CN110785488A - 基因疗法 - Google Patents

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L.纳尔蒂尼
G.埃斯科巴尔
B.R.金特纳
A.穆西
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Ospedale San Raffaele SRL
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Abstract

包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中预防或治疗癌症的用途，其中所述载体包含与编码干扰素α(IFNα)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir‑130a和/或mir‑126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和/或肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞联用。

Description

基因疗法
发明领域
本发明涉及细胞因子基因疗法的用途，特别是干扰素(例如，干扰素α或γ)基因疗法任选地与免疫检查点抑制剂、肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞和/或1-甲基-色氨酸(1-MT)联用用于治疗或预防癌症的用途。
背景技术
由于其具有诱导长期缓解的潜力，使得免疫疗法最近引起了人们对于抗癌治疗的新兴趣。对癌细胞逃避免疫应答机制的了解不断加深，促进了针对免疫检查点的新疗法的发展，从而释放出免疫系统的威力1。在此前所认为的总是致命的肿瘤(如转移性黑色素瘤)中进行的临床测试中，这些药物产生了空前持久的应答率2,3。然而，尽管取得了这些进展，但是由于无法产生肿瘤特异性T细胞或存在免疫抑制性肿瘤微环境(其对经典负向检查点CTLA4或PD1/PDL14的阻断作用产生抗性)，使得大部分患者对这些疗法均无应答。
因此，目前努力的目标是鉴定新的免疫检查点靶点和开发联合疗法，这可能将免疫疗法的益处惠及更多肿瘤患者。在这一点上，使得对于将细胞因子(如干扰素(IFN))作为抗癌剂的兴趣再度升温5。除了对肿瘤细胞和血管的细胞抑制和抗血管生成作用以外，IFN(尤其是I型干扰素)增加树突状细胞(DC)的成熟和交叉激发能力，T细胞的增殖和细胞毒性，自然杀伤(NK)细胞的杀伤能力以及B细胞的免疫球蛋白类型转换6,7。我们此前报道的原理证明，在肿瘤浸润的移植的、经基因工程改造的造血干细胞(HSC)的单核细胞/巨噬细胞子代中选择性表达干扰素-α(IFNα)转基因的细胞和基因疗法策略能够激发抗肿瘤应答。这种肿瘤靶向IFNα递送策略在小鼠中未显示出全身毒性并抑制自发乳腺肿瘤的生长，以及分别抑制乳腺和结直肠癌细胞的肺转移和肝转移8–10。
另一种免疫治疗方法是表达转基因T细胞受体(TCR)的经基因工程改造的T细胞或针对肿瘤相关抗原(TAA)的嵌合抗原受体(CAR)的过继转移11,12。这种方法特别适于突变负担低，不能诱导针对TAA的内源性T细胞应答的恶性疾病。识别CD19抗原的CAR T细胞对复发难治性B细胞恶性疾病有显著疗效。然而，这些研究还表明，对淋巴结疾病的治疗效果不如骨髓(BM)疾病或白血病明显，表明免疫抑制微环境是成功进行免疫疗法的主要障碍，特别是在实体瘤方面。而且，在快速生长的肿瘤(如B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL))中，多达20％接受CD19 CAR T细胞治疗的患者发生抗原丢失，这说明针对单一抗原的免疫疗法存在局限性11,13。然而，关于白血病是否在同种异体移植背景之外诱导TAA特异性T细胞应答，以及是否可以将这种应答用于治疗目的的数据很少。
仍然需要改进的癌症疗法。本发明通过建立当通过基因疗法递送的细胞因子(如IFNα)与其他免疫疗法策略组合使用时可以实现改善的有效性来实现该需求。
发明内容
本发明人令人吃惊的发现通过基因疗法递送细胞因子(如干扰素)能够增强抗肿瘤应答的诱导、巩固和维持，并与其他免疫治疗策略具有协同作用，特别是使用免疫检查点抑制剂治疗和使用肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞治疗。
根据本发明的一个方面，提供了包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或单核细胞用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或单核细胞用于与肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述载体用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述载体用于与TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述载体用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述载体用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了表达CAR和/或转基因TCR的TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体。
根据本发明的另一个方面，免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予载体，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予载体，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用载体，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予载体的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述载体包括与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞的步骤，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用载体，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予载体的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了表达CAR和/或转基因TCR的TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码细胞因子的多核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的多核苷酸可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予多核苷酸的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞的步骤，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码细胞因子的多核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予多核苷酸的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞在患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述载体包括与编码I型干扰素(IFN)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了表达CAR和/或转基因TCR的TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过载体，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过载体，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过载体，所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予过载体，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用载体，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予载体的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述载体包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞的步骤，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用载体，所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述载体用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含载体的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予载体的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述载体包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素(IFN)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述多核苷酸包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了表达CAR和/或转基因TCR的TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了TAA特异性T细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了1-甲基-色氨酸(1-MT)用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了免疫检查点抑制剂和TAA特异性T细胞的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与免疫检查点抑制剂和/或a TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予多核苷酸的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述多核苷酸包含与编码I型干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用TAA特异性T细胞的步骤，和/或向所述患者施用免疫检查点抑制剂的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，所述多核苷酸包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中将所述多核苷酸用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予包含多核苷酸的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述多核苷酸包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于在此前已给予多核苷酸的患者中治疗和/或预防癌症的方法，所述多核苷酸包含与编码干扰素的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括向所述患者施用1-甲基-色氨酸(1-MT)的步骤。
在一个实施方式中，所述TAA特异性T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或转基因T细胞受体(TCR)。在一个实施方式中，所述TAA特异性T细胞表达CAR。在一个实施方式中，所述TAA特异性T细胞表达转基因TCR。
因而，本发明可以使用经工程化改造的T细胞以表达TAA特异性CAR或TCR。
在一个实施方式中，细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一个实施方式中，细胞因子是干扰素(IFN)。优选地，细胞因子是I型干扰素或II型干扰素。
在一个优选的实施方式中，细胞因子是IFNα。
在另一个优选的实施方式中，细胞因子是干扰素-γ(IFNγ)。
在一个实施方式中，I型干扰素是干扰素-α(IFNα)或干扰素-β(IFNβ)。
在一个实施方式中，I型干扰素是IFNα。
在一个实施方式中，I型干扰素是IFNβ。
在一个实施方式中，II型干扰素是干扰素-γ(IFNγ)。
在一个实施方式中，提供了本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于在患者中预防癌症复发的用途。
在一个实施方式中，提供了本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于在患者中预防癌症进展的用途。
在一个实施方式中，所述TAA选自以下任意一种或多种：癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕激素受体、肝配蛋白B2、ROR1、间皮素、c-Met、GD-2、MAGE A3 TCR、4-1BB、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD152、CD200、CD22、CD19、CD22、CD123、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD4、CD40、CD44、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CS-1、CNT0888、CTLA-4、DR5、EpCAM、CD3、纤连蛋白额外域-B、叶酸受体1、糖蛋白75、GPNMB、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、肌腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、5T4、CD5、CD19、CD20、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、CAMPATH-1(CDw52)、HLA-DR、抗-独特型、TAG-72、Ep-CAM、MUC1、叶酸结合蛋白、A33、G250、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、铁蛋白、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2)、Ley、CA-125、CA19-9、表皮生长因子受体(EGFR)、p185HER2、IL-2受体、de2-7 EGFR、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白、金属蛋白酶、内皮素、碳酸酐酶、半乳凝素9、缩醛酶A、eIFγ4、酪氨酸酶、半乳凝素4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、休眠蛋白、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、b-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CT、Cyp-B、DAM-6(MAGE-B2)和DAM-10(MAGE-B1)、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、蛋白1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2和WT1。
在一个实施方式中，TAA是CD19。
在一个优选的实施方式中，TAA特异性T细胞表达CD19特异性CAR。
在一个实施方式中，TAA特异性T细胞来源于从患者中分离的细胞。
在一个实施方式中，已对TAA特异性T细胞进行工程化改造，以破坏至少一个内源性基因，优选地其中所述至少一个内源性基因选自编码TCRα链、TCRβ链和主要组织相容性复合物(MHC)的内源性基因。
在一个实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗体，优选地其中免疫检查点抑制剂抗体选自下组：抗-CTLA4抗体、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-PDL2抗体和抗-LAG-3抗体。
在一个实施方式中，载体包含至少一个mir-130a靶序列和至少一个mir-126靶序列，优选地载体包含两个mir-130a靶序列和两个mir-126靶序列。
在一个实施方式中，在本发明中使用的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞包含至少一个mir-130a靶序列和至少一个mir-126靶序列，优选地在本发明中使用的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞包含两个mir-130a靶序列和两个mir-126靶序列。
载体或多核苷酸还可以包含与编码细胞因子(例如，I型干扰素)的核苷酸序列可操作地连接的组织特异性启动子。优选的组织特异性启动子是TEK(Tie2)启动子。
在一个实施方式中，癌症是血液系统恶性疾病或实体瘤，优选地其中所述血液系统恶性疾病选自下组：急性髓性白血病(AML)、淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性肿瘤(MPN)、原发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、非典型慢性髓性白血病、慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤；或者优选地其中所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
在一个实施方式中，癌症是由原发性肿瘤转移的。
在一个实施方式中，本发明中使用的细胞是包含载体或多核苷酸的HSC，其中所述载体或所述多核苷酸包含与编码细胞因子(例如，I型干扰素)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
在一个实施方式中，本发明中使用的细胞是包含载体或多核苷酸的HPC，其中所述载体或所述多核苷酸包含与编码细胞因子(例如，I型干扰素)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
在一个实施方式中，本发明中使用的细胞是包含载体或多核苷酸的髓系/单核细胞定型祖细胞，其中所述载体或所述多核苷酸包含与编码细胞因子(例如，I型干扰素)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
在一个实施方式中，本发明中使用的细胞是包含载体或多核苷酸的巨噬细胞，其中所述载体或所述多核苷酸包含与编码细胞因子(例如，I型干扰素)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
在一个实施方式中，本发明中使用的细胞是包含载体或多核苷酸的单核细胞，其中所述载体或所述多核苷酸包含与编码细胞因子(例如，I型干扰素)的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列。
根据本发明的另一个方面，提供了包含含有与编码第一细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体和含有与编码第二细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述第一和第二细胞因子是不同的。
根据本发明的另一个方面，提供了使用包含含有与编码第一细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体和含有与编码第二细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体转导的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的群用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述第一和第二细胞因子是不同的。
在一个实施方式中，所述第一细胞因子是在第一载体上编码的和所述第二细胞因子是在第二载体上编码的。在一个实施方式中，所述第一和第二细胞因子是在同一载体上编码的。
根据本发明的另一个方面，提供了包含与编码第一细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的多核苷酸和包含与编码第二细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的多核苷酸的组合用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述第一和第二细胞因子是不同的。
在一个实施方式中，所述第一细胞因子是在第一多核苷酸上编码的和所述第二细胞因子是在第二多核苷酸上编码的。在一个实施方式中，所述第一和第二细胞因子是在同一多核苷酸上编码的。所述多核苷酸可以是例如载体形式。
在一个实施方式中，所述第一和第二细胞因子分别独立地选自干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)，
在一个实施方式中，所述第一和第二细胞因子分别独立地选自下组：I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)、II型IFN(优选地IFNγ)和TNFα。
在一个实施方式中，所述第一和第二细胞因子分别独立地选自下组：IFNα、IFNβ、IFNγ和TNFα。
在一个实施方式中，所述第一细胞因子是IFNα和所述第二细胞因子是IFNγ。
在一个实施方式中，所述第一细胞因子是IFNα和所述第二细胞因子是TNFα。
在一个优选的实施方式中，所述第一细胞因子是IFNγ和所述第二细胞因子是TNFα。
根据本发明的另一个方面，提供了包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述细胞因子是干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)。
根据本发明的另一个方面，提供了载体用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述细胞因子是干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)。
根据本发明的另一个方面，提供了多核苷酸用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述多核苷酸包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述细胞因子是干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)。
在一个实施方式中，所述IFN是II型IFN(优选地IFNγ)或I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)。
在一个实施方式中，所述细胞因子是IFNγ。在一个实施方式中，所述细胞因子是IFNα。在一个实施方式中，所述细胞因子是IFNβ。
附图说明
图1：通过诱导OVA特异性CD8+T细胞在IFN小鼠中抑制OVA-ALL生长。
a，用于工程化HSC并产生自发性B-ALL的慢病毒载体(LV)的示意图。b，实验设计。c，在CTRL(n＝10，给予同种型对照抗体)、IFN(n＝10，给予同种型对照抗体)、CTRL+aCTLA4(n＝14)和IFN+aCTLA4(n＝13)小鼠的外周血(PB)中随着时间的推移亲本ALL的绝对数量(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法。d，e，f在IFN(n＝15)和CTRL(n＝15)小鼠的随着时间的推移的PB(d)中以及BM和脾脏(e，f；肿瘤注射后14天)中OVA-ALL(如上所示，采用NGFR/OVA双向工程化改造)的绝对数量(平均值±SEM)(显示了9次实验中的1次)。每个点代表一只小鼠。****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法(d)；*p<0.05，**p<0.01，Mann-Whitney(e,f)。g，通过针对使用NGFR-OVA或NGFR-CD20 BdLV转导的EL4靶细胞系的IFNg-ELISPOT检测的，来自肿瘤注射后13天的IFN小鼠或来自未荷瘤CTRL(天然C57Bl/6，n＝1)小鼠的脾脏CD8+T细胞。每个点代表一只小鼠，平均值±SEM。低肿瘤负荷(n＝5)：5.2±4.9(平均值±SEM)％OVA-ALL；中肿瘤负荷(n＝1)：33％OVA-ALL；高肿瘤负荷(n＝6)：51±4.9％OVA-ALL。h，在IFN(n＝14-6)和CTRL(n＝15-8)小鼠中特异性T细胞的百分比(平均值±SEM)。**p<0.01，在OVA-ALL注射后9天后进行的Mann Whitney。每个点代表一只小鼠。将转基因OT-I小鼠的T细胞作为阳性对照(未显示)。i，j，在来自3次独立实验的IFN(n＝23)和CTRL(n＝26)小鼠中肿瘤注射9天后在BM(i)和脾脏(j)中OVA特异性T细胞的绝对数量(平均值±SEM)。**p<0.01，***p<0.001，Mann-Whitney。每个点代表一只小鼠。k，采用与在(g)中一样的方法检测的来自肿瘤注射后9天的IFN(n＝7)和CTRL(n＝8)小鼠或来自未荷瘤小鼠的脾脏CD8+T细胞。将来自OT-I小鼠的刀豆蛋白A(ConA)刺激的T细胞(未显示)作为阳性对照。每个点代表一只小鼠。l，m，在IFN(n＝9)、CD8耗竭的IFN(n＝7)和CTRL(n＝9)小鼠的PB中OVA-ALL的百分比(l)和绝对数量(m)(平均值±SEM)。**p<0.01，****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法(l)；*p<0.05，****p<0.0001，使用经Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis(m)。
图2：在IFN小鼠中过继转移OT-I T细胞的扩增以及含有OVA-ALL。
a，b，实验设计(a)以及在IFN(n＝7)或CTRL(n＝7)小鼠中OVA-ALL生长随时间的变化情况(b，在PB中的百分比；平均值±SEM)。c，OT-I过继转移后3天在IFN(n＝7)、CTRL(n＝7)和未荷瘤(C57Bl/6无肿瘤，n＝3)小鼠的BM和脾脏中OTI T细胞的绝对数量(平均值±SEM)。*p<0.05，**p<0.01，Mann-Whitney。每个点代表一只小鼠。d，来自(c)过继转移后3天小鼠BM和脾脏的OT-I T细胞内天然(CD44-CD62L+)、中央记忆(CD44+CD62L+)和效应记忆(CD44+CD62L-)细胞的百分比(平均值±SEM)。**p<0.01，非参数组合检验。e，f，实验设计(e)以及OVA-ALL注射CTRL(n＝12)、IFN+OT-I(n＝9)和CTRL+OT-I(n＝10)小鼠的存活曲线(f)。*p<0.05，****p<0.0001，通过Bonferroni检验校正p值的Mantel-Haenszel检验。g，在来自(f)的CTRL+OT-I和IFN+OT-I以及未荷瘤C57Bl/6小鼠(n＝3)的PB中，随着时间的推移，过继转移OT-I T细胞的绝对数量(平均值±SEM)。长期存活小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。h，在来自(f，g)小鼠的PB中OT-I T细胞上表达Lag3的百分比(平均值±SEM)。每条线代表一只小鼠。
图3：在IFN小鼠中ISG/Th1启动基因标签以及增加经典巨噬细胞和M1偏向。
a，火山图显示了在OVA-ALL攻击前后在IFN和CTRL小鼠的BM和脾脏中一系列癌症免疫基因表达的变化情况。水平虚线表示显著性阈值(FDR<0.05)。垂直虚线表示相对于CTRL小鼠表达增加/减少2倍的基因。ISG用橙色表示，Th1和T细胞活化基因用浅蓝色表示，IFN和Th1应答共有基因用绿色表示，巨噬细胞和DC活化基因用红色表示，NK细胞活化基因用紫色表示，抗原加工基因用蓝色表示，白血病相关基因用灰色表示。门控插图在右侧放大显示。每个样品n＝3只小鼠，但是CTRL BM+ALL，n＝2。b，对来自肿瘤注射9天后注射OVA-ALL的IFN(n＝6)和CTRL(n＝5)小鼠和来自未荷瘤C57Bl/6小鼠的脾脏CD4+T细胞中所示Th1基因(与注射OVA-ALL的小鼠相比的平均变化倍数±SEM)的RT-qPCR表达分析。每个点代表一只小鼠。*p<0.05，Mann-Whitney。c，在OVA-ALL注射前后(12天)在IFN(n＝11)和CTRL(n＝13)小鼠的PB中所示髓系群的百分比(平均值±SEM)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。在每个单独的髓系细胞群中进行统计学分析。
图4：可诱导持久的抗癌应答并且当与免疫检查点疗法联用时进一步改善存活的IFN细胞和基因疗法。
a，b，c，d在使用所示ALL细胞进行首次(a；n＝11，13；*p<0.05，Mantel-Haenszel检验)和随后的肿瘤攻击后，注射OVA-ALL的IFN和CTRL小鼠的存活曲线(b：来自(a)的n＝3只长期存活的IFN小鼠对比4只天然小鼠；c：来自(a，b)的同样3只存活的小鼠对比4只天然小鼠；d：来自(a，b，c)的3只存活小鼠中的2只对比4只天然小鼠)。e,实验设计。f，g，注射OVA-ALL的(f)IFN(n＝14)、CTRL(n＝14)、IFN+aCTLA4(n＝14)和CTRL+aCTLA4(n＝15)小鼠的存活曲线，*p<0.05，***p<0.001，Mantel-Haenszel检验，通过Bonferroni法校正p值；和(g)IFN+aCTLA4(n＝10)和CTRL+aCTLA4(n＝12)小鼠，*p<0.05，Mantel-Haenszel检验。h，通过针对使用NGFR-OVA或NGFR-CD20 BdLV或PGK-OFP或PGK-tTA LV转导的EL4靶细胞系的IFNg-ELISPOT检测的，来自肿瘤注射后51天的(f)(IFN n＝3，CTRL n＝1，IFN+aCTLA4 n＝4，CTRL+aCTLA4 n＝3)的存活小鼠和来自未荷瘤(OT-I，n＝1和移植的CTRL小鼠，n＝2)小鼠的PBMC。虚线表示在EL4 NGFR靶细胞中可见的较高中位背景水平。每个点代表一只针对所有4个TAA进行检测的小鼠。i，来自(f)OVA-ALL注射前(箭头起点，T0)和第二次肿瘤再攻击后4天(箭头的尖端，T2)存活小鼠(每个箭头代表一只小鼠)TCR-βCDR库的克隆性和相似性。j，在肿瘤注射后19天，通过与(h)中一样的IFNg-ELISPOT检测的来自(g)(IFN+αCTLA-4存活者，实心蓝色标记，n＝3；CTRL+αCTLA-4存活者，实心红色标记，n＝1；IFN+αCTLA-4无应答者，空心蓝色标记，n＝7；CTRL+αCTLA-4，空心红色标记，在12个无应答者对照中n＝8)的小鼠的PBMC。每个点代表一只针对所有4个TAA进行检测的小鼠。k，基于通过(j)中所示的IFNg-ELISPOT测定评估的其免疫反应性层化的来自(g)的小鼠的存活曲线。与2个或更多个抗原反应的小鼠用红色表示；与1个抗原或不与抗原反应的小鼠用黑色表示。值得注意的是，针对OVA和NGFR的反应性为1，因为其表达是由在BdLV中存在的双向启动子共同调控的。
图5：与亲本ALL相比经工程改造的OVA-ALL显示出增加的免疫原性。
a，用于产生OVA-ALL的双向LV(BdLV)的示意图，其代表性图显示了纯化OVA-ALL上的NGFR表达。b，用于鉴定在注射肿瘤小鼠的PB中的ALL上表达的B-ALL(CD19+OFP+)和NGFR的门控策略。c，上图：在免疫功能正常C57Bl/6(n＝5)和免疫缺陷NSG(n＝6)小鼠PB中OVA-ALL的百分比(平均值±SEM)以及在免疫功能正常C57Bl/6(n＝5)小鼠PB中亲本PB的百分比(平均值±SEM)。下图：在免疫功能正常C57Bl/6(n＝5)和免疫缺陷NSG(n＝6)小鼠PB中ALL上存在的NGFR标记物的表达情况。值得注意的是，NGFR和OVA抗原的表达由BdLV中存在的双向启动子共同调节。d，e，处死时在免疫功能正常C57Bl/6(n＝5)(d)和免疫缺陷NSG(n＝6)小鼠(e)BM中存在的白血病细胞上OVA-ALL和表达的NGFR标记物的百分比(平均值±SEM)。
图6：在IFN小鼠中抑制OVA-ALL生长以及抑制OVA特异性T细胞。
a，用于鉴定OVA特异性CD8+T细胞的门控策略。b，c，d，肿瘤注射9天后，在IFN(n＝14-6)和CTRL(n＝15-8)小鼠的PB(b)以及BM和脾脏(c，d)中OVA-ALL的百分比(b)和绝对数量(c，d)(平均值±SEM)。***P<0.001，Mann-Whitney。每个点代表一只小鼠。e，肿瘤攻击9天后，在IFN(n＝9)、CD8耗竭的IFN(n＝7)和CTRL(n＝9)小鼠PB中OVA-ALL的百分比。每个点代表一只小鼠。*p<0.05，***p<0.001，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。
图7：用于评估OVA-ALL凋亡、细胞周期和增殖速率的门控策略。
a，b，肿瘤注射9天后，在IFN(n＝11)和CTRL(n＝15)小鼠BM和脾脏中存在的早期凋亡(Annexin+7-AAD-)、晚期凋亡(Annexin+7-ADD+)、死亡/坏死(Annexin-7AAD+)和活(Annexin-7-AAD-)OVA-ALL细胞的门控策略(a)和分析(b)(百分比，平均值±SEM)。*p<0.05，Mann-Whitney。c，d，肿瘤注射9天后，在IFN(n＝11)和CTRL(n＝15)小鼠BM和脾脏中在细胞周期的G0(Ki67-Hoechst低)、G1(Ki67+Hoechst低)和S-G2-M(Ki67+Hoechst高)期OVA-ALL分布情况的门控策略(c)和分析(d：百分比，平均值±SEM)。e，f，肿瘤注射后9天，在IFN(n＝11)和CTRL(n＝15)小鼠BM和脾脏中增殖EdU+ALL细胞的门控策略(e)和分析(f：百分比，平均值±SEM)。**p<0.01，Mann-Whitney。
图8：在注射OVA-ALL的CTRL、IFN小鼠以及未荷瘤C57Bl/6小鼠中OT-I T细胞的过继转移。
a，OT-I过继转移后的所示时间，在CTRL(n＝7)和IFN(n＝7)小鼠中OVA-ALL的绝对数量(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。b，OT-I T细胞过继转移后3天，在IFN(n＝7)、CTRL(n＝7)和未荷瘤(无肿瘤C57Bl/6，n＝3)小鼠BM和脾脏中OT-I T细胞上Lag3的表达情况。每个点代表一只小鼠。c，用于鉴定在来自(a，b)小鼠BM和脾脏中存在的过继转移的OT-IT细胞(CD45.2+)和OT-I T细胞上Lag3表达情况的门控策略。首先通过OFP-CD8+T细胞门控排除OVA-ALL细胞。将CD45.1和CD45.2标记物用于区分来源于射线耐受受体的CD8+T细胞(CD45.1+)、来源于供体的CD8+T细胞(CD45.1.2+)和过继转移的OT-I T细胞(CD45.2+)。在未荷瘤小鼠中，将过继转移的OT-I T细胞定义为CD8+T细胞并通过门控CD45.2+CD8+T细胞将其与来源于CD8+受体的T细胞(CD45.1+)相区分。d，用于鉴定幼稚(CD62L+CD44-)、中央记忆(CD62L+CD44+)和效应记忆(CD62L-CD44+)过继转移OT-I T细胞的门控策略。如(c，首先通过门控CD19-CD8+T细胞排除CD19-CD8+T)中所述鉴定OT-I T细胞。e，f，OT-I T细胞过继转移后3天，在来自(a，b)所示小鼠的BM和脾脏中OVA-ALL的绝对数量(e)(平均值±SEM)和ALL上NGFR标记物的表达情况(f)。每个点代表一只小鼠。**p<0.01，***p<0.001，Mann-Whitney(e)。
补充图6：在纯化的脾脏CD4+T细胞中原型Th2和Treg基因的基因表达和分析。
a，在从肿瘤注射9天后注射OVA-ALL的IFN(n＝6)和CTRL(n＝5)小鼠以及从未荷瘤天然C57Bl/6小鼠中纯化的脾脏CD4+T细胞中，所示Th2和Treg基因(与注射OVA-ALL的CTRL小鼠相比的平均变化倍数±SEM)的RT-qPCR表达分析。每个点代表一只小鼠。
图9：在IFN小鼠中过继转移OT-I T细胞的扩增以及含有OVA-ALL。
a，b，c，d，在IFN+OT-I(n＝9，a，c)和CTRL+OT-I(n＝10，b，d)小鼠PB(a，b)和BM(c，d)中ALL细胞和ALL细胞上NGFR标记物表达情况的百分比(平均值±SEM)。长期存活小鼠用绿色表示。值得注意的是，对于根治白血病的存活小鼠未显示NGFR表达情况。每只单独的小鼠用单独的点(b，d)或线(a，b)表示。e，f，在来自(a，b，c，d，CTRL+OT-I，n＝8；IFN+OT-I，n＝3)的处死荷瘤小鼠的BM、脾脏和淋巴结中幼稚(CD62L+CD44-)、中央记忆(CD62L+CD44+)和效应记忆(CD62LCD44+)OT-I T细胞的百分比(平均值±SEM)。f，在(e)中所示小鼠的BM、脾脏和淋巴结中存在的OT-I T细胞上PD1表达情况的百分比(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。
图11：在荷瘤和未注射肿瘤IFN和CTRL小鼠的PB和脾脏中髓系细胞的流式细胞术分析。
a，b，c，肿瘤注射10天后，在无肿瘤和注射OVA-ALL的IFN和CTRL小鼠(CTRL：n＝3，IFN n＝2，CTRL+ALL：n＝9，IFN+ALL：n＝7)的脾脏中髓系细胞群的门控策略(a)和分析(b，绝对数量，平均值±SEM)。将巨噬细胞(MF)鉴定为CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+细胞并且使用IAb(MHC II)标记物将其进一步区分为MHC-II+MF和MHC-II-MF。我们将CD19-F4/80-CD11c+MHCII-髓系细胞与CD19-F4/80-CD11c+MHCII+树突状细胞加以区分。我们将粒细胞定义为CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+，将经典单核细胞定义为CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G-和将非经典单核细胞定义为CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C-Ly6G-。**p<0.01，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。对每个单独的髓系群进行统计分析。d，在来自(c)的无肿瘤或荷瘤IFN和CTRL小鼠中存在的MHC-II巨噬细胞的百分比。**p<0.01，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。
图12：在荷瘤和未注射肿瘤IFN和CTRL小鼠的BM和脾脏中的BM和调节性T细胞中的髓系细胞的流式细胞术分析。
a，b，肿瘤注射后10天，在无肿瘤和注射OVA-ALL的IFN和CRTL小鼠(CTRL：n＝3，IFN：n＝2，CTRL+ALL：n＝9，IFN+ALL：n＝7)的BM中髓系细胞群的门控策略和分析(绝对数量，平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。将巨噬细胞(MF)鉴定为CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+细胞，将树突状细胞(DC)鉴定为CD19-F4/80-CD11c+MHCII+，将粒细胞鉴定为CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+，将经典单核细胞鉴定为CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G-和将非经典单核细胞鉴定为CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6CLy6G-。*p<0.05，**p<0.01，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。对每个单独的髓系群进行统计分析。c，d，在来自(b)的无肿瘤和注射OVA-ALL的IFN和CTRL小鼠BM和脾脏中调节性T细胞的门控策略(c)和分析(d，绝对数量，平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。将调节性T细胞定义为CD3+CD4+CD25+FoxP3+。**p<0.01，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。对每个单独的组织进行统计分析。
图13：在荷瘤和未注射肿瘤IFN和CTRL小鼠的脾脏中NK和NKT细胞的流式细胞术分析。
a，b，肿瘤注射10天后，在无肿瘤或注射OVA-ALL的IFN和CTRL小鼠(CTRL：n＝3，IFN：n＝2，CTRL+ALL：n＝9，IFN+ALL：n＝7)的脾脏和BM中NK和NKT细胞的门控策略(a)和分析(b，绝对数量，平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。将NK细胞鉴定为CD19-CD3-NK1.1+和将NKT细胞鉴定为CD19-CD3+NK1.1+。使用CD11b和CD27标记物，我们进一步区分了最不成熟的(CD11b-CD27+)、成熟且细胞毒性最高和细胞因子产生最多的(CD11b+CD27+)，以及成熟且细胞毒性较低和细胞因子产生较少的(CD11b+CD27-)NK细胞。**p<0.01，***p<0.001，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。对每个单独的群进行统计分析。c，在来自(b)的无肿瘤或荷瘤IFN和CTRL小鼠的脾脏(上图)和BM(下图)中所示NK细胞亚群的百分比(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。d，e，在来自(b)的小鼠的脾脏(d)和BM(e)中存在的CD11b+CD27+(d)和CD11b+CD27-(d，e)NK细胞上表达的NKG2D和NKp46的百分比(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。*p<0.05，**p>0.01，使用通过Dunn检验校正的p值的Kruskall-Wallis。对每个单独的群进行统计分析。
图14：由OVA特异性T细胞施加的免疫压力导致小鼠中OVA阴性ALL细胞的免疫选择。
a，在每只单独的IFN(n＝11)和CTRL(n＝13)小鼠的PB中OVA-ALL的百分比(平均值±SEM)。每条线代表一只小鼠。b，在显示出加速或延迟病程(加速病程：CTRL：13-29天(范围)，20.4±1.3(平均值±SEM)，n＝11；IFN：16-27天，20.8±1.8，n＝5；延迟病程：CTRL：34-44天，39±5，n＝2；IFN：34-100天，56±22，n＝3)的IFN(n＝8)和CTRL(n＝13)小鼠的PB中OVA特异性T细胞(每条线代表一只小鼠)的BM浸润ALL(或者无法进行BM分析的那些小鼠的PB循环ALL)上的NGFR表达和绝对数量(平均值±SEM)。c，在长期存活IFN(n＝3)小鼠的PB中，OVA特异性T细胞的绝对数量(平均值±SEM)。每条线代表一只小鼠。d，使用OVA-ALL进行二次肿瘤攻击后14天，来自图4b的存活IFN小鼠(n＝3)对比4只天然小鼠的OVA特异性T细胞的百分比(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。e，代表性图显示了在注射至小鼠体内之前将OVA-ALL和亲本ALL细胞按照1:1比例混合。
图15：在单独小鼠中的白血病生长动力学。
a，b，在每只单独的(a)IFN(n＝14)、CTRL(n＝14)、IFN+aCTLA4(n＝14)和CTRL+aCTLA4(n＝15)小鼠和(b)IFN+aCTLA4(n＝10)和CTRL+aCTLA4(n＝12)小鼠PB中的OVA-ALL百分比(平均值±SEM)。每条线代表一只小鼠。
图16：在给予CTLA4的IFN和CTRL小鼠中OVA阴性ALL细胞的免疫选择增强。
a，在显示出加速、延迟病程或长期存活的IFN(n＝14)、CTRL(n＝14)、IFN+aCTLA4(n＝14)和CTRL+aCTLA4(n＝15)小鼠的PB中OVA特异性T细胞(每条线代表一只小鼠)的BM浸润ALL(或者无法进行BM分析的那些小鼠的PB循环ALL)上的NGFR表达和绝对数量(平均值±SEM)。加速病程：CTRL：14-21天(范围)，15.66±0.8(平均值±SEM)，n＝12；IFN：17-25天，21±1.3，n＝8；CTRL+CTLA4：14-21天，19±1.2，n＝6；IFN+CTLA4：25天，25±0，n＝2；延迟病程：CTRL：36天，n＝1；IFN：30-36天，34±2，n＝3；CTRL+CTLA4，30-64天，42±7.4，n＝5；IFN+CTLA4：25-64天，44±4.9，n＝7。b，在来自(a)的小鼠的PB中，CD8+T细胞中的OVA特异性T细胞的百分比。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法。c，在OVA-ALL注射前(箭头起点，T0)和OVA-ALL攻击后30天时(箭头尖端，T1)，来自图4f的无肿瘤长期存活小鼠(每个箭头代表一只小鼠)TCR-βCDR库的克隆性和相似性。
图17：IFN基因疗法通过激活适应性免疫抑制ALL生长。
在CTRL(n＝10，给予同种型对照抗体)、IFN(n＝10，给予同种型对照抗体)、CTRL+αCTLA4(n＝14)和IFN+αCTLA4(n＝13)小鼠的外周血(PB)中，随着时间的推移，亲代ALL的绝对数量(平均值±SEM)。每个点代表一只小鼠。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法。
图18：IFN基因疗法在TME中利用了免疫刺激程序。
在来自CTRL+ALL(n＝7)和IFN+ALL(n＝8)小鼠的BM中，在MHC-I分子上提呈免疫优势OVA(SINFEKL)肽的DC百分比。*p<0.05Mann-Whitney检验。
图19：通过IFN基因疗法对白血病TME进行转录重编程。
a，b，火山图(左图)显示了荷瘤小鼠(ALL)对比对照(CTRL)小鼠(a)或给予(IFN+ALL)或不给予(ALL)IFN基因疗法的ALL小鼠脾脏巨噬细胞中差异表达的上调(绿色)或下调(橙色)的基因(绝对log2FC>1.5，FDR<0.05)。条形图(右图)显示了在所示比较中在上调(绿色)或下调(橙色)基因中富集的GO项。c，d，在ALL小鼠(c)的巨噬细胞中或在IFN+ALL小鼠(d)诱导的ISG中失控基因的选定RNA-Seq快照。e，f，结合了来自10,821CD11b+细胞的scRNA-Seq数据的tSNE图，这些细胞是从给予或不给予IFN基因疗法的CTRL或ALL小鼠脾脏中分选的。图例中的数字和颜色表示转录定义的聚类和相关细胞类型(e)。在来自基于实验条件着色的聚类1(非经典单核细胞)的细胞中的单细胞RNA-Seq数据(f)。g，来自所示比较的聚类1(非经典单核细胞)的scRNA-Seq数据中上调(绿色)或下调(橙色)的前100个基因(通过log2FC排序)富集的GO项。h，在所示条件下选定基因的非经典单核细胞中的平均表达(对数转化的TPM值，针对细胞数进行归一化)。i，子聚类后，来自聚类1(非经典单核细胞)的scRNA-Seq数据的最小生成树(MST)分析。每个饼图代表一个子聚类，并显示了其大小(细胞数)和组成(实验条件)。用星号标记的饼图表示组成分散的次要子聚类。
图20：IFN基因疗法促进过继转移的CAR19转导T细胞的激活并增强存活。
a，b，实验设计(a)和在CTRL+CTRLT(n＝5)、IFN+CTRLT(n＝5)、CTRL+CART19(n＝7)、IFN+CART19(n＝7)中随着时间的推移ALL的生长情况(b，在PB中的绝对数量；平均值±SEM)。****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法。c，在来自(b)的小鼠PB中，CD8+NGFR+CART19细胞上Lag3表达情况的百分比(平均值±SEM)。长期存活的小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。d，e，实验设计(d)和在CTRL+CTRLT(n＝7)、IFN+CTRLT(n＝6)、CTRL+CART19(n＝7)、IFN+CART19(n＝6)、CTRL+iCART19(n＝7)、IFN+iCART19(n＝6)、IFN+CTRLT后期(n＝6，后期介入试验)、IFN+iCART19后期(n＝6，后期介入试验)中随着时间的推移ALL的生长情况(e，在PB中的绝对数量；平均值±SEM)。****p<0.0001，针对在析因实验中的纵向数据的基于非参数秩的方法。在选定的组中进行统计分析(参见补充的在线表9和10)。f，在来自(b)的小鼠PB中CD8+NGFR+CART19细胞上随着时间的推移Lag3表达情况的百分比(平均值±SEM)。将CTRL+CART19和CTRL+iCART19小鼠在一起作图。长期存活的小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。g，来自(b和e)的给予CART19或iCART19细胞的小鼠的存活曲线。来自图20的给予CART19和iCART19的CTRL小鼠。b，e是CTRL+i/CART19(n＝21)、IFN+CART19(n＝13)、IFN+iCART19(n＝6)、IFN+iCART19后期(n＝6)在一起作图。****p≤0.0001，通过Bonferroni法校正p值的Mantel-Haenszel检验。
图21：与亲本ALL相比经工程改造的OVA-ALL显示出增加的免疫原性。
注射ALL的CTRL(n＝10，给予同种型对照抗体)、IFN(n＝10，给予同种型对照抗体)、CTRL+αCTLA4(n＝14)和IFN+αCTLA4(n＝13)小鼠的存活曲线。**p<0.01，Mantel-Haenszel检验。
图22：在脾脏巨噬细胞中的批量RNA-Seq分析。
a，箱形图显示了与ALL对照相比在来自给予IFN基因疗法的ALL小鼠(IFN+ALL)的巨噬细胞中上调(n＝213)或下调(n＝258)基因在所示条件下的表达水平。数字表示在所示比较中Wilcoxon符号秩检验。b，来自所示条件的巨噬细胞中RNA-Seq数据集之间相关性的热图。数字表示计算的决定系数(R2)。基于无监督分层聚类对样品进行排序。
图23：来自脾脏CD11b+细胞的scRNA-Seq数据中的细胞类型鉴定。
a，tSNE图显示了所示基因标签(GS)的单细胞表达水平。非经典单核细胞：Cd300e、1700011I03Rik、Tspan9、Dmpk、Fxyd2；经典单核细胞：Ly6c2、Tarm、Tfec、Psrc1、Mmp8；中性粒细胞：Il1f9、Pglyrp4、Nlrp12、Mrgpra2b、Mmp8、Ltf、Amer2、Stfa2l1、Gm5483；树突状细胞：Adam23、Procr、Mab21l3、Sucnr1、Fndc5、Rnf186、Flt3、Cd207、Adam11、Apol7c、Htr7；巨噬细胞：Vcam1、Mertk、Actn1、Fcna、Crip2、Spic、Kcna2、Gfra2、Stab2、Jup；NK细胞：Khdc1c、Khdc1b、Phactr3、Col8a2、Klra4、Adamts14、Gzma、Cma1、Gzmb、Clip4；T细胞：Cd3g、Cd3e、Bcl11b、Actn2、Camk4；B细胞：Pax5、Cd79a、Cd19、Chst3、Scn4a、Cacna1i、Ly6d、Klhl14、Mzb1。色标反映了每个标签中各基因的平均表达情况(对数转换的TPM)。b，热图显示了每个聚类中前20个差异基因的表达情况(缩放的对数转化的TPM值)。每个聚类选择的代表性基因如右侧所示。每个聚类显示了最多200个单细胞。
图24：在脾脏CD11b+细胞上的scRNA-Seq数据中白血病和IFN诱导的变化。
tSNE图显示了来自基于实验条件着色的聚类2-11中的scRNA-Seq数据。
图25：非经典单核细胞的scRNA-Seq数据的子聚类分析和CD4 T细胞上的基因表达分析。
a，流式细胞术图显示了来自3只代表性的注射ALL的CTRL(CTRL+ALL)、IFN无应答者(IFN+ALL NR)和IFN应答者(IFN+ALL R)小鼠脾脏的OVA-ALL细胞(上图)和OVA特异性CD8T细胞(下图)。通过scRNA-seq对这些小鼠的CD11b+细胞进行分析。b，tSNE图显示了在基于聚类(上图)或实验条件(下图)着色的非经典单核细胞群中的细胞子聚类。圆圈中的子聚类表示组成分散的次要子聚类，并且其对应于图19i中标有星号的子聚类。
图26：IFN基因疗法促进CART19细胞激活。
a，用于转导小鼠T细胞的双向LV(BdLV)的示意图，以及在向图20b中的小鼠输注之前在未转导(UT)和转导(CART19)CD4和CD8 T细胞中NGFR表达的百分比。b，在向图20b中的小鼠输注之前，幼稚(CD62L+CD44+)、中央记忆(CD62L+CD44+)和效应记忆(CD62L-CD44+)UT或CART19 T细胞的百分比。c，显示了PB中B细胞发育不良的图20b中IFN+CART19存活小鼠的代表性流式细胞术图。d，来自CTRL+CART19(n＝7)和IFN+CART19(n＝7)小鼠的CD8+NGFR+CART19细胞上随着时间的推移PD1表达情况的百分比(平均值±SEM)。长期存活的小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。e，f，在来自(d)的小鼠的CD4+(e)和CD8+(f)CART19细胞上随着时间的推移NGFR的表达水平(平均荧光强度，MFI)。长期存活的小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。
图27：IFN基因疗法促进iCART19细胞激活。
a，在向图20e中的小鼠输注之前在未转导(UT)和转导(CART19)CD4和CD8 T细胞中NGFR表达的百分比。b，在向图20e中的小鼠输注之前，幼稚(CD62L+CD44+)、中央记忆(CD62L+CD44+)和效应记忆(CD62L-CD44+)UT或CART19 T细胞的百分比。c，来自CTRL+CART19(n＝7)、IFN+CART19(n＝6)、CTRL+iCART19(n＝7)、IFN+iCART19(n＝6)和IFN+iCART19后期(n＝6，后期介入试验)小鼠的CD4(上图)和CD8(下图)NGFR+CART19细胞的绝对数量(平均值±SEM)。长期存活的小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。d，来自(c)小鼠的CD4+(上图)和CD8+(下图)CART19细胞上随着时间的推移NGFR的表达水平(平均荧光强度，MFI)。长期存活的小鼠用绿色表示。每条线代表一只小鼠。
图28
构建体NGFR对照(上图)、Tig126/130a(中图)和Tta126/130a(下图)的结构。
图29
评估IFNγ递送对白血病生长和由白血病诱导的促肿瘤微环境的影响。
图30
评估使用Tie2载体骨架将几种免疫刺激性细胞因子同时递送进入白血病微环境。
图31
评估基于IFNγ递送的基因疗法与包括检查点抑制剂抗-CTLA-4和抗-LAG-3以及吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂1-甲基-色氨酸(1-MT)在内的其他免疫治疗策略之间的协同作用。
具体实施方式
细胞
干细胞能够分化为多种细胞类型。将能够分化为所有细胞类型的细胞称为全能细胞。在哺乳动物中，仅有受精卵和早期胚胎细胞是全能的。在大多数(如果不是全部)多细胞生物体中均发现了干细胞。其特征是能够通过有丝分裂细胞分裂来自我更新并并分化多种专门的细胞类型。哺乳动物干细胞的两种主要类型是从胚泡的内部细胞团中分离出来的胚胎干细胞，以及在成人组织中发现的成体干细胞。在发育的胚胎中，干细胞能够分化成所有专门的胚胎组织。在成年生物中，干细胞和祖细胞可作为人体的修复系统，补充专门的细胞，还可以维持诸如血液、皮肤或肠道组织等再生器官的正常运转。
造血干细胞(HSC)是可以存在于例如外周血、骨髓和脐带血中的多能干细胞。HSC能够自我更新并分化成任何血细胞谱系。其能够重新定殖整个免疫系统，以及所有造血组织(如骨髓、脾脏和胸腺)中的红系和髓系谱系。其提供了造血细胞所有谱系的终生生产。
造血祖细胞(HPC)具有分化成为特定细胞类型的能力。然而，与干细胞不同的是，其已经具有更高的特异性：其被推动分化成为其“靶”细胞。HSC与HPC之间的差异是HSC能够无限复制，而HPC仅能够分裂有限次。
在一个实施方式中，本发明可以使用包含HSC和HPC的混合细胞群(例如，HSPC群)。
分化的细胞是与干细胞或祖细胞相比已变得更加特化的细胞。分化发生在多细胞生物体发育过程中，因为所述生物体从单一受精卵变为组织和细胞类型的复杂系统。分化也是在成体中的常见过程：在组织修复和正常细胞更新过程中，成体干细胞分裂并形成完全分化的子代细胞。分化会显着改变细胞的大小、形状、膜电位、代谢活性和对信号的响应性。这些变化很大程度上是由于基因表达受到高度控制的修饰。换言之，分化细胞是具有特定结构并且由于涉及特定基因的激活和失活的发育过程而执行某些功能的细胞。这里，分化细胞包括造血谱系的分化细胞，如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。例如，通过检测在未分化细胞(HSC和HPC)上不表达或表达程度较低的细胞表面分子，可以将造血谱系的分化细胞与HSC和HPC区分开。适宜的人谱系标记物的实例包括CD33、CD13、CD14、CD15(髓系)、CD19、CD20、CD22,CD79a(B),CD36,CD71,CD235a(erythroid),CD2,CD3,CD4,CD8(T),CD56(NK).
细胞来源
在一个实施方式中，在本发明中使用的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞是从组织样品获得的。
例如，HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞可以从成人和胎儿的外周血、脐带血、骨髓、肝脏或脾脏获得。优选地，这些细胞从外周血或骨髓获得。其可以通过生长因子处理在体内动员细胞后获得。
HSC或HPC的动员可以使用例如G-CSF、plerixaphor或其组合进行。也可以将其他试剂如NSAID、CXCR2配体(Grobeta)和二肽基肽酶抑制剂用作动员剂。
随着能够获得干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF，现在大多数造血干细胞移植程序都是使用从外周血而不是从骨髓中收集的干细胞进行的。收集外周血干细胞可提供更多的移植物，无需对供体进行全身麻醉即可收集移植物，从而缩短了植入时间，并且可能降低长期复发率。
可以通过标准抽吸方法(稳态或动员后)或使用下一代收获工具来收集骨髓。
此外，HSC还可以来源于诱导的多能干细胞。
HSC特征
通过流式细胞术，HSC通常具有低前向散射和侧向散射分布。如罗丹明标记所证实的，一些代谢处于静止状态，从而可以确定线粒体活性。HSC可以含有某些细胞表面标记物如CD34、CD45、CD133、CD90和CD49f。还可以将其定义为缺乏CD38和CD45RA细胞表面标记物表达的细胞。然而，这些标记物中的一些的表达取决于HSC的发育状态和组织特异性背景。如通过流式细胞术所检测的，一些称为“侧群细胞”的HSC排出了Hoechst 33342染料。因而，HSC具有能够对其进行鉴定和分离的描述性特征。
阴性标记物
CD38是人HSC最成熟和最有用的单一阴性标记物。
人HSC针对诸如CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD36、CD56、CD66b、CD271和CD45RA的谱系标记物也是阴性的。然而，可能需要将这些标记物联合使用用于富集HSC。
通过阴性标记物，应理解的是人HSC缺乏这些标记物的表达。
阳性标记物
CD34和CD133是最有用的HSC的阳性标记物。
一些HSC针对普谱系标记物如CD90、CD49f和CD93也是阳性的。然而，可能需要将这些标记物联合使用用于富集HSC。
通过阳性标记物，应理解的是人HSC表达这些标记物。
因此，治疗性细胞群可以是CD34+CD38-。可以进行进一步的分离以获得例如CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞。
miRNA表达
在细胞中表达miRNA mir-126和mir-130a表明该细胞是HSC或HPC。更具体的是，表达mir-126表明该细胞是原始HPC。表达Mir-130a表明该细胞是更加具体的HPC。
细胞因子
细胞因子是通常尺寸为约5-20kDa的小蛋白类别，其在细胞信号传导中具有重要作用。细胞因子包括干扰素、趋化因子、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，并由多种细胞产生，包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞。
细胞因子通过受体发挥作用，并且在免疫系统中具有特别重要的作用，其调节基于体液和细胞之间的免疫应答。
细胞因子包括干扰素(IFN)、IL-12和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
干扰素(IFN)是宿主细胞响应存在的病原体(例如，病毒、细菌和寄生虫)和肿瘤细胞而产生的一组信号蛋白。
IFN通常分为三类：I型、II型和III型。
I型干扰素(IFN)
I型干扰素(IFN)是一类由免疫细胞(白细胞，例如NK细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞等)产生的细胞因子。将I型IFN称为多效性细胞因子，因为其能够对多种细胞类型产生特定的IFN作用。
在一个实施方式中，I型IFN是干扰素-α(IFNα)。IFNα也称为IFN-α、IFNa、INFα-1/13。
示例性IFNα的氨基酸序列是：
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
(SEQ ID NO:6)
在一个实施方式中，编码I型IFN的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的IFNα蛋白。在一个实施方式中，编码I型IFN的核苷酸序列编码IFNα蛋白，所述IFNα蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的氨基酸序列，并且其基本上保持了具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的IFNα蛋白的功能性。
编码IFNα的示例性核苷酸序列是：
ATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA
(SEQ ID NO:7)
在一个实施方式中，编码IFNα的核苷酸序列包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码IFNα的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:7具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:6所示蛋白基本上具有相同功能的蛋白。
在一个实施方式中，I型IFN是干扰素-β(IFNβ；IFNb)。
示例性IFNβ的氨基酸序列是：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFD
IPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK
TVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN
(SEQ ID NO:8)
在一个实施方式中，编码I型IFN的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的IFNβ蛋白。在一个实施方式中，编码I型IFN的核苷酸序列编码IFNβ蛋白，所述IFNβ蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的氨基酸序列，并且其基本上保持了具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的IFNβ蛋白的功能性。
编码IFNβ的示例性核苷酸序列是：
gaattctcaggtcgtttgctttcctttgctttctcccaagtcttgttttacaatttgctttagtcattcactgaaactttaaaaaacattagaaaacctcacagtttgtaaatctttttccctattatatatatcataagataggagcttaaataaagagttttagaaactactaaaatgtaaatgacataggaaaactgaaagggagaagtgaaagtgggaaattcctctgaatagagagaggaccatctcatataaataggccatacccacggagaaaggacattctaactgcaacctttcgaagcctttgctctggcacaacaggtagtaggcgacactgttcgtgttgtcaacatgaccaacaagtgtctcctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctctttccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagtgtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatactgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaactgaagatctcctagcctgtgcctctgggactggacaattgcttcaagcattcttcaaccagcagatgctgtttaagtgactgatggctaatgtactgcatatgaaaggacactagaagattttgaaatttttattaaattatgagttatttttatttatttaaattttattttggaaaataaattatttttggtgcaaaagtcaacatggcagttttaatttcgatttgatttatataaccatccatattataaaattgccaagtacctattagttgttctttttaaaatatacctgcaaagtagtatactttctggcccctgcctttaaggaatttaaaattcaagaaagccatgatggaatatataaggtaagagacaataaggggacctgaaccttatgggggaataaatatggcatgaactgctgtgggattaaaagagaaaaggaaagctggagggtctggaactaaacctggggttcccattcctcctactgtgtgttccagattctctcatcataaagttagaattgagctggccatcaggaatagccagaggaatatgtcagcttttgtgttctccctaaccttccccagttatttgggggatcactttgctcctcgaaagatttttaaataattatgtgccccccaccatccctgcaagcttaagggtgagaagtcccatttacttccatgacactattaagcagcaatctctttattctgctcatcatgggacagccaagatgtgtgggtatcttaggggagctgtgggtccctgtctgctggcatggcacaggcatcagaggaagaagaacctttttataccctagccatctggttagttttctccctagtttttcaaaaaactaagcctgcttccagtccccactgccttgttcatacagaattc
(SEQ ID NO:9)
在一个实施方式中，编码IFNβ的核苷酸序列包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码IFNβ的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:9具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:8所示IFNβ蛋白基本上具有相同功能的蛋白。
在一个实施方式中，对编码I型IFN的核苷酸序列进行密码子优化。
II型干扰素-干扰素-γ(IFNγ)
干扰素-γ(IFNγ)也称为免疫干扰素，其由白介素-12活化并且在调节和活化免疫应答中具有重要作用。
示例性IFNγ氨基酸序列是：
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ
(SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO:12的氨基酸1-23可以充当信号肽并且被切割以形成由SEQ ID NO:12的氨基酸24-161表示的成熟蛋白。示例性的成熟IFNγ氨基酸序列是：
QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ
(SEQ ID NO:13)
在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:12或13所示氨基酸序列的IFNγ蛋白。在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列编码IFNγ蛋白，所述IFNγ蛋白包含与SEQ ID NO:12或13具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的氨基酸序列，并且其基本上保持了具有SEQ ID NO:12或13所示氨基酸序列的IFNγ蛋白的功能性。
进一步的示例性IFNγ氨基酸序列是：
MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
(SEQ ID NO:17)
在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的IFNγ蛋白。在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列编码IFNγ蛋白，所述IFNγ蛋白包含与SEQ ID NO:17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的氨基酸序列，并且其基本上保持了具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的IFNγ蛋白的功能性。
示例性的编码IFNγ的核苷酸序列是：
ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAA
(SEQ ID NO:14)
示例性的编码成熟形式IFNγ的核苷酸序列是：
CAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGT
(SEQ ID NO:15)
进一步的示例性编码IFNγ的核苷酸序列是：
ATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTCATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCATGAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGA
(SEQ ID NO:16)
在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14、15或16所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14、15或16具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:12或13所示蛋白基本上具有相同功能的蛋白。
进一步的示例性编码IFNγ的核苷酸序列是：
ATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTCATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCATGAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGA
(SEQ ID NO:18)
在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列包含SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码IFNγ的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:18具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:17所示蛋白基本上具有相同功能的蛋白。
在一个实施方式中，对编码IFNγ的核苷酸序列进行密码子优化。
肿瘤坏死因子α(TNFα)
肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种参与全身性炎症的细胞因子。它的主要作用是调节免疫细胞。
TNFα主要由活化的巨噬细胞产生，但也由诸如CD4+淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和神经元的其他细胞类型产生。
示例性的TNFα氨基酸序列是：
MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL
(SEQ ID NO:19)
在一个实施方式中，编码TNFα的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的TNFα蛋白。在一个实施方式中，编码TNFα的核苷酸序列编码TNFα蛋白，所述TNFα蛋白包含与SEQ ID NO:19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的氨基酸序列，并且其基本上保持了具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的TNFα蛋白的功能性。
示例性的编码TNFα的核苷酸序列是：
ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGCGACGTGGAACTGGCAGAAGAGGCACTCCCCCAAAAGATGGGGGGCTTCCAGAACTCCAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATTCCTGCTTGTGGCAGGGGCCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCCCCAAAGGGATGAGAAGTTCCCAAATGGCCTCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCAGACCCTCACACTCAGATCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGCTGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTAGTGGTGCCAGCCGATGGGTTGTACCTTGTCTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGACAAGGCTGCCCCGACTACGTGCTCCTCACCCACACCGTCAGCCGATTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAGTCAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCCTGCCCCAAGGACACCCCTGAGGGGGCTGAGCTCAAACCCTGGTATGAGCCCATATACCTGGGAGGAGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGGGACCAACTCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCCAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTCCGGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGCTCTG
(SEQ ID NO:20)
在一个实施方式中，编码TNFα的核苷酸序列包含SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码TNFα的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:20具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:19所示蛋白基本上具有相同功能的蛋白。
1-甲基-色氨酸(1-MT)(1-MT)
1-甲基色氨酸(1-MT)是色氨酸分解代谢酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂，并且其结构为：
Figure BDA0002323808170000431
本发明的1-MT可以作为盐或酯存在，特别是药学上可接受的盐或酯。
在一个实施方式中，1-ML是d-1-MT。在一个实施方式中，1-ML是l-1-MT。在一个实施方式中，1-ML是外消旋混合物。
本发明试剂的药学上可接受的盐包括适宜的酸加成盐或其碱式盐。适宜的药学上可接受的盐的综述可以参见Berge等，(1977)J Pharm Sci 66:1-19。
本发明在适当时还包括试剂的所有对映异构体和互变异构体。本领域技术人员能够认识到具有光学性质(例如，一个或多个手性碳)或互变异构特征的化合物。可以采用本领域公知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
微RNA靶序列
微RNA基因散布在除Y染色体以外的所有人类染色体上。其可以位于基因组的非编码区或蛋白编码基因的内含子内。约50％的miRNA出现在转录为多顺反子一级转录本的簇中。与蛋白质编码基因相似，miRNA通常由聚合酶II启动子转录，产生所谓的初级miRNA转录本(pri-miRNA)。然后通过一系列核酸内切裂解步骤处理该pri-miRNA，这些步骤由属于III型RNAse家族的两种酶Drosha和Dicer进行。从pri-miRNA中，称为mirna前体(pre-mirna)的长度约60个核苷酸的茎环被特定核酸复合物切除，所述特定核酸复合物由Drosha和DiGeorge综合征关键区基因(DGCR8)组成，该复合物截短了两条链靠近主茎环的碱基，并留下5'磷酸和2bp长的3’悬突。然后，pre-mirna通过RAN-GTP和输出蛋白从细胞核主动转运到细胞质。随后，Dicer在未由Drosha切割定义的茎环末端进行双链切割，生成19-24bp的双链体，该双链体由成熟的miRNA和双链体的相对链(称为miRNA*)组成。与热力学不对称规则相一致，只有双链体的一条链选择性地加载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，并积累为成熟的微RNA。这条链通常是5'末端与其互补链不紧密配对的一条链，如siRNA双链体的每条链5'末端引入的单核苷酸错配所证明的那样。然而，有些miRNA支持两条双链的积累程度相似。
微RNA触发RNAi，就像小干扰RNA(siRNA)一样，后者广泛用于实验性基因敲减。miRNA和siRNA之间的主要区别在于其生物发生。一旦加载到RISC中，小RNA分子的引导链就会与优先在蛋白编码基因的3’非翻译区(3’UTR)中存在的mRNA靶序列相互作用。已经发现，从miRNA的5’端开始计数的2-8位核苷酸，即所谓的种子序列，对于触发RNAi是必不可少的。如果整个引导链序列与mRNA靶点完全互补(通常是siRNA和植物miRNA的情况)，则通过Argonaute(Ago)蛋白(也称为小RNA双链体变成RNA诱导的沉默复合物(RISC)的“切片子”)的参与，mRNA进行核酸内切酶切割。DGRC(DiGeorge综合征关键区基因8)和TRBP(TAR(HIV)RNA结合蛋白2)是双链RNA结合蛋白，其分别促进由Drosha和Dicer RNase III酶进行的成熟miRNA生物发生。miRNA双链体的引导链整合到效应复合物RISC中，该复合物通过不完善的碱基配对识别特定靶点，并诱导转录后基因沉默。对于这种调控模式，已经提出了几种机制：miRNA可以诱导翻译起始的阻遏，标记靶mRNA的腺苷酸化降解或将靶点螯合到细胞质处理小体中。
另一方面，如果仅种子与靶mRNA完全互补，而其余碱基显示不完全配对，则RNAi通过多种机制起作用，导致翻译抑制。真核mRNA降解主要通过缩短mRNA 3’末端的polyA尾，并在5'末端去封端，随后是5’-3’核酸外切酶消化和miRNA在离散细胞质区域的积累，所谓的处理小体在mRNA衰变途径的组分中富集。
根据本发明，细胞因子(如I型IFN)的表达通过使用相应miRNA靶序列的内源性miRNA调控。使用这种方法，在细胞中内源表达的miRNA通过与定位在载体或多核苷酸中的相应miRNA靶序列结合来阻止或减少该细胞中的转基因表达。与依靠组织特异性启动子相比，其具有很多优点，尤其是组织特异性启动子经常与一部分非靶细胞中的泄漏表达有关的事实。
在本发明中使用的miRNA靶序列是在HSC中表达，但不在分化细胞(例如，髓系细胞(包括肿瘤浸润的巨噬细胞))中广泛表达的miRNA靶序列。这是特别重要的，因为已知IFNα的表达对HSC具有毒性。
在本发明中使用的miRNA靶序列的优选实例是mir-130a和mir-126。
Mir-126miRNA与mir-126靶序列的结合最有效地阻断了在HSC中和在红系谱系的细胞中的表达。因而，mir-126靶序列特别适合依靠髓系和淋巴谱系中稳定的转基因表达的基因治疗应用。
Mir-126miRNA可以具有核苷酸序列：
UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方式中，mir-126靶序列包含核苷酸序列
GCATTATTACTCACGGTACGA(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方式中，在本发明中使用的载体或多核苷酸包含至少1个、至少2个或至少3个拷贝的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方式中，mir-126靶序列包含两个拷贝的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一个实施方式中，在本发明中使用的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞包含至少1个、至少2个或至少3个拷贝的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方式中，mir-126靶序列包含两个拷贝的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
Mir-126靶序列的拷贝可以由间隔序列所分隔。间隔序列可以包含至少1个、至少2个、至少3个或至少4个或至少5个核苷酸碱基。
Mir-130a miRNA与mir-130a靶序列的结合最有效地阻断了在HSC中和在红系谱系的细胞中的表达(与miR-126类似)。因而，miR-130a靶序列特别适合依靠髓系和淋巴谱系中稳定的转基因表达的基因治疗应用。
Mir-130a miRNA可以具有核苷酸序列：
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方式中，mir-130a靶序列包含核苷酸序列
ATGCCCTTTTAACATTGCACTG(SEQ ID NO:4)。
在一个实施方式中，mir-130a靶序列包含至少1个、至少2个或至少3个拷贝的SEQID NO:4所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方式中，mir-130a靶序列包含两个拷贝的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
Mir-130a靶序列的拷贝可以由间隔序列所分隔。间隔序列可以包含至少1个、至少2个、至少3个或至少4个或至少5个核苷酸碱基。
在一个实施方式中，载体包含两个拷贝的mir-126靶序列和两个拷贝的mir-130a靶序列。
在一个实施方式中，两个拷贝的mir-126靶序列和两个拷贝的mir-130a靶序列包含在下述核苷酸序列中：
GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCACGGTACGAACGCGTATGCCCTTTTAACATT GCACTGATGCATATGCCCTTTTAACATTGCACTG(SEQ ID NO:5)。
组合靶序列(例如，包含两个拷贝的mir-126靶序列和两个拷贝的mir-130a靶序列的靶序列)是特别优选用于本发明的，因为使用这种组合可以最大程度的抑制载体在HSC中以及在髓系子代中的表达。
此外，当使用组合靶标点，两个独立的miRNA可确保HSC中的转基因下调，并且降低了干扰内源性miRNA调控的风险，从而提高了靶序列的安全性和有效性。
载体
载体是一种允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明，并且举例来说，重组核酸技术中使用的一些载体允许转移诸如核酸区段(例如，异源性DNA区段，如异源性Cdna区段)之类的实体进入靶细胞。载体可用于在细胞内维持异源核酸(DNA或RNA)，促进包含核酸区段的载体的复制或者促进核酸区段编码的蛋白表达的目的。载体可以是非病毒或病毒。在重组核酸技术中使用的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体还可以是例如裸核酸(例如，DNA)。在其最简形式中，载体本身可以是目标核苷酸。
在本发明中使用的载体例如可以是质粒或病毒载体并且可以包含用于表达多核苷酸的启动子和任选地启动子的调控因子。在一个优选的实施方式中，载体是病毒载体。
可以使用各种本领域公知的技术(如转化、转染和转导)将本发明中使用的包含多核苷酸的载体引入细胞。若干技术是本领域公知的，例如使用重组病毒载体(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体，睡美人载体)转导；直接注射核酸和基因枪转化。
非病毒递送系统包括但不限于DNA转染法。这里，转染包括使用非病毒载体向靶细胞递送基因的过程。典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染、阳离子试剂介导的转染，阳离子面部两亲性(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14；556)及其组合。
术语“转染”应理解为包括通过病毒和非病毒递送向细胞递送多核苷酸。
此外，本发明可以使用基因靶向方案，例如DNA修饰剂递送。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体。
逆转录病毒是具有不同于裂解病毒的生命周期的RNA病毒。在这一点上，逆转录病毒是通过DNA中间体复制的传染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组会通过逆转录酶转化为DNA形式。DNA拷贝可作为模板，用于生产新的RNA基因组和组装感染性病毒颗粒所需的病毒编码蛋白。
存在很多逆转录病毒例如鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、藤浪肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔森鼠白血病病毒(A-MLV)、禽骨髓瘤病毒29型(MC29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)和所有其他逆转录病毒，包括慢病毒。
逆转录病毒的详细列表可以参见Coffin等(“Retroviruses”1997Cold SpringHarbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SM Hughes,HE Varmus pp 758-763)。
慢病毒也属于逆转录病毒科，但是其能够感染分裂细胞和非分裂细胞(Lewis等(1992)EMBO J.3053-3058)。
在一个实施方式中，载体是慢病毒载体。
启动子
在一个实施方式中，载体包含组织特异性启动子。优选地，组织特异性启动子驱动肿瘤浸润髓系细胞子集的特异性表达，如表达Tie2的单核细胞(TEM)或M2极化的巨噬细胞。
在一个优选的实施方式中，组织特异性启动子是TEK(Tie2)启动子。
示例性的TEK启动子核苷酸序列是：
gatcacgagactagcctcgagtcacacctgcaaactggaaacattaattggttcttaagatcatcatcgacgtgataaaacctgggacagaaattagtcaagactagctgcatctgccttttcctctggtgggtaggaaaaggaggagtataatgatttcctcaggcatgaaggtcgatgatgagcaaagtgtatactctctaatctaatgtcataattcatattgtggagtaattatctggataagtgtagggtctctgacctcattctagatattgtacattccatggctattttcattttggtccatgaactctctttgctctcatgagcaccatttttatcccaatctaatcctgtatgtttgtgtttttacacagattagtttttaaatgttatatataatttgcttctgaaacaccattgctcaatgactaccaaatctttctcattaccaaaatccttctatgccaacttcttcaagaaatttgatcacctttagatgaattgttaatgaaaattaaagctatagccggcaacatgggtatctttgggctaatggccaaccaacaggccatctgtgtgaaagaaaacaggctaacaattttggactctggtctcttggggctacattgagcattgacctcaccggtgctcactgaaattaattgcttttcaggttgtattttctcatcacggaaaccttcttctcccaattcaaaccatgtgggttaaaatgagaaaacaaaagccaaaacggcttcccacacccaaaagctccttctgtcagagatcccagtagccccgggagagctgttagaagtctgagaaggattggtcatcatcgcataccatacataggtggagggcttgttattctcagtttcccgcctatgagaggatacccctattgtttctgaaaatgctgaccgggacccacacttccaacaaaaattcctctgcccctacagcagcagcaaaagcagcagcagaagcaacagcaacagataagtgttttgatgaattgcgagatggatagggcttgagtgcccccagccctgctgataccaaatgcctttaagatacagcctttcccatcctaatctacaaaggaaacaggaaaaaggaacttaaaactccctgtgctcagacagaaatgagactgttacagcctgcttctgtgctgttccttcttgcctctaacttgtaaacaagacgtagtaggacgatgctaatggaaagtcacaaaccgctgggtttttgaaaggatcctagactcgagcggccgcca
(SEQ ID NO:10)
在一个实施方式中，TEK启动子包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，TEK启动子包含与SEQ ID NO:10具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列。
TEK(Tie2)启动子可以与mir-126靶序列和/或mir-130a靶序列联用。这使得能够在肿瘤浸润髓系细胞(例如，肿瘤浸润巨噬细胞)子集中进行特异性的转基因表达。
在一个实施方式中，载体可以进一步包含TEK(Tie2)增强子序列。
示例性的TEK(Tie2)增强子序列是：
cttcagacctggaggaggagatatgagggaccaattgtggccagacgattccttaactcgtgttacacctgcagaatgagttttagatctagctgtgacctcttcccccagccccacccccattgtccccttgtgtgccttcaggaatctgatcattcttctctcctgctccttcccaaaggctgcaggagcaggtgtgaagacgtggatgtgccagatgcagagtcctgacacttttcaacacatctgcatattagaggaagtacatacccattgcttggtggtttcatgtctaatgtggtatgagtgtgacaaagagagggagaaaatttggactagccaaagaagccagtcaggcgtggggtttgaagggcatcgtgggcggctgtcatttgctctctgcttgtcacagccccttgcccagggcttgaccagtgaggtgtatgtgctggtcacacccatctcagcagatctgtcagctttcccgcttttgttaaagggtgatatcatgcttcctggggggagcactggaagacaatgctcggccactttcctccagatacaataggcggagtcaggaaggcagtattgacattgctggggctggggaggcactcactgctctgcggccgtcagatggtgaaccagcttaaccttggcacacagggcctgggttgtgcaaggcgtctggctgcagagccaaaggggactccaccctggggacaggagtgctttagacatctgggaatctgggatgggcttcaaattctgatccctgtgtcagaaacaaccacaaaacaataagagtaccagtaataacaaaaatgactaccctaggttgaatgcctttatgtgccaagtgtcaattg(SEQ ID NO:11)
在一个实施方式中，TEK增强子序列包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，TEK增强子包含与SEQ ID NO:11具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％同一性的核苷酸序列。
密码子优化
在本发明中使用的多核苷酸可以是密码子优化的。此前已在WO 1999/41397和WO2001/79518中对密码子优化进行了描述。不同细胞对特定密码子的使用不同。这种密码子偏好对应于在该细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使其适合于相应tRNA的相对丰度，可以增加表达。同样，可以通过故意选择对应于已知tRNA在特定细胞类型中罕见的密码子来减少表达。因而，翻译控制的程度更高。
很多病毒(包括HIV和其他慢病毒)都使用大量稀有密码子，并且通过将其改为相应的常用哺乳动物密码子，可以实现增加包装成分在哺乳动物生产细胞中的表达。哺乳动物细胞以及多种其他生物体的密码子使用表是本领域公知的。
密码子优化还可能涉及去除mRNA不稳定基序和隐秘剪接位点。
肿瘤相关抗原(TAA)
如在本申请中所使用的，术语肿瘤相关抗原(TAA；也称为肿瘤抗原)指由癌细胞(例如，肿瘤细胞)表达的抗原分子。TAA可以被免疫细胞所识别，所述免疫细胞表达能够与TAA分子的一部分(例如，表位)特异性结合的免疫受体(例如，TCR，转基因TCR或CAR)。
如在本申请中所使用的，术语TAA特异性T细胞指表达对TAA具有特异性的TCR或CAR的T细胞。
表达TAA特异性TCR或TAA特异性CAR的T细胞可能能够特异性靶向和杀死表达TAA的肿瘤细胞。TAA特异性TCR可以是转基因TCR。
在一个实施方式中，TAA特异性T细胞可以不是经过基因工程改造的。T细胞可以是天然诱导的肿瘤特异性T细胞。例如，在本发明中使用的T细胞可以从肿瘤或淋巴结中扩增。
与非肿瘤细胞(例如，健康细胞)相比，特定TAA可以在特定类型的肿瘤细胞上以相对较高丰度表达。
TAA的实例包括：癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕激素受体、肝配蛋白B2、ROR1、间皮素、c-Met、GD-2、MAGE A3 TCR、4-1BB、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD152、CD200、CD22、CD19、CD22、CD123、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD4、CD40、CD44、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CS-1、CNT0888、CTLA-4、DR5、EpCAM、CD3、纤连蛋白额外域-B、叶酸受体1、糖蛋白75、GPNMB、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、SCH900105、SDC1、SLAMF7、肌腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、5T4、CD5、CD19、CD20、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、CAMPATH-1(CDw52)、HLA-DR、抗-独特型、TAG-72、Ep-CAM、MUC1、叶酸结合蛋白、A33、G250、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、铁蛋白、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2)、Ley、CA-125、CA19-9、表皮生长因子受体(EGFR)、p185HER2、IL-2受体、de2-7 EGFR、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白、金属蛋白酶、内皮素、碳酸酐酶、半乳凝素9、缩醛酶A、eIFγ4、酪氨酸酶、半乳凝素4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、休眠蛋白、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、b-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CT、Cyp-B、DAM-6(MAGE-B2)和DAM-10(MAGE-B1)、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、蛋白1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2和WT1。
可以使用本领域公知的方法鉴定其他TAA——参见例如Zilberberg等，2015的综述文章(Biology of Blood and Marrow Transplantation,第21卷，第6期，2015年6月，第1000–1007页)，其内容通过引用并入本申请。
T细胞
如在本申请中所使用的，术语“T细胞”可以指CD8+T细胞、CD4+T细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、γ/δT细胞。
在本发明中使用的T细胞可以用于过继性T细胞转移。本发明还包括肿瘤浸润拘束细胞(TIL)和/或骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的过继转移。
如在本申请中所使用的，术语“过继性T细胞转移”指向患者施用T细胞群。可以从对象中分离T细胞，然后进行基因修饰和体外(离体)培养，以便在向患者施用前表达TAA特异性TCR或CAR。
过继性细胞转移可以是同种异体的或自体的。
应将通过“自体细胞转移”理解为指初始细胞群来自与所转导的T细胞群施用的对象相同的对象。自体转移是有利的，因为其避免了与免疫学不相容相关的问题，并且无论是否能够获得遗传匹配的供体其均可用于对象。
应将通过“同种异体细胞转移”理解为初始细胞群来自与所转导的细胞群施用的对象不同的对象。优选地，供体与给予所述细胞的对象将是遗传匹配的，以最大程度的降低免疫学不相容的风险。或者，供体可以是不匹配的以及与患者无关的。
转导细胞群的适宜剂量是例如在治疗和/或预防上有效的。所施用的剂量可以取决于待治疗的对象和病况，并且可以由技术人员容易地确定。
T细胞可以来源于从患者中分离的T细胞。T细胞可以是对象中分离的混合细胞群的一部分，如外周血淋巴细胞(PBL)群。可以通过本领域公知的方法活化PBL群中的T细胞，如使用抗-CD3和/或抗-CD28抗体或者与抗-CD3和/或抗-CD28抗体缀合的细胞大小的小珠。
T细胞可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。T细胞可以是CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞混合的群。多克隆激活(例如，使用抗-CD3抗体任选地与抗-CD28抗体联用)将触发CD4+和CD8+T细胞的增殖。
T细胞可以从遗传修饰的细胞将要过继转移到的对象中分离。在这一方面，可以通过从对象中分离T细胞，任选地激活T细胞，将TCR基因离体转移至细胞来制备所述细胞。然后，可以通过过继转移TCR转导的细胞来对所述对象进行后续的免疫疗法。如在本申请中所使用的，这种方法指自体T细胞转移，即将向T细胞最初所来源的同一对象施用TCR转导的细胞。
或者，可以从不同对象分离T细胞，这样其是同种异体的。可以从供体对象分离T细胞。例如，如果所述对象正在进行同种异体造血干细胞移植(Allo-HSCT)或实体器官移植或细胞移植或干细胞疗法，则所述细胞可以来源于所述供体，或来源于其所来源的器官、组织或细胞。供体和接受治疗的对象可以是兄弟姐妹。
或者，T细胞可以来源于干细胞，如造血干细胞(HSC)。由于干细胞不表达CD3分子，因而将基因转移至HSC不会导致TCR在细胞表面上表达。然而，当干细胞分化为迁移到胸腺的淋巴样前体时，CD3表达的启动导致所导入的TCR在胸腺细胞中的表面表达。
这种方法的优势在于，成熟的T细胞一旦产生，仅表达导入的TCR而很少或不表达内源性TCR链，因为导入的TCR链的表达抑制了内源性TCR基因区段形成功能性TCRα和β基因的重排。另一个好处是基因修饰的干细胞是具有所需抗原特异性的成熟T细胞的连续来源。因此，可以将HSC、HPC或本申请所定义的载体与基因修饰的干细胞联用，优选基因修饰的造血干细胞，其在分化后产生表达TAA特异性TCR的T细胞。
可以将本领域公知的其他方法用于减少、限制、阻止、沉默或消除本发明的细胞中或由本发明方法制备的细胞中内源性基因的表达。
如在本申请中所使用的，术语“破坏”指减少、限制、阻止、沉默或消除基因的表达。本领域技术人员能够使用本领域公知的任何方法以破坏内源性基因，例如用于基因编辑、基因沉默、基因敲减或基因敲除的任何适宜方法。
例如，可以使用人工核酸酶破坏内源性基因。人工核酸酶例如是经工程化改造以选择性靶向特定多核苷酸序列(例如，编码目标基因的)并在所述多核苷酸序列中诱导双链断裂的人工限制性酶。通常地，双链断裂(DSB)将通过易错的非同源末端连接(NHEJ)修复，从而导致形成无法表达内源性基因的非功能性多核苷酸序列。
在一些实施方式中，人工核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas(例如，CRISPR/Cas9)。
T细胞受体(TCR)
在抗原加工过程中，抗原在细胞内部降解，然后被主要组织相容性复合物(MHC)分子携带到细胞表面。T细胞能够识别在抗原提呈细胞表面上的这种肽：MHC复合物。有两种不同类型的MHC分子：MHC I和MHC II，每种类型均将肽从不同细胞区室递送到细胞表面上。
T细胞受体(TCR)是存在于T细胞表面上的分子，其负责识别与MHC分子结合的抗原。在约95％的T细胞中，TCR异二聚体由阿尔法(α)和贝塔(β)链构成，而约5％的T细胞具有由伽马(γ)和德尔塔(δ)链构成的TCR。
TCR与抗原和MHC的结合导致T淋巴细胞活化，在其上通过相关的酶、共受体和专门的辅助分子介导的一系列生化事件来表达TCR。
TCR的每条链均是免疫球蛋白超家族成员，并且具有一个N-末端免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、一个跨膜/跨细胞膜区域一个在C末端的短胞质尾。
TCRα链和β链的可变结构域均具有3个高变或互补性决定区(CDR)。CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，但是α链的CDR1也显示出了与抗原肽N末端部分的相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。
TCR结构域的恒定结构域由短链接序列构成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。
在本发明中使用的TCR可以在每条α和β链中具有一个或多个附加的半胱氨酸残基，以使得TCR可以在恒定结构域中包含两个或更多个二硫键。
该结构使得TCR能够与其他分子(如CD3，其在哺乳动物中具有3个不同的链(γ、δ和ε))和ζ-链结合。这些辅助分子具有带负电的跨膜区域，这对于将信号从TCR传递至细胞中是至关重要的。CD3和ζ链与TCR在一起形成被称为T细胞受体复合物的物质。
通过特异性共受体与MHC分子同时结合，增强了来自T细胞复合物的信号。对于辅助T细胞而言，该共受体是CD4(对II类MHC具有特异性)；而对于细胞毒性T细胞而言，该共受体是CD8(对于I类MHC具有特异性)。该共受体能够延长抗原提呈细胞与T细胞之间的结合，并且将必要的分子(例如，LCK)募集到参与活化的T淋巴细胞信号传导的细胞内。
因此，如在本申请中所使用的，术语“T细胞受体”(TCR)指能够识别由MHC分子提呈的肽的分子。该分子可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。
在本发明中使用的TCR可以是包含来源于一个以上物种的序列的杂交TCR。例如，令人吃惊的发现，鼠TCR在人T细胞中比人TCR更有效地表达。因此，TCR可以包含人可变区和鼠恒定区。
这种方法的缺点是鼠恒定序列可能触发免疫应答，导致转移的T细胞的排斥。然而，为准备进行过继性T细胞疗法的患者准备的条件方案可能已充分进行了免疫抑制，以使得能够植入表达鼠序列的T细胞。
与同主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原肽建立大部分接触的TCR的部分是互补性决定区3(CDR3)，其对于每个T细胞克隆而言均是独特的。CDR3区是在胸腺中发生体细胞重排事件时产生的，并且涉及属于可变(V)、多样性(D，针对β和δ链)和连接(J)基因的非连续基因。此外，在每个TCR链基因的重排基因座处插入/缺失的随机核苷酸大大增加了高度可变的CDR3序列的多样性。因而，生物样品中特定CDR3序列的频率表示特定T细胞群的丰度。在健康人中TCR库极大的多样性针对抗原提呈细胞表面上由MHC分子提呈的多种外来抗原提供了广泛的保护。在这一点上，值得注意的是，在胸腺中理论上能够产生多达1015个不同的TCR。
T细胞受体的多样性集中在CD3上，该区域主要负责抗原识别。
CDR可以例如与给定序列相比包含1个、2个或3个取代、添加或缺失，条件是TCR保留与来源于由MHC分子提呈的肽的TAA结合的能力。
本领域技术人员可以使用本领域公知的任何方法容易地产生特异性针对TAA的TCR。
例如，可以通过Linnemann等(Nature Medicine 19,1534–1541(2013))的TCR基因捕获法鉴定TAA特异性TCR。简言之，这种方法使用高通量的基于DNA的策略，通过捕获和测序编码TCR基因的基因组DNA片段来鉴定TCR序列，并且可以用于鉴定TAA特异性TCR。
改善TCR表达和减少TCR错配
增加CD3分子的供应可以增加TCR表达，例如在已修饰以表达本发明的TCR的细胞中。因此，可以对T细胞进行修饰(例如，使用载体)，以包含一个或多个编码CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε和/或CD3-ζ的基因。在一个实施方式中，T细胞包含编码CD3-ζ的基因。T细胞可以包含编码CD8的基因。编码此类基因的载体可以编码选择性标记物或自杀基因以增加经基因工程改造细胞的安全性性质。基因可以通过自我切割序列连接，如2A自我切割序列。
或者，可以提供一个或多个编码CD3基因的单独的载体，以便于一个或多个编码TCR的载体同时、顺序或分别共同转移至T细胞。
可以在本发明使用的T细胞中表达转基因TCR，以改变T细胞的抗原特异性。TCR转导的T细胞表达至少两条TCRα链和两条TCRβ链。尽管内源性TCRα/β链形成自我耐受的受体，但是所引入的TCRα/β链形成对给定靶抗原具有确定特异性的受体。
然而，TCR基因疗法需要充分表达转移的(即，转基因的)TCR，因为转移的TCR可能会因内源性TCR的存在而被稀释，导致肿瘤特异性TCR的表达欠佳。此外，内源性和引入的链之间可能发生错配以形成新的受体，这种受体可能显示出对自身抗原出乎意料的特异性，并在转移到患者体内时引起自身免疫损伤。
因此，已经探索了几种策略来降低内源性和引入的TCR链之间错配的风险。TCRα/β界面的突变是目前用于减少不必要的错配的一种策略。例如，在α和β链的恒定结构域中引入半胱氨酸能够形成二硫键并增强引入链的配对，同时减少与野生型链的错配。
因此，本发明中使用的TCR可以在α链/β链界面处包含一个或多个突变，以使得当在T细胞中表达α和β链时，在所述链与内源性TCRα和β链之间的错配频率降低。在一个实施方式中，一个或多个突变将半胱氨酸残基引入每条α链和β链的恒定区结构域中，其中所述半胱氨酸残基能够在α链和β链之间形成二硫键。
减少错配的另一种策略依赖于引入编码siRNA的多核苷酸序列，将其添加到编码肿瘤特异性TCRα和β链的基因中，并旨在限制内源TCR基因的表达(Okamoto S.Cancerresearch 69,9003-9011,2009)。
因此，编码本发明中使用的TCR的载体或多核苷酸可以包含旨在限制或消除内源性TCR基因表达的一个或多个siRNA或其他试剂。
还可以将设计为靶向内源性TCR基因(TRAC和或TRBC)恒定区的人工核酸酶联用，如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统，以获得内源性TCRα和/或β链基因的永久性破坏，从而使得能够充分表达肿瘤特异性TCR，以及从而降低或消除TCR错配的风险。在体外和体内均已证实称为TCR基因编辑的这种方法优于TCR基因转移(Provasi E.,Genovese P.,Nature Medicine May；18(5):807-15；2012)。
此外，基因组编辑技术允许将表达盒靶向整合到被人工核酸酶破坏的内源基因中，所述表达盒包含编码本发明中使用的TCR的多核苷酸以及任选地一个或多个启动子区和/或其他表达控制序列(Lombardo A.,Nature biotechnology 25,1298-1306；2007)。
所开发的增加转基因TCR表达并减少TCR错配的另一种策略是“鼠源化作用”，其中其鼠源性对应物替代了人TCRα和TCRβ恒定区(例如，TRAC，TRBC1和TRBC2区)。在例如Sommermeyer和Uckert J Immunol；2010(184:6223-6231)中描述了TCR恒定区的鼠源化作用。因此，在本发明中使用的TCR可以是鼠源化的。
嵌合抗原受体(CAR)
CAR包含胞外配体结合结构域，最常见的是与胞内信号传导成分连接的单克隆抗体(scFv)的单链可变片段，最常见的是单独的CD3ζ或与一个或多个协同刺激结构域联用。通常在胞外抗原结合结构域与跨膜部分之间加入间隔物，以优化与靶点之间的相互作用。
在本发明中使用的CAR可以包含：
(i)抗原特异性靶向结构域；
(ii)跨膜结构域；
(iii)任选地至少一个共刺激结构域；和
(iv)胞内信号传导结构域。
优选地，抗原特异性靶向结构域包含抗体或其片段，更优选地包含单链可变片段。
优选地，抗原特异性靶向结构域靶向TAA。
在一个实施方式中，抗原特异性靶向结构域靶向CD19。
跨膜结构域的实例包括T细胞受体复合物CD28和CD8aζ链的跨膜结构域。
共刺激结构域的实例包括来自CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、DaplO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40的共刺激结构域。
在一个实施方式中，共刺激结构域是来自CD28的共刺激结构域。
胞内信号传导结构域的实例包括人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾和携带胞质受体的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
嵌合抗原受体
如在本申请中所使用的，“嵌合抗原受体”或“CAR”指能够赋予细胞(例如，T细胞，如幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合)抗原特异性的经工程化改造的受体。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。优选地，本发明的CAR包含抗原特异性靶向区、胞外域、跨膜结构域、任选地一个或多个共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
抗原特异性靶向结构域
抗原特异性靶向结构域为CAR提供了与目标靶抗原结合的能力。抗原特异性靶向结构域优选地靶向具有临床意义的抗原，期望触发针对该抗原的效应免疫应答，从而导致肿瘤杀伤。
抗原特异性靶向结构域可以是具有特异性识别和结合生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白，或其成分)能力的任何蛋白或肽。抗原特异性靶向结构域包括针对目标生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组生产的结合伴侣。
示例性的抗原特异性靶向结构域包括抗体或抗体片段或衍生物、受体的胞外域、细胞表面分子/受体的配体或其受体结合结构域以及肿瘤结合蛋白。
在一个优选的实施方式中，抗原特异性靶向结构域是或来源于抗体。来源于抗体的靶向结构域可以是抗体的片段或者抗体一个或多个片段的基因工程产物，所述片段参与与抗原的结合。实例包括可变区(Fv)、互补性决定区(CDR)E、Fab、单链抗体(scFv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和骆驼抗体(VHH)。
在一个优选的实施方式中，结合结构域是单链抗体(scFv)。scFv可以是鼠源、人源或人源化scFv。
关于抗体或其抗原结合片段的“互补性决定区”或“CDR”指在抗体重链或轻链可变区中的高变环。CDR能够与抗原构象相互作用，并且在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知一些框架区参与结合)。重链可变区和轻链可变区均含有3个CDR。
“重链可变区”或“VH”指抗体的重链片段，其含有插入在称为框架区的侧翼伸展之间的3个CDR，所述框架区比CDR更为保守并形成支持CDR的支架。
“轻链可变区”或“VL”指抗体的轻链片段，其含有插入在框架区之间的3个CDR。
“Fv”指携带完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由于单一重链可变区结合的单一轻链可变区构成。
“单链Fv抗体”或“scFv”指由彼此之间直接或通过肽接头序列连接的轻链可变区和重链可变区构成的经工程化改造的抗体。
可以使用本领域熟知的方法制备与肿瘤细胞表面分子特异性结合的抗体。此类方法包括噬菌体展示，用于产生人源或人源化抗体的方法，或者使用转基因动物或经工程化改造的植物以生产人抗体的方法。部分或完全合成抗体的噬菌体展示文库是可用的，并且可以用于筛选能够与靶分子结合的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。一旦鉴定，就可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。
对于靶向癌症抗原的靶向结构域而言，靶向结构域的选择将取决于所治疗的癌症类型，并且可以靶向肿瘤抗原。可以将来自对象的肿瘤样品表征为存在某些生物标记物或细胞表面标记物。例如，来自对象的乳腺癌细胞针对Her2Neu、雌激素受体和/或孕激素受体的每一个可以是阳性或阴性的。选择在个体对象的肿瘤细胞上存在的肿瘤抗原或细胞表面分子。优选地，抗原特异性靶向结构域靶向在肿瘤细胞上存在的并且在正常组织上基本上不存在的，或者其表达限于非重要的正常组织的细胞表面分子。
可以被本发明中使用的CAR靶向的TAA包括但不限于下述中的任意一个或多个：癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕激素受体、肝配蛋白B2、ROR1、间皮素、c-Met、GD-2、MAGE A3TCR、4-1BB、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD152、CD200、CD22、CD19、CD22、CD123、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD4、CD40、CD44、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CS-1、CNT0888、CTLA-4、DR5、EpCAM、CD3、纤连蛋白额外域-B、叶酸受体1、糖蛋白75、GPNMB、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、肌腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、5T4、CD5、CD19、CD20、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、CAMPATH-1(CDw52)、HLA-DR、抗-独特型、TAG-72、Ep-CAM、MUC1、叶酸结合蛋白、A33、G250、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、铁蛋白、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2)、Ley、CA-125、CA19-9、表皮生长因子受体(EGFR)、p185HER2、IL-2受体、de2-7 EGFR、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白、金属蛋白酶、内皮素、碳酸酐酶、半乳凝素9、缩醛酶A、eIFγ4、酪氨酸酶、半乳凝素4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、休眠蛋白、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、b-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CT、Cyp-B、DAM-6(MAGE-B2)和DAM-10(MAGE-B1)、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、蛋白1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2或WT1。
共刺激结构域
在本发明中使用的CAR还可以包含一个或多个共刺激结构域。该结构域可以增细胞增殖、细胞存活和记忆细胞的发育。
每个共刺激结构域包含以下任意一个或多个的共刺激结构域，例如，TNFR超家族成员、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、DaplO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。来自其他蛋白的共刺激结构域也可以与本发明中使用的CAR一起使用。其他共刺激结构域对本领域技术人员而言将是显而易见的。
胞内信号传导结构域
在本发明中使用的CAR还可以包含胞内信号传导结构域。该结构域可以是胞质的，并且可以转导效应功能信号并引导细胞执行其专门的功能。胞内信号转导结构域的实例包括但不限于T细胞受体或其任何同源物(例如，η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)的ζ链，CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)，src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子，如CD2、CD5和CD28。胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、携带胞质受体的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)或其组合。
跨膜结构域
在本发明中使用的CAR还可以包含跨膜结构域。跨膜结构域可以包含来自具有跨膜结构域的任何蛋白的跨膜序列，包括任意I型、II型或III型跨膜蛋白。在本发明中使用的CAR的跨膜结构域还可以包含人工疏水性序列。可以对在本发明中使用的CAR的跨膜结构域进行选择，以使其不发生二聚化。其他跨膜结构域对本领域技术人员而言将是显而易见的。在CAR构建体中使用的跨膜(TM)结构域的实例是：1)CD28 TM区(Pule等，Mol Ther,2005,Nov；12(5):933-41；Brentjens等，CCR,2007,Sep 15；13(18Pt 1):5426-35；Casucci等，Blood,2013,Nov 14；122(20):3461-72.)；2)OX40 TM区(Pule等，Mol Ther,2005,Nov；12(5):933-41)；3)41BB TM区(Brentjens等，CCR,2007,Sep 15；13(18Pt 1):5426-35)；4)CD3ζTM区(Pule等，Mol Ther,2005,Nov；12(5):933-41；Savoldo B,Blood,2009,Jun 18；113(25):6392-402.)；5)CD8a TM区(Maher等，Nat Biotechnol,2002,Jan；20(1):70-5.；ImaiC,Leukemia,2004,Apr；18(4):676-84；Brentjens等，CCR,2007,Sep 15；13(18Pt 1):5426-35；Milone等，Mol Ther,2009,Aug；17(8):1453-64.)。
免疫检查点抑制剂
如在本申请中所使用的，术语免疫检查点抑制剂指抑制、阻断、防止、减少或下调抑制性检查点分子的表达或与之拮抗的分子、化合物、抗体或药物。当在细胞表面上表达时，抑制性检查点分子抑制或减少(dampen)T细胞介导的对所述细胞的免疫应答。例如，抑制性检查点分子的表达可以阻止细胞被T细胞应答杀死。在癌细胞表达抑制性检查点分子的情况下这种机制是特别有害的，因为这可能使癌细胞逃避宿主T细胞应答。因此，当在肿瘤细胞上的抑制性检查点分子被免疫检查点抑制剂所抑制时，将出现针对肿瘤细胞的宿主T细胞应答增强。
在一个实施方式中，免疫检查点抑制剂抑制选自下组的抑制性检查点分子：A2AR(腺苷A2A受体)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(B和T淋巴细胞衰减子；CD272)、HVEM(疱疹病毒进入媒介物)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；CD152)、IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)、TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因-3)、PD-1(程序性死亡受体1)、PD-L1(PD-1配体1)、PD-L2(PD-1配体2)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)、VISTA(T细胞活化的V-结构域Ig抑制物)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)。还可以使用检查点抑制剂的组合。
在一个实施方式中，免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂；优选地PD-1抑制剂是抗-PD-1抗体。
在另一个实施方式中，免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂；优选地PD-L1抑制剂是抗-PD-L1抗体、
在另一个实施方式中，免疫检查点抑制剂是PD-L2抑制剂；优选地PD-L2抑制剂是抗-PD-L2抗体。
在另一个实施方式中，免疫检查点抑制剂是CTLA4抑制剂，优选地CTLA4抑制剂是抗-CTLA4抗体。
在另一个实施方式中，免疫检查点抑制剂是LAG-3抑制剂；优选地LAG-3抑制剂是抗-LAG-3抗体。
如在本申请中所使用的，将术语“抗体”理解为基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合和识别抗原(例如，细胞表面标记物)。如在本申请中所使用的，术语“抗体”指全部或完整的抗体分子(例如，IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD或IgE)或者其任何抗原结合片段。
抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体是由相同的免疫细胞(例如，杂交瘤可以是由生产抗体的B细胞系和癌性B细胞系融合产生的)生产的。针对特定抗原的单克隆抗体将识别在所述抗原上的单一特异性表位。而相反的是，多克隆抗体是由多个不同的细胞系生产的，并且因此识别特定抗原上的若干不同表位。
抗体的抗原结合片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。scFv片段是包含scFv来源的抗体的重链和轻链可变区的单一多肽链。此外，胞内抗体、微型抗体、三体和双体(参见例如，Todorovska等，(2001)J ImmunolMethods 248(1):47-66；Hudson和Kortt(1999)J Immunol Methods 231(1):177-189；Poljak 25(1994)Structure 2(12):1121-1123；Rondon和Marasco(1997)Annual Reviewof Microbiology 21:257-283)也包括在抗体的定义中并且与本申请所述方法的用途是相容的。如在本申请中所使用的，术语“抗体”还包括通过对完整抗体进行修饰生产的或使用重组方法从头合成的那些抗体片段。
用于生产针对特定抗原的抗体或其片段的适宜方法是本领域公知的(参见例如，Greenfield(2014)Antibodies:A Laboratory Manual，第2版，201-221)。变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本申请中提及的特定蛋白和多核苷酸以外，本发明还包括变体、衍生物、类似物、同源物及其片段的用途。
在本发明的背景下，任何给定序列的变体是这样的序列，其中特定残基的序列(无论是氨基酸残基还是核酸残基)以这样的方式已被修饰，即使得所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留至少一种其内源性功能。可以通过在天然存在的蛋白中加入、缺失、取代、修饰、替代和/或改变至少一个残基获得变体序列。
如在本申请中所使用的，涉及本发明的蛋白或多肽的术语“衍生物”包括对所提供的序列进行的任何取代、改变、修饰、替代、缺失和/或向所提供的序列加入一个(或多个)氨基酸残基，以使得所得到的蛋白或多肽基本上保留至少一种其内源性功能。
如在本申请中所使用的，涉及多肽或多核苷酸的术语“类似物”包括任何模拟物，即具有其所模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源性功能的化学化合物。
在本发明中使用的蛋白还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默的改变并产生功能上等同的蛋白。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性来进行故意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有亲水性值相似的不带电荷的极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
取代可以包括将氨基酸替代为相似的氨基酸(保守性取代)。相似的氨基酸是具有侧链部分的氨基酸，这些侧链部分具有分为一组的相关性质，例如，如下所示：
(i)碱性侧链：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；
(ii)酸性侧链：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
(iii)不带电荷的极性侧链：天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)；或者
(iv)非极性侧链：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。
变体序列可以包含氨基酸取代、添加、缺失和/或插入。
例如，可以根据下表进行保守性取代、添加或缺失。在第二列同一个框中的，优选地在第三列同一行中的氨基酸可以彼此之间取代：
Figure BDA0002323808170000631
本发明还包括同源取代(在本申请中使用的取代和替代均指替代的残基)与现有氨基酸残基互换)例如类似的取代，如碱性取代为碱性，酸性取代为酸性，极性取代为极性等。也可以发生非同源取代，例如从一类残基变为另一类残基，或者涉及包括非天然氨基酸，如鸟氨酸。
如在本申请中所使用的，术语“变体”可以指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有某些同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
变体序列可以包括可以与目标序列至少50％、55％、65％、75％、85％或90％是相同的，优选地至少95％、至少97％或至少99％是相同的氨基酸序列。通常地，变体将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管也可以将同源性认为是相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的背景下，优选以序列同一性表示同源性。
变体序列可以包括可以与目标序列至少40％、45％、50％、55％、65％、75％、85％或90％是相同的，优选地至少95％、至少97％或至少99％是相同的核苷酸序列。尽管也可以将同源性认为是相似性，但是在本发明的背景下，优选以序列同一性表示同源性。
优选地，提及与本申请所述的任意一个SEQ ID NO具有同一性百分比的序列时是指在所提及的SEQ ID NO的全长上具有所述同一性百分比的序列。
同一性比较可以通过目测进行，或者更常见的是借助容易获得的序列比较程序进行。这些市售的计算机程序可以计算两条或更多条序列之间的同源性或同一性百分比。
可以在连续的序列上计算同源性百分比，即一条序列与另一序列比对，并且一条序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。将其称为“无空位”比对。通常地，仅在相对较小数量的残基上进行这种无空位的比对。
尽管这是一种非常简单且一致的方法，但是其没有考虑到，例如在另外一对相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可能无法对之后的密码子进行比对，因此当执行整体比对时，可能导致同源性百分比大大降低。因此，将大部分序列比较方法设计为产生最佳比对，该比对考虑了可能的插入和缺失而不会过度惩罚总体同源性评分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尝试最大化局部同源性来实现的。
然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给比对中出现的每个空位，以便对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对，反映了两个比较序列之间更高的相关性，其将会获得比具有很多空位的一个更高的评分。通常使用“仿射空位成本”，其对于存在的空位具有相对较高的成本，并且对于空位中的每个随后的残基具有较小罚分。这是最常用的空位评分系统。当然，高空位罚分将产生具有较少空位的优化比对。大部分比对程序允许对空位罚分进行修订。然而，当使用此类软件进行序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的缺省空位罚分对于空位是-12，对于每个延伸是-4。
因此，计算最大同源性百分比首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。用于执行这种比对的适宜的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux等，(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。能够进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，(1999)ibid–Ch.18)、FASTA(Atschul等，(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具组件。BLAST和FASTA都可以用于离线和在线检索(参见Ausubel等，(1999)ibid，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。也可使用另一种称为BLAST 2序列的工具来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177:187-8)。
尽管可以根据同一性来衡量最终的同源性百分比，但比对过程本身通常不是基于全或无配对比较。取而代之的是，通常使用缩放的相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离为每个配对比较分配评分。通常使用的此类矩阵的实例是BLOSUM62矩阵——BLAST程序组件的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值或如果提供的话自定义符号比较表(有关更多详细信息，请参见用户手册)。对于一些应用，优选使用针对GCG软件包的公共缺省值，或者在其他软件的情况下，使用缺省矩阵，如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，就可以计算同源性百分比，优选地序列同一性百分比。软件通常将其作为序列比较的一部分，并生成数值结果。
“片段”也是变体，并且该术语通常指功能上或例如在测定中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”指作为全长多肽或多核苷酸一部分的氨基酸或核酸序列。
可以使用标准重组DNA技术(如位点定向诱变)制备此类变体。在进行插入的情况下，可以制备编码插入的合成DNA以及与插入位点任一侧的天然存在序列相对应的5’和3’侧翼区域。侧翼区域将含有与天然序列中的位点相对应的方便的限制性位点，从而可以用适当的酶切割该序列，并将合成的DNA连接到该切口中。然后根据本发明表达DNA以制备编码蛋白。这些方法仅说明了本领域公知的用于操纵DNA序列的众多标准技术，并且也可以使用其他公知技术。
联用
可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与免疫检查点抑制剂联用。
或者，可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与TAA特异性T细胞联用。
或者，可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与表达CAR的TAA特异性T细胞联用。
或者，可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与表达转基因TCR的TAA特异性T细胞联用。
或者，可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与免疫检查点抑制剂和表达转基因TCR的TAA特异性T细胞联用。
或者，可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与免疫检查点抑制剂和表达CAR的TAA特异性T细胞联用。
或者，可以将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体用于与1-甲基-色氨酸(1-MT)联用。
如在本申请中所使用的，短语“用于与……联用”包括将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体与免疫检查点抑制剂和/或TAA特异性T细胞依次、分别或同时施用。
可以在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少14天施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周或至少12周施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
如在本申请中所使用的，短语“用于与……联用”包括将本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体与1-甲基-色氨酸(1-MT)依次、分别或同时施用。
可以在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少14天施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周或至少12周施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
可以在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或载体。
药物组合物
可以将用于本发明用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞、免疫检查点抑制剂、TAA特异性T细胞、载体、1-甲基-色氨酸(1-MT)及其组合与药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂制剂。
患者
患者可以是人患者。患者可以是非人动物。
患者可能患有癌症。或者，患者可能处于发展成癌症的风险中。
可能此前已确定患者有患癌症的风险。增加的风险可能是通过基因筛查和/或通过回顾患者的家族史来确定的。可能已经确定患者表达一种或多种指示发生癌症风险增加的遗传标记。
适宜地，本领域技术人员将意识到与发展成癌症风险增加相关的遗传风险因素(例如，遗传标记)。技术人员可以使用本领域公知的任何适宜方法或技术来确定对象是否发展成癌症的风险增加。
对象可能此前已经接受了针对癌症的治疗。对象可能处于癌症缓解。对象可能对化疗耐受。
在本发明的一些方面中，在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前，患者此前已施用了本发明的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少14天已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周或至少12周已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用TAA特异性T细胞和/或免疫检查点抑制剂之前至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在本发明的一些方面中，在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前，患者此前已施用了本发明的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少14天已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周或至少12周已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在一个实施方式中，在施用1-甲基-色氨酸(1-MT)之前至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月已向患者施用本发明的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞。
人用和兽用治疗均在本发明的范围内。
如在本申请中所使用的，术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”与“包括(including)”或“包括(includes)”；或者“含有(containing)”或“含有(contains)”同义，并且是包容性或开放式的，并且不排除其他未引用成员、要素或步骤。术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”也包括术语“由……组成”。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用细胞生物学、分子生物学、组织学、免疫学、肿瘤学的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中均有解释。
参见例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等，(1995年和定期补编)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13and 16,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.和Kahn,A.(1996)DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；以及Lilley,D.M.和Dahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些一般教科书中的每一个均通过引用并入本申请。
现在将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方式。
实施例
实施例1–肿瘤靶向IFNα在ALL模型中增强T细胞介导的抗肿瘤应答
我们将C57Bl/6小鼠移植了使用mTie2-IFN-mirT LV(IFN小鼠)或mTie2-GFP-mirTLV转导或假转导(均作为对照小鼠)的HSC，以便将IFN/GFP表达靶向至分化的TIE2+单核细胞子代，其在肿瘤中是高度富集的15,16。如前所示，使用mTie2-IFN-mirT LV转导的细胞重建可产生功能性多谱系移植物，且无明显的副作用8–10。然后，我们使用我们此前描述的B-ALL模型对重建小鼠进行攻击(图1a)，并且发现IFN小鼠与对照小鼠相比白血病生长受到抑制(图1b，c)。在对照小鼠中施用抗-CTLA4阻断抗体(aCTLA4)没有作用，但是在IFN小鼠中其进一步显著改善ALL抑制，表明其对于在IFN小鼠中观察到的应答具有免疫作用。将IFN基因疗法与αCTLA4联用显著改善小鼠的存活(图21)。为了研究诱导抗肿瘤免疫的作用，我们使用慢病毒载体(LV)工程化改造了ALL细胞，以使其能够协同表达卵蛋白(OVA)模型抗原和来自双向启动子的截短形式的神经生长因子受体(NGFR)细胞表面标记物(OVA-ALL，图5a，b)。
当注射至具有免疫能力的C57Bl/6小鼠中时，与亲本ALL相比，OVA-ALL在部分小鼠中显示出生长动力学减慢和延迟发病。在尸检时，所有小鼠均表现出ALL细胞的大量BM浸润，而在疾病延迟的小鼠中NGFR阴性母细胞过度生长(图5c，d)。当将OVA ALL细胞注射至免疫缺陷NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)小鼠时，我们观察到与亲本细胞相当的肿瘤生长，并且NGFR表达没有损失(图5c，e)。总而言之，这些结果OVA-ALL变体的免疫原性增强，从而导致在输注产品中可能存在的免疫编辑以及罕见未转导或沉默ALL克隆(OVA/NGFR阴性)的选择。然而，在攻击后没有小鼠存活。因而，我们检测了肿瘤靶向IFN细胞和基于基因的递送增强针对OVA-ALL的抗肿瘤免疫应答的能力。尽管ALL在对照小鼠中迅速扩增(图1d-f)，但是在IFN小鼠血液中胚泡的出现和累积被延迟，以及在BM和脾脏中的浸润减少。值得注意的是，一部分IFN小鼠在分析的所有器官中均未显示出白血病。
通过g-IFN-ELISPOT，在来自IFN小鼠体外刺激纯化的脾脏CD8+T细胞中显示出诱导针对OVA的特异性应答，在显示出最低肿瘤负荷的小鼠中具有增加数量的应答细胞(图1f)。在IFN和对照小鼠通过OVA257-264-H-2Kb五聚体染色检测OVA特异性CD8+T细胞，其在IFN组血液和BM中的百分比和数量更高(图1h-j和图6a)。而且，使用OVA进行离体再刺激后，对照小鼠的CD8+T细胞不释放IFN-g，而IFN小鼠的T细胞却释放(图1k)，这表明与IFN小鼠相比对照小鼠存在功能障碍，这预期缺乏肿瘤抑制作用一致(图6b-d)。引人注目的是，在IFN小鼠中耗竭CD8+T细胞消除了抗肿瘤应答(图11，m)。总体而言，这些结果表明在IFN小鼠中诱导CTL能够诱导针对肿瘤新生抗原的有效应答。
我们还注意到，与对照相比，CD8耗竭IFN小鼠的初始肿瘤负荷较低，这表明除了CD8介导的控制以外的其他机制可能(至少在最初和暂时性地)有助于肿瘤抑制(图6e)。尽管在IFN与对照小鼠之间BM和脾ALL细胞的凋亡细胞分数和细胞周期分布没有差异(图7a-d)，但是在IFN小鼠中通过EdU掺入测量的增殖率在BM中降低，但是在脾脏中没有差异(图7e，f)。可能由IFN直接触发的增殖延迟可能有利于以有效的效应物靶点比例产生肿瘤特异性CTL，以抑制肿瘤细胞生长。
实施例2-过继转移的转基因OT-I T细胞仅在IFN小鼠中扩增并包含白血病
为考察I型IFN对T细胞募集和活化的作用，我们在IFN和对照小鼠中过继转移了幼稚转基因OVA特异性T细胞(OT-I)(图2a)。我们调整了两组之间的输注时间，以便在相当的白血病负荷下输注OT-I细胞(图2b和图8a)，并在3天后对小鼠进行分析。我们观察到，与对照小鼠相比，在注射了白血病的IFN小鼠的脾脏和BM中，OT-I细胞的数量要高得多，在对照小鼠中OT-I细胞的回收数量很低，类似于未荷瘤的对照(图2c)。细胞荧光分析表明，大多数OT-I细胞在患有白血病的IFN和对照小鼠中上调活化受体LAG3，并获得了中央记忆或效应记忆表型，且在IFN小鼠组中活化增加。
这些发现与无肿瘤对照小鼠形成鲜明对比，在无肿瘤对照小鼠中OT-I细胞保持了幼稚表型(图2d和图8b-d)。在过继T细胞转移后的早期，与对照小鼠相比，IFN小鼠的白血病负荷已显着降低(图8e)。对照小鼠的几乎所有白血病细胞均表达NGFR标记，而IFN小鼠中NGFR阴性细胞的比例增加，表明其对OVA-ALL具有选择性压力(图8f)。
然后，我们探索了IFN细胞治疗的协同作用以及OT-1T细胞的过继转移在促进存活中的作用(图2e)。输注OT-I T细胞可导致20％的小鼠存活，而在对照组中无此结果，联用疗法可将存活率显著提高至67％(图2f)。对IFN+OT-I小鼠的纵向分析显示了OT-I扩增，其在输注后6天达到峰值，并伴有短暂的LAG3上调和OVA-ALL清除(图2g，h和图9a)。值得注意的是，死于该疾病的那些IFN+OT-I小鼠(在图2g，h和图9a中用黑色表示)显示出在血液和BM中NGFR阴性ALL细胞的生长，因而证实了输注的OT-I细胞已经消除了表达OVA的白血病细胞(图9a，c)。而相反的是，在大多数对照小鼠中OT-I细胞未能扩增，并显示出组成型高水平的LAG3表达，这是T细胞衰竭的迹象(图2g，h)。因此，在这些小鼠中输注OT-I细胞未能清除表达OVA的B-ALL细胞，其表现为在循环中表达NGFR的白血病细胞最初但短暂地减少，随后其在血液和BM中生长(图9b，d)。
尸检时，尽管IFN+OT-I小鼠的BM、脾脏和淋巴结中有相当一部分OT-I T细胞仍作为记忆库并下调PD1抑制性标记物，但是在CTRL+OT-I小鼠中大多数OT-I T细胞具有耗竭效应物的性质，因为其均表达PD1标记物(图9e，f)。正如所预期的那样，在未注射肿瘤的对照小鼠中输注OT-I T细胞没有扩增，也不上调Lag3表达(图2g，h)。总体而言，这些数据表明，尽管OT-I细胞在IFN小鼠中经过强大的活化和扩增，导致肿瘤清除，但是这些细胞在对照小鼠中功能低下，未能扩增并显示出衰竭表型的证据。
实施例3-在IFN小鼠中产生针对M1和M2应答的免疫基因标签；IFN基因疗法抵消白血病诱导的肿瘤微环境(TME)变化并增强免疫刺激程序
为研究我们的IFN基因递送策略是否改变了白血病微环境，从而有利于诱导有效的免疫应答，我们在750基因嵌板上进行了基因表达的多重测量，用于对白血病攻击前后对对照和IFN小鼠脾脏和BM上的癌症免疫谱进行分析。在IFN和对照小鼠的组织中，几乎所有显著上调的基因均是IFN刺激基因(ISG)，并且在脾脏中，T细胞活化、抗原加工、巨噬细胞/DC活化、NK活化和先天性免疫基因证实了我们的治疗在这些组织中增强IFN/Th1应答标签。这些变化在肿瘤攻击后仍然很明显，并伴随着白血病相关基因的下调(图3a)。然后，在我们纯化了脾脏CD4+T细胞以查询选定的基因，并且与对照荷瘤小鼠相比，在IFN小鼠中，发现编码Th1转录因子TBET的Tbx21显著上调，并且原型Th2和Treg基因没有变化。我们还观察到在IFN小鼠中Il17基因上调，但这种变化并不伴随其他原型Il22和Rorc Th17基因的上调(图3b和图10a)。
随后，我们鉴定了血液、脾脏和BM中髓系细胞的表型。我们发现，与对照小鼠相比，在IFN小鼠的血液中，经典(Ly6C+Ly6Glow)单核细胞的百分比增加和非经典(Ly6C-Ly6G-)单核细胞的百分比降低，并且在白血病攻击后这种差异进一步增强(图3c和图11a)。我们还发现在IFN小鼠中循环粒细胞(Ly6Cint Ly6G+)增加。在对照小鼠的脾脏中，白血病生长伴随着未成熟髓系细胞(CD11cint MHCII-F4/80-)的扩增以及MHC-II阴性M2巨噬细胞百分比的增加，而在IFN小鼠中却没有发现这些变化(图11b-d)。在IFN小鼠的BM髓系细胞中也缺乏白血病相关的变化，取而代之的是显示出了DC的增加以及在MHC-I上提呈免疫优势OVA257-264肽的DC比例的增加(图12a，b和图18)。类似地，在白血病小鼠的脾脏和BM中可见NK和NKT细胞的变化(包括活化NKG2D受体的表达降低)，在IFN小鼠中不存在(图13a-e)。
RNA测序(RNA-Seq)分析表明在巨噬细胞中存在的白血病诱导的转录变化在很大程度上被IFN基因治疗所抵消(图22a，b)。与对照小鼠相比，来自ALL小鼠的脾脏巨噬细胞中编码免疫抑制性细胞因子IL-10、免疫检查点PD-1的基因以及与细胞分裂和对免疫刺激基因本体(GO)术语的应答相关的基因上调。下调的基因富集在于脂肪酸代谢、白细胞活化和抗原提呈相关的GO术语中(图19a，c)。在ALL小鼠中的IFN基因疗法引发了免疫刺激程序，其特征是上调了在防御应答、白细胞迁移和对干扰素GO术语中富含的IFN刺激基因(ISG)，并且消除了白血病诱导的Il10上调和MHC II基因下调(图19b-d)。IFN基因疗法在ALL小鼠中诱导的ISG水平比其在对照中触发的ISG水平更高(图19d和图22a)，并且对照小鼠和IFN无肿瘤小鼠的巨噬细胞转录组显示出高度相关性，而其明显不同于ALL和IFN+ALL组的(图22b)。这些数据证实并扩展了此前的报道，即我们的单核细胞介导的基因疗法优先将IFN靶向TME(De Palma,M.等，(2008)Cancer Cell 14:299–311；Escobar,G.等，(2014)Sci.Transl.Med.6:217ra3；Catarinella,M.等，(2016)EMBO Mol.Med.8:155–170)。
为了以更加公正的方式剖析白血病和IFN基因疗法对TME的影响，我们对从给予或未给予IFN基因疗法的对照和荷瘤小鼠的脾脏中分离的CD11b+细胞进行了单细胞(sc)RNA-Seq。使用基于液滴的方法(Zheng,G.X.等，(2017)Nat.Commun.8:14049)，我们从10,821个细胞中产生了scRNA-Seq数九，检测了平均1,338个基因/细胞。使用公开的数据集(Lavin,Y.等，(2014)Cell 159:1312-1326；Varol,D.等，(2017)Immunity 46:1030-1044；ImmGen)基于图形聚类和基因标签分析鉴定了对应于单核细胞(cl.1-3)、中性粒细胞(cl.4-6)、树突状细胞(cl.7)巨噬细胞(cl.8)、自然杀伤细胞和T细胞(cl.9)、肥大细胞(cl.10)和B细胞(cl.11)的11个聚类。在单核细胞和中性粒细胞群中观察到了异质性，包括非经典(cl.1)和经典(cl.2)单核细胞、共表达单核细胞和中性粒细胞基因的聚类(cl.3)(
Figure BDA0002323808170000741
A.等，(2017)Immunity 47:890-902)以及中性粒细胞成熟中间体(图19e和图23a，b)。白血病对非经典单核细胞的转录情况具有重大影响(图19f)，其在荷瘤小鼠的脾脏中扩增(参见图11c)。包括巨噬细胞和DC在内的其他髓系细胞群显示出相对较少的白血病引起的改变(图24)。肿瘤相关非经典单核细胞上调GO术语中富含的基因，如补体激活和炎症的负向调控，而其下调与抗原加工和提呈相关的基因(图19g)。IFN治疗促进对ALL小鼠非经典单核细胞ISG驱动的免疫刺激程序，如在GO术语中富含与防御和先天性免疫应答相关的基因以及MHCII基因上调所证实的(图19g,h)。如通过基于图形聚类和差异基因表达(图19f，h)所揭示的，IFN基因疗法对TME的转录重编程在来自对IFN基因疗法无应答小鼠的非经典单核细胞中效果较差(图25a)。来自非经典单核细胞的scRNA-Seq数据子聚类鉴定出了四个主要子聚类(1A至1D；图25b)。子聚类1A包含来自对照和IFN小鼠的无疾病小鼠，而其他3个子聚类与来自IFN+ALL应答者(1B)、INF+ALL无应答者(1C)和ALL(1D)的细胞大部分重叠。最小生成树(MST)分析揭示了从1A至1D的轨迹，从而证实了在无应答者对比应答者IFN小鼠细胞中的部分重编程和有效重编程(图19i)。
出乎意料的是，我们还发现了在注射肿瘤的IFN小鼠的BM中，FOXP3+CD25+CD4+T细胞的数量增加(图12c，d)。总体而言，这些变化与在IFN小鼠中M1和Th1应答激活一致，在白血病攻击后，这可能有利于诱导保护性免疫应答。
实施例4-IFN治疗诱导靶向多个肿瘤抗原的持久性抗肿瘤应答
然后，我们考察了是否靶向肿瘤的IFNα治疗也能在小鼠中促进长期持久性应答。令人惊讶的是，平均有24％(5次不同实验的平均值，n＝11、14、8、16、12)的IFN小鼠可以长期存活并且可以有效治愈该疾病，而仅有2％的对照小鼠(n＝13、14、8、16、13)存活下来(在图4a和图14a中显示了一次代表性实验的结果)。值得注意的是，当基于存活时间对小鼠进行层化时，我们发现肿瘤注射后较早处死的小鼠显示出较低的循环OVA特异性T细胞百分比并且没有出现NGFR阴性ALL(图14b)。而相反的是，在较晚时间点处死的小鼠显示出诱导产生了可变百分比的循环OVA特异性T细胞并且出现了NGFR阴性ALL克隆(图14b)。这些结果表明，死于该疾病的小鼠要么未能激发免疫应答而过早死亡，要么激发了抗OVA应答，但最终由于这些细胞无法保护小鼠而死亡，其分别是由于耗竭或出现了免疫选择性的OVA阴性ALL克隆。长期存活者显示出了稳定的循环OVA特异性T细胞，并且当使用OVA-ALL再次攻击时，仍是无病的(图4b和图14c)。肿瘤清除与循环OVA特异性T细胞的扩增相关，表明记忆性T细胞应答的发展在保护小鼠免受随后的肿瘤攻击中起到关键作用(图14d)。令人惊讶的是，当使用1:1比例的这些细胞或单独的亲本细胞再次攻击时，长期存活的IFN小鼠有效清除了表达OVA以及亲本OVA阴性的ALL细胞，这表明对其他肿瘤相关抗原(TAA)的应答扩散已经出现，并且可能是实现长期持久性保护所需的(图4c、d和图14e)。
实施例5-IFN治疗与CTL4阻断联用提高了白血病的存活
然后，在我们的实验性OVA-ALL模型中，我们考察了CTLA-4阻断疗法与靶向肿瘤的IFNα治疗的组合(图4e)。尽管所有治疗组——单独的IFN基因疗法或使用CTLA4治疗或其组合与对照相比均显著提高了小鼠的存活，但是联用疗法更为有效(IFN 21％；aCTLA4 20％；CTRL+同种型对照抗体7％；IFN+aCTLA4 36％；图4f和图15a)，如在第二项实验中所证实的(IFN+αCTLA430％对比αCTLA4 8％；图4g和图15b)。IFN或aCTLA-4治疗增加了PB中OVA207特异性T细胞的百分比，在联用组中其进一步增加(图16b)。因此，在IFN+aCTLA4和aCTLA4组中，NGFR阴性ALL的免疫选择更为明显，尽管并没有始终伴有疾病进程的延迟(图16a)，这表明对单一新抗原的免疫应答可能无法负担肿瘤保护。除了占优势的OVA抗原以外，我们的ALL模型还表达了OFP(其与miR-126共表达)和原核反式激活因子tTA(其上调miR-126的表达)，其是有助于驱动转化的表型的潜在新抗原(参见图1a)。我们用表达LV的tTA、OFP、NGFR或OVA转导的靶细胞刺激长期存活小鼠的外周血单核细胞(PBMC)(来自图4f所示的实验)，并通过ELISPOT测量了γ-IFN的产生情况。除了OVA以外，这些小鼠中的大部分显示出了针对一种或多种新抗原的反应性，观察到其针对tTA的应答最强和针对NGFR的应答最弱(图4h)。
这些发现表明在大多数长期存活的小鼠中发生了针对其他新抗原的免疫应答的扩散。然后，我们使用1:1比例的OVA阳性和阴性ALL再次攻击了这些小鼠，并且发现其中的大多数从再次攻击中存活下来。有趣的是，对个别小鼠的分析表明，那些未能存活的小鼠未能产生针对肿瘤抗原的广泛应答和/或死于选择了缺乏一种以上新抗原的ALL克隆(补充表1)。对作为小鼠存活基础的适应性免疫应答的进一步指示，我们比较了白血病攻击前后PBMC的TCR-β互补性决定区(CDR)库。在白血病再次攻击后，在不同小鼠之间库的生殖克隆性(多样性指标，在每只小鼠中范围从0＝多克隆到1＝单克隆)和相似性增加，表明在存活小鼠中针对一组常见TAA的肿瘤反应性T细胞克隆扩增(图4i和图16c)。
为进一步评估是否产生针对多种新抗原的应答是长期存活的预测指标，我们进行了一项新实验，并收集了OVA-ALL攻击后早期的PBMC，以通过IFNg-ELISPOT测定考察针对所有已知TAA的T细胞反应性。显示出包含多种TAA的抗肿瘤库的小鼠比仅对单一TAA产生应答或无TAA应答的小鼠具有高得多的长期存活可能性，后者均死于该疾病(图4j，k)。
总而言之，这些数据表明，IFN基因疗法和CTLA4阻断均增加了T细胞的启动作用并扩大了针对肿瘤新抗原的应答库，并且这些应答是能够叠加的并对肿瘤侵害产生长期保护作用。
实施例6–IFN基因疗法增强过继转移CAR19转导的T细胞的活化和扩增并提高存活
为了在临床相关模型中进一步探索IFN基因疗法与过继性T细胞转移之间的协同作用，我们制备了表达此前描述的靶向小鼠CD19的第二代(2G)CAR(CART19细胞)以及整合了CD28内共刺激结构域的T细胞(Kochenderfer,J.N.等，(2010)Blood 116:3875–3886)，并将其给予已注射亲本(OVA-阴性)ALL的小鼠。对于CAR基因转移，我们利用了协同表达CAR和来自双向启动子的NGFR标记物的LV(Casucci,M.等，(2013)Blood 122:3461–3472)(图26a，b)。为了植入CART19细胞(Davila,M.L.等，(2013)PLoS One 8:1–14)，在输注前使用环磷酰胺对小鼠进行调理(图20a)。在我们的实验条件下，单独使用CART19细胞几乎不会对对照组小鼠迅速生长的ALL产生任何影响，但是在IFN小鼠中其显著抑制白血病负荷并耗竭正常B细胞(图20b和图26c)。这让人联想到了使用OT-I T细胞的发现，在IFN而非对照小鼠中CART19细胞显示出了早期和暂时性的LAG3和PD1上调，其在长期IFN存活者中达到最高峰(图20c和图26d，IFN长期存活者用绿色表示)。有趣的是，在IFN小鼠的CART19细胞上NGFR表达也上调，这可能反映了在IFN小鼠中产生了响应于CART细胞更高的代谢活化的磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)活性的增加(图26e，f)。由于在我们的LV中，NGFR和CAR19的表达由PGK启动子共同调控，因而后者更高表达可能也有助于在IFN小鼠中更有效地杀死CD19+ALL。我们还检测了改进的CD19 CAR形式(iCAR19)，其在第1个和第3个CD3ζITAM结构域含有失活突变，据报道与标准CAR19相比，其可以提高杀伤效率并增加T细胞活力(Kochenderfer,J.N.等，(2010)Blood 116:3875–3886)。我们以较低或交给的白血病负荷给予对照或IFN小鼠表达CAR19的T细胞或对照T细胞(图20d和图27a，b)。尽管在对照小鼠中CART19和iCART19细胞对肿瘤负荷均具有可检测但不显著的影响，但是在早期和晚期干预试验中，其均显著抑制IFN小鼠的ALL(图20e)。在来自IFN小鼠的这两种CART19细胞中我们也证实了早期LAG3上调(图20f)。纵向分析显示，在IFN小鼠中iCART19扩增的峰值与在IFN小鼠中ALL的生长抑制或清除以及NGFR/CAR19表达的早期上调相关(图27c，d)。总体而言，在最新的随访中，很大一部分用CART19细胞治疗的IFN小鼠仍然存活(图20g)。
材料和方法
实验设计
根据此前在实验模型和测定中的经验选择样本量。未从分析中排除样品或动物。将小鼠随机分配至各实验组。研究者是非盲的。
质粒构建和LV产生
此前已描述了mTie2-IFN-mirT、mTie2-GFP-mirT、PGK-OFP、PGK-tTA LV9,10,14。NGFR-OVA转移BdLV是通过利用PCR克隆从PGK-OVA LV37中扩增的OVA cDNA(AgeI–SalI)替代NGFR-GFP BdLV38中的GFP cDNA(AgeI–SalI)产生的。使用的引物如下所示：引物：Fw：5’-CGACCGGTCCACAAAGACAGCACCATGACA；引物：Rv：5’-ATTGTCGACTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGA。NGFR-CD20转移BdLV是通过从合成质粒中(KpnI blunt–SalI)克隆密码子优化的人CD20cDNA替代NGFR-GFP BdLV中的GFP cDNA(AgeI blunt-SalI)产生的。NGFR-CAR19和NGFR-iCAR19转移BdLV是通过此前描述的(Kochenderfer,J.N.等，(2010)Blood 116:3875–3886)利用PCR克隆CAR19和无活性的CAR19序列替代NGFR-GFP BdLV中的NGFR-GFP BdLV(AgeI–SalI)产生的。使用了下述引物：引物Rv(无活性的CAR19)：5’-AAACAGCTCCTCGAGTTATCTAGGGGCCA；引物Rv(CAR19)：5’-AAACAGCTCCCTCGAGTCATCTAGGGGCCAGT；引物Fw(CAR19和无活性的CAR19)：5’-AACACCGGTGTACCGAATTCATGGGCGTG。如此前所述(Follenzi,A.等，(2000)Nat.Genet.25:217–222)生产和滴定浓缩的VSV-G假型LV。
小鼠
C57Bl/6Ly45.2和Ly45.1小鼠购自Charles River Laboratory。C57Bl/6 Ly45.1/Ly45.2由在圣拉斐尔科学研究所动物研究实验室中将C57Bl/6Ly45.2和C57Bl/6Ly45.1小鼠杂交获得，将其作为HPC移植的供体。将转基因OT-I C57Bl/6Ly45.2小鼠在圣拉斐尔科学研究所动物研究实验室中集中饲养。所有动物操作均根据圣拉斐尔科学研究所动物保护和使用委员会(IACUC 600)批准的方案进行，并根据意大利法律上报给卫生部和地方主管机关。
造血干细胞和祖细胞(HSPC)的移植
在C57Bl/6小鼠中移植HSPC
使用CO2处死6周龄的C57Bl/6Ly45.2/Ly45.1小鼠，并通过冲洗股骨和胫骨来收集BM。使用基于免疫磁柱的细胞纯化系统(小鼠谱系细胞耗竭试剂盒，Miltenyi,#130-090-858)从总BM中分离出富含HS/PC的谱系阴性细胞。然后，在将106个谱系阴性细胞/ml在含有混合细胞因子(20ng/ml IL-3，100ng/ml SCF，100ng/ml FLT-3L，50ng/ml TPO，均来自Peprotech)的无血清StemSpan培养基(StemCell Technologies)中预刺激3-4hr，随后使用所示的慢病毒载体以108个转导单位/ml的剂量在相同的含细胞因子培养基中转导上述细胞12hr。转导后，洗涤细胞并将106个细胞通过尾静脉输注至经致死剂量照射的6周龄雌性C57Bl/6Ly45.1中。照射剂量为935cGy，分两次进行。另外，在IMDM培养基中在体外培养转导细胞15天，IMDM培养基中补充了10％FBS、SCF(100ng/ml)、FLT3L(100ng/ml)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100ug/ml)和2％谷氨酰胺，然后如此前所述(De Palma等，Blood2005)通过qPCR，将其与从已稳定重建造血系统(6周)的移植小鼠中分离的PMNC细胞一起进行检测，以便对VCN进行定量。
肿瘤研究
小鼠OVA-ALL
通过使用NGFR-OVA BdLV转导亲代ALL克隆#1114产生OVA-ALL亚克隆。简言之，在补充了10％FBS、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100ug/ml)、2％谷氨酰胺、IL3(20ng/ml)、SCF(100ng/ml)、FLT3L(100ng/ml)、TPO(50ng/ml)的Stem Span中以2x106 cell/ml的浓度培养ALL，并使用2x107TU/ml NGFR-OVA BdLV对其进行转导。暴露于LV后6小时，洗涤转导的ALL并将其静脉注射至经亚致死剂量照射(450cGy)的受体C57Bl/6Ly45.2小鼠中。在14天后(当ALL达到总PB细胞的90％时)处死白血病小鼠，并通过洗涤股骨和胫骨收集BM。
通过免疫磁性细胞标记(CD271 MicroBead试剂盒，Miltenyi,#130-099-023)分离NGFR+转导的细胞。通过流式细胞术分析，使用抗NGFR抗体标记细胞，确定所选择的ALL的纯度，估计为98％(NGFR+ALL；见图5a)。然后，将OVA-ALL批次在多个等分试样中冷冻，贮存在液氮中，并用于所有实验。对于肿瘤攻击而言，静脉注射给予小鼠重悬于200μl磷酸盐缓冲液(PBS)中的1剂105个OVA-ALL或3x104个亲本ALL。对于再次攻击实验而言，我们将OVA-ALL与亲本(OVA-阴性)ALL以1：1比例混合(共计105个ALL)。在体内注射前，使用抗NGFR抗体标记混合细胞，通过流式细胞术分析对输注产品组合物进行确证。通过对定期PB取样进行细胞荧光分析确定肿瘤生长动力学。对于存活研究而言，每天对小鼠进行检查，并在显示出痛苦迹象时评估其疾病状态，然后处死，并在无菌条件下收集BM和脾脏进行进一步分析。对于CTLA-4阻断实验而言，从亲本ALL或OVA-ALL注射后第3天开始腹腔注射施用小鼠抗-小鼠CTLA4阻断单克隆抗体(mAb克隆9D9 BioXCell，#BE0164)或小鼠同种型对照抗体(mAb克隆MCP-11BioXCell，#BE0086)，其初始剂量为200μg/小鼠，随后剂量为100μg/小鼠，每3-4天施用一次，共计进行5次抗体输注。
体内CD8 T细胞耗竭
对于体内T细胞耗竭而言，在OVA-ALL注射前一天以及然后在整个实验持续期间每3天一次以200ug/小鼠的剂量腹腔注射给予小鼠抗CD8耗竭单克隆抗体(mAb 53-6.72BioXCell，#BE0004-1)。
过继性OT-I T细胞转移
对于过继性T细胞实验而言，通过免疫磁性选择(CD8+T细胞分离试剂盒，Miltenyi,#130-104-075)从8周龄转基因雌性OT-I C57Bl/6Ly45.2小鼠的脾脏中纯化OT-I细胞。使用一组抗CD8、CD4和CD3抗体通过细胞荧光分析评价选定的OT-1T细胞的纯度。在OVA-ALL注射后的所示时间点，静脉注射给予移植的IFN或CTRL小鼠1x106个幼稚OT-I T细胞。
CART19细胞的产生
首先，根据生产厂商的说明书，通过免疫磁性选择(泛T细胞分离试剂盒，Miltenyi,#130-095-130)从8周龄转基因雌性C57Bl/6CD45.2+小鼠的脾脏中纯化T细胞，随后使用抗-CD3/CD28 Dyna小珠(ThermoFisher#11452D)活化。在补充了10％FBS、青霉素(100U/ml)、链霉素(100ug/ml)、1％谷氨酰胺、IL2(30u/ml)、IL7(5ng/ml)、IL15(5ng/ml)、丙酮酸钠(1mM)、Hepes(20mM)、NEAA(1uM)和β-巯基乙醇(0.05mM)的RPMI中培养T细胞。活化后1天，使用108TU/ml的NGFR-CAR19或NGFR-iCAR19 BdLV转导浓度为1x106个细胞/ml的T细胞。暴露于LV 12小时后，洗涤T细胞并在培养基中扩增8天，随后以7x 106个(图20b中的实验)和107个(图20e中的实验)NGFR+T细胞的剂量输注给予小鼠。
体外Edu增殖测定
使用5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU,Invitrogen)(一种可替代BrdU的胸腺嘧啶类似物)进行体内增殖试验。以10mg/ml的浓度将EdU溶于无菌1x PBS。腹腔注射给予小鼠100μgEdU 24h后进行分析。根据生产厂商的说明书，收集和处理BM和脾脏(EdU流式细胞术测定试剂盒，Invitrogen,#C10636)，并且通过流式细胞术分析测量掺入白血病细胞的EdU百分比。
细胞培养和转导
将来源于小鼠EL4 C57Bl/6的淋巴瘤细胞系维持在补充了10％FBS、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和2％谷氨酰胺的IMDM中。以浓度为106个细胞/ml和所示载体原液的剂量为108TU/ml进行转导。孵育细胞12小时，然后洗涤以除去载体。培养7天后，通过流式细胞术分析评估转导细胞上的OFP。通过在转导后7天使用抗-NGFR或抗-CD20抗体对细胞进行染色评价NGFR和CD20的表达情况(参见流式细胞术章节)。如此前所述(De Palma等，Blood 2005)，在培养15天后，通过实时qPCR确定转导细胞的VCN。
流式细胞术
所有细胞计数分析均使用FACSCanto II和LSRFortessa仪器(BD Bioscience)进行，并使用FlowJo软件(v.9.3,Tree Star Inc.)进行分析。
培养的细胞
洗涤EL4细胞并将其重悬于含2％FBS的PBS中。对于免疫染色而言，在4℃下使用抗-小鼠Fc受体阻断抗体孵育细胞15min，然后在4℃下使用抗NGFR或抗CD20抗体染色20min(对于抗体参见补充表1)。为了从分析中排除死细胞，洗涤细胞并将其重悬于含10ng/ml 7-氨基放线菌素D(7-AAD)的PBS中。
外周血
对于每只小鼠而言，将250μl外周血加入10μL含45mg/mL EDTA的PBS。为了进行免疫染色，首先在室温下使用抗-小鼠FcγIII/II受体(Cd16/Cd32)封闭抗体孵育已知体积的全血(100μl)，然后在存在单克隆抗体的情况下(有关抗体，参见补充表1)在室温下孵育15min。在存在等体积FBS(100μl)的情况下，用TQ-Prep工作站(Beckman-Coulter)裂解除去红细胞，以保护白细胞。对于定量流式细胞术，如上所述，我们首先对已知体积的血液(100μl)进行染色和裂解，然后我们使用已知浓度的Beckman Coulter,#7547053加入固定体积(50μl)的流式计数荧光球。为了确定细胞的绝对数量，我们使用以下公式：绝对计数(细胞/μl)＝[计数的细胞总数/(计数的荧光球总数x 2)]x流式计数荧光球的浓度。对于OVA特异性五聚体染色，首先将全血用H2O裂解。然后，将1x106个PBMC重悬于50ul含2mM EDTA和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，并且在室温下使用抗-小鼠FcγIII/II受体(Cd16/Cd32)封闭抗体孵育10min，随后使用OVA特异性五聚体试剂(0.5μg/1x106个细胞)和单克隆抗体(有关抗体，参见补充表1)在室温下再孵育10min。为了从分析中排除死细胞，洗涤细胞并将其重悬于含2％FBS和10ng/ml 7-氨基放线菌素D(7-AAD)的PBS中。对于PB中的Treg细胞染色，如上所述，我们首先对50μl全血(有关抗体，参见补充表1)进行表面染色。然后，洗涤染色的全血并重悬于100ul固定/穿透溶液(eBioscience,#00-5523-00)中，在室温下孵育20min，洗涤并重悬于50μl含抗-小鼠FoxP3或同种型对照抗体的穿透溶液中，并且在室温下孵育20min。
骨髓
通过在含2％FBS的PBS溶液中冲洗股骨并使细胞悬液通过40μm尼龙滤器以获得BM细胞。洗涤细胞(1x106–3x106个细胞)，重悬于100μl含2mM EDTA和0.5％牛BSA的PBS中，使用抗-小鼠FcγIII/II受体(Cd16/Cd32)封闭抗体在4℃下孵育15min。然后，使用单克隆抗体(有关抗体，参见补充表1)在4℃下染色20min。对于OVA特异性五聚体染色而言，如上针对PB所述，对1x106个BM细胞染色。对于所有细胞内染色和某些表面染色，根据生产厂商的说明书，将LIVE/DEAD固定死细胞染色(ThermoFisher,#L34959)用于区分活细胞和死细胞。对于PB中的Treg细胞染色，如上针对PB所述，我们首先对1x106个BM细胞进行表面染色。
脾脏
首先将脾脏捣碎，并使所得的细胞悬液通过40μm尼龙过滤器。使用H2O裂解红细胞，将获得的细胞悬液进一步通过40μm尼龙过滤器，并在含2mM EDTA和0.5％BSA的冷PBS中洗涤。如上述针对BM所述，处理细胞并进行免疫染色。
细胞周期染色
如上所述，从注射OVA-ALL的小鼠中收集BM细胞和脾细胞。随后，对细胞进行表面标记物染色，洗涤并使用BD Cytofix缓冲液(BD#554655)固定，洗涤并使用BD Perm 2(BD#347692)穿透，洗涤并使用与PerCP-Cy5.5-or APC-缀合的Ki67抗体染色以及最后重悬于含1μg/mL Hoechst的BD Cytofix缓冲液中。然后在带有UV激光的BD LSRFortessa机器上分析细胞。
细胞凋亡染色
如上所述，从注射OVA-ALL的小鼠中收集BM细胞和脾细胞。然后，如上所述，使用表面标记物对细胞进行染色。随后，使用细胞染色缓冲液(BioLegend,#420201)洗涤染色的细胞2次，将其重悬于Annexin V结合缓冲液(Biolegend#422201)中，并使用5ul与Pacificblue缀合的Annexin V和10ul 7-AAD(Biolegend,#420403/420404)在室温下孵育15分钟。之后，将400ul Annexin V结合缓冲液加入每个样品中，并通过流式细胞术分析在染色30min内测量OVA-ALL中凋亡/死细胞的百分比。
ELISPOT测定
在包被了5μg/ml抗小鼠IFN-g一抗(BD,#554430)的96孔平底培养板(Millipore)中进行g-IFN ELISPOT。首先，使用免疫磁性细胞标记(CD8MicroBead试剂盒，Miltenyi,#130-049-401)纯化脾脏CD8+效应T细胞，并且通过细胞荧光分析使用一组抗CD8、CD4和CD3抗体评价纯度。随后，在存在经照射(6000cGy)的105个EL4靶细胞的条件下，以105或2x105个细胞/孔的终浓度将效应T细胞铺板。对于一些实验，我们还使用2.5μg/ml刀豆蛋白A刺激效应T细胞作为对照。在37℃/5％CO2下孵育46小时后，洗涤细胞并使用生物素化的抗小鼠IFN-g抗体(克隆XMG 1.2，BD#554410，1μg/ml)孵育2小时。然后使用PBS-吐温洗板4次，之后使用PBS洗板3次，随后再加入亲和素-POD(Roche#11089153001)(在PBS中以1:5000稀释)孵育1小时。然后使用PBS-吐温洗板4次，之后使用PBS洗板3次，随后再向每孔中加入50μl 3-氨基-9-乙基咔唑底物(AEC,SIGMA#A6926/50tab)孵育15-20分钟。通过加入自来水终止反应，使用ELI-Expert.Elispot-Reader对斑点进行定量并使用Eli.Analyze 5.1版(A.EL.VIS)进行分析。当使用总PBSC作为效应细胞时，首先使用H2O裂解全血以消除红细胞，对回收的PBMC计数并以105个细胞/孔的终浓度铺板。
RNA提取、qPCR和基因表达分析
使用RNeasy Plus微量试剂盒(Qiagen)从BM细胞、脾细胞和纯化的脾脏CD4+T细胞中提取RNA。在补充了β巯基乙醇的Buffer RLT plus中裂解细胞。然后，使裂解物通过20号针头。随后，根据生产厂商的说明书提取RNA。使用SuperScript Vilo试剂盒(11754250；Invitrogen)对提取的mRNA进行逆转录。在单基因上进行的所有Q-PCR分析均使用AppliedBiosystems(如下所示)的TaqMan探针进行。使用Viia 7仪器进行40个循环的QPCR，然后使用Viia 7软件提取原始数据(Ct)。为确定基因表达情况，计算每个基因的阈循环(Ct)与参照基因之间的差异(ΔCt)。ΔCt越低，基因表达水平越高。为获得相对定量值，然后我们利用公式2–ΔΔCt计算了目标基因表达相对于其参照样品表达的变化倍数。针对两组之间的每个基因，根据平均2–ΔΔCt值的Mann-Whitney计算p值。
在纯化的小鼠脾脏CD4+T细胞上使用了下述Taqman探针：Il10(Mm00439616_m1)、Il17(Mm00439618_m1)、Ifn-g(Mm01168134_m1)、Il2(Mm00434256_m1)、Tbx21(TBET)(Mm00450960_m1)、Rorc(Mm01261022_m1)、Foxp3(Mm00475156_m1)、Gata3(Mm00484683_m1)、Il22(Mm00444241_m1)、Il4(Mm00445259_m1)。
TCR测序
从肿瘤注射前(T0)，在无肿瘤长期存活小鼠中在OVA-ALL注射后30天(T1)以及使用以1:1比例混合的OVA-ALL与亲本ALL再攻击后4天(T2)的IFN和CTRL小鼠的PBMC获得输入DNA。在Adaptive Biotechnologies使用ImmunoSEQ平台进行TCRβ链测序，其使用对所有54种已知表达的Vβ和所有13Jβ区具有特异性的引物。对每个在氨基酸水平的独特CDR模板均以每百万计数(cpm)进行定量。以1-Pielou均匀度39评价克隆性：
Figure BDA0002323808170000841
其中H’是样本的熵，以大于0的模板计数(即，小鼠中所有可见模板的结合)计算得到，H是小鼠的最大理论熵，其定义为
H＝in(S)
其中S是小鼠中独特模板的数量。以1-样本s与在t时间下模板计数平均值之间的Bray-Curtis距离评价相似性。
Figure BDA0002323808170000851
该指标等同于
Figure BDA0002323808170000852
相似性指数，对其进行了评估，包括在时间t时所有i观察到的模板。
批量RNA测序
使用ReliaPrep RNA MiniPrep系统(Promega)从10,000-50,000个分选细胞中提取RNA，并使用经过较小修改的SMART-Seq2方案(Picelli,S.等，(2014)Nat.Protoc.9:171-181)制备RNA-Seq文库。简言之，使用定制的oligodT和模板转换LNA寡核苷酸(序列)对RNA(1-5ng)进行逆转录，随后进行PCR扩增和纯化(Ampure XP小珠，Beckman Coulter)。将所得到的cDNA(0,5-1ng)在55℃下标记30分钟，并使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备最终的RNA-Seq文库。在NextSeq 500机器(Illumina,San Diego,CA)上使用NextSeq 500/550高输出v2试剂盒(75个循环)进行测序。
单细胞RNA测序
根据生产厂商的说明书，在铬单细胞控制器(10X Genomics,Pleasanton,CA)上使用铬单细胞3’试剂盒v2进行基于液滴的数字3’端scRNA-Seq。简言之，将悬浮的单细胞在Gel Beads in Emulsion(GEM)中分配和裂解，随后进行RNA条码化、逆转录和PCR扩增(12-14个循环)。根据生产厂商的说明书制备即用型测序scRNA-Seq，在2100生物分析仪(Agilent Genomics,Santa Clara,CA)和Qubit 3.0((Invitrogen,Carlsbad,CA)仪器上进行检查和定量。在NextSeq 500机器(Illumina,San Diego,CA)上使用NextSeq 500/550高输出v2试剂盒(75个循环)进行测序。
计算方法
使用CellRanger 1.3版(https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger)利用缺省参数对原始数据进行处理，并与ENSEMBL mm10转录组进行比对。仅保留带有有效条形码和UMI(唯一分子标识符)的可信映射读段，非PCR重复项。我们滤除了低质量细胞。针对细胞最低需要检测300个独特的基因，另外还要弃去线粒体与内源基因表达之比超过0.1的细胞。结果保留了10,821个细胞进行进一步分析。基因表达值以每百万的对数转化的转录本[log(TPM+1)]进行定量。使用R软件包Seurat 2.1版(https://github.com/satijalab/seurat/)进行下游分析。在1,031个最大可变基因上进行细胞聚类和tSNE分析，所选择这些基因的平均表达高于0.01，并且对数转化的方差与平均值之比高于0.5。
Nanostring数据分析
根据生产厂商的说明书，使用针对小鼠嵌板的nCounter PanCancer免疫分析仪(Nanostring Technologies)在nCounter SPRINT仪器上评价RNA表达情况。按照如下所示处理使用获得的转录本计数。使用R/Bioconductor libraryNanoStringNorm(v 1.1.21)将在RCC文件中的原始计数归一化40；使用内参对照的几何平均值对技术测定变异进行归一化，通过计算阴性对照的平均值对背景进行估算，使用管家基因表达的几何平均值对RNA计数进行归一化，并应用附加方差稳定化方法。通过在R/Bioconductor limma库中实现的线性模型评估归一化数据的差异表达41。当阈值经校正的p值<0.05时(Benjamini-Hochberg校正)，认为转录本是差异表达的。
统计学分析
如所示的，值以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。除非另有说明，否则使用Mann-Whitney检验或Kruskall-Wallis检验，然后用Dunn后检验进行校正。当p<0.05时，认为差异具有统计学显著性。使用R 3.2.242、NPC Test R1043和Prism(GraphPad Prism 7.0版)进行分析。通过非参数组合检验43对图2中的细胞群进行分析，该检验是对参数化Hotelling T平方二样本检验的基于排列的替代检验。这种方法可以在不满足多元正态性假设的情况下，以少量观察值对组中的平均值进行多元比较。图1a，l、图16b、图17和图20b，e是在非参数框架内建模的，这样就可以考虑小样本量，存在异常值，非高斯分布和严重偏斜的数据分布，这对于参数化程序而言是不合适的。采用了一种耐用且灵活的基于秩的方法，其适于析因设计中的纵向分析44,45。在这种情况下，假设检验的重点是检测所收集变量分布的差异，而非其平均值之间的差异46,47。该分析是使用R46开发的nparLD软件包进行的。通过Kaplan-Meier(KM)估算生存曲线。这里考虑的事件变量是死亡事件，因此不会出现信息删失。使用非参数对数-秩(Mantel-Haenszel)检验统计方法，以比较与k样本相关的k生存曲线48。在存在两个以上组的情况下，通过Bonferroni法校正p值可以解决多重比较的问题。
实施例7
我们开发了一种用于干扰素-γ(IFNγ)(II型干扰素)的肿瘤特异性表达的新型慢病毒载体构建体。如此前所述，通过转录控制，即通过来自Tie2(Tek)基因座的增强子/启动子序列的转录控制，提供肿瘤特异性，从而在肿瘤浸润髓系细胞子集中选择性地驱动转基因表达，同时借助被miR-126-3p和miR-130a所识别的微RNA靶序列阻止其在造血干细胞和祖细胞中表达(Escobar,G.等，(2014)Sci Transl Med 6:217ra3)。将该构建体称为“Tig126/130a”。
将在Tie2和miR-126靶序列控制下表达干扰素-α的类似构建体(即，Tie2.Ifna.126T)称为“Tia126”。
除了Tig126/130a和Tia126载体以外，我们开发了携带肿瘤坏死因子α(Tnfa)基因cDNA的慢病毒载体，将其称为“Tta126/130a”。构建体的结构(例如，Tig126/130a和Tta126/130a)如图28中所示。
通过使用Tig126/130a离体转导造血干细胞和祖细胞(HSPC)，随后将经工程改造的细胞移植到条件化的受体中可以实现治疗。植入后，HSPC子代将扩增和分化，并且其中的一些将被募集到肿瘤微环境中。在肿瘤浸润单核细胞/巨噬细胞子集中，特别是在位于血管周围区域并且具有促血管生成和免疫抑制功能的表达Tie2的单核细胞/巨噬细胞(TEM)中，启动子的活性特别地上调(De Palma,M.等，(2005)Cancer Cell 8:211-226；De Palma,M.等，(2008)Cancer Cell 14:299-311)，在这一战略性位置递送货物(例如，IFNγ)。
我们使用了能够很好地模拟人费城样B-ALL的可移植的B-急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)模型(Nucera,S.等，(2016)Cancer Cell 29:905-921)，其能够容易地诱导例如特征为出现髓系来源抑制细胞、II类MHC基因下调和IL10和PD1上调的促肿瘤的免疫抑制性微环境。
我们首先评估了基于Tig126/130a的IFNγ递送对白血病生长以及由白血病诱导的促肿瘤微环境的影响(图29)。
使用谱系阴性HSPC对6至8周龄C57/BL6小鼠进行重建，HSPC已使用Tig126/130a、Tta126/130a或对照慢病毒载体转导，对照慢病毒载体表达无生物活性的、截短的神经生长因子受体(NGFR)基因。Tig126/130a和Tta126/130a的剂量在体外分别用载体拷贝数定量为1,39和2,01，以及在体内分别定量为0,44和0,83。移植后8周，待外周血重建后，给予动物B-ALL，然后频繁采血。与对照动物相比，经工程化改造以表达IFNγ的小鼠显示出疾病进展明显减缓(图29A)。而且，在处死时，我们观察到脾脏巨噬细胞上II类MHC表达上调(图29B)以及在骨髓中来源于髓系的抑制细胞减少(图29C)，这均表明肿瘤微环境转化为了具有更高抗肿瘤性的“M1样”极化状态。Tig126/130a基因疗法对白血病的抑制程度与我们此前使用相似载体骨架(Tia126)开发的I型干扰素货物(即，干扰素-α)、相同的递送平台以及相似的白血病模型观察到的结果相当。而相反的是，如果作为单药疗法进行开发，Tta126/130a载体对白血病的生长没有可测量的作用。
然后，我们使用配有不同转基因货物的Tie2载体骨架将几种免疫刺激性细胞因子同时递送到白血病微环境中。与Tia126单药疗法或使用无生物活性的Tie2.NGFR载体转导的对照组相比，我们使用Tia126、Tig126/130a和Tta126/130a载体的双重组合共同转导谱系阴性HSPC，并将所述细胞移植到经致死剂量照射的受体小鼠中。与预期的一样，由于细胞因子的联合表达，小鼠发生了重建且没有附加毒性。通过特异性定量PCR测定测量了单一载体的载体拷贝数，其在重建小鼠中相当低，范围从0.1至0.3。如上所述，使用B-ALL攻击小鼠。与对照相比，单独使用Tia126可以减少白血病生长，其类似于与Tig126/130a或Tta126/130a联用(图30A)。
出乎意料的是，Tig126/130a和Tta126/130a的组合导致白血病进展的显著减缓，其与在脾脏巨噬细胞上II类MHC的表达显著增加(图30B)、MDSC减少(图30C)和在脾脏中的细胞毒性CD8+T细胞增加(图30D)相关。这些数据表明，通过在Tie2增强子/启动子的控制下的白血病浸润髓系细胞在肿瘤微环境中局部表达的IFNγ和TNFa之间具有协同作用。
此外，我们评价了我们的基于IFNγ递送的基因疗法与其他免疫治疗策略之间的潜在协同作用，其他免疫治疗策略包括检查点抑制剂抗-CTLA-4和抗-LAG-3以及IDO酶抑制剂1-甲基-色氨酸(1-MT)。我们使用Tig126/130a或不具有生物活性的对照Tie2.NGFR载体转导了谱系阴性HSPC，并将所述细胞移植到经致死剂量照射的受体小鼠中。与预期的一样，由于细胞因子的联合表达，小鼠发生了重建且没有附加毒性。通过特异性定量PCR测定测量了单一载体的载体拷贝数，在重建小鼠中针对Tig126/130a和对照的载体拷贝数分别为0,72和0,84。如上所述，使用B-ALL攻击小鼠。
我们观察到，尽管抗-CTLA-4(αCTLA4)和抗-LAG-3(αLAG3)的单药疗法在减缓B-ALL进展方面已显示出一些有效性，但是1-MT治疗没有任何有益效果(图31A)。此外，基于IFNγ递送的基因疗法与1-MT和检查点抑制剂联用可提高治疗的有效性，从而减缓疾病进展(图31A)，其与脾脏和骨髓巨噬细胞上的II类MHC表达显著增加(图31A和31B)和脾脏中细胞毒性CD8+T细胞增加(图31D)相关。
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Claims (23)

1.包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其用于在患者中预防或治疗癌症的用途，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞与免疫检查点抑制剂、肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞和/或1-甲基-色氨酸(1-MT)联用，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，或II型IFN(优选地IFNγ)，
更优选地其中所述I型IFN是IFNα。
2.根据权利要求1所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或所述单核细胞与免疫检查点抑制剂和TAA-特异性T细胞联用。
3.根据权利要求1或2所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述TAA-特异性T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或转基因T细胞受体(TCR)。
4.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述TAA选自下组：癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕激素受体、肝配蛋白B2、ROR1、间皮素、c-Met、GD-2、MAGE A3 TCR、4-1BB、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD152、CD200、CD22、CD19、CD22、CD123、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD4、CD40、CD44、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CS-1、CNT0888、CTLA-4、DR5、EpCAM、CD3、纤连蛋白额外域(extra domain)-B、叶酸受体1、糖蛋白75、GPNMB、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、SCH900105、SDC1、SLAMF7、肌腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、5T4、CD5、CD19、CD20、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、CAMPATH-1(CDw52)、HLA-DR、抗-独特型、TAG-72、Ep-CAM、MUC1、叶酸结合蛋白、A33、G250、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、铁蛋白、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2)、Ley、CA-125、CA19-9、表皮生长因子受体(EGFR)、p185HER2、IL-2受体、de2-7 EGFR、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白、金属蛋白酶、内皮素、碳酸酐酶、半乳凝素9、缩醛酶A、eIFγ4、酪氨酸酶、半乳凝素4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、休眠蛋白、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、b-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CT、Cyp-B、DAM-6(MAGE-B2)和DAM-10(MAGE-B1)、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、蛋白1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2和WT1，
优选地，其中所述TAA特异性T细胞表达CD19特异性CAR。
5.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述TAA特异性T细胞来源于从所述患者分离的细胞。
6.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述TAA特异性T细胞已被工程化改造以破坏至少一个内源性基因，优选地其中所述至少一个内源性基因选自编码TCRα链、TCRβ链和主要组织相容性复合物(MHC)的内源性基因。
7.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体，优选地其中所述免疫检查点抑制剂抗体选自下组：抗-CTLA4抗体、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-PDL2抗体和抗-LAG-3抗体。
8.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含至少一个mir-130a靶序列和至少一个mir-126靶序列，优选地其中所述载体包含两个mir-130a靶序列和两个mir-126靶序列。
9.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体还包含与编码所述细胞因子的所述核苷酸序列可操作地连接的组织特异性启动子，优选地其中所述组织特异性启动子是TEK(Tie2)启动子。
10.根据前述任一权利要求所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述癌症是血液系统恶性疾病或实体瘤，优选地其中所述血液系统恶性疾病选自下组：急性髓性白血病(AML)、淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性肿瘤(MPN)、原发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、非典型慢性髓性白血病、慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤；或者优选地其中所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
11.肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，优选地其中所述TAA选自下组：癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕激素受体、肝配蛋白B2、ROR1、间皮素、c-Met、GD-2、MAGE A3 TCR、4-1BB、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD152、CD200、CD22、CD19、CD22、CD123、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD4、CD40、CD44、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CS-1、CNT0888、CTLA-4、DR5、EpCAM、CD3、纤连蛋白额外域-B、叶酸受体1、糖蛋白75、GPNMB、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、肌腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、5T4、CD5、CD19、CD20、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、CAMPATH-1(CDw52)、HLA-DR、抗-独特型、TAG-72、Ep-CAM、MUC1、叶酸结合蛋白、A33、G250、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、铁蛋白、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2)、Ley、CA-125、CA19-9、表皮生长因子受体(EGFR)、p185HER2、IL-2受体、de2-7 EGFR、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白、金属蛋白酶、内皮素、碳酸酐酶、半乳凝素9、缩醛酶A、eIFγ4、酪氨酸酶、半乳凝素4、HERKV-K10、p53、NY-LU-12、休眠蛋白、NY-CO-38、MAGE-1、MAGE-4a、SSX2、NY-ESO-1、SCP-1、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、b-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CT、Cyp-B、DAM-6(MAGE-B2)和DAM-10(MAGE-B1)、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、蛋白1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2和WT1，优选地其中所述TAA特异性T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或转基因T细胞受体(TCR)，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，或者II型IFN(优选地IFNγ)，
更优选地其中所述I型IFN是IFNα，
优选地，其中所述TAA特异性T细胞表达CD19特异性CAR。
12.免疫检查点抑制剂，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，优选地其中所述免疫检查点抑制剂是抗体，更优选地其中所述免疫检查点抑制剂抗体选自下组：抗-CTLA4抗体、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-PDL2抗体和抗-LAG-3抗体，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，或者II型IFN(优选地IFNγ)，
更优选地其中所述I型IFN是IFNα。
13.1-甲基-色氨酸(1-MT)，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是II型IFN(优选地IFNγ)。
14.免疫检查点抑制剂和肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞的组合，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述患者此前已给予包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，优选地其中所述TAA特异性T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或转基因T细胞受体(TCR)，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，或者II型IFN(优选地IFNγ)，
更优选地其中所述I型IFN是IFNα。
15.根据权利要求11所述用途的TAA特异性T细胞，根据权利要求12所述用途的免疫检查点抑制剂，根据权利要求13所述用途的1-甲基-色氨酸(1-MT)或者根据权利要求14所述用途的组合，其中所述载体包含至少一个mir-130a靶序列和至少一个mir-126靶序列，优选地其中所述载体包含两个mir-130a靶序列和两个mir-126靶序列。
16.根据权利要求11或15所述用途的TAA特异性T细胞，根据权利要求12或15所述用途的免疫检查点抑制剂，根据权利要求13或15所述用途的1-甲基-色氨酸(1-MT)，或者根据权利要求14或15所述用途的组合，其中所述载体还包含与编码所述细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的组织特异性启动子，优选地其中所述组织特异性启动子是TEK(Tie2)，启动子。
17.根据权利要求11和15-16中任一项所述用途的TAA特异性T细胞，根据权利要求12和15-16中任一项所述用途的免疫检查点抑制剂，根据权利要求13或15-16中任一项所述用途的1-甲基-色氨酸(1-MT)，或者根据权利要求14-16中任一项所述用途的组合，其中所述癌症是血液系统恶性疾病或实体瘤，优选地其中所述血液系统恶性疾病选自下组：急性髓性白血病(AML)、淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤；或者优选地其中所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
18.一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的步骤，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述HSC、所述HPC、所述髓系/单核细胞定型祖细胞、所述巨噬细胞或单核细胞与免疫检查点抑制剂、肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞和/或1-甲基-色氨酸(1-MT)联合向所述患者施用，优选地其中所述TAA特异性T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或转基因T细胞受体(TCR)，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，或者II型IFN(优选地IFNγ)，
更优选地其中所述I型IFN是IFNα。
19.一种在此前给予包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞的患者中治疗或预防癌症的方法，其中所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，所述方法包括施用肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞的步骤，施用免疫检查点抑制剂的步骤和/或施用1-甲基-色氨酸(1-MT)的步骤，优选地其中所述TAA特异性T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或转基因T细胞受体(TCR)，
优选地其中所述细胞因子是干扰素(IFN)、IL-12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，
优选地其中所述IFN是I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，或者II型IFN(优选地IFNγ)，
更优选地其中所述I型IFN是IFNα。
20.一种包含含有与编码第一细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体和含有与编码第二细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，其中所述第一和第二细胞因子是不同的，
优选地其中所述第一和第二细胞因子分别独立地选自干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)，
优选地其中所述第一和第二细胞因子分别独立地选自下组：I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)、II型IFN(优选地IFNγ)和TNFα，
优选地其中所述第一和第二细胞因子分别独立地选自下组：IFNα、IFNβ、IFNγ和TNFα。
21.一种造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞群，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述群使用含有与编码第一细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体和含有与编码第二细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列的载体转导，其中所述第一和第二细胞因子是不同的，
优选地其中所述第一和第二细胞因子分别独立地选自干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)，
优选地其中所述第一和第二细胞因子分别独立地选自下组：I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)、II型IFN(优选地IFNγ)和TNFα，
优选地其中所述第一和第二细胞因子分别独立地选自下组：IFNα、IFNβ、IFNγ和TNFα。
22.根据权利要求20或21所述用途的HSC、HPC、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞、单核细胞或者群，其中：
(a)所述第一细胞因子是IFNα和所述第二细胞因子是IFNγ；
(b)所述第一细胞因子是IFNα和所述第二细胞因子是TNFα；或者
(c)所述第一细胞因子是IFNγ和所述第二细胞因子是TNFα，
优选地其中所述第一细胞因子是IFNγ和所述第二细胞因子是TNFα。
23.包含载体的造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、髓系/单核细胞定型祖细胞、巨噬细胞或单核细胞，其用于在患者中治疗或预防癌症的用途，所述载体包含与编码细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的至少一个mir-130a和/或mir-126靶序列，其中所述细胞因子是干扰素(IFN)或肿瘤坏死因子α(TNFα)，
优选地其中所述IFN是II型IFN(优选地IFNγ)或I型IFN(优选地IFNα或IFNβ)，
更优选地其中所述II型IFN是IFNγ。
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