EA023938B1 - Вектор гена - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к вектору гена для использования в генной терапии, содержащему по меньшей мере одну мишень последовательности микроРНК, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, имеющей соответствующую микроРНК в гематопоэтической клетке-предшественнике (ГКП) или гематопоэтической стволовой клетке (ГСК), которые предотвращают или уменьшают экспрессию нуклеотидной последовательности в URG или ГСК, но не в дифференцированной клетке.

Description

Настоящее изобретение касается векторов гена, используемых при переносе генов и терапевтических применениях, а также способов их получения и их применения.

Предпосылки создания изобретения

Трансплантация гематопоэтических клеток (ТГК) от здоровых доноров представляет собой лечебную терапию для некоторых наследственных и приобретенных заболеваний. Тем не менее, пересадка ограничена недостаточным наличием соответствующих доноров и смертностью, связанной с аллогенной процедурой (в основном связанной с реакцией трансплантант против хозяина - РТПХ). ТГК имеет очень низкую эффективность в некоторых расстройствах, таких как лизосомальные болезни накопления (ЛБН). В целях повышения безопасности и эффективности аллогенной трансплантации и определения альтернативных протоколов для пациентов, не имеющих подходящего донора, подход генной терапии основан на пересадке исправленного гена, требуется собственная гематопоэтическая стволовая клетка (ГСК).

В качестве альтернативы аллогенной трансплантации гематопоэтических клеток наследственный генетический дефект может быть исправлен в собственных гематопоэтических клетках пациента путем генной терапии. Тем не менее, доставка функциональной копии соответствующего гена во все пораженные клетки тела очень затруднительна. Концепция генной терапии стволовых клеток основана на генетической модификации относительно небольшого количества стволовых клеток, которые остаются долго в организме в результате процесса самообновления, а также генерирования огромного количества генетически исправленного потомства, тем самым обеспечивая непрерывную поставку исправленных клеток для остальной жизни пациента. Гематопоэтические стволовые клетки представляют собой отличную мишень-популяцию для генной терапии, поскольку они могут быть легко и безопасно получены из костного мозга (КМ) либо мобилизованной периферической крови. Изолированная ГСК может быть генетически модифицирована и возвращена пациенту в качестве собственного трансплантата. Долгосрочная польза требует пересадки достаточно большого количества генномодифицированных ГСК, которые могут населить условный костный мозг, что приводит к увеличению роста клеток крови всех кроветворных линий. Собственные аллогенные ГСК делают процедуру пересадки доступной всем пациентам и позволяют избежать иммунологических проблем с совместимостью, ведущих к РТПХ. Кроме того, некоторые болезни, такие как первичные признаки иммунодефицита, требуют коррекции части кроветворных стволовых клеток и их потомства. Интенсивность режима кондиционирования (так называемого немиелоаблативного или мини режима кондиционирования) уменьшается, что приводит к лучшей переносимости и меньшим количествам побочных эффектов для пациентов. Сниженный режим кондиционирования менее совместим со стандартной аллогенной трансплантацией, потому что смешанный химеризм доноров, как правило, неустойчив в аллогенной настройке из-за иммунологического противоборства с принимающими иммунными клетками реципиента.

Эффективная долгосрочная генная модификация ГСК и их потомства требует технологии, которая позволяет стабильную интеграцию корректирующей ДНК в геном, не затрагивая функции ГСК. Наиболее эффективной системой доставки являются векторы вируса.

Например, перенос генов и экспрессия в гематопоэтическую клетку-предшественник (ГКП) из лизосомального фермента галактоцереброзидазы (при отсутствии глобоидной лейкодистрофии - ГЛД - или болезни Краббе) вызывает апоптоз и функциональные нарушения трансдуцированных клеток, предотвращая развитие ГКП, основанных на подходах генной терапии для лечения расстройств (см. ниже). Таким образом, будущие кассеты экспрессии, используемые в генной терапии должны напоминать физиологические модели экспрессии и избегать внематочной и/или нефизиологической экспрессии трансгена, что может привести к токсичности, удалению или даже злокачественной трансформации трансдуцированных клеток. Это особенно важно для стволовых клеток, ключевая клетка-мишень гарантирует долгосрочную эффективность генной терапии, биология которой не должна быть нарушена генетическим вмешательством.

Подводя итог, текущие гематопоэтические стратегии генной терапии требуют трансдукции ГСК, чтобы гарантировать долгосрочную коррекцию кроветворной системы, но они могут принести значительную пользу от регулируемой экспрессии трансгенных кассет, которые не выражают эктопически трансгенные продукты в ГСК, но включают только в дифференцированное потомство, которые является целью для генетических заболеваний, например, лимфоцитов в ТКИН (тяжёлой комбинированной иммунной недостаточности), гранулоцитов в ХГБ (хроническая гранулематозная болезнь) и моноцитов/макрофагов в ГЛД.

Одним из способов достижения этого является использование линии конкретных транскрипционных контрольных элементов, например эндогенных промоторов локуса, которые приводят к экспрессии терапевтического гена в векторе. Однако промоторы часто распространяются через большие расстояния ДНК и слабо изучены, следовательно, не могут быть легко восстановлены в полном объеме в конструкции вектора. Кроме того, уровни экспрессии от тканеспецифических промоторов, воссозданных в передаче векторов гена, часто недостаточны для достижения фенотипической коррекции, скорее всего, из-за несовершенного восстановления и/или вредного влияния хроматина в полупроизвольной векторной ин- 1 023938 теграции участка гена. Таким образом, крайне необходимы дополнительные стратегии для регулирования трансгена.

Изложение сущности изобретения

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения представленный вектор гена, используемый в генной терапии, содержащий по меньшей мере одну последовательность микроРНК, функционально связан с мишенью нуклеотидной последовательности, имеющей соответствующую микроРНК в гематопоэтической клетке-предшественнике (ГКП), которая предотвращает или уменьшает экспрессию нуклеотидной последовательности в ГКП, но не в дифференцированной клетке.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения представленный вектор гена, используемый в генной терапии, содержащий по меньшей мере одну мишень последовательности микроРНК функционально связан с нуклеотидной последовательностью, имеющей соответствующую микроРНК в гематопоэтической стволовой клетке (ГСК), которая предотвращает или уменьшает экспрессию нуклеотидной последовательности в ГСК, но не в дифференцированной клетке.

Другими словами, настоящее изобретение предлагает вектор гена, подходящий для использования в гематопоэтической генной терапии, содержащий по меньшей мере одну мишень последовательности микроРНК для микроРНК, которая присутствует в достаточном количестве в гематопоэтической клеткепредшественнике или гематопоэтической стволовой клетке и, возможно, трансгене. Под эффективным количеством подразумеваем, что концентрация эндогенного микроРНК достаточна, чтобы уменьшить или предотвратить экспрессию трансгена, который функционально связан с соответствующей мишенью микроРНК последовательности. Таким образом, настоящее изобретение применяет использование микроРНК, сильно экспрессированных в клетках, таких как ГКП и ГСК, но не в дифференцированном потомстве, например миелоидного и лимфоидного происхождения, предотвращая или сокращая экспрессию потенциально токсичного трансгена в группе уязвимых стволовых клеток, в то же время поддерживая экспрессию и терапевтическую эффективность в больном потомстве.

МикроРНК функционально связана с трансгеном. Термин функционально связана означает, что описанные компоненты находятся в отношениях, позволяющих им функционировать необходимым образом.

Стволовая клетка способна дифференцироваться во многие типы клеток. Клетка, способная дифференцироваться во все типы клеток, известна как тотипотентная. У млекопитающих только зиготы и ранние эмбриональные клетки тотипотентны. Стволовые клетки представляют собой клетки, которые есть в большинстве, если не во всех, многоклеточных организмах. Для них характерна способность обновляться посредством митотического деления клеток и дифференцироваться в разнообразные специализированные типы клеток. Два широких типа стволовых клеток млекопитающих: эмбриональные стволовые клетки, которые выделяют из внутренней клеточной массы бластоцист, и взрослые стволовые клетки, которые находятся в тканях взрослого организма. В развивающемся эмбрионе стволовые клетки могут дифференцироваться во все специализированные эмбриональные ткани. У взрослых организмов стволовые клетки и клетки-предшественники выступают в качестве возобновляющей системы для тела, пополняющей специализированные клетки, а также поддерживающей нормальное обновление регенеративных органов, например, крови, кожи или кишечных тканей.

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются мультипотентными стволовыми клетками, которые дают начало всем типам клеток крови, включая миелоидные (моноциты и макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки), и лимфоидные линии (Т-клетки, В-клетки, ΝΚ-клетки).

Клетки-предшественники имеют способность к дифференциации в определенный тип клеток. В отличие от стволовых клеток, однако, они уже гораздо более конкретны: они вынуждены дифференцироваться в свою клетку мишень. Самое важное различие между стволовыми клетками и клеткамипредшественниками в том, что стволовые клетки могут воспроизводиться до бесконечности, в то время как клетки-предшественники могут только делиться ограниченное количество раз. ГКП может быть строго дифференцированна от ГСК только функциональностью в естественных условиях анализа, т.е. трансплантации, а также демонстрации того, что они могут дать начало всем линиям крови в течение длительных периодов времени. Обнаружение поверхностных клеточных маркеров, таких как С-Κίΐ (ΟΌ117), §са-1, и отсутствие/низкой экспрессии панели линии маркеров, в сочетании с недавно описанным набором молекул, принадлежащих к семейству рецепторов §ЬЛМ (СЭ150 и СЭ48). может обогатить субпопуляции ГСК и ГКП, достигая чистоты 50% при испытании стандартными функциональными тестами (Киль и др.).

Дифференцированной клеткой является клетка, которая стала более специализированной, по сравнению со стволовой клеткой или клеткой-предшественником. Дифференциация происходит во время развития многоклеточного организма, так как организм изменяется из одной зиготы в сложную систему тканей и типов клеток. Дифференциация представляет собой также общий процесс у взрослых: взрослые стволовые клетки делятся и создают полностью дифференцированные дочерние клетки во время восстановления тканей и во время нормального обновления клеток. Дифференциация в корне меняет размер ячейки, форму, мембранный потенциал, метаболическую активность и способности реагировать на сиг- 2 023938 налы. Эти изменения происходят в значительной степени из-за высококонтролируемых изменений в экспрессии генов. Другими словами, дифференцированной клеткой является та клетка, которая содержит конкретные структуры и выполняет определенные функции в связи с развитием процесса, который включает в себя активацию и деактивацию конкретных генов. Таким образом, дифференцированная клетка включает в себя дифференцированные клетки линии кроветворения, такие как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки, Т-клетки, В-клетки и ΝΚ-клетки. Например, дифференцированные клетки гематопоэтической линии можно отличить от ГСК и ГКП при обнаружении на поверхности клеточных молекул, которых нет или они менее выражены на недифференцированных клетках. Примерами подходящей линии маркеров являются такие, как СЭ11Ь, Сг1, СЭ19, Тег119 и СЭ3.

В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложен вектор гена для использования в генной терапии, содержащий по меньшей мере одну мишень последовательности микроРНК, соответствующую микроРНК, выбранной из группы, включающей тгК-130а, тгК-126 и тгК-223, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью.

Мишень тгК-126 блокирует экспрессию наиболее эффективно в более примитивных ГКП и (у людей) в эритроидной линии, тгК-126 будет, в частности, пригодна для применения в генной терапии, опираясь на надежную экспрессию трансгена в миелоидной и лимфоидной линиях.

Мишень тгК-130а блокирует экспрессию наиболее эффективно в более примитивных ГКП (также как и тгК-126), тЖ.-130а будет, в частности, пригодна для применения в генной терапии, опираясь на надежную экспрессию трансгена в миелоидной, лимфоидной и эритроидной линиях.

тгК-126 может быть сильнее, чем тЖ.-130а в человеческих СЭ34 клетках, но может также иметь неспецифическую активность в дифференцированном потомстве. Комбинация мишени, включающая тЖ.-130аТ последовательности (предпочтительно 2-4 копии) и половину тгК-126Т (желательно в двух копиях) максимизирует рабочее окно, определяемое отношением репрессии в ГКП и экспрессии в миелоидном потомстве. Кроме того, при использовании комбинации мишени снижение экспрессии трансгена в ГКП обеспечивается за счет двух независимых πυΚΝΑ^ и риск вмешательства в эндогенную регуляцию микроРНК снижается, повышая тем самым безопасность и эффективность целевой последовательности. Мишень тгК-223 блокирует экспрессию наиболее эффективно в миелоидных коммитированных клетках-предшественниках и, по меньшей мере частично, в более примитивных ГКП. В противоположность тгК-126 и тгК-130а, мишень тгК-223 полностью и решительно блокирует экспрессию в дифференцированных миелоидных клетках, включая гранулоциты, моноциты, макрофаги, миелоидные дендрические клетки. Мишень ιηίΚ-223 особенно бы подходила для применения в генной терапии, опираясь на надежную экспрессию трансгена в лимфоидных или эритроидных линиях. Мишень тгК-223 может блокировать экспрессию также очень эффективно в человеческих ГСК.

Предпочтительно, чтобы микроРНК мишени последовательности соответствовали тгК-130а и ийК126.

В одном из вариантов осуществления вектор гена содержит нуклеотидные последовательности, которая управляет экспрессией вектора. Другими словами, эндогенная микроРНК предотвращает экспрессию или распространение вирусов в определенных типах клеток (ГСК и ГКП), но допускает экспрессию или распространение в другие типы клеток. Например, тШ.-126, пйК-130 и пйК-223 предотвращают экспрессию вектора гена или онколитического вируса в гематопоэтических стволовых клетках или клеткахпредшественниках.

В одном из вариантов осуществления вектор гена содержит нуклеотидную последовательность, которая является трансгеном.

В другом варианте осуществления вектор переноса генов находится в форме невирусного вектора переноса генов. В этом варианте осуществления вектор переноса генов может включать в себя или быть в форме вектора экспрессии или плазмиды, которая включает в себя мишень последовательности микроРНК, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью.

Векторы экспрессии, как описано здесь, содержат участки нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности, которые могут быть транскрибированы. Таким образом, последовательности, кодирующие мРНК, тРНК и рРНК, включены в это определение.

Вектор гена или вектор переноса гена настоящего изобретения могут быть использованы для доставки трансгена в сайт или клетку, представляющую интерес. Вектор настоящего изобретения может быть доставлен к целевому сайту вирусным или невирусным вектором.

Вектор является инструментом, который позволяет или способствует передаче объекта из одной среды в другую. Как пример некоторые векторы, используемые в рекомбинантной ДНК, позволяют элементам, таким как сегмент ДНК (например, гетерологичный сегмент ДНК, такой как гетерологичный сегмент кДНК), быть переданными в клетку-мишень. При желании, один раз в клетке-мишени вектор может служить для поддержания гетерологичной ДНК в клетке или может выступить в качестве единицы репликации ДНК. Примеры векторов, используемых в рекомбинантной ДНК, включают плазмиды, хромосомы, искусственные хромосомы или вирусы.

- 3 023938

Невирусные системы доставки включают, но они не ограничиваются методами трансфекции ДНК. Так, трансфекция включает в себя процесс с использованием невирусного вектора для доставки генов в целевую клетку млекопитающих.

Типичные методы трансфекции включают электропорацию, баллистическую трансфекцию ДНК, липидно-опосредованную трансфекцию, уплотненную ДНК-опосредованную трансфекцию, липосомы, иммунолипосомы, липофектин, катионный опосредованный агент, катионные лицевые амфифилы (СРАБ) (Ыа1иге В1о1ееЬпо1оду, 1996, 14; 556) и их комбинации.

В одном варианте осуществления вектор гена представляет собой вектор вируса.

Вирусная система доставки включают, но не ограничивается ими, вектор аденовируса, аденоассоциированный вирусный (ААВ) вектор, герпесный вирусный вектор, ретровирусный вектор, вектор лентивирусов, бакуловиральный вектор. Другие примеры векторов включают векторы бывших естественных систем доставки, которые включают, но не ограничиваются ими, методы трансфекции ДНК, такие как электропорация, баллистическая трансфекция ДНК, липидно-опосредованная трансфекция, уплотненная ДНК-опосредованная трансфекция.

Термин векторная частица относится к упакованному ретровирусному вектору, т.е. предпочтительно способному к соединению с и проникновению в клетки-мишени. Компоненты частиц, как уже обсуждалось в случае вектора, могут быть изменены по отношению к дикому типу ретровируса. Например, Εην белки в белковом слое частиц могут быть генетически изменены для того, чтобы изменить их специфику ориентации или достичь другие нужные функции.

Предпочтительно вектор вируса преимущественно преобразовывает определенные виды клеток или виды клеток.

Более предпочтительно вектор вируса представляет собой целевой вектор, т.е. он имеет доступ к тканям, которые изменяются по сравнению с природным вирусом, так что вектор направлен на определенные клетки.

В предпочтительном варианте вектор гена получают из лентивирусов.

В одном из вариантов осуществления вектор гена содержит тканеспецифический промотор. Предпочтительно тканеспецифический промотор выбран из группы, включающей СЮ11Ь и с-Рек, и промоторы, полученные из цитохрома Ь-245 тяжелой цепи (СУВВ, др91 рЬох) локуса и ТЕК (Т1е2). ТЕК (Т1е2) промотор может быть объединен с мишенью шгК.-126 последовательности, данная комбинация позволит специфическую экспрессию трансгена в множество опухолепроникающих миелоидных клеток.

В одном из вариантов осуществления вектор гена содержит трансген, кодирующий энзим. Предпочтительно энзим выбран из группы лизосомального фермента галактоцереброзидазы и §р91 рЬох. В соответствии с этим настоящее изобретение может быть использовано для доставки иммуномодулирующих молекул, таких как интерферон-альфа. Предпочтительно, чтобы эти векторы доставляли иммуномодулирующие молекулы в опухолевые клетки при трансплантации костного мозга. Предпочтительно, чтобы эти векторы содержали Т1е2 промотор плюс шгК.-126Т последовательность.

Важно отметить, что Т1е2 промотор обладает активностью в гематопоэтических стволовых клетках, и иммуномодулирующие молекулы, таких как интерферон-альфа, как известно, являются токсичными для гематопоэтической стволовой клетки. Таким образом, использование конкретных гематопоэтических стволовых клеток тгКТк, как описано в данном документе, становится обязательным, а не вариантом для того, чтобы специально получить биологически активные молекулы с помощью Т1е2 экспрессии, проникающих в опухоль макрофагов, не вмешиваясь в функции гематопоэтической стволовой клетки. Учитывая, что промотор Т1е2 слабее в ГСК, чем промотор РСК, который был использован в исследованиях, авторы ожидают, что 126Т/130аТ последовательности полностью предотвратят токсичность трансгенов, выраженных Т1е2 промотором в ГСК.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложен набор ДНК-конструктов для производства вирусных векторных частиц, содержащих ДНК-конструкты, кодирующие вирусный векторный геном, содержащий по меньшей мере одну последовательность микроРНК в соответствии с данным изобретением и, при необходимости, трансген. Под упакованным векторным геномом подразумеваем, что вектор генома находится в среде, где он может быть упакован в вирусную векторную частицу. Как правило, это требует наличия Сад-Ро1 и Εην.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложен способ получения вирусных векторных частиц, включающий введение набора ДНК-конструктов данного изобретения в клетку-хозяина и получение вирусной векторной частицы.

В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин содержит соответствующую микроРНК.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложена вирусная векторная частица, полученная способом настоящего изобретения.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая вектор гена или частицу в соответствии с настоящим изобретением вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, наполнителем или носителем.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложена клетка, инфицированная или трансдуцированная вектором гена или частицей в соответствии с настоящим изобретением. Клетка может быть

- 4 023938 трансдуцирована или инфицирована в организме или в искусственных условиях. Клетки могут быть получены из или являться частью животного, предпочтительно млекопитающего, такого как человек или мышь. Таким образом, будет понятно, что настоящее изобретение полезно в обеспечении трансгенных животных, например, для использования в качестве моделей болезни. В одном варианте осуществления млекопитающее является нечеловеческим млекопитающим.

В одном варианте осуществления клетка является гематопоэтической стволовой клеткой или гематопоэтической клеткой-предшественником.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложена комбинация по меньшей мере двух различных мишеней последовательностей микроРНК, соответствующих микроРНК, выбранным из группы, включающей ш1К-130а, Ш1К-126, Ш1К-223.

В одном из вариантов осуществления мишени микроРНК последовательности направлены на одновременное, раздельное или последовательное применение.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложены вектор гена в соответствии с настоящим изобретением, частица в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с формулой настоящего изобретения или комбинация в соответствии с настоящим изобретением для предотвращения или уменьшения экспрессии трансгена в гематопоэтических стволовых клетках или гематопоэтических клетках-предшественниках.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложены вектор гена в соответствии с настоящим изобретением, частица в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с формулой настоящего изобретения или комбинация в соответствии с настоящим изобретением для лечения заболевания, выбранного из глобоидной лейкодистрофии клетки, хронической гранулематозной болезни и тяжёлой комбинированной иммунной недостаточности (ТКИН).

В соответствии с другим аспектом изобретения предложены вектор гена в соответствии с настоящим изобретением, частица в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с формулой настоящего изобретения или комбинация в соответствии с настоящим изобретением для увеличения шансов на выживание гематопоэтических стволовых клеток или гематопэтических клеток-предшественников по отношению к генной терапии.

Шансы на выживание ГСК или ГКП могут быть увеличены специальной ненацеливающей экспрессией генов этих клеток. В частности, ненацеливание экспрессии трансгенов, которые являются токсичными для ГСК или ГКП, могли бы оказаться полезными для выживания этих клеток. Кроме того, ненацеливание экспрессии трансгенов, которые могут вызвать нежелательную иммунную реакцию в реципиенте, может привести к увеличению шансов на выживание клетки.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложены вектор гена в соответствии с настоящим изобретением, частица в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с формулой настоящего изобретения или комбинация в соответствии с настоящим изобретением для повышения безопасности и/или эффективности генной терапии.

Увеличение безопасности генной терапии включает в себя предотвращение или сокращение нежелательной экспрессии трансгенов или экспрессии вектора в определенные типы клеток, такие как ГСК и ГКП.

Ненацеливание экспрессии трансгена или вектора из специфических типов клеток может уменьшить нежелательные реакции и побочные эффекты, которые могут сопровождать генную терапию. Увеличение эффективности генной терапии включает в себя то, что трансгены более эффективно выражаются в нужные типы клеток, таких как дифференцированные гематопоэтические клетки, так как эти клетки более эффективно генерируются из генно-модифицированных недифференцированных клеток, которые были защищены от трансгенной токсичности и нежелательных иммунных реакций с помощью мишеней последовательности микроРНК. В частности, генная терапия, связанная с трансплантацией ГСК или ГКП, может быть более безопасной и эффективной, если экспрессию трансгена можно было бы избежать, пока клетки дифференцировались.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложены вектор гена в соответствии с настоящим изобретением, частица в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с формулой настоящего изобретения или комбинация в соответствии с настоящим изобретением для предотвращения апоптоза гематопоэтических стволовых клеток или гематопоэтических клеток-предшественников, в результате чего апоптоз вызван экспрессией трансгена.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложены вектор гена в соответствии с настоящим изобретением, частица в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с формулой настоящего изобретения или комбинация в соответствии с настоящим изобретением для мониторинга стадии дифференциации в гематопоэтических стволовых клетках или гематопоэтических клетках-предшественниках.

- 5 023938

Наличие Ш1К-126, Ш1К-223 и т1К-130а является показателем ГСК или ГКП. Более конкретно, ιηίΕ126 является показателем примитивной ГКП, в людях, а также клетках эритроидной линии. ш1К-130а является показателем более примитивной ГКП. ш1К-130а является показателем миелоидных совершенных клеток-предшественников и более примитивных ГКП. ιηίΕ-223 также является показателем дифференцированных миелоидных клеток, включая гранулоциты, моноциты, макрофаги и миелоидные дентритичные клетки.

В одном варианте осуществления вектор гена применим в гематопоэтической клеточной терапии. Гематопоэтическая клеточная терапия включает гематопоэтическую стволовую клеточную трансплантацию.

В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложена мишень микроРНК последовательности, соответствующая микроРНК, выбранной из группы т1К-130а, т1К-126, т1К-223 для использования в генной терапии.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложен способ определения степени дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, включая определение уровня экспрессии микроРНК в клетке, в которой микроРНК соответствует микроРНК целевой последовательности, функционально связанной с последовательностью нуклеотидов, в которой микроРНК предотвращает или уменьшает экспрессию нуклеотидной последовательности в гематопоэтической клетке-предшественнике (ГКП) или гематопоэтической стволовой клетке (ГСК), но не в дифференцированной клетке. Например, экспрессия т1К-130а и ιηίΒ-126 указывает на то, что клетка является ГКП или ГСК, в то время как экспрессия микроРНК-223 указывает на принадлежность к миелоидной линии, т.е. гранулоцитам и моноцитам, в том числе их предшественников и дериватов.

В соответствии с другим аспектом изобретения предложен способ определения степени дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, включая определение уровня экспрессии по меньшей мере двух микроРНК в клетке, в которой микроРНК соответствует мишени микроРНК последовательности, функционально связанной с последовательностью нуклеотидов, в которой микроРНК предотвращает или уменьшает экспрессию нуклеотидной последовательности в гематопоэтической клетке-предшественнике (ГКП) или гематопоэтической стволовой клетке (ГСК), но не в дифференцированной клетке и сравнения уровня экспрессии различных микроРНК. Более того, экспрессия двух микроРНК может быть проанализирована одновременно и независимо друг от друга, используя двунаправленный вектор, который выражает два маркерных гена, каждый из которых содержит различные мишени микроРНК последовательности. Например, различные микроРНК, могут быть связаны с различными маркерами, такими как флуоресцентные маркеры.

Различные цвета могут означать различные смеси экспрессии микроРНК, которые представляют различные стадии дифференциации (например, зеленый маркер + микроРНК-126Т, красный маркер + микроРНК-223Т. Если клетки красного или черного цвета: ->ГКП, если клетки желтые: -> лимфоциты, если клетки зеленого цвета: дифференцированные клетки миелоидной линии).

В соответствии с другим аспектом изобретения предложен способ определения степени дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, включая определение уровня экспрессии трансгена в указанной гематопоэтической стволовой клетке или гематопоэтической клетке-предшественнике, в которой трансген функционально связан с мишенью последовательности микроРНК, в результате чего соответствующая микроРНК предотвращает или уменьшает выраженность трансгена в гематопоэтической клетке-предшественнике (ГКП) или гематопоэтической стволовой клетке (ГСК), но не дифференцированной клетке.

Кроме того, репортер векторов для микроРНК, выбранный из группы, содержащей микроРНК-126, т1К-130а и микроРНК-223, может применяться для определения гематопоэтических стволовых клеток и/или их непосредственных предшественников в культуре системы с целью получения линии гематопоэтических клеток из индуцированных плюрипотентных клеток (ΙΡδ) или эмбриональных стволовых клеток (Εδ).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения микроРНК, используемые в способах настоящего изобретения, включают микроРНК выбранные из группы, включающей ппК-130а. т1К-126 и т1К-223.

Некоторые дальнейшие ключевые преимущества изобретения

Изобретение учит, как векторы гена, подходящие для генной терапии, могут быть спроектированы для регулирования эндогенных микроРНК для ГСК и ГКП для управления экспрессией трансгенов для достижения конкретных профилей экспрессии вектора. Изобретение обеспечивает широкое применение этих векторов, так как они помогают предотвратить токсичность трансгена в ГСК и ГКП и, тем самым, содействовать развитию стратегий генной терапии для лечения различных заболеваний. Векторы являются особенно подходящими для генной терапии, которая включает экспрессию трансгена, который является токсичным для ГСК или ГКП.

Изобретатели предлагают новый способ профилирования деятельности отдельных микроРНК нескольких гематопоэтических множеств клеток, включая редкие ГКП, тем самым добавляя новое измерение в обычную экспрессию микроРНК, профилируя подходы, которые являются широкими, но ограни- 6 023938 ченными ранее очищенными массовыми совокупностями. Этот метод основывается на трансдукции ГКП с микроРНК лентивирусными репортерными векторами, которые служат в качестве живого генетического индикатора активности микроРНК, легко поддаются количественной оценке на одном уровне клеток и на разных уровнях клеточных популяций параллельно с помощью проточной цитометрии. Используя этот подход, учёные определили две микроРНК, которые высокофункциональны в мышиных и человеческих ГКП, в том числе множествах, обогащенных для самых примитивных стволовых клеток. По дифференциации, одна микроРНК регулируется стремительно вниз на раннем уровне клетокпредшественников, а другая - в дальнейшем индуцирована во время гранулоцитопоэза и моноцитопоэза, но регулируется резко вниз в лимфоцитах и в течение дифференциации мегакариоцитов/эритроцитов.

Кроме того, учёные применяли одну из двух микроРНК, сильно выраженную в ГКП для преодоления важного вопроса, предотвращающего эффективное лечение глобоидной лейкодистрофии (ГЛД) (лизосомальные расстройства хранения из-за дефектов активности лизосомальных ферментов галактоцереброзидазы - САЬС) в мышиной модели лентивирусных векторов, основанных на стволовой клеточной генной терапии. В отличие от других лизосомальных ферментов, САЬС перенос генов и экспрессия в ГКП приводят к апоптозу и функциональному нарушению трансдуцированных клеток из-за дисбаланса внутриклеточного содержания в биологически активных сфинголипидах, следующим за экспрессией энзима. Дифференцированные клетки миелоидной и лимфоидной линий не зависят от САЬС экспрессии, предлагая уникальную чувствительность ГКП к токсичности энзима. Проблематика последовательностей микроРНК, используемая для репортерного вектора, позволила регулировать профиль экспрессии генов в терапевтически соответствующем САЬС трансгене, ненацеливании экспрессии трансгена из клеток, где родственные микроРНК выражаются (ГКП), при этом обеспечивается возможность полной терапевтической экспрессии в дифференцированное потомство, которое не зависит от экспрессии токсичности САЬС. ГКП, трансдуцированные с микроРНК-регулируемыми САЬС векторами лентивирусов, были защищены от фермента токсичности и сохранили свои функции как в искусственных условиях, так и в организме. Предварительные результаты показывают терапевтическую эффективность данного подхода в коррекции проявлений болезни в мышиной модели.

Предпочтительно следующие мишени микроРНК последовательности используют для достижения регулируемой экспрессии трансгена в человеческой гематопоэтической системе: генная терапия приложений, которые требуют экспрессии в миелоидную линию (например, хроническое гранулематозное заболевание, лизосомальные нарушения хранения данных, такие как болезнь Краббе, метахроматическая лейкодистрофия, адренолейкодистрофия и т.д.): 126Т/130аТ (2+2 мишени последовательности) - оптимизированы для максимальных репрессий в ГКП; 126Т (2 целевая последовательность) - оптимизирована для минимальной фоновой активности в миелоидном потомстве.

Методы генной терапии, которые требуют экспрессии в эритроидную линию (например, талассемия, недостаточность глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназы, серповидно-клеточная анемия, ...): 130аТ (4 мишени последовательности) или 223Т (2 или 4 мишени последовательности). Последняя мишень может проявлять некоторую активность (<5 раз) в более примитивных ВЬи-Ь и СРИ-Ь.

Методы генной терапии, которые требуют экспрессии в лимфоидную линию (например, КАС1/КАС2 недостаточность, ВТК недостаточность, Х-8СГО, АИА-8СГО): 223Т (2 или 4 мишени последовательности), возможно, в комбинации с 126Т/130аТ (2+2 мишени последовательности) или 126Т (2 мишени последовательности).

Векторы, такие как вирусные векторы лентивирусов, в том числе для экспрессии трансгена для переноса генов и терапии, могут быть сконструированы с мишенью микроРНК последовательности, чтобы быть признанными эндогенными клетками эндогенных микроРНК к ГСК и ГКП, регулируя тем самым экспрессию трансгена во множестве клеток. Кроме того, комбинации мишеней микроРНК последовательности могут быть использованы для получения векторов с высокой определенной клеточной экспрессией шаблонов.

Практика настоящего изобретения будет работать, если не указано иное, в обычных методах химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей среднего специалиста в данной области техники. Такие методы описаны в литературе. См., например, 1. 8атЬгоок, Е.Р. Ргйзсй апб Т. Машайз, 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогайгу Мапиа1, 2-е изд., Книги 1-3, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогайгу Ргезз; АизиЬе1, Р.М. е1 а1. (1995) и периодические издания Сиггей Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, сй. 9, 13 и 16, 1ойп \УПеу & 8опз, Иете Уотк, Ν.Υ.); В. Кое, ί. СтаЫтее, апб А. Кайп, 1996, ΌΝΛ 1зо1аИоп апб 8ерпепс1пд: ззейта1 Тесййдиез, 1ойп \УПеу & 8опз; ЙМ. Ро1ак апб йтез О'И. МсСее, 1990, 1п 8Ии НуЪпй/айоп: Ргшщр1ез апб Ргасйсе; Охйэгб ийуегзйу Ргезз; МЛ СаВ (ЕбНоИ 1984, Ойдопис1еойбе 8уййез1з: А РгасИса1 Арргоасй, 1г1 Ргезз; И.МЛ ЬШеу апб ЙЕ. ИайЬегд, 1992, Мебюбз о£ Еп/уто1оду: Структура ДНК часть А: 8уййез1з апб Рйузюа1 Апа1уз1з о£ ИХА Мебюбз ш Ешуто1оду, Асабетю Ргезз; Изшд АпбЬоб1ез: Лабораторный справочник: РоПаЫе Рго1осо1 №. I Ьу Еб\\шб Наг1оте, Иау|б Ьапе, Еб. Наг1о\у (1999, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогайгу Ргезз, Ι8ΒΝ 0-87969-544-7); Λй^Ьоб^ез: Лабораторный справочник под ред. Еб Наг1о\у (Ебйог), Иау1б Ьапе (ЕбВог) (1988, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогайгу Ргезз, Ι8ΒΝ 0-87969-314-2), 1855. НапбЬоок о£ Эгид 8сгеейпд, под редакцией Ратакпзйпа 8ее1йа1а, РгаЬйауаД В. Ретапбез (2001, №\у Υо^к. ΝΥ, Магсе1 Иеккег, Ι8ΒΝ

- 7 023938

0-8247-0562-9) и ЬаЬ КеГ: Справочник рецептов, реагентов и других средств для использования а1 (Не ВепсН, Ебйеб 1апе Коккатк апб Ьшба Кобдегк, 2002, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу, Ι8ΒΝ 0-87969-630-3. Каждый из этих общих текстов включен в настоящий документ посредством ссылки.

Описание чертежей

Настоящее изобретение будет описано далее, только в качестве примеров, со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, как показано на прилагаемых чертежах.

Фиг. 1. Схематическое изображение двунаправленной микроРНК, регулируемой репортерными векторами лентивирусов.

Здесь показаны представители структуры микроРНК, регулируемой двунаправленными векторами (Вб.ЬУк), содержащие зеленый флуоресцентный белок (СРР) в качестве репортера микроРНК и усеченной форме человеческого сходства фактора роста нервных рецепторов (ΝΟΡΚ), как конститутивно выраженного нормализатора. Хотя Вб.ЬУ-с1г не содержит мишени микроРНК последовательности (мирт), Вб.ЬУ-223Т и 126Т-Вй.ЬУ были построены с добавлением 4 тандемных повторов, содержащих 21 Ьр, полностью дополняющих микроРНК-223 или микроРНК-126 соответственно.

Фиг. 2. Оценка микроРНК репортеров Вб.ЬУк в клеточных линиях.

а - Количественный анализ микроРНК-223 и микроРНК-126 уровней экспрессии (копий/пг) в НЕК293Т, И937 и НЕК293Т клетках, которые эктопически экспрессируют микроРНК-126 с помощью трансдукции с ЬУ содержащими РК1-ттК-126 под управлением вездесущего промотора (НЕК293Т.ЬУ.т1К-126).

Ь - Репрезентативный РАС8 анализ НЕК293Т, И937, НИУЕС и НЕК293Т.ЬУ. ипК-126 клеток, трансдуцированных Вб.ЬУк, регулируемыми указанными микроРНК. Клетки были проанализированы на СРР микроРНК репортер и ΝΗΡΚ нормализатор экспрессии.

с - Формула для расчета микроРНК-опосредованной репрессии гена репортера на уровне белка и на уровне РНК. Гистограммы показывают микроРНК-223 и микроРНК-126 активность в клеточных линиях, рассчитываемых как СРР РК значения на белковом уровне. Алмазы представляют СРР РК на уровне РНК.

Фиг. 3. Оценка микроРНК репортера ВбЬУк в организме.

Линия^-'^|о'“ костный мозг (КМ) гематопоэтических стволовых и клеток-предшественников (ГКП) были трансдуцированы с двунаправленным микроРНК репортером векторов лентивирусов (ВбЬУк) для тгК-223 и ттК-126 и трансплантированы в реципиентов мышей. Клетки периферической крови мышей, регулярно привитых клетками, несущих микроРНК репортер, были проанализированы посредством РАС8.

а - Селекционная стратегия при применении для идентификации основной популяции лейкоцитов из мышиной периферической крови: гранулоциты (СЭ11Ь⁺, 88СН§й), моноциты (СН11Ь⁺, 88С1оте), Влимфоциты (СЭ19+) и Т-клетки (СН11Ь^-СЭ19Ь^-).

Ь - Представитель РАС8 анализа СРР и ΝΗΤΚ экспрессии в мышиной периферической крови подмножеств.

с - СРР РК значения (среднее ± 8Ό) в периферической крови субпопуляций от мышей, трансплантированных - ГКП, трансдуцированных либо Вб.ЬУ-с1г (п=5), Вб.ЬУ-223Т (п=6), либо Вб.ЬУ-126Т(п=4).

Фиг. 4.

а - Линии ^|о'“ костного мозга (КМ) гематопоэтических стволовых и клеток-предшественников (ГКП) были трансдуцированны с двунаправленным микроРНК репортером векторов лентивирусов (ВбЬУк) и трансплантированы в смертельно облученных мышей. ВбЬУк совместно выражают дестабилизированный СРР (64СРР) репортер, реагирующий на специфическую микроРНК 4 тандемными повторами, полностью коплементарной мишени микроРНК (ттКТ) последовательности и усеченный ген ΝΟΕΡ маркера (ΔΝΗΤΚ). Мыши были подвергнуты эвтаназии через 8-12 недель после трансплантации, и многие субпопуляции ГКП костного мозга были проспективно определены иммунофенотипированием, как показано (ГСК: гематопоэтические стволовые клетки; МРР: мультипотентные предшественники; СМЬР: гранулоцитарно-моноцитолимфоцитные предшественники; СМР: гранулоцитарно-моноцитные предшественники; еМЕР: ранние мегакариоцито-эритроцитные предшественники; ЕР: прекурсоры эритроцитов).

Ь - Представители РАС8 схемы показывают экспрессию СойтоКВбЬУ (пиКТ или 133аТ, мускульно-специфичные ниКТ) и репортер ВбЬУк для пиК-126 (126Т), т£К-130а (130аТ), пиК-196Ь (196ЬТ), пиК10а (10аТ), тК-223 (223Т), тК-19а (19аТ), тЖ-93 (93Т), тЖ-17-5р (17Т) и 1е1-7а (Ье17аТ) в ГКП субпопуляциях, недавно изолированных из костного мозга трансплантированным мышам, как описано в (а). Каждая строка показывает образцовую модель экспрессии репортера для указанных ВбЬУ в ГКП вышеупомянутых этапов дифференциации. Гистограммы справа от каждой строки показывают небольшую ± свернутую репрессию (РК) рассчитываемого РЭМ из репортера, означающего интенсивности флуоресценции (контроль: п=9; 126Т: п=10; 130аТ: п=4; 196ЬТ: п=4; 10аТ: п=4, кроме ГСК и МРР1, где п=1, хотя статистика п/а; 223Т: п=6, из которых 5 с еСРР репортером 19аТ: п=3; 93Т: п=2; 17Т: п=3; 1е17аТ: п=1 депо крови из 3 мышей). Статистические сравнения микроРНК активности между ГКП субпопуляциями были сделаны односторонней Апоуа и ВопГеггош послетестовой коррекцией, используя ЕРк каждой

- 8 023938 группы репортера ВйЬУ в качестве опорного (***: р<0,001; **: 0,01>р>0,001; *: р<0.05).

Фиг. 5.

а - Гематопоэтическая активность 8 микроРНК, измеряемой небольшой свернутой репрессией (РК), указанным ВйЬУк репортером на нескольких клеточных популяциях, изолированных от трансплантированных мышей. Линия^- подмножества КМ: как это описано на фиг. 4; Линия' подмножества КМ: Рго В: ΟΌ19⁺ΟΌ43⁺; ΟΌ43^- В: ΟΌ19⁺ΟΌ43^-; Т Ьу: СО3+; Мопо: ΟΌ11ΐ>⁺ΟΌ48⁺; Огаии: ΟΌ11ΐ>⁺ΟΌ48¹⁰; Периферическая кровь: Огаии: СП11Ь' мйе ксаПсг¹; Мопо: СЭ11Ь' мйе ксаПсг'⁰; В Ьу: СЭ19'; Т Ьу: СЭ3.

Ь - Мишени последовательности комбинации, содержащей 4 копии штК-130аТ и 2 копии Ш1К-126Т (130а/126Т; и=4 мыши), были сравнены либо с 4 копиями штК-126Т (126Т; и=10 мышей), либо 4 копиями тгК-130аТ (130аТ; и=4 мыши). Столбики показывают свернутую репрессию ±РЭМ, полученными этими тгКТ последовательностями в линейном маркере отрицательных популяций костного мозга (обозначения как на схеме 4) и лейкоцитов периферической крови. Обратите внимание, что 130а/126Т достигает лучших репрессий в ГСК, чем 126Т один, в то время как фоновая репрессия в лейкоцитах РВ снижается.

Фиг. 6. Регулирование экспрессии гена самоубийства мишенями микроРНК последовательностями. а - тЖ.Т последовательность полностью дополняют ιηίΡ-142. ιηίΡ-223. ιηίΡ-126 или ιηίΡ-130;·ι. которые были добавлены к транскрипции дестабилизированной тимидинкиназы (ЙТК). Однонаправленные векторы самоубийства лентивирусов (правая половина каждой векторной графики), которые были использованы для (Ь), а двунаправленные векторы самоубийства, связывающие ОРР маркер с микроРНК регулируемыми ТК, или маркер ΝΟΡΚ с контроль-ТК при применении в (с).

Ь - Линейно^1о'“ ГКП были трансдуцированны с указанными векторами лентивирусов, с покрытием ± ганцикловир (ОСУ) в среде полутвердых (ЬУ-ОРР: и=2; СТКЬ-ТК: и=8; ТК-142Т: и=4; ТК-223Т: и=6; ТК-126Т: и=4; ТК-130аТ: и=2). После 10й количество миелоидных (СРИ-ОМ, СРИ-О, СРИ-ОМ) и эритроидных (ВРИ-Е, СРИ-Е) колоний было подсчитано. Диаграммы боксов и контактов показывают количество колоний в культурах, содержащих ОСУ, разделенное на количество колоний в соответствующих контрольных культурах без ОСУ (10-90-й процентиль). Данные ио ОСУ точки показывают покрытие изменчивости (количество колоний каждого не-ОСУ рассматриваемой культуры, поделенное на среднее количество колоний всех не ОСУ обработанных культур; и=26). Статистические сравнения были сделаны против ОСУ обработанных, ЬУ-ОРР групп; не существенно не отличается; **: 0,001<р<0,01, ***: р<0,001.

с - Линия^-'^|о'“ ГКП от С.П45.1' мышей были трансдуцированны либо с ТК вектором контроля ^ОРК-отмеченным) или микроРНК-регулируемым ТК вектором (ОРР-отмеченным; опыт № 1: ТК.126Т; опыт № 2: ТК.142Т). ЬУ^ОРК/Контрольные ТК и ЬУ.ОРР/ТК-тгКТ-трансдуцированные клетки были смешаны в соотношении 1:1 и трансплантированы в С.П45.2 конгенных мышей, получавших ОСУ (опыт № 1: и=6 мышей; опыт № 2: и=5 мышей) для 7-14, начиная с 3 дня после трансплантации или оставленных без лечения (опыт № 1: и=4; опыт № 2: и=3). Репрезентативные диаграммы РАС8 показывают ОРР^ОРК химеризм в СИ45.1+ клетках донора. Графики показывают фракцию ОРР-экспрессирующих клеток в трансдуцированных, полученных донорских клетках в крови для обработанных ОСУ (рыжих) и необработанных (черных) мышей, для каждого типа клеток крови в течение периода 7-8 месяцев. Обратите внимание, что весьма большое количество клеток - это ОРР+ в ОСУ группе (***: р<0,001, в двухфакторном дисперсионном анализе), указывающие на защиту от самоубийства и селективное преимущество ГСК, трансдуцированных с помощью ОРР/ТК.126Т или ОРР/ТК.142Т. Таким образом, пиК-126Т последовательность, добавленная к трансгену, преодолевает токсичность ГКП, связанную с высокотоксичными трансгенами даже при экспрессии от убиквитарных промоторов, неся значительный потенциал для повышения безопасности и эффективности ГКП-основанной генной терапии. Кроме того, эти результаты официально доказывают, что тгК-126 принимает активное участие в долгоживущих привитых гематопоэтических стволовых клетках, как показывает анализ функционального вторичного заселения.

Фиг. 7.

а - Для решения безопасности эксплуатации тгК-126 регулирования генной терапии трансгенная линия мышей, содержащая тгК-126 репортер (Тд.126Т), была создана путем микроинъекции, иллюстрированной ЬУ, в перивителлиновое пространство зигот. Анализ РАС8 костного мозга молодых, взрослых трансгенных мышей показал, что ОРР экспрессия была самой низкой в Кй+8са+Линейных^- (К8Ь) клетках маркера (синий график в гистограмме участка), в то время как ОРР экспрессия включена в Кй+8са^-Ьш предшественников (черный и красный график в гистограмме участка). ОРР МР1 Тд.126Т мышей и контрольных ОРР трансгенных мышей был измерен для расчета РК т!К-126 репортера в указанных субпопуляциях ГКП (средняя ± РЭМ, и=10 Тд.126Т мышей; ***: р<0,001; **: 0,01>р>0,001 по сравнению с ЕР).

Ь - В то время как мыши с двумя мощными аллелями для тгК-126 проявляют значительную эмбриональную смертность из-за дефектов кровеносных сосудов, разведение Тд.126Т колонии привело к нормальному размеру помета и ожидаемому числу копий (ΥΟΝ) распределения вектора в потомстве, отражающем одно из родительских поколений, предполагая, что умеренная экспрессия тЖ.-126Т последовательностей из промотора РОК не мешала регулированию естественных тгК-126 мишеней в процессе

- 9 023938 разработки.

с - Клетки КМ СЭ45.2+ Тд126Т мышей и СЭ45.1+ мышей дикого типа (УТ), обогащенных для ГКП положительной селекцией для СЭ117 и успешно трансплантированными (соотношение 1:1) в смертельно облученных СЭ45.2+ реципиентов (п=4). Трансплантированные мыши истекали кровью через регулярные промежутки времени, и ί'.Ό45.1/ί'.Ό45.2 химеризм был определен в различных периферийных линиях клеток крови (Сгапи: СЭ11Ь' з1Йе зсаИег¹; Мопо: СЭ11Ь' з1Йе зсайег¹⁰; В-клетки: СЭ19+; Т-клетки: СЭ3+). Эти данные показывают, что существует удобное терапевтическое окно для безопасного использования Щ1К-126 регулирования.

Фиг. 8.

а - СЭ34ТКП очищали от человеческой пуповинной крови (ПК) и трансдуцированных с контрольно-ВйЬУ (контроль) или Щ1К-126 репортером ВйЬУз для Щ1К-126 (126Т), тЖ.-130а (130аТ) или ιηίΚ-223 (223Т) (п=3 биологических репликаций в группе). Клетки находились в жидкой среде при условиях поддержки краткосрочного поддержания ГКП и ВйЬУ маркеров, экспрессию измеряли через 2 дня после трансдукции в СЭ34'СЭ38^-ГКП и СЭ34'Э38' предшественников (первые 2 столбца слева). Затем клетки были дифференцированы либо в жидкой среде в течение 6 дней (СЭ34^-СЭ38' клеток, средняя колонка), либо в полужидкой среде в течение 16 дней (СЭ13+ миелоидных клеток, СЭ235+ эритроидных клеток). Репрезентативные диаграммы РЛС8 представлены. Количественные гистограммы снизу показывают ттК-126, тгК.-130а и ιηίΚ-223 активность в соответствующих подгруппах (п=3, средняя кратная репрессия ± РЭМ; **: 0,001<р<0,01, ***: р<0,001).

Ь - Клетки пуповинной крови СЭ34+ были трансдуцированны с контрольной или ιηίΚΝΛ. регулируемыми двунаправленными векторами самоубийства, содержащими мишени последовательности ιηίΚΝΛ для тЖ.-223 (ТК-223Т) или ιηίΚ-126 (ТК-126Т, см. также схему 2) и показанными в СРС анализах в четырех экземплярах либо в присутствии или в отсутствие пролекарства ОСУ. Число СРР⁺ эритроидных (СРИ-Е, ВРИ-Е) или миелоидных (СРИ-С, СРИ-М, СРИ-СМ) колоний было подсчитано через 14 дней после покрытия, а нормализовано к количеству, исчисляемому не-ССУ культурой. Диаграммы боксов и контактов показывают 10-90-й процентили. ССУ полностью предотвратил рост СТ.-ТК трансдуцированных колоний.

с - Комбинации тЖ.-126Т и тЖ.-130аТ последовательностей (4+4 и 2+2 и тандемные повторы, соответственно), а также 2 тандемных повтора тгК.-126Т были только сравнены со стандартным проецированием тгК.Т, утилизируя 4 тандемных повтора тгК.-126Т или тгК.-130аТ соответственно. Человеческие клетки пуповинной крови были трансдуцированы с соответствующими ВйЬУз репортерами и кратная репрессия репортера была определена в примитивных стволовых/предшествующих отсеках (СЭ34'СЭ38 ) и предшествующем отсеке (ί'.Ό34'ί'.Ό38^-) в течение 2 дней после трансдукции, а также в миелоидном потомстве (СИ13+) и эритроидном потомстве (СИ235+) в течение 10-14 дней после трансдукции. 126Т (4 мишени), 126Т/130аТ (4+4 мишени) и 126Т/130аТ (2+2 мишени) подавляют одинаково хорошо в стволовом/предшествующем отсеке. Тем не менее, 126Т/130аТ (4+4 мишени) имеет более высокий фон подавляющей активности в миелоидном потомстве.

ά - Подавляющая активность 126Т (4 мишени), 126Т/130аТ (2+2 мишени) и 126Т (2 мишени) в примитивном отсеке (как в С) и в конце миелоидных этапов дифференциации (миелоциты: С011Ь'/СЭ16^-; метамиелоциты: СЭ11Ь'/СЭ16'/88С1о; гранулоциты: ί'.Ό11Κ/ί'.Ό16ΥΟιί§1ι) по С-С8Р, индуцированной дифференциации ш νίΐτο. Этапы дифференциации были проверены на Мау-Сгипа1й/С1етза окрашенных образцах цитоспина от культуры. Регулирование индекса (правый график) рассчитывается путем деления кратной репрессии соответствующих тгКТ в СЭ34 СЭ38^- стволовом/мультипотентном отсеке, кратной репрессии в метамиелоцитах. Лучшее освобождение экспрессии трансгена в миелоидном потомстве получается от 126Т (2 мишени), в то время как подавление в стволовом/предшествующем отсеке подобно на 130аТ (4 мишени) - чуть меньше по сравнению с 126Т (4 мишени) и 126Т/130аТ (2+2 мишени). Что касается последних 2 мишеней последовательностей, 126Т/130аТ (2+2 мишени) предпочтительнее 126Т (4 мишени), так как она предлагает большое регулирование индекса. Кроме того, снижение экспрессии трансгена обеспечивается за счет двух независимых микроРНК, и риск вмешательства в эндогенную регуляции микроРНК еще больше снижается, что повышает безопасность и эффективность пнКТ.

Фиг. 9. Лизосомный энзим гиперэкспрессии в ГКП.

Энзим уровня экспрессии, нормированный к дикому типу, в мГКП (а) и чГКП (Ь) на ЬУ трансдукции. СЛЬС экспрессия была значительно ниже по сравнению с ΆΚ8Ά и ШИЛ.

Фиг. 10. Нарушение функции мышиных ГКП на ЬУ-опосредованной СЛЬС экспрессии. а - СРС анализ на мГКП трансдуцированных с СЛЬС и контролем ЬУ. Число (#) колоний/пластин (левая ось Υ, колонки) было рассчитано, и число комплексных ЬУ копий/клеток (УСП) (правая ось Υ, точки) было измерено. СЛРС.ЬУ трансдуцированные -/- мГКП (п=12 независимых экспериментов) производятся значительно меньше, число колоний по сравнению с СРР.ЬУ (п=10) и ЛКЗЛ.ЬУ (п=8) трансдуцированными клетками. Это нарушение не было обнаружено, когда мГКП были трансдуцированны с 1шК-142Т СЛРС.ЬУ (п=6). *: р<0,001 в однофакторном дисперсионном анализе для обоих количеств колоний/пластин и ΜΟΝ. Средние величины ± 8Ό показаны. Аналогичные результаты были получены с -/- 10 023938 и +/+ мГКП.

Ь - ОАЬС активность измеряется на трансдуцированных мГКП. После ОЛЬС.ЬУ трансдукции ОАЬС -/- (на этом -/-) (п=5) и ОЛЬС +/+ (на этом +/+) (п=5) мГКП показал 2-кратное увеличение ОЛЬС активности над дикими типами уровней (+/+ мГКП трансдуцированных с ОРР.ЬУ, п=5). Отсутствие увеличения активности было обнаружено в мГКП, трансдуцированных с Ш1К-142, регулируемой ОЛЬС.ЬУ (тЖ-142Т) (п=3).

Фиг. 11. Нарушение функции человеческой ГКП на ЬУ-опосредованной ОЛЬС экспрессии. а - СРС анализ на чГКП, трансдуцированных с ОЛЬС и контролем ЬУ. Число (#) колоний/пластин (левая ось Υ, колонки) было рассчитано, и число комплексных ЬУ копий/клеток (УСЫ) (правая ось Υ, точки) было измерено. ОЛЬС.ЬУ трансдуцированные п.б. (п=4) и ОЬО чГКП (п=4) показали значительное ухудшение в образовании колоний по сравнению с контрольными клетками (п=5), которых не наблюдалось в следующей Щ1К-142Т ОЛЬС.ЬУ трансдукции (п=4). Колонии, полученные из ОЛЬС.ЬУ трансдуцированных чГКП, показали значительно низший вектор содержания, по сравнению с ОРР/ЛК8А/ОАЬСт1К 142Т.ЬУ контрольными группами. *: р<0,001 в однофакторном дисперсионном анализе для обоих количеств колоний/пластин и УСЫ. Средние величины ± 8Ό показаны.

Ь - ОЛЬС активность измеряется на трансдуцированных чГКП. ОЛЬС.ЬУ трансдукция позволила воссоздание ОЛЬС активности в п.б. уровнях в ОЬО чГКП (п=3), в то время как трансдукция п.б. чГКП (п=4 для СВ и п=3 для КМ) привела к гиперэкспрессии энзима выше ОРР.ЬУ трансдуцированных уровней (п=3). Отсутствие увеличения активности было обнаружено в чГКП, трансдуцированных с ιηίΒ-142. регулируемой ОЛЬС.ЬУ (т1К-142Т) (п=3).

Фиг. 12. Выживание ΐνί мышей после ГСКТ. а - Схематическое изображение ОРР.ЬУ и ОЛЬС.ЬУ.

Ь - Средняя продолжительность жизни ίνΐ мышей, получивших ГСКТ. Тто мыши трансплантировали с общим КМ (ТВМ) (п=12), или с ОРР.ЬУ трансдуцированными +/+ мГКП и нетрансдуцированными 8са1-предшественниками (ОРР.ЬУ +/+ Ьш- & +/+ 8еа1-, п=7), или с ОРР.ЬУ трансдуцированными +/+ чГКП и ОРР.ЬУ трансдуцированными 8еа1-предшественниками (ОРР.ЬУ +/+ Ьш- & ОРР.ЬУ +/+ 8еа1-, п=5) достигли более долгого выживания по сравнению с необработанными контрольными группами (ИТ) (п=10). Мыши, получившие ОЛЬС.ЬУ трансдуцированных -/- мГКП и +/+ 8еа1-предшественников (п=7), показали значительно более высокую продолжительность жизни по отношению к ТВМ или +/+ Ьш- & 8еа1-трансплантированным мышам. Напротив, трансплантация ОЛЬС.ЬУ трансдуцированных -/- Ьш- & -/- 8еа1- (п=13) не приводит к длительным срокам жизни. Контрольные группы: мыши, трансплантированные с ОРР.ЬУ трансдуцированными 1 ГКП (+/+ Ьш-) (п=10); мыши, трансплантированные с ОРР.ЬУ трансдуцированными +/+ 8еа1-предшественниками (п=8). *: р<0,01 на тесте однофакторного дисперсионного анализа.

с - Репрезентативная диаграмма, показывающая процент ОРР+ привитых клеток в периферической крови Ινί мышей, трансплантированных ОРР.ЬУ трансдуцированными +/+ чГКП и 8са1 -предшественниками.

Фиг. 13. Нарушенная в организме функция мГКП в РУВ/ΐνί мышах. Среднее выживание мышей, получивших мГКП трансплантацию, как указано -/- мыши с трансплантированной с ОРР.ЬУ трансдуцированных +/+ мГКП (п=11), достигли дольшего выживания по сравнению с необработанными контрольными группами (ИТ), а наоборот, -/- (п=9) и +/- (°) (п=5) мыши, трансплантированные с ОЛЬС.ЬУ трансдуцированными -/- мГКП, не выжили после смертельного облучения. Табл. 2: Среднее УСЫ 8Ό, обнаруженных в костном мозге -/- или +/+ мышей, трансплантированных с перечисленными мГКП (трансдуцированных ОЛЬС.ЬУ или ОРР.ЬУ) на 20 и 120 день после трансплантата (п=3 точка времени). (°) +/- хозяин. (§) Аналогичные результаты были получены с помощью +/+ мГКП.

Фиг. 14. Апоптоз ОАЬС экспрессии мышиных и человеческих ГКП.

а, Ь - ТиЫЕЬ анализ на -/- мГКП (слева) и чГКП (справа) (из п.б СВ и ОЬО КМ) на 2 и 5 день после переноса генов. ТиЫЕЬ+ядро от общего количества ядерных клеток заявлены. 8 полей и 100 клеток были подсчитаны в таком состоянии. Аналогичные результаты были получены с +/+ чГКП.

а - Большинство ОАЬС.ЬУ трансдуцированных м- и чГКП были ТиЫЕЬ положительным как на 2, так и на 5 день после трансдукции.

Ь - ТиЫЕЬ анализ (красный) и ТоРго (ТРШ, синий) для окрашивания ядер на м- и чГКП на 2 и (чГКП) день после трансдукции с указанными ЬУ: репрезентативные изображения (изображения были получены с помощью тройного лазерного конфокального микроскопа - Сияние 2100, ВюКаб; флуоресцентные сигналы от одиночных оптических секций были последовательно получены и проанализированы программным обеспечением АбоЬс РНоЮ+ор С8, увеличение 100х).

с - Цитофлурометрический анализ окрашивания Аииехт У на м- (верхние панели) (от -/- мышей доноров) и чГКП (нижние панели) (из п.б. СВ). Часть апоптотических клеток выше среди ОЛЬС.ЬУ трансдуцированных мГКП и чГКП по сравнению с ОРР-трансдуцированными контрольными группами. СМТ = обработанная камптотецином положительная контрольная группа. Получение было выполнено с РАС8 СаПЬиг 2, Вескоп Пюкткоп. По меньшей мере 10000 случаев были оценены, и данные были обработаны Р1о\\4о 8.5.3 программным обеспечением. Данные -/- мГКП и п.П. СВ (СБП и ВМ для ТиЫЕЬ)

- 11 023938 показаны, но аналогичные результаты были получены следующей ОЛЬС трансдукцией +/+ мГКП по сравнению с -/- клеток и в η.ά. КМ (ΤυΝΕΕ и Άηηβχίη V) и ОБЭ ВМ (Лииехш V) чГКП по сравнению с СВ клетками.

Фиг. 15. 1ОР1 лечение препятствует апоптозу ОЛЬС экспрессии ГКП.

а - СРС анализ на ΟΛΜΆν и ΑΚδΑ.Εν трансдуцированных мГКП, обработанных или нет 1ОР 1. Число (#) колоний/пластин (левая ось Υ, пластины) было рассчитано, и число комплексных копий/клеток векторов лентивирусов (νΟΝ (правая ось Υ, точки) было измерено. ΙΟΡ1 лечение индуцированного роста высшего количества колоний, по сравнению с ОЛБСРМ трансдуцированными необработанными клетками (и=4 независимых эксперимента). По антиапоптотическому лечению, νϋΝ из ОЛБСРМ трансдуцированных клеток показало, что из ΑΚδΑ.Εν трансдуцированных контрольных клеток (и для СРС количества, и для νϋΝ однофакторного дисперсионного анализа: *: р<0,001 по сравнению с обработанными ОАЬС трансдуцированных мГКП с необработанной ΟΑΣΟΕν трансдуцированных клеток; р>0,05 для сравнения с обработанными ΟΑΣΟΕν трансдуцированными мГКП с ΑΚδΑ.Εν трансдуцированными клетками).

Ь - Колонии, выросшие из обработанных мГКП, также показали увеличение в размерах (фото справа, увеличение 5х).

с - ТиЫЕЬ анализ на ΟΑΜΆν и ΑΚδΑ.Εν-трансдуцированных мГКП, обработанных или нет с ΙΟΡ1. 8 полей и 100 клеток были подсчитаны в таком состоянии. Подавляющее большинство обработанных клеток были отрицательными для ΤυΝΕΕ (однофакторный дисперсионный анализ: р<0,001 по сравнению с необработанной ΟΑΜΆν трансдуцированными клетками; р>0,05 по сравнению с ΑΚδΑ.Εν трансдуцированными клетками).

ά - ΟΑΜ'.' активность измеряется на трансдуцированных мГКП от -/- или +/+ мышей. ΙΟΡ1 лечение не оказывает существенного влияния ΟΑΡί'.' уровни экспрессии (и=3) по сравнению с трансдуцированными необработанными контрольными группами (и=6). Показаны средние величины ± δΌ.

Фиг. 16. Анализ катепсина Ό активации в трансдуцированных клетках.

Вестерн-блот анализ катепсина Ό на ОРР.БА или ΟΑΡΕΈν трансдуцированных мГКП и υ937 клетках через различные промежутки времени после переноса генов, как было указано. Активированная форма соответствует 30 кДа мембраносвязанной изоформе, как показано стрелкой. Никаких существенных накоплений активной формы катепсина Ό не наблюдалось в ΟΑΡΡΆν трансдуцированных клетках после переноса генов, по сравнению с ОРР.Б-ν трансдуцированными клетками. Предшественник (48 кДа, стрелка) накопился в ОРР-трансдуцированных клетках после 7 дней культуры (ОРР 7ά), а его накопление было менее выражено в присутствии ΟΑ^С (ΟΑ^С 5ά), кульминацией которого было исчезновение и предшественника, и зрелых форм после 7 дней. Антиактин был использован в качестве контроля для белковой нагрузки.

Фиг. 17. Базальная ΟΑ^С активность в различных типах клеток.

Базальная ΟΑ^С активность, нормированная на уровне мГКП дикого типа. Оба первичных олигодендроцита дикого типа (и=4) и микроглии (и=4) показали более высокую ΟΑ^С активность по сравнению с мГКП.

Фиг. 18. Чувствительность к новой ΟΑ^С экспрессии в миелоидных клетках.

Результаты ΤυΝΕΕ анализа (% ΤϋΝΕΕ+ клеток от общего числа ядерных клеток, на левой оси Υ, пластины), определения ΟΑ^С активности (по правой оси Υ, точки) и, по возможности, предназначенной для окрашивания, выполненного на (а) человеческих моноцитах (Ь) моноцитарной линии клеток человека υ (с) мышиных макрофагах и (ά) мышиных микроглиях через 5 дней после трансдукции. Во всех протестированных условиях ΤυΝΕΕ окрашивание продемонстрировало возникновение незначительного/отсутствие апоптоза (>6 полей и >250 клеток были подсчитаны в состоянии), несмотря на это, эффективная трансдукция (оценивается по анти-НА окрашивания на макрофагах в (с)) и устойчивая ΟΑ^С экспрессия выше базальных уровней и во всех других образцах (ΑΚδΑ.Εν или ОРРЕ-νтрансдуцированных клетках), были получены. Средние величины ± δΌ показаны.

с и ά - Репрезентативные изображения ΤυΝΕΕ анализа на ΟΑ^С/ΟΑ^С-ΗΑ.^V или ОРР.Б-ν трансдуцированных макрофагах (с) и микроглиях (ά). Изображения были получены трёхлазерным конфокальным микроскопом (РгАаисе 2100, ΒίοΡαά). Флуоресцентные сигналы от одиночных оптических секций были последовательно получены и проанализированы программным обеспечением Αάο^ ΡΙιοΙοΜιορ Сδ. Увеличение: 80х в С, 100х в Ό.

Фиг. 19. Чувствительность к новой ΟΑ^С экспрессии в лимфоцитах.

Результаты ΤυΝΕΕ анализа (% ΤυΝΕΕ+ клетки от общего числа ядерных клеток, на левой оси Υ, пластины), определения ΟΑ^С активности (по правой оси Υ, точки), выполненной на Т- и В-лимфоцитах через 5 дней после трансдукции.

ΤυΝΕΕ окрашивание продемонстрировало возникновение незначительного/отсутствие апоптоза (>6 полей и >250 клеток были подсчитаны в состоянии), несмотря на эффективную трансдукцию (см. устойчивая ΟΑ^С экспрессия выше базальных уровней). Средние величины ± δΌ показаны.

Фиг. 20. Чувствительность к новой ΟΑ^С экспрессии в олигодендроцитах.

- 12 023938 а - ТиЫЕЬ анализ (% ТиЫЕЬ+ клетки от общего числа ядерных клеток, на левой оси Υ, пластины), определения САЬС активности (по правой оси Υ, точки), выполненной через 5 дней после трансдукции. ТиЫЕЬ окрашивание продемонстрировало возникновение незначительного/отсутствие апоптоза (>6 полей и >250 клеток были подсчитаны в состоянии), несмотря на эффективную трансдукцию (см. устойчивая СЛЬС экспрессия выше базальных уровней). Средние величины ± §И показаны.

Ь - Репрезентативные изображения ТИЫЕЬ анализа на САЬС.ЬУ или СРР.ЬУ трансдуцированных олигодендроцитах.

Чистота подготовки олигодендроцитов была проверена ЫС2 и Са1-Сег окрашиванием на нетрансдуцированных клетках (ИТ), в то время как микроглии окрашивали Р4/80 на САЬС.ЬУтрансдуцированных клетках; ТоРго (ТР111) был использован для окрашивания ядер. Изображения были получены трёхлазерным конфокальным микроскопом (РаФапсе 2100, ВюРаб). Флуоресцентные сигналы от одиночных оптических секций были последовательно получены и проанализированы программным обеспечением АбоЬе Рйо1о8йор С§. Увеличение: 40х.

Фиг. 21. Регулирование САЬС экспрессии с помощью микроРНК 126. а - Схематическое изображение САЬС.микроРНК126Тад.ЬУ.

Ь, с - САЬС анализ активности и СРС анализ производится на Ι-мГКП, трансдуцированных с САЬС.микроРНК126Тад.ЬУ (САЬС.126шГГ) или с САЬС.ЬУ или СРР.микроРНК126Тад.ЬУ.

Ь - Активность была нормализована до +/+ уровней (первая колонка). Клетки, трансдуцированные с САЬС.микроРНК126Тад.ЬУ САЬС гиперэкспрессией на супрафизиологических уровнях.

с - Число (#) колоний/пластин (левая ось Υ, пластины) было рассчитано, и число комплексных копий/клеток векторов лентивирусов (УСЫ) (правая ось Υ, точки) было измерено. Репрессия САЬС экспрессии микроРНК126 привела к росту высшего количества колоний, по сравнению с САЬС.ЬУ трансдуцированными необработанными клетками (п=4 независимых эксперимента). *: р<0,01 тестом однофакторного дисперсионного анализа.

Фиг. 22. микроРНК126 регулирование САЬС экспрессии предотвращает апоптоз мГКП. а - ТИЫЕЬ анализ на САЬС.микроРНК126Тад.ЬУ или САЬС.ЬУ и СРР.микроРНК126Тад.ЬУтрансдуцированных мГКП. >8 полей и >100 клеток были подсчитаны в состоянии. Подавляющее большинство САЬС.ш1РЫА126Тад.ЬУ трансдуцированных клеток были отрицательными для ТЦЫГЕЬ.

Ь - ТИЫЕЬ анализ (красный) и ТоРго (ТР111, синий) для окрашивания ядер или САЬС.ЬУ САЬС.микроРНК126Тад.ЬУ или САЬС.ЬУ трансдуцированных мГПК -/- через 5 дней после трансдукции: репрезентативные изображения (изображения были получены с помощью тройного лазерного конфокального микроскопа - Раб1аисе 2100, ВюРаб; флуоресцентные сигналы от одиночных оптических секций были последовательно получены и проанализированы программным обеспечением АбоЬе Рйо1о8Йор С§, увеличение 40х).

Фиг. 23. Токсичность новой САЬС экспрессии в ГКП и спасение с помощью Ш1Р-126 регулирования.

Указанные ЬУ§ (а) были использованы для трансдукции мышиных и человеческих ГКП, полученных из Са1с-/- (-/-) и (+/+) мышей дикого типа, а также пуповинной крови (ПК) и костного мозга (КМ) от нормальных доноров соответственно. САЬС активность (Ь) и вектор количества копий (УСЫ) (с) были измерены в искусственных условиях потомства культуры, трансдуцированных мышиных (верхние панели) и человеческих (нижние панели) ГКП (объединенные данные -/- и +/+ ГКП показаны в верхней панели С).

б - количество (#) колоний, полученных из клоногенных анализов (СРС), выполненных в конце трансдукции с указанными ЬУ на мышиных -/- (верхняя панель) и человеческих (нижняя панель) ГКП, сообщено.

е - ТИЫЕЬ анализ проводился через два дня после трансдукции с указанными ЬУ на мышиных -/ГКП (верхняя панель) и СИ34+ клетках ПК и КМ здоровых доноров (нижняя панель). Частота апоптоза среди трансдуцированных клеток была оценена (% ТиЫЕЬ+ клетки). Каждая точка представляет собой отдельный образец (Ь-е).

Ь, е - >8 полей и >100 клеток были подсчитаны для каждого образца. *: р<0,05; ** р<0,01; ***: р<0,001.

£ - Репрезентативный ТиЫЕЬ окрашивания на СРР ЬУ-и САЬС ЬУ-трансдуцированных ГКП показан. Увеличение100х.

Фиг. 24. Улучшение выживания мышей после СЬИ генной терапии ГСК.

Са1е-/- или +/+ мышиные ГКП были трансдуцированы с указанными векторами и внутривенно трансплантировании в Тт8 мышей по экспериментальной схеме (а).

Средние выживание ± §И и среднее приживление трансдуцированных клеток измеряется в % от СРР+ клеток или УСЫ, обнаруженных в костном мозге трансплантированных мышей (± §И) на 120 день или в момент смерти, показаны (п=4-26 на группу). (§) Аналогичные результаты были получены, используя +/+ мГПК. Выживание необработанных СЬИ мышей показано в первой строке (* = необлученные; п.а. = не применимо).

- 13 023938

Ь - Человеческие первичные моноциты, В- и Т-лимфоциты и мышиные микроглии были трансдуцированы с указанными векторами. ОЛЬС активность (выражена кратно к нетрансдуцированным клеткам ИТ) измеряли на культивируемых клетках >5 дней посттрансдукции (центральная панель) и ТиМЕЬ анализ (выраженный в качестве % ТиМЕЬ⁺ клеток) был выполнен через 2 дня посттрансдукции (правая панель). Данные ОЛЬС-трансдуцированных мышиных и человеческих ГКП (из схемы 5) и % ΤυΝΕ0 клеток в ОРР-трансдуцированных микроглиях приводятся для сравнения. Каждая точка представляет собой отдельный образец, в котором >6 полей и >250 клеток были подсчитаны.

с - Репрезентативные изображения ΤϋΝΕΕ окрашивания на клетках микроглии, трансдуцированных с ОЛЬС ЬУ или ОРР ЬУ, как указывалось, окрашивают маркер микроглии Р4/80 (ОЛЬС трансдуцированных клеток) или ОРР. Ядра были обозначены ТоргоШ (ТРШ). Увеличение 100х.

й - Кривые выживания Кар1ап-Ме1ег Тг8 мышей, трансплантированных либо с Оа1е -/- ГКП, трансдуцированных с ОЛЬС-126Т ЬУ (п=26) или Оа1с/ГКП, трансдуцированных ОРР ЬУ (п=10) и необработанных пострадавших контрольных групп (ИТ) (п=15). ОАЕС-126Т по сравнению с ОРР при входе ранговые критерии попарного сравнения: р=0,002; ОЛЬС-126 по сравнению с ИТ: р<0,0001.

е - ОАЕС-126Т трансплантированные мыши были разделены на две группы в зависимости от УС0 измеренным от общих КМ клеток на момент смерти. Выживание показано для животных, несущих меньше (среднее ± 8Ό = 67±13 дней) или более (среднее ± 8Ό = 117±43 дней), чем 5 ЬУ копий в клетки, будучи 5 средним УС0 измеряемым в КМ целой популяции обработанных мышей.

ί - ОЛЬС активность (светло-голубая) была качественно оценена в отделах мозга ОАЕС-126Т трансплантированных и контрольных мышей. Репрезентативные отделы из гиппокампа (ί, д) и варолиева моста (к, ί) из ОАЕС-126Т трансплантированных мышей, по сравнению с \УТ и необработанными Тг8 мышами представлены. ОЛЬС анализ был связан с микроглиями/макрофагагами 1Ьа1 маркера (ί, д) и гематопоэтическим маркером СЭ45 (к, ί). Отмеченное проникновение активированных гематопоэтических клеток присутствует в необработанных и ОАЕС-126Т трансплатированных Тг8 мышах, последний показатель ОЛЬС активности и внутри трансдуцированных ГКП гематопоэтического потомства (стрелка в д и ί, показывающие совместное окрашивание ОЛЬС [в синем] и 1Ьа1 [д] и СЭ45 [ί] в коричневом) и в 1Ьа1^-, СП45^-негематопоэтических клеток. Увеличение 20х в (ί, к) и 40х в (д, ί).

Микро-РНК (ωΐΚΝΆ).

Центральной догмой биологии с давних пор является то, что генетическая информация идет от ДНК к РНК к белку. Другими словами, было сделано предположение, что гены кодируют белки, а белки выполняют все клеточные функции, в том числе регулирование программ экспрессии генов. Однако лишь меньшинство РНК-транскриптов (2-3%) кодируют белки у высших эукариот, ставя под сомнение центральную догму, что белки являются только эффекторами функционирования клетки (Мегсег е! а1., 2009). На самом деле, в настоящее время есть новые доказательства того, что класс некодирующих малых РНК, называемых микроРНК, выполняют важную роль в регуляции экспрессии генов. МикроРНК являются (ВЖ е! а1., 2004; §айе1аш М., 2006; §айе1аш е! а1., 2005; Газиев е! а1., 2005; УекШрек М., 2006; ЛЬопоиг е! а1., 2000) нуклеотидными длинными некодирующими РНК, негативно регулирующими экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, запуская процесс так называемой РНК-интерференции (РНК-интерференции, см. ниже) (Вайе1 Э.Р.. 2004). МикроРНК была впервые обнаружена в СаепогкаЬйь !ΐ8 е1едап8 в виде 1ш-4 и 1е!-7, и они были представлены для регулирования сроков развития личинок. (Ьее е! а1., 1993, Рейнхарт е! а1., 2000). Это открытие привело к поиску аналогичных некодирующих РНК, контролирующих экспрессии генов у высших эукариот. Открытие, что все организмы выражают микроРНК, многие из которых являются филогенетически и сохраняются у разных видов, было задумано как революция в области биологии. Согласно базе данных микроРНК ссылка (к!1р://шюгогпа.8апдег.ас.ик/). 695 различных микроРНК были выявлены у людей на момент написания статьи. МикроРНК были вовлечены почти во всех биологических процессах, включая разработку, дифференциацию, пролиферацию и апоптоз (Х1ао и Ра]е^8ку, 2009). Они также играют важную роль при таких заболеваниях, как рак, сердечная недостаточность и нарушения обмена веществ (Х1ао е! а1., 2009; ЭЛака е! а1., 2008, Кгн1/Ге1й1 е! а1., 2006).

МикроРНК гены разбросаны во всех хромосомах человека, за исключением хромосомы Υ. Они могут быть расположены в некодирующих областях генома или в пределах интроно, генов, кодирующих белки. Около 50% микроРНК появляются в сочетаниях, которые транскрибируются как полицистроновые первичные транскрипты (Еадо8-Цшп!апа е! ак., 2003). Как и в генах, кодирующих белки, микроРНК, как правило, расшифрованы с полимеразы-ΙΙ промоторов, создавая так называемую первичную транскрипцию микроРНК (РК1-микроРНК). Эта РК1-микроРНК затем обрабатывается с помощью ряда эндонуклеотичных шагов расщепления, в исполнении двух энзимов, принадлежащих к типу РНКазы ΙΙΙ, Эго8ка и Эюег. С РК1-микроРНК, стволовой цикл около 60 нуклеотидов в длину, называется мирна предшественником (пре-мирна), выделяется по конкретному ядерному комплексу, состоящему из Эго8ка и ЭЮеогде синдрома критической области гена (ООСК8), который культивирует обе цепи у основания первого контура стебля и листьев 5' фосфат и 2 б.п. в длину, 3' в высоту. Пре-мирна затем активно транспортируются из ядра в цитоплазму по ΚΆΝ-ОТР и Е.хрогОп-01 е! а1., 2003, Лунд е! а1., 2004). Затем Оюег выполняет двойную нить, выделенную в конце контура стебля, не определенную надрезом Ого8ка, гене- 14 023938 рируя 19-24 б.п. дуплексов, которые состоят из зрелых микроРНК и противоположной нити дуплекса, называемой микроРНК * (Ваг1е1 Ό.Ρ., 2004). В соответствии с правилом термодинамической асимметрии, только одной нить дуплекса, выборочно загруженая в РНК-индуцированный приглушённый комплекс (К18С), накапливается в зрелом микроРНК. Это нить, как правило, такая нить, 5'-конец которой менее тесно сопряжена с её дополнением, как это было продемонстрировано при помощи однонуклеотидных несоответствий, представленных в 5'-конец каждой нити микроРНК дуплексов (Томари и соавт., 2005). Однако есть некоторые микроРНК, которые поддерживают накопление двух дуплексных нитей в аналогичной степени (Шварц е1 а1., 2003).

МикроРНК вызвает ΡΝΆί, очень похожие на малые интерферирующие РНК (δίΚΝΛ), которые широко используются для экспериментальных разрушений гена. Основное различие между πιίΚΝΛ и δίΚΝΛ является их биогенез. После загрузки в К18С, главная нить небольшой молекулы РНК взаимодействует с мРНК целевой последовательностью, преимущественно находящейся в З'-нетранслируемой области (З'иТК) генов, некодирующих белки. Было показано, что нуклеотиды 2-8, отсчитываемые от 5'-конца микроРНК, так называемой семенной последовательности, необходимы для запуска РНК-интерференции (Вгеппеске е1 а1., 2005). Если вся последовательность главной нити полностью дополняет мРНК цель, как это обычно бывает для δίΚΝΛδ и растительного микро РНК, мРНК эндонуклиотически расщепляется, при участии ЛгдопаШе (Адо) белка, называемый также срезом малого дуплекса индуцированного РНК комплекса сайленсинга (К18С). ЭСКС (ИЮеогде синдром критической области гена 8) и ТКВР (ТАК (ВИЧ), РНК-связывающий белок 2) двухцепочечные РНК-связывающие белки, которые способствуют развитию биогенеза зрелых миРНК с помощью энзимов ΟϊΌδΙια и Э|сег РНКазы III соответственно. Главная нить дуплекса микроРНК включена в эффекторный комплекс К18С, в котором принимает конкретные задачи с помощью несовершенного соединения оснований и вызывает посттранскрипционное приглушение генов. Несколько механизмов были предложены для этого режима регулирования: ιηίΡΗΚ могут вызывать подавление инициации трансляции, отмечая целевую мРНК деградации с помощью деаденуляции или секвестре цели в цитоплазму 1с Р-тела.

С другой стороны, при условии, что семя полностью дополняет целевой мРНК, но оставшиеся базы показывают неполное соединение, ΚΝΑί действует через несколько механизмов, ведущих к поступательной репрессии (Вайе1 Ό.Ρ., 2004; РШа1 Κ.δ., 2005; Ваг1е1 ΌΡ., 2009). Эукариотические деградации мРНК происходят главным образом через сокращение окончания ро1уА на З'-конце мРНК, и потерей покрытия в 5'-конце, за которым следует 5'-3' экзонуклеазное пищеварение и накопление миРНК в дискретных цитоплазматических областях, так называемых Р-тел, обогащенных компонентами путей распада ιηΚΝΛ (Луи и соавт., 2005).

МикроРНК, которые полезны в данном изобретении, являются микроРНК, которые выражаются в гематопоэтических стволовых и/или клетках-предшественниках, но которые не выражены широко в дифференцированных клетках. Предпочтительные примеры включают тгК-130а, т1К-12б и тгК-223. Другие подходящие микроРНК включают микроРНК, выраженные в эмбриональных стволовых клетках и так называемых плюрипотентных клетках. Например, микроРНК-302А, микроРНК-373 и микроРНК292 специально выражаются в плюрипотентных клетках (Εδ, ΙΡδ), но не у взрослых типа стволовых клеток или дифференцированных клеток. Ье!-7 семьи микроРНК выражены во всех клетках, за исключением плюрипотентных (Εδ, ΙΡδ). т!К-124а специфично выражается в нейронах.

Векторы гена.

МикроРНК могут быть использованы с подходящим вектором гена, т.е. вектором, подходящим для доставки генов (трансгенов), представляющих интерес, таких как вирусный вектор. Вирусные векторы, подходящие для генной терапии, хорошо известны в данной области. Примеры вирусных векторов полезны для настоящего изобретения, описаны в νΟ 2007/000668.

Вирусы из разных семей были изменены, чтобы генерировать вирусные векторы для доставки генов. Вирусы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают ретровирусы, лентивирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы простого герпеса, пикорнавирусы и альфа-вирусы. Настоящее изобретение предпочтительно работает с ретровирусами, в том числе лентивирусами.

Настоящее изобретение может быть использовано для управления экспрессией трансгена, включенного в вектор. Изобретение может быть использовано для управления экспрессией вектора. Например, вектор, который может управляться тю-РНК настоящего изобретения, является онколитическим вирусом.

Трансплантация гематопоэтических стволовых клеток.

Трансплантация гематопоэтических стволовых клеток является ГСКТ-трансплантацией стволовых клеток крови, полученных из костного мозга (в данном случае известного как пересадка костного мозга) или крови. Трансплантация стволовых клеток является медицинской процедурой в области гематологии и онкологии, чаще всего проводится для людей с заболеваниями крови, костного мозга или некоторых видов рака.

- 15 023938

При наличии стволовых клеток факторы роста, ОМ-С8Р и О-С8Р, большинство процедур трансплантации гематопоэтических стволовых клеток в настоящее время осуществляются с использованием стволовых клеток, собранных из периферической крови, а не из костного мозга. Сбор стволовых клеток периферической крови обеспечивает большее количество трансплантата, не требует, чтобы донор подвергался общему наркозу при сборе трансплантата, результаты видны за более короткое время приживления, а может снизить степень долгосрочных рецидивов.

Трансплантация гематопоэтических стволовых клеток остается рискованной процедурой со многими возможными осложнениями, она традиционно зарезервирована для пациентов с угрожающими жизни заболеваниями. Хотя иногда используется экспериментально при доброкачественных и негематологических показаниях, таких как тяжелое инвалидизирующее аутоиммунное заболевание и сердечнососудистые заболевания, риск смертельных осложнений является слишком высоким, чтобы получить более широкое признание.

Многие реципиенты ГСКТ являются пациентами множественной миеломы или лейкемии, которые не получили бы пользу от длительного лечения, или уже устойчивы к химиотерапии. Кандидаты на ГСКТ включают педиатрические случаи, когда пациент имеет врожденный дефект, такие как тяжелый комбинированный иммунодефицит или врожденная нейтропения с дефектными стволовыми клетками, а также детей и взрослых с апластической анемией, которые потеряли свои стволовые клетки после рождения. Другие условия, при которых лечение производится трансплантацией стволовых клеток, включают серповидно-клеточную анемию, МДС, нейробластому, лимфому, саркому Юинга, вызывающие развитие фиброзной ткани маленькие круглые опухоли и болезнь Ходжкина. Совсем недавно немиелоаблативные или так называемые мини-трансплантатные процедуры были разработаны, которые требуют меньших доз препаративной химиотерапии и радиации. Это позволило ГСК быть привитыми пожилым и другим пациентам, которые иначе считаются слишком слабыми, чтобы противостоять обычной процедуре лечения. Настоящее изобретение направлено на расширение терапевтического применения такого лечения за счет повышения их безопасности и/или эффективности.

Заболевания.

Настоящее изобретение особенно полезно в генной терапии, в частности тех методов лечения, которые связаны с выражением потенциально токсичного трансгена. Заболевания, которые могут быть обработаны в соответствии с настоящим изобретением, включают лизосомальные нарушения хранения данных (Ь8Э), такие как глобоидная лейкодистрофия клетки (ГЛД). Другим примером болезни, излечимой настоящим изобретением, является хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ).

Глобоидная лейкодистрофия клетки (СЬЭ). или болезнь Краббе, вызывается мутациями в гене ОАЬС, что вызывает дефицит фермента, называемого галактозилцерамидаза. Накопление неусвоенных липидов влияет на рост защитной оболочки нерва миелина (покрытие, которое изолирует много нервов) и вызывает серьезные дегенерации двигательных навыков. В рамках группы заболеваний, известных как лейкодистрофия, результаты болезни Краббе появляются от несовершенного роста и развития миелина. Лечения генной терапии СЬЭ предполагает вырабатывание ОАЬС гена в организм пациента. Например, ОАЬС может быть вживлен в ГКП или ГСК, которую затем трансплантируют в организм пациента. Авторы настоящего изобретения обнаружили токсичность и в искусственных условиях, и в организме функциональных нарушений мышиных и человеческих ГКП после ЬУ-опосредованного переноса гена ОАЬС и его экспрессии. Эта токсичность может быть преодолена с помощью векторов гена данного изобретения.

Доставка одного или более терапевтических генов векторной системой в соответствии с настоящим изобретением может быть использована отдельно или в комбинации с другими методами лечения или компонентами лечения.

Например, вектор настоящего изобретения может быть использован для доставки одного или нескольких трансгенов, полезных при лечении расстройств, перечисленных в \νϋ-Λ-98/05635. Для удобства, часть этого списка теперь предоставляется: рак, воспаление или воспалительные заболевания, кожные расстройства, лихорадка, сердечно-сосудистые эффекты, кровотечение, коагуляция и острая фаза обострения, кахексия, потеря аппетита, острая инфекция, ВИЧ-инфекция, шоковые состояния, отторжение трансплантата, аутоиммунные заболевания, реперфузионное повреждение, менингит, мигрень и аспиринозависимый антитромбоз; рост опухоли, инвазия и распространение ангиогенеза, метастазы, злокачественные асциты и злокачественная плевральная жидкость; ишемия головного мозга, ишемическая болезнь сердца, остеоартрит, ревматоидный артрит, остеопороз, бронхиальная астма, рассеянный склероз, нейродегенеративные заболевания, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, инсульт, васкулит, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит; пародонтит, гингивит, псориаз, атопический дерматит, хроническая язва, буллезный эпидермолиз; роговичная язвенная ретинопатия и лечение с хирургическим вмешательством; ринит, аллергический конъюнктивит, экзема, анафилаксия; рестеноза, застойная сердечная недостаточность, эндометриоз, атеросклероз или эндосклероз.

Кроме того или в качестве альтернативы, вектор настоящего изобретения может быть использован для доставки одного или нескольких трансгенов, полезных в лечении заболеваний, перечисленных в VΟ-А-98/07859. Для удобства, часть этого списка теперь предоставляется: цитокин и пролиферация кле- 16 023938 ток/дифференциация деятельности; иммунодепрессанты или иммуностимулирующее деятельность (например, для лечения иммунной недостаточностью, в том числе инфицирование вирусом иммунодефицита человека; регулирование лимфоцитов роста, лечения рака и многих аутоиммунных заболеваний, и для предотвращения отторжения трансплантата или для развития противоопухолевого иммунитета); регулирование кроветворения, например лечения миелоидных или лимфоидных заболеваний; способствующих росту костей, хрящей, сухожилий, связок и нервных тканей, например, для заживления ран, лечения ожогов, язв и заболеваний пародонта и нейродегенерации, торможение или активация фолликулостимулирующего гормона (модуляция фертильности); хемотаксичная/хемокинестичная деятельность (например, для мобилизации специфических типов клеток на участки травм или инфекций); кровоостанавливающая и тромболитическая активность (например, для лечения гемофилии и инсульта); противовоспалительная активность (например, для лечения септического шока или болезни Крона), в качестве противомикробных препаратов, модуляторы, например, метаболизма или поведения; анальгетики, лечение специфических расстройств дефицита, лечение, например, псориаза, в человеческой и ветеринарной медицине.

Кроме того или в качестве альтернативы, ретровирусный вектор настоящего изобретения может быть использован для доставки одного или нескольких трансгенов, полезных в лечении заболеваний, перечисленных в ТОО-А-98/09985. Для удобства, часть этого списка теперь предоставляется: тормозные макрофаги и/или Т-клетки, ингибирующие активность и, таким образом, противовоспалительную активность; антииммунная активность, т.е. тормозящее действие на клеточном и/или гуморальном иммунном ответе, в том числе ответе, не связанном с воспалением, подавлять способность макрофагов и Т-клеток придерживаться компонентов внеклеточного матрикса и фибронектина, а также до-регулируемых Гак рецепторов экспрессии в Т-клетках, подавлять нежелательные иммунные реакции и воспаления, включая артрит, включая ревматоидный артрит, воспаление, связанное с повышенной чувствительностью, аллергические реакции, бронхиальная астма, системная красная волчанка, коллагеновые болезни и другие аутоиммунные заболевания, воспаления, связанные с атеросклерозом, атеросклероз, атеросклеротическая болезнь сердца, реперфузионное повреждение, остановка сердца, инфаркт миокарда, сосудистые воспалительные заболевания, респираторный дистресс-синдром или другие сердечные заболевания, воспаление, связанное с язвенной болезнью, язвенный колит и другие заболевания желудочно-кишечного тракта, фиброз печени, цирроз печени и другие заболевания печени, тиреоидит или другие железистые заболевания, гломерулонефрит или другие почечные и урологические заболевания, отит или другие оториноларингологические заболевания, дерматит или другие кожные заболевания, заболевания пародонта или другие стоматологические заболевания, орхит или эпидидимо-орхит, бесплодие, тестикулярные травмы или другие иммунные, связанные с яичками заболевания, дисфункции плаценты, плацентарная недостаточность, привычный аборт, эклампсия, преэклампсия и другие иммунные и/или связанные с воспалением гинекологические заболевания, задний увеит, промежуточный увеит, передний увеит, конъюнктивит, хориоретинит, увеоретинит, неврит зрительного нерва, внутриглазное воспаление, например, ретинит или цистоидный отек макулы, симпатическая офтальмия, склерит, пигментный ретинит, иммунные и воспалительные компоненты дегенеративных болезней, воспалительные компоненты глазной травмы, глазные воспаления, вызванные инфекцией, пролиферативная витреоретинопатия, острая ишемическая невропатия зрительного нерва, чрезмерное рубцевание, например, следующая фильтрация операция глаукомы, иммунная и/или воспалительная реакция против глазных имплантатов и других иммунных и воспалительных реакций, связанных с глазными заболеваниями, воспаления, связанные с аутоиммунными заболеваниями или условиями или расстройствами, где как в центральной нервной системе (ЦНС) или в любом другом органе, иммунном и/или подавление воспаления было бы выгодно, болезнь Паркинсона, осложнения и/или побочные эффекты от лечения болезни Паркинсона, связанные со СПИДом деменции комплекса, связанные с ВИЧ энцефалопатиии, болезнь Девича, хорея Сиденгама, болезнь Альцгеймера и другие дегенеративные заболевания, условия или расстройства центральной нервной системы, воспалительные компоненты Стокса, синдром постполиомиелита, иммунные и воспалительные компоненты психических расстройств, миелит, энцефалит, подострый склерозирующий панэнцефалит, энцефаломиелит, острая нейропатия, подострая нейропатия, хроническая нейропатия, Сш11а1т-Барре, БуйепЬат хоры, миастения, псевдоопухоль мозга, синдром Дауна, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, воспалительные компоненты ЦНС, сжатие, или травмы ЦНС, или инфекции центральной нервной системы, воспалительные компоненты, мышечная атрофия и дистрофия, и иммунные и воспалительные заболевания, условия или заболевания центральной и периферической нервной системы, посттравматические воспаления, септический шок, инфекционные заболевания, воспалительные осложнения или побочные эффекты хирургии, трансплантация костного мозга и другие осложнения трансплантации и/или побочных эффектов, воспалительные и/или иммунные, и побочные эффекты генной терапии, например, из-за инфекции с вирусными переносчиком, или воспаление, связанное со СПИДом, чтобы подавлять или тормозить гуморальный и/или клеточный иммунный ответ для лечения или смягчения моноцитов или лейкоцитов пролиферативных заболеваний, например лейкемия, за счет сокращения количества моноцитов и лимфоцитов, в целях предотвращения и/или лечения отторжения трансплантата в случаях трансплантации натуральных или искусственных клеток, тканей и органов, таких как роговица, костный

- 17 023938 мозг, органы, линзы, кардиостимуляторы естественного или искусственного покрова кожной ткани.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения людей путем генной терапии, где композиция содержит терапевтически эффективное количество вектора настоящего изобретения в составе одного или нескольких получаемых терапевтических и/или диагностических трансгенов и/или вирусной частицы, производимой или полученной таким же образом. Фармацевтическая композиция может быть использована для человека или животного. Как правило, терапевт будет определять фактические дозы, которые будут наиболее эффективны для индивидуального субъекта, и они будут меняться в зависимости от возраста, массы тела и реакции конкретного человека.

Композиция может необязательно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или вспомогательное лекарственное вещество. Выбор фармацевтического носителя, наполнителя или разбавителя может быть определён с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции могут включать в себя, как или в дополнение, носитель, наполнитель или разбавитель любого подходящего связующего вещества(в), смазки(ок), временного возбудителя(ей), наружного возбудителя(ей), солюбилизирующего возбудителя(ей) и других носителей возбудителей, которые могут помочь или увеличить вирусное проникновение в целевой участок (как, например, система доставки липидов).

Где это уместно, фармацевтической композицией можно управлять каким-либо одним или несколькими способами: ингаляцией, в виде суппозитория или пессария, наружно в виде лосьона, раствора, крема, мази или присыпки с использованием на участках кожи, при приёме внутрь в форме или в виде таблеток, содержащих наполнители, такие как крахмал или лактоза, или в капсулах или яйцеклетках либо самостоятельно, либо в смеси с наполнителями, или в виде эликсиров, растворов или суспензий, содержащих ароматические или красящие вещества, или они могут быть введены парентерально, например через носовую полость, внутривенно, внутримышечно или подкожно. Для парентерального введения композиции могут быть лучше всего использованы в виде стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например достаточно соли или моносахаридов, чтобы сделать раствор изотоническим с кровью. При трансбуккальном или подъязычном введении композиции могут быть в виде таблеток или пастилок, которые могут быть сформированы обычным образом.

Поставка одного или более терапевтических генов векторной системой в соответствии с настоящим изобретением может быть использована отдельно или в комбинации с другими методами лечения или компонентами лечения. Болезни, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются только ими, рак, неврологические заболевания, наследственные заболевания, болезни сердца, инсульт, артрит, вирусные инфекции и заболевания иммунной системы. Подходящие терапевтические гены включают кодирование для опухолевых супрессорных белков, наркотических активирующих ферментов, иммуномодулирующих молекул, антител, сложных молекул иммуноглобулинов, гибридных белков, гормонов, мембранных белков, вазоактивных белков или пептидов, цитокинов, хемокинов, антивирусных белков, антисмысловых РНК и рибозим.

- 18 023938

Примеры

Нуклеотидные последовательности: жирным шрифтом: целевая последовательность, дополняющая микроРНК. В общем, используются 4 копии мишеней микроРНК, разделенных 4-6 нуклеотидными линкерами. Это, однако, может быть оптимизировано.

пйк-126: исоиАсссислоиААиААиосо

Ш1К-126Т последовательность:

ССАТТАТТАСТСАСССТАССАСОАТССАТТАТТАСТСАСССТАССААСО

СОТССАТТАТТАСТСАСССТАССАТСАСОСАТТАТТАСТСАСССТАССА пиК-ВОа: САСиССААисииААААОСОСАи тЖ-130аТ последовательность:

АТССССТТТТААСАТТ6САСТ6ТТССАААТССССТТТТААСАТТССАСТО

АСОСОТАТССССТТТТААСАТТССАСТСАТОСАТАТССССТТГТААСАТТ

ССАСТС ιηϊκ-223: иоисАоиииоисАААилссссА пнК.-223Т последовательность:

ССССТАТТТСАСАААСТСАСАССАТССССТАТТТСАСАААСТСАСААСС

СОТССССТАТТТСАСАААСТСАСАТСАСССССТАТТТСАСАААСТСАСА

126Т/130аТ 2/2 комбинация:

ССАТТАТТАСТСАСССТАССАСОАТССАТТАТТАСТСАСССТАССААСа

СОТАТССССТТТТААСАТТССАСТСАТССАТАТССССТТТТААСАТТССА

СТО

126Т (2 мишени):

ССАТТАТТАСТСАСООТАСОАСОАТССАТТАТТАСТСАСООТАССА

Тройная комбинационная цель (126Т/130аТ/223Т, 2 каждая мишень):

ССАТТАТТАСТСАСССТАССАССАТССАТТАТТАСТСАСССТАССААСС

СОТАТССССТТТТААСАТТССАСТСАТОСАТАТССССТТТТААСАТТССА

СТССССССЮТССОСТАТТТСАСАААСТСАСАТСАСССССТАТТТСАСАА

АСТСАСА

Пример 1.

Строительство и проверка лентивирусных векторов репортеров микроРНК.

Для того чтобы определить активность микроРНК в гемеопатических клетках, в том числе редких и слабоизученных в популяциях, как ГСК, авторы воспользовались собственным предварительным наблюдением, что трансгены, выраженные из лентивирусных векторов, могут быть подавлены при эндогенных микроРНК, для которых искусственные участки связывания (мирт, микроРНК целевые участки) будут добавлены в трансген кассеты (Вго^и Β.Ό., 2006). Таким образом, была поставлена цель построить лентивирусную микроРНК репортерных векторов, учитывая микроРНК активность в реальном времени и на одной резолюции клетки. Двунаправленные лентивирусные векторы (Вб.ЬУ) позволяют координировать выражение двух генов репортеров, обусловленных конститутивным промотором с двунаправленной деятельностью, состоящей из человеческого фосфоглицерата киназы (РСК) промотора, слитого с ТАТАполем в виде минимального цитомегаловируса (СМУ) промотора в противоположной ориентации (Атеибо1а М., 2005). Так как эта конструкция позволяет репортерам быть выраженными как две независимые транскрипции, одна из которых может быть выполнена с реагированием на микроРНК активность, добавив ιιτίΚΤ к 3'-ИТК (микроРНК репортер), в то время как другая, не обеспеченная ниКТ, не повлияет на микроРНК и будет служить в качестве внутреннего контроля (нормализатора). Был создан

- 19 023938 клон таких двунаправленных векторов (Вб.ЬУк), содержащих зеленый флуоресцентный белок (СВР) в качестве репортера микроРНК и усеченной формы человеческого небольшого сходства фактора роста нервных рецепторов (ΝΌΡΚ), как конститутивно выраженного нормализатора.

Были выбраны для исследования две микроРНК, которые должны быть выражены в гематопоэтической ткани, микроРНК-223 и микроРНК-126-3р. МикроРНК-223, как сообщалось, высоко и конкретно выражается в дифференцированных миелоидных клетках, но отсутствует в лимфоцитах (Ра/ί В., 2005), что позволяет проверить работу Вб.ЬУк репортеров в хорошо изученных линиях. Более того, авторы хотели исследовать, как микроРНК-223 была выражена в гематопоэтических стволовых клетках и клеткахпредшественниках ГКП. С точки зрения генной терапии, было бы весьма актуальным для идентификации микроРНК, которая сильно выражена в ГКП, но не в дифференцированном потомстве, для того, чтобы предотвратить вне целевой экспрессию трансгена в чувствительных популяциях стволовых клеток при полном сохранении терапевтической коррекции больного потомства. Крупномасштабное клонирование микроРНК позволило предположить, что микроРНК-126 может выполнить эти критерии, как это было специально обнаружено в человеческих СЭ34' ΗδΡΟ, но не в других гематопоэтических популяциях клеток (Ландграф и соавт., 2007).

Авторы изобретения выпустили репортер Вб.ЬУк для микроРНК-223 и микроРНК-126-3Р (ВДЬУ223Т и 126Т-Вй.ЬУ соответственно), а также контроль Вб.ЬУ, не содержащий ниКТ (схема 1). Эти векторы были тогда оценены по панели различных типов клеток (схема 2). ΗΕΚ293Τ эмбриональных почечных клеток, И937 моноцитов клеток и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НИУЕСк) были трансдуцированы с согласованными дозами Вб.ЬУ-СТК, Вй.ЬУ-223Т и 126Т-Вй.ЬУ и проанализирована ярепортера методом проточной цитометрии (РΑСδ) через несколько дней после трансдукции. ΗΕΚ293Τ клетки выражают от низкого до неопределённого уровня микроРНК-223 или микроРНК-126, в то время как И937 клетки сильно выражают микроРНК-223, но не микроРНК-126 (схема 2) и НИУЕСк выражают микроРНК-126, но не микроРНК-223 (КиеЬЬасЬег с1 а1., 2007). В качестве дополнительного контроля авторы спроектировали НЕК293Т клетки, чтобы эктопически выразить микроРНК-126 (схема 2а) с помощью трансдукции с ЬУ, содержащие рг1-т1К-126 под управлением вездесущего промотора (в настоящее время называют НЕК293Т.ЬУ.т1К-126, в отличие от неконтролируемого типа клетки НЕК293Т).

В НЕК293Т клетках СВР означает интенсивность флуоресценции (ΜΡΙ) из ЫСРК экспрессии трансдуцированных клеток, одинаковый для всех трех Вб.ЬУк (схема 2б в левой колонке), подтверждающий, что ни микроРНК-223, ни микроРНК-126-3р не были выражены в этих клетках. В резком контрасте, И937 клетки, трансдуцированные с Вй.ЬУ.223Т, показали существенное сокращение СВР МФО по сравнению с ВДЬУ.126Т или Вй.ЬУ.с1г1, указывая, что микроРНК-223, но не микроРНК-126, была биологически активна в И937 клетках. Напротив, НИУЕСк показали репрессию СВР специально для ВДЬУ-126Т по сравнению с векторным контролем. Точно так же НЕК293Т.ЬУ.ш1К-126 клетки, трансдуцированные с Вб.ЬУ126Т репортером, сильно регулируется СВР экспрессией по сравнению с неконтролируемым типом НЕК293Т клеток (сравните последний и первый участок в третьем ряду схема 2б).

Для описания микроРНК активности в более количественном выражении, мы вычислили значение Рго1еш ВоМ Кергеккюи (ВК), основанное на нормированном значении интенсивности флуоресценции (МВ1) из микроРНК репортера ВДЬУ по управлению ВДЬУ (схема 2с). Для учета различных уровней переноса генов между векторными группами, мы использовали внутренний нормализатор, ЫСВК, который транскрибируется в стехиометрические суммы с микроРНК репортером, СВР. Таким образом, мы завершили ВΑСδ анализ ЫСВК положительных клеток, и рассчитали соотношение трансгена (ТСК), деля ЫСВК МВ1 по СВР МВ1 для каждого ВДЬУ. ТСК, полученные для микроРНК репортерных векторов (ВДЬУ.223Т или ВДЬУ.126Т, соответственно) были затем разделены с помощью ТСК контроля ВДЬУ. Это фактор, который мы называем кратная репрессия с сегодняшнего дня, не зависит от дозы вектора и уровня трансдукции (по меньшей мере, в пределах линейного участка векторной кривой дозыреакции) и обеспечивает количественный отсчет для микроРНК активности в анализируемых клетках (схема 2с). ттКТ были разработаны для того, чтобы идеально дополнять родственные микроРНК. Таким образом, ожидается, что транскрипции, признанные микроРНК, были деградированы. Чтобы доказать это, измерили ЫСВК и транскрипции СВР мРНК при помощи КТ-ОРСК в И937 и НЕК293Т.ЬУ.т1К-126 клетки и рассчитанной Ρ.ΝΛ кратной репрессией, как указано на схеме 2с. В самом деле, СВР транскрипции были снижены по сравнению с NСВК транскрипциями И937.ВДЬУ.223Т клеток, а также в НЕК293ТПУ.т1К-126.ВДЬУ.126Т клетках, как показано расчётами значения КNΑ кратной репрессии 7 и 14 соответственно (схема 2с, алмазы).

- 20 023938

Взятые вместе, эти результаты показывают, что рассматриваемая микроРНК, регулируемая ВЙ.ЬУк, на самом деле подтверждает микроРНК активность в клеточных линиях в соответствии с нашими собственными и ранее опубликованными данными микроРНК экспрессии. В дополнение к традиционным методам профилирования микроРНК, рассматриваемые векторы подтверждают не только наличие микроРНК, но и её биологическую активность. РЛС8 анализ клеток, имеющие рассматриваемый ВЙ.ЬУ репортер, позволяет оценить микроРНК активность на одном уровне клеток и, таким образом, подходит для анализа гетерогенных смесей клетки, которые могут быть далее разделены иммунофенотипированием.

Характеристика микроРНК-223 и микроРНК-126 активности в мышиной гематопоэтической системе.

Продемонстрировав надежность репортеров ВЙ.ЬУк в измерении активности микроРНК в клеточных линиях, перейдем к исследованию активности вышеупомянутых микроРНК в начальных гематопоэтических клетках. С этой целью воспользуемся мышиным образцом, потому что он широко доступен, легко управляем в экспериментальных условиях и хорошо описан. На самом деле, когда авторы стремились определить микроРНК активность в редких популяциях ГКП, мышиная гематопоэтическая система, хорошо характеризуемая поверхностными маркерами, представляет большое преимущество. Экспериментальный подход был направлен на обогащение мышиной ГКП из костного мозга, разделяя линии положительных клеток, для их трансдукции с векторными лентивирусными репортерами микроРНК и трансплантации этих клеток в смертельно облученных конгенных мышей-реципиентов. МикроРНК активность была тогда контролирована в лейкоцитах периферической крови в течение долгого времени, чтобы определить её активность в дифференцированных клетках. После достижения стабильного приживления мыши были подвергнуты эвтаназии, и микроРНК активность определяли в нескольких популяциях костного мозга, определяя поверхностным иммунофенотипированием. Таким образом, авторы хотели оценить, насколько эти микроРНК были выражены в будущих определенных ГКП. В частности, авторы хотели определить, присутствует ли микроРНК-126 в самых примитивных ГСК участках. Первая группа мышей была трансплантирована с ГКП, трансдуцированных описанным ранее репортером ВЙ.ЬУк (см. схему 1; ВЙ.ЬУ-СТК, п=5 мышей были трансплантированны; ВЙ.ЬУ-223Т, п=6 мышей или ВЙ.ЬУ-126Т, п=4 мыши).

Периферическая кровь (ПК) была собрана через 8 недель после трансплантации, и лейкоциты были отсортированы в соответствии с физическими параметрами и поверхностными маркерами в гранулоцитах (СЭ11Ь' участок ксайетЫ §§СЫ), моноцитах (СОНЬ' §§С1о), В-клетках (Τ.Ό19') и Т-клетках (СЭ11Ь СЭ19^-) (схема 3а). ОРР репортер микроРНК и ΝΟΡΚ нормализатор экспрессии был подсчитан в этих лейкоцитов с помощью РЛС8 (схема 3Ь). Хотя ОРР был также выражен во всех лейкоцитах, полученных из ВЙ.ЬУ-СТК и Вй.ЬУ-126Т-трансдуцированных Н8РС, отметим глубокую понижающую регуляцию ОРР, в частности, в ПК миелоидных клетках, но не в лимфоцитах ВЙ.ЙУ-223Т группы. Количественная оценка микроРНК-223 активности указывала на 30- и 17-кратную репрессию в гранулоцитах и моноцитах соответственно, в то время как микроРНК-126 не была активна в лейкоцитах ПК (схема 3с). Для того чтобы охарактеризовать микроРНК-223 и микроРНК-126 профиль в отличие от ГКП подмножества, пожертвовали ВЙ.ЬУ репортерными мышами и подвергали их костный мозг многоцветному анализу иммунофенотипирования с целью выявления в будущем различных популяций клеток-предшественников и стволовых клеток. Было проверено как на мышах, как описано выше, так и в последующем эксперименте на мышах, трансплантированных с ГКП, выраженную более чувствительным микроРНК репортером, основанным на дестабилизированном ОРР варианте. Этот репортер содержит пролин-глутамат-серинтреонин- (РЕ8Т) последовательность, соединенную с С-окончанием ОРР. РЕ8Т мотив опосредует быструю протеасомную деградацию и быстрый оборот белка, сокращение полураспада ОРР примерно с 26 до 4 ч (Кйкета е1 а1., 2007). Этот короткий полураспад ЙОРР позволил более точно выявить изменения в микроРНК экспрессии, которые, возможно, происходят во время транзита ГСК по отношению к совершенным предшественникам. Для того чтобы достоверно определить сигнал ЙОРР, который ниже, чем у стандартного ОРР, аутофлуоресценция в каждой отдельной подгруппе была выделена из ОРР МР1 путем включения группы мышей, несущих ВЙРУХСРР вектор, который не содержал ген ОРР. РЛС8 участки в следующей схеме 4 были получены от КМ мышей с транспортируемыми, более чувствительными векторами ВЙ.ЙОРР. Тем не менее, определение микроРНК активности в мышах, несущих стандартный репортер ОРР, дало очень близкие результаты, так что кратная репрессия на схеме 3 с может быть рассчитана на объединенных данных двух независимых экспериментов (ВЙ-СТК, п=10; ВЙ -223Т, п=9; ВЙ-126Т, п=13 мышей).

Футпринтинг микроРНК активности в мышиной ГКП и их потомстве.

Затем были подсчитаны ВЙЬУ репортерные белковые уровни в нескольких, перспективно определенных гематопоэтических субпопуляциях, изолированных от восстановленных мышей. Участок Н8РС был определен как костный мозг (ВМ) клеток, имеющих с-Кй ¹¹¹ линию маркеров с низким иммунофенотипом, а в дальнейшем был подразделен на части с различной способностью к самообновлению и дифференцирующим потенциалом, основанным на выражении ССС-1, СЭ150. СЭ48 и СЭ45. Следует отметить, что 3 из 5 клеток с иммунофенотипом с-Кй ⁺§са-1⁺ Ьт (К§Ь) СЭ150¹' СЭ48^- предрасположены

- 21 023938 иметь долгосрочный, мультилинейный потенциал обновления при одной клеточной трансплантации и, таким образом, представляют собой настоящие ГСК (Киль М. Дж., 2005). Более того, основываясь на литературе (Ргопк С.1. 2007) и собственных выводах, авторы разделили 1<П'Бса^-Линии^- клеток подмножества, обогащенные гранулоцитами/моноцитами предшественниками (СМР) против предшественников мегакариоцитов и эритроцитов (ЕР) и получившие оценку микроРНК экспрессии. Интересно, что микроРНК-126, ттК.-130а и микроРНК-196Ь показали самую высокую активность на участках, обогащенных самыми примитивными ГСК, и эта активность была потеряна во время ранних стадий дифференциации (схема 4). Важно отметить, что микроРНК-126, ттК.-130а и микроРНК-196Ь в значительной степени неактивны в дифференцированных клетках лимфоидной и миелоидной линий, за исключением терминально дифференцированных гранулоцитов, которые, кажется, могут восстановить некоторую степень микроРНК-126 активности. МикроРНК-223 была выражена в большинстве КБЬ клеток и во всех миелоидных предшественниках (СМР), но при этом был резко снижен уровень в ЕРк. Как и ожидалось, микроРНК-223 была постепенно увеличена в миелоидной дифференциации, в то время как В- и Тлимфоциты были лишены её (схема 5а). Кроме того, члены микроРНК-17 ~92 сочетаний (микроРНК-19, микроРНК-93а, микроРНК-17-5р) показали высокую экспрессию в ГКП. Однако их подавляющая активность была сохранена в течение дальнейшей дифференциации, и снизилась в некоторой степени только в терминально дифференцированных В-клетках и гранулоцитах (схема 5а). Наконец, 1е1-7а сохранила существенную подавляющую активность во всех типах гематопоэтических клеток, в том числе настоящих ГСК, в соответствии с ее вездесущей экспрессией.

Защита ГСК от условного самоубийства микроРНК-126.

Вышеупомянутые следы активности микроРНК были основаны на перспективе изоляции гематопоэтических клеточных популяций по иммунофенотипу. Для того чтобы окончательно определить активность выбранных микроРНК в функционально определенных подмножествах клеток, была разработана система условного самоубийства на основе лентивирусных векторов, выражающих вирус простого герпеса тимидин киназы (ТК) гена, регулируемого разными последовательностями ниКТ (схема 6а). Поскольку ТК является очень стабильной с периодом полураспада около 35 ч, то дестабилизировали белок ТК (сейчас он называется дТК) путем слияния РЕБТ области Й4СРР с С-точкой ТК. ГКП были трансдуцированы с одним из указанных векторов самоубийства или вектором СРР контроля и были помещены в полужидкую среду либо в присутствии, либо в отсутствие ССУ (схема 6б). ГКП, трансдуцированные с вектором ТК контроля, не вызывали рост колонии в присутствии ССУ. Добавление микроРНК-142Т последовательности в транскрипцию ЙТК полностью спасло образование колоний, в соответствии с пангематопоэтической экспрессией этой микроРНК (Вго^п ΒΌ., 2006). Вместо этого, тШ.-223Т, по меньшей мере частично, восстановил рост миелоидных колоний, в то время как число эритроидной колонии было значительно снижено (р<0,001) и не отличалось от контрольных статистически ТК-трансдуцированных клеток. Частичное спасение миелоидных колоний было также достигнуто с помощью микроРНК-126Т, хотя и на более низком уровне, чем полученное с помощью микроРНК-223Т. ССУ полностью предотвратило рост как миелоидных, так и эритроидных колоний в микроРНК-130аТ группах в соответствии с резкой понижающей регуляцией ттК.-130а на ранних стадиях дифференциации.

Затем авторы разработали в организме анализ самоубийства, чтобы продемонстрировать активность микроРНК в функционально определенной ГСК.

ТК/ССУ самоубийственная система требует деления клетки, чтобы стать токсичной. Пробные эксперименты совместно с пересадкой ТК-трансдуцированных клеток с нетрансдуцированными КМ опорными клетками показали, что 1-недельный курс ССУ в течение первых 2 недель после приживления эффективно устраняет ТК-трансдуцированные долгосрочные размножающиеся ГСК (данные не представлены). Затем трансдуцировали ГКП либо с микроРНК-регулируемым двунаправленным вектором самоубийства, выраженным ЙТК-126Т или ЙТК-142Т и СРР, или контрольным двунаправленным вектором самоубийства, выраженным ЙТК и АИСРК. Клетки, трансдуцированные с контрольным или одним из микроРНК регулируемым вектором самоубийства, были тогда трансплантированы в конгенных мышей, которые получали или не получали ССУ во время фазы приживления (схема 6). Долгосрочный анализ периферической крови химеризма показал, что большинство из ΝΟΕΡ' клеток были эффективно устранены в ССУ-обработанных мышах, в то время СРР клетки сохраняются в + относительно повышенном числе. Это наблюдалось в нескольких линиях (гранулоциты, моноциты, В- и Т-лимфоциты) и >7месячного срока как для ЙТК-126Т, так и для 142Т-йТК-трансдуцированных клеток. Эти данные определяют, что как микроРНК-126, так и микроРНК-142 выражаются в долгосрочном размножении ГСК на достаточном уровне, чтобы предотвратить ТК экспрессию белка и гибели клеток, индуцированных ССУ.

Безопасность эксплуатации микроРНК-126 регулирования для генной терапии.

Затем авторы вывели линию трансгенных мышей (Тд.126Т мыши), которая собирает зародышевую линию интеграции лентивирусного вектора, выражающего Й4СРР. 126Т транскрипцию из того же промотора, используемую в ВйЬУ исследовании, которая описана выше. РАС8 анализ Ьш КМ клеток молодых мышей, Тд.126Т взрослых мышей показал аналогичную картину из микроРНК-126 активности, как это наблюдается в мышах с трансплантацией (схема 7а). Это подтверждает, что микроРНК-126 физиологически выражается в ГСК. МикроРНК-126, как известно, выражается в эндотелиальных клетках, а с поте- 22 023938 рей функции в процессе развития привела к гибели плода из-за дефектов ангиогенеза (ΡίδΡ ΙΕ., 2008). Явные фенотипические аномалии не присутствуют в Тд.126Т мышах. Когда Тд.126 мыши были скрещены, пометы нормальных размеров, которые сохранили среднее количество векторных компонентов их родителей, были получены (схема 7Ь). Эти данные показывают, что экспрессия микроРНК-126Т последовательностей из фосфоглицераткиназы 1 (РОК) промотора не мешала мышиному развитию, и выступают против гипотезы, что микроРНК-126Т экспрессия может вмешиваться в регулирование естественных целевых микроРНК-126 в эндотелиальных клетках в этих условиях. Для дальнейшего исключения этого последнего вопроса в гематопоэтических клетках, был проведен конкурентоспособный размножающийся эксперимент. СЭ45.1' Н8РС были совместно введены равным количеством СЭ45.2' Н8РС от Тд.126Т мышей в смертельно облученных СЭ45.1' реципиентов. Химеризма периферийной крови была стабильной и сохранялась не менее 1 года (последний момент анализа) на уровне около 40-50% СЭ45.2' клеток (п=4) для всех основных линий крови (схема 7с). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-126 экспрессирует в примитивные ГСК и биосенсорный подход обеспечивает мощные, нетоксичные средства для выявления гематопоэтических клеток на одном уровне клетки на основе микроРНК экспрессии.

Характеристика кандидата микроРНК активности в гематопоэтических клетках человека.

Характеристика микроРНК-223, ш1К-130а и микроРНК-126 активности в мышиной гематопоэтической системе позволила предположить эти микроРНК как перспективные эндогенные регуляторы для ограничения токсичности трансгена в ГКП, позволяя при этом терапевтическую экспрессию в дифференцированных миелоидных и лимфоидных клетках. Затем авторы стремились исследовать активность этих микроРНК в человеческих гематопоэтических клетках, которые являются фактическими целями для генной терапии. Авторы трансдуцировали человеческие СВ СЭ34' клетки с репортером Вб.ЬУк для ιηίΚ-126, т1К-130а, Ш1К-223 (схема 8А). Клетки культивировали в искусственных условиях, которые обеспечивают поддержку для краткосрочного сохранения ГКП, и субпопуляции, основанные на ί'Ό34/ί'Ό38 экспрессии были определены с помощью проточной цитометрии. Миелоидная (СЭ13') и эритроидная (СЭ235') дифференциация оценивалась с использованием анализа метилцеллюлозы. ιηίΚ-126, ш1К-130а и Ш1К-223 полностью подавили их соответствующие репортерные транскрипты в СЭ34' ГКП популяции. По дифференциации, микроРНК-223 сохранила активность в миелоидной линии, в то время как она снизилась в процессе эритроидной дифференциации. Напротив, микроРНК-126 потеряла свою активность в течение миелоидной дифференциации, но сохранила её в эритроидном потомстве. Эти модели экспрессии были функционально проверены условным анализом самоуничтожения (схема 8Ь). т1К-130а потеряли свою активность в обеих миелоидной и эритроидной линиях. Количественная оценка микроРНК активности в соответствующих популяциях (схема 8А) показала, что среди протестированных микроРНК, микроРНК-126 был самым мощным в микроРНК СЭ34'СЭ38^- СВ, обогащенным примитивными ГКП. Схема 8с/4 показывает дальнейшую оптимизацию штКТ последовательности путем объединения Ш1К-126Т и микроРНК-130аТ последовательностей.

Пример 2.

Вынужденная экспрессия ОАЬС в ГКП.

Для того чтобы оценить возможность чрезмерной экспрессии ОАЬС в мышиной ГКП (мГПК), выделили Ьт-клетки из ΡΥΒ/Γνΐ (ОАЬС -/-) мышей. мГПК были трансдуцированы в МО1 100 с ОАЬС.ЬУ в присутствии оптимизированного сочетания цитокинов (ВЖ с1 а1., 2004). После трансдукции клетки культивировали 10-14 дней в искусственных условиях для оценки энзимной активности и числа копий вектора (УСЫ) по О-РСК. Сравнили уровень экспрессии ОАЬС с гиперэкспрессией других лизосомальных ферментов, арилсульфатазы А (АК8А) и идуронидазы (ГОИА), полученных методом трансдуции мГПК с контролем векторов АК8А.РУ и ГОиА.ЬУ. Все векторы выразили трансген из той же экспрессионной кассеты, содержащей человеческие промоторы РОК. Так как цель заключалась в сравнении гиперэкспрессии энзима в трансдуцированных ^-/-ГКП по отношению к физиологическим уровням фермента дикого типа ГКП, мГПК, полученной из АК8А КО мышей и от ГОИА КО мышей, была использована для трансдукции АК8А.РУ и ГОиА.ЬУ соответственно. Трансдукция мГПК восстанавливает лизосомальную активность энзима в -/- клетках и ведет к гиперэкспрессии энзима по отношению к неконтролируемым уровням в культивированном потомстве, трансдуцированном -/- мГПК (фиг. 9А). Тем не менее, увеличение ОАЬС экспрессии (2 раза выше неконтролируемого типа) было значительно ниже по сравнению с увеличением ГОИА и АК8А, полученным из ШИА^У и АК8А.РУ контролёров (320 и 5,6 кратно по сравнению с неконтролируемым типом соответственно), несмотря на схожие УСЫ.

Аналогичный эксперимент был проведен на человеческих ГКП (чГКП), изолированных через ί'Ό34', выделенных из СВ, полученных от здоровых доноров (η.ά.). чГКП были трансдуцированы в МО1 100 с ОАРС.ЬУ, АК8А.ЬУ и ШИА^У, используя ранее оптимизированные протоколы трансдукции 105. Как и в мГПК, авторы оценили энзимную активность восстановления и УСЫ в искусственных условиях трансдуцированных клеток. ОАЬС.ЬУ трансдукция ГКП из η.ά. ПК (п=4) привела к ограниченной гиперэкспрессии энзима в культивированных клетках потомства по сравнению с ГОиА.ЬУ (п=3) и АК8А.ЬУ (п=6) контролёрами (фиг. 9В).

- 23 023938

Нарушенные в искусственных условиях функции САЬС, выраженных ГКП в ЬУ-опосредованной САЬС экспрессии.

Эффекты трансдукции и энзимной экспрессии в потенциальных клоногенных мГПК оценивались СРС анализом. Равное число САЬС/СРР/АК8А.ЬУ трансдуцированных мГПК были посеяны для анализа колониеобразования. АК8А был выбран в качестве контроля лизосомального энзима, как ранее было показано, не влияющего на ГКП функции (СароШопбо е1 а1., 2007). В 12 независимых экспериментах САЬС.ЬУ трансдуцированные -/-и +/+ мГПК дали развитие значительно меньшему количеству колоний по сравнению с СРР.ЬУ и АК8А.ЬУ трансдуцированными клетками (фиг. 10А для САЬС -/- клеток). Колонии из САЬС.ЬУ трансдуцированных мГПК были заметно уменьшены в размере по сравнению с контрольной группой (фиг. 24В). Эти результаты показали, что гиперэкспрессия САЬС на ЬУ трансдукции ухудшила клоногенный потенциал мГПК. Относительная доля эритроидных и миелоидных колоний при трансдукции САЬС.ЬУ была похожа на контрольную (не показано), предполагая, что экспрессия энзима ухудшила различные гематопоэтические линии в той же степени.

Сниженный потенциал клоногенных САЬС.ЬУ трансдуцированных мГПК может привести к смерти высокотрансдуцированных САЬС гематопоэтических предшественников с чрезмерной экспрессией. Для того чтобы исследовать возможности появления отрицательного отбора высокотрансдуцированных мГПК, подсчитали УСN колонии с помощью О-РСК. О-РСК проводили на ДНК, извлеченной из каждого пула 4 колоний (пулы были сделаны для того, чтобы иметь достаточное количество материала для анализа). Колонии, полученные из САЬС.ЬУ трансдуцированных мГПК, показали значительно низший вектор содержания по сравнению с контрольными (фиг. 10А), что свидетельствует о появлении отрицательной селекции высокотрансдуцированных предшественников.

По этим данным авторы не могли определить, были ли функциональное нарушение и селекция в искусственных условиях из-за токсического действия трансдукции или наличия вредных веществ, выпущенных вектором-производителем клеток и совместно очищенных вектором. Следует отметить, что во время производства САЬС.ЬУ, 293Т клетки отделяются от пластинки, предполагая, что САЬС экспрессия является токсичной для этих клеток. По этой причине включение токсичных молекул, полученных из мертвых 293Т клеток в векторе подготовки, не может быть исключено. Для решения этой проблемы было получено векторное управление, регулируемое гематопоэтическими специфическими тюгоКПА, САЬСттК-142Т.ЬУ 56. Четыре мишени последовательности для микроРНК 142 включены ниже трансгена, позволяя подавить экспрессию в мГПК и в их потомстве без ущерба САЬС экспрессии в негематопоэтических клетках, таких как 293Т ЬУ-продуцирующих клетках. Эта технология основана на микроРНК посттранскрипционной регуляции: микроРНК 142, выраженная только гематопоэтическими клетками, признает её целевую последовательность ниже трансгена и замедляет преобразование транскрипции и экспрессию трансгена. Как и ожидалось, трансдукция мГПК с САЬСтгК-142Т.ЬУ не была связана с повышением активности САЬС (фиг. 10В). Более того, мГПК, трансдуцированные с САЬСт1К-142Т.ЬУ (п=6) показали незатронутый клоногенный потенциал и аналогичный вектор содержания по сравнению с контрольной группой, тем самым подтвердив ранее наблюдаемое ухудшение, которое зависит от САЬС экспрессии (фиг. 10А).

Было исследовано влияние САЬС гиперэкспрессии также и на человеческие ГКП. чГКП были изолированы от п.б. ПК и КМ и из собранных КМ СЬО пациента, который должен был быть отвергнутым. Равное количество чГКП были трансдуцированы с САЬС.ЬУ или АК8А.ЬУ или СРР.ЬУ векторами контроля и посажены для СРС анализа для того, чтобы оценить клоногенный потенциал трансдуцированных чГКП. Как и в случае с мышиными клетками, САЬС.ЬУ, трансдуцированные п.б. и СЬО чГКП, показали нарушение клоногенного потенциала (фиг. 11А). Колонии из САЬС.ЬУ трансдуцированных чГКП показали значительно низший вектор содержания, по сравнению с контрольной группой, уменьшенный размер и сохранённую эритроидно-миелоидную пропорцию, снова предлагая отрицательную селекцию высокотрансдуцированных предшественников (фиг. 11А). Также в этом случае вектор контроля САЬСттК142Т.ЬУ был использован, чтобы исключить неспецифический токсичный эффект трансдукции. Как и в случае мышиных клеток, САЬСт!К-142Т.ЬУ, трансдуцированные чГКП (п=4), показали САЬС активность и клоногенный потенциал, аналогичный тому, который наблюдался в контрольных клетках (фиг. 11а и 11Ь).

В целом эти данные показывают, что вынужденная САЬС новая экспрессия на трансдукции ЬУ оказывает отрицательный эффект как на мышиных, так и человеческих ГКП, что приводит к отрицательной селекции САЬС слишком экспрессирующих клеток и функциональному нарушению.

Нарушенная в организме функция ГКП на ЬУ-опосредованной САЬС экспрессии.

Были проведены в естественных условиях эксперименты с целью оценки потенциала репопуляции м- и чГКП на трансдукции САЬС.ЬУ и САЬС новой экспрессии. В организме исследования проводились на ΐνί и РУВ/ίνί мышах для чГКП и на Кад2с мышах для чГКП.

Первоначальные эксперименты проводились на Ινί мышах, тяжелых моделях СЬО, как описано в разделе Методы. Первая серия экспериментов была направлена на определение условия ТГК у Ινί мышей. Общая трансплантация КМ из дикого типа доноров была выполнена у этих мышей, что привело к значительному увеличению продолжительности их жизни до 100 дней, как сообщалось ранее 115. Эти

- 24 023938 предварительные эксперименты позволили определить оптимальную дозу облучения. Использование донорских ГСК, содержащих СЭ45.1 аллели, позволило оценить приживление донорских клеток, так как ίνΐ мыши имеют СЭ45.2 аллеля. Поскольку целью было преобразование ΐνί ГСК, авторы старались создать трансплантацию Ыи-ГСК для того, чтобы уменьшить количество клеток, которые будут трансдуцированы и трансплантированы по сравнению с использованием общих клеток КМ. ГКП из дикого типа (+/+) мышей были трансдуцированы в ΜΟΙ 100 с РОК ОРР.БХ (ОРР.Б-ν) в присутствии оптимизированного сочетания цитокинов (ВЖ е1 а1., 2004) (фиг. 12А). После трансдукции клетки были трансплантированы в смертельно облученных 8 дневных Ινί мышей или +/- контрольные группы. Контрольные группы включали также ΐνί мышей с трансплантированным диким типом КМ или Ып-клеток. Удивительно, но и в отличие от контрольных животных, ГКП-трансплантированные -/- ΐνί мыши не выжили после смертельного кондиционирования, тем самым предполагая, что Ьш-клетки сами по себе не могут вновь заселить ΐνί мышей (фиг. 12Ь).

Таким образом, решено было поддержать ОРР.Б-ν трансдуцированное приживление ГКП путем совместной трансплантации нетрансдуцированных КМ-производных гематопоэтических коммитированных клеток-предшественников, обедненных ГКП. Эти клетки были получены магнитным истощением δса1+ клеток от общего КМ +/+ мышей. Интересно, что ΐνί мыши, трансплантированные с ОРР.Б-ν трансдуцированными +/+ Ып-клетками и нетрансдуцированными +/+ δса1^- клетками, достигли выживания, подобного полученному с +/+ общей трансплантации КМ (фиг. 12с). Приживление ОРР.Б-ν трансдуцированных ГКП было оценено с помощью проточной цитометрии на периферической крови. Пять-шесть недель после трансплантации цитофлуориметрический анализ показал высокое приживление ОРР' ГКП полученных клеток (фиг. 12ά). Таким образом, совместная трансплантация +/+ δса1-предшественников спасла дефектное приживление очищенных ГКП и позволила продлить жизнь и улучшить фенотип ΐνί мышей, подобно полученному из общего числа +/+ трансплантации КМ (Йегер и др., 1993; Хи е1 а1., 2000).

Так как процедуры трансплантации были оптимизированы с +/+ ГКП и ОРР.БХ. ΐνί мыши были трансплантированы с ΟΑ^С.^V трансдуцированными -/-ГКП и с или +/+ или ΟΑ^С.^V трансдуцированными -/- δса1-клетками. Τνί мыши, получившие ΟΑ^С.^V трансдуцированные -/- ГКП и +/+ нетрансдуцированные клетки, живут значительно дольше, чем мыши, трансплантированные с +/+ общим КМ или с +/+ ГКП и δса1-предшественниками, и показали улучшение их фенотипа и медленное прогрессирование заболевание (фиг. 12с). Эти данные позволяют предположить, что ΟΑ^С ГКП гиперэкспрессирующая трансплантация предоставляет уникальное терапевтическое преимущество по сравнению с обычными ГСК. Однако, когда оценивали присутствие ΟΑ^С.^V трансдуцированных клеток в костном мозге этих мышей с помощью О-РСК обнаружили небольшое количество копий вектора ^СЛ), от 0,8 до 1, что свидетельствует о том, что только ΟΑ^С.^V трансдуцированные клетки с низким νϋΝ удалось привить.

Тем не менее, ΐνί мыши, получившие -/- Ьш- и δса1-клетки, обе трансдуцированные с ΟΑ^С.^V, умерли после смертельного кондиционирования или имели продолжительность жизни, похожую на необработанных мышей. Эти результаты показали, что ΟΑ^С.^V трансдуцированные предшественники не в состоянии поддержать ГКП приживление в результате отказа приживления и аутологичного восстановления гематопоэза.

Авторы решили использовать ΓνΒ/ΐνί мышей вместо обычной ΐνί модели ОБЭ, чтобы воспользоваться преимуществом из чуть менее тяжелой модели: предыдущие эксперименты показали, что успешная трансплантация Ьш-клеток без необходимости δса1-поддерживающих клеток была возможна в этой модели. Более того, ΓνΒ/ΐνί мыши имеют большие пометы, что позволяет иметь большее число -/- мышей, чтобы изолировать мГПК.

Трансдуцированные мГПК были пересажены в смертельно облученных 8 дневных ΓνΒ/ΐνί -/- и гетерозиготных (+/-) реципиентов (схема 13). В целях снижения биологической изменчивости трансплантировали -/- и +/- однопомётных мышей. Мыши контрольной группы были трансплантированы с ОРР.Б-ν трансдуцированными +/+ клетками. Для этой контрольной группы эффективность трансдукции была оценена цитофлуориметрией через 7 дней после трансдукции на культуре в искусственных условиях, а приживление трансдуцированных клеток оценивали по цитофлуориметрии в периферической крови через 6 недель после ГСКТ. Эффективность трансдукции была очень высокой, в пределах между 75 и 93% ОРР' клеток. Все ОРР-трансплантированные животные показали высокое приживление трансплантированных клеток (между 63 и 85%), и все облученные контрольные группы (смертельно облученные мыши, которые не получили ГСК) умерли в течение 3 недель после кондиционирования, подтвердив тем самым правильные настройки ГСК условий. -/- мыши, получавшие ОРР.Б-ν трансдуцированные +/+ мГПК, достигли длительной выживаемости после смертельного кондиционирования (до 150 дней), по сравнению с нетрансплантированными контрольными мышами. Выживание необработанных и ОРРтрансплантированных ΓνΒ/ΐνί мышей было больше по отношению к наблюдаемому в соответствующих группах ΐνί мышей, подтвердив тем самым влияние генетического фона на тяжесть фенотипа. Приживление трансдуцированных мГПК также было оценено с помощью О-РСР на ДНК, извлеченной из КМ трансплантированных мышей, пожертвовав ими. Значительное приживление ОРР.Б-ν трансдуцирован- 25 023938 ных мГПК, измеряемых как УСЫ на геном, наблюдалось (табл. 2). Поразительно, обе -/- и +/- мыши, трансплантированные с САЬС.ЬУ трансдуцированными -/- или +/+ мГПК, не дожили до смертельного облучения (смерть в течение 21 дней, подобно той в контрольных группах) (фиг. 13 и данные не представлены). С-РСК оказался очень низким до неопределяемого УСЫ в своих КМ (табл. 2). Эти результаты показали функциональные нарушения САЬС-трансдуцированных мГПК, которые были не в состоянии населить смертельно условного хозяина.

Апоптоз САЬС экспрессии мышиных и человеческих ГКП.

Обнаружив функциональные нарушения САЬС.ЬУ трансдуцированных ГКП, авторы оценили, могло ли это произойти из-за апоптоза трансдуцированных клеток в посредничестве с новой САЬС экспрессией. Возникновение апоптоза было оценено в двух различных точках времени, 2 и 5 дней после трансдукции, когда экспрессия трансгена предположительно достигает стабильного состояния (см. СРР экспрессия на фиг. 14Ь) с помощью Аппехш У окрашивания и ТИЫЕЬ анализа. Первый метод категоризирует ранний апоптоз клеток, а второй - поздний апоптоз клеток, м- и чГКП были трансдуцированы с САЬС.ЬУ и контрольными СРР/АР§А.ЬУ. После трансдукции и абсорбции клетки были помещены на матригель-покрытые поверхности для анализа ТИЫЕЬ или культивированы в обычных пластинах и окрашены для Аппехш У и ТИЫЕЬ. В конфокальной микроскопии большинство САЬС.ЬУ трансдуцированных мГПК были ТИЫЕЬ положительные и показывали увеличенные ядра с конденсированным хроматином, что свидетельствует о широком распространении апоптоза в обеих временных точках (фиг. 14а, 14Ь). Напротив, АР§А/СРР.ЬУ трансдуцированные клетки были в основном ТИЫЕЬ отрицательными. Аппехш У окрашивание подтвердило появление апоптоза, показывая больший процент апоптотических клеток среди САЬС-трансдуцированных м- и чГКП, по сравнению с контрольной группой (фиг. 14с).

Чувствительность к САЬС экспрессии токсичности зависит от дифференциации и клеточной линии.

Макрофаги и микроглии представляют ГКП эффекторное потомство, воссоздающее активность фермента в пораженных тканях, в том числе нервной системе, в подходах ГКП генной терапии для Ь§И. Авторы оценили, могут ли прототипичная клеточная линия моноцитов (И937), первичные человеческие моноциты, первичные мышиные макрофаги и микроглии наблюдаться в САЬС экспрессии токсичности на ЬУ опосредованном переносе генов. Более того, для дальнейшего анализа специфики САЬСиндуцированного апоптоза вместе с гематопоэтической дифференциацией протестировали Т- и В-лимфоциты. Чтобы разрешить САЬС иммунодетекцию и эффективность оценки трансдукции, в некоторых экспериментах использовали С-неизлечимо помеченный трансген, в котором ген сливается в рамке с последовательностью, кодирующей НА пептид из белка гемагглютинина вируса гриппа человека. НА-помеченный энзим имел специфическую активность, сравнимую с активностью немодифицированного энзима, и был тщательно сортирован по лизосомальным ячейкам (данные не представлены). После трансдукции оценили в разные моменты времени возникновение апоптоза ТИЫЕЬ анализа и САЬС активности. Как и ожидалось, все проанализированные типы клеток показали различные уровни базальной САЬС активности (фиг. 17).

Макрофаги мышей были получены как присоединённая часть перитонеальной совокупности клетки. Первичные культуры микроглии были выделены из мозга +/+ и -/- РУВ/1\\з мышей установленными протоколами (Лгтйгопд Р.С., 1998; е1 а1., СпШ е1 а1. 1996..). Кроме того, протестировали оба первичных моноцита и И937 клеточную линию моноцитов. Человеческие моноциты были изолированы от РВМС положительной селекцией СИ14 моноцитарного маркера. Условия трансдукции были созданы, используя СРР.ЬУ и анализ эффективности трансдукции с помощью цитофлуориметрии (когда это возможно) либо с помощью конфокальной микроскопии. После трансдукции протокол был оптимизирован, микроглии и макрофаги эффективно трансдуцированы с СЛ^С.^У/СЛ^С-ΗЛ.^У и векторами контроля в ΜΟΙ 50 и 200 соответственно и выраженных САЬС выше базальных уровней (фиг. 18). Даже тогда, когда высокие уровни экспрессии (до 40 раз до \\1 уровня) были достигнуты, ТИЫЕЬ анализ показал низкую частоту или отсутствие апоптоза следующей САЬС.ЬУ трансдукции и САЬС гиперэкспрессию во всех клетках (фиг. 18). Никаких различий не наблюдалось между +/+ и -/- микроглией (фиг. 18 и другие данные не приводятся). Эти результаты показывают, что эффекторные клетки ГСК генной терапии не чувствительны к токсичности САЬС, тем самым предполагая, что с целью развития ГСК стратегии генной терапии для СЬИ, САЬС экспрессии следует избегать в ГКП, тогда как она должна быть повышена в дифференцированных миелоидных гематопоэтических клетках, способных нацелеванию энзима на пораженные ткани.

Человеческие Т- и В лимфоциты были получены при РНА-стимуляции и ЕВУ трансформации общего числа РВМС соответственно. Как и в экспериментах с моноцитами и макрофагами, трансдукция была оптимизирована с помощью СРР.ЬУ и проточной цитометрии. В-лимфоциты были эффективно трансдуцированы с СА^С.^У/СА^С-ΗЛ.^У и векторами контроля в ΜΟΙ 100, пока две дозы в ΜΟΙ 100 были использованы для Т-лимфоцитов. Несмотря на устойчивый рост на САЬС активность при трансдукции, не апоптоз был обнаружен на всех рассматриваемых временных точках (фиг. 19), тем самым еще больше поддерживая понятие, что дифференцированные гематопоэтические клетки не чувствительны к САЬС гиперэкспрессии.

- 26 023938

В искусственных условиях регуляция ОАЬС экспрессии с помощью ιηίΚΝΛ126.

Для того чтобы оценить влияние т1КЫА126 регулируемой ОАЬС экспрессии в ГКП, авторы трансдуцировали мГПК с ОАЬС.т1К-126Т.ЬУ, или с ΟΡΡ.ιηίΚ-126Τ.Κν, или ОАЬС.ЬУ в ΜΟΙ 100. После абсорбции клетки были посеяны для СРС анализа или культивированы в искусственных условиях в течение двух недель для ОАЬС анализа активности и Ο-Ρί'.'Κ анализа. Трансдукция с ОΛ^С.т^Κ-126Т.^V разрешает реконструкцию ОАЬС активности на супрафизиологических уровнях в дифференцированном мГПК потомстве до 2 раз, по сравнению с диким типом уровней. Важно отметить, что число колоний, полученных из мГПК трансдуцированных с ОΛ^С.т^Κ-126Т.^V. было подобно контрольным группам и было почти 2-кратно по отношению к ОΛ^С.^V колониям (схема 21с), тем самым предполагая, что регулирование ОАЬС экспрессии т1КЫА126 позволило сохранить клоногенный потенциал трансдуцированных мГПК. Эти обнадеживающие результаты побудили оценить, должен ли непораженный клоногенный потенциал спасти от апоптоза ОΛ^С.т^Κ-126Т.^V трансдуцированных мГПК. После трансдукции мГПК были посеяны на та1пде1-покрытую поверхность, и ТИИЕЬ анализ был выполнен после 2 и 5 дней культивирования. Уровень апоптоза был оценен с помощью конфокальной микроскопии. ТИИЕЬ анализ на ОΛ^С.т^Κ-126Т.^V трансдуцированных клетках показал незначительный или вообще отсутствие апоптоза как на временных точках (1% 1 и 3% 2 на 2 и 5 дней соответственно), подобно тому как это наблюдалось в клетках, трансдуцированных с контролем Εν. (фиг. 22а, 22Ь). Эти данные показали, что подавление ОАЬС экспрессии т1КЫА126 смогло спасти мГПК от ОАЬС-индуцированного апоптоза.

Регуляция ОАЬС экспрессии с помощью тШИА126 в организме.

Влияние ттКПА126 регулируемой ОАЬС экспрессии в мГПК потенциале репопуляции было оценено в +/- РУВ/1\п мышах. Смертельно облученные 8-дневные мыши были трансплантированы с ОΛ^С.т^Κ-126Т.^V трансдуцированных -/- мГПК или с ΡОΚ ОАЬС.ЬУ трансдуцированными клетками и выживаемость была оценена в кратко- и долгосрочной перспективе. Подобно тому, как наблюдалось с СП11Ь_ОАЬС.ЬУ, +/- РУВ/Τνΐ мыши, трансплантированные с ОАЬС.т1К-126Т.ЬУ трансдуцированными мГПК, были спасены от летальности и пережили длительный срок (более 3 месяцев после ТГСК), в отличие от ΡОΚ_ОА^С.^V-трансплантированных мышей, которые не выжили после смертельного кондиционирования. Когда мышам трансплантировали с ОАЬС.т1К-126Т.ЬУ, трансдуцированные мГПК были подвергнуты эвтаназии в возрасте 80 дней, и 0-ПЦР-анализ был проведен на КМ, авторы обнаружили среднее VСN из 5, подтвердив тем самым наличие трансдуцированных клеток в КМ долго после ТГК.

В целом, эти результаты вместе с теми, которые наблюдаются с С^11Ь_ОΛ^С.^V трансдуцированными клетками, показали успешное спасение ОАЬС дефицита и защиты от новой ОАЬС экспрессии в ГКП улучшенной регулируемой стратегии генной терапии.

Принудительная ОАЬС экспрессия является токсичной для ГКП, но не дифференцирует гематопоэтические клетки.

Чтобы разработать модель генной терапии, трансдуцировали ГКП от дикого типа и ОЬИ мышей, несущих точечную мутацию, приводящую к <5% остаточной активности энзима (ΤΚδ)⁴⁵, с ОАЬС или ОΡΡ-экспрессирующими векторами лентивирусов (фиг. 23а). Трансдукция с вектором ОАЬС восстановила ОАЬС активность в культивируемом потомстве ОЬИ клеток, ведущих к ~2-кратной гиперэкспрессии по сравнению с ОΡΡ-трансдуцированными клетками дикого типа (фиг. 23в). Аналогичные уровни экспрессии наблюдались при трансдукции дикого типа мышиных ГКП, а также человеческих С.П34' ГКП от нормальных СВ или КМ (фиг. 23в). Неожиданно, принудительная ОАЬС экспрессия нарушила клоногенную активность как человеческой, так и мышиной ГКП по сравнению с ОΡΡ-трансдуцированных клетками (фиг. 23ά и данные не представлены). ΤυΝΕΕ анализ, проведённый через два дня после трансдукции, показал, что большинство ОАЬС-, но не ОΡΡ-трансдуцированных ГКП были ΤυΝΕΕ положительные и показали увеличение ядер с конденсированным хроматином (фиг. 23е и 23£). Эти результаты показывают, что клоногенное нарушение из ОАЬС-трансдуцированных ГКП было связано с индукцией апоптоза, а также подтверждённым аппехт V окрашиванием (не показано). Функциональные нарушение ГКП непосредственно вызвано принудительной/новой ОАЬС экспрессией, а не токсичностью, связанной с вектором подготовки, так как ГКП, трансдуцированные с микроРНК-142-регулируемым, ОАЬС кодирующим вектором лентивирусов, показали нормальную клоногенную активность и отсутствие апоптоза. В самом деле, 142Т последовательность подавляется ОАЬС экспрессией энзима в гематопоэтических клетках, но не в ЬУ производных клетках³³ (фиг. 23Ь). Принудительная/новая ОАЬС экспрессия была также токсична для долгосрочных привитых клеток, а ОАЕС-трансдуцированным мышиным ГКП не удалось спасти Ττδ мышей от смертельного облучения (фиг. 24а).

После трансплантации ГСК макрофаги и микроглии являются эффекторным потомством, ответственным за воссоздание ОАЬС активности в пораженных тканях. Чтобы проверить, влияет ли токсичность принудительной/новой ОАЬС экспрессии на дифференцированные клетки, трансдуцировали человеческие первичные моноциты, Т- и В-лимфоциты, а также мышиные клетки микроглии с ОАЬС- или контрольными векторами (фиг. 24Ь). Хотя эффективная трансдукция и ОАЬС гиперэкспрессия были достигнуты во всех типах клеток, ΤυΝΕΕ анализ показал низкий или нулевой апоптоз в культурах (фиг. 24Ь и 24с). Таким образом, чувствительность к ОАЬС экспрессии является уникальной особенно- 27 023938 стью ГКП, которая не наблюдалось в зрелых гематопоэтических клетках.

ипК-126 регулирование спасает ГКП от ОАЬС экспрессии токсичности и дает возможность генной терапии ОЬИ.

Селективная токсичность новой ОАЬС экспрессии в ГКП подчеркивает необходимость жесткого регулирования экспрессии трансгена в ГКП для успешной генной терапии ОЬИ. Таким образом, протестировали эффективность новой т!К-126, основанной на системе регулирования и сравнимой с её транскрипционной стратегией, основанной на миелоидно-специфичных СП11Ь промоторах к целевой ОАЬС экспрессии дифференцированного ГКП потомства. Обе стратегии спасли трансдуцированные ГКП от ОАЬС- вызванной токсичности (см. фиг. 23Ь-23е). Тем не менее, восстановленная ОАЬС активность была значительно выше (в 2 раза, чем у уровня дикого типа) в потомстве клеток, трансдуцированных с ОАЬС-126Т лентивектором (в котором ОАЬС экспрессия становится активной с помощью РОК промотора), чем в СИ11Ь-ОАЬС трансдуцированных клетках, даже если сравнить культуры, трансдуцированные с аналогичным количеством копий вектора (фиг. 23Ь и 23с). Авторы также убедились, что ОАЬС.126Т вектор лентивирусов эффективно защитил человеческую ГКП от ОАЬС токсичности (схема 23с и 23й). Учитывая вероятное преимущество от сверхфизиологической активности энзима в зрелых гематопоэтических клетках, выбрали микроРНК-регулируемый вектор для исследования ОЬИ терапии в организме.

ГКП от Тг8 мышей были трансдуцированы с ОАЬС-126Т вектором лентивирусов и трансплантированы в новорожденных Тгк мышей. Трансплантированные мыши были успешно привиты (фиг. 24а) и показали значительно более долгое выживание не только по отношению к необработанным Тгк мышам (р<0,0001), но и к мышам, трансплантированным с диким типом ОРР-трансдуцированных ГКП (р=0,002; фиг. 24а и 24й). Более того, когда стратифицировали генную терапию мышей по количеству копий вектора, измеряемого в КМ, животные с высоким содержанием вектора показали значительно более долгое выживание (фиг. 6е), уверенно предполагая, что суперфизиологическая экспрессия энзима в гематопоэтических клетках увеличивает терапевтическую эффективность ГСК трансплантации. Действительно, эффективная доставка функционального ОАЬС энзима в повреждённый мозг и восстановление дефектной активности наблюдались в мозге Тгк мышей, лечимых генной терапией (фиг. 24ί-24ί). В центральной нервной системе мышей ОАЬС активность была обнаружена как в 1Ьа1+, СИ45+ проникающих гематопоэтических клетках, а также и в 1Ьа1^-, С.П45^- негематопоэтических клетках (фиг. 24ί-24ί), демонстрирующих перекрёстную коррекцию клеток резидентов, вероятно из-за секреции энзима потомством, трансплантированных и трансдуцированных ГКП. Важно отметить, что восстановление активности энзима и увеличение выживаемости были связаны с улучшением фенотипа обработанных мышей, по сравнению с необработанными пораженными контрольными группами, с сохраненными способностями к ходьбе и снижением судорожного сокращения (ОЬИ-связанные интенционные дрожания).

Обсуждение.

Глубокое профилирование экспрессии микроРНК в гематопоэтической системе.

МикроРНК репортерные векторы, используемые в этой работе, дают возможность измерять микроРНК биологическую активность, а не полагаться только на уровни экспрессии микроРНК, обеспечивая тем самым биологически значимое, количественное считывание функции микроРНК. Вго^и е1 а1. предположили, что пороговый уровень экспрессии микроРНК должен быть достигнут для значительной подавляющей активности в отношении появления микроРНК целей, которые могут быть результатом предельной ΗΝΆί структуры, доступной в клетке (Вго^и е1 а1., 2007). Если малые РНК конкурируют за ограниченные ΗΝΆί эффекторные комплексы, достаточно высокий уровень экспрессии может быть необходим для обеспечения включения микроРНК в активную К18С. Таким образом, те виды микроРНК, которые выражаются до очень низких уровней, могут иметь небольшую или отсутствие активности, потому что они не являются частью функционирования К18С. Исследования микроРНК профилирования часто рассматриваются только в относительных различиях в экспрессии микроРНК и, таким образом, показывают статистически значимые различия, которые, тем не менее, могут и не иметь никакого отношения к регуляции генов. Сочетание широты геномозначимого анализа экспрессии микроРНК (например, с помощью микроматриц или глубоко секвенирования) с микроРНК репортерным Вй.ЬУ подходом добавляет новый аспект в изучение микроРНК. Это позволяет строго проверить биологическую значимость дифференциальной экспрессии микроРНК и может быть использовано для продольного изучения экспрессии выбранного микроРНК по нескольким клеточным популяциям, с одним клеточным расщеплением и в живых клетках. Авторы использовали этот подход для изучения экспрессии выбранной микроРНК в редких и труднодоступных клеточных популяциях, таких как ГСК. Проведенные исследования микроРНК репортерного вектора не только подтвердили данные о пиК-223 и пиК-126 экспрессии профилей, описанных в литературе, но добавили дополнительную информацию об активности этих микроРНК в высокочистых ГКП субпопуляциях и их потомстве. ипК-223 ранее уже была описана, в изобилии выраженная в миелоидной линии мышей и людей (СЬеи е1 а1., 2004; Ра/ί е1 а1., 2005, Кока е1 а1., 2007). Действительно, данные репортерного вектора обнаружили высокую активность тгК-223 в гранулоцитах. Более того, активность ипК-223 также была найдена в моноцитах и в иерархии ГКП, в частности в предшественниках, стремящихся к гранулоцито-моноцитной линии. Данные позволяют предположить, что, по

- 28 023938 меньшей мере, некоторые плюрипотентные гематопоэтические клетки выражают тгК-223 как в мышах, так и в людях. Одна возможность заключается в том, что эти клетки нацелены на гранулоцитомоноцитный метаболический путь. Двунаправленные репортерные векторы позволяют фракционирование этих ГКП популяций по ιπίΡ-223 экспрессии и исследовании их потенциала дифференциации. Эти исследования могут обеспечить новый способ перспективного выявления миелоидных предшественников, опираясь не только на поверхностные маркеры, и, возможно, исследовать самые ранние шаги линии дифференциации.

Экспрессия тгК-126 в гематопоэтической системе до сих пор была слабо изучена. Широкое, основанное на глубоком секвенировании исследование микроРНК профилирования широко присваивается к его СИ34+ ГКП. Теперь покажем, что тгК-126 работает в мышиных и человеческих ГКП, в частности в рамках подмножеств, обогащенных самыми примитивными ГСК. На ранних стадиях дифференциации активность ιπίΡ-126 постепенно уменьшается. Ассоциация тгК-126 для человеческих ГСК еще более подтверждается анализом ВбЬУ.126Т-трансдуцированных СВ ГКП, недавно изолированы от Ν00/80ΙΩ мышей, выполненным сотрудником на υΉΝ, Торонто (Ьесйтап е1 а1., 2008, А8Н, аннотация). Данные подтверждают стволовую/раннюю предшествующе специфическую экспрессию шаблона для т|К-126, с сайленсингом в большинстве нижних линий.

Интересно, что подгруппа острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), характеризуемая мутациями в ядро-связующем факторе (СВР), выражает высокие уровни ιπίΡ-126 121. Авторы определили полоподобные киназы (РЬК-2А проверенная цель тгК-126. РЬК-2 была признана в качестве регулятора клеточного цикла и может действовать как опухолевый супрессор гена в гематологических заболеваниях. С учетом жесткой ассоциации тгК-126 с ГСК авторы изобретения изучают в сотрудничестве с группой Джона Дика на υΉΝ, Торонто, активность тгК-126 в лейкозных стволовых клетках (Ь8С), редкие субпопуляции которых стоят на вершине развития иерархии АМЬ, которая, как полагают, отвечают за стойкость к химиотерапии и рецидив (ВагаЬе е1 а1., 2007, Кеппебу е1 а1., 2007). Предварительные результаты показывают, что АМЬ образцы, в частности, принадлежащие к другим подгруппам, чем СВР-АМЬ, проявляют градиент экспрессии т1К-126, будучи самым высоким в Ь8С-обогащенной СИ34+38^- фракции и низким в непривитой фракции. Эта модель активности тгК-126 сохранена в трансплантации Ь8С в иммунодефицитных ΝΘΉ/8ΟΙΉ мышах. Таким образом, активность т|К-126, визуализированная репортером Вб.ЬУ лентивирусов, может служить новым биомаркером и потенциально терапевтической мишенью для лейкозных АМЬ стволовых клеток (Ьесйтап е1 а1., 2008, А8Н, аннотация).

За пределами гематопоэтической системы т1К-126 была тщательно описана как положительный регулятор ангиогенезной индукции в эндотелиальных клетках. Ангиогенез описывает формирование новых кровеносных сосудов за счет роста уже существующих судов. Сигналы, содействующие ангиогенезу, включают фактор роста эндотелия сосудов (УЕСР) и основной фактор роста фибробластов (ЬРСР), которые активируют митоген-активированную протеинкиназу (МАРК) и фосфоинозитидную 3-киназу (Р13К), каскады, регулирующие моторику и пролиферацию эндотелиальных клеток, и последующее прорастание сосудов. т1К-126 имеет две оцененные мишени, участвующие в процессе ангиогенеза, прорастающе-связующий ЕУН1 домен, содержащей белок (8ргеб1) и регуляторную субъединицу Р13К, оба отрицательных регулятора УЕРС/РСР индукции. Эндотелиальные клетки с недостатком т1К-126 не реагируют на сигналы ангиогенеза. Разрушение тгК-126 в полосатом данио привело к потере сосудистой целостности и кровотечения во время эмбрионального развития (Р1зй е1 а1., 2008), в то время как удаление тгК-126 у мышей является причиной протекания сосудов, кровотечения и частичной эмбриональной смертности в связи с потерей сосудистой целостности и дефектов в пролиферации эндотелиальных клеток, миграции и ангиогенезе (\Уапд е1 а1., 2008).

Таким образом, тгК-126 выражается в биологически соответствующих уровнях в ангиогенных эндотелиальных клетках, а также гематопоэтических стволовых клетках и их ближайшем потомстве. Интересно, что экспрессия ιπίΡ-126 является еще одним фактором, который является общим для эндотелиальных клеток и ГСК. На самом деле, во время эмбрионального развития одновременное появление эндотелиальных и гемопоэтических клеток (эритроцитов) в желточном мешке и последовательное появление ГСК и эндотелиальных клеток в аойа-допабо-тезоперйгоз области (АСМ) подчеркивают общее происхождение этих 2 линий, возникающих с так называемого гемангиобласт клеточной популяции. Не удивительно, что растущий список генов, изначально предполагая, что он выражен исключительно в эндотелии сосудов, которые оказались в ГСК, факторах транскрипции и мембранных рецепторах, таких как Т1е2 рецепторы, ССС-1, УЕСРК-(РЙ-1), УЕСРК-(Р1к-1) и СЮ1.

С учетом функциональной и анатомической связи между микроциркуляторной частью и ГСК в процессе развития и во взрослом костном мозге тгК-126 может способствовать гомеостазу гемопоэтической ниши и регулированию пролиферации двух её эндотелиальных и ГСК компонентов.

Вмешательство микроРНК-регулируемой ЬУ с микроРНК функцией.

Одним вопросом по поводу использования микроРНК регулирования является возможность вмешиваться в регулирование природных микроРНК целей с помощью гиперэкспрессивной транскрипции, содержащей последовательности тЖАА цели. Для того чтобы понять биологию и безопасность микроРНК-регулируемой ЬУ, авторы подсчитали требуемую дозу для насыщения активности микроРНК

- 29 023938 (Оейпег е! а1., 2009). При измерении потерь регулирования чувствительных репортеров и природной микроРНК цели при стимулировании клеток с увеличением дозы транскриптов, содержащих последовательности ιηίΚΝΑ цели, обнаружено, что порог для вмешательства в физиологической регуляции микроРНК, как правило, высок и может быть достигнут только при двигательной экспрессии из сильных, вирусных промоторов. Последовательность миРНК цели выражена умеренным промотором как фосфоглицераткиназа (РОК), промотор не насыщает активность микроРНК даже при высоком количестве копий вектора (до 50 интеграций). Это позволило предположить, что регулирование микроРНК могло бы быть безопасно использовано для генной терапии ГСК при выражении микроРНК-регулируемого транскрипта из умеренного промотора и с ограниченным количеством интеграций на клетку. Тем не менее, обнаружили, что векторы лентивирусов могут быть разработаны для намеренного вмешательства в активность микроРНК и, таким образом, быть использованы в качестве инструмента для характеристики микроРНК функции.

При гипервыраженной мишени последовательности микроРНК от сильных промоторов авторы показали, что микроРНК активность может быть насыщенной, ведущей к потерям по регулированию естественных мишеней для ιηίΚΝΑ 126. Кроме того, обнаружили, что насыщение может быть предпочтительным, изменив конструкцию мишени последовательностей. Для генно-регулируемых векторов, таких как описанных в этом тезисе, использовали идеально дополняющие микроРНК соединяющие участки, которые, в первую очередь, приводят к деградации тКЫА транскрипта (см. схему 2с), подобно механизму действия δίΚΝΑ (Вго\\п е! а1., 2007). Поскольку этот процесс происходит с быстрой кинетикой (На1еу е! а1., 2004), микроРНК-К18С комплекс, на самом деле, работает как энзим с высокой скоростью обновления, что делает его по сути труднонасыщаемым. С другой стороны, при внедрении несоответствий между нуклеотидами 9 и 11 микроРНК в мишень последовательности микроРНК деградация транскрипта нарушается до 57, перенаправляя ιηίΚΙ8ί7ιηΚΝΑ комплекс к пути поступательной репрессии, который также используется первоначально в природных микроРНК в клетках животных. Так как поступательная репрессия, вероятно, происходит более медленными темпами, чем деградация, было показано, что несовершенные мишени привели более эффективно к потенциально блокирующей активности микроРНК по отношению к полностью дополняющим мишеням (СеШпег е! а1., 2009). Важно отметить, что векторно-основанная технология лентивирусов позволяет стабильную интеграцию таких кассет экспрессии, предназначенных для разрушения ιηίΚΝΑ в геноме, тем самым представляя платформу, которая позволяет стабильное вмешательство в ιηίΚΝΑ активность. Авторы успешно использовали эту технологию для получения стабильного разрушения тгк-223. Трансплантированные мыши с КМ клетками, трансдуцированными с разрушениями ιηίΚ-223 вектора с высоким количеством копий вектора, ведущего к расширению миелоидных клеток, предполагая, что тгк-223 действует на прекурсоры гранулоцитов моноцитов как негативный регулятор миелопоэза. Кроме того, обнаружили воспалительные патологии легких у мышей, которые были воссозданы с КМ, содержащим тгк-223 вектор разрушения, предлагая дополнительные функции ιηίΚ-223 в регуляции воспаленных миелоидных клеток (ОепШег е! а1., 2009). Удивительно, но эти мыши фенокопировали недавно описанные ιηίΚ-223 мышиные линии разрушения ПоНпшάίδ е! а1., 2008). Помимо генетического разрушения, микроРНК с потерей функцией исследования были ограничены до сих пор до временной трансфекции химически модифицированных тЖЫА антисмысловых молекул, называемых антагомирами (Кги!/Ге1й! е! а1., 2005). Будучи эффективным, их использование ограничивается клетками, которые могут быть легко трансфицированы, что не является возможным для большинства первичных клеток. Кроме того, разрушение является временным и поэтому не легко применимо к генетическим системам модели. Авторы представляют себе широкое применение для ЬУ промежуточного стабильного тЖЫА разрушения. Они являются важными инструментами для исследования физиологической роли тЖЫА.

Применение микроРНК-регулируемых векторов для гемапоэтических стволовых клеток генной терапии.

Характер экспрессии гена репортера, которые описываются в этой работе, имеет также соответствующие последствия для генной терапии. Большинство клинических конструкций генной терапии содержит повсеместно выраженные промоторы, которые гарантируют надежную экспрессию трансгена в типах клеток-мишеней, но и приводит к внецелевой экспрессии. Это эктопическая экспрессия может привести к токсичности, контрселекции генно-модифицированных клеток, включая иммунную реакцию, направленную против трансгенных продуктов или даже онкогенного преобразования (^МеИ е! а1., 1997; Ой е! а1., 2006, Вго\\п е! а1., 2006; Вго\\п е! а1., 2007; \МооЙ5 е! а1., 2006).

Добавление мишени последовательности микроРНК-223 терапевтического трансгена, доставленного в ГСК, будет препятствовать экспрессии в миелоидном потомстве, в том числе предшественниках гранулоцитов, моноцитов и, по меньшей мере, субфракции ГСК. Важно отметить, что эта стратегия приведет к полной терапевтической экспрессии в лимфоидной и красной линиях клеток.

Идентификация тгк-126, которая является сильно выраженной в ГКП, но не в дифференцированном потомстве миелоидной и лимфоидной линий, позволяет предотвратить экспрессию потенциально токсичного трансгена в чувствительных популяциях стволовых клеток, сохраняя при этом экспрессию и терапевтическую эффективность в больном потомстве.

- 30 023938

Токсичность СЛЬС новой экспрессии.

Замена энзима и приложения генной терапии в ЛСД пациентах (КоЬгЬасЬ е! а1., 2007, Вгайу е! а1., 2004) и животных (ВИП е! а1., 2006; §апо е! а1., 2005; Нойшд е! а1., 2004; Запйз е! а1., 1997), в общем, продемонстрировали отсутствие токсичности управления лизосомальных энзимов и экспрессии выше нормального уровня. В случае метахроматической лейкодистрофии (МШ) безопасность ЬУ-опосредованной гиперэкспрессии ΆΚδΆ, катализирующая шаг вверх СЛЬС в метахроматическом метаболизме, была продемонстрирована в мГПК, чГКП и трансгенных мышах (Вйй е! а1., 2004, СароШопйо е! а1., 2007), что вызвало клинические испытания генной терапии ГКП для этого заболевания. Таким образом, сообщаем о неожиданном нахождении очевидной токсичности и в искусственных условиях и в организме функциональных нарушений мышиных и человеческих ГКП после ЬУ-опосредованного переноса гена СЛЬС и его экспрессии. СЛЬС.ЬУ трансдуцированные мышиные ГКП показали нарушение клоногенного потенциала и не смогли прижиться и долго населять туе1оаЬ1а!ей трансплантаты реципиентов. Это было связано с отрицательной селекцией и апоптозом высокотрансдуцированных ГКП. Отсутствие апоптоза и функционального нарушения наблюдается в мышиных и человеческих ГКП, трансдуцированных с контрольным вектором, в котором экспрессия СЛЬС регулируется микроРНК (МесШсНепаком) е! а1.; 2007) (исключительно выраженная в гематопоэтической линии клеток) (Вгоп е! а1., 2006 подтвердили уникальную роль выраженной СЛЬС в определении смерти трансдуцированных клеток).

Дифференцированные клетки менее чувствительны к СЛЬС-относящейся токсичности.

Авторы заметили, что дифференцированные клетки гематопоэтической линии (лимфоциты, моноциты, макрофаги и микроглии) и клетки из других линий (олигодендроциты, а также нейронные предшественники) (Сгйй е! а1., рег8опа1 соттишсайоп) не влияют на ЬУ-опосредованную СЛЬС гиперэкспрессию. Таким образом, ГКП, по-видимому, имеют уникальную чувствительность к СЛЬС- и сфинголипидо-опосредованному контролю выживаемости клеток, который был, возможно, потерян в процессе дифференциации в зрелые миелоидные Т- и В-клетки и который ограничен гематопоэтической линией. Возможным объяснением этого может быть очень низкая базальная СЛЬС активность, обнаруженная в ГКП, по сравнению с другими типами клеток, такими как микроглии и олигодендроциты. Более того, роль метаболизма сфинголипидов и последствия изменений в содержании Сег и производных молекул, таких как 8о и §1Р, могут варьироваться в зависимости от типа клеток и дифференциации этапов. Например, эффект внутриклеточного накопления Сег в олигодендроцитах изучался глубинно с противоречивыми выводами. Недавнее исследование показало, что индукция кислоты сфингомиелиназы, которая отвечает за Сег производство от деградации сфингомиелина, привела к Сег накоплению и индукции апоптоза (Чудакова и др., 2008). Такой же метаболический путь, кажется, вовлечен в олигодендроцитную гибель клеток, индуцированную окислительным стрессом или накоплением пептида ату1о10-Ье1а при болезни Альцгеймера Папа е! а1., 2007, Ьее е! а1., 2004). Тем не менее, зрелые олигодендроциты были также описаны как устойчивые к некоторым проапоптическим раздражителям, вызывающим Сег накопление. Кроме того, дифференциальный ответ на проапоптическую ТПР-стимуляцию наблюдался в олигодендроцитных прекурсорах, в которых высокий уровень апоптоза наблюдался и в зрелых олигодендроцитах, которые оказались устойчивы к апоптической стимуляции (§сиг1оск е! а1., 1999). Зрелые олигодендроциты также устойчивы к апоптозу, вызванному 1Ь-1 управлением (Вго§1 е! а1., 1997). Это говорит о том, что увеличением внутриклеточного Сег можно управлять по-разному, по метаболическим путям, активированным в том особенном типе клеток и в той определённой стадии дифференциации. В поддержку этой гипотезы было заявлено, что увеличение внутриклеточного Сег в нервной ткани управляется высокой активностью кислоты сегаппйазе (Ниапд е! а1., 2004). Этот энзим катализирует деградацию Сег к §о, который, в свою очередь, фосфорилируется в §1Р. §1Р спасает клетки от Сег-индуцированного апоптоза (Ве!йо е! а1., 2006) и вызывает распространение в нейронных клетках-предшественниках (Нагайа е! а1., 2004). Можно предположить, что аналогичный механизм был ответственен за понижение чувствительности олигодендроцитов в СЛЬС гиперэкспрессии, связанной с апоптозом. Метаболический путь сфинголипида также очень активен в олигодендроцитах, которые участвуют в миелинизации для производства миелин гликосфинголипидов (Са1Сег и ЮйГаййе). Более того, эти молекулы участвуют в углеводном взаимодействии, образуя д1усо8упарзе8 (для обзора см. Воддз е! а1., 2008).

Пониженная чувствительность к СЛЬС нового экспрессивно-индуцированного апоптоза, наблюдаемая в моноцитах и макрофагах, может быть объяснена как активностью сегатйазе, так и её секреторным действием. Отчеты показывают, что в эндотелиальных клетках и клетках иммунной системы Сег быстро превращается в §о и §1Р, которые выделяются. В плазме эти молекулы связываются альбумином и выступают в качестве сигналов для специфических рецепторов на лимфоцитах (для обзора см. 78, 142143, Наппип е! а1., 2008; МесЬ!сЬе^^акονа е! а1., 2007, К.щега е! а1., 2008).

Посттранскрипционная регуляция СЛЬС экспрессии для безопасных и эффективных СБП генной терапии.

Регуляция экспрессии трансгена представляет большой интерес в области генной терапии. В частности, возможность посттранскрипционной регуляции тюго Ρ.ΝΛ (ιηίΡ,ΝΛ) в последнее время открывает новые перспективы для настройки уровня экспрессии трансгена по типу клетки и дифференциации

- 31 023938 (Оеп!пег е! а1., 2008). В этом исследовании авторы применили эту инновационную технологию, чтобы подавить ОЛЬС экспрессию в ГКП, которые, как было показано, являются наиболее чувствительными клетками к гиперэкспрессии ОЛЬС токсичности, позволяя при этом гиперэкспрессию энзима в дифференцированных клетках, которые отвечают за ОЛЬС секрецию и перекрёстную коррекцию олигодендроцитов. В частности, была выбрана ш1сгоККЛ126, которая, как сообщается, более высоко выражена в ГКП, по сравнению с мононуклеарными клетками периферической крови 145. Данные показали, что регулирование ОЛЬС экспрессии с помощью ГСК-специфичных т^ΚNΑ126. защищает ГСК от ОЛЬС заново индуцированного апоптоза в искусственных условиях и трансдукция ОЛЬС -/- ГКП с ОЛЬС.шгК.126Т.ЬУ допускает восстановление энзимной активности в их дифференцированном потомстве на сверхфизиологическом уровнях, без ущерба для клоногенного потенциала мультипотентных предшественников, по оценке СРС анализа. Эти данные подтвердили, что ιηίΚΝΑ126 подавляет ОЛЬС экспрессию только в ГКП, а не в их дифференцированном потомстве. Непоражённый клоногенный потенциал может означать, что ОЛЬС экспрессия подавляется не только в ГСК, но и в мультипотентных предшественниках, ответственных за формирование гематопоэтических колоний в СРС анализе.

Более того, трансплантация ОЛЬС.Ш1К-126Т.ЬУ-трансдуцированных ГКП в ОЛЬС +/- РУВ/Ηνί мышей привела к длительному выживанию подопытных животных. Эти данные показывают, что подавление ОЛЬС активности в более примитивных ГСК с помощью ιηίΚΝΑ126 позволяет их долгосрочное заселение и дифференциацию потенциала, который должен быть сохранен. Наличие высокотрансдуцированных клеток в КМ через десять недель после ГСКТ также подтвердило, что долгоживущие ГСК были спасены от ОЛЬС гиперэкспрессии апоптоза.

Важно отметить, что посттранскрипционная регуляция с помощью ГСК-специфической микроРНК допускала использование сильного промотора, такого как РОК, тем самым достигая такого же уровня экспрессии трансгена в дифференцированном ГСК потомстве, так как это было получено с нерегулируемыми РОК_ОЛЬС.ЬУ. Как отмечалось выше, уровень ОЛЬС экспрессии, необходимый для эффективности ГСК генной терапии, неизвестен. Тем не менее, даже если низкий уровень экспрессии энзима может быть достаточен, чтобы получить положительный клинический эффект, использование сильного промотора может позволить снижение количества копий вектора, но достигнуть желаемой энзимной экспрессии. Этот вопрос может иметь отношение к безопасности клинического преобразования генной терапии.

Выводы

Лентивирусная векторная платформа представляет собой универсальный и очень полезный инструмент для изучения функций микроРНК. Разработанные двунаправленные микроРНК репортерные векторы позволяют измерять микроРНК деятельность на одном уровне клетки в сложных массах клеток, добавив новое измерение к традиционным подходам экспрессии микроРНК. Используя этот подход, авторы проанализировали экспрессию нескольких микроРНК в стволовых и клетках-предшественниках (Н8РС) с беспрецедентным разрешением. Изменение промотора и строения целевой микроРНК может привести к лентивирусным векторам, способным к стабильному разрушению микроРНК, полезным для получения потерявших функциональность фенотипов в качестве основы для разработки физиологической роли микроРНК. Протеомный анализ после стабильного разрушения микроРНК позволит определить ключевые цели, такие как микроРНК, которые модулируются в естественной обстановке.

Помимо решения этих основных вопросов биологии, микроРНК-регулируемые векторы имеют значительный терапевтический потенциал. В дополнение к 3'-ИТК из терапевтического трансгена, микроРНК целевая последовательность может уменьшить эктопическую экспрессию трансгена и, таким образом, облегчить или избежать токсичность трансгенов. В частности, биология кроветворной стволовой клетки не должна быть нарушена лечением генной терапии, а кроветворная стволовая клетка представляет собой гарант долгосрочной коррекции болезни, непрерывно поставляя генно-модифицированные дочерние клетки. МикроРНК, характеризуемые здесь, микроРНК-126, шШ.-130а и микроРНК-223 ограничивают нежелательные выражения трансгена в Н8РС, позволяя при этом в дифференцированном потомстве, и получает дальнейшее развитие в клинических протоколах генной терапии.

Каждая из заявок и патентов, упомянутых в этом документе, и каждый документ, цитируемый или упомянутый в каждой из вышеуказанных заявок и патентов, в том числе во время ведения каждой из заявок и патентов (применение цитируемых документов) и инструкции производителя, или каталогов для любых продуктов, цитируемых или упомянутых в каждой из заявок и патентов и в любой из заявок цитируемых документов, включены в настоящее описание в виде ссылки. Кроме того, все документы, приведенные в этом тексте, и все документы, цитируемые или упомянутые документы, приведенные в этом тексте, а также инструкции производителя, или каталоги для любых продуктов, цитируемые или упомянутые в данном тексте, включены в настоящее описание в виде ссылки.

Различные модификации и вариации описанных методов и систем изобретения будут очевидны для специалиста в данной области, не взирая на объем и сущность изобретения. Хотя изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами, должно быть понятно, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами. Действительно, различные модификации описанных режимов для осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в области молекулярной биологии или в смежных областях, призваны быть в пределах объема формул.

- 32 023938

Ссылки

АЬопоиг К, ШППатз ϋΑ, ΕϊηΗοπι Е, е( а1. Ейкйеп! геВоуюиз-тесНаиО (гапзГег οί (Ье ηιιι][ϊάηι§ гез1з1.апсе 1 селе ίηΐο аи(о1о§оиз Нитап !оп£-(егт гер ори1а(т§ Ьета1оро1е1ю йет сеПз. Νβΐ Мед. 2000; 6:652-658.

Ака$М К, Тгауег ϋ, М^уатою Т, 1¥е1ззтап II.. А с1опо§епю соттоп туекнс! рго°еп11ог (На( {Нусз гве (о а11 туекнс! Нпсаеез. №(игс. 2000; 404:193-197.

Атеп<1о1а, М., Уеппеп, М.А., Βίίϊϊ, А., Ук;па, Е. & ΝεΙύίηί, ί. СоогсПпа(е 4иа1-§епе Тгап5§спс515 Ьу Ιεηΐίνϊτβΐ уесюгз саггутс; зуп(Ьс(ю ЬкЛгсс(юпа1 ргото1сгз. Чагигс Ыо1есЬпо1о£у 23, 108-116 (2005).

Агтз(гоп£ КС. 1зо1а(юп ап<1 сНагас(еша(юп οί иптаПие оН§ос1епс1гос>1е Ппеа^е сеПз. Меткой 1998; 16:282-292.

ВагаНе Р, Кеппеду ЛА, Норе КЕ ϋίεΕ ТЕ. Μοάβ1ϊη§ (Не ипВапоп ап<1 рго^геззюп οί Нитап аси(е 1еикет1а ϊη тюе. Зс1епсе. 2007; 316:600-604.

ВаЛе1 ОР. МюгоКЫАз: §епотюз, Ъюцепезк. тесНашзт, апс! ήιηοΐίοη. Се11. 2004; 116:281-297.

Вале! ОР. МюгоКЬГАз: (аг§с( гссо§т(юп апб гс§и1а(огу йтс(юпз. Се11. 2009; 136:21 5-233.

Ве(йо 8, СиуИПег О. Ке§и1а(юп Ьу зрЫп^озте 1-рЬозрНа1с оГВах апб Ваб асбУсВез Винп§ арорЮ515 ΐη а МЕК-с!ереп<1еп1 таппег. ВюсНет ВюрЬуз Кез Соттип. 2006; 340:1273-1277.

ВНВ А, СароЮпбо А, Разапо 8, е1 а1. Оепе (Ьегару οί тейсЬготабс 1еикоВуз1горЬу геуегзез пеиго!о§юа1Ватаге апВ ВеПскз 1п тюе. Л СНп 1пуез(. 2006; 1 16:3070-3082.

Βϊίίϊ А, Ое Ра1та М, фиаНпш А, е( а1. СогтесВоп οί те(асНгота(ю 1еикос1уз1горНу ϊη (Не тоизе то<1е1 Ьу 1гапзр1ап(а(юп οί ^епеВсаПу тосППес! Ьета(оро1е(ю з(ет сеПз. 1 СНп 1пуей. 2004; 113:1118-1129.

В1Я5 А, Ое Ра1та М, Оиайпт А, е( а1. СоггесВоп οί МесаскготаНс ЬеикодузН-орЬу ϊη (Не Моизе МоВе1 Ьу Тгапзр1ап(а(юп οί ОепеВсаПу МосНйеВ Нета(оро1е(ю 3(ет СеПз. 1 СНп 1пуей- 2004; 113; 1118-1129.

- 33 023938

В5 ЛМ, Оао XV, НкаЬага Υ. МуеНп 1>1усо5р!|т£;оПр1Й8, £а1асЮзу1сегагпк1е апй зийаОйе, рагбараСе ίη сагЬоЬуйга(е-сагЬоНуйга1е тГегасОопз Ье(\сееп аррозей тетЬгапез апй тау Гогт §1усозупарзез Ьс1\уееп оП§ойепйгосу1е апй/ог туеНп тетйгапез. ВюсЫт ВюрНуя Ас1а. 2008; 178 0:445-455.

Вгайу КО, ЗсЫЯтапп К. Епгуте-гер1асетеп1 (Ьегару Гог те1аЬоНс я!ога§с Й1зогйегз. Еапсе1 ΝβιίΓοΙ. 2004; 3:752-756.

Вгайу КО. Епгутс гер1асетеп1 Гог 1узозота1 йкеазез. Аппи Кеу Мей. 2006; 57:283296.

Вгеппеске I, Магк А, КиззеП КВ, СоЬеп 5М. Рппс1р1ея οί ιηίεΓθΚΝΑ-ΐ3Γ§ε1 гесо^пкюп. РЬо5 Вю1. 2005; 3;е85.

Вго§1 А, Мгагга М, Ме1Н М, СоЯапОпо-Сессапш Е. Ιηάικίίοη оГ ш1гасе11и1аг сегапййе Ьу т1ег1еик!п-1 Ье1а ίη оН§ойепйгосу1ез. 3 Се11 ВюсНет. 1 997; 66:532-541.

Вгодап Βϋ, Сатоге Α, Αηηοηί А, е1 а1. А пйсгоК14А-ге§и1а1ей Ιβηΐΐνΐταί уесГог тей!а1ез з1аЫе соггейюп оГЬеторЬШа В пйсе. В1оой. 2007; 110:4144-4152.

Вгоууп ВО, ОепГпег В, Сапюгс А, е1 а1. Епйо§епоиз ткгоИЙА сап Не Ьгоай1у ехр1окей 1о гсди1а!с (гапздепе ехргеззюп ассогйтц 1о йззие, Ьпсацс апй Й|ГГсгеп11а1юп з1а1с. Ка( Вю(есЬпо1.200 7; 25:1457-1467.

ΒΐΌ\νη Βϋ, Уеппеп МА, 2тда1е А, 8ег§1 5ег§1 Ь, Νβΐώηΐ Ь. Епйодепоиз пйсгоЮЧА ге@и1а(юп зирргеззез 1гапз§епе ехргеззюп ίη ЬетаЮро1еНс Ипеадез апй епаЫез з(аЫе дспс 1гапзГег. ΝβΙ Мей. 2006;12:585-591.

Саро(опйо А, Ссзат М, Рере 5, е( а). 8а(ё1у оГ Агу1зи1Га1азе А Оуегехргеззюп Гог Оепе ТЬегару оГМе1асЬготайс ЕеикойузйорЬу. Нит Оепе ТНег, 200 7; [ЕриЬ аНеай οΓρπηΙ] РМГО: 17845130.

СНеп ΟΖ, Ы Ь, ЬоЙ1зН НЕ, Вайе! ОР. ΜίοΓοΚΝΑδ тойи1а1е ЬетаЮрО1е11с Нпеаде йПГегепНаПоп. 8с1епсе. 2004; 303:83-86.

СЬийакоуа О Α, Ζί ίόβη ΥΗ, \УЬее1ег ΒΨ, е( а1. 1те§пп-аззос1а1ей Еуп ктазе ргото(ез се11 зиМуа] Ьу зирргеззтд ас1й ярЬтдотусПпаяе аейуку. .1 ΒίοΙ СЬет. 2008;283:28806-28816.

- 34 023938

РАака гап V, Мапп 1)1.. ТЬе ешегпДпд го!е οί ппсгоКΝΑ® ίη сагсЬас гетобеНп^ апй Ьеа« ЙПиге. СЬгс К.ез. 2008;! 03:1072-1083.

Ρβζί Р, Коза А, Райса А, е! ак А тнйсЁгсикгу сотрпзеб οί πιίοι·οΚΝΑ-223 апс1 (гапзспр(юп (асЕогз ΝΡΙ-Α апс! С/ЕВРа1рЬа геёи1а(ез Ьитап §гапи1оро1ез15. Се11. 2005; 123:81 9-831.

р|зЬ ДЕ, Зап(ого ММ, Μοιίοη 813, е1 ак ηιίΚ-126 ге§и1а(ез апдгедстс з1§паЬп§ апб уазси!аг т(е£п1у. Ρβν Се11.2008; 15:272-284.

Οπζίβν Д, ЬисагеЫ О. 51ет се11 (гапзр1ап(а(юп апб §епе Легару Йг Ьето^оЬторабйез. Сигг Нета(о1 Кер. 2005;4:126-131.

Оептег В, 5сЫга С, СшзЕассЬЁт А, е! ак 3(аЫе кпоскбо\уп οί ηιίϋΓοΡίΝΛ ίη νίνο Ьу ΙβιιΐίνίτηΙ уесЮгн. N31 МетЬобз. 2009;6:63-66.

Оептег В, ЗсЬЬа О, ОшзЕассЬЫ А, е1 ак 8(аЫе кпоскбоЕУп οί ηιίοΓοΚΝΑ ίη νίνο Ьу 1еп(ίνίταΙ уесюгз. №( Ме(Ьобз, 2008.

Οπίίί А, РагаЕЁ ЕА, Соуа Ь, еЕ ак Ми1(Ёро(еп(1а1 зЕет сеПз &от ЕЬе аби1( тоизе ЬгаЁп ргоЫсгаЕс апб зеК-гепе\у ίη гезропзе Ео Ьазгс ПЬгоЫазЕ ^гоеуеЬ 1ас(ог. Д Иеигозск 1996; 16:1091-1100.

На1еу В, 2атоге РР. Κίηβίίο апа1уз18 οί (Ье ΚΝΑί епгуте сотр1ех. Кги 3(гис( Мо1 ΒίοΙ. 2004; 11:599-606.

Нагаба Д, Року М, МозкоибЕг МА, ТОгсЬег С. ЗрЬт§озте-1-рЬозрЬа(е тбисез ргоЬГегайоп апб тогрЬо1о§гса! сЬап^ез οί пеига) ргодепйог сеНз. ДКеигосЬет. 2004; 88:1 026-1039.

Не Ь, Не X, Ьотое ЗТО, Наппоп ОД. тюгоКИАз ,ίοίη (Ье р53 пе(№огк--апо1Ьег рЁесе ίη (Ье Еитоиг-зирргеззюп ρυζζΐβ. Νβ( Κβν Сапсег. 2007; 7:819-822.

ΗοίΙίηβ АА, Ρβνίηβ 8, Уо§1ег С, Запбз М3. Нитап СР34⁺ Ьета(оро1е(гс ргодепког се11-б|гес(еб 1еп(тга1-теб1а(еб цепе (Ьегару ίη а хепо(гапзр!ап(а(юп тобе1 οί 1узозота1 зтога§е б1зеазе. Мо1 ТЬег. 2004; 9:856-865.

Ниап§ Υ, Таттика: Н, ЬЁи Ρ, ΙςЬа1 К, Огипбке-кфа!1, Ооп° СХ. ΕΚνοίίοη οί (Ье ΙενεΙ апб ас(ίνίίν οίасИ сегапибазе ίη АЙгсЬпег'з бЁзеазе Ьга!п. Еиг Д N ей газе ί. 2004; 20:3489-3497.

- 35 023938

Дата А, РаЬап К. ΟχίόβΙίνε я1гсзз кП1з китап рптагу ок§обепбгосу1ез \1а пеи1га1 5рк]п§отуе1та$е: 1трксакопз Гог ти1бр1е зс1его513. 1 Ыеиготтипе РЬагтаеок 2007;2:184-193.

1ο1ηιηί6ί3 ЗВ, Нагпз МН, Акее1ег КТ, е1 а1. Ке§и1а1юп оГргоцепког се11 ргоПГегаВоп апб £гапи1осу1е йтсбоп Ьу тюгоКЫА -223. Ыа1иге. 2008; 451:1 125-1129.

Кеппебу 1А, ВагаЬе Р, Роерр! АО, Аап§ 1С, ГЬск .ΙΕ. Соттеп! оп Титог дго'лЧЬ песб по( Ье бгкеп Ьу гаге сапсег з1ет сеПз. 8с1епсе. 2007; 318:1 722; аи(ког гер1у 1722.

ΚίβΙ ΜΙ, УПтаг ОН, ЕуазНка Т, Тегкогз! С, Могпзоп 81. 8Т.ЛМ ГатПу гесер!огз 6Ϊ5ΐίη§ιιί5Η Ьета(оро1е11с Яет апб рго§епког сеНз апб гехеа! епбогЬеНа! тскез Гог зГетсеПз. Се11. 2005; 1 21:1109-1121.

Ккзега Ν, КЬоЫа А, Ере В. ОейаЫНгеб §гееп биогезсеп! ρΓοίοίη бс(ес(з гар1б Γβηιονβΐ οί 1гапзспр1юп Ыоскз аЙег еепокдас ехрозиге. Вкйескшдиез. 2007; 43:222227.

ΚηιΐζΓβΙύί 1, Ка|е\\'зку Ν, Вгаюк К, е( а!. 8Пепст§ оГ тюгоКИАз ίη νίνο \νπΤ 'ап1а§от1гз'. ИаГиге. 2005; 438:685-689.

ΚηιΙζΓβΙάΙ 1, 81оЙе1 Μ. ΜϊογοΚΝΑϊ: а ηβ\ν с1азз оГ ге§и1а(огу §епез аГ(ес£1п§ те(аЬокзт. Се11 Ме1аЬ. 2006; 4:9-12.

КиеЬЬасЬег А, игЫсЬ С, ΖβίΙιεΓ АМ, О1тте1ег 8. Ко1е οί О|ссг апб ОгозЬа Гог епбокЬека! гтсгоКЫА ехргеззюп апб ап§1о§епез18. Скс Кез. 2007; 101:59-68.

Еа^оз-ОипПапа М, Каики! К, Меуег 1, ВогкЬагб! А, ТизсЫ Τ. Νενν тюгоЮТАз Ггот тоизе апб китап. ΚΝΑ. 2003; 9:175-179.

Ьапб^гаГР, Кизи М, 8Ьепбап К, е! а1. А таттакап ιπιογοΚΝΑ ехргеззюп аВаз Ьазеб оп зта11 ΚΝΑ НЬгагу зециепстд. Сек. 200 7; 1 29:1401-1414.

1.сс ГГ, Хи 1, Ьее 1М, е( а]. Ату1о1б-ке(а рерВбе юбисез ок§обепбгосу1е бса(Н Ьу асВуаВп» 1ке пеи1га1 зрЬ]П£отускпазе-ссгат|бс ра{к\уау. 1 Се11 ΒίοΙ. 2004; 164:123-131.

Ьее КС, РетЬаит КЬ, АтЬгоз V. ТЬе С. е1е§апз ке!егоскгопю §епе Ιίη-4 епсобез зта11 ΚΝΑ3\νίΐΗ аппзспяе сотр1етеп!ап!у ΐο кп-14. Сек. 1 993; 75:843-854.

- 36 023938

ΙλιικΙ Ε, СиПт§ег δ, СаМо А, ОаЫ Ьег£ ΙΕ, Ки(ау и. Ыис1еаг ехроп о£ гглсгоКМА ргесигзогз. Зс1епсе. 2004; 303:95-98.

МесМсНепакоуа ϋ, Ш1асНоз А, 8оЬапоу Л, е( а1. ЗрНтдозте 1-рНозр Ьа(е рЬо$рНа(азе 2 Ϊ5 тбисеб 4иг1п§ шПаттаГогу гезропзез. Се1181§па1, 2007; 19:748-760.

Мегсег ТК, От§ег МЕ, МаПгск 18. Ьогщ поп-сосНп^ ΚΝΑϊ: 1пз1§Н(з ΐη(ο йтсОопз. ΝβίΚβνΟβηβί. 2009; 1 0:155-159.

Νδίάίηΐ Ь, В1отег и, Оа11ау Р, е( а1. ϊη νίνο §епе беПхегу ап<1 з(аЫе напзОисОоп о£ ηοηάίνϊάΐη§ се11з Ьу а Ιβηΐίνίτβΐ уес(ог. 8с1епсе. 1996; 272:263-267.

Оп МО, 8сЬт1<11 М, ЗсНсуагэтуаеШег К, е( а1. Соггеспоп о£ Х-11пкес1 сНгоп!С §гапи1ота(оиз сПзеазе Ьу §епе (Негару, аи§теп(ес1 Ьу 1пзеП1опа1 аспуаПоп о£МЕ>31 Ενίΐ, РКОМ1 6 ог ЗЕТВР1. №( Мес1. 2006; 1 2:401-409.

Оп МО, 5е§ег К, 8(ет 8, ЗПег и, НоеЬег О, Огег М. Аскапсез ΐη (Не 1геа(теп1 о£ СНгошс Огапи1ота(оиз Оксазс Ьу аепе (Негару. Сигт Оепе ТНег. 2007; 7:155-161.

ΡϊΙΙβί К8. ΜϊογοΚΝΑ Йтс(юп: ти№р1е тесНатзтз £ог а (5пу ΚΝΑ? ΚΝΑ. 2005; 1 1:1753-1761.

Ргопк СЕ Коз51 ЭЕ Мапззоп К, е( а]. Е1иск1а1юп о£ (Не рНепоХургс, £ипс(юпа1, апс! то1еси!аг (оро^гарЬу о£ а туе1оегу(Нгой ргойепког се11 ЫегагсЬу, Се11 8(ет Се11. 2007; 1:428-442.

КетНаП ВЕ 31аск РЕ Ваззоп М, е( ак ТНе 21-пис1ео(к1е 1е(-7 ΚΝΑ ге§и1а(ез <!еуе1ортеп(а1 (ίιηίη§ ϊη СаепогНаМЮз екдапз. Ча(игс. 2000; 403:901-906.

Ккега Е Ргоса КЬ, О1кега А. ТНе аШапсе о£ зр111п§с«1пе-1-рНозрЬа(е апб ΐ($ гесер(огз ϊη 1ттиш(у. 14а( Кеу 1ттипо1. 2008; 8:753-763.

КоНгНасН М, С1агке ЕТ. Тгеа(теп( о£ 1узозота1 зСога^е сНзогдегз: рго°гезз «НН епгуте гер1асетеп( (Негару. Оги§з. 2007; 67:2697-2716.

КоНгЬасН М, С1агке ЕГ. Тгеа(теп( о£ 1узозота1 з(ога§е сПзогбегз: рго^гезз ννίΐΗ епгуте гер1асетеп( (Негару. Оги§з. 2007; 67:2697-2716.

Коза А, ВаИаппо М, 8опеп('то А, е( а1. ТНе т(егр1ау Ье№ееп (Не таз(ег (гапзспрПоп £ас(ог Ри.1 апб ηιίΚ-424 ге§и1а(ез Нитап топосу(е/тасгорЬа£е <Н££егепПа(гсп. Ргос

- 37 023938

Νβίΐ Асаб 5сл и 8 А. 2007; 1 04:19849-19854.

ЗабеЫп М, Ызо\¥зк1 Ь, ЗатакодШ 8, Κΐνβΐΐα 8, Мау С, КМеге I. Ргодгезз (сплагб (Ье £епе(гс (геа(теп( оГ (Ье Ье(а-(Ьа1аззет1аз. Αηη Ν Υ Асаб 5с ϊ. 2005; 1054:78-91.

ЗабеЫп М. Кесеп( абуапсез ίη §1оЫп депе (гапзГег Гог (Ье (геа(теп( оГ Ье(а(Ьа1а5зет1а апб 31ск1е се11 апепиа. Сип^- Ορϊη Нета£о12006;13:142-148.

Запбз М3, \'о§1сг С, Тоггеу А, е( ак Мигте тисоро1узассЬапбоз15 (уре VII: 1опд (егт (ЬегареиПс ейес(з оГ епгуте гер1асетеп( апб епгуте гер1асетеп( ГоПо^еб Ьу Ьопе тагговд (гапзр1ап(а(юп. 1 СНп Ιηνβίΐ. 1 997; 99:1596-1605,

Запо К, Теззкоге А, 1пдгазз1а Α, 6Άζζο А. СЬетокте-тбисеб гесгиктеп! оГ депейсаПу тобШсб Ьопе таггочс сеПз т(о (Ье СИ8 оГ СМОдапдНозккЫз гтсе соггес(з пеигопа! ра(Ьо1оду. В1ооб. 2005; 1 06:2259-2268.

ЗеЬ'лаг/ 08, НиКадпсг С, Ои Т, Хи Ζ, Ατοηίη Ν, /итоге РО. Азутте(гу ϊη (Ье аззетЫу оГ(Ье Κ.ΝΑΪ епгуте сотр1ех. СеН. 2003; 115:199-208,

8сиг1оск В, Оа\сзоп О. О1Йёгеп(1а1 гезропзез οί оНдобепбгосуГез (о (итог песгоз!з ГаеЮг апб о(Ьег рго-арор(о(ю адеп(з: го!е оГ сегапйбе ΐη арор(оз1з. 1 ТЧеигозс! Кез. 1999;55:514-522.

ГегЯарреп Ь\У, Ниапд 8, ЗаГГогб М, Ьапзбогр РМ, Ьокеп МК. ЗедиепНа! §епега(юпз оГ Ьета(оро1е(!с со!отез беггуеб Ггот ятд1е поп1теаде-соттк(еб СО34⁺ СО38' рго^епког сеПз. В1ооб. 1991; 77:1218-1227.

Тотап Υ, /атоге Ρϋ. РегзресБуе: тасЫпез Гог ΚΝΑί. Сепез ϋβν. 2005; 1 9:517529.

1Уап§ 5, Аигога АВ, 1о1тзоп ВА, е( а1. ТЬе епбо(ЬеНа1-зрес(йс γπιογοΚΝΑ т1К-126 доустз уазси1аг пКсдгку апб апдюдепеж. ОеуСеН. 2008; 15:261-271.

ЗА/еН \УМ. Ьт(оп ΟΡ, \УЬктд-ТЬеоЬа1б Ν, е( ак Оепейс соггес(юп оГ р67рЬох бейс1еп( сЬготс дгапи1ота(оиз б>зеазе изт§ репрЬега! Ыооб ргодепког сеПз аз а (агде( Й»г ге( гоукиз теб1а(еб депе (гапзГег. В1ооб. 1997;89:1 754-1761.

ЗУообз ΝΒ, ВоКего V, ЗсЬпйб! Μ, νοη Ка11е С, Уегта ΙΜ. Оепе (Ьегару: (ЬегареиВс депе саизтд 1утрЬота. 14а(иге. 2006; 440:1 123.

- 38 023938

ΟΛι ΥΡ, Маиида I, КиЬо(а Α, διιζιιΐά К, 5игик! К, Ιηίίΐϋιταίϊοη οί ЬепШодепоиз 1Ь)еа§е се11з ϊη(ο (Ье ОетуеПпаОпд сеп(га1 псгуоия зуз(ет οί ЕуЬсЬег тюе. .1 ЧеигораЙю! Ехр Ыеиго!. 2000; 59:628-639.

Х(ао С, Ра]е^'5ку К. ΜϊογοΚΝΑ соп(го1 ΐη (Ье ттипе зуйет: Ъазю ρηηοΐρίββ. Се11. 2009; 136:26-36.

Уеа§ег АМ, Вгеппап 8. ПЯапу С, Мозег ΗΨ, 8ап(оз ΟΨ. Рго1оп^ес! зигуКа! апд гетуеЬпаГюп айег Ьета(оро1еис се11 (гапзр1ап(а(юп ίη (Ье глксЬег тоизе. 8с(епсе. 1984;225:1052-1054.

Уеа§ег АМ, 8Ыпп С, ЗЬЬюЬага М, РагдоИ ϋΜ. Нета(оро1е(ю се11 (гапзр1ап(а(юп ΐη (Ье (чуйсЬег тоизе. ТЬе ейёс(з οί рге(гапзр1ап( ίθιιάϊ(ίοηίιι§ ν/τίΗ £гаёед довез о£ ЬизиИап. Тгапзр1ап(а(юп. 1993; 56:185-190.

УеьШрек МА. 3(ет се11 (гапзр1ап(а(юп ΐη Ьето§1оЫпора(Ыез. Нето§1оЬт. 2007; 31:251-256.

Υΐ К, ζ>ΐη Υ, Масага 10, СиНеп ВК. Εχροηΐη-5 тесНагез (Ье пис1еаг ехроп οί ргеппсгоЮЧАз апд зЬоН Ьакрш МЧАз. Оепез ϋβν. 2003; 1 7:3011-3016.

- 39 023938

Перечень последовательностей

<110>	Фондационе Чентро Сан Рафаэле дель монтэ Табор Фондационе телетон
<120>	Вектор гена
<130>	Ρ037109ΝΟ
<140> <141>	РСТ/1В2010/001166 2010-04-30
<150> <151>	115 61/174124 2009-04-30
<160>	10
<170>	расепггп уегзгоп 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 22 РНК Синтетическая последовательность
<220> <223>	мишень микроРНК последовательности
<400>	1

исдиассдид адиааиааид сд 22 <21О> 2 <211> 98 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Ш1К'126Т последовательность, комплементарная микроРНК <400> 2 дсатгамас ГсасддГасд асдагдсатт амастсасд дтасдаасдс дгдсаттам 60 астсасддта сдатсасдса 1Та«асТса сддгасда 98 <210> 3 <211> 22 <212> РНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> мишень микроРНК последовательности <400> 3 садидсааид ииаааадддс аи 22 <210> 4 <211> 106 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ттк-130ат последовательность, комплементарная микрорнк <400> 4 аТдсссТТГС аасаТТдсас ТдТТсдаааТ дсссТ1£Таа саттдсас£д асдсдтатдс 60

- 40 023938

5ец1 ссххххааса ттдсасхдах дсахахдссс ттттаасатх дсасхд 106 <210> 5 <211> 22 <212> РНК <213> Синтетическая последовательность <22О>

<223> мишень микроРНК последовательности <400> 5 идисадииид исаааиассс са 22 <210> б <211> 98 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Ш1К-223Т последовательность, комплементарная микроРНК <400> 6 ддддхахххд асааасхдас асдахддддх ахххдасааа схдасаассд дхддддхахх 60 хдасааасхд асахсасддд дхахххдаса аасхдаса 98 <210> 7 <211> 102 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> 12бТ/130аТ 2/2 последовательность комбинации <400> 7 дсаххаххас хсасддхасд асдахдсахх аххасхсасд дхасдаасдс дхахдсссхх 60 ххаасаххдс асхдахдсах ахдсссхххх аасаххдсас Хд 102 <210> 8 <211> 46 <212> ДНК <213> синтетическая последовательность <22О>

<223> 126Т (2 мишени) <400> 8 дсаххаххас хсасддхасд асдахдсахх аххасхсасд дхасда 46 <210> 9 <211> 155 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Мишень трехкомпонентной комбинации (126т/130аТ/223т, 2 мишени каждая) <400> 9 дсаххаххас хсасддхасд асдахдсахх аххасхсасд дхасдаасдс дхахдсссхх 60 ххаасаххдс асхдахдсах ахдсссхххх аасаххдсас Хдссссддхд дддхахххда 120

ЕецТ сааасхдаса хсасддддха хххдасааас хдаса 155 <210> 10 <211> 4 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> мотив последовательности <400> 10

Рго С1и 5ег тНг

Claims (52)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Вектор гена, пригодный для использования в генной терапии и содержащий по меньшей мере одну последовательность мишени микроРНК, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, причем последовательность мишени микроРНК является наводимой микроРНК, выбранной из группы, включающей ш1К-130а и ιηίΡ-126.
2. 2. Вектор по п.1, содержащий по меньшей мере одну последовательность мишени микроРНК, наводимую ш1К-130а, и по меньшей мере одну последовательность мишени, наводимую Ш1К-126.
3. 3. Вектор по п.2, где число копий последовательности мишени микроРНК, наводимой т1К-130а, составляет двойное число копий последовательности мишени микроРНК, наводимой Ш1К-126.
4. 4. Вектор по любому из предшествующих пунктов, где нуклеотидная последовательность контролирует экспрессию вектора.
5. 5. Вектор по п.1 или 2, где нуклеотидная последовательность представляет собой трансген.
6. 6. Вектор по любому из предшествующих пунктов, где вектор является вирусным вектором.
7. 7. Вектор по любому из предшествующих пунктов, где вектор получается из лентивирусов.
8. 8. Вектор по любому из предшествующих пунктов, где вектор содержит тканеспецифический промотор.
9. 9. Вектор по п.8, где тканеспецифический промотор выбирают из группы, включающей СО11Ь, с-Ре8 и СΥВВ и ТЕК.
10. 10. Вектор по п.9, где тканеспецифический промотор является миелоидным специфическим промотором, таким как ТЕК.
11. 11. Вектор по любому из предшествующих пунктов, где трансген кодирует фермент.
12. 12. Вектор по п.11, где фермент выбирают из группы, включающей лизосомальные ферменты галактоцереброзидазы, др91 ркох и интерферон-альфа.
13. 13. Набор ДНК-конструктов, пригодный для получения частицы вирусного вектора, содержащий ДНК-конструкт, кодирующий геном вирусного вектора, включающий по меньшей мере одну последовательность мишени микроРНК, как определено в любом из пп.1-4, и, при необходимости, трансген.
14. 14. Способ получения частицы вирусного вектора, включающий введение набора ДНК-конструктов по п.13 в клетку-хозяин и получение частицы вирусного вектора.
15. 15. Способ по п.14, в котором клетка-хозяин содержит микроРНК, которая наводима на последовательность мишени микроРНК, как определено в любом из пп.1-4.
16. 16. Частица вирусного вектора, полученная способом по п.14 или 15.
17. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по любому из пп.1-12 или частицу по п.16.
18. 18. Клетка, инфицированная или трансдуцированная вектором по любому из пп.1-12 или частицей по п.16.
19. 19. Клетка по п.18, которая представляет собой гематопоэтическую стволовую клетку или гематопоэтическую клетку-предшественник.
20. 20. Набор по меньшей мере из двух различных последовательностей мишени микроРНК, причем последовательности мишени микроРНК являются наводимыми микроРНК, выбранными из группы, включающей тК-130а и тК-126.
21. 21. Набор по п.20, в котором последовательности мишени микроРНК предназначены для одновременного, раздельного или последовательного применения.
22. 22. Вектор по любому из пп.1-12, пригодный для предотвращения или уменьшения экспрессии трансгена в гематопоэтической стволовой клетке или гематопоэтической клетке-предшественнике.
23. 23. Частица по п.16, пригодная для предотвращения или уменьшения экспрессии трансгена в гематопоэтической стволовой клетке или гематопоэтической клетке-предшественнике.
24. 24. Клетка по п.18 или 19, пригодная для предотвращения или уменьшения экспрессии трансгена в гематопоэтической стволовой клетке или гематопоэтической клетке-предшественнике.
25. 25. Набор по п.20 или 21, пригодный для предотвращения или уменьшения экспрессии трансгена в гематопоэтической стволовой клетке или гематопоэтической клетке-предшественнике.
26. 26. Вектор по любому из пп.1-12, пригодный для лечения заболевания, выбранного из глобоидной клеточной лейкодистрофии, хронической гранулематозной болезни, тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИН) и солидных опухолей.
27. 27. Частица по п.16, пригодная для лечения заболевания, выбранного из глобоидной клеточной лейкодистрофии, хронической гранулематозной болезни, тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИН) и солидных опухолей.
28. 28. Клетка по п.18 или 19, пригодная для лечения заболевания, выбранного из глобоидной клеточной лейкодистрофии, хронической гранулематозной болезни, тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИН) и солидных опухолей.
29. 29. Набор по п.20 или 21, пригодный для лечения заболевания, выбранного из глобоидной клеточной лейкодистрофии, хронической гранулематозной болезни, тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИН) и солидных опухолей.

    - 42 023938
30. 30. Вектор по любому из пп.1-12, пригодный для увеличения шансов на выживание гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника относительно генной терапии.
31. 31. Частица по п. 16, пригодная для увеличения шансов на выживание гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника относительно генной терапии.
32. 32. Клетка по п.18 или 19, пригодная для увеличения шансов на выживание гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника относительно генной терапии.
33. 33. Набор по п.20 или 21, пригодный для увеличения шансов на выживание гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника относительно генной терапии.
34. 34. Вектор по любому из пп.1-12, пригодный для повышения безопасности и/или эффективности генной терапии.
35. 35. Частица по п.16, пригодная для повышения безопасности и/или эффективности генной терапии.
36. 36. Клетка по п.18 или 19, пригодная для повышения безопасности и/или эффективности генной терапии.
37. 37. Набор по п.20 или 21, пригодный для повышения безопасности и/или эффективности генной терапии.
38. 38. Вектор по любому из пп.1-12, пригодный для предотвращения апоптоза гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, при этом апоптоз вызван экспрессией трансгена.
39. 39. Частица по п.16, пригодная для предотвращения апоптоза гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, при этом апоптоз вызван экспрессией трансгена.
40. 40. Клетка по п.18 или 19, пригодная для предотвращения апоптоза гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, при этом апоптоз вызван экспрессией трансгена.
41. 41. Набор по п.20 или 21, пригодный для предотвращения апоптоза гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, при этом апоптоз вызван экспрессией трансгена.
42. 42. Вектор по любому из пп.1-12, пригодный для мониторинга стадии дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника.
43. 43. Частица по п.16, пригодная для мониторинга стадии дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника.
44. 44. Клетка по п.18 или 19, пригодная для мониторинга стадии дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника.
45. 45. Набор по п.20 или 21, пригодный для мониторинга стадии дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника.
46. 46. Применение вектора по любому из пп.22, 26, 30, 34, 38 или 42 в гематопоэтической стволовой клеточной терапии.
47. 47. Применение последовательности мишени микроРНК, причем последовательность мишени микроРНК является наводимой микроРНК, выбранной из группы ттк-130а и ιηίΚ-126, для производства лекарственного средства для использования в генной терапии.
48. 48. Применение последовательности мишени микроРНК, причем последовательность мишени микроРНК является наводимой микроРНК, выбранной из группы ттк-130а и ιηίΚ-126, в генной терапии.
49. 49. Способ определения степени дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, включая определение уровня экспрессии микроРНК в клетке, причем микроРНК наводима на последовательность мишени микроРНК, функционально связанную с последовательностью нуклеотидов, причем микроРНК предотвращает или уменьшает экспрессию нуклеотидной последовательности в гематопоэтической клетке-предшественнике или гематопоэтической стволовой клетке, но не в дифференцированной клетке.
50. 50. Способ определения степени дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, включая определение уровня экспрессии по меньшей мере двух различных микроРНК в клетке, причем микроРНК наводимы на последовательности мишени микроРНК, функционально связанные с последовательностями нуклеотидов, причем микроРНК предотвращают или уменьшают экспрессию нуклеотидных последовательностей в гематопоэтической клеткепредшественнике или гематопоэтической стволовой клетке, но не в дифференцированной клетке, и сравнение уровня экспрессии различных микроРНК.
51. 51. Способ определения степени дифференциации гематопоэтической стволовой клетки или гематопоэтической клетки-предшественника, включая определение уровня экспрессии трансгена в указанных гематопоэтической стволовой клетке или гематопоэтической клетке-предшественнике, причем трансген функционально связан с последовательностью мишени микроРНК, причем микроРНК наводима на последовательность мишени микроРНК и предотвращает или уменьшает выраженность трансгена в гематопоэтической клетке-предшественнике (ГКП) или гематопоэтической стволовой клетке (ГСК), но не дифференцированной клетке.
52. 52. Способ по одному из пп.50, 51, в котором микроРНК выбирают из группы, включающей