BR112019021953A2

BR112019021953A2 - célula-tronco hematopoiética, célula progenitora hematopoiética, célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito, célula-t específica para antígeno associado a tumor, inibidor de ponto de checagem imune, 1-metil-triptofano, combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-t específica para antígeno associado a tumor, método para tratamento ou prevenção de um câncer, e, população de células-tronco hematopoiéticas, células progenitoras hematopoiéticas, células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, macrófagos ou monócitos.

Info

Publication number: BR112019021953A2
Application number: BR112019021953-6A
Authority: BR
Inventors: Luigi Naldini; Giulia Escobar; Bernhard Rudolf Gentner; Adele Mucci
Original assignee: Ospedale San Raffaele S.R.L.; Fondazione Telethon
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2020-07-21
Also published as: CN110785488A; SG11201909814WA; KR20200020677A; US20200078408A1; JP7252135B2; AU2018253959A1; EP3612624A1; JP2020517261A; WO2018193119A1; JP2023078376A; CA3060145A1

Abstract

Uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC) uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de interferon-alfa (IFNalfa) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA).

Description

CÉLULA-TRONCO HEMATOPOIÉTICA, CÉLULA PROGENITORA HEMATOPOIÉTICA, CÉLULA PROGENITORA MIELOIDE/MONÓCITO-COMPROMETIDA, MACRÓFAGO OU MONÓCITO, CÉLULA-T ESPECÍFICA PARA ANTÍGENO ASSOCIADO A TUMOR, INIBIDOR DE PONTO DE CHECAGEM IMUNE, 1-METIL- TRIPTOFANO, COMBINAÇÃO DE UM INIBIDOR DE PONTO DE CHECAGEM IMUNE E UMA CÉLULA-T ESPECÍFICA PARA ANTÍGENO ASSOCIADO A TUMOR, MÉTODO PARA TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UM CÂNCER, E, POPULAÇÃO DE CÉLULAS- TRONCO HEMATOPOIÉTICAS, CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOIÉTICAS, CÉLULAS PROGENITORAS MIELOIDE/MONÓCITO-COMPROMETIDAS, — MACRÓFAGOS OU

MONÓCITOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao uso de terapia gênica com citocina, em particular à terapia gênica com interferon (e.g. interferon-alfa ou -gama), opcionalmente em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune, uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA, Tumor Associted Antigen) e/ou l-metil-triptofano (1I-MT) para tratamento ou prevenção de câncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Imunoterapia tem ganho recentemente interesse renovado como tratamento anticâncer, devido ao seu potencial para induzir remissão de longa duração. Um entendimento aumentado dos mecanismos cooptados pelas células cancerosas para se evadirem da resposta imune tem resultado no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos reconhecedores dos pontos de checagem imune, eliminando, com isso, o poder do sistema imune'. Testes clínicos destes fármacos têm resultado em taxas inéditas de respostas duráveis em tumores previamente considerados invariavelmente letais, como melanoma metastático?”?. Entretanto, não obstante estas vantagens, uma grande fração de pacientes não respondem a estas terapias, quer devido à falha para gerar células-T tumor-específicas quer a existência de um microambiente tumoral imunossupressor, que concede resistência ao bloqueio dos pontos de checagem negativos clássicos, CTLA4 ou PDI/PDLI14.

[003] Esforços atuais estão, por conseguinte, almejando identificar novos alvos de ponto de checagem imune e terapias de combinação, que possam estender os benefícios de imunoterapia para um número maior de pacientes com tumor. Nesse aspecto, há um interesse renovado no uso de citocinas, como interferons (IFNs) como agentes anticâncer”. Além dos efeitos citostático e antiangiogênicos sobre células tumorais e vasos sanguíneos, os IFNs, em particular os interferons de tipo 1, aumentam a capacidade de maturação e de apresentação cruzada (cross-priming) de células dendríticas (DCs, Dendritic Cells), a proliferação e a citotoxicidade de células-T, a capacidade de matança de células assassinas naturais (NK, Natural Killer), e a mudança de classe de imunoglobulina de células-B“º”. Previamente relatamos a prova-de-princípio de que uma estratégia de terapia celular e gênica que seletivamente expressa um transgene de interferon-alfa (IFNo) na progênie de monócito/macrófago infiltrante tumoral de células- tronco hematopoiéticas (HSC, Hematopoietic Stem Cells) geneticamente modificadas, transplantadas, pode reforçar as respostas antitumorais. Esta estratégia de distribuição de IFNo direcionada para tumor não mostrou toxicidade sistêmica nas camundongos fêmeas e inibiu o crescimento de tumores mamários espontâneos e, também, as metástases para pulmão e fígado de células de câncer de mama e de câncer colorretal, respectivamente?

[004] Outra abordagem de imunoterapia é a transferência adotiva de células-T geneticamente modificadas expressoras de um receptor de célula-T (TCR, T Cell Receptor) transgênico ou de um receptor quimérico de antígeno

(CAR, Chimeric Antigen Receptor) direcionado contra um antígeno associado a tumor (TAA)!!"?. Esta abordagem é particularmente adequada para malignidades com baixa carga de mutação que falha em induzir respostas de células-T endógenas contra TAAs. Células-T CAR reconhecedoras de antígeno CDI9 têm demonstrado eficácia notável em malignidades de células-B recidivas e refratárias. Entretanto, estes estudos também sugeriram que o efeito terapêutico foi menos evidente em doença nodal com respeito à doença de medula óssea (BM, Bone Marrow) ou leucemia, sugerindo que um microambiente imunossupressor representa um grande impedimento para imunoterapia bem sucedida, especialmente em massas tumorais sólidas. Além disso, em tumores de crescimento rápido como leucemia linfoblástica aguda de células-B (B-ALL, B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia), perda de antígenos ocorre em até 20% dos pacientes tratados com células-T CAR CDIS9, ilustrando uma limitação da imunoterapia direcionada contra um único antígeno!!3, Entretanto, há poucos dados disponíveis sobre se leucemia induz resposta de células-T específicas para TAA fora do ambiente de transplante alogeneico, e se uma tal resposta pode ser potencializada para propósitos terapêuticos.

[005] Permanece uma necessidade de terapias para câncer aprimoradas. A presente invenção atende a esta necessidade pela comprovação de que eficácia aprimorada pode ser alcançada quando uma citocina como IFNa distribuída por terapia gênica é usada em combinação com outras estratégias imunoterapêuticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Os inventores têm surpreendentemente descoberto que uma citocina como um interferon distribuído por terapia gênica pode reforçar a indução, a consolidação e a manutenção de respostas antitumorais e sinergizar com outras estratégias imunoterapêuticas, em particular tratamento com inibidores de ponto de checagem imune e tratamento com células-T específicas para antígeno associado a tumor (TAA).

[007] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido(a) uma célula-tronco hematopoiética (HSC, Hematopoietic Stem Cell), uma célula progenitora hematopoiética (HPC, Hematopoietic Progenitor Cell), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[008] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA).

[009] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0010] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1- metil-triptofano (1-MT).

[0011] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0012] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com a célula-T específica para TAA.

[0013] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0014] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com 1-metil-triptofano (1- MT).

[0015] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA expressora de um CAR e/ou um TCR transgênico para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0016] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0017] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0018] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0019] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido 1-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0020] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido 1-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0021] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0022] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0023] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0024] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir- 130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do mesmo em que o vetor é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0025] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que o método compreende administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0026] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que compreende a etapa de administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou a etapa de administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0027] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1-metil-triptofano (1-MT).

[0028] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir- 130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do mesmo, em que o vetor é usado em combinação com 1-metil-triptofano (1I-MT).

[0029] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que o método compreende administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1I-MT).

[0030] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que compreende a etapa de administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1I-MT).

[0031] De acordo com a outro aspecto da presente invenção, é provida uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0032] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA).

[0033] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0034] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1-metil-triptofano (1-MT).

[0035] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0036] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com a célula-T específica para TAA.

[0037] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0038] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com 1 -metil-triptofano (1-MT).

[0039] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA expressora de um CAR e/ou um TCR transgênico para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0040] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0041] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0042] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0043] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido 1-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0044] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido l-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-

130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0045] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0046] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina.

[0047] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0048] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do mesmo, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0049] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que o método compreende administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0050] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que compreende a etapa de administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou a etapa de administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0051] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1- metil-triptofano (1I-MT).

[0052] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que o polinucleotídeo é usado em combinação com 1-metil- triptofano (1I-MT).

[0053] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que o método compreende administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1-MT).

[0054] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, que compreende a etapa de administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1-MT).

[0055] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon (IFN) de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0056] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo | para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA).

[0057] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0058] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1- metil-triptofano (1I-MT).

[0059] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0060] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com a célula-T específica para TAA.

[0061] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0062] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o vetor é usado em combinação com 1-metil-triptofano (1-

MT).

[0063] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA expressora de um CAR e/ou um TCR transgênico para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0064] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0065] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0066] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0067] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido 1-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon.

[0068] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido 1-metil-triptofano (I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon.

[0069] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0070] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-

126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0071] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo | a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0072] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir- 130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 a um paciente que necessita do mesmo, em que o vetor é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0073] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1, que o método compreende administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0074] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1, que compreende a etapa de administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou a etapa de administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0075] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1-metil-triptofano (1-MT).

[0076] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir- 130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon a um paciente que necessita do mesmo, em que o vetor é usado em combinação com 1-metil-triptofano (1-MT).

[0077] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon, que o método compreende administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1I-MT).

[0078] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon, que compreende a etapa de administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1I-MT).

[0079] De acordo com a outro aspecto da presente invenção, é provida uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 (TFN) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0080] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo | para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA).

[0081] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-

24 /156 comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0082] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1-metil-triptofano (1-MT).

[0083] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[0084] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com a célula-T específica para TAA.

[0085] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

[0086] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com 1 -metil-triptofano (1-MT).

[0087] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA expressora de um CAR e/ou um TCR transgênico para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0088] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0089] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido

26 /156 um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0090] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de ponto de checagem imune para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0091] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido 1-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon.

[0092] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido l1-metil-triptofano (1I-MT) para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir- 130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon.

[0093] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0094] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1.

[0095] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0096] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1 a um paciente que necessita do mesmo, em que o polinucleotídeo é usado em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou a célula-T específica para TAA.

[0097] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1, que o método compreende administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0098] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon de tipo 1, que compreende a etapa de administrar ao paciente uma célula-T específica para TAA, e/ou a etapa de administrar ao paciente um inibidor de ponto de checagem imune.

[0099] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com 1-metil-triptofano (1-MT).

[00100] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer, que compreende administrar um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que o polinucleotídeo é usado em combinação com 1-metil- triptofano (1I-MT).

[00101] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma HSC, uma HPC, uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon, que o método compreende administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1-MT).

[00102] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de um interferon, que compreende a etapa de administrar ao paciente 1-metil-triptofano (1-MT).

[00103] Em uma modalidade, a célula-T específica para TAA expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) e/ou um receptor de célula-T (TCR) transgênico. Em uma modalidade, a célula-T específica para TAA expressa um CAR. Em uma modalidade, a célula-T específica para TAA expressa um TCR transgênico.

[00104] Por conseguinte, a presente invenção pode usar uma célula-T modificada para expressar um CAR ou TCR específico para TAA.

[00105] Em uma modalidade, a citocina é um interferon (IFN), IL-12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago .

[00106] Em uma modalidade, a citocina é um interferon (IFN). Preferivelmente, a citocina é um interferon de tipo I ou um interferon de tipo II.

[00107] Em uma modalidade preferida, a citocina é IFNo.

[00108] Em outra modalidade preferida, a citocina é interferon-gama (IFNy).

[00109] Em uma modalidade, o interferon de tipo 1 é interferon-alfa (IFNo) ou interferon-beta (TFNB).

[00110] Em uma modalidade, o interferon de tipo 1 é IFNa.

[00111] Em uma modalidade, o interferon de tipo 1 é IFNB.

[00112] Em uma modalidade, o interferon de tipo II é interferon-gama (IFNy).

[00113] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago, o monócito ou o vetor da presente invenção é provido(a) para uso na prevenção da recorrência do câncer no paciente.

[00114] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago, o monócito ou o vetor da presente invenção é provido(a) para uso na prevenção da progressão do câncer no paciente.

[00115] Em uma modalidade, o TAA é selecionado dentre qualquer um(a) ou mais de antígeno carcinoembriônico (CEA, Carcinoembryonic Antigen), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrina-B2, RORI, mesotelina, c-Met, GD-2, e MAGE A3 TCR, 4-1BB, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, célula de linfoma-B, antígeno C242, anidrase carbônica 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CDI19,

CD22, CD123, CD221, CD23 (receptor de IZE), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-A, DR5, EpPCAM, CD3, extra-domínio-B de fibronectina, receptor de folato 1, glicoproteína 75, GPNMB, HGF, quinase receptora de fator de crescimento (scatter factor) humano, receptor de IGF-1, IGF-I, IGG1, LI-CAM, IL-13, IL- 6, receptor de fator de crescimento do tipo insulina [, integrina a5B1, integrina avB3, MORADb-009, MS4A1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-IC, PDGF-Ra, PDLI92, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMFY7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-B, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5ST4, CDS, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1I (CDw52), HLA- DR, Anti-idiótipo, TAG-72, Ep-CAM, MUCI, Proteína ligante de folato, A33, G250, Antígeno de membrana específico prostático (PSMA, Prostate- Specific Membrane Antigen), Antígeno específico prostático (PSA, Prostate Specific Antigen), Ferritina, Gangliosídeos (e.g.

GD2, GD3, GM2), Le, CA- 125, CAI9-9, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor), pl 855HER2, receptor de IL-2, de2-7 EGFR, Proteína de ativação de fibroblasto (FAP, Fibroblast Activation Protein), Tenascina, metaloproteinases, Endossialina, Anidrase carbônica, Galectina 9, Aldolase A, eIlFy4, Tirosinase, Galectina 4, HERKV-KI10, p53, NY-LU-12, Restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-L, SCP-1,707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenina/m, Ber-abl, CAMEL, CAP- 1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) e DAM- (MAGE-B1), ELFPM, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (TRT), iCE, KIAAO205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART- 1/Melan-A, MCIR, Miosina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-

A, NY-ESO-1, P15, ber-abl minor p190, Pnl/RARa, PRAME, RAGE, RUI, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteína 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 ou WTI.

[00116] Em uma modalidade, o TAA é CD19.

[00117] Em uma modalidade preferida, a célula-T específica para TAA expressa um CAR específico para CDI19.

[00118] Em uma modalidade, a célula-T específica para TAA é derivada de uma célula isolada de um paciente.

[00119] Em uma modalidade, a célula-T específica para TAA tem sido modificada para perturbar pelo menos um gene endógeno, preferivelmente em que o pelo menos um gene endógeno é selecionado dentre um gene endógeno codificante de uma cadeia a de TCR, uma cadeia 8 de TCR e um complexo principal de histocompatibilidade (MHC, Major Histocompatibility Complex).

[00120] Em uma modalidade o inibidor de ponto de checagem imune é um anticorpo, preferivelmente em que o anticorpo inibidor de ponto de checagem imune é selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo anti-CTLAA, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-PDL2 e um anticorpo anti-LAG-3.

[00121] Em uma modalidade o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e pelo menos uma sequência alvo mir-126, preferivelmente o vetor compreende duas sequências alvo mir-130a e duas sequências alvo mir-126.

[00122] Em uma modalidade a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito usado(a) na presente invenção compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e pelo menos uma sequência alvo mir-126, preferivelmente a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito usado(a) na presente invenção compreende duas sequências alvo mir-130a e duas sequências alvo mir-126.

[00123] O vetor ou o polinucleotídeo compreende, adicionalmente, um promotor tecido-específico funcionalmente ligado à sequência de nucleotídeos codificante da citocina, por exemplo o interferon de tipo 1. Um promotor tecido-específico preferido é o promotor TEK (Tie2).

[00124] Em uma modalidade o câncer é uma malignidade hematológica ou um tumor sólido, preferivelmente em que a malignidade hematológica é selecionada a partir do grupo consistindo em leucemia mieloide aguda (AML, Acute Myeloid Leukemia), leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda (ALL, Acute Lymphoblastic Leukemia), síndromes mielodisplásicas (MDS, Myelodysplastic Syndromes), neoplasmas mieloproliferativos (MPN, Myeloproliferative Neoplasms), mielofibrose primária, trombocitemia essencial, policitemia verdadeira, leucemia mieloide crônica atípica, leucemia mieloide crônica (CML, Chronic Myeloid Leukemia), linfoma, mieloma múltiplo, linfoma de não Hodgkin, e linfoma de Hodgkin; ou preferivelmente em que o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer de mama, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cólon, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer ovariano, cânceres de cabeça e pescoço, sarcoma sinovial, angiossarcoma, osteossarcoma, câncer de tireoide, câncer endometrial, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de fígado, melanoma, câncer de próstata, câncer renal, sarcoma de tecido mole, câncer urotelial, câncer biliar, glioblastoma, câncer cervical e câncer colorretal.

[00125] Em uma modalidade, o câncer é uma metástase de um tumor primário.

[00126] Em uma modalidade, a célula usada na presente invenção é uma HSC compreendendo um vetor ou um polinucleotídeo, em que o vetor ou o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, por exemplo um interferon de tipo 1.

34 /156

[00127] Em uma modalidade, a célula usada na presente invenção é uma HPC compreendendo um vetor ou um polinucleotídeo, em que o vetor ou o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, por exemplo um interferon de tipo 1.

[00128] Em uma modalidade, a célula usada na presente invenção é uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida compreendendo um vetor ou um polinucleotídeo, em que o vetor ou o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, por exemplo um interferon de tipo 1.

[00129] Em uma modalidade, a célula usada na presente invenção é um macrófago compreendendo um vetor ou um polinucleotídeo, em que o vetor ou o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, por exemplo um interferon de tipo 1.

[00130] Em uma modalidade, a célula usada na presente invenção é um monócito compreendendo um vetor ou um polinucleotídeo, em que o vetor ou o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, por exemplo um interferon de tipo 1.

[00131] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma primeira citocina, e um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma segunda citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que as primeira e segunda citocinas são diferentes.

[00132] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida uma população de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células progenitoras hematopoiéticas (HPCs), células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, macrófagos ou monócitos, a população transduzida com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma primeira citocina, e um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma segunda citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que as primeira e segunda citocinas são diferentes.

[00133] Em uma modalidade, a primeira citocina é codificada em um primeiro vetor e a segunda citocina é codificada em um segundo vetor. Em uma modalidade, as primeira e segunda citocinas são codificadas no mesmo vetor.

[00134] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida uma combinação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma primeira citocina, e um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma segunda citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que as primeira e segunda citocinas são diferentes.

[00135] Em uma modalidade, a primeira citocina é codificada em um primeiro polinucleotídeo e a segunda citocina é codificada em um segundo polinucleotídeo. Em uma modalidade, as primeira e segunda citocinas são codificadas no mesmo polinucleotídeo. Os polinucleotídeos podem estar, por exemplo, na forma de um vetor.

[00136] Em uma modalidade, as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente, selecionadas dentre um interferon (IFN) ou fator- alfa de necrose tumoral (TNFa, Tumour Necrosis Factor Alpha), Em uma modalidade, as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente, selecionadas a partir do grupo consistindo em um IFN de tipo I (preferivelmente IFNa ou IFNB), um IFN de tipo II (preferivelmente IFNy) e TNFa.

[00137] Em uma modalidade, as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente, selecionadas a partir do grupo consistindo em IFNo, IFNB, IFNy e TNFa.

[00138] Em uma modalidade, a primeira citocina é IFNa e a segunda citocina é IFNy.

[00139] Em uma modalidade, a primeira citocina é IFNa e a segunda citocina é TNFa.

[00140] Em uma modalidade preferida, a primeira citocina é IFNy e a segunda citocina é TNFa.

[00141] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido(a) uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir- 126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a citocina é um interferon (IFN) ou fator-alfa de necrose tumoral (TNFa).

[00142] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-

126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a citocina é um interferon (IFN) ou fator-alfa de necrose tumoral (TNFo).

[00143] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a citocina é um interferon (IFN) ou fator-alfa de necrose tumoral (TNFo).

[00144] Em uma modalidade, o IFN é um IFN de tipo TI (preferivelmente IFNy) ou um IFN de tipo I (preferivelmente IFNa ou IFNB)

[00145] Em uma modalidade, a citocina é IFNy. Em uma modalidade, a citocina é IFNo. Em uma modalidade, a citocina é IFNB.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1. Inibição de crescimento de OVA-ALL em camundongos IFN pela indução de células-T CD8+ específicas para OVA.

[00146] a, Representação esquemática dos vetores lentivirais (LV, Lentiviral Vectors) usados para modificar HSC e gerar B-ALL espontânea. b, Planejamento experimental. c, Números absolutos (média + EPM (Erro Padrão da Média)) de ALL parental em sangue periférico (PB, Peripheral Blood) ao longo do tempo de camundongos CTRL (n=10, tratados com anticorpo isotípico de controle), IFN ((n=10, tratados com anticorpo isotípico de controle), CTRL + aCTLAA4 (n=14) e IFN + aCTLAA4 (n=13). Cada ponto representa um camundongo individual. *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,001, método não paramétrico baseado em postos (rank) para dados longitudinais em experimentos fatoriais. d, e, f Números absolutos (média + EPM) de OVA-ALL (modificada com LV bidirecional NGFR/OVA mostrado na parte superior) no PB ao longo do tempo (d), e em BM (Bone Marrow, medula óssea) e em baço (SP, SPleen) (e, f; 14 dias após a injeção de tumor) de camundongos IFN (n=15) e CTRL (n=15) (um de cada 9 experimentos mostrado). Cada ponto representa um camundongo individual. ****p<0,001, método não paramétrico baseado em postos para dados longitudinais em experimentos fatoriais (d); *p<0,05, ** p<0,01, Mann-Whitney (e, D. g, Células-T CD8+ esplênicas de camundongos IFN, 13 dias após a injeção de tumor, ou de camundongos CTRL não possuindo tumor (naíve C57B1/6, n=1) testados por ELISPOT de IFN-y contra a linhagem celular alvo EIA transduzida com NGFR-OVA BdLV ou NGFR-CD20 BdLV (BdLV, Bidirectional Lentiviral Vector). Cada ponto representa um camundongo individual, média + EPM.

Carga tumoral baixa (n=5): 5,2% + 4,9% (média + EPM) de OVA-ALL; carga tumoral mediana (n=1): 33% de OVA-ALL; carga tumoral alta (n=6): 51% + 4,9% de OVA-ALL. h, Percentagem (média + EPM) de células-T específicas para OVA no PB de camundongos IFN (n=14-6) e CTRL (n=15-8). **p<0,01, Mann Whitney realizado a 9 dias após a injeção de OVA-ALL.

Cada ponto representa um camundongo individual.

Células-T de camundongos OT-I transgênicos são usadas como controle positivo (não mostrado). i, j, Números absolutos (média + EPM) de células-T específicas para OVA na BM (i) e no baço (]), 9 dias após a injeção de tumor, em camundongos IFN (n= 23) e CTRL (n=26) de 3 experimentos independentes. **p<0,01, ***p< 0,001, Mann-Whitney.

Cada ponto representa um camundongo individual. k, Células-T CD8+ esplênicas de camundongos IFN (n=7) e CTRL (n=8) 9 dias após a injeção de tumor ou de camundongos não possuindo tumor testados como em (g). Estimulação com concanavalina A (ConA) e células-T de camundongos OT-I (não mostrado) são usadas como controles positivos.

Cada ponto representa um camundongo individual. 1, m, Percentagem (1) e Números absolutos (m) (média + EPM) de OVA-ALL no PB de camundongos IFN (n=9), IFN CD8-depletado (n=7) e CTRL (n=9). **p<0,01, ****p<0,001, método não paramétrico baseado em postos para dados longitudinais em experimentos fatoriais (1); *p<0,05, ****1D<0,001, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn (m). Figura 2. Células-T OT-I adotivamente transferidas expandem e contêm OVA-ALL em camundongos IFN.

[00147] a, b, Planejamento experimental (a) e crescimento de OVA- ALL ao longo do tempo (b, percentagem em PB; média + EPM) em camundongos IFN (n=7) ou CTRL (n=7). c, Números absolutos (média + EPM) de células-T OT-I em BM e em baço de camundongos IFN (n= 7), CTRL (n=7) e não possuindo tumor (C57B1/6 sem tumor, n=3) 3 dias após a transferência adotiva de OT-I. *p<0,05, **p<0,01, Mann-Whitney. Cada ponto representa um camundongo individual. d, Percentagens (média + EPM) de células naíive (CD44-CD62L+), de memória central (CD44+CD621L+) e de memória efetoras (CD44+CD62L-) dentro de células-T OT-I na BM e no baço de camundongos de (c) 3 dias após a transferência adotiva. **p<0,01, teste de combinação não paramétrica. e, f, Planejamento experimental (e) e curva de sobrevivência (f) de camundongos CTRL (n=12), IFN + OT-I (n=9) e CTRL + OT-I (n=10) injetados com OVA-ALL. *p<0,05, ****p<0,001 teste de Mantel-Haenszel, valor-p ajustado pelo teste de Bonferroni. g, Números absolutos (média + EPM) de células-T OT-I adotivamente transferidas no PB ao longo do tempo de camundongos CTRL + OT-I e IFN + OT-I de (D, e camundongos C57BlI/6 não possuindo tumor (n=3). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. h, Percentagem (média + EPM) de expressão de Lag3 sobre células-T OT-I no PB de camundongos de (f, g). Cada linha representa um camundongo individual. Figura 3. Assinatura genética primada ISG/Th1 e monócitos clássicos aumentados e assimetria-M1 em camundongos IFN.

[00148] a, Gráfico de vulcão mostrando as alterações na expressão de um painel de genes imunes de câncer na BM e no baço de camundongos IFN

40 /156 CTRL antes do e após o desafio com OVA-ALL. As linhas tracejadas horizontais indicam o limiar de significância (FDR<0,05). As linhas tracejadas verticais indicam os genes com expressão aumentada/decrescida 2 vezes com respeito aos camundongos CTRL. ISGs são mostrados em laranja, genes de ativação de células-T e Thl em azul claro, genes comuns para respostas IFN e Th1l em verde, genes de ativação de macrófago e DC em vermelho, genes de ativação de NK em púrpura, genes de processamento de antígeno em azul, genes associados à leucemia em cinza. Inserções gateadas (agrupadas em janela de análise) mostradas magnificadas à direita. n=3 camundongos para cada amostra, exceto para CTRL BM + ALL, n=2. b, Análise de expressão por RT-gPCR dos genes Th1 indicados (alteração em vezes média sobre camundongos CTRL injetados com OVA-ALL + EPM) em células-T CD4+ esplênicas de camundongos IFN (n=6) e CTRL (n=5) injetados com OVA-ALL 9 dias após a injeção de tumor e de um camundongo C57B1I/6 não possuindo tumor. Cada ponto representa um camundongo individual. *p<0,05, Mann-Whitney. c, Percentagem (média + EPM) das populações mieloides indicadas no PB de camundongos IFN (n=11) e CTRL (n=13) antes da e após (12 dias) a injeção de OVA-ALL. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,001, Kruskall-Wallis, com o valor- Pp ajustado pelo teste de Dunn. A análise estatística é realizada dentro de cada população individual de células mieloides. Figura 4. Terapia gênica e celular com IFN induz respostas anticâncer duráveis e quando combinada com terapia de ponto de checagem imune melhora adicionalmente a sobrevivência.

[00149] a, b, c, d Curvas de sobrevivência de camundongos IFN e CTRL injetados com OVA-ALL após o primeiro desafio tumoral (a; n=11,13; *p<0,05, teste de Mantel-Haenszel) e o desafio tumoral subsequente com as células ALL indicadas (b: n=3 camundongos IFN sobreviventes durante longo período de tempo de (a) versus 4 camundongos naive; c: mesmos 3 camundongos sobreviventes de (a, b) versus 4 camundongos naiíve; d: 2 dos 3 camundongos sobreviventes de (a, b, c) versus 4 camundongos naive. e, Planejamento experimental. f, g, Curvas de sobrevivência de (f) camundongos IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN +aCTLA4 (n=14) e CTRL + aCTLA4 (n=15) injetados com OVA-ALL, *p<0,05, ***p<0,001, teste de Mantel-Haenszel, o valor-p ajustado pelo método de Bonferroni; e (g) camundongos IFN + aCTLAA4 (n=10) e CTRL + aCTLA4 (n=12), *p<0,05, teste de Mantel- Haenszel. h, PBMC de camundongos sobreviventes de (f) (IFN n=3, CTRL n=1, IFN + aCTLA4 n=4, CTRL + aCTLAA4 n=3) 51 dias após a injeção de tumor e de camundongos não possuindo tumor (OT-I, n=1 camundongos CTRL transplantados, n=2) testados por ELISPOT de IFN-y contra a linhagem celular alvo ELA transduzida com NGFR-OVA ou NGFR-CD20 BdLV ou PGK-OFP ou PGK+«TA LV.

A linha tracejada indica o nível de fundo mediano mais alto visto contra as células alvo EL4 NGFR.

Cada ponto representa um camundongo individual testado contra todos os quatro TAAs. i, Clonalidade e similaridade do repertório de TCR-beta CDR de camundongos sobreviventes (cada seta representa um camundongo) de (f) antes da injeção de OVA-ALL (início da seta, TO) e 4 dias após o segundo redesafio tumoral (ponta da seta, T2). j, PBMC de camundongos de (g) (sobreviventes IFN + aCTLA-4, símbolos azuis cheios, n=3; sobreviventes CTRL + aCTLA-A4, símbolos vermelhos cheios, n=1; não respondedores IFN + aCTLA-A, símbolos azuis vazios, n=7; CTRL + aCTLA-A4, símbolo vermelho vazio, n=8 de cada 12 controles não respondedores) testados por ELISPOT de IFN-y como em (h), 19 dias após a injeção de tumor.

Cada ponto representa um camundongo individual testado contra todos os quatro TAAs. k, Curva de sobrevivência de camundongos de (g) estratificados baseados na reatividade imune deles como ensaiada pelo ensaio ELISPOT de IFN-y mostrado em (j). Camundongos mostrados em vermelho reagem contra 2 ou mais antígenos; camundongos mostrados em preto reagem contra 1 ou nenhuns antígenos.

Observar que a reatividade contra OVA e NGFR vale 1 porque a expressão deles é corregulada por um promotor bidirecional presente dentro de um BdLV. Figura 5. OVA-ALL modificada mostrou imunogenicidade aumentada em comparação com ALL parental.

[00150] a, Representação esquemática do LV bidirecional (BdLV) usado para gerar OVA-ALL com gráfico representativo mostrando a expressão de NGFR em OVA-ALL purificada. b, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (gating) usada para identificar a expressão de B-ALL (CD1I9+OFP+) e NGFR em ALL em PB de camundongos injetados com tumor. c, Parte Superior: Percentagem (média + EPM) de OVA-ALL no PB de camundongos C57Bl/6 imunocompetentes (n=5) e NSG imunodeficientes (n=6) e de ALL parental no PB de camundongos C57B1l/6 imunocompetentes (n=5). Parte Inferior: expressão do marcador NGFR em ALL presente no PB de camundongos C57B1/6 imunocompetentes (n=5) e NSG imunodeficientes (n=6). Observar que a expressão de antígenos NGFR e OVA é corregulada por um promotor bidirecional presente dentro de um BdLV. d, e, Percentagem (média + EPM) de OVA-ALL e expressão de marcador NGFR sobre células leucêmicas presentes na BM de camundongos C57B1I/6 imunocompetentes (n=6) (d) e NSG imunodeficientes (n=6) (e) no momento da matança. Figura 6. Inibição de crescimento de OVA-ALL em camundongos IFN e indução de células-T específicas para OVA.

[00151] a, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise usada para identificar células-T CD8+ específicas para OVA. b, c, d, Percentagem (b) e Números absolutos (c, d) (média + EPM) de OVA-ALL em PB (b) e em BM e em baço (c, d) de camundongos IFN (n=14-6) e CTRL (n=15-8), 9 dias após a injeção de tumor. ***P<0,001, Mann-Whitney. Cada ponto representa um camundongo individual. e, Percentagem de OVA-ALL em PB de camundongos IFN (n=9), IFN CD8-depletado (n=7) e CTRL (n=9) 9 dias após desafio tumoral. Cada ponto representa um camundongo individual. *p<0,05, ***p<0,001, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn. Figura 7. Estratégia de agrupamento de células em janela de análise usada para avaliar a apoptose de OVA-ALL, o ciclo celular e a taxa de proliferação.

[00152] a, b, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (a) e análise (b) (percentagem, média + EPM) de células OVA-ALL apoptóticas precoces (Anexina+7-AAD-), apoptóticas tardias (Anexina+7- ADD+), mortas/necróticas (Anexina-/AAD+) e vivas (Anexina-7-AAD-) presente em BM e em baço de camundongos IFN (n=11) e CTRL (n=15), 9 dias após a injeção de tumor. *p<0,05, Mann- Whitney. c, d, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (c) e análise (d: percentagem, média + EPM) de distribuição de OVA-ALL na fase GO (Ki67-Hoechst!”), na fase G1 (Ki67+Hoechst!º*) e na fase S-G2-M (Ki67+Hoechst"=") do ciclo celular em BM e em baço de camundongos IFN (n=11) e CTRL (n=15), 9 dias após a injeção de tumor. e, f, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (e) e análise (f: percentagem, média + EPM) de células ALL EdU+ proliferantes presentes em BM e em baço de camundongos IFN (n=11) e CTRL (n=15), 9 dias após a injeção de tumor. **p<0,01, Mann-Whitney. Figura 8. Transferência adotiva de células-T OT-I em camundongos CTRL, IFN injetados com OVA-ALL e camundongos C57BI/6 não possuindo tumor.

[00153] a, Números absolutos (média + EPM) de OVA-ALL no PB de camundongos CTRL (n=7) e IFN (n=7) no tempo indicado após a transferência adotiva de OT-I. Cada ponto representa um camundongo individual. b, expressão de Lag3 sobre células OT-I T em BM e em baço de camundongos IFN (n= 7), CTRL (n=7) e não possuindo tumor (C57B1/6 sem

44 / 156 tumor, n=3), 3 dias após a transferência adotiva de células-T OT-I. Cada ponto representa um camundongo individual. c, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise usada para identificar as células-T OT-I adotivamente transferidas (CD45.2+) e a expressão de Lag3 sobre células-T OT-I presentes em BM e em baço de camundongos de (a, b). Células OVA- ALL são primeiro excluídas por agrupamento em janela de análise de células- T OFP-CD8+. Marcadores CD45.1 e CD45.2 são usados para distinguir dentre as células-T CD8+ derivadas de recipiente radiorresistente (CD45.1+), as células-T CD8+ derivadas de doador (CD45.1.2+) e as células-T OT-I adotivamente transferidas (CD45.2+). Em camundongos não possuindo tumor, as células-T OT-I adotivamente transferidas são definidas como células-T CD8+ e são distinguidas das células-T derivadas de recipiente CD8+ (CDA45.1+) por agrupamento em janela de análise de células-T CDA45.2+ CD8+. d, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise usada para identificar células-T OT-I adotivamente transferidas naíve (CD62L+CD44-), de memória central (CD62L+CD44+) e de memória efetoras (CD62L-CD44+). Células-T OT-I são identificadas como descrito em (ec, OVA-ALL são primeiro excluídas por agrupamento em janela de análise de células-T CD19-CD8+). e, f, Números absolutos de OVA-ALL (e) (média + EPM) e expressão de marcador NGFR (f) em ALL em BM e em baço de camundongos mostrados em (a, b) a 3 dias após a transferência adotiva de células-T OT-I. Cada ponto representa um camundongo individual. **p<0,01, ***1n<0,001, Mann- Whitney (e).

Figura Suplementar 6. Análise de expressão gênica de genes prototípicos Th2 e Treg em células-T CD4+ esplênicas purificadas.

[00154] a, Análise de expressão por RT-qPCR dos genes Th2 e Treg indicados (alteração em vezes média sobre camundongos CTRL injetados com OVA-ALL + EPM) em células-T CD4+ esplênicas purificadas de camundongos IFN (n=6) e CTRL (n=5) injetados com OVA-ALL, 9 dias após a injeção de tumor e de um camundongo C57B1/6 naive não possuindo tumor. Cada ponto representa um camundongo individual. Figura 9. Células-T OT-I adotivamente transferidas expandem e contêm OVA-ALL em camundongos IFN.

[00155] a, b, c, d, Percentagem (média + EPM) de células ALL e expressão de marcador NGFR sobre células ALL no PB (a, b) e na BM (c, d) de camundongos IFN + OT-I (n=9, a, c) e CTRL + OT (n=10, b, d). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Observar que a expressão de NGFR não é mostrada para camundongos sobreviventes que erradicam leucemia. Cada camundongo individual é representado como um ponto único (b, d) ou uma linha única (a, b). e, f, Percentagaem (média + EPM) de células-T OT-H naive (CD62L+CD44-), de memória central (CD62L+CD44+) e de memória efetoras (CD62LCD44+) no BM, no baço e nos linfonodos de camundongos possuindo tumor eutanasiados de (a, b, c, d, CTRL + OT-I, n=8; IFN + OT-L, n=3). f, Percentagem (média + EPM) de expressão de PD1 sobre células-T OT-I presentes na BM, no baço e nos linfonodos de camundongos mostrados em (e). Cada ponto representa um camundongo individual. Figura 11. Análise citométrica de fluxo de células mieloides no PB e no baço de camundongos IFN e CTRL possuindo tumor e não injetados com tumor.

[00156] a, b, c, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (a) e análise (b, Números absolutos, média + EPM) de populações de células mieloides no baço de camundongos IFN e CTRL isentos de tumor e injetados com OVA-ALL (CTRL: n=3, IFN n=2, CTRL + ALL: n=9, IFN + ALL: n=7), 10 dias após a injeção de tumor. Macrófagos (MF) são identificados como células CDI9-CDI11c-Ly6G-F4/80+ e adicionalmente distinguidos em MHC-Il+ MF e MHC-II- Mf usado o marcador IAb (MHC- ID). Distinguimos células mieloides CD19-F4/80-CD1 1c+MHCII- das células

46 / 156 dendríticas CD19-F4/80-CD11c+MHCII+. Definimos granulócitos como CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, monócitos clássicos como CD19-F4/80-CD11c-CD1 1b+Ly6ClowLy6G- e monócitos não clássicos como CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C-Ly6G-. **p<0,01, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn. A estatística é realizada dentro de cada população individual de células mieloides. d, Percentagem de macrófagos MHC-II presentes em camundongos IFN e CTRL isentos de tumor ou possuindo tumor de (c). **p<0,01, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn.

Figura 12. Análise citométrica de fluxo de células mieloides na BM e de células-T regulatórias na BM e no baço de camundongos IFN e CTRL possuindo tumor e não injetados com tumor.

[00157] a, b, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise e análise (Números absolutos, média + EPM) de populações de células mieloides na BM de camundongos IFN e CTRL isentos de tumor e injetados com OVA-ALL (CTRL: n=3, IFN: n=2, CTRL + ALL: n=9, IFN + ALL: n=7), 10 dias após a injeção de tumor. Cada ponto representa um camundongo individual. Macrófagos (MF) são identificados como células CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+, células dendríticas (DCs) como CD19-F4/80- CD11c+MHCII+, granulócitos como CD19-F4/80-CD1 1c- CDI 1b+Ly6C+Ly6G+, monócitos clássicos como CDI19-F4/80-CD11lc- CDI 1b+Ly6ClowLy6G- e monócitos não clássicos como CD19-F4/80- CDI11c-CD11b+Ly6CLy6G-.*p<0,05, **p<0,01, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn. A estatística é realizada dentro de cada população mieloide individual. c, d, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (c) e análise (d, Números absolutos, média + EPM) de células-T regulatórias em BM e em baço de camundongos IFN e CTRL isentos de tumor e injetados com OVA-ALL de (b). Cada ponto representa um camundongo individual. Células-T regulatórias são definidas como

47 /156 CD3+CD4+CD25+FoxP3+. **p<0,01, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn. A estatística é realizada dentro de cada tecido individual. Figura 13. Análise citométrica de fluxo de células NK e NKT no baço de camundongos IFN e CTRL possuindo tumor e não injetados com tumor.

[00158] a, b, Estratégia de agrupamento de células em janela de análise (a) e análise (b, Números absolutos, média + EPM) de células NK e NKT presente no baço e na BM de camundongos IFN e CTRL isentos de tumor ou injetados com OVA-ALL (CTRL: n=3, IFN: n=2, CTRL + ALL: n=9, IFN + ALL: n=7), 10 dias após a injeção de tumor. Cada ponto representa um camundongo individual. As células NK são identificadas como células CD19- CD3-NK1.1+ e as células NKT como CDI9-CD3+NKI1.1+. Usando os marcadores CDI 1b e CD27 distinguimos, adicionalmente, dentre as células NK produtoras de citocina mais maduras (CDI 1b-CD27+), as células NK produtoras de citocina maduras e mais citotóxicas (CDI Ib+CD27+) e as células NK produtoras de citocina maduras e menos citotóxicas (CDI 1b+CD27-). **p<0,01, ***p<0,001, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn. A estatística é realizada dentro de cada população individual. c, Percentagem (média + EPM) das subpopulações indicadas de células NK no baço (parte superior) e na BM (parte inferior) de camundongos IFN e CTRL isentos de tumor e possuindo tumor de (b). Cada ponto representa um camundongo individual. d, e, Percentagem (média + EPM) de expressão de NKG2D e de NKp46 em CDI1Ib+CD27+ (d) e CDI 1b+CD27- (d, e) células NK presentes no baço (d) e na BM (e) de camundongos de (b). Cada ponto representa um camundongo individual. *p<0,05, **p>0,01, Kruskall-Wallis com o valor-p ajustado pelo teste de Dunn. A estatística é realizada dentro de cada população individual. Figura 14. Pressão imune exercida por células-T específicas para OVA resulta em imunosseleção de células ALL negativas para OVA nos

48 / 156 camundongos.

[00159] a, Percentagem (média + EPM) de OVA-ALL no PB de cada um dos camundongos IFN (n=11) e CTRL (n=13) individuais. Cada linha representa um camundongo individual. b, expressão de NGFR em ALL infiltrante em BM (ou ALL circulante em PB para aqueles camundongos cuja análise de BM não está disponível) e Números absolutos (média + EPM) de células-T específicas para OVA (cada linha representa um camundongo individual) no PB de camundongos IFN (n=8) e CTRL (n=13) mostrando curso rápido ou retardado da doença (curso rápido da doença: CTRL: 13-29 dias (faixa), 204 + 1,3 (média + EPM), n=11; IFN:16-27 dias, 20,8 + 1,8, n=5; curso retardado da doença: CTRL: 34-44 dias, 39 + 5, n=2; IFN: 34-100 dias, 56 + 22, n=3). c, Números absolutos (média + EPM) de células-T específicas para OVA no PB de camundongos IFN sobreviventes durante longo período de tempo (n=3). Cada linha representa um camundongo individual. d, Percentagem (média + EPM) de células-T específicas para OVA em camundongos IFN sobreviventes (n=3) versus 4 camundongos naive de Figura 4b, 14 dias após o segundo desafio tumoral com OVA-ALL. Cada ponto representa um camundongo individual. e, Gráfico representativo mostrando as células OVA-ALL e ALL parental em razão de | para 1 antes da injeção nos camundongos. Figura 15. Cinética de crescimento leucêmico em camundongos individuais.

[00160] a, b, Percentagem (média + EPM) de OVA-ALL no PB de cada indivíduo (a) camundongos IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN + aCTLA4 (n=14) e CTRL + aCTLAA4 (n=15) e (b) camundongos TIFN + aCTLA4 (n=10) e CTRL + aCTLA4 (n=12). Cada linha representa um camundongo individual. Figura 16. Imunosseleção de células ALL negativas para OVA é intensificada em ambos os camundongos IFN e CTRL tratados com

49 / 156 CTLAA.

[00161] a, Expressão de NGFR em ALL infiltrando a BM (ou ALL circulante no PB para aqueles camundongos cuja análise de BM não está disponível) e Números absolutos (média + EPM) de células-T específicas para OVA (cada linha representa um camundongo individual) no PB de camundongos IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) e CTRL+aCTLAA4 (n=15) mostrando cursos rápido, retardado da doença ou sobrevivência de longo prazo. Curso rápido da doença: CTRL: 14-21 dias (faixa), 15,66 + 0,8 (média + EPM), n=12; IFN: 17-25 dias, 21 + 1,3, n=8; CTRL + CTLAA4: 14-21 dias, 19 + 1,2, n=6; IFEN + CTLAA4: 25 dias, 25 + 0, n=2; curso retardado da doença: CTRL: 36 dias, n=1; IFN: 30-36 dias, 34 + 2, n=3; CTRL + CTLAA, 30-64 dias, 42 + 7,4, n=5; IFN + CTLAA4: 25-64 dias, 44 + 4.9, n=7). b, Percentagem de células-T específicas para OVA dentro de células-T CD8+ no PB de camundongos de (a). *p<0,05, **p<0,01, ****D<0,001, método não paramétrico baseado em postos para dados longitudinais em experimentos fatoriais. c, Clonalidade e similaridade do repertório de TCR-beta CDR de camundongos sobreviventes durante longo período de tempo, isentos de tumor (cada seta representa um camundongo) da Figura 4f antes da injeção de OVA-ALL (início da seta, TO) e a 30 dias após o desafio com OVA-ALL (ponta da seta, T1). Figura 17. Terapia gênica com IFN inibe crescimento de ALL pela ativação de imunidade adaptativa.

[00162] Números absolutos (média + EPM) de ALL parental em sangue periférico (PB) ao longo do tempo de camundongos CTRL (n=10, tratados com anticorpo isotípico de controle), IFN (n=10, tratados com anticorpo isotípico de controle), CTRL + aCTLAA4 (n=14) e IFN + aCTLA4 (n=13). Cada ponto representa um camundongo individual. *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,001, método não paramétrico baseado em postos para dados longitudinais em experimentos fatoriais.

Figura 18. Terapia gênica com IFN impõe um programa imunoestimulatório no TME.

[00163] Percentagem “de DCs apresentado o peptídeo imunodominante de OVA (SINFEKL) em moléculas de MHC-I na BM de camundongos de CTRL + ALL (n=7) e IFEN + ALL (n=8). *p<0,05, teste de Mann-Whitney. Figura 19. Reprogramação transcricional do TME de leucemia por terapia gênica com IFN.

[00164] a,b, Gráficos de vulcão (painéis esquerdos) mostrando genes diferencialmente expressados (log?FC>1,5, FDR<0,05 abs.) suprarregulados (verde) ou infrarregulados (laranja) em macrófagos esplênicos de camundongos possuindo tumor (ALL) versus camundongos de controle (CTRL) (a) ou camundongos ALL tratados (IFN+ALL) ou não tratados (ALL) com terapia gênica com IFN (b). Gráficos de barras (painel direito) mostram termos de GO enriquecidos em genes suprarregulados (verde) ou infrarregulados (laranja) das comparações indicadas. c,d, Gráficos-Snapshots selecionados dentre RNA-Seq de genes desregulados em macrófagos de camundongos ALL (c) ou ISGs induzidos em camundongos IFN+ALL (d). e, f, gráficos de tSNE incorporando os dados de scRNA-Seg de 10.821 células CD11b* separadas do baço de camundongos CTRL ou ALL, tratados ou não com terapia gênica com IFN. Agrupamentos (clusters) transcricionalmente definidos e tipos celulares associados (e) são indicados por números e cores na legenda. Dados de RNA-Seq de célula individual em células do agrupamento (cluster) | (monócitos não clássicos), coloridos com base na condição experimental (f). g, Termos de GO enriquecidos nos 100 genes de topo (ranqueados por log;FC) suprarregulados (verde) ou infrarregulados (laranja) em dados de scRNA-Seq do agrupamento | (monócitos não clássicos) nas comparações indicadas. h, Expressão média (valores de TPM transformado em log, normalizados para o número de células) em monócitos não clássicos de genes selecionados para as condições indicadas. i, Análise via árvore de espalhamento mínimo (MST, Minimum Spanning Tree) de dados de scRNA-Seq do agrupamento 1 (monócitos não clássicos), após subclusterização. Cada gráfico de pizza representa um subagrupamento (sub- cluster) e mostra o seu tamanho (número de células) e sua composição (condição experimental). Os gráficos de pizza marcados com asterisco representam os subagrupamentos menores com composição dispersada. Figura 20. Terapia gênica com IFN reforça a ativação de células-T transduzidas com CARIS9 adotivamente transferidas e intensifica a sobrevivência.

[00165] a, b, Planejamento experimental (a) e crescimento de ALL ao longo do tempo (b, Números absolutos em PB; média + EPM) em camundongos CTRL + CTRLT (n=5), IFEN + CTRLT (n=5), CTRL + CARTI9 (n=7), IEN + CARTI9 (n=7). ****p<0,001, método não paramétrico baseado em postos para dados longitudinais em experimentos fatoriais. c, Percentagem (média + EPM) de expressão de Lag3 sobre células CD8+NGFR+ CARTI9 no PB de camundongos de (b). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. d, e, Planejamento experimental (d) e crescimento de ALL ao longo do tempo (e, Números absolutos em PB; média + EPM) em camundongos CTRL + CTRLT (n=7), IFN + CTRLT (n=6), CTRL + CARTI9 (n=7), IFN + CARTI19 (n=6), CTRL + iCARTI9 (n=7), IFN + iCARTI9 (n=6), IFN + CTRLT late (n=6, teste de intervenção tardia), IFN + iCARTIO9 late (n=6, teste de intervenção tardia). ****p<0,001, método não paramétrico baseado em postos para dados longitudinais em experimentos fatoriais. A análise estatística é realizada em grupos selecionados (consulte as Tabelas 9 e 10 Suplementares Online) f, Percentagem ao longo do tempo (média + EPM) de expressão de Lag3 sobre células CD8+NGFR+ CARTI9 no PB de camundongos de (b). Os camundongos CTRL + CARTI9 e CTRL + iCARTI9 são representados graficamente juntos. Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. g, Curva de sobrevivência de camundongos tratados com células CARTI9 ou iCARTI9 de (b e e). Camundongos CTRL tratados com CARTI9 e iCARTI9 da Figura 20. b, e são representados graficamente juntos (CTRL + i/CARTI9, n=21), IFEN + CARTI9 (n=13), IFN + iCARTI9 (n=6), IFN + iCARTI9 late (n=6). ****p<0,001, teste de Mantel-Haenszel, o valor-p ajustado pelo método de Bonferroni. Figura 21. OVA-ALL modificada mostrou imunogenicidade aumentada em comparação com ALL parental.

[00166] Curva de sobrevivência de camundongos CTRL (n=10, tratados com anticorpo isotípico de controle), TIFN (n=10, tratados com anticorpo isotípico de controle), CTRL + aCTLAA4 (n=14) e IFN + aCTLA4 (n=13) injetados com ALL. **p<0,01, teste de Mantel-Haenszel. Figura 22. Análises de RNA-Seg de numerosas células (bulk) em macrófagos esplênicos.

[00167] a, Diagramas em caixa mostrando os níveis de expressão nas condições indicadas de genes suprarregulados (n=213) ou infrarregulados (n=258) em macrófagos de camundongos ALL tratados com terapia gênica com IFN (IFN+ALL) em comparação com os controles ALL. Os números representam os resultados do teste dos postos sinalizados de Wilcoxon nas condições indicadas. b, Mapa de calor de correlação entre os conjuntos de dados de RNA-Seq em macrófagos a partir das condições indicadas. Os números indicam os coeficientes de determinação (R?) calculados. As amostras são ordenadas com base em clusterização hierárquica não supervisionada. Figura 23. Identificação de tipo de célula em dados de scRNA-Seq das células CD11b* esplênicas.

[00168] a, Representações gráficas de tSNE mostrando os níveis de expressão em célula individual das assinaturas genéticas (GS, Gene Signatures) indicadas. Monócitos não clássicos: Cd300e, 17000111I03Rik, Tspan9, Dmpk, Fxyd2; monócitos clássicos: Ly6c2, Tarm, Tfec, Psrcl, Mmp8; neutrófilos: I11f9, Pglyrp4, Nirpl2, Mrgpra2b, Mmp8, Ltf, Amer2, Stfa211, Gm5483; células dendríticas: Adam23, Procr, Mab2113, Sucnrl, Fndc5, Rnf186, FIt3, Cd207, Adaml11, Apol7c, Htr7; macrófagos: Vcaml, Mertk, Actnl, Fena, Crip2, Spic, Kena2, Gfra2, Stab2, Jup; células NK: Khdclc, Khdcelb, Phactr3, Col8a2, Klra4, Adamts14, Gzma, Cmal, Gzmb, Clip4; T cells: Cd3g, Cd3e, Bcl11b, Actn2, Camk4; células-B: Pax5, Cd79a, Cd19, Chst3, Scn4a, Cacnali, Ly6d, KIhl14, Mzbl. A escala de cores reflete a expressão média (TPM transformado em log) dos genes dentro de cada assinatura. b, Mapa de calor mostrando a expressão (valores escalonados de TPM transformado em log) dos 20 genes discriminativos de topo para cada agrupamento. Genes representativos selecionados para cada agrupamento são mostrados à direita. Até 200 células individuais são mostradas para cada agrupamento.

Figura 24. Alterações induzidas por IFN e leucemia em dados de scRNA- Seq em células CD11b* esplênicas.

[00169] Representações gráficas de tSNE mostrando os dados de scRNA-Segq dos agrupamentos 2-11, coloridas com base na condição experimental.

Figura 25. Análise de subclusterização de dados de scRNA-Seq de monócitos não clássicos e análises de expressão gênica em células-T CD4.

[00170] a, Representações gráficas citométricas de fluxo mostrando células OVA-ALL (parte superior) e células-T CD8 específicas para OVA (parte inferior) no baço de 3 camundongos representativos CTRL (CTRL + ALL), IFN não respondedor (IFN + ALL NR) e IFN respondedor (IFN + ALL R) injetados com ALL. Células CDI 1b+ destes camundongos foram

54 /156 analisadas por scRNA-Seq. b, Representações gráficas de tSNE mostrando subagrupamento (sub-cluster) de células dentro da população de monócitos não clássicos, coloridas com base na clusterização (representação gráfica superior) ou na condição experimental (representação gráfica inferior). Subagrupamentos — (sub-clusters) dentro de círculo representam subagrupamentos menores com composição dispersada e correspondem aqueles marcados com asterisco na Figura 19i. Figura 26. Terapia gênica com IFN reforça a ativação de células CARTIS9.

[00171] a, Representação esquemática do LV bidirecional (BdLV) usado para transduzir células-T de camundongo e a percentagem de expressão de NGFR em células-T CD4 e CD8 não transduzidas (UT, Un-Transduced) e transduzidas (CARTI19) antes da infusão nos camundongos da Figura 20b. b, Percentagem de células-T naive (CD62L+CD44+), de memória central (CD62L+CD44+) e de memória efetoras (CD62L-CD44+) UT ou CARTI9 antes da infusão nos camundongos da Figura 20b. c, Representação gráfica citofluorimétrica de fluxo representativa do camundongo sobrevivente IFN + CARTIS9 da Figura 20b mostrando aplasia de célula-B no PB. d, Percentagem ao longo do tempo (média + EPM) de expressão de PDI1 sobre células CD8+NGFR+ CARTI9 de camundongos CTRL + CARTI9 (n=7) e IFN + CARTI19 (n=7). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. e, f, Nível (intensidade média de fluorescência, MFI (Mean Fluorescent Intensity)) de expressão de NGFR ao longo do tempo em células CD4+ (e) e CD8+ (f) CARTI9 de camundongos de (d). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. Figura 27. Terapia gênica com IFN reforça a ativação de células iCARTIS9.

[00172] a, Percentagem de expressão de NGFR em células-T CD4 e CD8 não transduzidas (UT) e transduzidas (CART19) antes da infusão nos camundongos da Figura 20e. b, Percentagem de células-T naive (CD62L+CD44+), de memória central (CD62L+CD44+) e de memória efetoras (CD62L-CD44+) UT ou CARTI9 antes da infusão nos camundongos da Figura 20e. c, Números absolutos (média + EPM) de células-T CD4 (parte superior) e CD8 (parte inferior) NGFR+ CARTI9 de camundongos CTRL + CARTI9 (n=7), IFEN + CARTI9 (n=6), CTRL + iCARTI9 (n=7), IFN + iCARTI9 (n=6) e IFN + iCARTIO9 late (tardia) (n=6, teste de intervenção tardia). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. d, Nível (intensidade média de fluorescência, MFI) de expressão de NGFR ao longo do tempo de células CD4+ (parte superior) e CD8+ (parte inferior) CARTIS9 de camundongos de (c). Camundongos sobreviventes durante longo período de tempo são mostrados em verde. Cada linha representa um camundongo individual. Figura 28

[00173] Estruturas dos construtos NGFR de controle (parte superior), Tig126/130a (parte do meio) e Tta126/130a (parte inferior) Figura 29

[00174] Avaliação da distribuição de IFNy sobre o crescimento de leucemia e o microambiente pró-tumoral induzido pela leucemia. Figura 30

[00175] Avaliação da distribuição contemporânea de várias citocinas imunoestimulatórias para dentro do microambiente de leucemia usando a cadeia principal do vetor Tie2. Figura 31

[00176] Avaliação da sinergia entre distribuição, baseada em terapia gênica, de IFNy com outras estratégias imunoterapêuticas, incluindo os inibidores de ponto de checagem anti-CTLA-4 e anti-LAG-3, e o inibidor de indolamina-2,3-dioxigenase (IDO), 1-Metil-Triptofano (1-MT).

DESCRIÇÃO DETALHADA CÉLULAS

[00177] Uma célula-tronco é capaz de se diferenciar em muitos tipos de células. Uma célula que é capaz de se diferenciar em todos os tipos de células é conhecida como totipotente. Em mamíferos, apenas o zigoto e as células embrionárias precoces são totipotentes. As células-tronco são encontradas na maioria, talvez em todos, os organismos multicelulares. Elas são caracterizadas pela capacidade de se renovarem mediante divisão celular mitótica e de se diferenciarem em um variedade diversa de tipos de células especializadas. Os dois tipos amplos de células-tronco de mamíferos são as células-tronco embrionárias que são isoladas da massa celular interna de blastocistos, e células-tronco de adulto que são encontradas em tecidos de adultos. Em um embrião desenvolvente, as células-tronco podem se diferenciar em todos os tecidos embrionários especializados. Em organismos adultos, as células-tronco e as células progenitoras atuam como um sistema de reparo para o corpo, suprindo de novo as células especializadas, mas também mantendo a renovação (turnover) normal de órgão regenerativos, como sangue, pele ou tecidos intestinais.

[00178] As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são células-tronco multipotentes que podem ser encontradas, por exemplo, em sangue periférico, medula óssea e sangue do cordão umbilical. As HSCs são capazes de autorrenovação e diferenciação em qualquer linhagem celular sanguínea. São capazes de recolonizar o sistema imune inteiro, e as linhagens eritroide e mieloide em todos os tecidos hematopoiéticos (como medula óssea, baço e timo). Proveem produção vitalícia de linhagens de ALL de células hematopoiéticas.

[00179] As células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) têm a capacidade para se diferenciarem em um tipo específico de célula. Entretanto, em contraste com as células-tronco, já são muito mais específicas: são estimuladas para se diferenciarem em célula “alvo” delas. Uma diferença entre HSCs e HPCs é que as HSCs podem replicar-se indefinidamente, enquanto que as HPCs podem apenas dividir-se em um número limitado de Vezes.

[00180] Em uma modalidade, a presente invenção pode usar uma população mista de células compreendendo HSCs e HPCs (e.g. uma população de HSPC).

[00181] Uma célula diferenciada é uma célula que tem se tornado mais especializada em comparação com uma célula-tronco ou uma célula progenitora. A diferenciação ocorre durante o desenvolvimento do organismo multicelular à medida que o organismo se altera de um zigoto único para um sistema complexo de tecidos e tipos de células. A diferenciação é também um processo comum em adultos: as células-tronco de adulto dividem-se e criam células filhas completamente diferenciadas durante o reparo de tecido e a renovação de células normais. A diferenciação altera enormemente um tamanho da célula, um formato da célula, um potencial de membrana da célula, uma atividade metabólica da célula e uma responsividade da célula aos sinais. Estas alterações são predominantemente devido às modificações elevadamente controladas da expressão gênica. Em outras palavras, uma célula diferenciada é uma célula que tem estruturas específicas e desempenha determinadas funções devido a um processo desenvolvente que envolve a ativação e a desativação de genes específicos. Aqui, uma célula diferenciada inclui células diferenciadas da linhagem hematopoiética como monócitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos/plaquetas, células dendríticas, células-T, células-B e células- NK. Por exemplo, as células diferenciadas da linhagem hematopoiética podem ser distinguidas de HSCs e HPCs pela detecção de moléculas da superfície celular que não são expressadas ou são expressadas em um grau menor sobre células não diferenciadas (HSCs e HPCs). Exemplos de marcadores de linhagem humana incluem CD33, CD13, CDIl4, CDI5 (mieloide), CDI9, CD20, CD22, CD79a (B), CD36, CD71, CD235a (eritroide), CD2, CD3, CDA4, CD8 (T), CD56 (NK). Fonte de células

[00182] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito usado(a) na presente invenção é obtido(a) de uma amostra de tecido.

[00183] Por exemplo, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito pode ser obtido(a) de sangue periférico fetal e de adulto, de sangue do cordão umbilical, da medula óssea, do fígado ou do baço. Preferivelmente, estas células são obtidas do sangue periférico ou da medula óssea. Podem ser obtidas após mobilização das células in vivo por meio de tratamento com fator de crescimento.

[00184] A mobilização de HSC ou HPC pode ser realizada usando, por exemplo, G-CSF, plerixafor ou combinações dos mesmos. Outros agentes, como NSAIDs, ligantes CXCR2 (Grobeta) e inibidores de dipeptidil- peptidase podem também ser úteis como agentes mobilizantes.

[00185] Com a disponibilidade dos fatores de crescimento de célula- tronco GM-CSF e G-CSF, a maioria dos procedimentos de transplantação de células-tronco hematopoiéticas são agora realizados usando células-tronco coletadas do sangue periférico, ao invés da medula óssea. A coleta de células- tronco do sangue periférico provê um enxerto maior, não exige que o doador seja submetido à anestesia geral para coletar o enxerto, resulta em tempos mais curtos de transplantação e pode prover uma mais baixa taxa de recidiva de longo prazo.

[00186] A medula óssea pode ser coletada por métodos de aspiração padrão (quer no estado de equilíbrio quer após mobilização), ou pelo uso de ferramentas coletoras de próxima geração.

[00187] Além disso, as HSCs podem também ser derivadas de células- tronco pluripotentes induzidas. Características das HSCs

[00188] HSCs são tipicamente de baixo perfil de dispersão frontal e de dispersão lateral pelos procedimentos citométricos de fluxo. Algumas são metabolicamente quiescentes, como demonstrado pela marcação com Rodamina que permite a determinação da atividade mitocondrial. As HSCs podem compreender determinados marcadores de superfície celular como CD34, CD45, CD133, CD90 e CD49f. Podem também ser definidas como células desprovidas da expressão dos marcadores de superfície celular CD38 e CDA45RA. Entretanto, a expressão de alguns destes marcadores é dependente do estágio desenvolvente e do contexto tecido-específico da HSC. Algumas HSCs chamadas “células da população lateral” excluem o corante Hoechst 33342 conforme detectado por citometria de fluxo. Portanto, as HSCs têm características descritivas que permitem a identificação e o isolamento delas. Marcadores negativos

[00189] CD38 é o marcador negativo único mais comprovado e útil para HSCs humanas.

[00190] As HSCs humanas podem também ser negativas para marcadores de linhagem como CD2, CD3, CDI4, CDI16, CDI9, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271 e CD45RA. Entretanto, pode ser necessário que estes marcadores sejam usados em combinação para enriquecimento de HSC.

[00191] Entende-se por marcador negativo que as HSCs humanas estão desprovidas da expressão destes marcadores. Marcadores positivos

[00192] CD34 e CD133 são os marcadores positivos mais úteis para

HSCs.

[00193] Algumas HSCs são também positivas para marcadores de linhagem como CD90, CD49f e CD93. Entretanto, pode ser necessário que estes marcadores sejam usados em combinação para enriquecimento de HSC.

[00194] Entende-se por marcador positivo que as HSCs humanas expressam estes marcadores.

[00195] Consequentemente, a população terapêutica de células pode ser CD34*CD38". Outras separações podem ser realizadas para obter, por exemplo, células CD34*CD38 CD45RA CD90*CD49f*. Expressão de miRNA

[00196] A expressão de miRNAs mir-126 e mir-130a em uma células indica que a célula é uma HSC ou uma HPC. Mais especificamente, a expressão mir-126 indica que a célula é uma HPC primitiva. A expressão mir- 130a indica que a célula é HPC mais primitiva.

CITOCINAS

[00197] Citocinas são um categoria de proteínas pequenas, tipicamente de tamanho de aproximadamente 5 a 20 kDa, que desempenham uma função importante em sinalização celular. As citocinas podem incluir interferons, quimiocinas, interleucinas, linfocinas e fatores de necrose tumoral, e são produzidas por uma ampla variedade de células, incluindo macrófagos, linfócitos-B, linfócitos-T, mastócitos, células endoteliais e fibroblastos.

[00198] A citocinas atuam mediante receptores, e têm uma função particularmente importante no sistema imune, modulando o equilíbrio entre as respostas imunes humorais e as respostas imunes baseadas em células.

[00199] As citocinas incluem interferons (IFNs), IL-12 e fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF).

[00200] Os interferons (IFNs) são um grupo de proteínas sinalizadoras que são produzidas pela células do hospedeiro em resposta à presença de patógenos (e.g. vírus, bactérias e parasitas) e células tumorais.

[00201] Os IFNs são tipicamente divididos em três classes: tipo 1, tipo II, e tipo III. INTERFERONS (IFNs) DE TIPO I

[00202] Os interferons (IFNs) de tipo I são uma classe de citocinas produzidas por células imunes (leucócitos, e.g. células-NK, células-B, células-T, macrófagos etc.). Os IFNs de tipo I são chamados de citocinas pleiotrópicas porque podem ter um efeito de IFN específico sobre múltiplos tipos de células.

[00203] Em uma modalidade, o IFN de tipo I é interferon-alfa (IFNa). O IFNa é também conhecido como IFN-alfa, IFNa, INFo-1/13.

[00204] Uma sequência de aminoácidos de IFNa exemplificadora é:

MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTL MLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIF NLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLM KEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQE

SLRSKE (SEQ ID NC: 6)

[00205] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFN de tipo I codifica uma proteína IFNa compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFN de tipo I codifica uma proteína IFNa compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO:6, e em que a funcionalidade da proteína IFNa tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 é substancialmente mantida.

[00206] Uma sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica um IFNa é:

ATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGT GCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAA ACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAG ATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACT TTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTG AAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCT CTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTA GACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAA GCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATG AAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATC ACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAG GTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACT

TGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA (SEQ ID NO: 7)

[00207] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNa compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNa compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO:7, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica uma proteína tendo substancialmente a mesma função que a proteína de SEQ ID NO: 6.

[00208] Em uma modalidade, o TFN de tipo 1 é interferon-beta (TFNB; IFND).

[00209] Uma sequência de aminoácidos de IFNB exemplificadora é:

63 / 156

MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMS YNLLGFLQORSSNFQCQ KLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQOQFQKEDAALTIYEMLQN IFAIFRODSSSTGWNETIVENLLANV YHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRG KLMSSLHLKRY YGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTG

YLRN (SEQ ID NO: 8)

[00210] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFN de tipo I codifica uma proteína IFNB compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFN de tipo I codifica uma proteína IFNB compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 8, e em que a funcionalidade da proteína IFNB tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 é substancialmente mantida.

[00211] Uma sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica um IFNRB é: gaatteteagegtegtttgctttectttgcttteteceaagtettgttttacaatttectttagtcatt cactgaaactttaaaaaacattagaaaacctcacagtttegtaaatctttttecctattatatatateataagataggas cttaaataaagagttttagaaactactaaaatgtaaatgacataggaaaactgaaagegagaagtgaaagtegs aaattcctetgaatagagagaggaccatcteatataaataggccatacccacggagaaaggacattetaactgc aacctttegaagcctttgctetggeacaacagetagtaggegacactgttegtgttgtcaacatgaccaacaagt gtetectecaaattgctetectgttgtgettetecactacagetetttecatgagetacaacttgcttggattectaca aagaagcagcaattttcagtgtcagaagetectgtggcaattigaatgggaggcttgaatactgccteaaggaca ggatgaactttgacatccctgaggagattaageagetgcagcagttecagaaggaggacgecgcattgaceat ctatgagatgctecagaacatctttgctatttteagacaagattcatetageactggetggaatgagactattgttga gaacctcctggetaatgtetateateagataaaccatetgaagacagtectggaagaaaaactggagaaagaa

64 / 156 gatttcaccaggggaaaacteatgageagtetg cacctgaaaagatattatgggaggattetgcattacctgaaggecaaggagtacagtea ctgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctecga aactgaagatctcctagcctgtgcctetgggactggacaattgcttcaageattetteaaccageagatgetettt aagtgactgatggctaatgtactgcatatgaaaggacactagaagattttgaaatttttattaaattatgagttattttt atttatttaaattttattttggaaaataaattatttttggtgcaaaagtcaacatggcagttttaatttegatttgatttatat aaccatccatattataaaattgccaagtacctattagttettctttttaaaatatacctgcaaagtagtatactttetes cecctegcctttaaggaatttaaaatticaagaaagccatgatggaatatataaggtaagagacaataaggggacct gaaccttatgggggaataaatatggcatgaactgcteteggattaaaagagaaaaggaaagctegageggtete gaactaaacctggggttecceattectectacteteteticcagatteteteateataaagttagaattgagetggee atcaggaatagccagaggaatatgteagcettttgtgttetecetaacettececagttattteggggateactttgct cetegaaagatttttaaataat tatgtgccececacceatecetgeaagettaagggtgagaagteceatttacttecatgaca ctattaagcagcaatctcetttattetgcteateateggacagecaagatgtgtgggtatettaggggagctetage tecetgtetgetggeatggeacaggcateagaggaagaagaacctttttataccctagecatetggttagttttete cctagttttteaaaaaactaagectgcttecagtececactgccttgtteatacagaatte (SEQ ID NO: 9)

[00212] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNB compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNB compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO:9, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica uma proteína tendo substancialmente a mesma função que a proteína IFNB de SEQ ID NO: 8.

[00213] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica

IFN de tipo I é com códons otimizados. INTERFERON DE TIPO II - INTERFERON-y (IFNy)

[00214] O interferon-y (IFNy), também conhecido como interferon imune, é ativado por Interleucina-12 e desempenha uma função importante nas regulação e ativação da resposta imune.

[00215] Uma sequência de aminoácidos de IFNy exemplificadora é:

MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYF NAGHSDV ADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKD DQSIQKS VETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKA

IHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ (SEQID NO: 12)

[00216] Os aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 12 podem atuar como um peptídeo de sinal e ser clivados para formar uma proteína madura que é representada pelos aminoácidos 24-161 de SEQ ID NO: 12. Uma sequência de aminoácidos madura exemplificadora de IFNy é:

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWK EESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSN KKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRS

QMLFRGRRASQ (SEQ ID NO: 13)

[00217] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFNy codifica uma proteína IFNy compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 13. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFNy codifica uma proteína IFNy compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 12 ou 13, e em que a funcionalidade da

66 / 156 proteína IFNy tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 13 é substancialmente mantida.

[00218] Uma outra sequência de aminoácidos de IFNy exemplificadora é:

MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFN SSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQUHSFYLRLFEVLKDNQAI SNNISVIESHLITTFFESNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIR

VVHQLLPESSLRKRKRSRC (SEQ ID NO: 17)

[00219] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFNy codifica uma proteína IFNy compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFNy codifica uma proteína IFNy compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 17, e em que a funcionalidade da proteína IFNy tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 é substancialmente mantida.

[00220] Uma sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica um IFNy é:

ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCT GCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGT AAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTC AGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAAT TGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGT CTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGC ATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAG

67 /156

TTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTG ACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATAC ATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAA CAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGA

GCATCCCAGTAA (SEQ ID NO: 14)

[00221] Uma sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica uma forma madura de IFNy é:

CAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAG AAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTC TTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAA AAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAA AAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCAT CAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAA ACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTG AATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCT GAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCA

GATGCTGTTTCGAGGT (SEQ ID NO: 15)

[00222] Uma outra sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica um IFNy é:

ATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCT TCCTCATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGA AAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGA TGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCA AAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTT CTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGC AACAACATAAGCGTCATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCA GCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCATGAGTATTGCCAAGT

68 /156

TTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAATGAGC TCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGA

AGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGA (SEQ ID NO: 16)

[00223] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNy compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, 15 ou 16. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNy compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 14, 15 ou 16, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica uma proteína tendo substancialmente a mesma função que a proteína de SEQ ID NO: 12 ou 13.

[00224] Uma outra sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica um IFNy é:

ATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCT TCCTCATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGA AAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGA TGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCA AAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTT CTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGC AACAACATAAGCGTCATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCA GCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCATGAGTATTGCCAAGT TTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAATGAGC TCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGA

AGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGA (SEQ ID NO: 18)

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[00225] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNy compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNy compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 18, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica uma proteína tendo substancialmente a mesma função que a proteína de SEQ ID NO: 17.

[00226] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o IFNy é com códons otimizados. FATOR DE NECROSE TUMORAL a (TNFa)

[00227] O fator de necrose tumoral a (TNFa) é uma citocina que está envolvida em inflamação sistêmica. Sua função primária é na regulação de células imunes.

[00228] O TNFa é predominantemente produzido por macrófagos ativados, mas é também produzido por outros tipos de células como linfócitos CD4+, células-NK, neutrófilos, mastócitos, eosinófilos, e neurônios.

[00229] Uma sequência de aminoácidos de TNFa exemplificadora é:

MSTESMIRDVELAEEALPQOKMGGFQNSRRCLCLSLFSFL LVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSS DKPVAHV VANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADG LYLVYSQVLFKGQGCPDY VLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPK DTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQV

YFGVIAL (SEQ ID NO: 19)

[00230] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica

TNFa codifica uma proteína TNFa compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica o TNFa codifica uma proteína TNFo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 19, e em que a funcionalidade da proteína TNFa tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 é substancialmente mantida.

[00231] Uma sequência de nucleotídeos exemplificadora que codifica um TNFa é:

ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGCGACGTGGAACTG GCAGAAGAGGCACTCCCCCAAAAGATGGGGGGCTTCCAGAACTCC AGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATTCCTGCTTGTGGCAG GGGCCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC CCAAAGGGATGAGAAGTTCCCAAATGGCCTCCCTCTCATCAGTTCT ATGGCCCAGACCCTCACACTCAGATCATCTTCTCAAAATTCGAGTG ACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGC AGCTGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCAACG GCATGGATCTCAAAGACAACCAACTAGTGGTGCCAGCCGATGGGT TGTACCTTGTCTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGACAAGGCTGCCC CGACTACGTGCTCCTCACCCACACCGTCAGCCGATTTGCTATCTCA TACCAGGAGAAAGTCAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCCTGCEC CCAAGGACACCCCTGAGGGGGCTGAGCTCAAACCCTGGTATGAGC CCATATACCTGGGAGGAGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGGGACCAAC TCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCCAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTC

CGGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGCTCTG (SEQ ID NO: 20)

[00232] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica TNFa compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica TNFa compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 20, em que a dita sequência de nucleotídeos codifica uma proteína tendo substancialmente a mesma função que a proteína de SEQ ID NO: 19. I-METIL-TRIPTOFANO (1-MT)

[00233] 1-Metil-triptofano (1I-MT) é um inibidor da enzima catabólica de triptofano indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e tem a estrutura: o N NHz H3C

[00234] O I1-MT da presente invenção pode estar presente como um éster ou sal, em particular um éster ou sal farmaceuticamente aceitável.

[00235] Em uma modalidade, o 1-ML é D-1|-MT. Em uma modalidade, o I-ML é L-1-MT. Em uma modalidade, o 1-ML é uma mistura racêmica.

[00236] Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos agentes da invenção incluem sais de base ou de adição de ácido adequados dos mesmos. Uma revisão de sais farmaceuticamente aceitáveis adequados pode ser encontrada em Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19.

[00237] A invenção também inclui, se apropriados, todos enantiômeros e tautômeros dos agentes. A pessoa versada reconhecerá compostos que possuem propriedades ópticas (e.g. um ou mais átomos de carbono quirais) ou características — tautoméricas. — Os enantiômeros e/ou tautômeros correspondentes podem ser isolados/preparados por métodos conhecidos na técnica.

SEQUÊNCIA ALVO DE MICRORNA

[00238] Genes microRNA estão dispersos em todos os cromossomos humanos, exceto no cromossomo Y. Podem estar localizados quer em regiões não codificantes quer dentro de íntrons de genes codificantes de proteínas. Cerca de 50% dos miRNAs aparecem em agrupamentos que são transcritos como transcritos primários policistrônicos. Similares aos genes codificantes de proteínas, os mIRNAs são habitualmente transcritos a partir de promotores de polimerase II, gerando um denominado transcrito de miRNA primário (pri- mMIRNA, primary miRNA). Este pri-miRNA é, então, processado mediante uma série de etapas de clivagem endonucleolíticas, realizadas por duas enzimas pertencendo à família de RNAse de Tipo III, Drosha e Dicer. A partir do pri-miRNA, uma haste-alça de comprimento de cerca de 60 nucleotídeos, chamada de precursor de miRNA (pre-miRNA), é excisada por um complexo nuclear específico, composto de Drosha e gene da região crítica da síndrome de DiGeorge (DGCR8), que corta ambas as fitas próximo da base da haste- alça primária e deixa um 5'-fosfato e uma projeção-3', de comprimento de 2 pb. O pre-miRNA é, então, ativamente transportado do núcleo para o citoplasma por RAN-GTP e Exportina. Então, Dicer realiza um corte em fita dupla na extremidade da haste-alça não definida pelo corte por Drosha, gerando um duplex de 19-24 pb, que é composto do miRNA maduro e a fita oposta do duplex, chamada de miRNA*. De acordo com a regra de assimetria termodinâmica, apenas uma fita do duplex é seletivamente incorporada no complexo silenciador induzido por RNA (RISC, RNA-Induced Silencing Complex), e acumula-se como o microRNA maduro. Esta fita é habitualmente aquela cuja extremidade 5º' é menos firmemente pareada com seu complemento, como foi demonstrado por malpareamentos de nucleotídeos individuais introduzidos na extremidade 5º de cada fita dos dúplices de siRNA. Entretanto, há alguns miRNAs que suportam a acumulação de ambas as fitas do duplex em extensão similar.

[00239] Os microRNAs engatilham o RNAi, muito semelhantemente aos RNAs interferentes pequenos (siRNA, small interfering RNAs) que estão sendo extensivamente usados para atenuação de atividade gênica (knock- down) experimental. A principal diferença entre miRNA e siRNA é à biogênese deles. Quando incorporada no RISC, a fita guia da molécula de RNA pequeno interage com as sequências alvo de mRNA preferivelmente encontradas na região-3' não traduzida (3'UTR, 3º UnTranslated Region) de genes codificantes de proteínas. Tem sido mostrado que os nucleotídeos 2-8 contados a partir da extremidade 5' do miRNA, a denominada sequência- semente, são essenciais para engatilhar o RNAi. Se a sequência de fita guia inteira é perfeitamente complementar ao MRNA-alvo, como é habitualmente o caso de siRNAs e de miRNAs de plantas, o MRNA é endonucleoliticamente clivado pelo envolvimento da proteína Argonauta (Ago), também chamada de “slicer” (cortadora) do duplex de RNA pequeno no complexo silenciador induzido por RNA (RISC). DGRC (DiGeorge syndrome critical region gene 8, gene da região crítica da síndrome de DiGeorge 8) e TRBP (TAR (HIV) RNA binding protein 2) são proteínas ligantes de RNA de fita dupla que facilitam a biogênese de miRNA maduro pelas enzimas Drosha e Dicer RNase III, respectivamente. A fita guia do duplex de miRNA incorpora-se no complexo efetor RISC, que reconhece os alvos específicos mediante pareamento imperfeito de bases e induz silenciamento gênico pós- transcricional. Vários mecanismos têm sido propostos para este modo de regulação: miRNAs podem induzir a repressão de iniciação de tradução, marcar MRNAs-alvo para degradação por desadenilação, ou sequestrar alvos para dento do corpo-P citoplasmático.

[00240] Por outro lado, se apenas a sequência-semente é perfeitamente complementar ao mRNA-alvo mas as bases restantes mostram pareamento incompleto, o RNAi atua mediante múltiplos mecanismos resultando em repressão traducional. A degradação de mRNA eucariótico ocorre predominantemente mediante o encurtamento da cauda poliA na extremidade 3º do mRNA, e descapeamento (remoção do quepe) na extremidade 5º, seguidos por digestão com 5º-3* exonuclease e acumulação do miRNA em áreas citoplasmáticas discretas, os denominados corpos-P, enriquecidos em componentes da via de degradação de mRNA.

[00241] De acordo com a presente invenção, a expressão da citocina, como do IFN de tipo 1, é regulada por miRNAs endógenos usando as sequências alvo de miRNA correspondentes. Com o uso deste método, um miRNA endogenamente expressado em uma célula previne ou reduz a expressão transgênica naquela célula pela ligação de sua sequência alvo de mMIRNA correspondente posicionada no vetor ou polinucleotídeo. Isto tem numerosas vantagens sobre o uso baseado em promotores tecido-específicos, pelo menos o fato de que os promotores tecido-específicos estão, com frequência, associados com expressão que resulta em perda de função parcial (leaky expression) em uma fração de células não alvo.

[00242] As sequências alvo de miRNA que são úteis na presente invenção são sequências alvo de miRNA que são expressadas em HSCs mas que não são expressadas extensivamente em células diferenciadas e.g., células mieloide (incluindo macrófagos infiltrantes tumorais). Isto é particularmente importante porque a expressão de IFNa é conhecidamente tóxica para HSCs.

[00243] Os exemplos preferidos de sequências alvo de miRNA para uso na invenção são mir-130a e mir-126.

[00244] A ligação do miRNA mir-126 à sequência alvo mir-126 bloqueia a expressão mais eficazmente em HSC e em células da linhagem eritroide. Dessa forma, a sequência alvo mir-126 é particularmente adequada para aplicações de terapia gênica que se baseiam em expressão transgênica robusta na linhagem mieloide e linfoide.

[00245] O miRNA mir-126 pode ter a sequência de nucleotídeos: UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NC: 1).

[00246] Em uma modalidade, a sequência alvo mir-126 compreende a sequência de nucleotídeos de GCATTATTACTCACGGTACGA (SEQ ID NO:2).

[00247] Em uma modalidade, o vetor ou polinucleotídeo usado na presente invenção compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três, cópias da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2. Em uma modalidade preferida, a sequência alvo mir-126 compreende duas cópias da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[00248] Em uma modalidade a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito usado(a) na presente invenção compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três, cópias da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2. Em uma modalidade preferida, a sequência alvo mir-126 compreende duas cópias da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[00249] As cópias das sequências alvo mir-126 podem estar separadas por uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode compreender pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro ou pelo menos cinco bases nucleotídicas.

[00250] A ligação de miRNA mir-130a à sequência alvo mir-130a bloqueia a expressão mais eficazmente em HSC e em células da linhagem eritroide (similar ao miR-126). Dessa forma, a sequência alvo miR-130a é particularmente adequada para aplicações de terapia gênica baseadas em expressão transgênica robusta na linhagem eritroide e linfoide.

[00251] O miRNA mir-130a pode ter sequência de nucleotídeos de: CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NO: 3).

[00252] Em uma modalidade, a sequência alvo mir-130a compreende a sequência de nucleotídeos de ATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID

NO: 4).

[00253] Em uma modalidade, a sequência alvo mir-130a compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três cópias da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade preferida, a sequência alvo mir-130a compreende duas cópias da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4.

[00254] As cópias das sequências alvo mir-130a podem estar separadas por um sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode compreender pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro ou pelo menos cinco bases nucleotídicas.

[00255] Em uma modalidade, o vetor compreende duas cópias da sequência alvo mir-126 e duas cópias da sequência alvo mir-130a.

[00256] Em uma modalidade, duas cópias da sequência alvo mir-126 e duas cópias da sequência alvo mir-130a estão compreendidas na sequência de nucleotídeos de:

GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTAC

TCACGGTACGAACGCGTATGCCCTTTTAACATTGCACTGATGCAT ATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO: 5).

[00257] A sequência alvo de combinação, e.g. uma sequência alvo compreendendo duas cópias da sequência alvo mir-126 e duas cópias da sequência alvo mir-130a é particularmente preferida para uso na presente invenção porque o uso desta combinação maximiza a repressão do vetor em HSC e a expressão na progênie mieloide.

[00258] Além disso, quando se usa a sequência alvo de combinação, a infrarregulação transgênica em HSC é garantida pelos dois miRNAs independentes, e o risco para interferência com regulação por miRNA endógeno é reduzido, aumentando, assim, a segurança e a eficácia da sequência alvo.

VETOR

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[00259] Um vetor é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro. De acordo com a presente invenção, e à guisa de exemplo, alguns vetores usados em técnicas de ácido nucleico recombinante permitem que entidades, como um segmento de ácido nucleico (e.g. um segmento de DNA heterólogo, como um segmento de cDNA heterólogo), seja transferido para dentro de uma células alvo. O vetor pode servir para o propósito de manter o ácido nucleico heterólogo (DNA ou RNA) dentro da célula, facilitar a replicação do vetor compreendendo um segmento de ácido nucleico, ou facilitar a expressão da proteína codificada por um segmento de ácido nucleico. Os vetores podem ser virais ou não virais. Exemplos de vetores usados em técnicas de ácido nucleico recombinante incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, cromossomos, cromossomos artificiais e vírus. O vetor pode também ser, por exemplo, um ácido nucleico nu (e.g. DNA). Em sua forma mais simples, o próprio vetor pode ser um nucleotídeo de interesse.

[00260] Os vetores usados na invenção podem ser, por exemplo, vetores plasmidiais ou virais e podem incluir um promotor para a expressão de um polinucleotídeo e opcionalmente um regulador do promotor. Em uma modalidade preferida o vetor um vetor viral.

[00261] Os vetores compreendendo polinucleotídeos usados na invenção podem ser introduzidos em células usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, como transformação, transfecção e transdução. Várias técnicas são conhecidas na técnica, por exemplo transdução com vetores virais recombinantes, como vetores retroviral, lentiviral, adenoviral, viral adeno-associado, baculoviral e viral do herpes simples, vetores “Sleeping Beauty", injeção direta de ácidos nucleicos e transformação biolística.

[00262] Sistemas de distribuição não virais incluem mas não são limitados aos métodos de transfecção de DNA. Aqui, a transfecção inclui um processo que usa um vetor não viral para distribuir um gene para uma célula alvo. Métodos de transfecção típicos incluem eletroporação, biolística com DNA, transfecção mediada por lipídio, transfecção mediada por DNA compactado, lipossomas, imunolipossomas, lipofectina, transfecção mediada por agente catiônico, anfifílicos faciais catiônicos (CFAs, Cationic Facial Amphiphiles) (Nature Biotechnology 1996 14; 556) e combinações dos mesmos.

[00263] O termo “transfecção” deve ser entendido como incluindo a distribuição de polinucleotídeos para células por distribuição tanto viral quanto não viral.

[00264] Além disso, a invenção pode utilizar protocolos de gene targeting (processo de alteração de um gene específico ou de uma sequência gênica específica em sua localização em um genoma), por exemplo a distribuição de agentes modificadores de DNA.

[00265] Sistemas de distribuição virais incluem mas não são limitados a um vetor adenoviral, um vetor viral adeno-associado (AAV, Adeno- Associated Viral), um vetor viral de herpes, um vetor retroviral, um vetor lentiviral, e um vetor baculoviral.

[00266] Retrovírus são vírus de RNA com um ciclo de vida diferente daquele dos vírus líticos. Sob esse aspecto, um retrovírus é uma entidade infecciosa que se replica mediante um intermediário de DNA. Quando um retrovírus infecta uma célula, seu genoma é convertido em uma forma de DNA por uma enzima transcriptase reversa. A cópia de DNA serve como um molde para a produção de novos genomas de RNA e de proteínas viralmente codificadas necessárias para a montagem das partículas virais infecciosas.

[00267] Há muitos retrovírus, por exemplo vírus da leucemia murina (MLV, Murine Leukemia Virus), vírus da imunodeficiência humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV, Equine Infectious Anaemia Virus), vírus de tumor mamário de camundongo fêmea (MMTV, Mouse Mammary Tumour Virus), vírus do sarcoma de Rous (RSV, Rous Sarcoma Virus), vírus do sarcoma de Fujinami (FuSV, Fujinami Sarcoma Virus), vírus da leucemia murina Moloney (Mo-MLV, Moloney Murine Leukemia Virus), vírus do osteossarcoma murino FBR (Finkel-Biskis- Reilly) (FBR MSV, FBR Murine osteosarcoma Virus), vírus do sarcoma murino Moloney (Mo-MSV, Moloney Murine Sarcoma Virus), vírus da leucemia murina Abelson (A-MLV, Abelson Murine Leukemia Virus), vírus da mielocitomatose aviária 29 (MC29, Avian Myelocytomatosis Virus-29), e vírus da eritroblastose aviária (AEV, Avian Erythroblastosis Virus) e todos os outros Retroviridiae incluindo lentivírus.

[00268] Uma lista detalhada de retrovírus pode ser encontrada em Coffin et al. (“Retroviruses” 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffinn SM Hughes, HE Varmus pp 758-763). Lentivírus também pertencem à família de retrovírus, mas podem infectar ambas as células dividindo-se e não dividindo-se (Lewis et al. (1992) EMBO J. 3053-3058).

[00269] Em uma modalidade, o vetor é um vetor lentiviral.

PROMOTOR

[00270] Em uma modalidade o vetor compreende um promotor tecido- específico. Preferivelmente, o promotor tecido-específico conduz expressão específica para um subconjunto de células mieloides infiltrantes tumorais, como monócitos expressores de Tie2 (TEM, Tie2 Expressing Monocytes) ou macrófagos M2-polarizados.

[00271] Em uma modalidade preferida, o promotor tecido-específico é o promotor TEK (Tie2).

[00272] Uma sequência de nucleotídeos de promotor TEK exemplificadora é: gatcacgagactagcctegagteacacetgcaaactggaaacattaattgettcttaagat catcatcgacgtgataaaacctgggacagaaattagteaagactagctgcatetgecttttectetggtggtas gaaaaggaggagtataatgatttecteaggcatgaaggtegatgatgageaaagtgtatactetetaatetaatet cataattcatattgtggagtaattatcetggataagtgtagggtetetgaceteattetagatattgtacattecatgge tatttteattttggtccatgaactetetttgceteteatgageaccatttttateceaatetaatectegtatetttetettttta cacagattagtttttaaatgttatatataatttgcttctgaaacaccattgcteaatgactaccaaatettteteattace aaaatccttetatgccaacttettcaagaaatttgatcacctttagatgaattgttaatgaaaattaaagctatagecg gcaacatggegtatettteggctaategcecaaceaacageccatetegtetgaaagaaaacagectaacaattttg gactctggtetettggggctacattgagcattgaceteaceggtegcteactgaaattaattectttteagettetattt teteateacggaaaccttettetecceaaticaaaccatgtegettaaaatgagaaaacaaaagecaaaacggctt cccacacccaaaagetecttetgtcagagateccagtagececgggagagctettagaagtctgagaaggatt ggtcatcategceataccatacatagetegageggcttettattcteagttteccgectatgagaggatacccctattg tttetgaaaatgctgaccgggaccecacacttecaacaaaaattectetgcecetacageageageaaaageage agcagaagcaacagcaacagataagtgttttgatgaattgcgagatggatagggctigagtgcccecagecet goetgataccaaatgcctttaagatacagecttteccatectaatetacaaaggaaacaggaaaaaggaacttaaa actccctgtgcteagacagaaatgagactgttacagecctgettetgtgetegttecttettgectetaacttgtaaaca agacgtagtaggacgatgctaatggaaagtcacaaaccgctggetttttgaaaggatectagactegagegge cgeca (SEQ ID NO: 10)

[00273] Em uma modalidade, o promotor TEK compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, o promotor TEK compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 10.

[00274] O promotor TEK (Tie2) pode ser combinado com a sequência alvo mir-126 e/ou a sequência alvo mir-130a. Isto permite expressão transgênica específica em um subconjunto de células mieloides infiltrantes tumorais, e.g. macrófagos infiltrantes tumorais.

[00275] Em uma modalidade, o vetor pode compreender, ainda, uma sequência de intensificador TEK (Tie2).

[00276] Uma sequência de intensificador TEK (Tie2) exemplificadora é: cttcagacctggaggaggagatatgagggaccaattgtggccagacgattecttaacte gtgttacacctgcagaatgagttttagatetagetgtgacetettececeagececacececattgtececttegtgt goecttcaggaatetgatceattettetetectgetectteceaaagectecaggagcagetetgaagacegtegategt gcecagatgcagagtectgacactttteaacacatetgcatattagaggaagtacatacccattgcttggtggttte atgtctaatgtggtatgagtgtgacaaagagageggagaaaatttggactagccaaagaagecagteagegcgte gggtttgaagggcategtegegcggetegteatttgctetetgettgteacagececttgeecagggettgaceagt gaggtgtatgtgctggteacacecateteageagatetgteagetttecegcettttgttaaagggtgatateatgett cctggggggagceactggaagacaatgcteggecactttectecagatacaataggcggagtoaggaaggea gtattgacattgctggggctggggaggeacteactgetetgeggeegtcagatggtgaaccagettaaccettgg cacacagggcctgggttgtgcaaggcgtetggetgcagagecaaaggggactecacectggggacaggagt goetttagacatctgggaatetgggatggegcticaaattctgatccctgtgtcagaaacaaccacaaaacaataas agtaccagtaataacaaaaatgactaccctaggttgaatgcctttatgtgccaagtgtcaattg (SEQ ID NO: 11)

[00277] Em uma modalidade, a sequência de intensificador TEK compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, o intensificador TEK compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 11.

OTIMIZAÇÃO DE CÓDONS

[00278] O polinucleotídeos usados na presente invenção podem ser com códons otimizados. A otimização de códons tem sido previamente descrita em WO 1999/41397 e WO 2001/79518. Diferentes células diferem em sua utilização de códons específicos. Esta utilização preferencial de códons corresponde a uma utilização preferencial de códons na abundância relativa de tRNAs específicos no tipo de célula. Pela alteração dos códons na sequência de modo que sejam adaptados para serem compatíveis com a abundância relativa de tRNAs correspondentes, é possível aumentar a expressão. Pela mesma razão, é possível decrescer a expressão pela escolha deliberada de códons para os tRNAs correspondentes que são conhecidamente raros no tipo de célula específico. Assim, um grau adicional de controle traducional está disponível.

[00279] Muitos vírus, incluindo HIV e outros lentivírus, usam um grande número de códons raros e pela alteração destes para corresponderem aos códons de mamíferos comumente usados, pode ser realizada expressão aumentada dos componentes empacotadores em células produtoras de mamíferos. Tabelas de uso de códons são conhecidas na técnica para células de mamíferos, e também para uma variedade de outros organismos.

[00280] A otimização de códons pode também envolver a remoção de sítios de encadeamento (splice) crípticos e motivos de instabilidade de mRNA. ANTÍGENO ASSOCIADO A TUMOR (TAA)

[00281] Como aqui usado termo antígeno associado a tumor (TAA; também conhecido como antígeno tumoral) se refere a uma molécula antigênica expressada por uma célula cancerosa, e.g. uma célula tumoral. Um TAA pode ser reconhecido por uma célula imune que expressa um receptor imune (e.g. um TCR, um TCR transgênico ou um CAR) que é capaz de especificamente se ligar a uma porção (e.g. um epítopo) da molécula de TAA.

[00282] Como aqui usado, o termo célula-T específica para TAA se refere a uma célula-T que expressa um TCR ou um CAR que é específico paraum TAA.

[00283] Uma célula-T que expressa um TCR específico para TAA ou um CAR específico para TAA pode ser capaz de especificamente reconhecer e matar células tumorais que expressam o TAA. O TCR específico para TAA- pode ser um TCR transgênico

[00284] Em uma modalidade, a célula-T específica para TAA pode não estar geneticamente modificada. As células-T podem ser células-T específicas para tumor naturalmente induzidas. Por exemplo, as células-T usada na presente invenção podem ser expandidas a partir do tumor ou linfonodo.

[00285] Um TAA específico pode ser expressado em uma abundância relativamente alta em um tipo específico de célula tumoral em comparação com uma célula não tumoral (e.g. uma célula saudável).

[00286] Exemplos de TAAs incluem antígeno carcinoembriônico (CEA), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrina-B2, RORI, mesotelina, c-Met, GD-2, e MAGE A3 TCR, 4-1BB, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, célula de linfoma-B, antígeno C242, anidrase carbônica 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CDI19, CD22, CD123, CD221, CD23 (receptor de IZE), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-A, DR5, EpPCAM, CD3, extra-domínio-B de fibronectina, receptor de folato 1, glicoproteína 75, GPNMB, HGF, quinase receptora de fator de crescimento (scatter factor) humano, receptor de IGF-1, IGF-I, IWGG1, LI-CAM, IL-13, IL- 6, receptor de fator de crescimento do tipo insulina [, integrina a5B1, integrina avB3, MORADb-009, MS4A1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-IC, PDGF-Ra, PDLI92, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMFY7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-B, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, Anti-idiótipo, TAG-72, Ep-CAM, MUCI, Proteína ligante de folato, A33, G250, Antígeno de membrana

84 /156 específico prostático (PSMA), Antígeno específico prostático (PSA), Ferritina, Gangliosídeos (e.g. GD2, GD3, GM2), Lei, CA-125, CA19-9, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), p185HER2, receptor de IL-2, de2-7 EGFR, Proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Tenascina, metaloproteinases, Endossialina, Anidrase carbônica, Galectina 9, Aldolase A, elFy4, Tirosinase, Galectina 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, Restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenina/m, Ber-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) e DAM-IO (MAGE-BI), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0O205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-I/Melan-A, MCIR, Miosina/m, MUCI, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA8S8-A, NY-ESO-1, P15, bcr-abl minor p190, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RUI, RU2, SAGE, SART- 1, SART-3, TEL/AML1I, TPI/m, TRP-1, proteína 1, gp75, TRP-2, TRP- 2/INT2 ou WTI.

[00287] TAAs adicionais podem ser identificados usando métodos conhecidos na técnica - consulte, e.g. o artigo de revisão de Zilberberg et al. 2015 (Biology of Blood and Marrow Transplantation, Volume 21, Issue 6, June 2015, Páginas 1000-1007) cujo conteúdo é aqui incorporado como referência. CÉLULA-T

[00288] Como aqui usado o termo “célula-T” pode referir-se às células-T CD8+, células-T CD4+, células-T naíve, células-T-tronco de memória, células-T de memória central, células-T duplo-negativas, células-T de memória efetoras, células-T efetoras, células Th0O, células Tc0O, células Thl1, células Tc1l, células Th2, células Tc2, células Th17, células Th22, células-T gama/delta.

[00289] A célula-T usada na presente invenção pode ser usada para transferência adotiva de células-T. A presente invenção também inclui a transferência adotiva de linfócitos infiltrantes tumorais (TIL, Tumor- Infiltrating Lymphocytes) e/ou linfócitos infiltrantes de medula (MIL, Marrow Infiltrating Lymphocytes).

[00290] Como aqui usado o termo “transferência adoptiva de células- T” se refere à administração de uma população de células-T a um paciente. Uma célula-T pode ser isolada de um sujeito e então ser geneticamente modificada e cultivada in vitro (ex vivo) com o propósito de expressar um TCR ou CAR específico para TAA antes de ser administrada ao paciente.

[00291] A transferência adotiva de células pode ser alogênica ou autóloga.

[00292] Entende-se por “transferência autóloga de células” que a população de partida de células é obtida do mesmo sujeito que aquele ao qual a populações de células-T transduzidas é administrada. A transferência autóloga é vantajosa porque evita problemas associados com incompatibilidade imunológica e está disponível para sujeitos independente da disponibilidade do doador geneticamente compatível.

[00293] Entende-se por “transferência alogênica de células” que a população de partida de células é obtida de um sujeito diferente daquele ao qual a população de células transduzidas é administrada. Preferivelmente, o doador será geneticamente compatível com o sujeito ao qual as células são administradas para minimizar o risco de incompatibilidade imunológica. Alternativamente, o doador pode ser geneticamente incompatível ou não relacionado ao paciente.

[00294] Doses adequadas de populações de células transduzidas são tais que são terapêutica e/ou profilaticamente eficazes. A dose a ser administrada pode depender do sujeito e da condição a ser tratada, e pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada.

[00295] A célula-T pode ser derivada de uma célula-T isolada de um

86 /156 paciente. A célula-T pode ser parte da população mista de células isolada do sujeito, como uma população de linfócitos do sangue periférico (PBL, Peripheral Blood Lymphocytes). As células-T dentro da população de PBL podem ser ativadas por métodos conhecidos na técnica, como usando anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 ou esferas de tamanho celular conjugadas com anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28.

[00296] A célula-T pode ser uma célula-T auxiliar CD4* ou uma célula-T citotóxica CD8*. A célula-T pode ser uma população mista de células-T auxiliares CD4*/células-T citotóxicas CD8*. Ativação policlonal, por exemplo usando anticorpos anti-CD3 opcionalmente em combinação com anticorpos anti-CD28 engatilhará a proliferação de células-T CD4* e CD8*.

[00297] A célula-T pode ser isolada do sujeito para o qual a célula geneticamente modificada é para ser adotivamente transferida. Nesse aspecto, a célula pode ser preparada pelo isolamento de uma célula-T de um sujeito, opcionalmente ativação da célula-T, transferência do gene TCR para a célula ex vivo. Imunoterapia subsequente do sujeito pode ser então realizada por transferência adotiva das células transduzidas com TCR. Como aqui usado este processo se refere à transferência autóloga de células-T - i.e. as células transduzidas com TCR são administradas ao mesmo sujeito do qual as células-T foram originalmente derivadas.

[00298] Alternativamente a célula-T pode ser isolada de um sujeito diferente, como aquele que é alogênico. A célula-T pode ser isolada de um sujeito doador. Por exemplo, se o sujeito está submetendo-se à transplantação alogênica de células-tronco hematopoiéticas (AIlo-HSCT, Allogeneic Haematopoietic Stem Cell Transplantation) ou transplantação de órgão sólido ou transplantação de células ou terapia com células-tronco, a célula pode ser derivada do doador, do qual os órgãos, tecidos ou células são derivados(as). O doador e o sujeito submetendo-se ao tratamento podem ser irmãos/irmãs.

[00299] Alternativamente a célula-T pode ser derivada de uma célula-

87 /156 tronco, como uma célula-tronco hematopoiética (HSC). A transferência de gene para dentro de HSCs não resulta na expressão de TCR na superfície celular porque as células-tronco não expressam moléculas de CD3. Entretanto, quando células-tronco se diferenciam em células precursoras linfoides que se migram para o timo, a iniciação da expressão de CD3 resulta na expressão na superfície celular, em timócitos, do TCR introduzido.

[00300] Uma vantagem desta abordagem é que as células-T maduras, quando produzidas, expressam apenas o TCR introduzido e poucas ou nenhumas cadeias de TCR endógenas, porque a expressão das cadeias de TCR introduzidas suprime o rearranjo de segmentos gênicos de TCR endógenos para formar genes funcionais codificantes das cadeias alfa e beta de TCR. Um benefício adicional é que as células-tronco geneticamente modificadas são uma fonte contínua de células-T maduras com a especificidade antigênica desejada. Consequentemente, a HSC, a HPC, ou o vetor, como aqui definido(a), pode ser usado(a) em combinação com uma célula-tronco geneticamente modificada, preferivelmente uma célula-tronco hematopoiética geneticamente modificada, que sob diferenciação, produz uma célula-T expressora de um TCR específico para TAA.

[00301] Outras abordagens conhecidas na técnica podem ser usadas para reduzir, limitar, prevenir, silenciar, ou ab-rogar a expressão de genes endógenos nas células da presente invenção ou nas células preparadas pelos métodos da presente invenção.

[00302] Como aqui usado o termo “disrupção (perturbar, perturbado)” se refere à redução, à limitação, à prevenção, ao silenciamento, ou à ab- rogação da expressão de um gene. A pessoa versada na técnica é capaz de usar qualquer método conhecido na técnica para perturbar um gene endógeno, e.g., qualquer método adequado para edição de genoma, silenciamento gênico, atenuação de atividade gênica (knock-down) ou inativação gênica (knock-out).

[00303] Por exemplo, um gene endógeno pode ser perturbado com uma nuclease artificial. Uma nuclease artificial é, e.g., uma enzima de restrição artificial modificada para seletivamente reconhecer uma sequência de polinucleotídeo específica (e.g. codificante de um gene de interesse) e induzir uma quebra de fita dupla na dita sequência de polinucleotídeo. Tipicamente, uma quebra de fita dupla (DSB, Double Strand Break) será reparada por junção de extremidades não homólogas (NHEJ, Non-Homologous End Joining) propensa a erro resultando, com isso, na formação de uma sequência de polinucleotídeo não funcional, que pode ser incapaz de expressar um gene endógeno.

[00304] Em algumas modalidades, a nuclease artificial é selecionada a partir do grupo consistindo em nucleases dedo de zinco (ZEN, Zinc Finger Nucleases), nucleases efetoras do tipo ativadoras de transcrição (TALEN, Transcription Activator-Like Effector Nucleases) e CRISPR/Cas (e.g. CRISPR/Cas9). RECEPTOR DE CÉLULA-T (TCR)

[00305] Durante o processamento de antígeno, os antígenos são degradados dentro das células e então transportados para a superfície celular por moléculas de complexo principal de histocompatibilidade (MHC). As células-T são capazes de reconhecer este complexo de peptídeo:MHC na superfície da célula apresentadora de antígenos. Há duas classes diferentes de moléculas de MHC: MHC I e MHC II, cada classe distribui peptídeos a partir de comportamentos celulares diferentes para a superfície celular.

[00306] Um receptor de célula-T (TCR) é uma molécula encontrada sobra a superfície de células-T que é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas de MHC. O heterodímero de TCR consiste em uma cadeia alfa (a) e uma cadeia beta (B) em cerca de 95% das células-T, enquanto que cerca de 5% das célula-T têm TCRs consistindo em cadeias gama (y) e delta (Ô).

89 /156

[00307] O engajamento do TCR com antígeno e MHC resulta em ativação do linfócito-T sobre o qual o TCR é expressado mediante uma série de eventos bioquímicos mediados por enzimas associadas, correpressores, e moléculas acessórias especializadas.

[00308] Cada cadeia do TCR é um membro da superfamília de imunoglobulinas e possui um domínio variável (V) de imunoglobulina (Ig) N- terminal, “um domínio constante (C) de 1[1g uma região transmembrana/transmembranar celular, e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C-terminal.

[00309] O domínio variável de ambas a cadeia a e a cadeia B de TCR tem três regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs, Complementarity Determining Regions). À CDR3 é a CDR principal responsável pelo reconhecimento de antígeno processado, embora também tenha sido mostrado que a CDR1 da cadeia alfa interage com a parte N-terminal do peptídeo antigênico, enquanto que a CDRI1 da cadeia beta interage com a parte C-terminal do peptídeo. É considerado que a CDR2 reconhece a molécula de MHC.

[00310] O domínio constante do domínio de TCR consiste em sequências conectoras curtas nas quais um resíduo de cisteína forma uma ligação dissulfeto, produzindo uma ligação entre as duas cadeias.

[00311] O TCR usado na presente invenção pode ter um ou mais resíduos de cisteína adicionais em cada uma das cadeias a e B de modo que o TCR possa compreender duas ou mais ligações dissulfeto nos domínios constantes.

[00312] A estrutura mostra que o TCR associa-se com outras moléculas como CD3 que possuem três cadeias diferentes (y, 3, e €) em mamíferos e a cadeia. Estas moléculas acessórias têm regiões transmembranares negativamente carregadas e são vitais para a propagação do sinal do TCR para dentro da célula. As cadeias -CD3 e -6, juntas com o

TCR, formam o que é conhecido como o complexo de receptor de célula-T.

[00313] O sinal do complexo de receptor de célula-T é intensificado pela ligação simultânea das moléculas de MHC por um correceptor específico. Para células-T auxiliares, este correceptor é CDA4 (específico para MCH de classe II); enquanto que para células-T citotóxicas, este correceptor é CD8 (específico para MHC de classe 1). O correceptor permite o engajamento prolongado entre a célula apresentadora de antígenos e a célula-T e recruta moléculas essenciais (e.g., LCK) dentro da célula envolvida na sinalização do linfócito-T ativado.

[00314] Consequentemente, como aqui usado o termo “receptor de célula-T” (TCR) se refere a uma molécula capaz de reconhecer um peptídeo quando apresentado por uma molécula de MHC. A molécula pode ser um heterodímero de duas cadeias a e B (ou opcionalmente y e à) ou pode ser um constructo de TCR de cadeia única.

[00315] O TCR usado na presente invenção pode ser um TCR híbrido compreendendo sequências derivadas de mais que uma espécie. Por exemplo, tem sido surpreendentemente descoberto que os TCRs murinos são mais eficazmente expressados em células-T humanas do que os TCRs humanos. O TCR pode, por conseguinte, compreender regiões variáveis humanas e regiões constantes murinas.

[00316] Uma desvantagem desta abordagem é que as sequências constantes murinas podem engatilhar uma resposta imune, resultando em rejeição das células-T transferidas. Entretanto, os regimes de condicionamento usados para preparar os pacientes para a terapia adotiva de células-T pode resultar em imunossupressão suficiente para permitir a transplantação de células-T expressoras de sequências murinas.

[00317] A porção do TCR que estabelece a maioria dos contatos com o peptídeo antigênico ligado ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) é àa região determinante de complementaridade 3 (CDR3,

Complementarity Determining Region 3), que é exclusiva para cada clone de célula-T. A região CDR3 é gerada sob eventos de rearranjo somático ocorrendo no timo e envolvendo genes não contíguos pertencendo aos genes variáveis (V), de diversidade (D, para as cadeias à e ô) e de junção (J). Além disso, nucleotídeos randômicos inseridos/deletados nos lócus de rearranjo de cada gene de cadeia de TCR aumentam enormemente a diversidade da sequência de CD3 elevadamente variável. Dessa forma, a frequência da sequência de CDR3 específica em uma amostra biológica indica a abundância de uma população específica de células-T. A grande diversidade do repertório de TCR em seres humanos saudáveis provê uma proteção de amplo espectro contra uma variedade de antígenos estranhos apresentados pelas moléculas de MHC sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos. Nesse aspecto, é de notar que teoricamente até 10"? TCRs diferentes podem ser gerados no timo.

[00318] A diversidade de receptores de célula-T é enfocada em CDR3 e esta região é principalmente responsável pelo reconhecimento de antígeno.

[00319] As CDRs podem, por exemplo, compreender uma, duas, ou três substituições, adições ou deleções de uma dada sequência, desde que o TCR mantenha a capacidade para se ligar ao peptídeo derivado de TAA quando apresentado pela molécula de MHC.

[00320] TCRs específicos para TAA podem ser gerados facilmente pela pessoa versada na técnica usando qualquer método conhecido na técnica.

[00321] Por exemplo, os TCRs específicos para TAA podem ser identificados pelo método de captura de gene de TCR de Linnemann et al. (Nature Medicine 19, 1534-1541 (2013)). Resumidamente, este método usa estratégia baseada em DNA de alto desempenho para identificar sequências de TCR pela captura e pelo sequenciamento de fragmentos de DNA genômico codificantes dos genes de TCR e pode ser usado para identificar TCRs específicos para TAA.

EXPRESSÃO APRIMORADA DE TCR E MALPAREAMENTO DE TCR REDUZIDO

[00322] O aumento do fornecimento de moléculas de CD3 pode aumentar a expressão de TCR, por exemplo, em uma célula que tem sido modificada para expressar os TCRs da presente invenção. Consequentemente, a célula-T pode ser modificada (e.g. usando um vetor) para compreender um ou mais genes codificantes de CD3-gama, CD3-delta, CD3-epsílon e/ou CD3- zeta. Em uma modalidade, a célula-T compreende um gene codificante de CD3-zeta. A célula-T pode compreender um gene codificante de CD8. O vetor codificante de tais genes pode codificar um marcador selecionável ou um gene suicida, para aumentar o perfil de segurança da célula geneticamente modificada. Os genes podem ser ligados por sequências autocliváveis, como a sequência autoclivável 2A.

[00323] Alternativamente um ou mais vetores separados codificantes de um gene de CD3 podem ser providos para cotransferência para uma célula- T simultânea, sequêncial ou separada com um ou mais vetores codificantes de TCRs.

[00324] O TCR transgênico pode ser expressado em uma célula-T usada na presente invenção para alterar a especificidade antigênica da célula- T. As células-T transduzidas com TCR expressam pelo menos duas cadeias alfa de TCR e duas cadeias beta de TCR. Embora as cadeias alfa/beta de TOR endógenas formem um receptor que é autotolerante, as cadeias alfa/beta de TCR introduzidas formam um receptor com especificidade definida para o dado antígeno alvo.

[00325] Entretanto, terapia gênica com TCR exige expressão suficiente de TCRs transfectados (i.e. transgênicos) porque o TCR transfectado poderia ser diluído pela presença do TCR endógeno, resultando em expressão subótima do TCR tumor-específico. Além disso, malpareamento entre cadeias endógena e introduzida pode ocorrer para formar novos receptores, que poderiam apresentar especificidades imprevistas para autoantígenos e causar dano autoimune quando transferidos para dentro de pacientes.

[00326] Consequentemente, várias estratégias têm sido exploradas para reduzir o risco de malpareamento entre cadeias de TCR endógena e introduzida. Mutações da interface alfa/beta de TCR é uma estratégia atualmente utilizada para reduzir malpareamento indesejado. Por exemplo, a introdução de uma cisteína nos domínios constantes das cadeias alfa e beta permite a formação de uma ligação dissulfeto e intensifica o pareamento das cadeias introduzidas enquanto que reduz o malpareamento com cadeias de tipo selvagem.

[00327] Consequentemente, os TCRs usados na presente invenção podem compreender uma ou mais mutações na interface de cadeia o/cadeia RB, de modo que quando a cadeia a e a cadeia À são expressadas em uma célula- T, a frequência de malpareamento entre as ditas cadeias e as cadeias a e B endógenas de TCR é reduzida. Em uma modalidade, as uma ou mais mutações introduzem um resíduo de cisteína no domínio da região constante de cada uma de a cadeia a e a cadeia B, em que os resíduos de cisteína são capazes de formar uma ligação dissulfeto entre a cadeia a e a cadeia 3.

[00328] Outra estratégia para reduzir o malpareamento baseia-se na introdução de sequências de polinucleotídeos codificantes de siRNA, adicionadas aos genes codificantes das cadeias a e B de TCR tumor- específico, e planejadas para limitar a expressão dos genes de TCR endógenos (Okamoto S. Cancer Research 69, 9003-9011, 2009).

[00329] Consequentemente, o vetor ou polinucleotídeo codificante dos TCRs usados na presente invenção pode compreender um ou mais siRNA ou outros agentes almejados para limitar ou ab-rogar a expressão dos genes de TCR endógenos.

[00330] Também é possível combinar nucleases artificiais, como nucleases dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras do tipo ativadoras de

94 /156 transcrição (TALEN) ou sistemas CRISPR/Cas, planejados(as) para reconhecer as regiões constantes dos genes de TCR endógenos (TRAC e, ou TRBCO), para obter a disrupção permanente dos genes de cadeias alfa e/ou beta de TCR endógenos, permitindo, assim, a expressão completa do TCR tumor-específico e reduzindo ou ab-rogando, assim, o risco de malpareamento de TCR. Este processo, conhecido como a editoração de genes de TCR comprovou-se superior à transferência de genes de TCR in vitro e in vivo (Provasi E., Genovese P., Nature Medicine May; 18(5):807-15; 2012).

[00331] Além disso, a tecnologia de edição genômica permite a integração direcionada de um cassete de expressão, compreendendo um polinucleotídeo codificante de TCR usado na presente invenção, e opcionalmente de uma ou mais regiões de promotor e/ou outras sequências de controle de expressão, em um gene endógeno perturbado pela nucleases artificiais (Lombardo A., Nature Biotechnology 25, 1298-1306; 2007).

[00332] Outra estratégia desenvolvida para aumentar a expressão de TCRs transgênicos e para reduzir o malpareamento de TCR consiste em “murinização”, que substitui as regiões constantes da cadeia a de TCR e da cadeia BB de TCR (e.g. as regiõês TRAC, TRBC1 e TRBC2) por suas contrapartes murinas. A murinização de regiões constantes de TCR é descrita, por exemplo, em Sommermeyer e Uckert J. Immunol., 2010 (184:6223-6231). Consequentemente, o TCR usado na presente invenção pode ser murinizado. RECEPTOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENO (CAR)

[00333] Os CARs compreendem um domínio extracelular de ligação ao ligante, mais comumente um fragmento variável de cadeia única (scFv, single chain variable fragment) de um anticorpo monoclonal ligado aos componentes intracelulares de sinalização, mais comumente CD36 sozinho ou combinado com um ou mais domínios coestimulatórios. Um espaçador é, com frequência, adicionado entre o domínio extracelular de ligação ao antígeno e a porção transmembranar para otimizar a interação com o alvo.

[00334] Um CAR para uso na presente invenção pode compreender: (1) um domínio reconhecedor específico para antígeno; (11) um domínio transmembranar; (111) opcionalmente pelo menos um domínio coestimulatório; e (iv) um domínio intracelular de sinalização.

[00335] Preferivelmente o domínio reconhecedor específico para antígeno compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo, mais preferivelmente um fragmento variável de cadeia única.

[00336] Preferivelmente o domínio reconhecedor específico para antígeno reconhece um TAA.

[00337] Em uma modalidade, o domínio reconhecedor específico para antígeno reconhece CD19.

[00338] Exemplos de domínios transmembranares incluem um domínio transmembranar de uma cadeia zeta de um complexo de receptor de célula-T, CD28 e CD8a.

[00339] Exemplos de domínios coestimulatórios incluem um domínio coestimulatório de CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD?2, CD5, ICAM-1, LFA-I, Lek, TNFR-I, TNFR-I, Fas, CD30 e CD40.

[00340] Em uma modalidade, o domínio coestimulatório é um domínio coestimulatório de CD28.

[00341] Exemplos de domínios intracelulares de sinalização incluem cadeia zeta de CD3 humana, FcyRIII, FesRI, uma cauda citoplasmática de um receptor Fc e receptores citoplasmáticos possuindo motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM, Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif). Receptores quiméricos de antígenos

[00342] “Receptor quimérico de antígeno” ou “CAR” ou “CARSs”, como aqui usado, se refere aos receptores modificados que podem conceder uma especificidade antigênica sobre células (por exemplo células-T como

96 / 156 células-T naive, célula-T de memória central, células-T de memória efetoras ou combinações das mesmas). Os CARs são também conhecidos como receptores artificiais de células-T, receptores quiméricos de células-T ou imunorreceptores quiméricos de células-T. Preferivelmente os CARs da invenção compreendem uma região reconhecedora específica para antígeno, um domínio extracelular, um domínio transmembranar, opcionalmente um ou mais domínios coestimulatórios, e um domínio intracelular de sinalização. Domínio reconhecedor específico para antígeno

[00343] O domínio reconhecedor específico para antígeno provê o CAR com a capacidade para se ligar ao antígeno alvo de interesse. O domínio reconhecedor específico para antígeno preferivelmente reconhece um antígeno de interesse clínico contra o qual seria desejável engatilhar uma resposta imune efetora que resulta em matança do tumor.

[00344] O domínio reconhecedor específico para antígeno pode ser qualquer proteína ou peptídeo que possui a capacidade para especificamente reconhecer e se ligar a uma molécula biológica (e.g., um receptor de superfície celular ou uma proteína de tumor, ou um componente do(a) mesmo(a)). O domínio reconhecedor específico para antígeno inclui qualquer parceiro de ligação de ocorrência natural, sintético, semissintético, ou recombinantemente produzido para uma molécula biológica de interesse.

[00345] Domínios reconhecedores específicos para antígeno incluem anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou derivados de anticorpos, domínios extracelulares de receptores, ligantes para receptores/moléculas de superfície celular, ou domínios dos mesmos de ligação ao receptor, e proteínas ligantes de tumor.

[00346] Em uma modalidade preferida, o domínio reconhecedor específico para antígeno é, ou é derivado de, um anticorpo. O domínio reconhecedor derivado de anticorpo pode ser um fragmento de um anticorpo ou um produto geneticamente modificado de um ou mais fragmentos do

97 /156 anticorpo. Exemplos incluem uma região variável (Fv), uma região determinante de complementaridade (CDR, Complementarity Determining Region), um Fab, um anticorpo de cadeia única (scFv), uma região da cadeia pesada (VH), uma região da cadeia leve (VL) e um anticorpo de camelídeo (VHH).

[00347] Em uma modalidade preferida, o domínio ligante é um anticorpo de cadeia única (scFv). O scFv pode ser scFv murino, humano ou humanizado.

[00348] “Região determinante de complementaridade” ou “CDR” com relação a um anticorpo ou a um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se refere a uma alça elevadamente variável na região variável da cadeia pesada ou da cadeia leve de um anticorpo. As CDRs podem interagir com a conformação do antígeno e predominantemente determinar a ligação ao antígeno (embora seja conhecido que algumas regiões framework (arcabouço) estão envolvidas na ligação). A região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve contêm 3 CDRs.

[00349] “Região variável da cadeia pesada” ou “VH” se refere ao fragmento da cadeia pesada de um anticorpo que contém três CDRs interpostas entre segmentos flanqueadores conhecidos como regiões Jramework, que são mais elevadamente conservados que as CDRs e formam um arcabouço para suportar as CDRs.

[00350] “Região variável da cadeia leve” ou “VL” se refere ao fragmento da cadeia leve de um anticorpo que contém três CDRs interpostas entre regiões framework.

[00351] “Fv” se refere ao menor fragment de um anticorpo que possui o sítio completo de ligação ao antígeno. Um fragmento Fv consiste na região variável de uma cadeia leve única ligada à região variável de uma cadeia pesada única.

[00352] “Anticorpo Fv de cadeia única” ou “scFv” se refere a um

98 /156 anticorpo modificado consistindo em uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada conectadas uma na outra diretamente ou via uma sequência conectora peptídica.

[00353] Anticorpos que especificamente se ligam a uma molécula de superfície de célula tumoral podem ser preparados usando métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem apresentação em fago, métodos para gerar anticorpos humanos ou humanizados, ou métodos usando um animal transgênico ou uma planta transgênica modificado(a) para produzir anticorpos humanos. Bibliotecas de apresentação em fago de anticorpos parcialmente ou completamente sintéticos estão disponíveis e podem ser triadas para um anticorpo ou um fragmento do mesmo que pode se ligar à molécula alvo. Bibliotecas de apresentação em fago de anticorpos humanos também estão disponíveis. Quando identificada, a sequência de aminoácidos ou a sequência de polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser isolada e/ou determinada.

[00354] Com respeito aos domínios reconhecedores que reconhecem antígenos de câncer, a seleção do domínio reconhecedor dependerá do tipo de câncer a ser tratado, e pode reconhecer antígenos tumorais alvo. Uma amostra de tumor de um sujeito pode ser caracterizada para a presença de determinados biomarcadores ou de determinados marcadores sobre a superfície celular. Por exemplo, células de câncer de mama de um sujeito podem ser positivas ou negativas para cada um de Her2Neu, o Receptor de estrogênio, e/ou o Receptor de progesterona. É selecionado(a) um antígeno tumoral ou uma molécula de superfície de célula que é encontrado(a) sobre as células de tumor do sujeito individual. Preferivelmente o domínio reconhecedor específico para antígeno reconhece uma molécula de superfície celular que é encontrada sobre células tumorais e não é substancialmente encontrada sobre tecidos normais, ou a expressão dela é restrita aos tecidos normais não vitais.

[00355] TAA que pode ser reconhecido pelo CAR usado na presente invenção inclui mas não é limitado a qualquer um(a) ou mais de um antígeno carcinoembriônico (CEA), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrina-B2, ROR1, mesotelina, c-Met, GD-2, e MAGE A3 TCR, 4-1BB, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, célula de linfoma-B, antígeno C242, anidrase carbônica 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (receptor de IZE), CD28, CD4, CDA40, CD4, CD4 v6, CDS51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNTO888, CTLAH, DR5, EpCAM, CD3, extra-domínio-B de fibronectina, receptor de folato 1, glicoproteína 75, GPNMB, HGF, quinase receptora de fator de crescimento (scatter factor) humano, receptor de IGF-1, IGF-I, IgG1, L1- CAM, IL-13, IL-6, receptor de fator de crescimento do tipo insulina |, integrina a5B1, integrina avB3, MORADb-009, MS4A1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, SCH 900105, SDCI, SLAMF7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-B, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAAI6.88, Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CDI9, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-I (CDw52), HLA-DR, Anti- idiótipo, TAG-72, Epo-CAM, MUCI, Proteína ligante de folato, A33, G250, Antígeno de membrana específico prostático (PSMA), Antígeno específico prostático (PSA), Ferritina, Gangliosídeos (e.g.

GD2, GD3, GM2), Le, CA- 125, CAI9-9, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), p185HER2, receptor de IL-2, de2-7 EGFR, Proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Tenascina, metaloproteinases, Endossialina, Anidrase carbônica, Galectina 9, Aldolase A, eIFy4, Tirosinase, Galectina 4, HERKV- K10, p53, NY-LU-12, Restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY- ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART, BAGE, b-catenina/m, Ber-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6

(MAGE-B2) e DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701I, HPV-E7, HSP70- 2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0O205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MCIR, Miosina/m, MUCI1, MUM-1, MUM-2, MUM, NAB88-A, NY-ESO-1, P15, ber-abl minor p190, PMI/RARa, PRAME, RAGE, RUI, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteína 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 ou WTI. Domínio coestimulatório

[00356] O CAR usado na presente invenção pode também compreender um ou mais domínios coestimulatórios. Este domínio pode intensificar a proliferação celular, a sobrevivência celular e o desenvolvimento de células de memória.

[00357] Cada domínio coestimulatório compreende o domínio coestimulatório de qualquer um(a) ou mais de, por exemplo, a superfamília de TNFR, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CDS5, ICAM-I, LFA-I, Lck, TNFR-1, TNFR-HII, Fas, CD30, CD40 ou combinações dos mesmos. Os domínios coestimulatórios de outras proteínas podem também ser usados com o CAR usado na presente invenção. Domínios coestimulatórios adicionais serão evidentes para aquelas pessoas versadas na técnica. Domínio intracelular de sinalização

[00358] O CAR usado na presente invenção pode também compreender um domínio intracelular de sinalização. Este domínio pode ser citoplasmático e pode transduzir o sinal de função efetora e direcionar a célula para realizar a função especializada dela. Exemplos de domínios intracelulares de sinalização incluem, mas não são limitados a, cadeia 6 do receptor de célula-T receptor ou qualquer um de seus homólogos (e.g., cadeia n, cadeias BB e FceRly, cadeia MB1 (Igom), cadeia B29 (Ig), etc), polipeptídeos CD3 (A, ô e e), tirosina-quinases da família syk (Syk, ZAP 70,

etc.), tirosina-quinases da família src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) e outras moléculas envolvidas em transdução de células-T, como CD2, CD5 e CD28. O domínio intracelular de sinalização pode ser uma cadeia zeta de CD3 humano, FcyRIII, FesRI, caudas citoplasmáticas de receptores Fc, receptores citoplasmáticos possuindo motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) ou combinações dos(as) mesmos(as). Domínio transmembranar

[00359] O CAR usado na presente invenção pode também compreender um domínio transmembranar. O domínio transmembranar pode compreender a sequência transmembranar de qualquer proteína que tem um domínio — transmembranar, incluindo qualquer uma das proteínas transmembranares do tipo 1, tipo II ou tipo III. O domínio transmembranar do CAR usado na presente invenção pode também compreender uma sequência hidrofóbica artificial. Os domínios transmembranares dos CARs usados na presente invenção podem ser selecionados de modo a não se dimerizarem. Domínios transmembranares adicionais serão evidentes para aquelas pessoas versadas na técnica. Exemplos de regiões transmembranares (TM) usadas em constructos de CAR são: 1) A região CD28 TM (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al., Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72.); 2) A região OX40 TM (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41); 3) A região 41BB TM (Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35); 4) A região CD3 zeta TM (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402.); 5) A região CD8a TM (Maher et al., Nat Biotechnol, 2002, Jan;20(1):70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr; 18(4):676- 84; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al., Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64.).

INIBIDOR DE PONTO DE CHECAGEM IMUNE

[00360] Como aqui usado o termo inibidor de ponto de checagem imune se refere a uma molécula, um composto, um anticorpo ou um fármaco que inibe, bloqueia, previne, reduz ou infrarregula a expressão de, ou é diferentemente antagonístico para, uma molécula inibitória de ponto de checagem. Quando expressado sobre a superfície celular, uma molécula inibitória de ponto de checagem inibe ou suprime a resposta imune mediada por célula-T à dita célula. Por exemplo, a expressão de moléculas inibitórias de ponto de checagem pode prevenir que uma célula seja morta por uma resposta de célula-T. Este mecanismo é particularmente prejudicial se uma célula cancerosa expressa moléculas inibitórias de ponto de checagem porque isto pode permitir que a célula cancerosa se evada da resposta de célula-T do hospedeiro. Consequentemente, quando moléculas inibitórias de ponto de checagem sobre células tumorais são inibidas por um inibidor de ponto de checagem imune, deve ocorre uma resposta intensificada de célula-T do hospedeiro contra a célula tumoral.

[00361] Em uma modalidade, o inibidor de ponto de checagem imune inibe uma molécula inibitória de ponto de checagem selecionada a partir do grupo consistindo em da2AR (receptor de Adenosina A2A, Adenosine A2A receptor), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCNI), BTLA (Atenuador de Linfócitos-B e -T; CD272), HVEM (Herpesvirus Entry Mediator, Mediador de Entrada de Herpesvírus), CTLA-4 (proteína associada ao linfócito-T citotóxico 4, Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4, CDI52), IDO (Indolamina-2,3-dioxigenase), TDO (triptofano-2,3-dioxigenase), KIR (Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor, receptor do tipo imunoglobulina de célula assassina), LAG3 (Lymphocyte Activation Gene-3, Gene-3 de Ativação de Linfócito), PD-1 (Programmed Death 1 receptor, receptor de Morte Programada 1), PD-L1 (PD-I ligand 1, ligante-1 de PD-1), PD-L2 (PD-I ligand 2, ligante 2 de PD-1), TIM-3 (T-cell Imnmunoglobulin domain and Mucina domain 3, domínio de mucina e domínio de imunoglobulina de célula-T - 3), VISTA (V-domain Ig Suppressor of T cell Activation, supressor da ativação de células-T com domínio-V de Ig), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86). Combinações de inibidores de ponto de checagem também podem ser usadas.

[00362] Em uma modalidade, o inibidor de ponto de checagem imune é um inibidor de PD-1; preferivelmente o inibidor de PD-1 é um anticorpo anti- PD-I.

[00363] Em outra modalidade, o inibidor de ponto de checagem imune é um inibidor de PD-L1; preferivelmente o inibidor de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1.

[00364] Em outra modalidade, o inibidor de ponto de checagem imune é um inibidor de PD-L2, preferivelmente o inibidor de PD-L2 é um anticorpo anti-PD-L2.

[00365] Em outra modalidade, o inibidor de ponto de checagem imune é um inibidor de CTLAA4, preferivelmente o inibidor de CTLA4 é um anticorpo anti-CTLAA4.

[00366] Em outra modalidade, o inibidor de ponto de checagem imune é um inibidor de LAG-3; preferivelmente o inibidor de LAG-3 é um anticorpo anti-LAG-3.

[00367] Como aqui usado, o termo “anticorpo” é entendido como um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou por genes de imunoglobulinas, ou fragmentos dos mesmos, que especificamente se ligam a e reconhecem um antígeno (e.g. um marcador de superfície celular). Como aqui usado, o termo “anticorpo” se refere a uma molécula de anticorpo completa ou intacta (e.g., IgM, IgG (incluindo IgG1, IgG2, IgG3, e IZG4), IgA, IgD, ou IgE) ou qualquer fragmento de ligação ao antígeno da mesma.

[00368] Um anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Os anticorpos monoclonais são produzidos por células imunes idênticas (e.g. hibridomas que podem ser geradas a partir da fusão de uma linhagem de célula-B produtora de anticorpo e uma linhagem de célula-B cancerosa).. Um anticorpo monoclonal direcionado para um antígeno específico reconhecerá um epítopo único no dito antígeno. Em contraste, os anticorpos policlonais são produzidos de múltiplas linhagens celulares não idênticas e, portanto, reconhecem vários epítopos diferentes em um antígeno específico.

[00369] Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo incluem, e.g., um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab', ou um fragmento F(ab'),. Um fragmento scFv é uma cadeia polipeptídica única que inclui ambas as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo do qual o scFv é derivado. Adicionalmente, intracorpos, minicorpos, triacorpos, e diacorpos (consulte, e.g., Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248(1):47-66; Hudson e Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231(1):177-189; Poljak 25 (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Rondon e Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 21:257-283), são também incluídos na definição de um anticorpo e são compatíveis para uso nos métodos descritos na presente invenção. O termo “anticorpo”, como aqui usado, também inclui fragmentos de anticorpo quer produzidos pela modificação de anticorpos inteiros quer aqueles sintetizados de novo usando métodos recombinantes.

[00370] Os métodos adequados para produção de um anticorpo ou de fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos direcionados para um antígeno específico são conhecidos na técnica (consulte, e.g., Greenfield (2014) “Antibodies: A Laboratory Manual”, Second Edition 201-221). VARIANTES, DERIVADOS, ANÁLOGOS, HOMÓLOGOS E

FRAGMENTOS

[00371] Além das proteínas específicas e dos polinucleotídeos específicos mencionados(as) na presente invenção, a presente invenção também inclui o uso de variantes, derivados, análogos, homólogos e fragmentos dos(s) mesmos(as).

[00372] No contexto da presente invenção, uma variante de qualquer dada sequência é uma sequência na qual a sequência específica de resíduos (quer de resíduos de aminoácidos quer de resíduos de ácidos nucleicos) tem sido modificada em uma tal maneira que o polipeptídeo ou o polinucleotídeo em questão substancialmente mantém pelo menos uma de suas funções endógenas. Uma sequência variante pode ser obtida por adição, deleção, substituição, modificação, reposição e/ou variação de pelo menos um resíduo presente na proteína de ocorrência natural.

[00373] O termo “derivado” como aqui usado, em relação às proteínas ou aos polipeptídeos da presente invenção inclui qualquer substituição de, variação de, modificação de, reposição de, deleção e/ou adição de um (ou mais) resíduos de aminoácidos da ou à sequência desde que a proteína ou o polipeptídeo resultante mantenha substancialmente pelo menos uma de suas funções endógenas.

[00374] O termo “análogo” como aqui descrito, em relação aos polipeptídeos ou polinucleotídeos inclui qualquer mimético, que é, um composto químico que possui pelo menos uma das funções endógenas dos polipeptídeos ou polinucleotídeos que ele imita.

[00375] As proteínas usadas na presente invenção podem também ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma proteína funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos deliberadas podem ser realizadas com base em similaridade de polaridade, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos desde que a função endógena seja mantida. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos-cabeça polares não carregados tendo valores de hidrofilicidade similares incluem asparagina, glutamina, serina, treonina e

106 /156 tirosina.

[00376] Uma substituição pode envolver a reposição de um aminoácido por um aminoácido similar (uma substituição conservativa). Um aminoácido similar é um que tem uma porção da cadeia lateral com propriedades relacionadas quando agrupados juntos, por exemplo, como mostrado abaixo: (1) cadeias laterais básicas: lisina (K), arginina (R), histidina (ED); (11) cadeias laterais ácidas: ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E); (Hi) cadeias laterais polares não carregadas: asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T) e tirosina (Y); ou (iv) cadeias laterais não polares: glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (1), prolina (P), fenilalanina (F), metionina (M), triptofano (W) e cisteína (C).

[00377] Sequências variantes podem compreender substituições, adições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.

[00378] Substituições, adições ou deleções conservativas podem ser realizadas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e preferivelmente na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos entre si: | A ROMÁTICOS mewY |

[00379] A presente invenção também inclui substituição homóloga (substituição e reposição são ambas aqui usadas para significarem o intercâmbio de um resíduo de aminoácido existente, com um resíduo alternativo), e.g. substituição de semelhante-por-semelhante como de básico-

107 /156 por-básico, de ácido-por-ácido, de polar-por-polar etc. Substituição não homóloga pode também ocorrer e.g. de uma classe de resíduo para outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácido não natural, como ornitina.

[00380] O termo “variante” como aqui usado, pode significar uma entidade tendo uma determinada homóloga com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem ou a sequência de nucleotídeos de tipo selvagem. O termo “homologia” pode ser equiparado à “identidade”.

[00381] Uma sequência variante pode incluir uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 50%, 55%, 65%, 75%, 85% ou 90% idêntica, preferivelmente pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência objeto de estudo. Tipicamente, as variantes compreenderão os mesmos sítios ativos etc. que os da sequência de aminoácidos objeto de estudo. Embora homologia possa também ser considerada em termos de similaridade (i.e. resíduos de aminoácidos tendo funções/propriedades químicas similares), no contexto da presente invenção é preferido expressar a homologia em termos de identidade de sequência.

[00382] Uma sequência variante pode incluir uma sequência de nucleotídeos que pode ser pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 75%, 85% ou 90% idêntica, preferivelmente pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência objeto de estudo. Embora homologia possa também ser considerada em termos de similaridade, no contexto da presente invenção é preferido expressar a homologia em termos de identidade de sequência.

[00383] Preferivelmente, referência a uma sequência que tem uma identidade percentual com relação a qualquer uma das SEQ ID NOs detalhadas na presente invenção se refere a uma sequência que tem a identidade de sequência declarada ao longo do comprimento inteiro da SEQ ID NO à qual se refere.

108 /156

[00384] Comparações de identidade podem ser conduzidas visualmente ou, mais comumente, com o auxílio de programas de comparação de sequências facilmente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a percentagem de homologia ou a percentagem de identidade entre duas ou mais sequências.

[00385] A percentagem de homologia pode ser calculada ao longo de sequências contíguas, i.e. uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é diretamente comparado com o aminoácido correspondente, um resíduo de cada vez. Este é chamado de um alinhamento “sem lacunas”. Tipicamente, tais alinhamentos sem lacunas são realizados apenas ao longo de um número relativamente curto de resíduos.

[00386] Embora este seja um método muito simples e consistente, ele falha em levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências sob outros aspectos idênticas, uma inserção ou deleção na sequência de nucleotídeos pode fazer com que os códons seguintes sejam posicionados fora de alinhamento, resultando, assim, potencialmente, em uma grande redução em homologia percentual quando um alinhamento global é realizado. Consequentemente, os métodos de comparação de sequências são, em sua maioria, planejados para produzir alinhamentos ótimos que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem penalizar o escore de homologia total. Isto é realizado pela inserção de “lacunas” no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia local.

[00387] Entretanto, estes métodos mais complexos atribuem “penalidades para lacunas” a cada lacuna que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequências com tão poucas lacunas quanto possível, refletindo o parentesco mais elevado entre as duas sequências comparadas, alcançará um escore mais alto do que um alinhamento com muitas lacunas. São tipicamente usados “custos de lacunas afins” que cobram um custo relativamente alto para a

109 / 156 existência de uma lacuna e uma penalidade mais baixa para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de determinação de escore de lacunas mais comumente usado. Altas penalidades para lacunas obviamente produzirão alinhamentos otimizados com menos lacunas. Os programas de alinhamento mostram, em sua maioria, as penalidades para lacunas a serem modificadas. Entretanto, é preferido usar os valores padrão quando se usam tais programas de computador para comparação de sequências. Por exemplo quando se usa o pacote “GCG Wisconsin Bestfit”, a penalidade para lacunas padrão para sequências de aminoácidos é -12 para uma lacuna e -4 para cada extensão.

[00388] O cálculo da máxima percentagem de homologia portanto primeiro exige a produção de um alinhamento ótimo, levando-se em consideração as penalidades para lacunas. Um programa de computador adequado para realizar um tal alinhamento é o pacote “GCG Wisconsin Bestfit” (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Exemplos de outros programas de computador que podem realizar comparações incluem, mas não são limitados a, o pacote BLAST (consulte Ausubel et al. (1999) ibid — Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) e a suíte GENEWORKS de ferramentas de comparação. Ambos BLAST e FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (consulte Ausubel et al. (1999) ibid, páginas 7-58 a 7-60). Entretanto, para algumas aplicações, é preferido usar o programa “GCG Bestfit”. Outra ferramenta, chamada “BLAST 2 Sequences” está também disponível para comparar sequências de proteínas e de nucleotídeos (consulte FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187- 8).

[00389] Embora a percentagem de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento tipicamente não é baseado em uma comparação de tudo-ou-nada de pares. Ao contrário, é em geral usada uma matriz de escore graduado de similaridade que atribui escores a cada comparação par-a-par baseado em similaridade química ou distância evolucionária. Um exemplo de uma tal matriz comumente usada é a matriz BLOSUMO6?2 - a matriz padrão para a suíte de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsin em geral usam valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolos personalizada se fornecida (consulte o manual de usuário para detalhes adicionais). Para algumas aplicações, é preferido usar os valores padrão públicos para o pacote GCG, ou no caso de outro programa de computador, a matriz padrão, como BLOSUMO6?2.

[00390] Quando o programa de computador produz um alinhamento ótimo, é possível calcular a percentagem de homologia, preferivelmente a percentagem de identidade de sequência. O programa de computador tipicamente realiza isto como parte da comparação de sequências e gera um resultado numérico.

[00391] “Fragmentos” são também variantes e o termo tipicamente se refere a uma região selecionada do polipeptídeo ou do polinucleotídeo que é de interesse quer funcionalmente quer, por exemplo, em um ensaio. “Fragmento” portanto se refere a uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico que é uma porção de um polipeptídeo de comprimento completo ou de um polinucleotídeo de comprimento completo.

[00392] Tais variantes podem ser preparadas usando técnicas de DNA recombinante padrão como mutagênese sítio-direcionada. Se inserções devem ser realizadas, pode ser preparado o DNA sintético codificante da inserção junta com as regiões flanqueadoras 5' e 3' correspondendo a cada lado do sítio de inserção da sequência de ocorrência natural. As regiões flanqueadoras conterão sítios de restrição correspondentes na sequência de ocorrência natural de modo que a sequência possa ser cortada com a(s) enzima(s) adequada(s) e o DNA sintético possa ser ligado no corte. O DNA é então expressado de acordo com a invenção para preparar a proteína codificada.

Estes métodos são apenas ilustrativos de numerosas técnicas padrão conhecidas na técnica para a manipulação de sequências de DNA e outras técnicas conhecidas também podem ser usadas.

COMBINAÇÃO

[00393] As HSCs, as —.HPCs, as células — progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune.

[00394] Alternativamente, as HSCs, as HPCs, as células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com uma célula-T específica para TAA.

[00395] Alternativamente, as HSCs, as HPCs, as células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com uma célula-T específica para TAA expressora de um CAR.

[00396] Alternativamente, as HSCs, as HPCs, as células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com uma célula-T específica para TAA expressora de um TCR transgênico.

[00397] Alternativamente, as HSCs, as HPCs, as células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA expressora de um TCR transgênico.

[00398] Alternativamente, as HSCs, HPCs, células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA expressora de um CAR.

[00399] Alternativamente, as HSCs, as HPCs, as células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou os vetores da presente invenção podem ser usados(as) em combinação com 1- metil-triptofano (1I-MT).

[00400] Como aqui usada, a frase “usados(as) em combinação com” inclui a administração das HSCs, das HPCs, das células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, dos macrófagos, dos monócitos ou dos vetores da presente invenção sequencialmente, separadamente, ou simultaneamente com um inibidor de ponto de checagem imune e/ou uma célula-T específica para TAA.

[00401] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 60 minutos antes de uma célula-T específica para TAA e/ou de um inibidor de ponto de checagem imune.

[00402] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas antes de uma célula-T específica para TAA e/ou de um inibidor de ponto de checagem imune.

[00403] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo menos três dias, pelo menos quatro dias, pelo menos cinco dias, pelo menos seis dias, pelo menos sete dias, ou pelo menos 14 dias antes de uma célula-T específica para TAA e/ou de um inibidor de ponto de checagem imune.

[00404] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas, pelo menos cinco semanas, pelo menos seis semanas, pelo menos sete semanas, pelo menos oito semanas, pelo menos nove semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 11 semanas, ou pelo menos 12 semanas antes de uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00405] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, ou pelo menos 12 meses antes de uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00406] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, ou pelo menos 12 meses antes de uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00407] Como aqui usada, a frase “usados(as) em combinação com” inclui a administração das HSCs, das HPCs, das células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, dos macrófagos, dos monócitos ou dos vetores da presente invenção sequencialmente, separadamente, ou simultaneamente com 1-metil-triptofano (1-MT).

[00408] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 60 minutos antes de 1-metil-triptofano (1-MT).

[00409] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas antes de 1-metil-triptofano (1-MT).

[00410] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo menos três dias, pelo menos quatro dias, pelo menos cinco dias, pelo menos seis dias, pelo menos sete dias, ou pelo menos 14 dias antes de 1-metil- triptofano (1I-MT).

[00411] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas, pelo menos cinco semanas, pelo menos seis semanas, pelo menos sete semanas, pelo menos oito semanas, pelo menos nove semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 11 semanas, ou pelo menos 12 semanas antes de 1-metil-triptofano (1- MT).

[00412] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos um mês, pelo menos dois meses,

pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, ou pelo menos 12 meses antes de 1-metil-triptofano (1-MT).

[00413] A HSC, a HPC, as células progenitoras mieloide/monócito- comprometidas, os macrófagos, os monócitos ou o vetor da presente invenção podem ser administrados(as) pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, ou pelo menos 12 meses antes de 1-metil-triptofano (1-MT).

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[00414] As HSCs, as HPCs, as células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, os macrófagos, os monócitos, os inibidores de ponto de checagem imune, as células-T específicas para TAA, os vetores, o 1-metil-triptofano (I-MT) e combinações dos(as) mesmos(as) para uso de acordo com a presente invenção podem ser formulados(as) com um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

PACIENTE

[00415] O paciente pode ser um paciente humano. O paciente pode ser um animal não humano.

[00416] O paciente pode estar afligido com um câncer. Alternativamente, o paciente pode estar sob o risco para desenvolvimento de um câncer.

[00417] Pode ter sido previamente determinado que o paciente está sob o risco para desenvolvimento de um câncer. O risco aumentado pode ter sido determinado por triagem genética e/ou por análise da história familiar do paciente. Pode ter sido determinado que o paciente expressa um ou mais marcadores — genéticos indicativos de um risco aumentado para desenvolvimento de um câncer.

[00418] Adequadamente, uma pessoa versada na técnica estará ciente dos fatores de risco genéticos (e.g. marcadores genéticos) associados com o risco aumentado para desenvolvimento de um câncer. A pessoa versada pode usar qualquer método adequado ou qualquer técnica adequada conhecido(a) na técnica para determinar se o sujeito tem um risco aumentado para desenvolvimento de um câncer.

[00419] O sujeito pode ter previamente recebido tratamento para o câncer. O sujeito pode estar em remissão do câncer. O sujeito pode ser resistente à quimioterapia.

[00420] Em alguns aspectos da presente invenção, o paciente pode ter sido previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito da invenção antes da administração de uma célula-T específica para TAA e/ou de um inibidor de ponto de checagem imune.

[00421] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos 6 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas antes da administração com uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00422] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo menos três dias, pelo menos quatro dias, pelo menos cinco dias, pelo menos seis dias, pelo menos sete dias, ou pelo menos 14 dias antes da administração com uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00423] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas, pelo menos cinco semanas, pelo menos seis semanas, pelo menos sete semanas, pelo menos oito semanas, pelo menos nove semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 11 semanas, ou pelo menos 12 semanas antes da administração com uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00424] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, ou pelo menos 12 meses antes da administração com uma célula-T específica para TAA e/ou um inibidor de ponto de checagem imune.

[00425] Em alguns aspectos da presente invenção, o paciente tem sido previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito da invenção antes da administração de 1-metil-triptofano (1-MT).

[00426] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos 6 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas antes da administração com 1-metil-triptofano (1-MT).

[00427] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo menos três dias, pelo menos quatro dias, pelo menos cinco dias, pelo menos seis dias, pelo menos sete dias, ou pelo menos 14 dias antes da administração de 1-metil-triptofano (1-MT).

[00428] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas, pelo menos cinco semanas, pelo menos seis semanas, pelo menos sete semanas, pelo menos oito semanas, pelo menos nove semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 11 semanas, ou pelo menos 12 semanas antes da administração com 1 -metil-triptofano (1-MT).

[00429] Em uma modalidade, a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito da presente invenção é administrado(a) ao paciente pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, ou pelo menos 12 meses antes da administração com 1-metil-triptofano (1- MT).

[00430] Ambos tratamentos humano e veterinário estão no escopo da presente invenção.

[00431] Os termos “compreendendo”, “compreende” e “compreendido de”, como aqui usados, são sinônimos de “incluindo” ou “inclui”; ou “contendo” ou “contém”, e são inclusivos ou de extremidade aberta e não excluem membros, elementos ou etapas adicionais, não citados(as). Os termos “compreendendo”, “compreende” e “compreendido de” também incluem o termo “consistindo em”.

[00432] A prática da presente invenção utilizará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, biologia molecular, histologia, imunologia, oncologia, que estão dentro das capacidades de uma pessoa comumente versada na técnica. Tais técnicas são explicadas na literatura.

[00433] Consulte, por exemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2"* Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 e suplementos periódicos), “Current Protocols in Molecular Biology”, Ch. 9, 13 e 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. e Kahn, A. (1996), “DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques”, John Wiley & Sons; Polak, J.M. e McGee, J.O'D. (1990), “In Situ Hybridization: Principles and Practice”, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984), “Oligonucleotide Synthesis: À Practical Approach”, IRL Press; e Lilley, DM. e Dahlberg, J.E. (1992), “Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Análise of DNA”, Academic Press. Cada um destes textos gerais é aqui incorporado como referência.

[00434] Várias características e modalidades preferidas da presente invenção serão agora descritas à guisa de exemplos não limitadores.

EXEMPLOS Exemplo 1 - IFNa direcionado para tumor reforça as respostas antitumorais mediadas por células-T em um modelo de ALL

[00435] Nós transplantamos camundongos C57BlI/6 com HSC transduzida com quer mTie2-IFN-mirT LV (camundongos IFN) quer mTie2- GFP-mirT LV ou Simuladamente-(Mock)-transduzida (ambos usados como camundongos de controle), para direcionar a expressão de IFN/GFP para progênie monocítica TIE2+ diferenciada, que está elevadamente enriquecida em tumores"*!6, Como previamente mostrado, a reconstituição com células transduzidas com m7Tie2-IFN-mirT LV resulta em um transplante multilinhagem funcional, sem efeitos colaterais evidentes*"º. Nós então desafiamos os camundongos reconstituídos com nosso modelo de B-ALL previamente descrito (Figura 1a) e descobrimos a inibição de crescimento de leucemia em camundongos IFN em comparação com os camundongos de controle (Figuras 1b,c). A administração de um anticorpo bloqueador anti- CTLA4 (aCTLAA4) não teve efeitos nos camundongos de controle mas melhorou adicionalmente e significativamente a inibição de ALL em camundongos IFN, sugerindo uma contribuição imune para a resposta observada em camundongos IFN. A combinação de terapia gênica com IFN e aCTLAA significativamente melhorou a sobrevivência dos camundongos (Figura 21). Com o propósito de investigar a indução de imunidade antitumoral, nós modificamos células ALL com um vetor lentiviral (LV) que permite a expressão coordenada do antígeno modelo Ovalbumina (OVA) e da forma truncada do marcador de superfície celular o receptor de fator de crescimento nervoso (NGFR, Nerve Growth Factor Receptor) a partir de um promotor bidirecional (OVA-ALL, Figuras 5a,b).

[00436] Quando injetada em camundongos C57BI/6 imunocomprometidos, OVA-ALL mostrou cinética de crescimento mais lenta e retardou o início em uma fração dos camundongos em comparação com a ALL parental. Na necropsia, todos os camundongos mostraram infiltração massiva da BM pelas células ALL, com excrescência de blastos negativos para NGFR nos camundongos com doença retardada (Figuras 5c,d). Quando as células OVA ALL foram injetadas em camundongos NOD-SCID-IL2Rg-/- (NSG) imunodeficientes, nós observamos crescimento de tumor comparável com as células parentais e nenhuma perda de expressão de NGFR (Figuras 5c,e). No todo, estes resultados indicam imunogenicidade aumentada da variante de OVA-ALL resultando em edição e seleção imunes de clones de ALL raros não transduzidos ou silenciados (negativos para OVA/NGFR) provavelmente presentes no produto de infusão. Entretanto, nenhuns camundongos sobreviveram a qualquer um dos desafios. Nós, por conseguinte, testamos a capacidade de distribuição baseada em gene e de IFN direcionado para célula tumoral para reforçar a resposta imune antitumoral contra OVA-ALL. Embora ALL rapidamente se expandiu em camundongos de controle (Figuras 1d-f), houve surgimento e acúmulo retardados de blastos no sangue, e infiltração reduzida na BM e no baço, de camundongos IFN. Importante, uma fração dos camundongos IFN mostrou ausência de leucemia em todos os órgãos analisados.

[00437] Células-T CD8+ esplênicas purificadas estimuladas in vitro de camundongos IFN mostraram indução de resposta específica contra OVA por ELISPOT de IFN-y, com número crescente de células respondedoras nos camundongos mostrando a carga tumoral mais baixa (Figura lg). Células-T CD8+ específicas para OVA foram detectadas por coloração com reagente pentâmero-OVA257-264-H-2Kb em ambos os camundongos IFN e camundongos de controle, com percentagens e números mais altos(as) no sangue e na BM do primeiro grupo (Figuras 1h-j e Figura 6a). Além disso, as células-T CD8+ de camundongos de controle não liberaram IFN-y após reestimulação ex-vivo com OVA, como o fizeram as células-T de camundongos IFN (Figura 1k), sugerindo disfunção, consistentemente com a falta de inibição de tumor em camundongos de controle versus camundongos IFN (Figuras 6b-d). Impressionantemente, a depleção de células-T CD8+ em camundongos IFN ab-rogou a resposta antitumoral (Figuras 11,m). No todo, estes resultados indicam indução de CTLs capazes de montar uma resposta eficaz contra um neo-antígeno tumoral em camundongos IFN.

[00438] Nós também observamos uma carga tumoral inicial mais baixa em camundongos IFN CD8-depletados em comparação com os camundongos de controle, sugerindo que mecanismos adicionais além do controle mediado por CD8 podem contribuir, pelo menos inicialmente e temporariamente, para inibição de tumor (Figura 6€). Embora não houvesse diferença na distribuição da fração de células apoptóticas e do ciclo celular de células ALL na BM e no baço entre camundongos IFN e camundongos de controle, (Figuras 7a-d), a taxa de proliferação, conforme medida pela incorporação de EdU, foi mais baixa na BM, mas não no baço, de camundongos IFN (Figuras 7e,f). Um retardo na proliferação, possivelmente engatilhado por IFN, pode favorecer o acúmulo de CTL tumor-específico em razão eficaz entre célula efetora e célula alvo para suprimir o crescimento de célula tumoral. Exemplo 2 - Células-T OT-I transgênicas adotivamente transferidas apenas expandem e contêm leucemia em camundongos IFN

[00440] Para investigar o efeito de IFN de tipo I sobre recrutamento e ativação de células-T, nós adotivamente transferimos células-T transgênicas naive específicas para OVA (OT-I) em camundongos IFN e camundongos de controle (Figura 2a). Nós ajustamos o tempo de infusão entre os 2 grupos para infundir células OT-I em carga leucêmica comparável (Figura 2b e Figura 8a) e analisamos os camundongos 3 dias depois. Nós observamos números substancialmente mais altos de células OT-I no baço e na BM de camundongos IFN injetados com leucemia do que em camundongos de controle, nos quais as células OT-I foram recuperadas em números baixos similares aos dos camundongos de controle não possuindo tumor (Figura 2c). Análise citofluorimétrica mostrou que uma maioria das células OT-I tiverem suprarregulada a ativação de receptor LAG3, e adquiriram fenótipo de células de memória central ou de células de memória efetoras, nos camundongos IFN possuindo leucemia e nos camundongos de controle, com ativação aumentada no primeiro grupo.

[00441] Estas descobertas foram fortemente contrastantes com os camundongos de controle isentos de tumor, nos quais as células OT-I mantiveram o fenótipo naive da coleta (Figura 2d e Figuras 8b-d). A carga leucêmica foi significativamente reduzida em camundongo IFN versus camundongos de controle já nos tempos precoces após a transferência adotiva de células-T (Figura 8e). Embora quase todas as células leucêmicas de camundongos de controle expressaram o marcador NGFR, houve uma fração crescente de células negativas para NGFR em camundongos IFN, sugerindo pressão seletiva contra OVA-ALL (Figura 81).

[00439] Nós então exploramos a sinergia de a terapia celular com IFN e a transferência adotiva de células-T OT-I no favorecimento da sobrevivência (Figura 2e). Embora a infusão de células-T OT-I resultasse em sobrevivência de 20% dos camundongos versus nenhuma sobrevivência no grupo de controle, o tratamento combinado significativamente melhorou a sobrevivência para 67% (Figura 2f). Análise longitudinal de camundongos IFN + OTH revelou a expansão de OT-I, alcançando o valor máximo em 6 dias após a infusão, acompanhado por suprarregulação transiente de LAG3 e depuração de OVA-ALL (Figuras 2g,h e Figura 9a). Importante, aqueles camundongos IFN + OT-I que sucumbiram à doença (mostrados em preto nas Figuras 2g,h e Figura 9a) mostraram a excrescência de células ALL negativas para NGFR no sangue e na BM, confirmando, assim, que as células leucêmicas expressoras de OVA haviam sido erradicadas pela células OT-I infundidas (Figura 9a,c). Inversamente, as células OT-I na maioria dos camundongos de controle falharam em expandir e mostraram níveis constitutivos mais altos de expressão de LAG3, um sinal de exaustão de células-T (Figuras 2g,h). Consequentemente, as células OT-I infundidas falharam em erradicar as células B-ALL expressoras de OVA nestes camundongos, como mostrado por um decréscimo inicial mas transiente em células leucêmicas expressoras de NGFR circulantes seguidas pela excrescência delas no sangue e na BM (Figuras 9b,d).

[00440] Na necropsia, embora um boa fração de células-T OT-I na BM, no baço e nos linfonodos de camundongos IFN + OT-I permaneceram como acervo de memória e tiveram infrarregulado o marcador inibitório de PD1, a maioria das células-T OT-I em camundongos CTRL + OT-I tiveram características de células efetoras exauridas, porque todas elas expressaram o marcador PD1 (Figuras 9e,f). Como previsto, as células-T OT-I infundidas em camundongos de controle não injetados com tumor não expandiram e não suprarregularam a expressão de Lag3 (Figuras 2g,h). No todo, estes dados mostram que, embora as células OT-I experimentaram ativação e expansão robustas em camundongos IFN, resultando em depuração de tumor, estas células foram hipofuncionais nos camundongos de controle, falharam em expandir e mostraram evidência fenotípica de exaustão.

Exemplo 3 - Assinatura genética imune primada para respostas M1 e Th1 em camundongos IFN; e terapia gênica com IFN compensa as alterações induzidas por leucemia no microambiante tumoral (TME) e impõe um programa imunoestimulatório

[00441] Para estudar se nossa estratégia de distribuição de gene TFN altera o microambiente leucêmico favorecendo a indução de respostas imunes eficazes, nós realizamos medição multiplexada de expressão gênica em um painel de 750 genes usado para perfilamento imune de câncer no baço e na BM de camundongos de controle e de camundongos IFN, antes e após o desafio leucêmico. Quase todos os genes significativamente suprarregulados em ambos os tecidos de camundongos IFN versus camundongos de controle foram genes estimulados por IFN (ISG, IFN Stimulated Genes) e, no baço, genes de ativação de células-T, de processamento de antígeno, de ativação de macrófago/DC, de ativação de NK e de imunidade inata confirmando que nosso tratamento impôs uma assinatura de resposta de IFN/Thl nestes tecidos. Estas alterações permaneceram evidentes após o desafio tumoral e foram acompanhadas por infrarregulação de genes associados à leucemia (Figura 3a). Nós então purificamos células-T CD4+ esplênicas para interrogar genes selecionados, e mostramos suprarregulação significativa de Tbx21, codificante do fator de transcrição de Th1, TBET, e nenhumas alterações em genes prototípicos Th2 e Treg em camundongos IFN versus camundongos de controle possuindo tumor. Nós também observamos suprarregulação do gene

117 em camundongos IFN mas esta alteração não foi acompanhada com suprarregulação dos outros genes prototípicos 1122 e Rorc Th17 (Figura 3b e Figura 102).

[00442] Nós então caracterizamos o fenótipo de células mieloides no sangue, no baço, e na BM. Nós descobrimos percentagem aumentada de monócitos clássicos (LyY6C+Ly6Glow) e percentagem reduzida de monócitos não clássicos (Ly6C-Ly6G-) no sangue, de camundongos IFN versus camundongos de controle, e tais diferenças foram adicionalmente intensificadas após desafio leucêmico (Figura 3c e Figura 11a). Nós também descobrimos granulócitos circulantes (Ly6Cint Ly6G+) em camundongos IFN. O crescimento de leucemia no baço de camundongos de controle foi acompanhado pela expansão de células mieloides imaturas (CDI1lcint MHCII-F4/80-) e percentagem aumentada de macrófagos M2 negativos para MHC-II, enquanto que nenhumas destas alterações foram vistas em camundongos IFN (Figuras 11b-d). As alterações associadas à leucemia estiveram também ausentes nas células mieloides da BM de camundongos IFN, que mostram, ao contrário, um aumento em DCs e na fração de DC apresentando o peptídeo imunodominante OVAy»s7.2654 sobre MHC-I (Figuras 12a,b e Figura 18). Similarmente, as alterações em células NK e NKT vistas no baço e na BM de camundongos leucêmicos - incluindo expressão decrescida do receptor ativador NKG2D - estavam ausentes em camundongos IFN (Figuras 13a-e).

[00443] As análises de sequenciamento de RNA (RNA-Seg) revelaram alterações transcricionais induzidas por leucemia em macrófagos, que foram substancialmente neutralizadas pela terapia gênica com IFN (Figuras 22a,b). Macrófagos do baço de todos os camundongos ALL versus camundongos de controle suprarregularam os genes codificantes da citocina imunossupressora IL-10, do ponto de checagem imune inibitório PD-1 e também os genes ligados à divisão celular e à resposta aos estímulos imunes conforme os

126 / 156 termos de ontologia gênica (GO, Gene Ontology). Genes infrarregulados foram enriquecidos em termos GO relacionados ao metabolismo de ácidos graxos, ativação de leucócitos e apresentação de antígenos (Figuras 19a,c). À terapia gênica com IFN em todos os camundongos ALL induziram um programa imunoestimulatório caracterizado pela suprarregulação de Genes Estimulados por IFN (ISGs, IFN-Stimulated Genes) enriquecidos em termos GO de resposta de defesa, migração de leucócitos e resposta ao interferon, e ab-rogaram a suprarregulação induzida por leucemia de 1110 e a infrarregulação de genes de MHC II (Figuras 19b-d). A terapia gênica com IFN em todos os camundongos ALL induziu ISGs em níveis mais altos que aqueles engatilhados nos camundongos de controle, (Figura 19d e Figura 22a), e os transcriptomas de macrófagos de camundongos de controle de camundongos IFN isentos de tumor mostraram alta correlação, enquanto que eles foram claramente diferentes dos grupos ALL e IFN+ALL (Figura 22b). Estes dados confirmam e ampliam os relatórios prévios de que nossa terapia gênica mediada por monócitos preferivelmente direciona o IFN para o TME (De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299—311; Escobar, G. et al. (2014) Sci. Transl. Med. 6: 217ra3; Catarinella, M. et al. 2016) EMBO Mol. Med. 8: 155170).

[00444] Para analisar a influência da leucemia e da terapia gênica com IFN sobre o TME em uma maneira mais não viesada, nós realizados (so)RNA-Seq de célula única (single-cell RNA-Seg) em células CD11b+ isoladas do baço de camundongos de controle e de camundongos possuindo tumor, tratados ou não com terapia gênica com IFN. Usando uma abordagem baseada em gotícula (Zheng, G.X. et al. 2017) Nat. Commun. 8: 14049), nós geramos dados de scRNA-Seg de 10.821 células, detectando uma média de

1.338 genes/célula. A clusterização baseada em gráfico e as análises de assinatura genética usando conjuntos de dados publicados (Lavin, Y. et al. (2014) Cell 159: 1312-1326; Varol, D. et al. 2017) Immunity 46: 1030-1044;

127 /156 ImmGen) identificaram 11 agrupamentos (clusters) correspondendo a monócitos (cl. 1-3), neutrófilos (cl. 4-6), células dendríticas (cl. 7), macrófagos (cl. 8), células assassinas naturais e células-T (cl. 9), mastócitos (cl. 10) e células-B (cl. 11). Heterogeneidade foi observada com as populações de monócitos e de neutrófilos, incluindo monócitos não clássicos (cl. 1) e monócitos clássicos (cl. 2), um agrupamento (cluster) coexpressando genes de monócitos e de neutrófilos (cl. 3) (Yáfez, A. et al. 2017) Immunity 47: 890-902) e intermediários de maturação de neutrófilo (Figura 19e e Figuras 23a,b). A leucemia teve um influência maior sobre o cenário transcricional de monócitos não clássicos (Figura 19f), que foram expandidos no baço de camundongos possuindo tumor (consulte a Figura 11c). As outras populações de células mieloides, incluindo macrófagos e DCs, mostraram comparativamente menos alterações induzidas por leucemia (Figura 24). Os monócitos não clássicos associados a tumor suprarregularem os genes enriquecidos em termos GO como ativação de complemento e regulação negativa de inflamação, enquanto que eles infrarregularam os genes ligados à apresentação de antígenos e ao processamento de antígenos (Figura 198). À terapia gênica com IFN impôs um programa imunoestimulatório conduzido por ISG aos monócitos não clássicos dos camundongos ALL, conforme evidenciado pela suprarregulação de genes enriquecidos em termos GO relacionados à resposta de defesa e à resposta imune inata, e também de genes de MHC IM (Figuras 19g,h). A reprogramação transcricional do TME pela terapia gênica com IFN foi menos eficaz em monócitos não clássicos de camundongos que não responderam à terapia gênica com IFN (Figura 252), como revelado pela clusterização baseada em gráfico e pela expressão gênica diferencial (Figuras 19f,h). Subclusterização de dados de scRNA-Seq de monócitos não clássicos identificou quatro subagrupamentos (subclusters) maiores (IA a 1D; Figura 25b). Subagrupamento (subcluster) 1A foi compreendido de células de camundongos isentos de doença de ambos os camundongos de controle e os camundongos INF, enquanto que os outros três subagrupamentos (subclusters) predominantemente coincidiram com células de respondedor IFN+ALL (1B), de não respondedor IFN+ALL (1C), e de ALL (1D). Análise via árvore de espalhamento mínimo (MST, Minimum- Spanning Tree) revelou uma trajetória de 1A para 1D, confirmando reprogramação parcial versus reprogramação eficaz em células de camundongos não respondedores versus de camundongos IFN respondedores (Figura 191).

[00445] Surpreendentemente, nós também descobrimos números aumentados de células-T FOXP3+CD25+CD4+ na BM de camundongos IFN injetados com tumor (Figuras 12cd). No todo, estas alterações são consistentes com a primeira exposição ao antígeno (priming) para ativação de respostas M1 e Thl em camundongos IFN, que pode favorecer, sob desafio leucêmico, a indução de resposta imune protetora. Exemplo 4 - Tratamento com IFN induz respostas antitumorais duráveis reconhecedoras de múltiplos antígenos tumorais

[00446] Nós então investigamos se o tratamento com IFNa direcionado para tumor poderia também favorecer respostas duráveis de longa duração nos camundongos. Impressionantemente, uma média de 24% (média de 5 experimentos diferentes, n=11, 14, 8, 16, 12) dos camundongos IFN sobreviveram durante longo tempo e foram eficazmente curados da doença, enquanto que apenas 2% dos camundongos de controle (n=13, 14, 8, 16, 13) sobreviveram à doença (um experimento representativo é mostrado na Figura 4a e na Figura 14a). Importante, pela estratificação dos camundongos com base no tempo de sobrevivência, nós descobrimos que os camundongos eutanasiados precocemente após a injeção de tumor mostraram percentagem baixa de células-T específicas para OVA circulantes e nenhum surgimento de clones de ALL negativos para NGFR (Figura 14b). Inversamente, os camundongos eutanasiados em instantes de tempo mais tardios mostraram indução de percentagens variáveis de células-T específicas para OVA circulantes e o surgimento de clones de ALL negativos para NGFR (Figura 14b). Estes resultados sugerem que os camundongos que sucumbiram à doença quer falharam em montar uma resposta imune e morreram muito precocemente, quer montaram respostas anticCOVA mas enfim morreram devido à falha destas células em proteger os camundongos, quer por causa de exaustão quer a emergência de clones de ALL negativos para OVA imunosselecionados. Os sobreviventes de longo tempo mostraram células-T específicas para OVA estáveis circulantes e, quando redesafiados com OVA- ALL, permaneceram isentos da doença (Figura 4b e Figura 14c). A depuração tumoral foi associada com a expansão de células-T específicas para OVA circulantes, sugerindo que o desenvolvimento de respostas de células-T de memória desempenha uma função-chave na proteção de camundongos contra o desafio tumoral subsequente (Figura 14d). Impressionantemente, os camundongos INF sobreviventes durante longo tempo eficazmente eliminaram ambas as células ALL expressoras de OVA e as células ALL parentais, negativas para OVA, quando redesafiados com uma razão de 1 para 1 destas células ou com apenas células parentais, sugerindo que havia ocorrido a disseminação da resposta para antígenos associados a tumor (TAA) adicionais, e poderia ser necessária para alcançar proteção durável de longo tempo (Figuras 4c,d e Figura 14€).

Exemplo 5 - Combinação de tratamento com IFN e bloqueio de CTLA-4 intensifica a sobrevivência à leucemia

[00447] Nós então investigamos a combinação de terapia de bloqueio CTLA- com o tratamento com IFNa direcionado para tumor em nosso modelo experimental OVA-ALL (Figura 4e). Enquanto que todos os grupos de tratamento - terapia gênica com IFN ou tratamento com aCTLA4 sozinho ou a combinação deles - significativamente aumentou a sobrevivência de camundongos versus os camundongos de controle, a terapia de combinação foi mais eficaz (IFN 21%; aCTLA4 20%; CTRL+ anticorpo isotípico de controle 7%; IFN+aCTLAA4 36%; Figura 4f e Figura 15a), como confirmado em um segundo experimento (IFN+aCTLA4 30% versus aCTLA4 8%; Figura 4g e Figura 15b). Tratamento com IFN ou aCTLA-4 aumentou a percentagem de células-T específicas para OVA207 em PB, que foi adicionalmente aumentado no grupo de terapia de combinação (Figura 16b). Consequentemente, a seleção imune de ALL negativa para NGFR foi mais evidente nos grupos IFN+aCTLA4 e aCTLA4, embora ela não fosse consistentemente acompanhada pelo curso de doença retardado (Figura 16a), sugerindo que a resposta imune a um único neo-antígeno pode não produzir proteção contra tumor. Além do antígeno dominante OVA, nosso modelo ALL também expressa OFP (que é coexpressada com miR-126) e o trans- ativador procariótico tTA (que suprarregula a expressão de miR-126) como neo-antígenos potenciais que ajudam a incentivar o fenótipo transformado (consulte a Figura la). Nós estimulamos as células mononucleares de sangue periférico (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) de camundongos sobreviventes de longo tempo (do experimento mostrado na Figura 4f) com células alvo transduzidas com LV expressor de tTA, OFP, NGFR ou OVA, e medimos a produção de IFN-y por ELISPOT. A maioria destes camundongos mostraram reatividade contra um ou mais neo-antígenos adicionalmente à OVA, com a resposta mais forte observada contra tTA e a resposta mais fraca contra NGFR (Figura 4h).

[00448] Estas descobertas indicam que a disseminação da resposta imune para neo-antígenos adicionais ocorreu na maioria dos camundongos sobreviventes de longo tempo. Nós então redesafiamos estes camundongos com uma razão de 1:1 de ALL positiva para OVA e ALL negativa para OVA e descobrimos que a maioria deles sobreviveram ao redesafio. Intrigantemente, a análise de camundongos individuais indicou que aqueles que falharam em sobreviver haviam falhado em gerar uma resposta ampla contra antígenos tumorais e/ou sucumbiram à seleção de clones de ALL desprovidos de mais que um neo-antígeno (Tabela Suplementar 1). Como uma indicação adicional de uma resposta imune adaptativa subjacente à sobrevivência dos camundongos, nós comparamos o repertório de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de TCR-B de PBMCs antes e depois dos desafios leucêmicos. Ambas a clonalidade produtiva (uma medição da diversidade na faixa de O=policlonal a I=monoclonal dentro de cada camundongo) e a similaridade do repertório dentre camundongos diferentes aumentou após o redesafio leucêmico, indicando a expansão de clones de células-T reativas a tumor contra um conjunto comum de TAAs dentre os camundongos sobreviventes (Figura 4i a Figura 16c).

[00449] Para adicionalmente avaliar se a geração de respostas para múltiplos neo-antígenos é um preditor de sobrevivência de longo prazo, nós realizamos um experimento novo e coletamos PBMCs precocemente após o desafio com OVA-ALL para investigar, pelo ensaio ELISPOT de IFN-y, a reatividade de células-T contra todos os TAAs conhecidos. Os camundongos mostrando um repertório antitumoral incluindo múltiplos TAAs tiveram uma possibilidade muito mais alta de sobrevivência de longo prazo do que os camundongos respondedores a um único TAA ou a nenhum TAA, que morreram todos da doença (Figura 4),k).

[00450] Juntos, estes dados mostram que tanto a terapia gênica com IFN quanto o bloqueio de CTLA4 aumentam a primeira exposição ao antígeno (priming) de célula-T e ampliam o repertório de resposta contra neo- antígenos tumorais, e que estas respostas podem ser aditivas e proteger a longo prazo contra o tumor. Exemplo 6 — Terapia gênica com IFN reforça a ativação e a expansão de células-T transduzidas com CARI9 adotivamente transferidas e intensifica a sobrevivência

[00451] Para explorar adicionalmente a sinergia entre a terapia gênica com IFN e a transferência adotiva de células-T em um modelo clinicamente relevante, nós geramos células-T expressoras de um CAR de segunda geração (2G), previamente descrito, que reconhece CDI9 (células CARTI9) de camundongo e que incorpora o domínio endocoestimulatório CD28 (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886), e tratamos os camundongos injetados com a ALL parental (negativa para OVA). Para a transferência de gene CAR nós utilizamos LV que coordenadamente expressa o CAR e o marcador NGFR a partir de um promotor bidirecional (Casucci, M. er al. (2013) Blood 122: 3461-3472) (Figuras 26a,b). Para permitir a transplantação de células CARTI9 (Davila, M.L. et al. (2013) PLoS One 8: 1-14), os camundongos foram condicionados com ciclofosfamida antes da infusão (Figura 20a). Embora as células CARTI9 sozinhas dificilmente tiveram alguma influência sobre ALL rapidamente crescente em camundongos de controle em nossas condições experimentais, elas significativamente inibiram a carga leucêmica e depletaram células-B normais em camundongos IFN (Figura 20b e Figura 26c). Similar à descoberta com células-T OT-I, as células CARTI9 revelaram suprarregulação precoce e transiente de LAG3 e de PDI em camundongos IFN mas não em camundongos de controle, alcançando o pico mais alto em um sobrevivente IFN de longo prazo (Figura 20c e Figura 26d, sobrevivente IFN de longo prazo mostrado em verde). Intrigantemente, a expressão de NGFR foi também suprarregulada sobre células CARTI9 de camundongos IFN, provavelmente refletindo a atividade aumentada do promotor de fosfoglicerato-quinase (PGK, PhosphoGlycerate Kinase) em resposta à ativação metabólica mais alta de células CART em camundongos IFN (Figuras 26e,f). Visto que em nosso LV, as expressões de NGFR e de CARIS9 são correguladas pelo promotor PGK, a expressão mais alta do último pode também ter favorecido a matança mais eficaz de CDI9+ ALL em camundongos IFN.

Nós também testamos uma versão aprimorada de CDI9 CAR (iCARI9), que contém mutações inativadoras nos primeiro e segundo domínios CD3zeta ITAM e foi relatado que aprimora a eficiência de matança e aumenta a viabilidade de células-T em comparação com o CARI9 padrão (Kochenderfer, J.N. er al. (2010) Blood 116: 3875-3886). Nós tratamos camundongos de controle ou camundongos IFN com células-T expressoras de CARI9 ou com células-T de controle em carga leucêmica baixa ou alta (Figura 20d e Figuras 27a,b). Embora as células CARTIS9 e iCARTIS9 tenham efeito detectável mas não significativo sobre a carga tumoral em camundongos de controle, elas significativamente inibiram ALL em camundongos IFN em qualquer um dos testes de intervenção precoce e tardia (Figura 20e). Nós também confirmamos a suprarregulação precoce de LAG3 em ambas as células CARTI9 de camundongos IFN (Figura 20f). Análise longitudinal revelou picos de expansão de iCART1I9 em camundongos IFN concomitante com a depuração ou a inibição de crescimento de ALL, e suprarregulação precoce de expressão de NGFR/CARI9 em camundongos IFN (Figuras 27c,d). No todo, uma fração significativa dos camundongos IFN tratados com células CARTI9 estavam ainda vivos na catamnésia mais tardia (Figura 20g).

MATERIAIS E MÉTODOS Planejamento experimental

[00452] O tamanho de amostra foi escolhido de acordo com experiência prévia com ensaios e modelos experimentais. Nenhuma amostra ou nenhum animal foi excluído(a) das análises. Os camundongos foram aleatoriamente designados a cada grupo experimental. Os investigadores não estavam cegos. Construção de plasmídeos e produção de LVs

[00453] Os mTie2-IFN-mirT, mTie2-GFP-mirT, PGK-OFP, PGK-tTA LV foram previamente descritos”!!! O BdLV transferidor de NGFR-OVA foi gerado por clonagem do OVA cDNA (Agel — Sall) amplificado do PGK- OVA LV37 por PCR no lugar do GFP cDNA (Agel — Sall) no NGFR-GFP

BdLV38. Os iniciadores usados foram os seguintes: Iniciador Direto: 5*- CGACCGGTCCACAAAGACAGCACCATGACA; Iniciador Reverso: 5*- ATTGTCGACTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGA. o BdLV transferidor de NGFR-CD20 foi caracterizado por clonagem do CD20 cDNA humano códon-otimizado de um plasmídeo sintético (KpnI blunt — Sall) no lugar de GFP cDNA (Agel blunt - Sall) no NGFR-GFP BdLV. Os BdLVs transferidores de NGFR-CARI9 e de NGFR-ICARI9 foram gerados por clonagem das sequências de CARI9 e de CARIO9 inativo previamente descritas (Kochenderfer, J.N. er al. (2010) Blood 116: 3875-3886) por PCR no lugar do GFP cDNA (Agel — Sall) no NGFR-GFP BdLV usando os seguintes — iniciadores: “Iniciador Reverso (CARI9 inativo): 5*- AAACAGCTCCTCGAGTTATCTAGGGGCCA; Iniciador Reverso (CARI19): S"-AAACAGCTCCCTCGAGTCATCTAGGGGCCAGT; Iniciador Direto (CAR1I9 e CARI9 inativo): 5- AACACCGGTGTACCGAATTCATGGGCGTG. LVs VSV-G- pseudotipificados — concentrados foram produzidos e titulados como previamente descrito (Follenzi, A. et al. (2000) Nat. Genet. 25: 217222). Camundongos

[00454] Camundongos C57B1I/6 Ly45.2 e Ly45.1 foram comprados junto ao Charles River Laboratory. Camundongos C57B1I/6 Ly45.1/Ly45.2 foram obtidos por cruzamento dos camundongos C57BI/6 Ly45.2 e C5S7BI/6 Ly45.1 na Instalação de Pesquisa Animal do Instituto Científico San Raffaele e usados como doadores para transplante de HPC. Camundongos transgênicos OT-I C57BI/6 Ly45.2 foram mantidos como colônia na Instalação de Pesquisa Animal do Instituto Científico San Raffaele Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal do Instituto Científico San Raffaele (IACUC 600) e comunicado ao Ministério da Saúde e às autoridades locais de acordo com a lei italiana.

Transplantação de célula-tronco progenitora hematopoiética (HSPC, Hematopoietic Stem Progenitor Cell) Transplantação de HSPC em camundongos C57B1/6

[00455] Camundongos C57BlI/6 Ly45.2/Ly45.1 de seis semanas de idade foram eutanasiados com CO; e a BM foi coletada dos fêmures e das tíbias por lavagem com jato de líquido. Células de linhagem negativa enriquecidas em HS/PCs foram isoladas da BM total usando um sistema de purificação de células baseado em coluna imunomagnética (“Lineage Cell Depletion Kit Mouse”, Miltenyi, nº 130-090-858). 10º Células de linhagem negativa/mL foram então pré-estimuladas durante 3 a 4 h em um meio StemSpan isento de soro (StemCell Technologies) contendo um coquetel de citocinas (20 ng/mL de IL-3, 100 ng/mL de SCF, 100 ng/mL de FLT-3L, 50 ng/mL de TPO, todas da Peprotech) e então transduzidas com os vetores lentivirais indicados em uma dose de 10º unidades de transdução [Transducing Units, TUl/mL durante 12 h no mesmo meio contendo citocinas. Após a transdução, as células foram lavadas e 10º células foram infundidas para dentro da veia da cauda de camundongos fêmeas C57B1l/6 Ly45.1 de 6 semanas de idade letalmente irradiadas. As doses de radiação foram de 935 cGy divididas em duas doses. As células transduzidas foram também cultivadas in vitro durante 15 dias em IMDM suplementado com 10% de FBS, SCF (100 ng/mL), FLT3L (100ng/mL), penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100pg/mL) e 2% de glutamina e então testadas juntas com as células PBMC isoladas de camundongos fêmeas transplantados em reconstituição hematopoiética estável (6 semanas) para quantificar o NCV (Número de Cópias de Vetores) por qPCR como previamente descrito (De Palma et al., Blood 2005). Estudos de tumor OVA-ALL de camundongo

[00456] O subclone OVA-ALL foi gerado por transdução do clone de

ALL parental de nº 1114 com o NGFR-OVA BdLV. Resumidamente, células ALL foram mantidas em cultura em uma concentração de 2x10º células/mL em StemSpan suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100pug/mL), 2% de glutamina, IL3 (2O0ng/mL), SCF (100ng/mL), FLT3L (100ng/mL), TPO (50ng/mL) e transduzidas a 2x107 TU/mL com o NGFR-OVA BdLV. Após 6 horas de exposição ao LV, as células ALL transduzidas foram lavadas e intravenosamente injetadas em camundongos CS7BI/6 Ly45.2 recipientes subletalmente irradiados (450 cGy). Os camundongos leucêmicos foram mortos 14 dias depois, quando as células ALL alcançaram 90% de células PB totais, a BM foi coletada dos fêmures e das tíbias por lavagem com jato de líquido.

[00457] Células transduzidas NGFR+ foram isoladas por marcação celular imunomagnética (“CD271 MicroBead Kit”, Miltenyi, nº130-099-023). A pureza das células ALL foi determinada por análise via citômetro de fluxo pela marcação das células com um anticorpo anti-NGFR e foi estimada em ser de 98% (NGFR+ ALL; consulte a Figura 5a). A batelada de OVA-ALL foi então congelada em múltiplas alíquotas, que foram armazenadas em nitrogênio líquido e usadas em todos os experimentos. Para desafio tumoral, os camundongos foram intravenosamente injetados com uma dose de 10º OVA-ALL ou de 3x10º de ALL parental ressuspensos em 200uL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, Phosphate Buffer Saline). Para experimentos de redesafio, nós misturados OVA-ALL e ALL parental (negativa para OVA) em uma razão de 1:1 (10º ALL total). A composição do produto de infusão foi verificada por análise via citômetro de fluxo antes da injeção in vivo pela marcação das células mistas com um anticorpo anti- NGFR. A cinética de crescimento de tumor foi determinada por análise citofluorimétrica das amostras de PB periodicamente obtidas. Para estudos de sobrevivência, os camundongos foram diariamente inspecionados e quando mostraram sinais de sofrimento foram avaliados para status da doença e foram

137 /156 subsequentemente eutanasiados e a BM e o baço foram coletados em condições estéreis para análise posterior. Para experimentos de bloqueio de CTLA-, um anticorpo monoclonal bloqueador de camundongo anti-CTLA4- de-camundongo (“mAb clone 9D9 BioXCell”, nº BE0164) ou o anticorpo isotípico de controle de camundongo (“mAb clone MCP-11 BioXCell”, nº BEO0086) foram administrados intraperitonealmente a partir do dia 3 após injeção de ALL parental ou de OVA-ALL em uma dose inicial de 200 ug/camundongo e seguida por doses de 100 ug/camundongo a cada 3-4 dias para um total de cinco infusões de anticorpo. Depleção in vivo de células-T CD8

[00458] Para a depleção in vivo de células-T, um anticorpo monoclonal depletor anti-CD8 (“mAb 53-6.72 BioXCell”, nº BEO0004-1) foi administrado intraperitonealmente aos camundongos em uma dose de 200ug/camundongo um dia antes da injeção de OVA-ALL e então a cada 3 dias no decorrer da duração inteira do experimento. Transferência adotiva de células-T OT-I

[00459] Para os experimentos de transferência adotiva de células-T OT-I, as células-T OT-I foram purificadas do baço de camundongos fêmeas transgênicos OT-I C57BI/6 Ly45.2 de 8 semanas de idade por seleção imunomagnética (“CD8+ T Cell Isolation Kit”, Miltenyi, nº 130-104-075). À pureza das células-T OT-I foi avaliada por análise citofluorimétrica usando um painel de anticorpos anti-CD8, anti-CD4 e anti-CD3. 1x10º Células -T OT-I naive foram intravenosamente injetadas em camundongos IFN ou CTRL transplantados no tempo indicado após injeção de OVA-ALL. Geração de células CART19

[00460] Células-T foram primeiro purificadas do baço de camundongos fêmeas C57B1I/6 CD45.2+ de 8 semanas de idade por seleção imunomagnética (“Pan T Cell Isolation Kit”, Miltenyi, nº 130-095-130) e subsequentemente — ativadas com “antiCCD3/CD28 —Dynabeads&”

(ThermoFisher nº 11452D), de acordo com as instruções do fabricante. As células-T foram cultivadas em RPMI suplementado com 10% de FBS, penicilina (10O0UI/mL), estreptomicina (100ug/mL), 1% de glutamina, IL2 (30pug/mL), IL7 (5ng/mL), ILI5 (5ng/mL), Piruvato de Na (IMM), Hepes (20mM), NEAA (IuM) e Beta-Mercaptoetanol (0,05mM). Um dia após a ativação, as células-T foram transduzidas em uma concentração de 1x10º células/mL com 10º*TU/mL do NGFR-CARI9 BdLV ou do NGFR-iCARI9 BdLV. 12 Horas após a exposição ao LV, as células-T foram lavadas e expandidas em cultura durante 8 dias antes da infusão em camundongos fêmeas em uma dose de 7 x 10º células-T NGFR+ (experimento da Figura 20b) e 107 células-T NGFR+ (experimento da Figura 20e€). Ensaio de proliferação in vivo com Edu

[00461] Ensaios de proliferação in vivo foram realizados usando 5- etinil-2'-desoxiuridina (EdU, Invitrogen), um análogo de timidina usado alternativamente à BrdU. EdU foi dissolvida em PBS 1x estéril em uma concentração de 10 mg/mL. Os camundongos foram injetados i.p. com 100ug de EdU 24h antes da análise. BM e o baço foram coletados e processados de acordo com as instruções do fabricante (“Click-iT& EdU Flow Cytometry Assay Kit”, Invitrogen, nº C10636), e as percentagens de incorporação de EdU em célula leucêmica foram medidas por análise citométrica de fluxo. Cultura e transdução de células

[00462] A linhagem celular de linfoma ELA derivada de camundongo C57B1/6 foi mantida em IMDM suplementado com 10% de FBS, penicilina (100UI/mL), estreptomicina (100ug/mL) e 2% de glutamina. A transdução foi realizada em uma concentração de 10º células/ml. com uma dose de 10º TU/mL do estoque de vetor indicado. As células foram incubadas durante 12 horas e então foram lavadas para remover o vetor. OFP sobre células transduzidas foi avaliada após 7 dias de cultura por análise citométrica de fluxo. As expressões de NGFR e de CD20 foram avaliadas por coloração das

139 /156 células com um anticorpo anti-NGFR ou um anticorpo anti-CD20 a 7 dias após a transdução (consultar a seção citometria de fluxo). O NCV de células transduzidas foi determinado por qPCR em tempo real após 15 dias de cultura como previamente descrito (De Palma et al., Blood 2005). Citometria de fluxo

[00463] Todas as análises citométricas foram realizadas usando os instrumentos FACSCanto IIGO e LSRFortessa& (BD Bioscience) e analisadas com o software FlowJo (v. 9.3, Tree Star Inc.). Células cultivadas

[00464] Células ELA foram lavadas e ressuspensas em PBS contendo 2% de FBS. Para imunocoloração, as células foram incubadas com anticorpos bloqueadores anti-receptor-Fe-de-camundongo durante 15 min a 4ºC e então coradas durante 20 min a 4ºC com o anticorpo anti NGFR ou o anticorpo anti CD?20 (para os anticorpos consultar a Tabela Suplementar 1). Para excluir células mortas da análise, as células foram lavadas e ressuspensas em PBS contendo 10 ng/mL de 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Sangue periférico

[00465] Para cada camundongo, 250 uL de sangue periférico foram adicionados a 10 ul de PBS contendo 45 mg/ml de EDTA. Para imunocoloração, um volume conhecido de sangue integral (100 uL) foi primeiro incubado com anticorpos bloqueadores anti-receptores-CD16/FceyIII- e-CD32/FeyII-de-camundongo durante 10 min à temperatura ambiente e, então, foi incubado na presença de anticorpos monoclonais (para os anticorpos consultar a Tabela Suplementar 1) durante 15 min à temperatura ambiente. Eritrócitos foram removidos por lise com a “TQ-Prep Workstation” (Beckman-Coulter) na presença de um volume igual de FBS (100 uL) para proteger as células de sangue integral. Para citometria de fluxo quantitativa, nós primeiro coramos e lisamos um volume conhecido de sangue (100 uL), como descrito acima, e nós então adicionamos um volume fixo (50 uL) de

140 /156 “Flow-count Fluorospheres” (Beckman Coulter, nº 7547053), com uma concentração conhecida. Para determinar o número absoluto de células, nós usamos a fórmula: Contagem Absoluta (células/uL) = [Número Total de Células Contadas / Número Total de Fluorospheres Contadas x 2)] x Concentração das Flow-count Fluorospheres. Para a coloração com reagente pentâmero específico para OVA, sangue integral foi primeiro lisado com HO. 1x10º PBMCs foram então ressuspensas em 50uL de PBS contendo 2mM de EDTA e 0,5% de albumina sérica bovina (BSA, Bovine Serum Albumine) e incubados com anticorpos bloqueadores anti-receptores- CD16/FeyIII-e-CD32/FeyII-de-camundongo durante 10 min à temperatura ambiente e então com o reagente pentâmero específico para OVA (0,5ug/Ix10º células) e anticorpos monoclonais (para os anticorpos consultar a Tabela Suplementar 1) durante outros 10 min à temperatura ambiente. Para excluir as células mortas da análise, as células foram lavadas e ressuspensas em PBS contendo 2% de FBS e 10 ng/mL de 7-aminoactinomicina D (7- AAD). Para a coloração de células Treg em PB, nós primeiro realizamos coloração de superfície em 50uL de sangue integral (para os anticorpos consultar a Tabela Suplementar 1), como descrito acima. As células coradas de sangue integral foram então lavadas e ressuspensas em 100uL de solução de Fixação/Permeabilização (eBioscience, nº 00-5523-00) e incubadas durante 20 min à temperatura ambiente, lavadas e ressuspensas em 50uL de solução de Permeabilização contendo anticorpo anti-FoxP3-de- camundongo e anticorpo isotípico de controle e incubadas durante 20 min à temperatura ambiente.

Medula óssea

[00466] Células de BM foram obtidas dos fêmures por lavagem com jato de líquido em solução de 2% de FBS em PBS e passagem da suspensão de células através de um filtro de náilon de 40 um. Células (1x10º — 3x10º células) foram lavadas, ressuspensas em 100 uL de PBS contendo 2mM de

EDTA e 0,5% de BSA bovina, e incubadas com anticorpos bloqueadores anti- receptores-CD16/FeyIII-e-CD32/FeyII-de-camundongo durante 15 min a 4ºC. A coloração foi então realizada com anticorpos monoclonais (para os anticorpos consultar a Tabela Suplementar 1) durante 20 min a 4ºC. Para a coloração com reagente pentâmero específico para OVA, 1x10º células da BM foram coradas como descrito acima para PB. Para toda a coloração intracelular e para alguma coloração de superfície o corante “LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Staining"” (ThermoFisher, nº L34959) foi usado para discriminar células vivas e mortas de acordo com as instruções do fabricante. Para a coloração de células Treg em BM, nós primeiro realizados coloração de superfície em 1x10º células de BM, como descrito acima para PB. Baço

[00467] Os baços foram primeiro despedaçados e a suspensão de células resultante foi passada através de filtro de náilon de 40 um. Eritrócitos foram lisados por HO e a suspensão de células obtida foi adicionalmente passada através de filtro de náilon de 40 um e as células foram lavadas em PBS fria contendo 2mMM de EDTA e 0,5% de BSA. As células foram processadas e imunocoradas como descrito acima para BM. Coloração de ciclo celular

[00468] Células de BM e esplenócitos de camundongos injetados com OVA-ALL foram coletados como descrito acima. As células foram então coradas para marcadores de superfície e fixadas usando a solução tampão “BD Cytofix Buffer” (BD nº 554655), lavadas e permeabilizadas com “BD Perm 2” (BD nº 347692), lavadas e coradas com anticorpo Ki67 conjugado com PerCP-Cy5.5 ou com APC e finalmente ressuspensas em solução tampão “BD Cytofix Buffer” com corante Hoechst a 1 ug/mL. As células foram então analisadas em uma máquina “BD LSRFortessa” com laser de UV. Coloração de apoptose celular

[00469] Células de BM e esplenócitos de camundongos injetados com

OVA-ALL foram coletados como descrito acima. As células foram então coradas com marcadores de superfície como descrito acima. As células coradas foram então lavadas duas vezes com solução tampão para coloração de células (BioLegend, nº 420201) e as células foram ressuspensas em Solução Tampão para Ligação de Anexina V (“Anexine V Binding Buffer”, Biolegend nº 422201) e incubadas com SuL de Anexina V conjugada com azul Pacífico e 10uL de 7-AAD (Biolegend, nº420403/420404) durante 15 minutos à temperatura ambiente. 400uL de Solução Tampão para Ligação de Anexina V foram então adicionados a cada amostra e as percentagens de células apoptóticas/mortas em OVA-ALL foram medidas por análise citométrica de fluxo dentro de 30 min após a coloração.

Ensaio ELISPOT

[00470] O ELISPOT de IFN-y foi realizado em uma placa de fundo plano de 96 poços (Millipore) revestida com Sug/mL de anticorpo primário anti-IFN-y-de-camundongo (BD, nº 554430). Células-T CD8+ efetoras esplênicas foram primeiro purificadas por marcação celular imunomagnética (“CD8 MicroBead Kit”, Miltenyi, nº 130-049-401) e a pureza foi avaliada por análise citofluorimétrica usando um painel de anticorpos anti-CD8, anti-CD4 e anti-CD3. Células-T efetoras foram subsequentemente plaqueadas em uma concentração final de 10º ou 2x10º células/poço na presença de 10º células EIA irradiadas (6.000 cGy). Para alguns experimentos, nós também estimulamos células-T efetoras com 2,5 ug/mL de Concanavalina A, como controle. Após 46 horas de incubação a 37ºC/5% de CO;, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo biotinilado anti-IFN-y-de-camundongo (clone XMG 1.2, BD nº 554410, lug/mL) durante duas horas. As placas foram então lavadas quatro vezes com PBS-Tween seguido por 3 lavagens com PBS e então a avidina-POD (POD, Peroxidase) (Roche nº11089153001) foi adicionada (diluída 1:5.000 em PBS) e deixada reagir durante 1 hora. As placas foram então lavadas quatro vezes com PBS-Tween seguido por 3

143 /156 lavagens com PBS e então 50uL do substrato 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, SIGMA nº A6926/50tab) foram adicionados a cada poço e deixados reagir durante 15-20 minutos. A reação foi interrompida pela adição de água de torneira, e as manchas foram quantificadas com “ELI-Expert.Elispot-Reader” e analisadas por “Eli.Analyze Version 5.1” (A.EL.VIS). Quando se usam PBMCs totais como células efetoras, o sangue integral foi primeiro lisado com H7O para eliminar eritrócitos, as PBMCs foram contadas e plaqueadas em uma concentração final de 10º células/poço. Extração de RNA, qPCR e análise de expressão gênica

[00471] Extração de RNA de células de BM, de esplenócitos e de células-T CD4+ esplênicas purificadas foi realizada usando o “RNeasy Plus Mini Kit” (Qiagen). As células foram lisadas em solução tampão “Buffer RLT Plus”, suplementada com beta-mercaptoetanol. O lisado foi então passado através de uma agulha de calibre 20. O RNA foi então extraído de acordo com as instruções do fabricante. Os mRNAs extraídos foram retrotranscritos usando o “SuperScript Vilo Kit” (11754250; Invitrogen). Todas as análises por Q-PCR em genes individuais foram realizadas usando sondas TagMan da Applied Biosystems (veja abaixo). Q-PCR foi realizada com 40 ciclos usando o instrumento Viia 7 enquanto que o software Viia 7 foi então usado para extrair os dados brutos (Ct). Para determinar a expressão gênica, foi calculada a diferença (ACt) entre o ciclo limiar (Ct) de cada gene e aquele do gene de referência. Quanto mais baixa a ACt, mais alto é o nível de expressão gênica. Para se obterem valores de quantificação relativa, nós então calculamos, pela fórmula 2º, a alteração em vezes (variação) da expressão do gene de interesse em relação à expressão do mesmo gene na amostra de referência. Os valores-p são calculados com base em Mann-Whitney dos valores médios de 2 AC! para cada gene entre os dois grupos.

[00472] As seguintes sondas Tagman foram usadas em células-T CD4+ esplênicas de camundongo purificadas: 1IIO Mm00439616 ml), T1l17

144 /156 (Mm00439618 ml), Ifn-g (MmO1168134 ml), 1I2 Mm00434256 ml), Tbx21 (TBET) (Mm00450960 ml), Rorc (Mm01261022 ml), Foxp3 Mm00475156 ml), Gata3 (MmO0484683 ml), 1122 (MmO0444241 ml), 14 Mm00445259 ml). Sequenciamento de TCR

[00473] DNA de entrada foi obtido de PBMC de camundongos IFN e de camundongos CTRL antes da injeção de tumor (TO), 30 dias após a injeção de OVA-ALL em camundongos sobreviventes a longo prazo isentos de tumor (T1) e 4 dias após o redesafio com OVA-ALL e ALL parental misturadas em razão de 1:1 (T2). O sequenciamento da cadeia B de TCR foi realizado em “Adaptive Biotechnologies” usando a plataforma “ImmunoSEQ” com iniciadores específicos para todas as 54 regiões VB expressadas conhecidas e todas as 13 regiões JB expressadas conhecidas. Cada molde de CDR único no nível de aminoácido foi quantificado em contagens por milhão (cpm). À clonalidade foi avaliada como 1 — uniformidade de Pielou” :

E c=1- 7 Onde H ' é a entropia de uma amostra, calculada em contagens de molde mais altas que O (i.e. o conjunto de moldes de ALL observáveis em um camundongo) e H é a máxima entropia teórica para um camundongo, definida por: H =In(S) Onde S é o número de moldes diferentes em um camundongo. A similaridade foi avaliada como 1 - distância de Bray-Curtis entre uma amostra s e a média de contagens de molde no tempo £. Sets Ei ls — Sue FE: |Sis + Se

[00474] Esta medição é equivalente ao índice de similaridade de Sgrensen-Dice e ela foi avaliada incluindo todos os i moldes observados no tempo f. Sequenciamento de RNA (RNA-Seg) de numerosas de células (bulk)

[00475] O RNA foi extraído de 10.000-50.000 células separadas usando o “ReliaPrep RNA MiniPrep System” (Promega) e as bibliotecas de RNA-Segq foram preparadas com o protocolo “SMART-Seg2” (Picelli, S. er al. (2014) Nat. Protoc. 9: 171-181), com pequenas modificações. Resumidamente, RNA (1-5 ng) foi reversamente transcrito usando oligodT customizado e oligos (sequências) “template-switching LNA”, seguido por amplificação por PCR e limpeza (“Ampure XP Beads”, Beckman Coulter). O cDNA resultante (0,5-1 ng) foi tagmentado a 55ºC durante 30 minutos e as bibliotecas de RNA-Seq finais foram geradas usando reagentes do “Nextera XT DNA Library Prep Kit” (Ilumina). O sequenciamento foi realizado em uma máquina NextSeq 500 (Illumina, San Diego, CA) usando o “NextSeq 500/550 High Output v2 Kit” (75 ciclos). Sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seg)

[00476] “Droplet-based digital 3' end scRNA-Seg” foi realizado em um “Chromium Single-Cell Controller” (10X Genomics, Pleasanton, CA) usando o “Chromium Single Cell 3' Reagent Kit v2” de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células únicas suspensas foram particionadas em Esferas de Gel em Emulsão (GEM;s, Gel Beads in Emulsion) e lisadas, seguido por codificação de barras de RNA, transcrição reversa e amplificação por PCR (12-14 ciclos) scRNA-Seq prontos para sequenciamento foram preparados de acordo com as instruções do fabricante, checados e quantificados em instrumentos “2100 Bioanalyzer” (Agilent Genomics, Santa Clara, CA) e Qubit 3.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O sequenciamento foi realizado em uma máquina “NextSeq 500” (Illumina, San Diego, CA) usando o “NextSeq 500/550 High Output v2 Kit” (75 ciclos).

146 / 156 Métodos computacionais

[00477] Os reads (sequências geradas pelo sequenciamento) brutos são processados e alinhados ao transcriptoma “ENSEMBL mml10” usando “CellRanger version 1.3” (https://support.]Oxgenomics.com/single-cell-gene- expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger) com parâmetros padrão. Foram retidos apenas os reads confiantemente mapeados, duplicatas de não-PCR, com códigos de barras e UMIs (Unique Molecular Identifiers, Identificadores Moleculares Únicos) válidos. Nós filtramos as células de qualidade baixa. Foi necessário um mínimo de 300 genes únicos detectados para célula, adicionalmente foram rejeitadas células com uma razão entre expressão de gene mitocondrial e expressão de gene endógeno ultrapassando 0,1. As 10.821 células resultantes foram retidas para análise posterior. Os valores de expressão de gene foram quantificados em transcrito por milhão transformado em log [log (TPM + 1)]. As análises posteriores foram realizadas usando o pacote de software R “Seurat version 21” (https://github.com/satijalab/seurat/). Clusterização de células e análise tSNE foram realizadas em 1.031 dos genes mais variáveis, selecionados com expressão média maior que 0,01 e razão entre variância transformada em log e média transformada em log maior que 0,5. Análise de dados de NanoStringo

[00478] A expressão de RNA foi avaliada em um instrumento “nCounter SPRINT” usando o “nCounter PanCancer Immune Profiler for Mouse Panel” (Nanostring Technologies) seguindo as instruções do fabricante. As contagens de transcritos obtidas com NanoString& foram processadas como segue. As contagens brutas em arquivos RCC foram normalizadas usado “R/Bioconductor Library NanoStringNorm (v 1.1.21)”*º; A variação do ensaio técnico foi normalizada usando média geométrica de controles internos, o ruído (background) foi estimado calculando a média de controles negativos, as contagens de RNA foram normalizadas usando a

147 /156 média geométrica de expressão de genes de manutenção (housekeeping), estabilização de variância adicional foi aplicada. Expressão diferencial de dados normalizados foi avaliada por meio de modelos lineares implementados na “R/Bioconductor Limma Library"*!. Os transcritos foram considerados diferencialmente expressados com um limiar de valor-p ajustado de <0,05 (correção de Benjamini-Hochberg).

Análise estatística

[00479] Os valores são expressados como média + erro padrão da média (EPM) como indicado. As análises estatísticas foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney ou teste de Kruskall-Wallis seguido pela correção pós-teste de Dunn, salvo indicação em contrário. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em p<0,05. As análises foram realizadas com “R 3.2.2º, NPC Test R10”* e “Prism (GraphPad Prism version 7.0)”. Análise de populações de células na Figura 2 foi realizada pelo teste de combinação não paramétrica?, que é um teste baseado em permutação alternativo ao teste paramétrico T-quadrado de Hotelling para duas amostras. Esta metodologia permite realizar comparação multivariada das médias em grupos com número pequeno de observações que não satisfazem a suposição para normalidade multivariada. Figura la, 1, Figura 16b, Figura 17 e Figuras 20b,e foram modeladas dentro de uma estrutura não paramétrica que permite considerar o tamanho pequeno da amostra, a presença de valores discrepantes (outliers), distribuição de dados não Gaussiana e intensamente assimétrica, para os quais procedimentos paramétricos não são apropriados. Foi aplicado um método baseado em postos (rank) robusto e flexível adequado para análise longitudinal em design fatorial***, Neste contexto, o teste de hipótese é enfocado na detecção de diferença nas distribuições de variáveis coletadas ao invés de na diferença entre as médias***”. Esta análise foi implementada pelo uso do pacote “nparLD” desenvolvido em R46. Curvas de sobrevivência foram estimadas

148 /156 por meio de Kaplan-Meier (KM). A variável evento aqui considerada foi tempo para morte, não ocorre censura informativa. Estatísticas com teste não paramétrico de log-rank (Mantel-Haenszel) foram usadas para comparar k curvas de sobrevivência relacionadas às k-amostras**. Na presença de mais que 2 grupos, problema de comparações múltiplas foi solucionado pelo ajuste do valor-p pelo método de Bonferroni. Exemplo 7

[00480] Nós desenvolvemos um novo constructo de vetor lentiviral para expressão tumor-específica de interferon-gama (IFNy), um interferon de tipo-Il. A especificidade tumoral é provida pelo controle transcricional mediante sequências de intensificador/promotor do lócus Tie2 (Tek) que executam a expressão transgênica seletivamente em um subconjunto de células mieloides infiltrantes de tumor, enquanto que previnem a expressão em células progenitoras e -tronco hematopoiéticas com a ajuda de sequências alvo de microRNA reconhecidas por miR-126-3p e miR-130a, como previamente descrito (Escobar, G. et al. (2014) Sci. Transl. Med. 6: 217ra3). Este constructo foi chamado de “Tig126/1302”.

[00481] Um constructo análogo para expressão de interferon-alfa sob o controle de Tie2 e uma sequência alvo miR-126 (i.e. Tie2.Ifna.126T) foi chamado de “Tia126”.

[00482] Além do vetores Tig126/130a e Tial26, nós desenvolvemos um vetor lentiviral transportando cDNA do gene de fator-alfa de necrose tumoral (TNF-alfa), que foi chamado de “Ttal26/130a”. A estrutura dos constructos (e.g. Tig126/130a e Tta126/130a) é mostrada na Figura 28.

[00483] A terapia é distribuída por transdução de células progenitoras e -tronco hematopoiéticas (HSPCs, Hematopoietic Stem And Progenitor Cells) ex-vivo com Tig126/130a, seguida por transplantação das células modificadas para dentro de um [camundongo] recipiente condicionado. Após a transplantação, a progênie de HSPC se expandirá e se diferenciará, e algumas

149 / 156 delas serão recrutadas para dentro do microambiente tumoral. A atividade de promotor é especificamente suprarregulada em um subconjunto de monócitos/macrófagos — infiltrantes = de tumor, em particular em monócitos/macrófagos — expressores de Tie2 (TEMs, Tie2-Expressing Monocytes/Macrophages) que se localizam em áreas perivasculares e têm funções pró-angiogênicas e imunossupressoras (De Palma, M. et al. (2005) Cancer Cell 8: 211-226; De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299- 311), distribuindo a carga (e.g. IFNy) nesta posição estratégica.

[00484] Nós utilizamos um modelo transplantável de leucemia linfoblástica aguda B (B-ALL) que rigorosamente imita a B-ALL humana do tipo Filadélfia (Nucera, S. et al. (2016) Cancer Cell 29: 905-921), que prontamente induz um microambiente pró-tumoral, imunossupressor caracterizado, por exemplo, pelo surgimento de células supressoras mieloide- derivadas, infrarregulação de genes de MHC de classe II e suprarregulação de IL10 e de PDI.

[00485] Nós primeiro avaliamos as consequências da distribuição de IFNy baseada em Tig126/130a sobre o crescimento da leucemia e sobre o microambiente pró-tumoral induzido pela leucemia (Figura 29).

[00486] Camundongos C57/BL6 de 6 a 8 semanas de idade foram reconstituídos com HSPCs de linhagem negativa transduzidas com quer Tig126/130a, Tta126/130a quer um vetor lentiviral de controle expressor do gene de fator de crescimento nervoso (NGFR) truncado, biologicamente inativo. A dosagem de Tig126/130a e Tta126/130a foi quantificada como um número de cópias de vetor de 1,39 e 2,01, respectivamente in vitro, e de 0,44 e de 0,83, respectivamente in vivo. Oito semanas após a transplantação, depois da reconstituição do sangue periférico, os animais receberam a B-ALL que foi então seguida por coleta frequente de sangue. Comparados com os animais de controle, os camundongos modificados para expressarem IFNy mostraram progressão da doença significativamente mais lenta (Figura 29A).

Além disso, no momento da morte, nós observamos suprarregulação de expressão de MHC de classe II sobre macrófagos esplênicos (Figura 29B) e também uma redução de células supressoras mieloide-derivadas na medula óssea (Figura 29C) apontando para uma conversão do microambiente tumoral para um estado de polarização “tipo-M1”, mais antitumoral. O grau de inibição de leucemia pela terapia gênica com Tig126/130a foi comparável com o que nós havíamos previamente observado com uma carga de interferon de tipo-I (a saber, interferon-alfa) distribuída usando uma cadeia principal de vetor similar (Tial26), a mesma plataforma de distribuição e o mesmo modelo de leucemia. Ao contrário, o vetor Ttal26/130a não teve efeito mensurável sobre o crescimento da leucemia se distribuído como monoterapia.

[00487] Nós então combinamos a distribuição simultânea de várias citocinas imunoestimulatórias para dentro do microambiente leucêmico usando a cadeia principal do vetor Tie2 equipada com carga transgênica diferente. Nós cotransduzimos HSPCs de linhagem negativa com combinações duplas dos vetores Tial26, Tigl126/130a e Ttal26/130a em comparação com a monoterapia com Tial26 ou um grupo de controle transduzido com o vetor Tie2.NGFR biologicamente inativo, e transplantamos as células para dentro de camundongos recipientes letalmente irradiados. Os camundongos reconstituíram-se conforme previsto, sem toxicidade aditiva devido à expressão de citocinas combinadas. O número de cópias de vetor dos vetores individuais, medido por ensaios de PCR quantitativa específica, foi bastante baixo na faixa de O,1l a 0,3 nos camundongos reconstituídos. Os camundongos foram desafiados com B-ALL, como descrito acima. Tial26 sozinho mostrou uma redução em crescimento de leucemia em comparação com o controle, similarmente às combinações com quer Tig126/130a quer Tta126/130a (Figura 30A).

[00488] Surpreendentemente, a combinação de Tigl26/130a e

Tta1l26/130a resultou em uma grande redução na progressão da leucemia, associada com um aumento significativo na expressão de MHC de classe II sobre macrófagos esplênicos (Figura 30B), redução em MDSC (Figura 30C) e um aumento em células-T CD8&+ citotóxicas no baço (Figura 30D). Estes dados sugerem um sinergismo entre IFNy e TNFa, localmente expressados no microambiente tumoral através de células mieloides infiltrantes leucêmicas sob o controle do intensificador/promotor Tie2.

[00489] Ainda mais, nós avaliamos a sinergia potencial de nossa distribuição, baseada em terapia gênica, de IFNy, com outras estratégias imunoterapêuticas incluindo inibidores de ponto de checagem anti-CTLA-4 e anti-LAG-3 e o inibidor da enzima IDO, 1-Metil-Triptofano (1I-MT). Nós transduzimos HSPCs de linhagem negativa com Tig126/130a ou um vetor Tie2.NGFR de controle, biologicamente inativo, e transplantamos as células para dentro de camundongos recipientes letalmente irradiados. Os camundongos reconstituíram-se conforme previsto, sem toxicidade aditiva devido à expressão de citocinas combinadas. O número de cópias de vetor dos vetores individuais, medido por ensaios de PCR quantitativa específica, foi de 0,72 para o Tig126/130a e de 0,84 para os controles nos camundongos reconstituídos. Os camundongos foram desafiados com B-ALL, como descrito acima.

[00490] Nós observamos que embora anti-CTLA-4 (aCTLA4) e anti- LAG-3 (aLAG3) mostrassem alguma eficácia já em monoterapia na redução da progressão de B-ALL, o tratamento com 1-MT não teve efeito benéfico (Figura 31A). Além disso, a combinação de distribuição, baseada em terapia gênica, de IFNy, com ambos I-MT e inibidores de ponto de checagem, aumentou a eficácia dos tratamentos resultando em uma redução da progressão da doença (Figura 31A) associada com um aumento significativo em expressão de MHC de classe II sobre macrófagos esplênicos e da medula óssea (Figura 31A a 31B) e um aumento em células-T CD8+ citotóxicas no baço (Figura 31D).

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, caracterizado(a pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune, uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA) e/ou 1-metil-triptofano (1-MT), preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo (preferivelmente IFNa ou IFNfB), ou um IFN de tipo II (preferivelmente IFNy), mais preferivelmente em que o IFN de tipo I é IFNa.

2. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado(a) pelo fato de que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é usado(a) em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para TAA.

3. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado(a) pelo fato de que a célula-T específica para TAA expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) e/ou um receptor de célula-T (TCR)

transgênica.

4. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o TAA é selecionado a partir do grupo consistindo em antígeno carcinoembriônico (CEA), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrina-B2, ROR1, mesotelina, c-Met, GD-2 e MAGE A3 TCR, 4-1BB, antígeno de adenocarcinoma, alfa- fetoproteína, BAFF, célula de linfoma-B, antígeno C242, anidrase carbônica 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CDI9, CD22, CD123, CD221, CD23 (receptor de IZE), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CDS1, CDS2, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpnCAM, CD3, extra- domínio-B de fibronectina, receptor de folato 1, glicoproteína 75, GPNMB, HGF, quinase receptora de fator de crescimento (scatter factor) humano, receptor de IGF-1, IGF-I, IZG1, LI-CAM, IL-13, IL-6, receptor de fator de crescimento do tipo insulina I, integrina a5fB1, integrina avB3, MORADb-009, MSA4A1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-IC, PDGF-Ra, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMFY7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-B, TRAIL-RI, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CDS5, CDI19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, Anti-idiótipo, TAG-72, Ep-CAM, MUCI, Proteína ligante de folato, A33, G250, Antígeno de membrana específico prostático (PSMA), Antígeno específico prostático (PSA), Ferritina, Gangliosídeos (e.g. GD2, GD3, GM2), Le”, CA-125, CA19-9, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), p1 85HER?2, receptor de IL-2, de2-7 EGFR, Proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Tenascina, metaloproteinases, Endossialina, Anidrase carbônica, Galectina 9, Aldolase A, eIFy4, Tirosinase, Galectina 4,

HERKV-KI10, p53, NY-LU-12, Restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenina/m, Ber- abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) e DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AMLI1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701I, HPV-E7, HSP70- 2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0O205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MCIR, Miosina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM3, NAB8S8-A, NY-ESO-1, P15, ber-abl minor p190, PmMl/RARa, PRAME, RAGE, RUI, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteína 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 e WTI, preferivelmente, em que a célula-T específica para TAA expressa um CAR específico para CD19.

5. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a célula-T específica para TAA é derivada de uma célula isolada de um paciente.

6. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a célula-T específica para TAA tem sido modificada para perturbar pelo menos um gene endógeno, preferivelmente em que o pelo menos um gene endógeno é selecionado dentre um gene endógeno codificante de uma cadeia a de TCR, uma cadeia BB de TCR e um complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

7. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o inibidor de ponto de checagem imune é um anticorpo, preferivelmente em que o anticorpo inibidor de ponto de checagem imune é selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo anti-CTLAA, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-PDL2 e um anticorpo anti-LAG-3.

8. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e pelo menos uma sequência alvo mir-126, preferivelmente em que o vetor compreende duas sequências alvo mir-130a e duas sequências alvo mir-126.

9. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o vetor compreende, adicionalmente, um promotor tecido-específico funcionalmente ligado à sequência de nucleotídeos codificante da citocina, preferivelmente em que o promotor tecido-específico é um promotor TEK (Tie2).

10. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito- comprometida, macrófago ou monócito para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o câncer é uma malignidade hematológica ou um tumor sólido, preferivelmente em que a malignidade hematológica é selecionada a partir do grupo consistindo em leucemia = mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda (ALL), síndromes mielodisplásicas (MDS), neoplasmas mieloproliferativos (MPN), mielofibrose primária, trombocitemia essencial, policitemia verdadeira, leucemia mieloide crônica atípica, leucemia mieloide crônica (CML), linfoma, mieloma múltiplo, linfoma não Hodgkin e linfoma de Hodgkin; ou preferivelmente em que o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer de mama, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cólon, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer ovariano, cânceres de cabeça e pescoço, sarcoma sinovial, angiossarcoma, osteossarcoma, câncer de tireoide, câncer endometrial, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de fígado, melanoma, câncer de próstata, câncer renal, sarcoma de tecido mole, câncer urotelial, câncer biliar, glioblastoma, câncer cervical e câncer colorretal.

11. Célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA), caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC) uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, preferivelmente em que o TAA é selecionado a partir do grupo consistindo em antígeno carcinoembriônico (CEA), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrina-B2, RORI, mesotelina, c-Met, GD-2, e MAGE A3 TCR, 4-1BB, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, célula de linfoma-B, antígeno C242, anidrase carbônica 9 (CA-IX), CCRA4, CD152, CD200, CD22, CDI19, CD22, CD123, CD221, CD23 (receptor de IZE), CD28, CD4, CD40, CD4, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-A, DR5, EpCAM, CD3, extra-domínio-B de fibronectina, receptor de folato 1, glicoproteína 75, GPNMB, HGF, quinase receptora de fator de crescimento (scatter factor) humano, receptor de IGF-1, IGF-I, IGG1, LI-CAM, IL-13, IL- 6, receptor de fator de crescimento do tipo insulina 1, integrina a5B1, integrina avB3, MORADb-009, MS4A1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico,

NPC-IC, PDGF-Ra, PDLI192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMFY7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-B, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, Anti-idiótipo, TAG-72, Ep-CAM, MUCI, Proteína ligante de folato, A33, G250, Antígeno de membrana específico prostático (PSMA), Antígeno específico prostático (PSA), Ferritina, Gangliosídeos (e.g.

GD2, GD3, GM2), Lei, CA-125, CA19-9, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), pl 85HER2, receptor de IL-2, de2-7 EGFR, Proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Tenascina, metaloproteinases, Endossialina, Anidrase carbônica, Galectina 9, Aldolase A, eIlFy4, Tirosinase, Galectina 4, HERKV-KI10, p53, NY-LU-12, Restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenina/m, Bcer-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) e DAM-IO (MAGE-BI), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-I/Melan-A, MCIR, Miosina/m, MUC1I, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NAS8S-A, NY-ESO-1, P15, bcer-abl minor p190, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RUI, RU2, SAGE, SART- 1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteína 1, gp75, TRP-2, TRP- 2/INT2 e WTI, preferivelmente em que a célula-T específica para TAA expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) e/ou um receptor de célula-T (TCR) transgênica,

preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF),

preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo (preferivelmente IFNa ou IFNfB), ou um IFN de tipo II (preferivelmente

IFNy), mais preferivelmente em que o IFN de tipo I é IFNa, preferivelmente, em que a célula-T específica para TAA expressa um CAR específico para CD19.

12. Inibidor de ponto de checagem imune, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, preferivelmente em que o inibidor de ponto de checagem imune é um anticorpo, mais preferivelmente em que o anticorpo inibidor de ponto de checagem imune é selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo anti-CTLAA, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-PDL2 e um anticorpo anti-LAG-3, preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo [ (preferivelmente IFNa ou IFNfB), ou um IFN de tipo II (preferivelmente IFN)), mais preferivelmente em que o IFN de tipo I é IFNa.

13. 1-Metil-triptofano (1-MT), caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo II (preferivelmente IFNy).

14. Combinação de um inibidor de ponto de checagem imune e uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA), caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente em que o paciente tem sido previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC) ou uma célula progenitora hematopoiética (HPC) compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, preferivelmente em que a célula-T específica para TAA expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) e/ou um receptor de célula-T (TCR) transgênica, preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo [ (preferivelmente IFNa ou IFNB), ou um IFN de tipo II (preferivelmente IFN)), mais preferivelmente em que o IFN de tipo I é IFNa.

15. Célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA)para uso de acordo com a reivindicação 11, inibidor de ponto de checagem imune para uso de acordo com a reivindicação 12, 1-metil- triptofano (1-MT) para uso de acordo com a reivindicação 13 ou combinação para uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado(a) pelo fato de que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e pelo menos uma sequência alvo mir-126, preferivelmente em que o vetor compreende duas sequências alvo mir-130a e duas sequências alvo mir-126.

16. Célula-T específica para TAA para uso de acordo com a reivindicação 11 ou 15, inibidor de ponto de checagem imune para uso de acordo com a reivindicação 12 ou 15, 1-metil-triptofano (1-MT) para uso de acordo com a reivindicação 13 ou 15, ou combinação para uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado(a) pelo fato de que o vetor compreende, adicionalmente, um promotor tecido-específico funcionalmente ligado à sequência de nucleotídeos codificante da citocina, preferivelmente em que o promotor tecido-específico é um promotor TEK (Tie2).

17. Célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA) para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 15 ou 16, inibidor de ponto de checagem imune para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 e 15 ou 16, I-metil-triptofano (1-MT) para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 15 ou 16, ou combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado(a) pelo fato de que o câncer é uma malignidade hematológica ou um tumor sólido, preferivelmente em que a malignidade hematológica é selecionada a partir do grupo consistindo em leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda (ALL), síndromes mielodisplásicas, linfoma, mieloma múltiplo, linfoma não Hodgkin e linfoma de Hodgkin; ou preferivelmente em que o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer de mama, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cólon, colangiocarcinoma, câncer pancreático, câncer ovariano, cânceres de cabeça e pescoço, sarcoma sinovial, angiossarcoma, osteossarcoma, câncer de tireoide, câncer endometrial, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de fígado, melanoma, câncer de próstata, câncer renal, sarcoma de tecido mole, câncer urotelial, câncer biliar, glioblastoma, câncer cervical e câncer colorretal.

18. Método para tratamento ou prevenção de um câncer,

caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar uma célula- tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófago ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina a um paciente que necessita do(a) mesmo(a), em que a HSC, a HPC, a célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, o macrófago ou o monócito é administrado(a) ao paciente em combinação com um inibidor de ponto de checagem imune, uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA) e/ou 1-metil-triptofano (1-MT), preferivelmente em que a célula-T específica para TAA expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) e/ou um receptor de célula-T (TCR) transgênica, preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo (preferivelmente IFNo ou IFNB), ou um IFN de tipo II (preferivelmente IFNY), mais preferivelmente em que o IFN de tipo I é IFNo.

19. Método para tratamento ou prevenção de um câncer em um paciente previamente administrado com uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula progenitora hematopoiética (HPC), uma célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, um macrófagco ou um monócito compreendendo um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar uma célula-T específica para antígeno associado a tumor (TAA), a etapa de administrar um inibidor de ponto de checagem imune, e/ou a etapa de administrar 1-metil-triptofano (1-MT),

preferivelmente em que a célula-T específica para TAA expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) e/ou um receptor de célula-T (TCR) transgênica, preferivelmente em que a citocina é um interferon (IFN), IL- 12 ou fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo [ (preferivelmente IFNa ou IFNfB), ou um IFN de tipo II (preferivelmente IFN)), mais preferivelmente em que o IFN de tipo I é IFNa.

20. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito, caracterizado(a) pelo fato de que compreende um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma primeira citocina, e um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma segunda citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que as primeira e segunda citocinas são diferentes, preferivelmente em que as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente selecionadas dentre um interferon (IFN) ou fator- alfa de necrose tumoral (TNFo), preferivelmente em que as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente selecionadas a partir do grupo consistindo em um IFN de tipo I (preferivelmente IFNa ou IFNB), um IFN de tipo TI (preferivelmente IFNy) e TNFa, preferivelmente em que as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente selecionadas a partir do grupo consistindo em IFNa, IFNB, IFNy e TNFa.

21. População de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células — progenitoras— hematopoiéticas — (HPCs), células progenitoras mieloide/monócito-comprometidas, macrófagos ou monócitos, a população caracterizada pelo fato de que é transduzida com um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma primeira citocina, e um vetor compreendendo pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma segunda citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que as primeira e segunda citocinas são diferentes, preferivelmente em que as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente selecionadas dentre um interferon (TFN) ou fator- alfa de necrose tumoral (TNFo), preferivelmente em que as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente selecionadas a partir do grupo consistindo em um IFN de tipo I (preferivelmente IFNa ou IFNB), um IEN de tipo II (preferivelmente IFNy) e TNFo, preferivelmente em que as primeira e segunda citocinas são, cada, independentemente selecionadas a partir do grupo consistindo em IFNa, IFNB, IFNy e TNFo.

22. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago, monócito ou população para uso de acordo com a reivindicação ou 21, caracterizado(a) pelo fato de que: (a) a primeira citocina é IFNa, e a segunda citocina é IFNy; (b) a primeira citocina é IFNa, e a segunda citocina é TNFa; ou (c) a primeira citocina é IFNy, e a segunda citocina é TNFa, preferivelmente em que a primeira citocina é IFNy, e a segunda citocina é TNFa.

23. Célula-tronco hematopoiética (HSC), célula progenitora hematopoiética (HPC), célula progenitora mieloide/monócito-comprometida, macrófago ou monócito, caracterizado(a) pelo fato de que compreende um vetor em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo mir-130a e/ou mir-126 funcionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos codificante de uma citocina para uso no tratamento ou na prevenção de um câncer em um paciente, em que a citocina é um interferon (IFN) ou fator-alfa de necrose tumoral (TNFo), preferivelmente em que o IFN é um IFN de tipo TI (preferivelmente IFNy) ou um IFN de tipo I (preferivelmente IFNa ou IFNB), mais preferivelmente em que o IFN de tipo II é IFNy.

Figura 31 )S- 410 1É CTRL isótipo e IFNy isótipo 8 e CTRL+ACTLA4 IFNy +ACTLA4 2 à CTRL+ALAG3 mB IFNVy+0LAG3 à 310, CTRLH-MT o IFNVHIMT º o = 3 e S2x100 Ít. | Fo o 2 o — Zz 5. 2 º ; do WX ; feição, 4 o 2-0 Feto DB E e h GaBOO ns. Ee 7 1" 13 16 Dias após injeção de ob . RRRROPRAEERRERTO 60 15

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| 1/30 Figura 1 a 1. Transduzir HSC de Camundongo = 2. Injetar em camundongos b HSC de Transdução com LV: Injetar em recipientes doador —> camundongos recipientes vv ss . Tee (O) pri-mir-126 V [o F—A—= 6 ED 14 —>

3. Desenvolvimento de uma Semanas de idade ] B-ALL transplantável (Ref. 14) J walEDy HI] Transplante — negão intavencea de 105 células ALL

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Figura 2 a b 15 + CTRL Camundongos IFN e I|FN Camundongos CTRL E jo Ô [o == 7 Ha 10 E 38 7 L Í as T+ + 2 is +0TI +0TI Injeção de 106 is 3 z cdi eee És LA 3 O Injeção intravenosa de T” 5 7 9 1 105 células OVA-ALL Dias após injeção de ALL c Medula Óssea 2 d [] nave — BN Memória Efetora 4x10iy E 4105 [EM memória Central ] * o 120, Meta Óssea Baço E 3x105- .º 3x108- = ] 1207 E; ” 5 100 00) É : r- go E É 2x10% 20 2 é SC [| oem EA $ % 3 Sep po ep po 3 1x105 Ss 1x108 9 8 oi E pe] 02234 E) * ENE BN BEST BR º * * + ã o e ó ç º o EE S e ô - vv SS vv O cs768/6 q SA C57BV6 E Fm FEM, EE FEET º f 100 — CTRL r Camundongos CTRLOUIFN 1, = CTRL + OT-! — = 80 NNE — Es Ls Estudo d 3 IFN + OT-| o 5 Sobreviáncia 8 4 em———— CX & o 1 je 4 ) metas occame E 19) | fios Ê h Injeção intravenosa de 220 prTmmmA TA! 105 células OVA-ALL ô o O 20 40 60 80 100 Dias após injeção de ALL CTRL + OT-| 9 Injeção OT IFN + OT-| C57B16 sem tumor + OT-| 150 150, 150 a.

Figura 3 a & CTRL vs. IFN ao b e CTRL+ALL T T araã a) i Orsa = gas fkStaTara É Gamb e IFN+ALL ; il 1 Lag3 ão o i xatto 1, ima: HoTda) ANIGSAO TOX2L 1%, 82 e C57BI66naive j USPIéS xao CRS oral, Em º = i itão Er66 e . a : Bstiéº 7 * oGzmm AfobiRa, CI2M4,GAMI | 5 : ra i iss TZ, SPbb| Od40/2Oxclf c2 ss 22 = 5 RSI N z go | ooo Mel fo NNE E. &e & 2 o : XCITOds o SA à geo ih SE ue o % Ê i KireteEE. tra? H2-K1 IN8r1 DS 1180ºº--28-S8-- 20 i Kiko" A * LIráS Gzmk se 5. o i : So ho ' clgak ANT ERAÇISW KO TT Ro CP. TA a RESESA Pr VW Baço Ea ESSO Fomes É eSs o : ” i 15 4d 05 o 0 1 15 2 + ” j i cast ML, Daxeols Es” o. i Naa asi ; É tamo Trafao NfZolieroTIrS, 16. 0515 o 40 i E Hit2o AXL 8 oh ek 2 Gbp2b i pigre 1 ro E, SS Fa io i Jakã * o e Kiel Cdes sê o ; ' fio oDdx58 A " oE 30 : i ES e REMoo : sãS oe % ' oE i E INE "Olga. — o, = i e i ret Se To 0.50 az o ope de 9%o. o ; Fi S 20 Ki : xa Cxer3 ão o A q 2 ii Ki ; o mer s S V * ese TO [als | 5 heome ge 10 ENA: EE) nd Mara

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Figura 5 a b Agrupadas em janela NGFR KCminP [PGRSOVA] de análise em células vivas individuais Células ALL-OVA .” r 16 élulas ALL- natas é Sã of EE hor e 1 =) PAO é “ -l a. pO RAÇA Sh = aj: 8 " & uu *" 2 bios à: FEAR LA 140.9) . 3 EOECIOS ERA Era dE NGFR CD19 CD19 FMO NGFR . SR o” e E E . se a E | or Oo o? Po “ o

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Figura 7 Agrupadas em a toa de análise Apoptóticas Tardias b em células vivas individuais Medula óssea Baço TETE SS Ls t 2.47 <S 120 * 1207 facas 4 SAR = | fee i 100 100- E vivas Eos j “ss E & "1 A E es í S, 80 80: EM Apoptóticas Precoces s VE Bl S o 60 [HR Apoptóticas Tardias CD Joc 1 &) o O. 8 40 40º [ Restos Necróticos 1 . h [CT alive E MNecróticos s 20 20) ME ço O |] 1834 110521 Do =. SE, BE o Laranja 7-AAD & CÊ &É CÊ d: e EEsT. d Medias em células individuais ledula óssea - Baço e] 31.7) |.-j69.8 194 eg 12 12 já, s6xM| 100 100: n.º o : : " < o 80 80- Z ij SL é») S eo 60. ms Al. ENS Ee »») Zz O S$-eM o 3 ie, MZ g 40 40. 2 * “1 MS o 20 20: É 18.7 [ro o DE OS NO MAO vv NV Laranja Hoechst E E &É ST Agrupadas em e à 1 f ; Ém câlutas Irdhaduais Medula óssea Baço recto ds Ea o” “Fes 412 3 50 EL $ 50 mm CEEE |. mo E u Z = <€ o SAS o A <l..] JE 3” 3 401 QB RSS E RL), À o : < 30 < 30) Bl E E Í Dol À : 8 8 o i EO 1 ES] À ” dao 3 20 3 20 .-« FE E E ” qu E) S | AAA A ENE los | LA 81 21 a EE a e Ne a mo TE EUEOS * , =: o FSC-A Laranja Edu-corante Í

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