시험관 내 배양시에 효소 활성 재구성 및 VCN을 평가하였다. 정상 공여자 CB로부터의 HSPC의 GALC.LV(n = 4) 형질도입은 IDUA.LV(n = 3) 및 ARSA.LV(n = 6) 대조군에 비해 배양된 세포 자손에서 제한된 효소의 과발현을 야기하였다(도 9b).
LV -매개의 GALC 발현시에 GALC 를 발현하는 HSPC 의 손상된 시험관 내 기능
mHSPC 클론형성능(clonogenic potential)에서의 형질도입 및 효소 발현의 효과를 CFC 검정에 의해 평가하였다. 동일한 수의 GALC/GFP/ARSA.LV 형질도입된 mHSPC를 콜로니 검정을 위해 씨딩하였다. ARSA를 대조군 리소좀 효소로 선택하였는데, 이는 ARSA가 이전에 HSPC 작용에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났었기 때문이다(Capontondo et al., 2007). 12개의 독립적인 실험에서, GALC.LV 형질도입된 -/- 및 +/+ mHSPC는 GFP.LV 및 ARSA.LV 형질도입된 세포에 비해 유의미하게 감소된 수의 콜로니를 야기하였다(GALC -/- 세포에 대한 도 10a). GALC.LV 형질도입된 mHSPC로부터의 콜로니는 대조군에 비해 현저하게 감소된 크기의 것이었다(도 24b). 이들 결과는 LV 형질도입시에 GALC 과발현이 mHSPC 클론형성능을 손상시킴을 시사한다. GALC.LV 형질도입시에 적혈구 및 골수 콜로니의 상대 비율은 대조군과 유사하였으며(미도시), 이는 효소 발현이 상이한 조혈 계통을 동일한 정도로 손상시킴을 시사한다.
GALC.LV 형질도입된 mHSPC의 감소된 클론형성능은 고도로 형질도입된 GALC 과발현 조혈 전구세포의 사멸으로부터 야기될 수 있다. 고도로 형질도입된 mHSPC의 음성 선택의 가능한 발생을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 Q-PCR에 의해 콜로니의 VCN을 정량화하였다. Q-PCR을 4개의 콜로니의 각각의 풀(pool)로부터 추출한 DNA상에서 수행하였다(분석에 충분한 양의 재료를 갖게 하기 위하여 풀을 만들었다). GALC.LV 형질도입된 mHSPC로부터 수득된 콜로니는 대조군에 비해 유의미하게 더 낮은 벡터 함량을 보여주었으며(도 10a), 이는 고도로 형질도입된 전구세포의 음성 선택의 발생을 제시한다.
이들 데이터에 따라, 본 발명자들은 기능적 손상과 시험관 내 선택이 형질도입의 독성 효과 때문인지, 또는 벡터와 함께 정제되며 벡터-생성자 세포에 의해 분비되는 오염물질의 존재 때문인지를 식별할 수 없었다. GALC.LV 생성 중에 293T 세포가 플레이트로부터 분리됨이 언급되어야 하며, 이는 GALC 발현이 또한 이들 세포에 독성임을 시사한다. 이러한 이유로, 사멸한 293T 세포로부터 유래된 독성 분자의 벡터 제제로의 혼입을 배제할 수 없었다. 이러한 이슈를 다루기 위하여, 본 발명자들은 조혈-특이적 마이크로RNA에 의해 조절되는 대조군 벡터, 즉 GALCmir142T.LV 56을 생성하였다. 전이유전자의 다운스트림에 혼입된 마이크로RNA 142에 대한 4개의 표적 서열은 비-조혈 세포, 예컨대 293T LV-생성 세포에서 GALC 발현의 손상 없이 mHSPC 및 그들의 자손에서의 발현의 억제를 가능하게 한다. 이러한 기법은 마이크로RNA 전사후 조절에 기초하며: 조혈 세포에 의해서만 발현되는 마이크로RNA 142는 전이유전자의 다운스트림 표적 서열을 인식하며, 전사체의 번역과 전이유전자의 발현을 억제한다. 예상되는 바와 같이, mHSPC의 GALCmir142T.LV로의 형질도입은 GALC 활성의 증가와 관련되지 않았다(도 10b). 더욱이, GALCmir142T.LV가 형질도입된 mHSPC(n = 6)는 대조군에 비해, 영향받지 않은 클론형성능과 유사한 벡터 함량을 보여주어, 이전에 관찰된 손상이 GALC 발현에 좌우됨을 확인시켜 주었다(도 10a).
본 발명자들은 또한 인간 HSPC 상에서 GALC 과-발현의 효과를 조사하였다. hHSPC를 정상 공여자 CB 및 BM과, 폐기될 예정인 GLD 환자의 수집된 BM으로부터 단리하였다. GALC.LV 또는 ARSA.LV 또는 GFP.LV 대조군 벡터로 형질도입된 동일한 수의 hHSPC를 CFC 검정을 위해 씨딩하여, 형질도입된 hHSPC의 클론형성능을 평가하였다. 뮤린 세포의 경우에서와 같이, GALC.LV 형질도입된 정상 공여자 및 GLD hHSPC는 손상된 클론형성능을 보여주었다(도 11a). GALC.LV 형질도입된 hHSPC로부터의 콜로니는 대조군에 비해 유의미하게 더 낮은 벡터 함량과, 감소된 크기 및 보존된 적혈구-골수 비율을 보여주었으며, 이는 다시, 고도로 형질도입된 전구세포의 음성 선택을 시사한다(도 11a). 또한, 이러한 경우에, 대조군 벡터 GALCmir142T.LV를 사용하여 형질도입의 비특이적 독성 효과를 배제시켰다. 뮤린 세포의 경우에서와 같이, GALCmir142T.LV 형질도입된 hHSPC(n = 4)는 대조군 세포에서 관찰되는 GALC 활성 및 클론형성능과 유사한 GALC 활성 및 클론형성능을 보여주었다(도 11a 및 b).
전반적인 이들 데이터는 LV 형질도입 시에 강제 GALC 드 노보 발현이 뮤린 및 인간 HSPC 둘 모두에 해로운 효과를 가하며, GALC 과발현 세포의 음성 선택 및 기능적 손상을 야기함을 나타낸다.
LV -매개의 GALC 발현 시의 HSPC 의 손상된 생체 내 기능
본 발명자들은 GALC 드 노보 발현 및 GALC.LV 형질도입 시의 m- 및 hHSPC의 재분포능을 평가하려는 목적으로 생체 내 실험을 수행하였다. mHSPC에 대해서는 twi 및 FVB/twi 마우스에서, 그리고 hHSPC에 대해서는 Rag2c 마우스에서 생체 내 연구를 수행하였다.
본 발명자들의 초기 실험은 방법 섹션에 기재된 바와 같이, GLD의 중증 모델인 twi 마우스에서 수행하였다. 실험의 제1 세트는 twi 마우스에서 HCT를 위한 조건을 설정하는 것에 전념하였다. 야생형 공여자로부터의 전체 BM 이식을 이들 마우스에서 수행하여, 이전에 115로 보고된 것처럼, 이들이 수명이 100일 이하의 유의미한 증가를 야기하였다. 이들 예비 실험은 최적의 조사 용량을 규정할 수 있게 하였다. CD45.1 대립형질을 지니는 공여자 HSC의 사용은 공여자 세포 생착의 평가를 가능하게 하였는데, 이는 twi 마우스가 CD45.2 대립형질을 지니기 때문이다. 본 발명자들의 목표가 twi HSC를 형질도입시키는 것이었기 때문에, 본 발명자들은 Lin- HSPC의 이식을 준비하여, 전체 BM 세포의 사용에 비하여 형질도입 및 이식되는 세포의 수를 줄이려고 하였다. 야생형 (+/+) 마우스로부터의 HSPC를 최적화된 사이토카인 조합의 존재 하에서 MOI 100으로 PGK_GFP.LV(GFP.LV)로 형질도입시켰다(Biffi et al., 2004)(도 12a). 형질도입 후에, 세포를 치사선량 조사된 8일된 twi 마우스 또는 +/- 대조군으로 이식시켰다. 또한, 대조군에 야생형 BM 또는 Lin- 세포를 이식한 twi 마우스를 포함시켰다. 놀랍게도, 대조군 동물과 상이하게, HSPC-이식된 -/- twi 마우스는 치사 조건형성(lethal conditioning) 후에 생존하지 않았으며, 이에 따라, 이는 단독의 Lin- 세포가 twi 마우스를 재분포시킬 수 없었음을 시사한다(도 12b).
따라서, 본 발명자들은 HSC가 없는 미형질도입 BM-유래의 조혈 수임된 전구세포의 공동-이식에 의하여 GFP.LV 형질도입된 HSPC 생착을 지지하기로 정하였다. 이들 세포를 +/+ 마우스의 전체 BM으로부터 Sca1+ 세포의 자기적 고갈에 의해 수득하였다. 흥미롭게도, GFP.LV 형질도입된 +/+ Lin- 세포 및 형질도입되지 않은 +/+ Sca1- 세포를 이식한 twi 마우스는 +/+ 전체 BM 이식으로 수득된 마우스와 유사한 생존에 도달하였다(도 12b). GFP.LV 형질도입된 HSPC의 생착을 말초 혈액 상에서 유세포분석으로 평가하였다. 이식 5-6주 후에, 세포형광측정 분석으로, GFP+ HSPC-유래의 세포의 높은 생착이 드러났다(도 12c). 따라서, +/+ Sca1- 전구세포의 공동-이식은 정제된 HSPC의 결함이 있는 생착을 구출하였으며, 수명의 연장 및 전체 +/+ BM 이식으로 수득된 것과 유사한 twi 마우스의 표현형의 개선을 가능하게 하였다(Yeager et al., 1993; Wu et al., 2000).
일단 이식 절차를 +/+ HSPC 및 GFP.LV로 최적화시키면, twi 마우스를 GALC.LV 형질도입된 -/- HSPC 및 +/+ 또는 GALC.LV 형질도입된 -/- Sca1- 세포 중 어느 하나로 이식하였다. GALC.LV 형질도입된 -/- HSPC 및 +/+ 미형질도입 세포를 받은 twi 마우스는 +/+ 전체 BM 또는 +/+ HSPC 및 Sca1- 전구세포가 이식된 마우스보다 유의미하게 더 길게 생존하였으며, 이들의 표현형의 개선 및 더 느린 질환 진행을 보여주었다(도 12b). 이러한 데이터는 GALC 과-발현 HSPC 이식이 통상적인 HSCT에 비해 독특힌 치료적 혜택을 제공함을 시사한다. 그러나, 본 발명자들이 Q-PCR에 의하여 이들 마우스의 BM 중의 GALC.LV 형질도입된 세포의 존재를 평가하는 경우, 본 발명자들은 0.8 내지 1의 낮은 벡터 카피수(VCN)를 밝혀냈으며, 이에 따라, 이는 낮은 VCN을 갖는 GALC.LV 형질도입된 세포만이 생착될 수 있었음을 시사한다.
그럼에도 불구하고, GALC.LV로 형질도입된 -/- Lin- 및 Sca1- 세포를 받은 twi 마우스는 치사 조건형성 후에 사멸하거나 미처리 마우스와 유사한 수명을 가졌다. 이들 결과는 GALC.LV 형질도입된 전구세포가 HSPC 생착을 지지하는 데 실패했으며, 생착 실패 및 조혈작용의 자가 재구성을 야기하였음을 시사한다.
본 발명자들은 약간 덜한 중증도 모델로부터 이익을 취하기 위하여 GLD의 보통의 twi 모델 대신에 FVB/twi 마우스를 사용하기로 결정하였으며: 이전의 실험은 Sca1-지지 세포의 필요 없이, Lin- 세포의 성공적인 이식이 이러한 모델에서 가능하였음을 보여주었다. 더욱이, FVB/twi 마우스는 더 많은 새끼를 가져, mHSPC를 단리하기 위한 더 많은 수의 -/- 마우스를 갖게 해준다.
형질도입된 mHSPC는 치사선량 조사된 8일된 FVB/twi -/- 및 이형접합(+/-) 수여자에게 이식시켰다(도 13). 생물학적 변이성을 줄이기 위하여, 본 발명자들은 -/- 및 +/- 한배새끼(littermate)를 이식시켰다. 대조군의 마우스를 GFP.LV 형질도입된 +/+ 세포로 이식하였다. 이러한 대조군에 대하여, 시험관 내 배양 상에서 형질도입 7일 후에 세포형광측정에 의하여 형질도입 효능을 평가하는 한편, HSCT 6주 후에, 말초 혈액 상에서 세포형광측정에 의해 형질도입된 세포의 생착을 평가하였다. 형질도입 효능은 GFP+ 세포의 75% 내지 93% 범위로 매우 높았다. 모든 GFP-이식 동물은 이식된 세포의 높은 생착을 보여주었으며(63% 내지 85%), 모든 조사 대조군(HSCT를 받지 않았던 치사선량 조사된 마우스)은 조건형성 3주 후에 사망하여, HSCT 조건의 올바른 설정을 확인하였다. GFP.LV 형질도입된 +/+ mHSPC를 받은 -/- 마우스는 치사 조건형성 후에 이식하지 않은 대조군 마우스에 비해, 연장된 생존을 달성하였다(150일 이하). 미처리 및 GFP-이식된 FVB/twi 마우스의 생존은 각각의 twi 마우스 그룹에서 관찰되는 생존에 비해 더 길었으며, 이에 따라, 표현형의 중증도에서의 유전적 백그라운드의 영향을 확인하였다. 또한, 형질도입된 mHSPC의 생착을 희생 시에 BM 이식된 마우스로부터 추출된 DNA 상에서의 Q-PCR에 의해 평가하였다. 게놈당 VCN으로 측정한, GFP.LV 형질도입된 mHSPC의 상당한 생착이 관찰되었다(표 2). 두드러지게, GALC.LV 형질도입된 -/- 또는 +/+ mHSPC를 이식한 -/- 및 +/- 마우스 둘 모두는 치사선량 조사에 대해 생존하지 못했다(조사 대조군과 유사하게 21일 이내 사망)(도 13 및 데이터 미도시). Q-PCR로, 그들의 BM에서 매우 낮은 VCN 내지 검출불가능한 VCN이 나타났다(표 2). 이들 결과는 GALC-형질도입된 mHSPC의 기능적 손상이 치사 조건형성된 숙주가 재분포되게 할 수 없게 하였음을 나타낸다.
GALC 를 발현하는 뮤린 및 인간 HSPC 의 아폽토시스 .
GALC.LV 형질도입된 HSPC의 기능적 손상이 검출되어서, 본 발명자들은 이것이 드 노보 GALC 발현에 의해 매개되는 형질도입된 세포의 아폽토시스 때문일 수 있는 지를 평가하였다. 전이유전자 발현이 아마도 정상 상태에 도달하였을 때(도 14b에서 GFP 발현 참조), 상이한 2회의 시간, 즉 형질도입 2일 및 5일 후에 아넥신 V 염색 및 TUNEL 검정에 의해 아폽토시스의 발생을 평가하였다. 첫번째 기법은 초기 아폽토시스 세포를 표지하고, 두번째 기법은 후기 아폽토시스 세포를 표지한다. m- 및 hHSPC를 GALC.LV 및 대조군 GFP/ARSA.LV로 형질도입시켰다. 형질도입 및 세정 후에, TUNEL 검정을 위하여 세포를 매트리겔-코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하거나, 보통의 플레이트에서 배양하고, 아넥신 V 및 TUNEL에 대하여 염색하였다. 공초점 현미경에서, 대부분의 GALC.LV 형질도입된 mHSPC는 TUNEL 양성이었으며, 응집된 염색질과 함께 확대된 핵을 나타내었으며, 이는 둘 모두의 시간에서의 아폽토시스의 광범위한 발생을 나타낸다(도 14a-b). 반면, ARSA/GFP.LV 형질도입된 세포는 대부분 TUNEL 음성이었다. 아넥신 V 염색으로, 아폽토시스의 발생을 확인하였으며, 이는 대조군에 비하여 GALC-형질도입된 m- 및 hHSPC에서 더 높은 비율의 아폽토시스 세포를 보여주었다(도 14c).
GALC 발현 독성에 대한 감수성은 분화 및 세포 계통에 좌우된다.
대식구 및 미세아교세포는 LSD에 대한 HSPC 유전자 요법 방법에서 신경계를 비롯한 이환 조직에서 효소 활성을 재구성하는 HSPC 이펙터 자손을 나타낸다. 본 발명자들은 원형의(prototypical) 단핵구성 세포주(U937), 일차 인간 단핵구, 일차 뮤린 대식구 및 미세아교세포가 LV 매개의 유전자 전달 시에 GALC 발현 독성을 경험할 수 있는지를 평가하였다. 더욱이, 조혈 분화에 따라 GALC-유도된 아폽토시스의 특이성을 추가로 분석하기 위하여, 본 발명자들은 T 및 B 림프구를 시험하였다. GALC의 면역검출을 가능하게 하고 형질도입 효능을 추정하기 위하여, 몇몇 실험에서, 본 발명자들은 C-말단 태그화된(tagged) 전이유전자를 사용하였으며, 여기서 이 유전자는 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질로부터의 HA 펩티드를 코딩하는 서열과 인 프레임(in frame)으로 융합된다. HA-태그화된 효소는 미변형 효소의 활성에 비해 특이적 활성을 가졌으며, 리소좀 구획으로 적절하게 분류되었다(데이터 미도시). 형질도입 후에, 본 발명자들은 상이한 시간에 TUNEL 검정 및 GALC 활성에 의해 아폽토시스의 발생을 평가하였다. 예상되는 바와 같이, 분석한 모든 세포 유형은 상이한 수준의 기저 GALC 활성을 보여주었다(도 17).
뮤린 대식구를 복막 세포 수집물의 부착 분획으로서 수득하였다. 미세아교세포의 일차 배양물을 확립된 프로토콜에 의하여 +/+ 및 - /- FVB/twi 마우스의 뇌로부터 단리하였다(Armstrong RC., 1998; Gritti et al., 1996). 추가로, 본 발명자들은 일차 단핵구 및 U937 단핵 세포주 둘 모두를 시험하였다. CD14 단핵구성 마커에 대한 양성 선택에 의하여 인간 단핵구를 PBMC로부터 단리하였다. GFP.LV를 사용하고, 세포형광측정(가능한 경우)에 의해 또는 공초점 현미경에 의해 형질도입 효능을 분석하여 형질도입 조건을 설정하였다. 일단 형질도입 프로토콜이 최적화되면, 미세아교세포 및 대식구를 각각 MOI 50 및 200으로 GALC.LV/GALC-HA.LV 및 대조군 벡터로 효율적으로 형질도입시켰으며, 기저 수준을 초과하여 GALC를 발현시켰다(도 18). 심지어 높은 발현 수준(야생형 수준에 비해 40배 이하)이 달성된 경우에도, TUNEL 검정에 의해, 모든 시험한 세포에서 GALC.LV 형질도입 및 GALC 과발현 후에 낮은 빈도의 아폽토시스가 나타나거나 아폽토시스가 나타나지 않았다(도 18). +/+ 와 -/- 미세아교세포 사이에 차이가 관찰되지 않았다(도 18, 다른 데이터는 미도시). 이들 결과는 HSC 유전자 요법 이펙터 세포가 GALC 독성에 감수성이 아님을 나타내며, 이에 따라 GLD를 위한 HSC 유전자 요법 전략을 개발하기 위하여, GALC 발현이 HSPC에서 제거되어야 하는 한편, GALC 발현이 분화된 조혈 골수 세포에서는 촉진되어, 효소를 이환 조직으로 표적화시킬 수 있어야 함을 제시한다.
전체 PBMC의 PHA-자극 및 EBV 형질전환 시에 각각 인간 T 및 B 림프구를 수득하였다. 단핵구 및 대식구를 사용한 실험과 유사하게, GFP.LV 및 유세포분석을 사용하여 형질도입을 최적화시켰다. B 림프구를 MOI 100으로 GALC.LV/GALC-HA.LV 및 대조군 벡터로 효율적으로 형질도입시켰으며, MOI 100에서 2개의 히트(hit)를 T 림프구를 위해 사용하였다. 형질도입 시에 GALC 활성에서의 지속된 증가에도 불구하고, 시험한 모든 시간에 아폽토시스가 검출되지 않았으며(도 19), 이에 따라 분화된 조혈 세포가 GALC 과별현에 검출가능하게 감수성이 아니라는 개념을 추가로 지지하였다.
miRNA126 에 의한 GALC 발현에서의 시험관 내 조절.
HSPC에서 miRNA126-조절된 GALC 발현의 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 mHSPC를 MOI 100으로, GALC.miR126T.LV, 또는 GFP.miR126T.LV 또는 GALC.LV로 형질도입시켰다. 세정 후에, 세포를 CFC 검정을 위해 씨딩하거나, GALC 활성 검정 및 Q-PCR 분석을 위하여 2주 동안 시험관 내에서 배양하였다. GALC.miR126T.LV로의 형질도입은 분화된 mHSPC 자손에서 야생형 수준을 초과하여 2배 이하의 상위생리학적 수준으로 GALC 활성의 재구성을 가능하게 하였다(도 35b). 중요하게는, GALC.miR126T.LV로 형질도입된 mHSPC로부터 수득한 콜로니의 수는 대조군과 유사하였으며, GALC.LV 콜로니에 대해서는 거의 2배였고(도 21c), 이에 따라, 이는 miRNA 126에 의한 GALC 발현의 조절이 형질도입된 mHSPC의 클론형성능을 보존하는 것을 가능하게 함을 시사한다. 이들 유망한 결과는 영향받지 않은 클론형성능이 GALC.miR126T.LV 형질도입된 mHSPC의 아폽토시스로부터의 구출 때문이었는지를 평가하도록 자극하였다. 형질도입 후에, mHSPC를 매트리겔-코팅된 커버슬립에 씨딩하고, TUNEL 검정을 배양 2일 및 5일 후에 수행하였다. 아폽토시스의 수준을 공초점 현미경으로 평가하였다. GALC.miR126T.LV 형질도입된 세포에서의 TUNEL 검정으로, 대조군 LV가 형질도입된 세포에서 관찰되는 것과 유사하게, 두 시간(각각 1일 및 5일에 1 %1 및 3%2) 모두에서 적은 아폽토시스를 보이거나, 아폽토시스를 보이지 않는 것으로 나타났다(도 22a-b). 이러한 데이터는 miRNA126에 의한 GALC 발현의 억제가 GALC-유도된 아폽토시스로부터 mHSPC를 구출할 수 있었음을 나타낸다.
miRNA126 에 의한 GALC 발현에서의 생체 내 조절
mHSPC 재분포능에서의 miRNA126-조절된 GALC 발현의 효과를 +/- FVB/twi 마우스에서 평가하였다. 치사선량 조사된 8일된 마우스를 GALC.miR126T.LV 형질도입된 -/- mHSPC 또는 PGK GALC.LV 형질도입된 세포로 이식하고, 단기간 및 장기간 둘 모두에서 생존을 평가하였다. CD11b_GALC.LV로 관찰된 것과 유사하게, GALC.miR126T.LV 형질도입된 mHSPC를 이식한 +/- FVB/twi 마우스는 치사 조건형성 후에 생존하지 않았던 PGK_GALC.LV-이식된 마우스와 다르게, 사망으로부터 구출되었으며, 장기간 생존하였다(HSCT 이후 3개월 초과). GALC. miR126T. LV 형질도입된 mHSPC를 이식한 마우스를 80일 나이에 안락사시키고, Q-PCR 분석을 BM상에서 수행한 경우, 본 발명자들은 평균 VCN이 5인 것을 발견하였으며, 이에 따라 HCT 후에 BM 중의 형질도입된 세포의 장기간의 존재를 확인하였다.
전반적으로, CD11b_GALC.LV 형질도입된 세포와 함게 관찰되는 결과와 함께 이들 결과는 본 발명자들의 개선된 조절형 유전자 요법 전략에 의한 HSPC에서의 GALC 결핍의 성공적인 구출 및 드 노보 GALC 발현으로부터의 보호를 보여준다.
HSPC 에 대해 독성이나 분화된 조혈 세포에서는 독성이 아닌 강제 GALC 발현
유전자 요법의 모델을 개발하기 위하여, 본 발명자들은 5% 미만의 잔류 효소 활성을 야기하는 점 돌연변이(Trs)45를 지니는 GLD 및 야생형 마우스로부터의 HSPC를 GALC- 또는 GFP-발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다(도 23a). GALC 벡터로의 형질도입은 배양된 GLD 세포의 자손에서 GALC 활성을 재구성하였으며, GFP-형질도입된 야생형 세포에 비해 약 2배의 과발현을 야기하였다(도 23b). 정상 CB 또는 BM으로부터의 인간 CD34+ HSPC뿐 아니라 야생형 뮤린 HSPC의 형질도입시에 유사한 발현 수준이 관찰되었다(도 23b). 예상 외로, 강제 GALC 발현은 GFP-형질도입된 세포에 비해 뮤린 및 인간 HSPC 둘 모두의 클론형성 활성을 손상시켰다(도 23d 및 데이터 미도시). 형질도입 2일 후에 수행한 TUNEL 검정으로, 대부분의 GALC-형질도입된 HSPC가 TUNEL 양성이었으며, GFP-형질도입된 HSPC는 TUNEL 양성이 아니었음이 나타났고, 응집된 염색질과 함께 확대된 핵을 나타내었다(도 23e 및 f). 이들 관찰은 GALC-형질도입된 HSPC의 클론형성 손상이 또한 아넥신 V 염색(미도시)으로도 확인된 바와 같은 아폽토시스의 유도 때문이었음을 시사한다. miR-142-조절된, GALC-코딩 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 HSPC가 정상의 클론형성 활성과 아폽토시스의 부재를 나타내었기 때문에, HSPC의 기능적 손상은 강제/드 노보 GALC 발현에 의해 직접 야기되며, 벡터 제제에 관련된 독성에 의해 직접 야기되는 것은 아니다. 실제로, 142T 서열은 조혈 세포에서 GALC 효소 발현을 억제하였으나, LV 생성자 세포33에서는 GALC 효소 발현을 억제하지 않았다(도 23b). 또한, GALC-형질도입된 뮤린 HSPC가 치사선량 조사로부터 Trs 마우스를 구출하는데 실패하였기 때문에, 강제/드 노보 GALC 발현은 장기간 생착 세포에 독성이 있었다(도 24a).
HSC 이식 시에, 대식구 및 미세아교세포는 이환 조직에서 GALC 활성을 재구성하는데 책임이 있는 이펙터 자손이다. 또한, 강제/드 노보 GALC 발현에 의한 독성이 분화된 세포에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 인간 일차 단핵구, 즉 T 및 B 림프구뿐 아니라, 마우스 미세아교세포를 GALC- 또는 대조군 벡터로 형질도입시켰다(도 24b). 효율적인 형질도입 및 GALC 과발현이 모든 세포 유형에서 달성된 한편, TUNEL 검정으로 배양물에서 낮은 아폽토시스가 나타나거나 아폽토시스가 나타나지 않았다(도 24b 및 c). 따라서, GALC 발현에 대한 감수성은 성숙 조혈 세포에서는 관찰되지 않았던 HSPC의 독특한 특징이다.
miR -126 조절은 HSPC 를 GALC 발현 독성으로부터 구출하고, GLD 의 유전자 요법을 가능하게 한다
HSPC에서 드 노보 GALC 발현의 선택적 독성으로, GLD의 성공적인 유전자 요법을 위하여 HSPC에서 전이유전자 발현을 엄격하게 조절할 필요가 강조되었다. 이에 따라, 본 발명자들은 본 발명의 신규한 miR-126 기반의 조절 시스템의 효능을 시험하고, 이를 GALC 발현을 분화된 HSPC 자손에 표적화하기 위한 골수-특이적 CD11b 프로모터에 기초한 전사 전략과 비교하였다. 두 전략 모두는 형질도입된 HSPC를 GALC-유도된 독성으로부터 구출하였다(도 23b-e 참조). 그러나, 재구성된 GALC 활성은 심지어 유사한 벡터 카피수로 형질도입된 배양물을 비교한 경우에도 CD11b-GALC 형질도입된 세포에서보다 GALC-126T 렌티바이러스로 형질도입된 세포의 자손(여기서, GALC 발현은 PGK 프로모터에 의해 추진됨)에서 실질적으로 더 높았다(야생형 수준에 비해 2배 이하)(도 23b 및 c). 또한, 본 발명자들은 GALC.126T 렌티바이러스 벡터가 GALC 독성으로부터 인간 HSPC를 효과적으로 보호함을 입증하였다(도 23c 및 d). 성숙 조혈 세포에서 상위생리학적 효소 활성으로부터의 있음직한 혜택을 감안하여, 본 발명자들은 GLD 요법의 생체 내 연구를 위하여 miRNA-조절된 벡터를 선택하였다.
Trs 마우스로부터의 HSPC를 GALC-126T 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고, 새로 태어난 Trs 마우스에 이식시켰다. 이식된 마우스를 성공적으로 생착시키고(도 24a), 미처리 Trs 마우스(p<0.0001)에 대해서뿐 아니라, 야생형 GFP-형질도입된 HSPC를 이식한 마우스에 대해서 유의미하게 더 긴 생존을 보였다(p=0.002; 도 24a 및 d). 더욱이, 본 발명자들이 BM에서 측정된 벡터 카피수에 따라 유전자 요법 처리된 마우스를 계층화시키는 경우, 가장 높은 벡터 함량을 갖는 동물이 유의미하게 더 긴 생존을 보여주었으며(도 6e), 이는 조혈 세포에서의 상위생리학적 효소 발현이 HSC 이식의 치료적 효능을 증가시킴을 강력하게 시사한다. 실제로, 기능적 GALC 효소의 이환 뇌로의 효과적인 전달 및 결핍 활성의 재구성이 유전자 요법 처리된 Trs 마우스의 뇌에서 관찰되었다(도 24f-i). 처리된 마우스의 중추신경계에서, GALC 활성은 Iba1+, CD45+ 침윤성 조혈 세포 및 Iba1-, CD45- 비-조혈 세포 둘 모두에서 검출되었으며(도 24f-i), 이는 아마도 이식되고 형질도입된 HSPC의 자손에 의한 효소 분비에 기인한 잔류 세포의 교차-수정을 나타낸다. 중요하게는, 효소 활성의 재구성 및 증가된 생존은 미처리 이환 대조군에 비해 처리된 마우스의 유의미하게 개선된 표현형과 관련이 있었으며, 걷는 능력이 보존되고, 단일수축(twitching)(GLD-관련 기도진전(intentional tremor))이 감소되었다.
고찰
조혈계에서 miRNA 발현의 딥 프로파일링( Deep profiling )
이러한 작업에 사용되는 miRNA 리포터 벡터는 miRNA 발현 수준에만 의존하지 않고 miRNA 생물활성을 측정할 기회를 제공하여, 생물학적으로 의미있는 miRNA 기능의 정량적 판독을 제공한다. 브라운(Brown) 등은 miRNA 표적에 대한 유의미한 억제 활성이 발생하기 위하여, 역치 수준의 miRNA 발현이 달성되어야 하며, 이는 세포 내에서 이용가능한 제한적 RNAi 기구의 결과일 수 있음을 제안하였다(Brown et al., 2007). 작은 RNA가 제한된 RNAi 이펙터 복합체에 대하여 경쟁한다면, miRNA의 활성 RISC로의 혼입을 보장하기 위하여 충분히 높은 수준의 발현이 필요할 수 있다. 따라서, 매우 낮은 수준으로 발현되는 그들 miRNA 종은 활성을 갖지 않거나, 활성을 거의 갖지 않을 수 있는데, 이는 이들이 기능성 RISC의 일부가 아니기 때문이다. miRNA 프로파일링 연구는 종종 miRNA 발현의 상대적 차이만을 고려하며, 이에 따라, 유전자 조절과 무관할 수 있는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낼 수 있다. 게놈-와이드(wide) miRNA 발현 분석(예를 들어, 마이크로어레이 또는 딥 시퀀싱에 의한)과 miRNA 리포터 Bd.LV 방법을 조합하는 것은 마이크로RNA의 연구에 추가의 면을 가한다. 이는 차등적 miRNA 발현의 생물학적 유의성을 엄중하게 입증하게 하며, 단일 세포 분해능으로, 살아있는 세포에서 다수의 세포 집단에 걸쳐 선택된 miRNA의 발현을 종적으로 연구하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은 HSC와 같은 불충분하게 이용가능한 희귀 세포 집단에서 선택된 miRNA의 발현을 연구하기 위하여 이러한 방법을 사용하였다. 본 발명의 miRNA 리포터 벡터는 문헌에 기재된 miR-223 및 miR-126 발현 프로파일에서 확인된 데이터뿐 아니라, 매우 순수한 HSPC 하위집단 및 이들의 자손 내의 이들 miRNA의 활성에서의 첨가된 추가의 정보를 연구한다. miR-223은 마우스 및 인간의 골수 계통에서 풍부하게 발현되는 것으로 이전에 기재되었다(Chen et al., 2004; Fazi et al., 2005; Rosa et al., 2007). 실제로, 본 발명의 리포터 벡터 데이터로, 과립구에서 가장 높은 miR-223 활성을 관찰하였다. 더욱이, miR-223 활성은 단핵구, 및 HSPC의 계층, 특히 과립구-단핵구 계통으로 수임된 전구세포에서도 나타났다. 본 발명자들의 데이터는 적어도 일부의 다능성 조혈 세포가 마우스 및 인간 둘 모두에서 miR-223을 발현함을 시사한다. 한가지 가능성은 이들 세포가 과립구-단핵구 운명으로 프라이밍(primed)된 것이다. 본 발명자들의 양방향성 리포터 벡터는 이들 HSPC 집단을 miR-223 발현에 따라 분류하게 하며, 그들의 분화능을 탐색한다. 이들 연구는 표면 마커에만 의존하지 않고 골수 전구세포를 예상하여 동정하고, 아마도 계통 수임의 가장 초기 단계를 조사하기 위한 새로운 방법을 제공할 수 있다.
조혈계에서의 miR-126의 발현은 지금까지 불충분하게 특성화되었다. 광범위한, 딥-시퀀싱 기반의 miRNA 프로파일링 연구는 이를 CD34+ HSPC에 광범위하게 할당하였다. 본 발명자들은 이제 miR-126이 뮤린 및 인간 HSPC에서, 특히 가장 원시의 HSC가 풍부한 서브셋에서 활성이 있음을 발견하였다. 초기 분화 단계 중에, miR-126 활성은 점차 감소하였다. 본 발명자들의 공동 연구자인 토론토 소재의 UHN에 의하여 수행된 NOD/SCID 마우스로부터 새로 단리된 BdLV.126T-형질도입된 CB HSPC의 분석에 의하여 miR-126와 인간 HSC의 연관이 추가로 제공되었다(Lechman et al., 2008, ASH Abstract). 본 발명자들의 데이터는 대부분의 다운스트림 계통에서의 침묵화와 함께, miR-126에 대한 줄기/초기 전구세포-특이적 발현 패턴을 지지한다.
흥미롭게, "코어-결합 인자"(CBF) 내의 돌연변이로 특성화되는 급성 골수성 백혈병(AML)의 하위그룹은 높은 수준의 miR-126 121을 발현한다. 본 발명자들은 miR-126의 유효한 표적으로서 폴로-유사(polo-like) 키나아제(PLK-2)를 동정하였다. PLK-2는 세포 주기의 조절자로 인식되어 왔으며, 혈액암에서 종양 억제 유전자로 작용할 수 있다. miR-126과 HSC의 단단한 연관성을 고려해볼 때, 본 발명자들은 토론토 소재의 UHN에서 존 딕(John Dick)의 그룹과 공동연구하여 AML의 발생 계층의 꼭대기에 있는 희귀 하위집단인 백혈병 줄기 세포(LSC)에서의 miR-126의 활성을 연구하였으며, 이는 화학요법 내성 및 재발의 원인인 것으로 생각된다(Barabe et al., 2007; Kennedy et al., 2007). 예비 결과는 AML 샘플, 특히 CBF-AML과 다른 하위그룹에 속하는 것이 소정의 기울기의 miR-126 발현을 나타내며, LSC-풍부 CD34+38- 분획에서 가장 높고, 비-생착 분획에서 낮다. 이러한 패턴의 miR-126 활성은 LSC의 면역결핍 NOD/SCID 마우스로의 이식시에 유지된다. 따라서, 렌티바이러스 리포터 Bd.LV에 의해 가시화된 miR-126 활성은 백혈병 AML 줄기 세포에 대한 새로운 바이오마커(biomarker) 및 잠재적인 치료 표적으로 소용될 수 있다(Lechman et al., 2008, ASH Abstract).
miR-126은 조혈계 밖에서, 내피 세포에서 혈관신생 신호전달의 양성의 조절제로서 널리 기재되어 있다. 혈관신생은 기존의 혈관의 성장을 통한 새로운 혈관의 형성을 말한다. 혈관신생을 촉진시키는 신호는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)를 포함하며, 이는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 및 포스포이노시티드 3-키나아제(PI3K) 캐스케이드(cascade)를 자극하여, 내피 세포의 증식 및 운동성과 그에 따른 혈관 스프라우팅(sprouting)을 조절한다. miR-126은 혈관신생 과정에 수반되는 2개의 입증된 표적, 즉 스프라우티(Sprouty)-관련 EVH1 도메인 함유 단백질(Spred1) 및 PI3K의 조절 서브유닛을 가지며, 둘 모두는 VEFG/FGF 신호전달의 음성 조절제이다. miR-126이 결여된 내피 세포는 혈관신생 신호에 반응하지 못한다. 제브라피쉬(zebrafish)에서 miR-126의 낙다운은 배아 발생 중에 출혈 및 혈관 완전성의 소실을 야기하는 한편(Fish et al., 2008), 마우스에서 miR-126의 결실은 혈관 완전성의 소실 및 내피 세포 증식, 이동 및 혈관신생의 결함에 기인한, 누출 혈관(leaky vessel), 출혈 및 일부 배아 치사를 야기한다(Wang et al., 2008).
요약하면, miR-126은 혈관신생 내피 세포뿐 아니라 조혈 줄기 세포 및 그들의 직후의 자손에서 생물학적으로 유의미한 수준으로 발현된다. 흥미롭게도, miR-126의 발현은 내피 세포 및 HSC가 공통으로 갖는 다른 인자이다. 사실상, 배아 발생 중에, 난황 주머니 내에서의 내피 및 조혈 세포(적혈구)의 동시의 출현, 대동맥-생식샘(gonado)-중신(mesonephros) 영역 (AGM)에서의 HSC 및 내피 세포의 성공적인 발생은 소위 "혈관모세포" 세포 집단으로부터 발생하는 이들 2 계통의 공통의 기원을 분명히 보여준다. 놀라울 것도 없이, 원래는 혈관 내피에서 배타적으로 발현되는 것으로 생각되었고 HSC에서 발견된 유전자 및 전사 인자 및 막 수용체, 예컨대 Tie2 수용체, Sca-1, VEGFR-(Flt-1), VEGFR-(Flk-1) 및 CD31의 리스트가 늘어나고 있다.
발생 동안, 그리고 성체 골수에서 미소 혈관계 및 HSC 사이의 기능 및 해부상의 연관성을 고려해볼 때, miR-126은 조혈 니치(hematopoietic niche)의 항상성에 기여할 수 있으며, 그의 내피 및 HSC 성분 둘 모두의 증식을 조절할 수 있다.
miRNA 기능으로 miRNA -조절된 LV 의 간섭
miRNA 조절을 조사하는 것에 관한 하나의 관심사는 miRNA 표적 서열을 함유하는 과발현 전사체에 의해 천연 miRNA 표적의 조절을 간섭할 가능성이다. 마이크로RNA-조절된 LV의 생물학 및 안전성을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 miRNA의 활성을 포화시키기 위한 용량 요건을 정량화하였다(Gentner et al., 2009). miRNA 표적 서열을 함유하는 증가 용량의 전사체를 사용한 세포의 접종 시에, 천연 miRNA 표적 및 감수성 리포터의 조절의 소실을 측정하여, 본 발명자들은 생리학적 miRNA 조절을 간섭하기 위한 역치가 일반적으로 높으며, 강한 바이러스 프로모터로부터 발현이 추진되는 경우에만 도달될 수 있음을 발견하였다. 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터와 유사한 중등의 프로모터로부터 발현된 miRNA 표적 서열은 심지어 높은 벡터 카피수(50 이하의 통합)에서도 miRNA 활성을 포화시키지 못했다. 이는 중등의 프로모터로부터, 그리고 세포당 제한된 통합수로부터 miRNA 조절된 전사체를 발현하는 경우, miRNA 조절이 HSC 유전자 요법을 위해 안전하게 이용될 수 있음을 시사한다. 그러나, 본 발명자들은 렌티바이러스 벡터를 miRNA 활성을 의도적으로 간섭하기 위하여 엔지니어링하여, miRNA 기능을 특성화하기 위한 도구로 사용할 수 있음을 발견하였다.
강력한 프로모터로부터 miRNA 표적 서열을 과발현하는 경우, 본 발명자들은 miRNA 활성이 포화되어, miRNA 126에 대한 천연의 표적의 조절의 소실을 야기할 수 있었음을 기재하였다. 더욱이, 본 발명자들은 본 발명의 표적 서열의 설계를 변경함으로써 포화가 바람직할 수 있음을 알아냈다. 본 발명의 유전자-조절된 벡터, 예컨대 본 가설에 기재된 벡터에 대하여, 본 발명자들은 siRNA의 활성 모드와 유사하게, 주로 mRNA 전사체의 분해를 야기하는 완전하게 상보성인 miRNA 결합 부위를 이용하였다(도 2c 참조)(Brown et al., 2007). 이러한 과정이 빠른 반응동역학으로 발생하기 때문에(Haley et al., 2004), miRNA-RISC 복합체는 실제로 높은 턴오버 속도를 갖는 효소와 같이 작동하여, 내재적으로 포화되기 어렵게 한다. 반면, miRNA의 뉴클레오티드 9 내지 11의 미스매치를 miRNA 표적 서열에 도입하는 경우, 전사체 분해는 손상되며(57), miRISC/mRNA 복합체를 동물 세포에서 천연의 miRNA에 의해서도 주로 사용되는 "번역 억제" 경로로 재배향시킨다. 번역 억제가 분해보다 더 낮은 수준으로 발생할 것 같기 때문에, 본 발명자들은 생성된 불완전한 표적이 완전히 상보적인 표적에 비해 miRNA 활성을 경쟁적으로 차단하는데 더 효과적이게 함을 보여주었다(Gentner et al., 2009). 중요하게는, 렌티바이러스 벡터-기반의 기법은 miRNA 낙다운을 위해 설계된 이러한 발현 카세트의 게놈 내로의 안정적인 통합을 가능하게 하여, miRNA 활성을 사용한 안정적인 간섭을 가능하게 하는 플랫폼을 제시한다. 본 발명자들은 miR-223의 안정적인 낙다운을 수득하기 위하여 이러한 기법을 성공적으로 이용하였다. miR-223 낙다운 벡터로 형질도입된 BM 세포를 높은 벡터 카피수로 마우스에 이식하면, 골수 세포의 확대가 야기되며, 이는 miR-223이 과립구 단핵구 전구체에서 골수세포형성의 음성 조절제로서 작용함을 시사한다. 더욱이, 본 발명자들은 miR-223 낙다운 벡터를 함유하는 BM으로 재구성한 마우스에서 염증성 폐 병리학을 관찰하였으며, 이는 염증성 골수 세포의 조절에서의 miR-223의 추가의 기능을 제시한다(Gentner et al., 2009). 현저하게, 이들 표현형모사된 마우스는 최근 miR-223 낙아웃 마우스 라인을 형성하였다(Johnnidis et al., 2008). 유전적 낙아웃과 달리, miRNA 기능 소실 연구는 현재까지 "안타고머(antagomir)"로 불리는 화학적으로 변형된 miRNA 안티센스 분자의 일시적 트랜스펙션으로 제한되었다(Krutzfeldt et al., 2005). 효과적이긴 하지만, 이들의 용도는 용이하게 트랜스펙션될 수 있는 세포에 제한되며, 대부분의 일차 세포에서는 용이하게 트랜스펙션되지 않는다. 더욱이, 낙다운은 일시적이어서, 유전적 모델 시스템에 용이하게 적용가능하지 않다. 본 발명자들은 LV 매개의 안정적인 miRNA 낙다운을 위한 광범위한 응용을 구상하였다. 이들은 miRNA의 생리학적 역할을 조사하기 위한 중요한 도구를 구성할 것이다.
조혈 줄기 세포 유전자 요법을 위한 마이크로 RNA -조절된 벡터의 응용
본 발명자들이 이러한 작업에서 기재한 리포터 유전자 발현 패턴은 유전자 요법에 적절한 연루를 갖는다. 대부분의 임상적 유전자 요법 작제물은 표적 세포 유형에서 전이유전자의 강력한 발현을 보장할 뿐 아니라, 오프-표적 발현도 야기하는 편재하여 발현하는 프로모터를 함유한다. 이러한 이소성 발현은 독성, 유전자-변형된 세포의 역선택, 전이유전자 생성물에 대해 지향된 면역 반응의 촉발 또는 심지어는 종양유발 형질전환을 야기할 수 있다(Weil et al., 1997; Ott et al., 2006; Brown et al., 2006; Brown et al., 2007; Woods et al., 2006).
miR-223 표적 서열을 HSC로 운반되는 치료적 전이유전자에 첨가하면, 과립구 단핵구 전구세포 및 적어도 하위분획(subfraction)의 HSC를 비롯한 골수 자손에서 발현이 방지될 것이다. 중요하게는, 이러한 전략은 림프 및 적혈구 계통에서 완전한 치료적 발현을 야기할 것이다.
HSPC에서 강력하게 발현되나 골수 및 림프 계통의 분화된 자손에서는 강력하게 발현되지 않는 miR-126의 동정은 감수성 줄기 세포 집단에서 잠재적으로 독성인 전이유전자의 발현을 방지하면서, 질환에 걸린 자손에서 발현 및 치료적 효능을 유지하게 한다.
GALC 드 노보 발현의 독성
LSD 환자(Rohrbach et al., 2007; Brady et al., 2004) 및 동물 모델(Biffi et al., 2006; Sano et al., 2005; Hofling et al., 2004; Sands et al., 1997)에서의 유전자 요법 응용 및 효소 대체는 일반적으로, 정상 수준을 초과하는 발현 및 리소좀 효소 투여의 독성의 결여를 나타내었다. 이염성백질이영양증(MLD)의 경우에, 술파타이드 대사작용에서 GALC의 업스트림 단계를 촉매작용시키는 ARSA의 LV-매개의 과발현의 안정성이 mHSPC, hHSPC 및 트랜스제닉 마우스에서 나타났으며(Biffi et al., 2004; Capontondo et al., 2007), 이는 이러한 질환을 위한 HSPC 유전자 요법의 임상 시험을 촉발시킨다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 표면화된 독성 및 LV-매개의 GALC 유전자 전달 및 발현 후에 뮤린 및 인간 HSPC의 시험관 내 및 생체 내 기능적 손상의 예기치않은 발견을 보고하였다. GALC.LV 형질도입된 뮤린 HSPC는 손상된 클론형성능을 보여주었으며, 골수파괴성 이식 수여자를 생착시키고 장기간 재분포시키는데 실패하였다. 이는 고도로 형질도입된 HSPC의 음성 선택 및 아폽토시스와 관련이 있었다. GALC 발현이 마이크로RNA(Mechtcheriakova et al; 2007)(조혈 계통 세포에서 배타적으로 발현되는)(Brown et al., 2006)에 의해 조절되는 대조군 벡터로 형질도입된 뮤린 및 인간 HSPC에서 관찰되는 기능적 손상 및 아폽토시스의 결여로, 발현된 GALC의 형질도입된 세포의 사멸을 결정하는 데에서의 독특한 역할을 확인하였다.
분화된 세포는 GALC -관련 독성에 덜 감수성이다
본 발명자들은 조혈 계통의 분화된 세포(림프구, 단핵구, 대식구 및 미세아교세포) 및 다른 계통으로부터의 세포(희소돌기아교세포뿐 아니라 신경 전구세포)(Gritti et al., personal communication)가 LV-매개된 GALC 과발현에 의해 영향을 받지 않았음을 알아차렸다. 따라서, HSPC는 세포 생존의 GALC- 및 스핑고지질-매개의 조절에 독특한 감수성을 갖는 것으로 보이며, 이는 성숙 골수종, 즉 T 및 B 세포로의 분화 중에 명백하게 소실되며, 이는 조혈 계통에 제한된다. 이를 위한 가능한 설명은 다른 세포 유형, 예컨대 미세아교세포 또는 희소돌기아교세포에 비하여 HSPC에서 검출되는 매우 낮은 기저 GALC 활성일 수 있다. 더욱이, 스핑고지질 대사작용의 역할 및 Cer 및 유래된 분자, 예컨대 So 및 S1P의 함량의 변경의 결과는 세포 유형 및 분화 단계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 희소돌기아교세포 내의 세포내 Cer 축적의 효과는 깊이 연구되었으며, 상반되는 관찰이 있다. 최근의 연구는 스핑고마이엘린 분해로부터 Cer 생성의 원인이 되는 산 스핑고마이엘리나아제의 유도가 Cer 축적과 아폽토시스의 유도를 야기함을 보고하였다(Chudakova et al., 2008). 동일한 경로가 알츠하이머 질환에서 산화적 스트레스에 의해 또는 아밀로이드-베타 펩티드 축적에 의해 유도되는 희소돌기아교세포 사멸에 연루되는 것으로 보인다(Jana et al., 2007; Lee et al., 2004). 그러나, 또한 성숙 희소돌기아교세포는 몇몇 아폽토시스-촉진(pro-apoptotic) 자극에 내성이 있어, Cer 축적을 유도하는 것으로 기재되어 있다. 유사하게, 아폽토시스-촉진 TNF-자극에 대한 차등적 반응이 희소돌기아교세포 전구체와 성숙 희소돌기아교세포에서 관찰되었으며, 희소돌기아교세포 전구체에서는 높은 수준의 아폽토시스가 관찰되었으며, 성숙 희소돌기아교세포에서는 아폽토시스 자극에 대하여 내성이 있는 것으로 관찰되었다(Scurlock et al., 1999). 또한, 성숙 희소돌기아교세포는 IL-1 투여에 의해 유도되는 아폽토시스에 내성이 있다(Brogi et al., 1997). 이는 세포내 Cer의 증가가 특정 분화 단계에서, 그리고 특정 세포 유형에서 활성화된 경로에 따라, 상이한 방식으로 처리될 수 있음을 시사한다. 이러한 가설을 지지하면서, 신경 조직에서의 세포내 Cer의 증가가 산 세라미다아제의 높은 활성에 의해 처리됨이 보고되었다(Huang et al., 2004). 이러한 효소는 Cer의 So로의 분해를 촉매작용시키며, 이는 차례로 S1P로 인산화된다. S1P는 Cer-유도된 아폽토시스로부터 세포를 구출하고(Betito et al., 2006), 신경 전구 세포에서 증식을 유도한다 (Harada et al., 2004). 유사한 메커니즘이 GALC 과발현-관련 아폽토시스에 대한 희소돌기아교세포의 감소된 감수성의 원인이 된다는 가설을 세울 수 있다. 또한, 스핑고지질 대사 경로는 희소돌기아교세포에서 매우 활성이 있으며, 이 세포는 마이엘린 글리코스핑고지질(GalCer 및 설파타이드)을 생성하기 위한 수초형성에 수반된다. 더욱이, 이들 분자는 탄수화물-탄수화물 상호작용에 참여하여 글리코시냅스(glycosynapse)를 형성한다(참조예(Boggs et al., 2008)).
단핵구 및 대식구에서 관찰되는 GALC 드 노보 발현-유도된 아폽토시스에 대한 감소된 감수성은 세라미다아제의 활성 및 그들의 분비 작용 둘 모두에 의해 설명될 수 있다. 보고에 의해, 내피 세포 및 면역계의 내피 세포에서 Cer가 So 및 S1P로 신속하게 전환되고, 이것이 분비되는 것이 드러났다. 혈장에서, 이러한 분자는 알부민에 결합하며 림프구 상의 특정 수용체에 대한 신호로서 작용한다(참조예(78 142 143 Hannun et al., 2008; Mechtcheriakova et al., 2007; Rivera et al., 2008).
안전하고 효율적인 GLD 유전자 요법을 위한 GALC 발현의 전사-후 조절
전이유전자 발현의 조절은 유전자 요법의 분야에서 엄청난 흥미거리이다. 특히, 마이크로RNA(miRNA)에 의한 전사-후 조절의 가능성은 최근 세포 유형 및 분화에 따라, 전이유전자의 발현 수준을 조정하기 위한 새로운 시각을 열었다(Gentner et al., 2008). 이러한 연구에서, 본 발명자들은 이러한 혁신적인 기법을 적용하여, GALC 과발현 독성에 가장 감수성인 세포로 보여진 HSPC에서 GALC 발현을 억제하는 한편, 희소돌기아교세포의 교차 수정 및 GALC 분비에 책임이 있는 분화된 세포에서 효소 과발현을 가능하게 한다. 특히, 본 발명자들은 말초 혈액 단핵 세포에 비해, HSPC에서 더욱 고도로 발현되는 것으로 보고되어 있던 마이크로RNA126을 선택하였다(145). 본 발명자들의 데이터에 의해, HSC-특이적 miRNA126에 의한 GALC 발현의 조절이 HSPC를 시험관 내에서 GALC 드 노보-유도된 아폽토시스로부터 보호하며, GALC.miR126T.LV를 사용한 GALC -/- HSPC의 형질도입은 CFC 검정으로 평가시 다능성 전구세포의 클론형성능을 손상시키지 않고, 그들의 분화된 자손에서 상위생리학적 수준으로 효소 활성의 재구성을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 miRNA126이 HSPC에서만 GALC 발현을 억제하고, 그들의 분화된 자손에서는 억제하지 않음을 확인시켜준다. 영향받지 않은 클론형성능은 GALC 발현이 HSC에서 뿐만 아니라, CFC 검정에서 조혈 콜로니의 형성에 책임이 있는 다능성 전구세포에서 억제되는 것을 나타낼 수 있다.
더욱이, GALC.miR126T.LV-형질도입된 HSPC의 GALC +/-FVB/twi 마우스로의 이식은 처리 동물의 장기간 생존을 야기하였다. 이러한 데이터는 miRNA126에 의한 더욱 원시의 HSC에서의 GALC 활성의 억제가 그들의 장기간 재분포 및 분화능이 보존되게 함을 증명한다. HSCT 10주 후에 BM 내의 고도로 형질도입된 세포의 존재는 장기간 HSC가 GALC 과발현 아폽토시스로부터 구출되었음을 추가로 확인시켜준다.
중요한 것은 HSC-특이적 miRNA에 의한 전사-후 조절이 강력한 프로모터, 예컨대 PGK의 사용을 가능하게 하여, 분화된 HSPC 자손에서 미조절 PGK_GALC.LV로 수득되는 것과 동일한 전이유전자의 발현 수준에 도달할 수 있다는 점이다. 상술된 바와 같이, 유효한 HSC 유전자 요법에 필요한 GALC 발현의 수준은 알려져 있지 않다. 그러나, 낮은 효소 발현 수준이 임상적 혜택을 얻는데 충분할 수 있지만, 강력한 프로모터의 사용은 벡터 카피수(들)가 감소되어도 원하는 효소 발현에 도달하게 할 수 있다. 이러한 이슈는 HSC 유전자 요법의 임상적 변환의 안정성에 관련될 수 있다.
결론
렌티바이러스 벡터 플랫폼은 마이크로RNA 기능을 연구하기 위한 매우 유용한 다목적 도구를 제시한다. 개발된 양방향성 miRNA 리포터 벡터는 복합 세포 혼합물 내에서 단일 세포 수준으로 miRNA 활성을 측정하고, 통상적인 miRNA 발현 프로파일링 방법에 새로운 면을 가하게 한다. 이러한 방법을 사용하여, 본 발명자들은 전에 없던 분석으로, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 집단 내에서 몇몇 miRNA의 발현을 조사하였다. 프로모터 및 miRNA 표적 설계를 변경하는 것은 안정적인 miRNA 낙다운을 달성할 수 있는 렌티바이러스 벡터를 야기할 수 있으며, 이는 miRNA의 생리학적 역할을 정교하게 만들기 위한 기초로서, 기능-소실 표현형을 생성하는데 유용하다. 안정적인 miRNA 낙다운 후의 프로테옴 분석은 천연의 설정에서 조절되는 miRNA에 대한 주요 표적의 동정을 가능하게 할 것이다.
이들 기본적인 생물학적 의문점을 다루는 것 외에, miRNA-조절된 벡터는 유의미한 치료적 효능을 갖는다. 치료적 전이유전자의 3'UTR에 첨가된 miRNA 표적 서열은 이소성 전이유전자 발현을 감소시켜, 전이유전자 독성을 완화하거나 방지할 수 있다. 특히, HSC가 유전자-변형된 딸세포를 지속적으로 공급함으로써 장기간 질환 수정에 대한 보증물을 나타내기 때문에, 조혈 줄기 세포(HSC) 생물학은 유전자 요법 처리에 의해 방해되지 않아야 한다. 본 명세서에서 특성화된 miRNA, 즉 miR-126, miR-130a 및 miR-223은 HSPC에서 원치않는 전이유전자 발현을 제한하면서, 분화된 자손에서 발현을 가능하게 하며, 임상 유전자 요법 프로토콜로 추가로 개발될 것이다.
본 명세서에 언급된 각각의 출원 및 특허, 및 각각의 출원 및 특허의 출원경과의 과정을 포함하는 상기 출원 및 특허의 각각에 인용되거나 참조된 각각의 문헌("출원에 언급된 문헌") 및 각각의 출원 및 특허내 및 모든 출원에 언급된 문헌에 인용되거나 언급된 모든 물건을 위한 모든 제조자의 지침 또는 카탈로그는 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한 본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 본 명세서에 언급된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌, 및 본 명세서에 인용되거나 언급된 모든 제품을 위한 모든 제조자의 지침 또는 카탈로그는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 상기 기재된 방법 및 시스템에 대한 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 목적으로부터 벗어남 없이, 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 바람직한 특정 실시형태와 연계하여 기술되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명이 명백히 이러한 특정 실시형태에 제한되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 분자생물학 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 자명한, 본 발명을 실시하기 위한 상기 기재된 양상에 대한 다양한 변형이 특허청구범위의 청구항들의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
참고문헌
Figure 112011094814170-pct00001
Figure 112011094814170-pct00002
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SEQUENCE LISTING <110> Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Fondazione Telethon <120> Gene Vector <130> P037109WO <140> PCT/IB2010/001166 <141> 2010-04-30 <150> US 61/174124 <151> 2009-04-30 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA sequence target <400> 1 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 2 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-126T sequence complementary to the miRNA <400> 2 gcattattac tcacggtacg acgatgcatt attactcacg gtacgaacgc gtgcattatt 60 actcacggta cgatcacgca ttattactca cggtacga 98 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA sequence target <400> 3 cagugcaaug uuaaaagggc au 22 <210> 4 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-130aT sequence complementary to the miRNA <400> 4 atgccctttt aacattgcac tgttcgaaat gcccttttaa cattgcactg acgcgtatgc 60 ccttttaaca ttgcactgat gcatatgccc ttttaacatt gcactg 106 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA sequence target <400> 5 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 6 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-223T sequence complementary to the miRNA <400> 6 ggggtatttg acaaactgac acgatggggt atttgacaaa ctgacaaccg gtggggtatt 60 tgacaaactg acatcacggg gtatttgaca aactgaca 98 <210> 7 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 126T/130aT 2/2 combination sequence <400> 7 gcattattac tcacggtacg acgatgcatt attactcacg gtacgaacgc gtatgccctt 60 ttaacattgc actgatgcat atgccctttt aacattgcac tg 102 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 126T (2 targets) <400> 8 gcattattac tcacggtacg acgatgcatt attactcacg gtacga 46 <210> 9 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Triple combination target (126T/130aT/223T, 2 targets each) <400> 9 gcattattac tcacggtacg acgatgcatt attactcacg gtacgaacgc gtatgccctt 60 ttaacattgc actgatgcat atgccctttt aacattgcac tgccccggtg gggtatttga 120 caaactgaca tcacggggta tttgacaaac tgaca 155 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence motif <400> 10 Pro Glu Ser Thr 1

Claims (41)

  1. 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, mir-130a 및 mir-126으로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열이 인터페론-알파, 리소좀 효소 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase) 또는 gp91 phox를 코딩하는, 조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)에서는 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키나, 분화된 세포에서는 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않도록 하는 유전자 요법에 사용하기 위한 유전자 벡터.
  2. 제1항에 있어서, mir-130a에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 서열 및 mir-126에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는, 유전자 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 mir-130a에 상응하는 miRNA 표적 서열의 카피 수는 상기 mir-126에 상응하는 miRNA 표적 서열의 카피 수의 두 배인, 유전자 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 유전자 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스로부터 유도가능한, 유전자 벡터.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 조직 특이적 프로모터를 포함하는, 유전자 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조직 특이적 프로모터가 CD11b, c-Fes 및 CYBB, 및 TEK로 구성된 군으로부터 선택되는, 유전자 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조직 특이적 프로모터는 미엘로이드(myeloid)-특이적인 프로모터인, 유전자 벡터.
  9. 제6항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 인터페론-알파를 코딩하고 프로모터는 TEK (Tie2)인, 유전자 벡터.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유전자 벡터를 포함하는, 조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)에서는 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키나, 분화된 세포에서는 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않도록 하는 유전자 요법에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유전자 벡터로 감염되거나 형질도입된, 조혈 전구 세포(HSPC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)에서는 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키나, 분화된 세포에서는 뉴클레오티드 서열의 발현을 방지하거나 감소시키지 않도록 하는 유전자 요법에 사용하기 위한 세포.
  12. 제11항에 있어서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포인, 세포.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포에서 뉴클레오티드 서열 발현의 방지 또는 감소용 약제의 제조를 위한, 유전자 벡터.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공세포백색질장애, 만성육아종병, 중증복합면역결핍증(SCID) 및 고형 종양으로부터 선택된 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 유전자 벡터.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 요법에 관련된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 생존 기회 증가용 약제의 제조를 위한, 유전자 벡터.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 요법의 안전성; 효능; 또는 안전성 및 효능 증가용 약제의 제조를 위한, 유전자 벡터.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 야기되는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 아폽토시스(apoptosis) 방지용 약제의 제조를 위한, 유전자 벡터.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포의 분화 단계의 모니터링용 약제의 제조를 위한, 유전자 벡터.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 요법에 사용하기 위한, 유전자 벡터.
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