CN102596255A - 基因载体 - Google Patents

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Abstract

一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低该核苷酸序列在HSPC或HSC中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。

Description

基因载体
发明领域
本发明涉及用于基因转移和治疗应用的基因载体，并涉及产生所述基因载体的方法及其用途。 
发明背景
对于若干遗传性病症和获得性病症，来自正常供体的造血细胞移植(HCT)是治疗性治疗。然而，移植受限于匹配供体可获得性差和与同种异体手术有关的死亡率(大多与移植物抗宿主病-GvHD有关)。在某些病症(例如溶酶体贮积病(LSD))中，HCT的功效非常低。为了提高同种异体移植的安全性和功效，并鉴定用于缺乏匹配供体的患者的备选方案，需要基于基因纠正的自体造血干细胞(HSC)移植的基因治疗方法。 
作为同种异体HCT的备选方法，在患者自身的造血细胞中通过基因治疗可纠正遗传性遗传缺陷。然而，难以将相关基因的功能性拷贝递送至机体的全部受累细胞中。干细胞基因治疗的构思基于相对较少数目的干细胞的遗传修饰，所述干细胞通过进行自我更新分裂长期保留在机体内，并产生众多的经遗传纠正的子代，因此确保了在患者有生之年不断供应经纠正的细胞。造血干细胞(HSC)构成基因治疗的优良的靶标群，因为它们可容易而安全地获自骨髓(BM)或动员的外周血。可对分离的HSC进行遗传修饰，并作为自体移植物再输回给患者。长期益处需要移植极充足数目的基因修饰的HSC，其可使经调理的骨髓进行种群恢复，产生所有造血谱系经纠正的血细胞。自体同种异型HSC使得可对所有患者进行移植手术，并且避免了导致GvHD的免疫相容性问题。另外，一些疾病像原发性免疫缺陷需要纠正部分HSC 及其子代。预处理(conditioning)方案(所谓的“非清髓性”或“微型(mini)”预处理方案)的强度降低，这产生对患者更好的耐受性和更少的副作用。简化的预处理方案与标准同种异体移植较不相容，因为在同种异体背景下，由于与宿主衍生的免疫细胞的免疫拮抗作用，所以混合供体嵌合状态通常是不稳定。 
HSC及其子代的有效的长期基因修饰需要允许纠正性DNA稳定整合到基因组而又不影响HSC功能的技术。最有效的递送系统是病毒载体。 
例如，造血祖细胞(HSPC)中溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶(在球状细胞性脑白质营养不良(Globoid Leukodystrophy，GLD)或克拉伯病(Krabbe disease)中缺乏)的基因转移和表达引起转导细胞凋亡和功能受损，妨碍用于治疗所述病症的基于HSPC的基因治疗方法的发展(见下文)。因此，用于基因治疗的未来的表达盒应类似于生理表达模式，并且避免可导致转导细胞毒性、清除甚至恶性转化的异位和/或非生理性转基因表达。这对于其生物学必须不被遗传干预扰乱的干细胞这种保证基因治疗的长期功效的关键靶细胞类型特别重要。 
总之，目前的造血基因治疗策略需要HSC的转导以保证造血系统的长期纠正，但可明显获益于调节的转基因表达盒，所述转基因表达盒在HSC中不会异位表达转基因产物，却只在作为遗传疾病的靶标的分化子代(例如SCID中的淋巴细胞、CGD中的粒细胞和GLD中的单核细胞/巨噬细胞)中“开启(switch on)”。 
实现这种造血基因治疗策略的一种方法是使用谱系特异性转录调控元件例如基因座的内源启动子以驱动载体中治疗基因的表达。然而，启动子常常散布在长距离的DNA内，而且表征不足，因此可能在载体构建体中不易以其整体重构。此外，基因转移载体中重构的组织特异性启动子的表达水平常常不足以实现表型纠正，最可能是因为半随机载体整合位点上染色质的不完全重构和/或不利影响。因此，迫切需要调节转基因的其它策略。 
发明陈述
按照本发明的一个方面，提供用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血祖细胞(HSPC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSPC中表达但并不防止或降低其在分化细胞中表达。 
按照本发明的另一个方面，提供用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血干细胞(HSC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSC中表达但并不防止或降低其在分化细胞中表达。 
换句话说，本发明提供适用于造血基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个以有效量存在于造血祖细胞或造血干细胞中的miRNA的miRNA序列靶标，并任选包含转基因。所谓有效量，我们意指内源miRNA的浓度足以降低或防止与相应的miRNA靶序列有效连接的转基因的表达。因此本发明利用在诸如HSPC和HSC等细胞中强表达但不在例如髓系和淋巴系的分化子代中表达的miRNA，这防止或降低可能的毒性转基因在敏感干细胞群中表达，同时保持在患病子代中表达和治疗功效。 
miRNA与转基因“有效连接”。术语“有效连接”意指所述组分处于允许以其预定方式发挥其作用的关系。 
干细胞能够分化成许多细胞类型。能够分化成所有细胞类型的细胞称为全能细胞。在哺乳动物中，只有受精卵和早期胚细胞是全能细胞。干细胞是存在于大多数(如果不是全部的话)多细胞生物中的细胞。它们的特征在于通过细胞有丝分裂自我更新并分化成多种特化细胞类型的能力。哺乳动物干细胞的两大类型是：自胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞和成体组织中存在的成体干细胞。在正在发育的胚胎 中，干细胞可分化成所有的特化胚胎组织。在成体生物中，干细胞和祖细胞起机体修复系统、补充特化细胞但也保持再生器官(例如血液、皮肤或肠组织)正常更新的作用。 
造血干细胞(HSC)是产生全部血细胞类型的多能干细胞，血细胞包括髓系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴系(T细胞、B细胞、NK细胞)。 
祖细胞具有分化成特定细胞类型的能力。然而，与干细胞不同，它们早已是非常特异性的：它们被推动分化成其“目标”细胞。干细胞和祖细胞之间最重要的差别是干细胞可无限复制，而祖细胞只可分裂有限的次数。只能通过功能性体内测定法(即移植和证明其可在长时期内产生全血谱系)中，将HSPC与HSC严格区分开来。细胞表面标记例如c-Kit(CD117)、Sca-1的检测和一组谱系标记的缺乏/低表达，结合最近披露的属于SLAM受体家族的一类分子(CD150和CD48)，可富集HSC和HSPC亚群，当用标准功能测定法测定时，达到50％的纯度(Kiel等)。 
分化细胞是与干细胞或祖细胞相比变得更加特化的细胞。分化发生在多细胞生物的发育期间，同时生物从单个受精卵变成组织和细胞类型的复杂系统。分化也是成体的普遍过程：成体干细胞在组织修复期间和在正常细胞更新期间分裂并产生完全分化的子细胞。分化显著改变细胞的大小、形状、膜电位、代谢活动和对信号的响应性。这些变化大多数都是由于基因表达的高度受控修饰引起的。换句话说，分化细胞是具有特定结构并且由于涉及特定基因的活化和失活的发育过程而执行某些功能的细胞。在这一点上，分化细胞包括造血细胞谱系的分化细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。例如，可通过检测在未分化细胞上不表达或表达较少的细胞表面分子，来将造血细胞谱系的分化细胞与HSC和HSPC 区分开来。合适的谱系标记的实例为例如CD11b、Gr1、CD19、Ter119和CD3。 
按照本发明的另一个方面，提供用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个与核苷酸序列有效连接的与选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列靶标。 
miR-126靶标在较原始的HSPC中和(在人中)在红细胞谱系(erythroid lineage)中最有效地阻断表达。miR-126可能特别适于依靠在髓系和淋巴系中进行稳健转基因表达的基因治疗应用。 
miR-130a靶标在较原始的HSPC中最有效地阻断表达(类似于miR-126)，miR-130a可能最特别适于依靠在髓系、淋巴系和红细胞谱系中进行稳健转基因表达的基因治疗应用。 
在人CD34细胞中，miR-126可强于miR-130a，但是在分化子代中也可具有非特异性的活性。包含miR-130aT序列(优选2-4个拷贝)和“半个”miR-126T(优选2个拷贝)的组合靶标使操作窗(operating window)最大化，所述操作窗由在HSPC中的阻抑和在髓样细胞子代中的表达之比确定。此外，当使用组合靶标时，两种独立的miRNA确保了转基因在HSPC中减量调节，而且干扰内源miRNA调节的风险降低，因此提高了靶序列的安全性和功效。miR-223靶标在骨髓定型祖细胞(myeloid committed progenitor)中最有效地阻断表达和在较原始的HSPC中至少部分地阻断表达。与miR-126和miR-130a不同，miR-223靶标在包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样树突细胞在内的分化髓样细胞中完全并强烈阻断表达。miR-223靶标可能特别适于依赖在淋巴系或红细胞谱系中进行稳健转基因表达的基因治疗应用。miR-223靶标还可在人HSC中非常有效地阻断表达。 
优选miRNA序列靶标对应于mir-130a和mir-126。 
在一个实施方案中，基因载体包含控制载体的表达的核苷酸序列。换句话说，内源微小RNA在某些细胞类型(HSC和HSPC)中阻止病毒的表达或增殖，但允许在其它细胞类型中表达或增殖。例如， mir-126、mir-130和mir-223在造血干细胞或祖细胞中防止基因载体或溶瘤病毒的表达。 
在一个实施方案中，基因载体包含作为转基因的核苷酸序列。 
在另一个实施方案中，基因转移载体呈非病毒基因转移载体的形式。在这个实施方案中，基因转移载体可包含含有与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列的表达载体或质粒，或者呈含有与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列的表达载体或质粒的形式。 
本文描述的表达载体包含含有能够被转录的序列的核酸区。因此，该定义包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。 
可使用本发明的基因载体或基因转移载体将转基因递送至目标位点或目标细胞。可通过病毒或非病毒载体将本发明的载体递送到靶位点。 
载体是允许或有利于将实体从一种环境转移到另一种环境的工具。举例来说，用于重组DNA技术的一些载体允许将实体(例如DNA区段(例如异源DNA区段，例如异源cDNA区段))转移至靶细胞。任选一旦进入靶细胞，载体便可在细胞内起维持异源DNA的作用，或者可起DNA复制单元的作用。用于重组DNA技术的载体的实例包括质粒、染色体、人工染色体或病毒。 
非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶哺乳动物细胞的过程。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转染、密集DNA介导的转染(compacted DNA-mediated transfection)、脂质体、免疫脂质体、脂转染(lipofectin)、阳离子剂介导的、阳离子表面两亲分子(cationic facial amphiphiles，CFA)(Nature Biotechnology 1996 14；556)及其组合。 
在一个实施方案中，基因载体是病毒载体。 
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。 载体的其它实例包括离体递送系统，其包括但不限于DNA转染方法，例如电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转染、密集DNA介导的转染。 
术语“载体颗粒”是指优选能够结合并进入靶细胞的经包装的反转录病毒载体。正如已对载体所做的论述一样，可根据野生型反转录病毒，对颗粒的组分进行修饰。例如，颗粒的蛋白质外壳中的Env蛋白可经遗传修饰以改变其靶向特异性或实现一些其它所需要的功能。 
优选病毒载体优先转导某一细胞类型或某些细胞类型。 
更优选病毒载体是靶向载体，也就是说具有与天然病毒相比已被改变的组织向性，使得载体靶向特定细胞。 
在一个优选的实施方案中，基因载体可得自慢病毒。 
在一个实施方案中，基因载体包含组织特异性启动子。优选组织特异性启动子选自CD11b和c-Fes及来源于细胞色素b-245重链(CYBB，gp91 phox)基因座和TEK(Tie2)的启动子。TEK(Tie2)启动子可与miR-126靶序列结合，这种结合可供在肿瘤浸润性髓样细胞亚类中进行特异性转基因表达。 
在一个实施方案中，基因载体包含编码酶的转基因。优选酶选自溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶和gp91 phox。按照本发明，可用来递送免疫调节分子，例如干扰素-α。优选这些载体在骨髓移植后将免疫调节分子递送至肿瘤细胞。优选这些载体含有Tie2启动子加miR-126T序列。 
重要的是，Tie2启动子在造血干细胞中具有活性，而且已知免疫调节分子(例如干扰素-α)对HSC有毒性。因此，为了通过Tie2表达来特异性地递送生物活性分子至肿瘤浸润巨噬细胞而不干扰HSC功能，HSC特异性miRT的使用—如本专利申请所述—变得是必须的，而不是选项。已知Tie2启动子在HSC中比在我们的整个研究中使用的PGK启动子弱，我们预期在HSC中，126T/130aT序列完全阻止由Tie2启动子表达的转基因的毒性。 
按照本发明的另一个方面，提供一组用于产生病毒载体颗粒的DNA构建体，包括编码可包装的病毒载体基因组的DNA构建体，所述DNA构建体包含至少一个本发明的miRNA序列靶标，并任选包含转基因。所谓可包装的载体基因组，我们意指载体基因组处于其中可将其包装成病毒载体颗粒的环境下。这通常需要Gag-Pol和Env的存在。 
按照本发明的另一个方面，提供用于制备病毒载体颗粒的方法，所述方法包括将本发明的DNA构建体组导入宿主细胞，并得到病毒载体颗粒。 
在一个实施方案中，宿主细胞包含相应的miRNA。 
按照本发明的另一个方面，提供通过本发明的方法产生的病毒载体颗粒。 
按照本发明的另一个方面，提供包含本发明的基因载体或颗粒以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的药物组合物。 
按照本发明的另一个方面，提供用本发明的基因载体或颗粒感染或转导的细胞。细胞可在体内或体外情况进行转导或感染。细胞可来源于动物(优选哺乳动物，例如人或小鼠)或形成动物(优选哺乳动物，例如人或小鼠)的组成部分。因此，应了解的是，本发明可用于提供转基因动物，例如用作疾病模型。在一个实施方案中，哺乳动物是非人类哺乳动物。 
在一个实施方案中，细胞是造血干细胞或造血祖细胞。 
按照本发明的另一个方面，提供至少两个不同的与选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列靶标的组合。 
在一个实施方案中，miRNA序列靶标同时、单独或序贯使用。 
按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于在造血干细胞或造血祖细胞中防止或降低转基因的表达。 
按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗 粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于治疗选自球形细胞脑白质营养不良、慢性肉芽肿病和重度联合免疫缺陷(SCID)的疾病。 
按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于提高与基因治疗相关的造血干细胞或造血祖细胞存活的机会。 
可通过这些细胞的基因的特异性脱靶表达来增加HSC或HSPC的存活机会。具体地讲，对HSC或HSPC有毒的转基因表达的脱靶可有益于这些细胞的存活。同样，在宿主中可引起不良免疫反应的转基因表达的脱靶，可导致细胞的存活机会增加。 
按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于提高基因治疗的安全性和/或功效。 
基因治疗安全性的提高包括在某些细胞类型(例如HSC和HSPC)中防止或降低转基因的不良表达或载体的表达。特定细胞类型的转基因或载体表达的脱靶可降低可能伴随基因治疗的不良反应或副作用。基因治疗功效的提高包括在所需要的细胞类型(例如分化造血细胞)中更有效地表达转基因，因为由通过微小RNA靶序列免于转基因毒性和不良免疫反应的基因修饰的未分化细胞更有效地产生这些细胞。具体地讲，如果可避免转基因的表达直到细胞分化，则涉及HSC或HSPC移植的基因治疗可更安全和更有效。 
按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于防止造血干细胞或造血祖细胞的细胞凋亡，其中细胞凋亡是由转基因的表达引起的。 
按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于监测造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段。 
mir-126、mir-223和mir-130a的存在表示HSC或HSPC。更准确地讲，mir-126表示原始HSPC，还在人中表示红细胞谱系的细胞。Mir-130a表示较原始的HSPC。Mir-223表示骨髓定型祖细胞和较原始的HSPC。Mir-223也表示分化髓样细胞，包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和髓样树突细胞。 
在一个实施方案中，基因载体用于造血细胞治疗。造血细胞治疗包括造血干细胞移植。 
按照本发明的另一个方面，提供与选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列靶标用于基因治疗。 
按照本发明的另一个方面，提供测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中miRNA的表达水平，其中miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。例如，mir-130a和mir-126的表达表明细胞是HSPC或HSC，而miR-223的表达表明属于髓系，即粒细胞和单核细胞，包括其前体细胞和衍生细胞。 
按照本发明的另一个方面，提供测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中至少两种不同miRNA的表达水平，其中miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达但不防止或降低其在分化细胞中表达；和对不同miRNA的表达水平进行比较。此外，可使用表达两种标记基因(每一种含有不同的微小RNA靶序列)的双向载体，同时和彼此独立地测定两种微小RNA的表达。例如，不同的微小RNA可与不同的标记(例如荧光标记)连接。不同颜色可表示代表不同分化阶段的微小RNA表达的不同混合物(例如绿色标记+miR-126T，红色标记+miR-223T。如果细胞为红色或黑色：--＞HSPC；如果细胞为黄色：--＞淋巴细胞；如果细胞为绿色：分化髓系细胞)。 
按照本发明的另一个方面，提供测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定转基因在所述造血干细胞或所述造血祖细胞中的表达水平，其中转基因与miRNA序列靶标有效连接，由此相应的miRNA防止或降低转基因在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。 
此外，选自miR-126、miR-130a和miR-223的miRNA的报道载体(reporter vector)可用于在目的是从诱导的多潜能细胞(iPS)或胚胎干细胞(ES)中获得造血谱系细胞的培养系统中鉴定造血干细胞和/或其直接前体。 
在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法的miRNA包括选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA。 
本发明的一些其它关键优势
本发明教导可如何将适于基因治疗的基因载体设计成受HSC和HSPC的内源miRNA调节用于控制转基因表达从而实现载体的特异性表达概况。本发明提供这些载体的广泛应用，因为它们可有助于在HSC和HSPC中防止转基因毒性，因此有利于开发治疗各种疾病的基因治疗策略。所述载体特别适于涉及对HSC或HSPC有毒的转基因表达的基因治疗。 
本发明人提供对所选miRNA在多种造血细胞亚类(包括稀少的HSPC群)内的活性进行概况分析的新方法，因此向广泛采用但限于之前纯化的混合群落(bulk population)的常规miRNA表达概况分析方法加入了新尺度。这种方法以HSPC用慢病毒miRNA报道载体转导为基础，所述报道载体用作miRNA活性的活的遗传指示物，可容易通过流式细胞术在单一细胞水平和在多细胞群中平行定量测量。采用这种方法，本发明人鉴定出在小鼠和人HSPC(包括富集最原始干细胞的亚类)中高度有功能的两种miRNA。在分化时，一种miRNA在早期祖细胞水平快速减量调节，而另一种则在粒细胞生成和单核细胞生成期 间被进一步诱导，但是在淋巴细胞中和在巨核细胞/红细胞分化期间急速减量调节。 
此外，本发明人利用在HSPC中高表达的两种miRNA之一来克服阻碍通过基于慢病毒载体的造血干细胞基因疗法有效治疗鼠模型的球状细胞性脑白质营养不良(GLD)(一种由于溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶—GALC的活性缺陷而引起的溶酶体贮积症)的主要问题。与其它溶酶体酶不同，GALC在HSPC中的基因转移和表达引起由于作为酶表达结果的生物活性鞘脂的胞内含量失衡所致的转导细胞凋亡和功能受损。髓系和淋巴系的分化细胞不受GALC表达的影响，这就表明HSPC对酶毒性有特有的敏感性。用于报道载体的miRNA反应性序列允许调节治疗上相关的GALC转基因的表达概况、使转基因表达从其中表达关联miRNA的细胞(HSPC)中脱靶，同时允许在不受GALC表达毒性影响的分化子代中进行完全治疗性表达。用miRNA调节的GALC慢病毒载体转导的HSPC受到保护免于酶毒性，并且保持其在体外和体内两者的功能。初步结果表明这种方法在纠正小鼠模型疾病表现中具有治疗功效。 
优选使用下列miRNA靶序列以在人造血系统中实现受调节的转基因表达：需要在髓系中表达的基因治疗应用(例如慢性肉芽肿病、溶酶体贮积症(例如克拉伯病)、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良等)：126T/130aT(2+2个靶序列)—对在HSPC中的最大阻抑最优化；126T(2个靶序列)—对在髓样细胞子代中的最低背景活性最优化。 
需要在红细胞谱系中表达的基因治疗应用(例如地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病等)：130aT(4个靶序列)或223T(2个或4个靶序列)。后一靶标在较原始的BFU-E和CFU-E中可能具有某种活性(＜5x)。 
需要在淋巴系中表达的基因治疗应用(例如RAG1/RAG2缺乏症、BTK缺乏症、X-SCID、ADA-SCID)：223T(2个或4个靶序 列)，可能与126T/130aT(2+2个靶序列)或126T(2个靶序列)组合)。 
为了被对HSC和HSPC而言是细胞内源的内源miRNA识别，可用miRNA靶序列对用于基因转移和治疗的转基因表达的载体(例如病毒载体，包括慢病毒载体)进行工程改造，从而在细胞亚类中调节转基因表达。此外，可使用miRNA靶序列的组合以获得具有高特异性细胞表达模式的载体。 
除非另有说明，否则本发明的实施将应用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都属于本领域普通技术人员的能力范围内。文献中对这类技术进行了解释。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak和James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(编辑)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I，Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual，Ed Harlow(编辑)，David Lane(编辑)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855.Handbook of Drug Screening，Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编辑(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；以及Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编辑，2002，Cold  Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。这些整体原文的每一份都通过引用结合到本文中。 
附图描述
将参照附图说明的其优选实施方案，仅以举例方式对本发明作进一步说明，其中：
图1：双向miRNA调节的慢病毒报道载体的示意图。该图表示miRNA调节的双向载体(Bd.LV)的代表性结构，其含有绿色荧光蛋白(GFP)作为miRNA报道分子和人低(loe)亲和力神经生长因子受体(NGFR)的截短形式作为组成型表达的标准化分子(normalizer)。尽管Bd.LV-ctr不含任何miRNA靶序列(miRT)，但Bd.LV-223T和Bd.LV-126T通过加入含有21bp的分别与miR-223或miR-126完全互补的4个串联重复来构建。 
图2：细胞系中miRNA报道分子Bd.LV的评价。a)在HEK293T、U937和通过用含有在遍在启动子控制下的pri-mir-126的LV转导异位表达miR-126的HEK293T细胞(HEK293T.LV.miR-126)中，对miR-223和miR-126表达水平(拷贝/pg)进行定量分析。b)用指定miRNA调节的Bd.LV转导的HEK-293T、U937、HUVEC和HEK293T.LV.miR-126细胞的代表性FACS分析。对细胞的GFP“miRNA报道分子“和NGFR“标准化分子”表达进行了分析。c)在蛋白质水平上和在RNA水平上，报道基因表达的miRNA介导的倍数阻抑(fold repression)的计算公式。直方图表示miR-223和miR-126在细胞系中的活性，计算为蛋白质水平上的GFP FR值。菱形表示RNA水平上的GFP FR。 
图3：miRNA报道分子BdLV的体内评价。谱系-/低骨髓(BM)造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)用miR-223和miR-126的双向miRNA报道分子慢病毒载体(BdLV)转导，并移植入受者小鼠中。通过FACS分析稳定植入携带miRNA报道分子的细胞的小鼠外周血细胞。a)用于鉴 定来源于鼠外周血的主要白细胞群的门控策略：粒细胞(CD11b+，SSC高)、单核细胞(CD11b+，SSC低)、B细胞(CD19+)和T细胞(CD11b-CD19b-)。b)鼠外周血亚类内GFP和NGFR表达的代表性FACS分析。c)来源于用转导有Bd.LV-ctr(n＝5)、Bd.LV-223T(n＝6)或Bd.LV-126T(n＝4)的HSPC移植小鼠的外周血亚群内的GFP FR值(平均值+/-SD)。 
图4：(a)谱系-/低骨髓(BM)造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)用双向miRNA报道分子慢病毒载体(BdLV)转导，并移植入经致死照射的小鼠中。BdLV共表达通过完全互补的miRNA靶(miRT)序列的4个串联重复使之对特异性miRNA有反应的去稳定GFP(d4GFP)报道分子和截短的NGFR标记基因(ΔNGFR)。移植后8-12周使小鼠安乐死，如所示通过免疫表型分析对多个BM HSPC亚群进行前瞻性鉴定(HSC：造血干细胞；MPP：多能祖细胞；GMLP：粒细胞-单核细胞-淋巴细胞祖细胞；GMP：粒细胞-单核细胞祖细胞；eMEP：早期巨核细胞-红细胞祖细胞；EP：红细胞前体)。(b)代表性FACS图表示从(a)中所述移植小鼠的BM中新鲜分离的HSPC亚群中，对照-BdLV(无miRT或133aT、肌肉特异性miRT)和miR-126(126T)、miR-130a(130aT)、miR-196b(196bT)、miR-10a(10aT)、miR-223(223T)、miR-19a(19aT)、miR-93(93T)、miR-17-5p(17T)和let-7a(Let7aT)的报道分子BdLV的表达。每行表示上述分化阶段的HSPC中，指定BdLV的报道分子表达的代表性模式。每行右边的柱状图表示根据报道分子平均荧光强度计算的平均倍数抑制(FR)±sem(对照：n＝9；126T：n＝10；130aT：n＝4；196bT：n＝4；10aT：除其中n＝1因此统计数为n/a的HSC和MPP1以外，n＝4；223T：n＝6，其中5种具有eGFP报道分子；19aT：n＝3；93T：n＝2；17T：n＝3；let7aT：n＝1，3只小鼠的合并物)。使用各报道分子BdLV组的EP作为参比，通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验校正进行HSPC亚群间miRNA活性的统计比较(***：p＜0.001；**：0.01＞p＞0.001；*：p＜0.05)。 
图5：(a)从移植小鼠分离的多个细胞群中，通过指定报道分子 BdLV的平均倍数阻抑(FR)测定的8种miRNA的造血活性。谱系-BM亚类：见图4；谱系+BM亚类：Pro B：CD19+CD43+；CD43-B：CD19+CD43-；T Ly：CD3+；单核细胞：CD11b+CD48+；粒细胞：CD11b+CD48lo；外周血：粒细胞：CD11b+侧向角散射(side scatter)hi；单核细胞：CD11b+侧向角散射lo；B Ly：CD19+；T Ly：CD3。(b)将含有4拷贝miR-130aT和2拷贝miR-126T(130a/126T；n＝4只小鼠)的组合靶序列与4拷贝miR-126T(126T；n＝10只小鼠)或4拷贝miR-130aT(130aT；n＝4只小鼠)进行了比较。柱状图表示谱系标记阴性骨髓群(图4图例)中和外周血白细胞中通过这些miRT序列得到的倍数阻抑±sem。注意，在HSC中130a/126T达到比仅126T更好的阻抑，而PB白细胞的背景阻抑减少。 
图6：通过miRNA靶序列调节自杀基因的表达。(a)将与miR-142、miR-223、miR-126或miR-130a完全互补的miRT序列加入去稳定胸苷激酶(dTK)转录物中。对于(b)使用单向慢病毒自杀载体(各载体图的右半部)，而(c)中使用GFP标记与miRNA调节的TK偶联或NGFR标记与对照-TK偶联的双向自杀载体。(b)谱系-/低HSPC用指定慢病毒载体转导，并接种到+/-更昔洛韦(GCV)的半固体培养基中(LV-GFP：n＝2；CTRL-TK：n＝8；TK-142T：n＝4；TK-223T：n＝6；TK-126T：n＝4；TK-130aT：n＝2)。10天后，统计骨髓(CFU-GM、CFU-G、CFU-GM)和类红细胞(BFU-E、CFU-E)集落数。箱须图表示含有GCV的培养物中的集落数除以相应无GCV的对照培养物的集落计数(第10-90百分位数)。′无GCV′数据点表示接种差异(plating variability)(各无GCV处理的培养物的集落计数除以所有无GCV处理的培养物的平均集落计数；n＝26)。对GCV处理的LV-GFP组进行统计比较；ns，无显著不同；**，0.001＜p＜0.01：***，p＜0.001。(c)来源于CD45.1+小鼠的谱系-/低HSPC用TK对照载体(经NGFR标记)或miRNA调节的TK载体(经GFP标记；Exp#1：TK.126T；Exp#2：TK.142T)转导。以1∶1比率将LV.NGFR/对照TK转导细胞和LV.GFP/TK-miRT转导细胞混 合，并移植入CD45.2+同类小鼠中，移植后第3天起，小鼠用GCV治疗(Exp#1：n＝6只小鼠；Exp#2：n＝5只小鼠)7-14天，或不治疗(Exp#1：n＝4；Exp#2：n＝3)。代表性FACS图表示CD45.1+供体细胞内的GFP/NGFR嵌合状态。图表表示对于在7-8个月时间内各种血细胞类型，GCV治疗(红色)和未治疗(黑色)小鼠血液中转导的供体衍生细胞内表达GFP的细胞的部分。注意，GCV组中显著较多的细胞为GFP+(***：p＜0.001，两因素方差分析)，这就表明受到保护免于自杀和用GFP/TK.126T或GFP/TK.142T转导的HSC的选择性优势。因此，加到转基因的miR-126T序列克服了由高毒性转基因引起的HSPC毒性(甚至自遍在启动子表达时)，具有改善基于HSPC的基因治疗的安全性和功效的重大潜力。此外，这些结果正式证实了miR-126在长期植入性造血干细胞中有活性，正如功能性种群恢复测定法(functional repopulation assay)所证实的一样。 
图7：(a)为了呈现利用miR-126调节用于基因治疗的安全性，通过将阐述的LV显微注射入受精卵的卵周隙，来产生含有miR-126报道分子(Tg.126T)的转基因小鼠品系。年青的成熟转基因小鼠骨髓的FACS分析表明，GFP表达在Kit+Sca+谱系标记-(KSL)细胞(直方图中的蓝色图)中最低，而GFP表达在Kit+Sca-Lin-祖细胞(直方图中的黑色和红色图)开启。测定Tg.126T小鼠和对照GFP转基因小鼠的GFP MFI以计算指定HSPC亚群中miR-126报道分子的FR(平均值±sem，n＝10只Tg.126T小鼠；***：p＜0.001；**：0.01＞p＞0.001，与EP相比)。(b)尽管携带miR-126的两个敲除等位基因的小鼠由于血管生成缺陷所致，表现出明显的胚胎致死性，但是培育我们的Tg.126T集落导致在反映亲代之一的后代中出现正常的每窝产仔数和预期的载体拷贝数(VCN)分布，这就表明了miR-126T序列自PGK启动子的适度表达不干扰发育期间天然miR-126靶标的调节。(c)来源于CD45.2+Tg126T小鼠和CD45.1+野生型(WT)小鼠的BM细胞通过CD117的阳性选择富集HSPC，并竞争性移植(1∶1比率)到经致死照射的CD45.2+受者(n＝4) 中。对移植小鼠定期采血，并测定各种外周血细胞谱系中的CD45.1/CD45.2嵌合状态(粒细胞：CD11b+侧向角散射hi；单核细胞：CD11b+侧向角散射低；B细胞：CD19+；T细胞：CD3+)。这些数据表明对于安全利用miR-126调节有一个宽裕的治疗窗。 
图8：(A)CD34+HSPC从人脐血(CB)中纯化，并用对照-BdLV(对照)或miR-126(126T)、miR-130a(130aT)或miR-223(223T)的miRNA报道分子BdLV转导(n＝3个生物学重复/组)。在支持HSPC短期维持的条件下将细胞保持在液体培养物中，在CD34+CD38-HSPC和CD34+CD38+祖细胞(左起头两栏)中转导后2天，测定BdLV标记表达。然后细胞或在液体培养中分化6天(CD34-CD38+细胞；中间栏)或在半固体培养基中分化16天(CD13+髓样细胞，CD235+类红细胞)。显示代表性FACS图。底部的柱状图表示在相应亚群中定量测定的miR-126、miR-130a和miR-223活性(n＝3；平均倍数阻抑+/-sem；**，0.001＜p＜0.01：***，p＜0.001)。(B)脐血CD34+细胞用对照双向自杀载体或含有miR-223(TK-223T)或miR-126(TK-126T，另见图2)的miRNA靶序列的miRNA调节的双向自杀载体转导，并在前药GCV的存在或不存在下，在CFC测定法中以一式四份接种。接种后14天，统计GFP+类红细胞(CFU-E、BFU-E)或骨髓(CFU-G、CFU-M、CFU-GM)集落数，并归一化至′无GCV′培养的统计数。箱须图表示第10-90百分位数。GCV完全阻止CTR-TK转导的集落的生长。(C)将miR-126T和miR-130aT序列(分别为4+4和2+2个串联重复)的组合以及仅miR-126T的2个串联重复与分别使用miR-126T或miR-130aT的4个串联重复的标准miRT设计进行比较。人脐血细胞用相应的报道分子BdLV转导，转导后2天，在原始干细胞/祖细胞区室(CD34+CD38-)和祖细胞区室(CD34+CD38+)中，以及转导后10-14天在髓样细胞子代(CD13+)和红细胞子代(CD235+)中，测定报道分子的倍数阻抑。126T(4个靶标)、126T/130aT(4+4个靶标)和126T/130aT(2+2个靶标)在干细胞/祖细胞区室中同样充分阻抑。然而，126T/130aT (4+4个靶标)在髓样细胞子代中具有较高的背景抑制活性。(D)G-CSF诱导体外分化时，在原始区室中(如在C中)和后期骨髓分化阶段(中幼粒细胞：CD11b+/CD16-；晚幼粒细胞：CD11b+/CD16+/SSC低；粒细胞：CD11b+/CD16+/SSC高)中126T(4个靶标)、126T/130aT(2+2靶标)和126T(2靶标)的抑制活性。培养物的May-Grünwald/Giemsa染色的细胞离心涂片(cytospin)样品上验证分化阶段。通过将CD34+/CD38-干细胞/多能细胞区室中相应miRT的倍数阻抑除以晚幼粒细胞中的倍数阻抑，来计算调节指数(右图)。通过126T(2个靶标)获得转基因表达在髓样细胞子代中的最佳“释放”，而在干细胞/祖细胞区室的阻抑(类似于130aT(4个靶标))与126T(4个靶标)和126T/130aT(2+2个靶标)相比略少。至于后2个靶序列，126T/130aT(2+2个靶标)优于126T(4个靶标)，因为它给出最大调节指数。此外，通过2个独立的miRNA确保了转基因减量调节，进一步降低了干扰内源miRNA调节的风险，因此提高了miRT的安全性和功效。 
图9：溶酶体酶在HSPC中的过量表达。在LV转导后，将在mHSPC(A)和hHSPC(B)中的酶表达水平归一化至野生型。与ARSA和IDUA相比，GALC表达显著较低。 
图10：在LV介导的GALC表达时鼠HSPC的功能受损。(A)对用GALC和对照LV转导的mHSPC的CFC测定。统计集落数(#)/板(Y左轴，柱)，并测定整合的LV拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与GFP.LV(n＝10)和ARSA.LV(n＝8)转导细胞相比，GALC.LV转导的-/-mHSPC(n＝12次独立实验)产生显著较低的集落数。当mHSPC用mir142T GALC.LV转导时(n＝6)，未观察到这种损害。*p＜0.001，集落数/板和VCN两者的单因素方差分析。给出了平均值±SD。用-/-和+/+mHSPC得到类似结果。(B)对转导的mHSPC测定GALC活性。在GALC.LV转导后，GALC-/-(从此为-/-)(n＝5)和GALC+/+(从此为+/+)(n＝5)mHSPC显示GALC活性提高至野生型水平(用GFP.LV转导的+/+mHSPC，n＝5)的2倍。用mir142调节的GALC.LV转导的 mHSPC(mir142T)(n＝3)中未检测到活性提高。 
图11：在LV介导的GALC表达时人HSPC的功能受损。(A)对用GALC和对照LV转导的hHSPC的CFC测定。统计集落数(#)/板(Y左轴，柱)，测定整合的LV拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与对照细胞(n＝5)相比，GALC.LV转导的n.d.(n＝4)和GLD hHSPC(n＝4)在集落形成中出现显著损害，这在下面的mir142T GALC.LV转导(n＝4)中未观察到。当与GFP/ARSA/GALCmir142T.LV对照相比时，由GALC.LV转导的hHSPC获得的集落具有显著较低的载体含量。*集落数/板和VCN两者的单因素方差分析的p＜0.001。给出了平均值±SD。(B)对转导的hHSPC测定的GALC活性。在GLD hHSPC(n＝3)中，GALC.LV转导允许在n.d.水平上重建GALC活性，而n.d.hHSPC的转导(CB的n＝4，BM的n＝3)导致酶超过GFP.LV转导水平(n＝3)的过量表达。在用mir142调节的GALC.LV转导的hHSPC(mir142T)(n＝3)中未检测到活性提高。 
图12：在HSCT时twi小鼠的存活。(A)GFP.LV和GALC.LV的示意图。(B)接受HSCT的twi小鼠的平均存活期。与未治疗对照(UT)(n＝10)相比，移植有全BM(TBM)(n＝12)或GFP.LV转导+1+mHSPC和未转导Scal-祖细胞(GFP.LV+1+Lin-&+1+Scal-，n＝7)或GFP.LV转导+1+mHSPC和GFP.LV转导Scal-祖细胞(GFP.LV+1+Lin-&GFP.LV+1+Scal-，n＝5)的twi小鼠，获得较长的存活期。与TBM或+1+Lin-和Scal-移植小鼠相比，接受GALC.LV转导-I-mHSPC和+1+Scal-祖细胞的小鼠(n＝7)的生命期限显著较长。相反，用GALC.LV转导的-I-Lin-&-I-Scal-(n＝13)移植不会导致生命期限延长。对照组：移植有GFP.LV转导+1+HSPC(+1+Lin-)的小鼠(n＝10)；移植有GFP.LV转导+1+Scal-祖细胞的小鼠(n＝8)。*单因素方差分析检验的p＜0.01。(C)表示移植有GFP.LV转导的+1+mHSPC和Scal-祖细胞的twi小鼠的外周血中GFP+植入细胞百分比的代表图。 
图13：FVB/twi小鼠中mHSPC的体内功能受损。按规定接受 mHSPC移植的小鼠的平均存活期。与未治疗对照(UT)相比，移植有GFP.LV转导的+/+mHSPC的-/-小鼠(n＝11)获得较长的存活期；相反，在致死照射后，移植有GALC.LV转导的-/-mHSPC的-/-(n＝9)和+/-(°)(n＝5)的小鼠无法存活。表2：移植后20天和120天(n＝3/时间点)移植有所列出的mHSPC(用GALC.LV或GFP.LV转导)的-/-或+/-小鼠BM中检测的平均VCN SD。(°)+/-宿主.(§)使用+/+mHSPC得到类似结果。 
图14：表达GALC的鼠和人HSPC的细胞凋亡。(A-B)在基因转移后2天和5天，对-/-mHSPC(左)和hHSPC(右)(来源于n.d.CB和GLD BM)进行的TUNEL测定。报导了相对于有核细胞总数的％TUNEL+核。8个视野和100个细胞为统计条件。使用+/+mHSPC得到类似结果。(A)在转导后2天和5天，大部分GALC.LV转导的mHSPC和hHSPC均为TUNEL阳性。(B)在用指定LV转导后2天和(mHSPC)天，对mHSPC和hHSPC的核进行TUNEL测定(红色)和ToPro(TPIII，蓝色)染色：代表性照片(通过三激光共焦显微镜-Radiance 2100，BioRad获得照片；从单一光学切片序贯获得荧光信号，并通过Adobe Photoshop CS软件分析；放大倍数100x)。(C)对mHSPC(上图)(来自-/-供体小鼠)和hHSPC(下图)(来自n.d.CB)进行的膜联蛋白V染色的细胞荧光测定分析(Cytofluorimetric analysis)。与GFP转导对照相比，在GALC.LV转导的mHSPC和hHSPC中凋亡细胞的部分较高。CMT＝喜树碱(Camptotecin)治疗的阳性对照。用FACS Calibur2，Beckton Dickinson进行数据采集。对至少10,000个事件进行了评分，数据用FlowJo 8.5.3软件进行处理。给出了得自-/-mHSPC和n.d.CB(且GLD BM用于TUNEL)的数据，但是与-/-细胞相比，在+/+mHSPC的GALC转导后得到类似研究结果，以及在n.d.BM(TUNEL和膜联蛋白V)和在GLD BM(膜联蛋白V)hHSPC中与CB细胞相比，得到类似的研究结果。 
图15：IGF1处理防止表达GALC的HSPC凋亡。(A)对用或未用 IGF 1处理的GALC.LV和ARSA.LV转导的mHSPC进行的CFC测定。对集落数(#)/板(Y左轴，柱)进行统计，测定了整合的慢病毒载体拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与GALC.LV转导的未处理细胞(n＝4次独立实验)相比，IGF 1处理诱导较高集落数的生长。在抗凋亡处理时，GALC.LV转导细胞的VCN接近ARSA.LV转导对照细胞的VCN(对于CFC数和VCN单因素方差分析：*＝p＜0.001，关于处理的GALC转导mHSPC与未处理GALC.LV转导细胞的比较；p＞0.05，关于处理的GALC.LV转导mHSPC与ARSA.LV转导细胞的比较)。(B)自处理的mHSPC生长的集落还显示出大小增大(右照片，放大倍数5x)。(C)对用或未用IGF1处理的GALC.LV和ARSA.LV转导的mHSPC的TUNEL测定。8个视野和100个细胞为统计条件。大多数处理细胞为TUNEL阴性(单因素方差分析：p＜0.001，与未处理GALC.LV转导细胞相比；p＞0.05，与ARSA.LV转导细胞相比)。(D)对来自-/-或+/+小鼠的转导mHSPC所测得的GALC活性。当与转导的未处理对照(n＝6)相比时，IGF1处理不显著影响GALC表达水平(n＝3)。给出了平均值SD。 
图16：转导细胞中组织蛋白酶D活化的分析。如所表明的，在基因转移后以不同间隔，对GFP.LV或GALC.LV转导的mHSPC和U937细胞的组织蛋白酶D的蛋白质印迹分析。活化形式相当于30kDa膜结合的同种型，用箭头表示。与GFP.LV转导细胞相比，在基因转移后的GALC.LV转导细胞中，未观察到组织蛋白酶D的活性形式明显蓄积。在培养7天(GFP 7d)后，前体(48kDa，箭头)在GFP转导细胞中蓄积，而其蓄积在GALC(GALC 5d)存在下较不明显，7天后前体和成熟形式两者最终消失。抗肌动蛋白用作蛋白质加样的对照。 
图17：不同细胞类型的基础GALC活性。归一化至野生型mHSPC水平的基础GALC活性。与mHSPC相比，初生野生型少突胶质细胞(n＝4)和小胶质细胞(n＝4)两者均具有较高的GALC活性。 
图18：在髓样细胞中对GALC从头表达的敏感性。转导后5天， TUNEL测定(相对于总有核细胞的％TUNEL+细胞，位于Y左轴，柱)、GALC活性测定(位于Y右轴，点)、可能时对(A)人单核细胞，(B)单核细胞人细胞系U，(C)鼠巨噬细胞和D)鼠小胶质细胞进行的专用染色的结果。在全部测定条件下，TUNEL染色表明发生较少细胞凋亡/不发生细胞凋亡(每种条件下统计≥6个视野和≥250个细胞)，尽管高效转导(在(C)中通过对巨噬细胞的抗HA染色评价)，并且在所有其它样品(ARSA.LV-或GFP.LV-转导细胞)中达到高于基础水平的持续GALC表达。给出了平均值±SD。(C和D)对GALC/GALC-HA.LV或GFP.LV转导巨噬细胞(C)和小胶质细胞(D)进行TUNEL测定的代表性照片。通过三激光共焦显微镜(Radiance 2100，BioRad)获得照片。序贯获取单一光学切片的荧光信号，并通过Adobe Photoshop CS软件分析。放大倍数：C中80x，D中100x。 
图19：淋巴细胞中对GALC从头表达的敏感性。转导后5天，对T和B淋巴细胞进行的TUNEL测定(相对于总有核细胞的％TUNEL+细胞，位于Y左轴，柱)、GALC活性测定(位于Y右轴，点)的结果。TUNEL染色表明发生较少细胞凋亡/不发生细胞凋亡(每种条件统计≥6个视野和≥250个细胞)，尽管高效转导(见高于基础水平的持续GALC表达)。给出了平均值±SD。 
图20：少突胶质细胞中对GALC从头表达的敏感性。(A)转导后5天进行的TUNEL测定(相对于总有核细胞的％TUNEL+细胞，位于Y左轴，柱)、GALC活性测定(位于Y右轴，点)。TUNEL染色表明发生较少细胞凋亡/不发生细胞凋亡(每种条件统计≥6个视野和≥250个细胞)，尽管高效转导(见高于基础水平的持续GALC表达)。给出了平均值±SD。(B)GALC.LV或GFP.LV转导少突胶质细胞的TUNEL测定的代表性照片。通过对非转导细胞(UT)的NG2和Gal-Cer染色来证实少突胶质细胞制备物的纯度，同时针对GALC.LV-转导细胞用F4/80对小胶质细胞染色；使用ToPro(TPIII)对核染色。通过三激光共焦显微镜(Radiance 2100，BioRad)获得照片。序贯获取单一光学切片 的荧光信号，并通过Adobe Photoshop CS软件分析。放大倍数：40x。 
图21：通过miRNA 126对GALC表达的调节。(A)GALC.miRNA126Tag.LV的示意图。(B-C)对用GALC.miRNA126Tag.LV(GALC.126miT)或用GALC.LV或GFP.miRNA126Tag.LV转导的-I-mHSPC进行的GALC活性测定和CFC测定。(B)根据+1+水平(第一栏)使活性归一化。用GALC.miRNA126Tag.LV转导的细胞以超生理水平过量表达GALC。(C)统计集落数(#)/板(Y左轴，柱)，并测定整合的慢病毒载体拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与GALC.LV转导细胞相比，通过miRNA126阻抑GALC表达允许较高集落数的生长(n＝4次独立实验)。*p＜0.01，单因素方差分析检验。 
图22：GALC表达的miRNA126调节阻止mHSPC凋亡。(A)对GALC.miRNA126Tag.LV或GALC.LV和GFP.miRNA126Tag.LV-转导的mHSPC进行的TUNEL测定。每种条件下统计≥8个视野和≥100个细胞。大多数GALC.miRNA126Tag.LV转导细胞呈TUNIEL阴性。(B)转导后5天，对GALC.miRNA126Tag.LV或GALC.LV转导的mHSPC-/-的核进行的TUNEL测定(红色)和ToPro(TPIII，蓝色)染色：代表性照片(通过三激光共焦显微镜-Radiance 2100，BioRad获得照片；序贯获取单一光学切片的荧光信号，并通过Adobe Photoshop CS软件分析；放大倍数40x)。 
图23：HSPC中从头GALC表达的毒性和通过miR-126调节拯救。 
使用指定LV(A)转导获自Galc-/-(-/-)和野生型(+/+)小鼠的鼠HSPC和人HSPC，以及分别得自正常供体的脐血(CB)和骨髓(BM)。测定转导鼠(上图)和人(下图)HSPC的体外培养子代中的GALC活性(B)和载体拷贝数(VCN)(C)(-/-和+/+HSPC的汇总数据见上图C)。(D)报导了在用指定LV转导结束时对鼠-/-(上图)和人(下图)HSPC进行的集落形成试验(clonogenic assay，CFC)得到的集落数(#)。(E)用指定LV转导后2天，对鼠-/-HSPC(上图)和来自正常供体的CB和BM的CD34+ 细胞(下图)进行TUNEL测定。对转导细胞中细胞凋亡的频率进行评价(％TUNEL+细胞)。每个点表示独立的样品(B-E)。在E中，每个样品统计≥8个视野和≥100个细胞。*：p＜0.05 **：p＜0.01；***：p＜0.001。(F)给出了对GFP LV转导HSPC和GALC LV转导HSPC的代表性TUNEL染色。放大倍数100X。 
图24：HSC基因治疗后GLD小鼠的生存期延长。 
将Galc-/-或+/+鼠HSPC用指定载体转导，并按照(A)的实验方案，静脉内移植到Trs小鼠中。给出转导细胞的平均存活期±SD和平均植入(n＝4-26/组)，测定为在120天或死亡时在移植小鼠的BM中检测的％GFP+细胞或VCN(±SD)。(§)使用+/+mHSPC得到类似结果。第一行表示未治疗GLD小鼠的存活期(*＝未照射；n.a.＝不适用)。(B)将人原始单核细胞、B和T淋巴细胞和鼠小胶质细胞用指定载体转导。测定转导后≥5天培养细胞的GALC活性(用与未转导细胞-UT的倍数表示)(中图)，并且在转导后2天进行TUNEL测定(用％TUNEL+细胞表示)(右图)。报道了得自GALC转导鼠和人HSPC的数据(来源于图5)和GFP转导小胶质细胞中的％TUNEL+细胞用于比较。每个点表示单独的样品，其中对≥6个视野和≥250个细胞进行统计。(C)如所示用GALC LV或GFP LV转导的小胶质细胞细胞的TUNEL染色以及针对小胶质细胞标记F4/80(GALC转导细胞)的染色或GFP的代表性照片。核用ToproIII(TPIII)标记。放大倍数100X。(D)用经GALC-126T LV转导的Galc-/-HSPC(n＝26)或经GFP LV转导的Galc+/+HSPC(n＝10)移植的Trs小鼠和未治疗患病对照(UT)(n＝15)的Kaplan-Meier生存曲线。在成对比较的时序检验(log rank test)中，GALC-126T对比GFP：p＝0.002；GALC-126对比UT：p＜0.0001。(E)根据在死亡时间对全BM细胞测定的VCN，将GALC-126T移植小鼠分为2组。给出了在BM细胞中携带小于(平均值±SD＝67±13天)或大于(平均值±SD＝117±43天)5个LV拷贝的动物的存活期，在整群治疗小鼠的BM中测定的平均VCN为5。(F-I)对GALC-126T移植小鼠和对照小鼠脑切片的GALC 活性(浅蓝色)进行了定性评价。给出了与野生型和未治疗Trs小鼠相比较，GALC-126T移植小鼠海马(F，G)和脑桥(H，I)的代表性切片。将GALC测定与小胶质细胞/巨噬细胞Iba1标记(F，G)和与造血标记CD45(H，I)联合。在未治疗和GALC-126T移植Trs小鼠中存在活化造血细胞的明显浸润，后者表示在转导HSPC造血子代(G和I中的箭头表示GALC[蓝色]与棕色的Iba1[G]和CD45[I]共染色)内和在Iba1-，CD45-非造血细胞两者的GALC活性。(F，H)的放大倍数为20x，(G，I)的为40x。 
微小RNA(miRNA)
遗传信息自DNA流向mRNA再流向蛋白质一直以来都是生物学的中心法则。换句话说，一直认为基因编码蛋白质，而蛋白质实现所有细胞功能，包括基因表达程序的调节。然而，在高等真核生物中仅有少数RNA转录物(2-3％)编码蛋白质，这对蛋白质是细胞功能的唯一效应物的中心法则提出了异议(Mercer等，2009)。实际上，目前有不断出现证据表明一类非编码的小RNA(称为“微小RNA”)在基因表达的调节中发挥重要作用。微小RNA(miRNA)是(Biffi等，2004；Sadelain M.，2006；Sadelain等，2005；Gaziev等，2005；Yesilipek MA.，2006；Abonour等，2000)的核苷酸长的非编码RNA，它通过引发称为RNA干扰(RNAi，见下文)的过程而在转录后水平负调节基因表达(Bartel DP.，2004)。最早在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)发现了lin-4和let-7形式的微小RNA，研究表明它们调节幼虫发育的时机(Lee等，1993；Reinhart等，2000)。这个发现导致了对高等真核生物中控制基因表达的类似非编码RNA的寻找。所有生物均表达miRNA(其中许多是种间系统发育上保守的)的发现，被认为是生物学领域的革命。根据参比微小RNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)，在编写本发明时，已在人中鉴定出695种不同miRNA。微小RNA参与几乎所有生物学过程，包括发育、分化、增殖和细胞凋亡(Xiao和Rajewsky，2009)。 它们还在诸如癌症、心力衰竭和代谢紊乱等疾病中起重要作用(Xiao等，2009；Divaka等，2008；Krutzfeldt等，2006)。 
微小RNA基因分散在除Y染色体以外的所有人染色体中。它们位于基因组的非编码区或蛋白质编码基因的内含子内。大约50％的miRNA以转录为多顺反子初级转录物的聚簇出现(Lagos-Quintana等，2003)。与蛋白质编码基因类似，miRNA通常从聚合酶-II启动子转录，产生所谓的初级miRNA转录物(pri-miRNA)。这种pri-miRNA然后通过一系列的内核分离(endonucleolytic cleavage)步骤加工，该步骤由属于RNA酶III型家族的两种酶Drosha和切酶(Dicer)进行。自pri-miRNA，长约60个核苷酸的茎环(称为mirna前体(pre-mirna))，被由Drosha和DiGeorge综合征临界区基因(DGCR8)组成的特异性核复合体切离，所述核复合体在原始茎环碱基附近剪切两条链，留下5’磷酸和2bp长的3’突出端。然后，通过RAN-GTP和核输出蛋白将pre-mirna从核主动运输到胞质(Yi等，2003；Lund等，2004)。然后，切酶在不受Drosha切割限定的茎环末端实施双链切割，产生由成熟miRNA和双链体的相反链组成的19-24bp双链体，称为miRNA*(Bartel DP.，2004)。与热动力学不对称规则一致，仅双链体的一条链选择性加载到RNA诱导沉默复合体(RISC)上，并作为成熟微小RNA蓄积。该链通常是其5’端与其互补链较不紧密配对的链，正如通过引入siRNA双链体各链5’端的单一核苷酸错配所证实的一样(Tomari等，2005)。然而，有一些支持双链体两条链以相似程度蓄积的miRNA(Schwarz等，2003)。 
微小RNA引发RNAi，与广泛用于实验基因敲减的小干扰RNA(siRNA)非常相像。miRNA和siRNA间的主要差异是其生物发生。一旦加载到RISC上，小RNA分子的指导链与优先存在于蛋白质编码基因3′非翻译区(3′UTR)的mRNA靶序列相互作用。研究表明，从miRNA的5′端起计第2-8个核苷酸(所谓的种子序列)是引发RNAi所必需的(Brennecke等，2005)。如果整个指导链序列与mRNA靶完全互补， 对于siRNA和植物miRNA通常正是这种情况，则mRNA通过小RNA双链体的Argonaute(Ago)蛋白(也称为“切片机(slicer)”)参与到RNA诱导沉默复合体(RISC)中而被内核分离。DGRC(DiGeorge综合征临界区基因8)和TRBP(TAR(HIV)RNA结合蛋白2)是分别通过Drosha和切酶RNA酶III酶促进成熟miRNA生物发生的双链RNA结合蛋白。miRNA双链体的指导链掺入到通过不完全碱基配对识别特异性靶标和诱导转录后基因沉默的效应物复合体RISC中。对这种调节方式提出了若干机制：miRNA可诱导翻译起始的阻抑、通过脱腺苷化标志靶标mRNA用于降解或将靶标隔离在胞质P体(P-body)中。 
另一方面，如果仅种子序列与靶标mRNA完全互补但保留具有不完全配对的碱基，则RNAi通过导致翻译阻抑的多种机制起作用(Bartel DP.，2004；Pillai RS.，2005；Bartel DP.，2009)。真核mRNA降解主要通过如下过程产生：缩短mRNA 3’端的聚A尾，5’端脱帽(de-capping)，接着5’-3’外切核酸酶消化，且miRNA在富集mRNA衰变途径的组分的分散胞质区域(所谓的P体)中蓄积(Lui等，2005)。 
可用于本发明的miRNA是在造血干细胞和/或祖细胞中表达但不在分化细胞中广泛表达的miRNA。优选的实例包括mir-130a、mir-126和mir-223。其它合适的微小RNA包括在胚胎干细胞和所谓的iPS细胞中表达的微小RNA。例如miR-302a、miR-373和miR-292在多潜能细胞(ES，iPS)中特异性表达，但不在成体类型干细胞或分化细胞中表达。let-7家族微小RNA在除多潜能细胞(ES，iPS)以外的所有细胞中表达。miR-124a在神经元中特异性表达。 
基因载体
MiRNA可与合适的基因载体，即适于递送目标基因(转基因)的载体(例如病毒载体)一起使用。适于基因治疗的病毒载体是本领域众所周知的。可用于本发明的病毒载体的实例参见WO2007/000668。 
已对来源于若干不同科的病毒进行修饰以产生用于基因递送的 病毒载体。可用于本发明的病毒包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疹病毒、小RNA病毒和甲病毒。本发明优选使用反转录病毒，包括慢病毒。 
本发明可用于控制载体中所包括的转基因的表达。本发明还可用于控制载体的表达。例如，可被本发明的mir-RNA控制的载体为溶瘤病毒。 
造血干细胞移植
造血干细胞移植(HSCT)是来源于骨髓(在这种情况下称为骨髓移植)或血液的血液干细胞的移植。干细胞移植是血液学和肿瘤学领域的医学手术，最常为患有血液、骨髓疾病或某些癌症类型的人实施。 
由于干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF的可得性，大多数造血干细胞移植手术目前使用自外周血而不是自骨髓采集的干细胞进行。采集外周血干细胞提供较大的移植物，不需要给供体进行全身麻醉来采集移植物，导致较短的植入时间，并可得到较低的长期复发率。 
造血干细胞移植仍然是一种具有许多可能的并发症的危险手术；其在传统上为患有危及生命的疾病的患者而保留。虽然不时在实验上用于非恶性和非血液适应症，例如严重致残的自身免疫病和心血管病，但致命并发症的风险似乎太高以至于得不到更广泛的认可。 
许多HSCT的接受者是不能受益于用化学治疗的长期治疗或已对化学治疗有抗性的多发性骨髓瘤或白血病患者。HSCT的候选人包括其中患者患有先天缺陷(例如重度联合免疫缺陷或伴有缺陷型干细胞的先天性中性粒细胞减少症)的儿科病例，以及患有再生障碍性贫血的儿童或成人(他们在出生后丧失干细胞)。用干细胞移植治疗的其它病况包括镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤因肉瘤(Ewing′s Sarcoma)、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和霍 奇金病(Hodgkin′s disease)。最近已开发出需要较少剂量的预备性化疗和放射治疗的非清髓性即所谓的“微移植”手术。这允许HSCT在老年人和另外被认为太虚弱而承受不了常规治疗方案的其它患者中进行。本发明的目的在于通过提高其安全性和/或功效而拓宽这类治疗的治疗应用。 
疾病
本发明特别可用于基因治疗。具体地讲是涉及可能有毒的转基因的表达的治疗。可根据本发明治疗的疾病包括溶酶体贮积症(LSD)，例如球形细胞脑白质营养不良(GLD)。通过本发明可治疗的疾病的另一个实例是慢性肉芽肿病(CGD)。 
球形细胞脑白质营养不良(GLD)或克拉伯病是由GALC基因的突变引起的，其引起称为半乳糖神经酰胺酶的酶缺乏。未代谢的脂质的积累影响神经的保护性髓鞘(隔离许多神经的覆盖物)的生长，并引起运动技能严重退化。作为一组称为脑白质营养不良的病症的部分，克拉伯病由髓鞘的不完全生长和发育引起。GLD的基因治疗包括将GALC基因引入患者中。例如，可将GALC导入HSPC或HSC中，然后将之移植入患者中。本发明人发现在LV介导的GALC基因转移和表达后，鼠和人HSPC的毒性及体内、外功能受损。这种毒性可通过使用本发明的基因载体来克服。 
通过本发明的载体系统递送的一种或多种治疗基因可单独使用或与其它治疗或治疗的组成部分联用。 
例如，本发明的载体可用来递送一种或多种用于治疗WO-A-98/05635中所列病症的转基因。为了容易查阅，下面提供该疾病列表的部分：癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病症、发热、心血管作用(cardiovascular effects)、出血、凝血和急性期反应、恶病质、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿 瘤生长、侵袭和扩散、血管生成、转移瘤、恶性肿瘤、腹水和恶性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化、神经变性、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、克罗恩病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎；牙周炎、龈炎；银屑病、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解；角膜溃疡、视网膜病和手术伤口愈合；鼻炎、变应性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化或内皮硬化(endosclerosis)。 
另外，或在备选方法中，本发明的载体可用来递送一种或多种用于治疗WO-A-98/07859中所列病症的转基因。为了容易查阅，下面提供该列表的部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治疗免疫缺陷，包括被人免疫缺陷病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫病，并防止移植排斥或诱导肿瘤免疫力)；调节造血作用，例如治疗骨髓病或淋巴病；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长，例如用于伤口愈合、治疗烧伤、溃疡和牙周病和神经变性；抑制或激活促卵泡激素(调节生育力)；趋化/趋化因子活性(例如用于将特定细胞类型动员到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如败血症性休克或克罗恩病)；作为抗微生物药；例如代谢或行为(behaviour)的调节剂；镇痛药；治疗特定营养缺乏症；用于治疗例如银屑病、用于人用或兽用药物。 
另外，或在备选方法中，本发明的反转录病毒载体可用于递送一种或多种用于治疗WO-A-98/09985中所列病症的转基因。为了容易查阅，下面提供该列表的部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性及因而的抗炎活性；抗免疫活性，即针对细胞和/或体液免疫应答(包括与炎症无关的反应)的抑制作用；抑制巨噬细胞和T细胞粘附胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及增量调节fas受体在T细胞中的表达；抑制不良免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、超敏反 应相关炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫病、动脉粥样硬化相关炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺病、与消化性溃疡、溃疡性结肠炎和胃肠道的其它疾病相关的炎症、肝纤维化、肝硬化或其它肝病、甲状腺炎或其它腺病、肾小球性肾炎或其它肾病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关性妇科疾病、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎或囊样黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性眼底病变(degenerative fondus disease)的免疫和炎性成分、眼外伤的炎性成分、由感染引起的眼炎、增殖性玻璃体视网膜病、急性缺血性视神经病变、例如青光眼滤过手术后的过度瘢痕形成、对眼植入物的免疫和/或炎症反应及其它免疫和炎症相关性眼科疾病、其中在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官两者中免疫和/或炎症抑制可能有益的与自身免疫病或病况或病症有关的炎症、帕金森病(Parkinson′s disease)、因帕金森病治疗引起的并发症和/或副作用、艾滋病相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、小舞蹈病、阿尔茨海默病和CNS的其它变性疾病、病况或病症、中风的炎性成分、脊髓灰质炎后综合征、精神障碍的免疫和炎性成分、脊髓炎、脑炎、亚急性致硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格-巴综合征(Guillaim-Barre syndrome)、小舞蹈病、重症肌无力、假脑瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS创伤或CNS感染的炎性成分、肌萎缩和营养不良的炎性成分、中枢神经系统和外周神经系统的免疫和炎症相关疾病、病况或病症、创伤后炎症、败血症性休克、感染性疾病、手术的炎症并发症或副作用、骨髓 移植或其它移植并发症和/或副作用、基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用(例如因病毒载体感染所致)或爱滋病相关炎症、用于阻抑或抑制体液和/或细胞免疫应答、通过减少单核细胞或淋巴细胞的量治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病(例如白血病)、在移植天然或人工细胞、组织和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶状体、起博器、天然或人工皮肤组织)的情况下用于预防和/或治疗移植排斥。 
本发明还提供通过基因治疗治疗个体的药物组合物，其中组合物包含治疗有效量的本发明的载体或由所述载体产生或得到的病毒颗粒，所述载体包含一种或多种可递送治疗性和/或诊断性转基因。药物组合物可用于人或动物。医师通常可确定最适于个体受试者的实际剂量，该剂量将随具体个体的年龄、体重和反应而变化。 
组合物可任选包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料。可根据预定的给药途径和标准药学实践进行药用载体、赋形剂或稀释剂的选择。药物组合物可包含以下作用剂作为载体、赋形剂或稀释剂或者除载体、赋形剂或稀释剂以外还包含以下作用剂：任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂和可有助于或增加病毒进入靶位点的其它载体物质(例如脂质递送系统)。 
适当时，可通过以下的任一种或多种给予药物组合物：吸入、呈栓剂或阴道剂的形式；局部施用，呈洗剂、溶液剂、乳膏剂、软膏剂或扑粉剂形式；通过使用皮肤贴剂；口服，含有诸如淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式、或呈单独或与赋形剂混合的胶囊剂或丸剂(ovule)；或含有矫味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂的形式；或它们可经诸如海绵体内、静脉内、肌内或皮下等胃肠外注射。对于胃肠外给予，组合物可能最好以含有其它物质的无菌水溶液的形式使用，所述其它物质为例如足够的盐或单糖使所述溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给予，组合物可以可按常规方式配制的片剂或锭剂形式给予。 
通过本发明的载体系统对一种或多种治疗基因的递送可单独使用或与其它治疗或治疗的组成部分联用。可治疗的疾病包括但不限 于：癌症、神经疾病、遗传疾病、心脏病、中风、关节炎、病毒感染和免疫系统疾病。合适的治疗基因包括编码肿瘤阻抑蛋白、酶、前药激活酶、免疫调节分子、抗体、工程改造的免疫球蛋白样分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、细胞因子、趋化因子、抗病毒蛋白、反义RNA和核酶的基因。 
实施例
核苷酸序列：黑体字：与miRNA互补的靶序列。总体来说，我们使用被4-6个核苷酸的接头分隔开的4拷贝的miRNA靶标。然而，可使之最优化。 
miR-126：UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG 
miR-126T序列： 
Figure BPA00001496698400341
miR-130a：CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU 
miR-130aT序列： 
Figure BPA00001496698400342
miR-223：UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA 
miR-223T序列： 
Figure BPA00001496698400343
126T/130aT 2/2组合： 
126T(2个靶标)： 
Figure BPA00001496698400352
三重组合靶标(126T/130aT/223T，各2个靶标)： 
Figure BPA00001496698400353
实施例1 
慢病毒微小RNA报道载体的构建和验证 
为了测定miRNA在包括很少表征和表征不足的细胞群(如HSC)在内的造血细胞中的活性，我们利用我们之前的观察资料，即由慢病毒载体表达的转基因可被其人工结合位点(miRT，miRNA靶位点)加到转基因盒的内源miRNA减量调节(Brown BD.，2006)。因此我们的目的在于构建实时和在单一细胞分辨率下读出miRNA活性的慢病毒miRNA报道载体。双向慢病毒载体(Bd.LV)允许由具有双向活性的组成型启动子驱动的两个报道基因协同表达，由与呈相反方向的最小巨细胞病毒(CMV)启动子形式的TATA框融合的人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子组成(Amendola M.，2005)。由于这种设计允许两个报道分子作为两个独立的转录物表达，它们中的一个可通过将miRT加到3′UTR而对miRNA活性产生反应(“miRNA报道分子”)，而另一个未配备miRT，将不受miRNA的影响，并可用作内部对照(“标准化分子”)。我们克隆了一组含有绿色荧光蛋白(GFP)作为miRNA报道分子的这类Bd.LV和截短形式的人低亲和力神经生长因子受体(NGFR)作为组成 型表达的标准化分子。 
我们选择研究据认为在造血组织中表达的两种miRNA即miR-223和miR-126-3p。据报道，miR-223在分化髓样细胞高表达且特异性表达，但在淋巴细胞中不存在(Fazi F.，2005)，这就允许我们在充分表征的谱系中测试我们的报道分子Bd.LV的性能。此外，我们希望研究miR-223如何在造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)群中表达。鉴于基因治疗前景，为了防止在敏感干细胞群中的脱靶转基因表达同时完全保持患病子代的治疗纠正，鉴定在HSPC中强表达但不在分化子代中表达的miRNA可能至关重要。大规模miRNA克隆表明，miR-126可满足这些标准，因为在人CD34+HSPC中但不在其它造血细胞群特异性检出miR-126(Landgraf等，2007)。 
我们制备了miR-223和miR-126-3p的报道分子Bd.LV(分别为Bd.LV-223T和Bd.LV-126T)以及不含任何miRT的对照Bd.LV(图1)。然后，在一组不同的细胞类型中对这些载体进行了评价(图2)。用相称剂量的Bd.LV-ctr、Bd.LV-223T和Bd.LV-126T转导HEK293T胚肾细胞、U937单核细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，转导后几天通过流式细胞术(FACS)分析报道分子表达。HEK293T细胞表达低到未检出水平的miR-223或miR-126，而U937细胞强表达miR-223但不表达miR-126(图2a)，HUVEC表达miR-126但不表达miR-223(Kuehbacher等，2007)。作为另外的对照，通过用含有在遍在启动子的控制下的pri-mir-126的LV转导，我们对HEK293T细胞进行改造以异位表达miR-126(图2a)(下面称为HEK293T.LV.miR-126，与野生型HEK293T细胞相对)。 
在HEK293T细胞中，对于所有3种Bd.LV，表达NGFR的转导细胞的GFP平均荧光强度(MFI)相同(图2b，左栏)，这就证实了miR-223和miR-126-3p都不在这些细胞中表达。形成鲜明对照的是，与Bd.LV.126T或Bd.LV.ctrl相比，用Bd.LV.223T转导的U937细胞的GFP MFI大大降低，这就表明了miR-223但非miR-126在U937细 胞中是有生物活性的。相反，当与对照载体相比时，HUVEC显示特别对Bd.LV-126T的GFP的阻抑。类似地，与野生型HEK293T细胞相比，用Bd.LV-126T报道分子转导的HEK293T.LV.miR-126细胞强烈减量调节GFP表达(比较图2b第三行最后一图与第一图)。 
为了以更量化的术语描述miRNA活性，我们根据miRNA报道分子Bd.LV相对于对照Bd.LV的归一化平均荧光强度(MFI)，计算出“蛋白质倍数阻抑”值(FR)(图2c)。为了说明基因转移在载体组间的不同水平，我们利用内部标准化分子NGFR，其是用miRNA报道分子GFP以化学计量的量转录的。因此，我们对NGFR阳性细胞进行了FACS分析，并计算“转基因比”(TGR)，即将NGFR MFI除以各Bd.LV的GFP MFI。然后将miRNA报道载体(分别为Bd.LV.223T或Bd.LV.126T)所得到的TGR除以对照Bd.LV的TGR。以下我们称为“倍数阻抑”的这个商不依赖于载体剂量和转导水平(至少在载体剂量反应曲线的线性部分内)，并提供所分析的细胞中miRNA活性的定量读出(图2c)。我们的miRT被设计成与关联miRNA完全互补。因此我们预期被miRNA识别的转录物降解。为了证实这一点，我们在U937和HEK293T.LV.miR-126细胞中通过RT-QPCR测定了NGFR和GFP mRNA转录物，并如图2c所示计算出“RNA倍数阻抑”。实际上，与NGFR转录物相比，在U937.Bd.LV.223T细胞中以及在HEK293T.LV.miR-126.Bd.LV.126T细胞中，GFP转录物减少，如通过计算的RNA倍数阻抑值分别为7和14所示(图2c，菱形)。 
总之，这些结果表明，我们的miRNA调节的Bd.LV如实报道了细胞系中的miRNA活性，与我们自己的和之前已发表的miRNA表达数据一致。除了常规的miRNA概况分析技术以外，我们的载体不仅报道了miRNA的存在情况，而且还报道了其生物活性。对携带我们的Bd.LV报道分子的细胞进行的FACS分析可供在单一细胞水平上评价miRNA活性，并因此适于分析异源细胞混合物，其可通过免疫表型分析进一步细分。 
小鼠造血系统中miR-223和miR-126活性的表征 
一旦证实报道分子Bd.LV在测定细胞系中的miRNA活性的可靠性，我们便转向研究上述miRNA在原始造血细胞中的活性。为此目的，我们利用鼠模型，因为它是普遍可获得的，在实验背景下容易操作，并且是充分表征的。实际上，当目的是在稀少的HSPC群中确定miRNA活性时，通过表面标记充分表征的鼠造血系统代表了极大的优势。我们的实验方法是通过耗尽谱系-标记阳性细胞从骨髓中富集鼠HSPC，以用慢病毒miRNA报道载体转导HSPC，并将这些细胞移植到经致死照射的同类受者小鼠中。然后，监测随时间变化的外周血白细胞中的微小RNA活性以测定它们在分化细胞中的活性。在实现稳定植入后，使小鼠安乐死，在通过表面免疫表型分析确定的多种骨髓群中测定miRNA活性。这样，我们希望评价这些miRNA是否在前瞻性鉴定的HSPC中表达。具体地讲，我们希望确定miR-126是否存在于最原始的HSC区室中。将第一组小鼠用通过前述报道分子Bd.LV转导的HSPC移植(参见图1；Bd.LV-ctr，n＝5只移植小鼠；Bd.LV-223T，n＝6只小鼠；或Bd.LV-126T，n＝4只小鼠)。 
移植后8周采集外周血(PB)，按照物理参数和表面标记，将白细胞群分成粒细胞(CD11b+侧向角散射hi SSChi)、单核细胞(CD11b+SSClo)、B细胞(CD19+)和T细胞(CD11b-CD19-)(图3a)。在这些白细胞亚类内通过FACS定量测定GFP miRNA报道分子和NGFR标准化分子表达(图3b)。虽然GFP在所有来源于Bd.LV-ctr-转导的HSPC和Bd.LV-126T-转导的HSPC的白细胞亚类中进行类似表达，但是我们注意到在Bd.LV-223T组内，GFP尤其在PB髓样细胞中但不在淋巴细胞中显著减量调节。miR-223活性的定量测定表明，在粒细胞和单核细胞中的阻抑分别为30倍和17倍，然而miR-126在PB白细胞中无活性(图3c)。为了在截然不同的HSPC亚类中表征miR-223和miR-126概况，我们处死了Bd.LV报道分子小鼠，并对其 骨髓进行多色免疫表型分析以前瞻性地鉴定截然不同的祖细胞亚群和干细胞亚群。这在上述小鼠中进行，而且还在后续实验中在用HSPC移植的小鼠中进行，所述HSPC基于去稳定GFP变体表达更敏感的miRNA报道分子。该报道分子含有与GFP的C端融合的富含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PEST)的序列。PEST基序介导快速的蛋白酶体降解和蛋白质快速更新，GFP半寿期由约26小时缩短至4小时(Kitsera等，2007)。这种短的dGFP半寿期使我们更准确地检测miRNA表达的变化，这可能在HSC转运到定型祖细胞期间发生。为了可靠地测定低于标准GFP的dGFP信号，通过包括携带不含GFP基因的Bd.LV-NGFR载体的小鼠组，从GFP MFI减去每个个别亚群中的自身荧光。在下面图4的FACS图获自用更敏感的Bd.dGFP载体移植的小鼠BM。然而，在携带标准GFP报道分子的小鼠中对miRNA活性的测定得到非常类似的结果，使得可根据来自所进行的两个独立实验的合并数据计算图3c中的倍数阻抑(Bd-ctr，n＝10；Bd-223T，n＝9；Bd-126T，n＝13只小鼠)。 
对鼠HSPC及其子代中的微小RNA活性进行足迹法 
然后，我们定量测定了自再生小鼠中分离的多个前瞻性鉴定的造血亚群中的BdLV报道分子蛋白质水平。HSPC区室定义为具有c-Kithi谱系标记-/低免疫表型的骨髓(BM)细胞，根据Sca-1、CD150、CD48和CD45的表达进一步细分成具有不同的自我更新和分化潜力的部分。值得注意的是，据报道，具有免疫表型c-Kit+Sca-1+Lin-(KSL)CD150hiCD48-的5种细胞中的3种在单一细胞移植时具有长期的多谱系种群恢复潜力，因此代表真实的HSC(Kiel MJ.，2005)。此外，根据文献(Pronk CJ.，2007)和我们自己的研究结果，我们把Kit+Sca-谱系-细胞细分成富含粒细胞/单核细胞祖细胞(GMP)与巨核细胞和红细胞祖细胞(EP)的亚类，并对miRNA表达进行了评价。有趣的是，miR-126、miR-130a和miR-196b显示在富含最原始HSC的部分中具有最高活 性，这种活性在分化早期丧失(图4)。重要的是，miR-126、miR-130a和miR-196b在淋巴系和髓系分化细胞中大多无活性，终末分化粒细胞是例外，终末分化粒细胞似乎重建某种程度的miR-126活性。miR-223在大多数KSL细胞和所有骨髓祖细胞(GMP)中表达，但在EP中急剧减量调节。如预期的一样，miR-223在骨髓分化期间逐步增量调节，而B淋巴细胞和T淋巴细胞则缺乏这种调节(图5a)。同样，所得到的miR-17～92聚簇的成员(miR-19、miR-93a、miR-17-5p)在HSPC中高表达。然而，在进一步分化期间保持其抑制活性，而且只在终末分化B细胞和粒细胞中降低到某种程度(图5a)。最后，let-7a在所有造血细胞类型(包括真实的HSC)中保持相当的抑制活性，与其遍在表达模式一致。 
通过miR-126保护HSC免于条件性自杀 
上述miRNA活性足迹法以按照免疫表型的造血细胞群的前瞻性分离为基础。为了确凿地证实选定miRNA在功能上确定的细胞亚类中的活性，我们根据表达由不同miRT序列调节的单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因的慢病毒载体设计了条件性自杀(conditional suicide)系统(图6a)。由于TK非常稳定，半寿期约35小时，我们通过将d4GFP的PEST结构域与TK的C端融合，使TK蛋白去稳定(下面称dTK)。将HSPC用一种指定的自杀载体或GFP对照载体转导，并在存在或缺乏GCV时接种到半固体培养基中(图6b)。用对照TK载体转导的HSPC在GCV存在时不产生集落。将miR-142T序列加至dTK转录物中完全拯救了集落形成，与这种miRNA的全造血性表达(pan-hematopoietic expression)一致(Brown BD.，2006)。反而，miR-223T至少部分恢复骨髓集落生长，而类红细胞集落数显著降低(p＜0.001)，且在统计上与对照TK转导细胞没有不同。用miR-126T也获得骨髓集落的部分拯救，虽然比用miR-223T获得的水平低。在miR-130aT组中，GCV完全阻止骨髓和类红细胞集落两者的生长，这与分化的早期阶段mir-130a的 急剧减量调节一致。 
然后，我们开发了体内自杀测定法以在功能上确定的HSC中证实miRNA活性。为了变得有毒性，TK/GCV自杀系统需要细胞分裂。共同移植TK-转导细胞与未转导BM支持细胞的初步实验表明，在植入头2周内给予1周时程的GCV有效消除TK转导的长期种群恢复性HSC(数据未显示)。我们然后用表达dTK-126T或dTK-142T和GFP的miRNA调节的双向自杀载体，或表达dTK和ΔNGFR的对照双向自杀载体转导HSPC。然后，将用对照或一种miRNA调节的自杀载体转导的细胞共同移植入同类小鼠中，所述小鼠在植入期期间接受或不接受GCV(图6c)。外周血嵌合状态的长期分析表明，大多数NGFR+细胞在GCV治疗小鼠中被有效消除，而GFP+细胞仍保持相对数目的增加。对于dTK-126T转导细胞和dTK-142T转导细胞两者，这在多个谱系(粒细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞)中并且在＞7个月时间内都观察到。这些数据证实，miR-126和miR-142两者在长期群恢复HSC中表达到足够水平以防止TK蛋白表达和由GCV诱导的细胞死亡。 
开发用于基因治疗的miR-126调节的安全性 
然后，我们得到带有慢病毒载体的种系整合的转基因小鼠品系(Tg.126T小鼠)，所述慢病毒载体自用于上述BdLV研究的相同启动子表达d4GFP.126T转录物。年轻成体Tg.126T小鼠的Lin-BM细胞的FACS分析显示与移植小鼠中所观察到的类似的miR-126活性方式(图7a)。这就证实了miR-126在HSC中以生理方式表达。已知miR-126在内皮细胞中表达，并且在发育期间丧失功能导致由血管生成缺陷引起的胚胎死亡(Fish JE.，2008)。Tg.126T小鼠中不存在显然的表型异常。当Tg.126小鼠互交时，得到保持其亲本载体整合体(integrant)平均数的正常大小的一窝小鼠(图7b)。该数据表明自磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子表达miR-126T序列不干扰小鼠发育，并且不赞成这样的 设想，即在这些情况下miR-126T表达可能干扰内皮细胞的天然miR-126靶标的调节。为了进一步排除后一问题在造血细胞中的可能性，我们建立了竞争性种群恢复实验(competitive repopulation experiment)。将CD45.1+HSPC与同样数目的得自Tg.126T小鼠的CD45.2+HSPC共同注射入经致死照射的CD45.1+接受者中。对于所有的主要血液谱系，外周血嵌合状态稳定，并约40-50％CD45.2+细胞(n＝4)保持至少1年(分析的最新时间)(图7c)。总之，这些数据表明miR-126在原始HSC中表达，并且该生物传感器方法提供在miRNA表达基础上在单一细胞水平上鉴定造血细胞的有力的无毒方法。 
人造血细胞中候选miRNA活性的表征
我们对鼠造血系统中miR-223、miR-130a和miR-126活性的表征提出了这些miRNA作为有前景的内源调节剂用于在HSPC中限制转基因毒性，同时允许在分化的髓样细胞和淋巴样细胞进行治疗性表达。我们接下来企图研究这些miRNA在作为基因治疗的实际靶标的人造血细胞中的活性。我们用miR-126、miR-130a，miR-223的报道分子Bd.LV转导人CB CD34+细胞(图8A)。在为HSPC短期维持提供支持的条件下体外培养细胞，通过流式细胞术鉴定基于CD34/CD38表达的亚群。应用甲基纤维素测定法对骨髓(CD13+)和红细胞(CD235+)分化进行了评价。miR-126、miR-130a和miR-223全都在CD34+HSPC群中抑制其相应的报道分子转录物。在分化时，miR-223在髓系中保持活性，而在红细胞分化时降低。相比之下，miR-126在骨髓分化时丧失其活性，但在红细胞子代中保持活性。通过条件性自杀测定法在功能上验证了这些表达模式(图8b)。miR-130a在髓系和红细胞谱系中均丧失其活性。相应群中miRNA活性的定量测定(图8A)表明，在所测试的miRNA中，miR-126在富集原始HSPC的CD34+CD38-CB部分中是最有效的miRNA。图8c/d表示通过miR-126T和miR-130aT序列的组合进一步优化miRT序列。 
实施例2 
在HSPC中的强迫性GALC表达 
为了评价GALC在鼠HSPC(mHSPC)中过量表达的可行性，我们从FVB/twi(GALC-/-)小鼠中分离出Lin-细胞。在最优化细胞因子组合存在下，将mHSPC用GALC.LV以MOI 100转导(Biffi等，2004)。转导后，将细胞体外培养10-14天，通过Q-PCR评价酶活性和载体拷贝数(VCN)。我们对GALC的表达水平与通过用对照载体ARSA.LV和IDUA.LV转导mHSPC获得的其它溶酶体酶芳基硫酸酯酶A(ARSA)和-艾杜糖苷酸酶(IDUA)的过量表达进行了比较。所有载体自含有人PGK启动子的相同表达盒表达转基因。由于我们的目的是对转导的-/-HSPC中的酶过量表达与在野生型HSPC中的生理性酶水平进行比较，因此分别使用获自ARSA KO小鼠和获自IDUA KO小鼠的mHSPC用于ARSA.LV和IDUA.LV转导。mHSPC的转导在-/-细胞中重建溶酶体酶活性，并且使得与转导的-/-mHSPC的培养子代中的野生型水平相比，酶过量表达(图9A)。然而，与在通过IDUA.LV和ARSA.LV对照获得的IDUA和ARSA中的增加(分别为野生型的320倍和5.6倍)相比，GALC表达的增加(野生型的2倍)显著较低，尽管VCN相似。 
对通过CD34+选择从正常供体(n.d.)获得的CB中分离的人HSPC(hHSPC)进行了类似的实验。采用前述优化转导方案105，用GALC.LV、ARSA.LV和IDUA.LV以MOI 100转导hHSPC。与mHSPC类似，我们在转导细胞体外培养时对酶活性重建和VCN进行了评价。与IDUA.LV(n＝3)和ARSA.LV(n＝6)对照相比，得自n.d.CB的HSPC的GALC.LV转导(n＝4)，引起酶在培养细胞子代中有限的过量表达(图9B)。 
LV介导的GALC表达时表达GALC的HSPC的体外功能受损 
通过CFC测定，对转导和酶表达对mHSPC集落形成潜力的影响 进行了评价。接种相同数目的GALC/GFP/ARSA.LV转导的mHSPC用于集落测定法。选择ARSA作为对照溶酶体酶，因为之前的研究表明它不影响HSPC功能(Capontondo等，2007)。在12次独立实验中，与GFP.LV和ARSA.LV转导细胞相比，GALC.LV转导的-/-和+/+mHSPC产生的集落数显著下降(对于GALC-/-细胞，图10A)。与对照相比，GALC.LV转导的mHSPC的集落的大小显著减小(图24B)。这些结果表明，LV转导时的GALC过量表达损害mHSPC集落形成潜力。GALC.LV转导时类红细胞集落和骨髓集落的相对比例类似于对照(未显示)，这就表明了酶表达以相同程度损害不同的造血谱系。 
GALC.LV转导的mHSPC集落形成潜力的降低可能是由过量表达高度转导的GALC的造血祖细胞的死亡引起的。为了研究可能发生的高度转导的mHSPC的阴性选择，我们通过Q-PCR定量测定了集落的VCN。Q-PCR对在4个集落的各个合并物中提取的DNA进行(为了得到用于分析的足量材料而进行合并)。与对照相比时，从GALC.LV转导的mHSPC中得到的集落具有显著较低的载体含量(图10A)，这就表明发生了高度转导的祖细胞的阴性选择。 
根据这些数据，我们无法区别功能受损和体外选择是由转导的毒性作用引起的还是由存在由载体生产细胞释放的污染物和与载体同纯化引起的。必须提及的是，在GALC.LV产生期间，293T细胞从板上脱离，这就表明了GALC表达对这些细胞也有毒。为此，不能排除来源于死亡293T细胞的毒性分子掺入载体制备物中。为了克服这个问题，我们制备了由造血特异性微小RNA调节的对照载体即GALCmir142T.LV 56。掺入转基因下游的微小RNA 142的4个靶序列可供抑制在mHSPC中和在其子代中表达，而不损害GALC在非造血细胞(例如产293T LV细胞)中表达。该技术以微小RNA转录后调节为基础：仅由造血细胞表达的微小RNA 142识别其转基因下游的靶序列，并抑制转录物的翻译和转基因的表达。如预期的一样，用GALCmir142T.LV转导mHSPC与GALC活性提高无关(图10B)。此 外，与对照相比，用GALCmir142T.LV转导的mHSPC(n＝6)显示集落形成潜力不受影响，并具有类似的载体含量，因此证实了之前观察到的损害有赖于GALC表达(图10A)。 
我们还研究了GALC过量表达对人HSPC的作用。从n.d.CB和BM中以及从预定弃去的已采集的GLD患者的BM中分离hHSPC。为了评价转导的hHSPC的集落形成潜力，相同数目的hHSPC用GALC.LV或ARSA.LV或GFP.LV对照载体转导，并接种用于CFC测定。正如在鼠细胞中的情况一样，GALC.LV转导的n.d.hHSPC和GLD hHSPC显示集落形成潜力受损(图11A)。与对照相比时，GALC.LV转导的hHSPC的集落具有显著较低的载体含量，大小减小，红细胞-骨髓比例保持，再次表明高度转导的祖细胞的阴性选择(图11A)。同样在这种情况下，使用对照载体GALCmir142T.LV排除转导的非特异性毒性作用的可能性。正如在鼠细胞中的情况一样，GALCmir142T.LV转导的hHSPC(n＝4)具有与对照细胞中观察到的类似的GALC活性和集落形成潜力(图11A和B)。 
总的来说，这些数据表明在LV转导时强迫性GALC从头表达对鼠HSPC和人HSPC两者发挥有害作用，导致过量表达GALC的细胞的阴性选择和功能受损。 
在LV介导的GALC表达时HSPC的体内功能受损。我们进行了体内实验，目的是评价mHSPC和hHSPC在GALC.LV转导和GALC从头表达时的种群恢复潜力。对于mHSPC，体内研究在twi和FVB/twi小鼠中进行，对于hHSPC在Rag2c小鼠中进行。 
我们的最初实验按方法部分的描述在twi小鼠(GLD重症模型)中进行。第一组实验专注于在twi小鼠中设置HCT的条件。在这些小鼠中进行来源于野生型供体的全BM移植，导致其生命期限显著延长至100天，如通过115之前的报道。这些初步实验可供界定最适的照射剂量。携带CD45.1等位基因的供体HSC的应用可供评价供体细胞植入，因为twi小鼠携带CD45.2等位基因。由于我们的目的是转导twi  HSC，因此为了减少待转导和移植的细胞数(与使用全BM细胞相比)，我们试图建立Lin-HSPC的移植。在最优化细胞因子组合的存在下，用PGK GFP.LV(GFP.LV)以MOI 100转导野生型(+/+)小鼠的HSPC(Biffi等，2004)(图12A)。转导后，将细胞移植入经致死照射8日龄的twi小鼠或+/-对照中。对照组还包括用野生型BM或Lin-细胞移植的twi小鼠。出乎意料的是，与对照动物不同，HSPC移植-/-twi小鼠在致死预处理后无法存活，因此这就表明了仅Lin-细胞不能使twi小鼠再生(图12B)。 
因此，我们决定通过共同移植耗尽HSC的未转导BM衍生的造血定型祖细胞支持GFP.LV转导的HSPC植入。通过磁性耗尽+/+小鼠全BM的Sca1+细胞来获得这些细胞。有趣的是，用GFP.LV转导+/+Lin-细胞和未转导+/+Sca1-细胞移植的twi小鼠达到的存活期与用+/+全BM移植得到的类似(图12B)。通过流式细胞术在外周血对GFP.LV转导HSPC的植入进行了评价。移植后5-6周，细胞荧光测定分析显示GFP+HSPC衍生的细胞的大量植入(图12C)。因此，+/+Sca1-祖细胞的共同移植拯救纯化的HSPC的缺损型植入(defective engraftment)，可供延长生命期限和改善与用全+/+BM移植获得的表型类似的twi小鼠的表型(Yeager等，1993；Wu等，2000)。 
一旦用+/+HSPC和GFP.LV使移植手术最优化，便给twi小鼠移植GALC.LV转导的-/-HSPC和+/+或GALC.LV转导的-/-Sca1-细胞。与用+/+全BM或用+/+HSPC和Sca1-祖细胞移植的小鼠相比，接受GALC.LV转导的-/-HSPC和+/+未转导细胞的twi小鼠的存活显著较长，其表型得到改善，并且疾病进程较缓慢(图12B)。该数据表明，与常规的HSCT相比，过量表达GALC的HSPC移植提供独特的治疗益处。然而，当我们通过Q-PCR评价这些小鼠的BM中GALC.LV转导细胞的存在情况时，我们发现载体拷贝数(VCN)低，介于0.8和1之间，因此这就表明了仅具有低VCN的GALC.LV转导细胞便能够植入。 
然而，接受两者都用GALC.LV转导的-/-Lin-和Sca1-细胞的twi小鼠，在致死预处理后死亡，或者生命期限与未治疗小鼠的类似。这些结果表明，GALC.LV转导的祖细胞不能支持HSPC植入，这就导致植入失败和血细胞生成的自体重建。 
我们决定使用FVB/twi小鼠而不是常用的GLD的twi模型以利用略为较不严重的模型：之前的实验向我们表明，在该模型中不需要Sca1支持细胞的Lin-细胞的成功移植是可能的。此外，FVB/twi小鼠一胎具有较大的幼仔数，因此允许我们具有较大-/-小鼠数来分离mHSPC。 
将转导的mHSPC移植到经致死照射8日龄的FVB/twi-/-和杂合(+/-)受者中(图13)。为了减小生物差异，我们移植-/-和+/-同窝鼠仔。给对照组的小鼠移植GFP.LV转导+/+细胞。对于该对照组，转导后7天，通过细胞荧光测定法对体外培养物的转导效率进行了评价，而在HSCT后6周，通过细胞荧光测定法对外周血的转导细胞的植入进行了评价。转导效率非常高，范围介于75％和93％的GFP+细胞之间。所有GFP移植的动物都显示移植细胞大量植入(介于63％和85％之间)，而且所有照射对照(不接受HSCT的致死照射小鼠)在预处理后3周内死亡，因此证实了HSCT条件的正确设置。与未移植对照小鼠相比，接受GFP.LV转导的+/+mHSPC的-/-小鼠在致死预处理后达到的存活延长(长达150天)。与在twi小鼠相应组中观察的相比，未治疗和GFP移植FVB/twi小鼠的存活期较长，因此证实了遗传背景对表型严重程度的影响。还通过处死时从BM移植小鼠中提取的DNA的Q-PCR对转导mHSPC的植入进行了评价。按VCN/基因组测定，观察到GFP.LV转导的mHSPC的明显植入(表2)。引人注目的是，用GALC.LV转导的-/-mHSPC或+/+mHSPC移植的-/-和+/-小鼠对致死照射无法存活(21天内死亡，与照射对照的类似)(图13，数据未显示)。Q-PCR显示在其BM中VCN非常低至未检出VCN(表2)。这些结果表明GALC转导mHSPC的功能受损，这使得不能再生致死处理的宿主。 
表达GALC的鼠HSPC和人HSPC的细胞凋亡。 
检测出GALC.LV转导的HSPC的功能受损后，我们评价了这是否可能是由从头GALC表达介导的转导细胞凋亡引起的。当通过膜联蛋白V染色和TUNEL测定法推测转基因表达达到稳定状态(参见图14B中的GFP表达)时，在两个不同的时间点上(转导后2天和5天)，对细胞凋亡的发生进行了评价。第一种技术对早期凋亡细胞进行标记，第二种对晚期凋亡细胞进行标记。mHSPC和hHSPC用GALC.LV和对照GFP/ARSA.LV转导。转导和洗涤后，将细胞铺板到基质胶包被的盖玻片上用于TUNEL测定法，或者培养在普通板上并针对膜联蛋白V和TUNEL染色。在共焦显微镜下，大多数GALC.LV转导的mHSPC呈TUNEL阳性，并且具有带浓密染色质的放大的核，这就表明在两个时间点上细胞凋亡广泛发生(图14A-B)。相反，ARSA/GFP.LV转导细胞大部分呈TUNEL阴性。膜联蛋白V染色证实了细胞凋亡的发生，这就表明与对照相比，在GALC转导的mHSPC和GALC转导的hHSPC中凋亡细胞部分较高(图14C)。 
对GALC表达毒性的敏感性取决于分化和细胞谱系 
在LSD的HSPC基因治疗方法中，巨噬细胞和小胶质细胞表示HSPC效应物子代在受累组织(包括神经系统)中重建酶活性。我们评价了原型单核细胞系(U937)、原始人单核细胞、原始鼠巨噬细胞和小胶质细胞是否在LV介导的基因转移时经历GALC表达毒性。此外，为了进一步仔细分析在造血分化中GALC诱导的细胞凋亡的特异性，我们测试了T淋巴细胞和B淋巴细胞。为了允许进行GALC的免疫检测和估算转导效率，在一些实验中，我们使用C端加标签的转基因，其中基因与编码来源于人流感病毒血凝素蛋白的HA肽的序列符合读框地融合。加HA标签的酶具有与未修饰的酶相当的比活，并且被适当地分选到溶酶体区室中(数据未显示)。转导后，我们通过TUNEL 测定法和GALC活性，对在不同时间点上发生的细胞凋亡进行了评价。如预期一样，所分析的所有细胞类型都具有不同的基础GALC活性水平(图17)。 
获得作为腹膜细胞采集物的粘附部分的鼠巨噬细胞。通过已建立的方案(Armstrong RC.，1998；Gritti等，1996)，自+/+和-/-FVB/twi小鼠的脑分离出小胶质细胞的原代培养物。另外，我们测定了原始单核细胞和U937单核细胞系两者。通过CD14单核细胞标记的阳性选择，由PBMC分离出人单核细胞。使用GFP.LV设立转导条件，并且通过细胞荧光测定法(可能时)或通过共焦显微镜，对转导效率进行了分析。一旦使转导方案最优化，小胶质细胞和巨噬细胞便被GALC.LV/GALC-HA.LV和对照载体分别以MOI 50和200有效转导，并且表达超过基础水平的GALC(图18)。即使当达到高表达水平(高达野生型水平的40倍)时，在所有测定的细胞中，TUNEL测定均显示在GALC.LV转导和GALC过量表达后的低频率或无细胞凋亡(图18)。在+/+和-/-小胶质细胞之间未观察到差异(图18，其它数据未显示)。这些结果证实，HSC基因治疗效应物细胞对GALC毒性不敏感，因此表明，为了开发用于GLD的HSC基因治疗策略，在HSPC中应避免GALC表达，而在能够将酶靶向受累组织的分化造血髓样细胞中则应提高其表达。 
在全PBMC的PHA刺激和EBV转化时，分别获得人T淋巴细胞和B淋巴细胞。与用单核细胞和巨噬细胞的实验类似，通过使用GFP.LV和流式细胞术使转导最优化。用GALC.LV/GALC-HA.LV和对照载体以MOI 100有效转导B淋巴细胞，而对于T淋巴细胞则利用MOI 100的两次命中(hit)。尽管转导时GALC活性保持提高，但在所有分析的时间点上未检出细胞凋亡(图19)，因此进一步支持分化造血细胞对GALC过量表达无可检出敏感性的观点。 
通过miRNA126对GALC表达的体外调节 
为了评价miRNA126调节的GALC表达在HSPC中的作用，我们用GALC.miR126T.LV或用GFP.miR126T.LV或GALC.LV以MOI100转导mHSPC。洗涤后，接种细胞用于CFC测定，或将细胞体外培养2周用于GALC活性测定和Q-PCR分析。用GALC.miR126T.LV的转导使得在分化的mHSPC子代中在超生理水平上重建GALC活性，高达野生型水平的2倍(图35B)。重要的是，由用GALC.miR126T.LV转导的mHSPC获得的集落数与对照类似，几乎为GALC.LV集落的2倍(图21C)，因此表明通过miRNA126调节GALC表达可供保持转导mHSPC的集落形成潜力。这些令人鼓舞的结果促使我们评价未受影响的集落形成潜力是否是由于拯救GALC.miR126T.LV转导的mHSPC不受细胞凋亡所引起的。转导后，将mHSPC接种到基质胶包被的盖玻片上，培养2天和5天后进行TUNEL测定。通过共焦显微镜对细胞凋亡水平进行了评价。对GALC.miR126T.LV转导的细胞进行的TUNEL测定表明，在两个时间点上细胞凋亡较少或无细胞凋亡(在2天和5天分别为1％1和3％2)，与在用对照LV转导的细胞中观察到的类似(图22A-B)。该数据表明，通过miRNA126抑制GALC表达可拯救mHSPC免于GALC诱导的细胞凋亡。 
通过miRNA126对GALC表达的体内调节 
在+/-FVB/twi小鼠中，对miRNA126调节的GALC表达对mHSPC种群恢复潜力的作用进行了评价。给经致死照射的8日龄小鼠移植GALC.miR126T.LV转导-/-mHSPC或PGK GALC.LV转导细胞，对短期和长期存活两者进行了评价。与用CD11b_GALC.LV观察到的类似，用GALC.miR126T.LV转导的mHSPC移植的+/-FVB/twi小鼠得到拯救免于死亡，并且长期存活(HSCT后超过3个月)，与在致死预处理后无法存活的PGK_GALC.LV-移植小鼠不同。当在80日龄时，处死用GALC.miR126T.LV转导mHSPC移植的小鼠，并对BM 进行了Q-PCR分析，我们发现平均VCN为5，因此证实了在HCT后在BM中长期存在转导细胞。 
总之，这些结果连同用CD11b_GALC.LV转导的细胞所观察到结果一起，显示通过我们的改进的调节基因治疗策略成功拯救GALC缺乏症，并且在HSPC中避免GALC从头表达。 
强迫性GALC表达对HSPC有毒但对分化造血细胞无毒 
为了开发基因治疗的模型，我们用表达GALC或表达GFP的慢病毒载体转导得自野生型和GLD小鼠的HSPC，GLD小鼠携带导致＜5％残留酶活性的点突变(Trs)45(图23A)。用GALC载体的转导在GLD细胞的培养子代中重建GALC活性，导致与GFP转导的野生型细胞相比过量表达约2倍(图23B)。在野生型鼠HSPC以及得自正常CB或BM的人CD34+HSPC转导时观察到类似的表达水平(图23B)。意料不到的是，与GFP转导细胞相比，强迫性GALC表达损害鼠HSPC和人HSPC的集落形成活性(图23D，以及未显示的数据)。转导2天后进行的TUNEL测定表明，大多数GALC转导的HSPC而不是GFP转导的HSPC呈TUNEL阳性，并且具有染色质浓密的扩大的核(图23E和F)。这些研究结果表明GALC转导的HSPC的集落形成损害是由细胞凋亡诱导引起的，通过膜联蛋白V染色也得到证实(未显示)。HSPC的功能受损是由强迫性/从头GALC表达直接造成的，并不是由与载体制备物有关的毒性造成的，正如用miR-142调节的编码GALC的慢病毒载体转导的HSPC显示的正常集落形成活性和缺乏细胞凋亡一样。实际上，142T序列在造血细胞但不在LV生产者细胞中抑制GALC酶表达33(图23B)。强迫性/从头GALC表达对长期植入的细胞也是有毒性的，因为GALC转导的鼠HSPC不能拯救Trs小鼠免于致死照射(图24A)。 
在HSC移植时，巨噬细胞和小胶质细胞是在受累组织中负责重建GALC活性的效应物子代。为了测定由强迫性/从头GALC表达产 生的毒性是否也影响分化细胞，我们用GALC载体或对照载体转导人原始单核细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞以及小鼠小胶质细胞(图24B)。虽然在所有细胞类型中实现了有效转导和GALC过量表达，但是TUNEL测定显示在培养物中细胞凋亡低或无细胞凋亡(图24B和C)。因此，对GALC表达的敏感性是HSPC的独特性质，这在成熟造血细胞中未观察到。 
miR-126调节拯救HSPC免于GALC表达毒性并使GLD的基因治疗成为可能 
从头GALC表达在HSPC中的选择性毒性强调了对于GLD的成功基因治疗需要严密调节HSPC中的转基因表达。我们因此测定了我们新的基于miR-126的调节系统的功效，并将其与基于骨髓特异性CD11b启动子的转录策略进行了比较，所述启动子使GALC表达靶向分化的HSPC子代。两种策略均拯救转导的HSPC免于GALC诱导的毒性(参见图23B-E)。然而，与在CD11b-GALC转导细胞中的相比，在用GALC-126T慢病毒载体(lentivector)(其中GALC表达由PGK启动子驱动)转导的细胞子代中，重建的GALC活性显著较高(高达野生型水平的2倍)，甚至当比较转导至类似载体拷贝数的培养物时(图23B和C)。我们还证实了GALC.126T慢病毒载体有效保护人HSPC不受GALC毒性影响(图23C和D)。考虑到在成熟造血细胞中超生理酶活性的可能益处，我们选择miRNA调节的载体用于GLD治疗的体内研究。 
Trs小鼠的HSPC用GALC-126T慢病毒载体转导，并移植入新生Trs小鼠中。移植小鼠成功地植入(图24A)，并且不仅仅与未治疗Trs小鼠相比(p＜0.0001)，而且与用野生型GFP转导的HSPC移植的小鼠相比(p＝0.002；图24A和D)，移植小鼠都具有显著较长的存活期。此外，当我们根据在BM中测定的载体拷贝数对基因疗法治疗的小鼠分层时，具有最高载体含量的动物具有显著较长的存活期(图6E)，这强 有力地表明了造血细胞中超生理酶表达提高HSC移植的治疗功效。实际上，在基因疗法治疗的Trs小鼠的脑中观察到功能性GALC酶有效递送至受累脑中和缺陷活性的重建(图24F-I)。在受治疗的小鼠中枢神经系统中，在Iba1+、CD45+浸润的造血细胞和在Iba1-、CD45-非造血细胞两者中检测到GALC活性(图24F-I)，这就表明了定居细胞的交互纠正很可能是由移植和转导HSPC的子代分泌的酶引起的。重要的是，与未治疗受累对照相比，酶活性重建和存活期提高与治疗小鼠表型的显著改善有关，其中步行能力保持和颤搐(GLD相关性意向性震颤)减少。 
讨论 
造血系统中miRNA表达的深度概况分析 
用于本研究的miRNA报道载体提供了测定miRNA生物活性而不只依赖于miRNA表达水平的机会，因此提供了miRNA功能的生物学上有意义的定量读出。Brown等人提出，必需达到miRNA表达的阈值水平以产生针对miRNA靶标的显著抑制活性，这可能是细胞内可获得的有限RNAi机构(RNAi machinery)的结果(Brown等，2007)。如果小RNA与有限的RNAi效应物复合体竞争，则足够高水平的表达对于确保miRNA掺入活性RISC中可能是必须的。因此，以非常低的水平表达的那些miRNA物类可能几乎无活性，因为它们不是功能性RISC的组成部分。miRNA概况分析研究常常只考虑miRNA表达中的相对差异，并可由此表明统计学显著性差异，然而这可能与基因调节无关。将全基因组miRNA表达分析的宽度(例如通过微阵列或深度测序)与miRNA报道分子Bd.LV方法结合为研究微小RNA增加了另一种尺度。它可供严密论证差异miRNA表达的生物重要性，并且可用于以单一细胞分辨率和在活细胞中纵向研究选定miRNA在多个细胞群中的表达。我们采用这个方法研究选定miRNA在极少可获得和难以获得的细胞群(像HSC)中的表达。我们的miRNA报道载体研 究不仅仅证实了文献中描述的miR-223和miR-126表达概况方面的数据，而且还进一步加入关于这些miRNA在极纯HSPC亚群及其子代中的活性的信息。miR-223之前被描述为在小鼠和人髓系中大量表达(Chen等，2004；Fazi等，2005；Rosa等，2007)。实际上，我们的报道载体数据发现，最大的miR-223活性在粒细胞中。此外，还在单核细胞和在HSPC的层级中，特别是在粒细胞-单核细胞谱系的定型祖细胞中揭示了miR-223活性。我们的数据表明，在小鼠和人两者中，至少一些多潜能造血细胞表达miR-223。一种可能是这些细胞是为粒细胞-单核细胞命运准备的。我们的双向报道载体允许按照miR-223表达来分级分离这些HSPC群，并探测其分化潜力。这些研究可提供不仅仅依赖表面标记的前瞻性鉴定骨髓祖细胞的新方法，并且可能研究谱系定型的最早步骤。 
迄今，miR-126在造血系统中的表达的表征不足。一个广泛的基于深度测序的miRNA概况分析研究将其大体上归于CD34+HSPC。现在，我们提出miR-126在鼠HSPC和人HSPC中是有活性的，特别是在富集最原始HSC的亚类内。在分化的早期阶段，miR-126活性逐步降低。通过我们在UHN，Toronto的合作者对从NOD/SCID小鼠新鲜分离的BdLV.126T转导的CB HSPC的分析(Lechman等，2008，ASH摘要)，进一步证实了miR-126与人HSC的关联。我们的数据支持miR-126的干细胞/早期祖细胞特异性表达模式，其在最下游谱系中沉默。 
有趣的是，以“核心结合因子”(CBF)突变为特征的急性髓细胞性白血病(AML)的亚组表达高水平的miR-126 121。作者鉴定出极体样激酶(PLK-2作为miR-126的经证实的靶标)。PLK-2被公认为细胞周期的调节因子，并可在血液学恶性中起肿瘤抑制基因的作用。考虑到miR-126与HSC的紧密关联，我们与UHN，Toronto的John Dick小组合作，在白血病干细胞(LSC)中研究了miR-126活性，白血病干细胞处于AML的发育层级顶点的稀有亚群，一般认为它是造成化学治 疗抗性和复发的原因(Barabe等，2007；Kennedy等，2007)。初步结果表明，AML样品，特别是属于其它亚群而不是CBF-AML的样品，出现miR-126表达的梯度，在富含LSC的CD34+38-部分中最高，而在非植入部分中低。miR-126活性的这种模式在LSC移植入免疫缺陷型NOD/SCID小鼠中时保持。因此，通过慢病毒报道分子Bd.LV观察到的miR-126活性可用作白血病AML干细胞的新的生物标记和潜在的治疗靶标(Lechman等，2008，ASH摘要)。 
造血系统以外，miR-126被广泛描述为内皮细胞中的血管生成信号转导的阳性调节因子。血管生成描述了通过预先存在血管的生长而形成新的血管。促进血管生成的信号包括血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，其激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)级联，调节内皮细胞的运动和增殖，以及随后的血管萌芽。miR-126具有2个已证实的参与血管生成过程的靶标，含有Sprouty相关EVH1结构域的蛋白质(Spred1)和PI3K的调节亚基，两者均为VEFG/FGF信号转导的负调节剂。缺乏miR-126的内皮细胞无法响应血管生成信号。斑马鱼中miR-126的敲减导致在胚胎发育期间丧失血管完整性和出血(Fish等，2008)，而在小鼠中缺失miR-126则引起血管渗漏、出血和部分胚胎致死性，这是由丧失血管完整性和内皮细胞增殖、迁移和血管生成方面的缺陷所致(Wang等，2008)。 
总之，在血管生成的内皮细胞以及造血干细胞及其直接子代中，miR-126表达至生物学相关水平。有趣的是，miR-126的表达是内皮细胞和HSC共有的另一个因子。实际上，在胚胎发育期间，在卵黄囊中同时出现内皮细胞和造血细胞(红细胞)，以及在主动脉-生殖腺-中肾区(AGM)中相继出现HSC和内皮细胞，强调了这2种谱系的共同起源，即产生于所谓的“成血管细胞”细胞群。意料之中的是，有一个不断增加的已出现在HSC和转录因子和膜受体(例如Tie2受体、Sca-1、VEGFR-(Flt-1)、VEGFR-(Flk-1)和CD31)中的基因表，所述基因最初 被认为只在血管内皮中表达。 
考虑到在发育中和在成体骨髓中微血管系统和HSC之间功能和解剖关系，miR-126可有助于造血小生境的稳态，并调节其内皮和HSC组分两者的增殖。 
具有miRNA功能的miRNA调节的LV的干扰 
有关利用miRNA调节的一个顾虑是因过量表达含有miRNA靶序列的转录物而干扰天然miRNA靶标的调节的可能性。为了了解微小RNA调节的LV的生物学和安全性，我们定量测定了使miRNA活性饱和的剂量需要(Gentner等，2009)。测定敏感报道分子和天然miRNA靶标在用递增剂量的含有miRNA靶序列的转录物攻击细胞时的调节丧失，我们发现干扰生理的miRNA调节的阈值一般均高，并且当由强病毒启动子驱动表达时才可达到。从适中启动子(像磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子)表达的miRNA靶序列不会使miRNA活性饱和，即使在高载体拷贝数(高达50次整合)下。这就表明，当自中等启动子和自每个细胞的有限整合数表达miRNA调节的转录物时，可将miRNA调节安全地用于HSC基因治疗。然而，我们发现，可对慢病毒载体进行改造以谨慎地干扰miRNA活性，因此被用作表征miRNA功能的工具。 
当自强启动子过量表达miRNA靶序列时，我们证实了miRNA活性可以饱和，这导致了对该miRNA 126的天然靶标调节的丧失。此外，我们发现，通过改变我们的靶序列的设计，饱和作用可能是有利的。对于我们的基因调节的载体，例如本论文中描述的基因调节的载体，我们利用了最初导致mRNA转录物降解的完全互补的miRNA结合位点(参见图2c)，这与siRNA的作用方式类似(Brown等，2007)。当该过程以快速动力学发生时(Haley等，2004)，miRNA-RISC复合体实际上像具有高周转率的酶一样起作用，使之变得固有地难以饱和。另一方面，在将miRNA的核苷酸9和11之间的错配引入miRNA靶 序列时，转录物降解受损57，使miRISC/mRNA复合体转向最初也被动物细胞的天然miRNA利用的“翻译阻抑”途径。因为翻译抑制很可能以比降解慢的速度发生，所以我们证明了与完全互补的靶标相比，有缺陷的靶标在竞争性阻断miRNA活性方面得到更高的效率(Gentner等，2009)。重要的是，基于慢病毒载体的技术可供设计用于miRNA敲减的这类表达盒稳定整合到基因组中，因此代表了一个平台，这个平台允许用miRNA活性进行稳定干扰。我们成功开发出这项技术以获得miR-223的稳定敲减。给小鼠移植用miR-223敲减载体转导至高载体拷贝数的BM细胞，导致髓样细胞扩繁，这就表明了miR-223作为骨髓形成的负调节因子作用于粒细胞单核细胞前体。此外，我们在用含有miR-223敲减载体的BM重建的小鼠中发现了炎症性肺病理，这就表明miR-223在调节炎性髓样细胞中的额外功能(Gentner等，2009)。引人注目的是，这些小鼠表型模拟了最新描述的miR-223敲除小鼠品系(Johnnidis等，2008)。除遗传敲除以外，到目前为止，miRNA功能丧失研究限于以化学法修饰的miRNA反义分子(称为“antagomirs”)的瞬时转染(Krutzfeldt等，2005)。虽然有效，但其使用限于可被容易转染的细胞，这对于大多数初级细胞却不都如此。此外，敲减是暂时的，因此不容易应用于遗传模型系统。我们预期LV介导的稳定miRNA敲减将得到广泛应用。它们将构成研究miRNA的生理作用的重要工具。 
将微小RNA调节的载体应用于造血干细胞基因治疗 
我们在本项研究中描述的报道基因表达的模式也对基因治疗具有相关关联。大多数临床基因治疗构建体含有确保转基因在靶细胞类型中稳固表达的遍在表达启动子，但也会导致脱靶表达。这种异位表达可产生毒性、基因修饰细胞的反选择、引发针对转基因产物的免疫应答、甚至致癌性转化(Weil等，1997；Ott等，2006；Brown等，2006；Brown等，2007；Woods等，2006)。 
将miR-223靶序列加入递送至HSC的治疗转基因中可阻止在髓样细胞子代(包括粒细胞单核细胞祖细胞和至少HSC的亚级分)中表达。重要的是，这种策略可导致在淋巴系和红细胞谱系中进行完全治疗性表达。 
在HSPC强表达但不在髓系和淋巴系的分化子代表达的miR-126的鉴定，可供阻止可能有毒的转基因在敏感干细胞群中表达，同时在患病子代中保持表达和治疗功效。 
GALC从头表达的毒性 
酶替代治疗和基因治疗在LSD患者(Rohrbach等，2007；Brady等，2004)和动物模型(Biffi等，2006；Sano等，2005；Hofling等，2004；Sands等，1997)中的应用普遍证实了缺乏高于正常水平的溶酶体酶给予和表达的毒性。在异染性脑白质营养不良(MLD)的情况下，在mHSPC、hHSPC和转基因小鼠中，证实了LV介导的ARSA(在硫苷脂代谢中催化GALC的上游步骤)的过量表达的安全性(Biffi等，2004；Capontondo等，2007)，推动了对这种疾病的HSPC基因治疗的临床试验。在此，我们报道料想不到的发现，即在LV介导的GALC基因转移和表达后，鼠HSPC和人HSPC中出现明显毒性及体外和体内功能受损。GALC.LV转导的鼠HSPC显示集落形成潜力受损，不能植入受者和不能使清髓(myeloablated)移植受者进行长期种群重建。这与高转导HSPC的阴性选择和细胞凋亡有关。在用其中GALC表达受微小RNA调节的对照载体转导的鼠HSPC和人HSPC中观察到的细胞凋亡和功能受损的缺乏(Mechtcheriakova等；2007)(只在造血谱系细胞中表达)((Brown等，2006)，证实了表达的GALC在决定转导细胞死亡中的独特作用。 
分化细胞对GALC相关毒性较不敏感 
我们注意到造血谱系的分化细胞(淋巴细胞、单核细胞、巨噬细 胞和小胶质细胞)和其它谱系的细胞(少突胶质细胞以及神经祖细胞)(Gritti等，个人通信)不受LV介导的GALC过量表达的影响。因此，HSPC似乎对GALC介导的和鞘脂介导的细胞存活的控制具有独特的敏感性，这显然在分化成成熟髓样细胞、T细胞和B细胞时丧失，并且限于造血谱系。对此的一种可能的解释可能是与其它细胞类型(例如小胶质细胞或少突胶质细胞)相比，在HSPC中检出非常低的基础GALC活性。此外，鞘脂代谢的作用和Cer和衍生分子(例如So和S1P)的含量改变的结果可能随细胞类型和分化阶段改变。例如，对少突胶质细胞中胞内Cer蓄积的作用进行深入的研究，结论相互矛盾。最近的研究报道了负责从鞘磷脂降解中产生Cer的酸性鞘磷脂酶的诱导，导致Cer蓄积并诱导细胞凋亡(Chudakova等，2008)。在阿尔茨海默病中，相同的途径似乎参与由氧化应激或淀粉样蛋白β肽蓄积诱导的少突胶质细胞死亡(Jana等，2007；Lee等，2004)。然而，成熟少突胶质细胞也被描述为对一些诱导Cer蓄积的促凋亡刺激有抗性。同样，在其中观察到高水平的细胞凋亡的少突胶质细胞前体中，以及在似乎抵抗凋亡刺激的成熟少突胶质细胞中，观察到对促凋亡TNF刺激的不同反应(Scurlock等，1999)。成熟少突胶质细胞也对由给予IL-1诱导的细胞凋亡有抗性(Brogi等，1997)。这就表明了可根据在该特定细胞类型和在该特定分化阶段激活的途径，以不同方式对付胞内Cer的增加。据报道，通过酸性神经酰胺酶的高活性对付神经组织中胞内Cer的增加(Huang等，2004)支持这一设想。该酶催化Cer降解成So，So进而被磷酸化成S1P。S1P拯救细胞免于Cer诱导的细胞凋亡(Betito等，2006)，并诱导在神经祖细胞中的增殖(Harada等，2004)。可以假设类似机制负责降低少突胶质细胞对GALC过量表达相关的细胞凋亡的敏感性。鞘脂代谢途径在参与髓鞘形成以产生髓鞘鞘糖脂(GalCer和硫苷脂)的少突胶质细胞中也非常活跃。此外，这些分子参与形成glycosynapses的碳水化合物-碳水化合物相互作用(有关综述参见Boggs等，2008)。 
在单核细胞和巨噬细胞中观察到的对GALC从头表达诱导的细胞凋亡的敏感性的降低可通过神经酰胺酶的活性及其分泌作用两者来解释。报告指出在内皮细胞和免疫系统细胞中，Cer快速转化成So和S1P，其被分泌出。在血浆中，这些分子结合白蛋白，并起淋巴细胞上的特异性受体的信号的作用(有关综述参见78 142 143，Hannun等，2008；Mechtcheriakova等，2007；Rivera等，2008)。 
用于安全有效的GLD基因治疗的GALC表达的转录后调节 
转基因表达的调节在基因治疗领域是非常有益的。具体地讲，根据细胞类型和分化，由微小RNA(miRNA)引起的转录后调节的可能性，近来展现了调整转基因表达水平的新的前景(Gentner等，2008)。在本研究中，为了抑制GALC在HSPC(已被证实是对GALC过量表达毒性最敏感的细胞)中表达，同时允许酶在负责GALC分泌和少突胶质细胞的交叉纠正的分化细胞中过量表达，我们应用了这项革新技术。具体地讲，我们选择了据报告与外周血单核细胞相比，在HSPC中更高表达的微小RNA126 145。我们的数据表明，通过HSC特异性miRNA126对GALC表达的调节体外保护HSPC免于GALC从头诱导的细胞凋亡，且用GALC.miR126T.LV转导GALC-/-HSPC允许在其分化子代中以超生理水平重建酶活性，而又不损害多能祖细胞的集落形成潜力，正如CFC测定评价的一样。该数据证实，miRNA126仅在HSPC中而不在其分化子代中抑制GALC表达。在CFC测定中，未受影响的集落形成潜力可表明，GALC表达不仅仅在HSC中受阻抑，而且还在负责造血集落形成的多能祖细胞中受阻抑。 
此外，将GALC.miR126T.LV转导的HSPC移植入GALC+/-FVB/twi小鼠中，导致受治疗动物长期存活。该数据表明，在较原始的HSC中GALC活性受miRNA126抑制，使其长期种群恢复和分化潜力得到保持。HSCT后10周，在BM中存在高转导的细胞进一步证实了长期HSC被拯救而免于GALC过量表达的细胞凋亡。 
重要的是，由HSC特异性miRNA引起的转录后调节，允许使用强启动子(例如PGK)，从而达到转基因在分化HSPC子代中的相同表达水平，与用未调节的PGK_GALC.LV得到的一样。如上所述，尚不清楚作为有效的HSC基因治疗所需要的GALC表达水平。然而，即使低的酶表达水平可足以获得临床益处，更强启动子的使用可供减少载体拷贝数，却达到所需要的酶表达。这个问题可能切中HSC基因治疗的临床翻译的安全性。 
结论 
慢病毒载体平台代表了研究微小RNA功能的多方面和十分有用的工具。所开发的双向miRNA报道载体可供在复杂细胞混合物中以单一细胞水平测定miRNA活性，为常规miRNA表达概况分析方法增加了新的尺度。采用这种方法，我们以前所未有的分辨率仔细研究了若干miRNA在造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)群中的表达。改变启动子和miRNA靶标设计可形成能够实现稳定miRNA敲减的慢病毒载体，可用于产生功能丧失表型作为详尽说明miRNA的生理作用的基础。稳定的miRNA敲减后的蛋白组学分析可供鉴定在天然环境中调节该miRNA的关键靶标。 
除了克服这些基本的生物学问题以外，miRNA调节的载体还具有重要的治疗潜力。加到治疗性转基因的3′UTR后，miRNA靶序列可降低异位转基因表达，因此减少或避免了转基因毒性。具体地讲，基因疗法治疗必须不扰乱造血干细胞(HSC)生物学，因为HSC代表了通过持续供应基因修饰的子细胞进行长期疾病纠正的保证因素。本文表征的miRNA，即miR-126、miR-130a和miR-223在HSPC中限制不需要的转基因表达，同时允许它在分化子代中表达，并且可进一步开发成临床基因治疗方案。 
本文提及的各项申请和专利，以及上述各项申请和专利中引证或引用的各个文献包括各项申请和专利审查期间引证或引用的各个 文献(“申请引用的文献”)和各项申请和专利中及任何申请引用的文献中引证或提及的任何产品的任何生产商的说明书或目录，均通过引用特此结合到本文中。此外，本文引用的所有文献和本文引用文献中引证或引用的所有文献，以及本文引用或提及的任何产品的任何生产商的说明书或目录，均通过引用特此结合到本文中。 
在不偏离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。虽然结合具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当了解的是，要求保护的本发明不应不当地限于这类具体的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域的技术人员而言是显而易见的用于实施本发明的所述方法的各种修改，均意在权利要求书的范围内。 
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Claims (41)

1.一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血祖细胞(HSPC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSPC中表达但不防止或降低其在分化细胞中表达。
2.一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血干细胞(HSC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSC中表达但不防止或降低其在分化细胞中表达。
3.一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个与核苷酸序列有效连接的与选自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)的miRNA相应的miRNA序列靶标。
4.权利要求3的基因载体，其包含与mir-130a和mir-126相应的miRNA序列靶标。
5.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述核苷酸序列控制载体的表达。
6.权利要求1-5的基因载体，其中所述核苷酸序列是转基因。
7.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述载体是病毒载体。
8.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述载体可来源于慢病毒。
9.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述载体包含组织特异性启动子。
10.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述组织特异性启动子选自CD11b、c-Fes和CYBB和TEK。
11.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述转基因编码酶。
12.权利要求11的基因载体，其中所述酶选自溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶、gp91 phox和干扰素-α。
13.一组用于产生病毒载体颗粒的DNA构建体，包括编码可包装的病毒载体基因组的DNA构建体，所述DNA构建体包含至少一个权利要求1-5中任一项定义的miRNA序列靶标，并任选包含转基因。
14.一种用于制备病毒载体颗粒的方法，所述方法包括将权利要求13的DNA构建体组导入宿主细胞，并得到病毒载体颗粒。
15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞包含相应的miRNA。
16.一种病毒载体颗粒，其通过权利要求14或15的方法制备。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1-12或16中任一项的基因载体或颗粒。
18.一种细胞，所述细胞用权利要求1-12或16中任一项的基因载体或颗粒感染或转导。
19.权利要求18的细胞，所述细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
20.至少两个不同的与选自以下的miRNA相应的miRNA序列靶标的组合：mir-130a、mir-126、mir-223和126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)。
21.权利要求20的组合，其中所述miRNA序列靶标同时、单独或序贯使用。
22.权利要求1-12中任一项的载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于在造血干细胞或造血祖细胞中防止或降低转基因表达的药物中的用途。
23.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于治疗选自以下的疾病的药物中的用途：球形细胞脑白质营养不良、慢性肉芽肿病、重度联合免疫缺陷(SCID)和实体瘤。
24.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于提高与基因治疗相关的造血干细胞或造血祖细胞的存活机会的药物中的用途。
25.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于提高基因治疗的安全性和/或功效的药物中的用途。
26.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于防止造血干细胞或造血祖细胞的细胞凋亡的药物中的用途，其中所述细胞凋亡由转基因的表达引起。
27.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于监测造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的药物中的用途。
28.权利要求22-27中任一项的用途，其中所述药物用于造血细胞治疗。
29.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于防止或降低转基因在造血干细胞或造血祖细胞中表达。
30.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于治疗选自以下的疾病：球形细胞脑白质营养不良、慢性肉芽肿病、重度联合免疫缺陷(SCID)和实体瘤。
31.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于提高与基因治疗相关的造血干细胞或造血祖细胞的存活机会。
32.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于提高基因治疗的安全性和/或功效。
33.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于防止造血干细胞或造血祖细胞的细胞凋亡，其中所述细胞凋亡由转基因的表达引起。
34.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于监测造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段。
35.权利要求29-34中任一项的基因载体，其用于造血干细胞治疗。
36.与选自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)的miRNA相应的miRNA序列靶标在制备用于基因治疗的药物中的用途。
37.用于基因治疗的与选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列靶标。
38.测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中的miRNA的表达水平，其中所述miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中所述miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。
39.测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中的至少两种不同miRNA的表达水平，其中所述miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中所述miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达；和对不同miRNA的表达水平进行比较。
40.测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定转基因在所述造血干细胞或所述造血祖细胞中的表达水平，其中所述转基因与miRNA序列靶标有效连接，由此相应的miRNA防止或降低所述转基因在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中的表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。
41.权利要求38-40的方法，其中所述miRNA选自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)。
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