TW201920255A - 核酸分子及其用途 - Google Patents

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彤瑤 劉
蘇珊娜 帕塔羅懷
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Abstract

本揭露提供核酸分子，其包含第一反向末端重複序列(ITR)、第二ITR、及編碼miRNA及/或治療性蛋白之遺傳卡匣。在某些實施例中，該治療性蛋白包含凝血因子，例如FVIII多肽、FIX多肽、或其片段。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒(AAV)之ITR。本揭露亦提供治療諸如血友病之流血性病症之方法，其包含向受試者投與該核酸分子或由此編碼之多肽。

Description

核酸分子及其用途
本發明係關於一種核酸分子。
基因療法治療多種疾病之持久手段。過去，基因療法通常依賴於病毒的使用。有許多病毒藥劑可以選擇用於此目的，其各自具有不同的性質，使得其或多或少地合適於基因療法。Zhou等人, Adv Drug Deliv Rev. 106(Pt A): 3-26, 2016。然而，一些病毒載體之不良性質，包括其免疫原性概況或其引起癌症之傾向，已經導致臨床安全性問題，且直到最近，限制其當前在臨床中用於某些應用，例如疫苗及溶瘤策略。Cotter等人, Front Biosci. 10:1098-105 (2005)。
腺相關病毒(AAV)為最常研究的基因療法載體之一。AAV為圍繞並保護約4.8千鹼基對(kb)之小的、單股DNA基因體的蛋白殼。Naso等人, BioDrugs, 31(4): 317-334, 2017。AAV屬於小病毒(parvovirus)科且依賴於與其他病毒(主要是腺病毒)之共同感染來複製。同上。 其單股基因體含有三個基因，Rep (複製)、Cap (殼體)、及aap (組裝)。同上 。這些編碼序列側接基因體複製及包裝所需的反向末端重複序列(inverted terminal repeat；ITR)。同上。 兩個順式作用AAV ITR之長度為約145個核苷酸，其具有間斷的迴文序列，該等迴文序列可折疊成T形髮夾結構，該等T形髮夾結構在DNA複製起始期間起引物的作用。
然而，使用習知AAV作為基因遞送載體已導致一些缺點。主要缺點之一與AAV之有限的約4.5 kb異源DNA之病毒包裝能力相關。(Dong等人, Hum Gene Ther. 7(17): 2101-12, 1996)。此外，AAV載體之投與可在人體中誘導免疫反應。儘管已顯示AAV比一些其他病毒(即，腺病毒)之免疫原性低，但是殼體蛋白可觸發人類免疫系統之各種組成部分。參見 Naso等人, 2017。AAV為人群中常見的病毒，且大多數人類已暴露於AAV，據此大多數人類已經產生針對其先前已暴露之特定變異體之免疫反應。此預先存在的適應反應可包括NAb及T細胞，其可降低後續再感染AAV之臨床功效及/或已轉導細胞之消除，從而使預先存在抗AAV免疫力之患者不適合於基於AVV之基因療法治療。無論是局部投與還是全身投與，病毒都將被視為外來蛋白，因此適應免疫系統將試圖消除它。此外，當藉由首次AAV治療未達成治療水準的功效時，AAV治療所誘導之抗AAV中和抗體阻礙藉由AAV之重複治療。此外，有證據表明T形髮夾環的AAV ITR易受結合AAV ITR之T形髮夾結構的宿主細胞蛋白/蛋白複合物的抑制。參見例如 ，Zhou等人,Scientific Reports 7 :5432 (2017年7月14日)。
因此，此項技術中需要在體外及體內情境中有效且持久地表現靶序列，例如治療性蛋白及/或miRNA，同時避免現有AAV載體技術之一些非預期的後果及限制。
本揭露之一個態樣係關於一種核酸分子，其包含第一反向末端重複序列(ITR)、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣(genetic cassette)；其中該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒(非AAV)之ITR，其中該遺傳卡匣定位於該第一ITR與該第二ITR之間，且其中該治療性蛋白包含凝血因子。在一些實施例中，該非AAV係選自由微小病毒(Parvoviridae )科病毒之成員及其任何組合組成之群。在一些實施例中，該第一ITR為非AAV之ITR，且該第二ITR為腺相關病毒(AAV)之ITR，或其中該第一ITR為AAV之ITR，且該第二ITR為非AAV之ITR。在其他實施例中，該第一ITR及該第二ITR為非AAV之ITR。在一些實施例中，該第一ITR及該第二ITR相同。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含不間斷的迴文序列。在其他實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含間斷的迴文序列。
在一些實施例中，該核酸分子中之該非AAV為微小病毒科病毒之成員。在一些實施例中，該微小病毒科之該成員係選自由以下組成之群：博卡病毒(Bocavirus )、依賴病毒(Dependovirus )、紅血球病毒(Erythrovirus )、阿留申病毒(Amdovirus )、小病毒、濃核病毒(Densovirus )、艾特拉病毒(Iteravirus )、康特拉病毒(Contravirus )、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒(Brevidensovirus )、肝胰濃核病毒(Hepandensovirus )、無脊椎對蝦濃核病毒(Penstyldensovirus )、及其任何組合。在一些實施例中，該微小病毒科病毒之該成員為紅血球病毒小病毒B19 (人類病毒)。在一些實施例中，該微小病毒科病毒之該成員為鴨源水禽小病毒(Muscovy duck parvovirus；MDPV)株。在一些實施例中，該MDPV株為減毒FZ91-30。在一些實施例中，該MDPV株為病原YY。仍然在一些實施例中，依賴小病毒(Dependoparvovirus )為依賴病毒鵝小病毒(Dependovirus Goose parvovirus；GPV)株。在一些實施例中，該GPV株為減毒82-0321V。在一些實施例中，該GPV株為病原B。在一些實施例中，該微小病毒科病毒之該成員係選自由以下組成之群：豬小病毒(U44978)、小鼠小病毒(mice minute virus) (U34256)、犬小病毒(M19296)、貂腸炎病毒(D00765)、及其任何組合。
在一些實施例中，該核酸分子進一步包含啟動子。在一些實施例中，該啟動子為組織特異性啟動子。在一些實施例中，該啟動子推動肝細胞、內皮細胞、肌細胞、竇狀細胞、或其任何組合中該治療性蛋白之表現。在一些實施例中，該啟動子定位於編碼該凝血因子之該核酸序列之5'方向。在一些實施例中，該啟動子係選自由以下所組成之群：小鼠thyretin啟動子(mTTR)、人類內源性因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、tristetraprolin (TTP)啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌凝蛋白重鏈α (αMHC)、肌紅蛋白(MB)、肌間線蛋白(DES)、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、tMCK、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、及其任何組合。在一些實施例中，該啟動子包含TTP啟動子。
在一些實施例中，該核酸分子進一步包含內含子序列。在一些實施例中，該內含子序列定位於編碼該凝血因子之該核酸序列之5'方向。在一些實施例中，該內含子序列定位於該啟動子之3'方向。在一些實施例中，其中該內含子序列包含合成內含子序列。在一些實施例中，該內含子序列包含SEQ ID NO: 115。
在一些實施例中，該核酸分子包含轉錄後調控元件。在一些實施例中，該轉錄後調控元件定位於編碼該凝血因子之該核酸序列之3'方向。在一些實施例中，該轉錄後調控元件包含經突變之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)、微小RNA結合位點、DNA核靶向序列、或其任何組合。在一些實施例中，該微小RNA結合位點包含至miR142-3p之結合位點。
在一些實施例中，該核酸分子包含3'UTR聚(A)尾序列。在一些實施例中，該3'UTR聚(A)尾序列係選自由以下組成之群：bGH聚(A)、肌動蛋白聚(A)、肌動蛋白聚(A)、及其任何組合。在一些實施例中，該3'UTR聚(A)尾序列包含bGH聚(A)。
在一些實施例中，該核酸分子包含強化子序列。在一些實施例中，該強化子序列定位於該第一ITR與該第二ITR之間。
在一些實施例中，該核酸分子以下列順序包含：該第一ITR、該遺傳卡匣、及該第二ITR；其中該遺傳卡匣包含組織特異性啟動子序列、內含子序列、編碼治療性蛋白(例如，凝血因子)之核酸序列或miRNA、轉錄後調控元件、及3'UTR聚(A)尾序列。
在一些實施例中，該核酸分子以下列順序包含：組織特異性啟動子序列、內含子序列、編碼FVIII多肽之該核酸序列、轉錄後調控元件、及3'UTR聚(A)尾序列。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 該第一ITR為微小病毒之非AAV家族成員之ITR； 　　(b) 該組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 該內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼治療性蛋白(例如，凝血因子)之核苷酸序列或miRNA； 　　(e) 該轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 該3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA；及 　　(g) 該第二ITR為微小病毒之非AAV家族成員之ITR。
在一些實施例中，該核酸分子包含單股核酸。在一些實施例中，該遺傳卡匣包含雙股核酸。
在一些實施例中，該核酸分子包含編碼治療性蛋白(例如，凝血因子)之基因，其中該凝血因子係由以下表現：肝細胞、內皮細胞、肌細胞、竇狀細胞、或其任何組合。在一些實施例中，該凝血因子包含因子I (FI)、因子II (FII)、因子V (FV)、因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII (FVIII)、溫韋伯氏因子(Von Willebrand factor；VWF)、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖網蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、胞漿素原、α2-抗胞漿素、組織胞漿素原活化劑(tPA)、尿激酶、胞漿素原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)、胞漿素原活化劑抑制劑-2 (PAI2)、或其任何組合。在一些實施例中，該凝血因子為FVIII。在一些實施例中，該FVIII包含全長成熟FVIII。在一些實施例中，該FVIII包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 106至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，該FVIII包含A1結構域、A2結構域、A3結構域、C1結構域、C2結構域、及部分B結構域或沒有B結構域。在一些實施例中，該FVIII包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 109至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，該凝血因子包含異源部分。在一些實施例中，該異源部分係選自由以下組成之群：白蛋白或其片段、免疫球蛋白Fc區、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單元之C端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、白蛋白結合部分、其衍生物、及其任何組合。在一些實施例中，該異源部分連接於該FVIII之N端或C端或插入於該FVIII中之兩個胺基酸之間。在一些實施例中，該異源部分係於選自表5中所列之插入位點的一或多個插入位點來插入於兩個胺基酸之間。在一些實施例中，該FVIII進一步包含A1結構域、A2結構域、C1結構域、C2結構域、視情況選用之B結構域、及異源部分，其中該異源部分經插入緊鄰對應於成熟FVIII (SEQ ID NO:106)之胺基酸745之下游。
在一些實施例中，該FVIII進一步包含FcRn結合搭配物。在一些實施例中，該FcRn結合搭配物包含免疫球蛋白恆定結構域之Fc區。在一些實施例中，編碼該FVIII之該核酸序列經密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼該FVIII之該核酸序列經密碼子最佳化以供在人類中表現。
在一些實施例中，編碼該FVIII之該核酸序列包含與核苷酸序列SEQ ID NO: 107至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該FVIII之該核酸序列包含與核苷酸序列SEQ ID NO: 71至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，該核酸分子係與遞送劑一起調配。在一些實施例中，該遞送劑包含一或多種脂質奈米粒子。在一些實施例中，該遞送劑係選自由以下組成之群：脂質體、非脂質聚合分子、胞內體、及其任何組合。
在一些實施例中，該核酸分子經調配以供靜脈內遞送、經皮遞送、皮內遞送、皮下遞送、肺部遞送、或口服遞送、或其任何組合。在一些實施例中，該核酸分子經調配以供靜脈內遞送。
在一些實施例中，本文提供一種載體，其包含如本揭露通篇所述之核酸分子。在一些實施例中，本文提供一種多肽，其由如本揭露通篇所述之核酸分子編碼。在一些實施例中，本文提供一種宿主細胞，其包含如本揭露通篇所述之核酸分子。
在一些實施例中，本文提供一種醫藥組成物，其包含：(a)如本文所述之核酸、包含如本揭露通篇所述之核酸分子之載體、由如本揭露通篇所述之核酸分子編碼之多肽、或包含如本揭露通篇所述之核酸分子之宿主細胞；(b) LNP；及(c)醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施例中，本文提供一種套組，其包含如本揭露通篇所述之核酸分子及用於向有需要之受試者投與該核酸分子的說明書。在一些實施例中，本文提供一種桿狀病毒系統，其用於產生本文所述之核酸分子。在一些實施例中，本文提供一種桿狀病毒系統，其中本文所揭示之核酸分子係於昆蟲細胞中產生。
在一些實施例中，本文提供一種表現構築體之奈米粒子遞送系統，其中該表現構築體包含本文所述之核酸分子。
本文亦揭示一種產生具有凝血活性之多肽之方法，其包含：在合適條件下培養本文所揭示之宿主細胞；及回收該具有凝血活性之多肽。在一些實施例中，本文揭示一種在有需要之受試者中表現凝血因子之方法，其包含向該受試者投與本文所揭示之核酸分子、本文所揭示之載體、本文所揭示之多肽、或本文所揭示之醫藥組成物。在一些實施例中，本文揭示一種治療患有凝血因子缺乏症之受試者之方法，其包含向該受試者投與本文所揭示之核酸分子、本文所揭示之載體、本文所揭示之多肽、或本文所揭示之醫藥組成物。在一些實施例中，該核酸分子係以以下方式投與：靜脈內、經皮、皮內、皮下、口服、肺部、或其任何組合。在一些實施例中，該核酸分子係靜脈內投與。在一些實施例中，該方法進一步包含向該受試者投與第二藥劑。在一些實施例中，受試者為哺乳動物。在一些實施例中，受試者為人類。
在一些實施例中，相對於該投與之前該受試者中之FVIII活性，向該核酸分子向該受試者之該投與導致增加的FVIII活性，其中該FVIII活性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、或至少約100倍。
在一些實施例中，受試者患有流血性病症。在一些實施例中，該流血性病症為血友病。在一些實施例中，流血性病症為A型血友病。
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本揭露描述質體樣核酸分子，其包含第一反向末端重複序列(ITR)、第二ITR、及編碼例如治療性蛋白或miRNA之遺傳卡匣，其中該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒之ITR (例如，該第一ITR及/或該第二ITR均來自非AAV)。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼治療性蛋白。在一些實施例中，治療性蛋白包含選自以下之蛋白：凝血因子、生長因子、激素、細胞介素、抗體、其片段、或其組合。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼X性聯肌縮蛋白(dystrophin X-linked)、MTM1 (肌管素(myotubularin))、酪胺酸羥化酶、AADC、環化水解酶(cyclohydrolase)、SMN1、FXN (frataxin)、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA (MPS I)、IDS (MPS II)、PAH、GAA (酸性α-葡萄糖苷酶)、或其任何組合。
在一些實施例中，治療性蛋白包含凝血因子。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FVIII或FIX蛋白。
在一些實施例中，遺傳卡匣編碼miRNA。在某些實施例中，miRNA下調選自SOD1、HTT、RHO、或其任何組合之靶基因之表現。
在某些實施例中，該非AAV係選自由微小病毒科病毒之成員及其任何組合組成之群。本揭露進一步關於在有需要之受試者中表現治療性蛋白例如凝血因子例如FVIII之方法，其包含向該受試者投與核酸分子，該核酸分子包含第一反向末端重複序列(ITR)、第二ITR、及編碼例如治療性蛋白或miRNA之遺傳卡匣，其中該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒(非AAV)之ITR。在某些實施例中，本揭露描述包含核苷酸序列之單離核酸分子，該核苷酸序列具有與選自SEQ ID NO: 113及120之核苷酸序列之序列同源性。
本揭露之示範性構築體在隨附圖式及序列表中說明。為對說明書及申請專利範圍提供清楚的理解，下文提供以下定義。 I. 定義
應注意，術語「一個(種)」實體係指一或多個(種)該實體，例如，「一個核苷酸序列」應理解為表示一或多個核苷酸序列。類似地，「一種治療性蛋白」及「一種miRNA」應理解為分別表示一或多種治療性蛋白及一或多種miRNA。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」、及「至少一個(種)」在本文可互換使用。
術語「約」在本文用於意謂近似、大致、大約、或在……左右。當術語「約」與數字範圍結合使用時，其藉由使邊界擴展高於及低於所陳述之數值來修飾該範圍。一般而言，術語「約」在本文藉由向上或向下(較高或較低)變化10%來修飾高於或低於所述值之數值。
亦如本文所用，「及/或」係指且涵蓋一或多個相關所列項目之任何及全部可能的組合，以及當在替代方案(「或」)中解釋時缺乏組合。
「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸」、「(一或多個)核苷酸序列」、及「多核苷酸」可互換使用且係指以單股形式或雙股螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷、或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷、或去氧胞苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯類似物諸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)及硫酯。單股核酸序列係指單股DNA (ssDNA)或單股RNA (ssRNA)。雙股DNA-DNA、DNA-RNA、及RNA-RNA螺旋為可能的。術語核酸分子且具體而言DNA或RNA分子僅指代分子之一級及二級結構，且不將其限於任何特定三級形式。因此，此術語包括在尤其是線性或環狀DNA分子(例如，限制片段)、質體、超旋扭DNA、及染色體中存在之雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子之結構時，序列可在本文根據正常慣例給出沿著DNA之非轉錄股(即，具有與mRNA同源之序列之股)在5'至3'方向方向上的序列來描述。「重組DNA分子」為經過分子生物學操縱的DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA、及半合成DNA。本揭露之「核酸組成物」包含一或多種如本文所述之核酸。
如本文所述，「反向末端重複序列」(或「ITR」)係指位於單股核酸序列之5'或3'末端的核酸序列，其包含一組核苷酸(初始序列)，之後下游為其反向補體，即迴文序列。初始序列與反向補體之間的核苷酸介入序列可為包括零之任何長度。在一個實施例中，實用於本揭露之ITR包含一或多個「迴文序列」。ITR可具有任何數量的功能。在一些實施例中，本文所述之ITR形成髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成T形髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成非T形髮夾結構，例如，U形髮夾結構。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞核中之長期存活。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞核中之永久存活(例如，就細胞之整個壽命而言)。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞核中之穩定性。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞核中之保留。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞核中之持久性。在一些實施例中，ITR抑制或預防核酸分子在細胞核中之降解。
在一個實施例中，初始序列及/或反向補體包含約2-600個核苷酸、約2-550個核苷酸、約2-500個核苷酸、約2-450個核苷酸、約2-400個核苷酸、約2-350個核苷酸、約2-300個核苷酸、或約2-250個核苷酸。在一些實施例中，初始序列及/或反向補體包含約5-600個核苷酸、約10-600個核苷酸、約15-600個核苷酸、約20-600個核苷酸、約25-600個核苷酸、約30-600個核苷酸、約35-600個核苷酸、約40-600個核苷酸、約45-600個核苷酸、約50-600個核苷酸、約60-600個核苷酸、約70-600個核苷酸、約80-600個核苷酸、約90-600個核苷酸、約100-600個核苷酸、約150-600個核苷酸、約200-600個核苷酸、約300-600個核苷酸、約350-600個核苷酸、約400-600個核苷酸、約450-600個核苷酸、約500-600個核苷酸、或約550-600個核苷酸。在一些實施例中，初始序列及/或反向補體包含約5-550個核苷酸、約5至500個核苷酸、約5-450個核苷酸、約5至400個核苷酸、約5-350個核苷酸、約5至300個核苷酸、或約5-250個核苷酸。在一些實施例中，初始序列及/或反向補體包含約10-550個核苷酸、約15-500個核苷酸、約20-450個核苷酸、約25-400個核苷酸、約30-350個核苷酸、約35-300個核苷酸、或約40-250個核苷酸。在某些實施例中，初始序列及/或反向補體包含約225個核苷酸、約250個核苷酸、約275個核苷酸、約300個核苷酸、約325個核苷酸、約350個核苷酸、約375個核苷酸、約400個核苷酸、約425個核苷酸、約450個核苷酸、約475個核苷酸、約500個核苷酸、約525個核苷酸、約550個核苷酸、約575個核苷酸、或約600個核苷酸。在特定實施例中，初始序列及/或反向補體包含約400個核苷酸。
在其他實施例中，初始序列及/或反向補體包含約2-200個核苷酸、約5-200個核苷酸、約10-200個核苷酸、約20-200個核苷酸、約30-200個核苷酸、約40-200個核苷酸、約50-200個核苷酸、約60-200個核苷酸、約70-200個核苷酸、約80-200個核苷酸、約90-200個核苷酸、約100-200個核苷酸、約125-200個核苷酸、約150-200個核苷酸、或約175-200個核苷酸。在其他實施例中，初始序列及/或反向補體包含約2-150個核苷酸、約5-150個核苷酸、約10-150個核苷酸、約20-150個核苷酸、約30-150個核苷酸、約40-150個核苷酸、約50-150個核苷酸、約75-150個核苷酸、約100-150個核苷酸、或約125-150個核苷酸。在其他實施例中，初始序列及/或反向補體包含約2-100個核苷酸、約5-100個核苷酸、約10-100個核苷酸、約20-100個核苷酸、約30-100個核苷酸、約40-100個核苷酸、約50-100個核苷酸、或約75-100個核苷酸。在其他實施例中，初始序列及/或反向補體包含約2-50個核苷酸、約10-50個核苷酸、約20-50個核苷酸、約30-50個核苷酸、約40-50個核苷酸、約3-30個核苷酸、約4-20個核苷酸、或約5-10個核苷酸。在另一實施例中，初始序列及/或反向補體由以下組成：2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸、或20個核苷酸。在其他實施例中，初始序列與反向補體之間的介入核苷酸為(例如，由以下組成)：0個核苷酸、1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸、或20個核苷酸。
因此，如本文所用之「ITR」可自身折疊且形成雙股區段。例如，序列GATCXXXXGATC當折疊以形成雙螺旋時包含初始序列GATC及其補體(3'CTAG5')。在一些實施例中，ITR在初始序列與反向補體之間包含連續的迴文序列(例如，GATCGATC)。在一些實施例中，ITR在初始序列與反向補體之間包含間斷的迴文序列(例如，GATCXXXXGATC)。在一些實施例中，連續或間斷的迴文序列之互補部份彼此相互作用以形成「髮夾環」結構。如本文所用，當單股核苷酸分子鹼基對上至少兩個互補序列形成雙股部份時，得到「髮夾環」結構。在一些實施例中，僅一部分ITR形成髮夾環。在其他實施例中，整個ITR形成髮夾環。
在本揭露中，至少一個ITR為非腺病毒相關病毒(非AAV)之ITR。在某些實施例中，ITR為微小病毒科病毒之非AAV成員之ITR。在一些實施例中，ITR為依賴病毒屬或紅血球病毒屬之非AAV成員之ITR。在特定實施例中，ITR為以下之ITR：鵝小病毒(GPV)、鴨源水禽小病毒(MDPV)、或紅血球病毒小病毒B19 (亦稱為小病毒B19、靈長類紅血球小病毒1 (primate erythroparvovirus 1)、B19病毒、及紅血球病毒)。在某些實施例中，兩個ITR中之一個ITR為AAV之ITR。在其他實施例中，構築體中兩個ITR中之一個ITR為選自以下之AAV血清型之ITR：血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、及其任何組合。在一個特定實施例中，ITR衍生自AAV血清型2，例如，AAV血清型2之ITR。
在本揭露之某些態樣中，核酸分子包含2個ITR，5' ITR及3' ITR，其中5' ITR位於核酸分子之5'端，且3' ITR位於核酸分子之3'端。5' ITR及3' ITR可衍生自相同病毒或不同病毒。在某些實施例中，5' ITR衍生自AAV病毒，且3' ITR不衍生自AAV病毒(例如，非AAV)。在一些實施例中，3' ITR衍生自AAV病毒，且5' ITR不衍生自AAV病毒(例如，非AAV)。在其他實施例中，5' ITR不 衍生自AAV病毒(例如，非AAV)，且3' ITR衍生自相同或不同的非AAV病毒。
如本文所用之術語「小病毒」涵蓋微小病毒科，包括但不限於自主複製小病毒及依賴病毒。自主性小病毒包括但不限於以下屬：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、及無脊椎對蝦濃核病毒。
示範性自主性小病毒包括但不限於豬小病毒、小鼠小病毒、犬小病毒、貂腸炎病毒、牛小病毒、雞小病毒、貓泛白細胞減少症病毒、貓小病毒、鵝小病毒、H1小病毒、鴨源水禽小病毒、蛇小病毒、及B19病毒。其他自主性小病毒為熟習此項技術者已知的。參見例如，FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。
如本文所用之術語「非AAV」涵蓋來自除微小病毒科之任何腺相關病毒(AAV)之外的微小病毒科之核酸、蛋白、及病毒。「非AAV」包括但不限於以下屬之自主複製成員：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、及無脊椎對蝦濃核病毒。
如本文所用，術語「腺相關病毒」(AAV)包括但不限於1型AAV、2型AAV、3型AAV (包括3A型及3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、山羊AAV、蝦AAV、Gao等人(J. Virol. 78:6381 (2004))及Moris等人(Virol. 33:375 (2004))所揭示之那些AAV血清型及分支群、及任何其他現在已知或後期發現的AAV。參見例如，FIELDS等人 VIROLOGY, 第2卷, 第69章(第4版, Lippincott-Raven Publishers)。
如本文所用之術語「衍生自」係指組分係單離自指定分子或有機體或該指定分子或有機體之資訊(例如，胺基酸序列或核酸序列)或者使用其製成。例如，一個核酸序列(例如，ITR)，衍生自第二核酸序列(例如，ITR)，可包括與該第二核酸序列之核苷酸序列一致或實質上類似的核苷酸序列。在核苷酸或多肽之情況下，衍生物種可藉由例如天然存在之誘變、人工定向誘變、或人工隨機誘變來獲得。用於衍生核苷酸或多肽之誘變可為有意定向或有意隨機的或各自之混合。誘變核苷酸或多肽以產生衍生自該第一核苷酸或多肽之不同核苷酸或多肽可為隨機事件(例如，由聚合酶失真(infidelity)引起)，且衍生核苷酸或多肽之識別可藉由例如如本文所述之適當篩選方法來進行。多肽的誘變通常需要操縱編碼多肽之多核苷酸。在一些實施例中，衍生自第二核苷酸或胺基酸序列之核苷酸或胺基酸序列具有與分別該第二核苷酸或胺基酸序列至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%之序列一致性，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。在其他實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR與該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)至少90%一致，其中該非AAV (或AAV) ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR與該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)至少80%一致，其中該非AAV (或AAV) ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR與該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)至少70%一致，其中該非AAV (或AAV) ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR與該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)至少60%一致，其中該非AAV (或AAV) ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR與該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)至少50%一致，其中該非AAV (或AAV) ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。
在某些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR包含該非AAV (或AAV)之ITR之片段或由其組成。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR包含非AAV (或AAV)之ITR之片段或由其組成，其中該片段包含至少約5個核苷酸、至少約10個核苷酸、至少約15個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約25個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約35個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約45個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約55個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約65個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約85個核苷酸、至少約90個核苷酸、至少約95個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約125個核苷酸、至少約150個核苷酸、至少約175個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約225個核苷酸、至少約250個核苷酸、至少約275個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約325個核苷酸、至少約350個核苷酸、至少約375個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約425個核苷酸、至少約450個核苷酸、至少約475個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約525個核苷酸、至少約550個核苷酸、至少約575個核苷酸、或至少約600個核苷酸；其中衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。在某些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR包含該非AAV (或AAV)之ITR之片段或由其組成，其中該片段包含至少約129個核苷酸，且其中衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。在某些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR包含該非AAV (或AAV)之ITR之片段或由其組成，其中該片段包含至少約102個核苷酸，且其中衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR保留該非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之功能性質。
在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR包含該非AAV (或AAV)之ITR之片段或由其組成，其中該片段佔非AAV (或AAV)之ITR之長度之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
在某些實施例中，衍生自第二核苷酸或胺基酸序列之核苷酸或胺基酸序列當恰當比對時具有與分別該第二核苷酸或胺基酸序列之同源部分至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%之序列一致性，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。在其他實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR當恰當比對時與非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之同源部分至少90%一致，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR當恰當比對時與非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之同源部分至少80%一致，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR當恰當比對時與非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之同源部分至少70%一致，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR當恰當比對時與非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之同源部分至少60%一致，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。在一些實施例中，衍生自非AAV (或AAV)之ITR的ITR當恰當比對時與非AAV ITR (或相應地AAV ITR)之同源部分至少50%一致，其中該第一核苷酸或胺基酸序列保留該第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。
「無殼體」或「少殼體」載體或核酸分子係指不含殼體之載體構築體。在一些實施例中，少殼體載體或核酸分子不含有編碼例如AAV Rep蛋白之序列。
如本文所用，「編碼區」或「編碼序列」為由可轉譯成胺基酸之密碼子組成之多核苷酸之一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA、或TAA)通常不轉譯成胺基酸，但其可被視為編碼區之一部分，不過任何側接序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、及其類似序列，不為編碼區之一部分。編碼區之邊界通常由在5'端之編碼所得多肽之胺基端的起始密碼子及在3'端之編碼所得多肽之羧基端之轉譯終止密碼子來確定。二或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構築體中，例如在單個載體上；或存在於獨立多核苷酸構築體中，例如在獨立(不同)載體上。單個載體又可僅含有單個編碼區，或包含二或更多個編碼區。
一旦生長中之蛋白鏈跨粗糙內質網之輸出已起始時，哺乳動物細胞所分泌的某些蛋白即與自成熟蛋白裂解之分泌信號肽締合。一般熟習此項技術者應明白，信號肽一般與多肽之N端融合，且自完整或「全長」多肽裂解以產生該多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然信號肽、或該序列之保留引導與其可操作地締合之多肽分泌之能力的功能性衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，例如人類組織纖維蛋白溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄醣醛酸酶信號肽，或其功能性衍生物。
術語「下游」係指核苷酸序列位於參考核苷酸序列之3'方向。在某些實施例中，下游核苷酸序列係關於在轉錄起始點之後之序列。例如，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點之下游。
術語「上游」係指核苷酸序列位於參考核苷酸序列之5'方向。在某些實施例中，上游核苷酸序列係關於位於編碼區或轉錄起始點之5'側之序列。例如，大多數啟動子位於轉錄起始位點之上游。
如本文所用，術語「基因調控區」或「調控區」係指位於編碼區之上游(5'非編碼序列)、內部、或下游(3'非編碼序列)，且影響所締合之編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性、或轉譯之核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點、及莖-環結構。若編碼區意欲在真核細胞中表現，則多腺苷酸化信號及轉錄終止序列將通常位於編碼序列之3'。
編碼基因產物(例如，miRNA)或產物(例如，多肽，諸如治療性蛋白)之多核苷酸可包括與一或多個編碼區可操作地締合之啟動子及/或其他表現(例如，轉錄或轉譯)控制元件。在一可操作締合中，基因產物(例如，多肽)之編碼區以將該基因產物之表現置於調控區之影響或控制下的方式與(一或多個)調控區締合。例如，若誘導啟動子功能引起編碼由編碼區編碼之基因產物之mRNA的轉錄，且若啟動子與編碼區之間之鍵聯的性質不干擾啟動子引導基因產物表現之能力或不干擾轉錄DNA模板之能力，則編碼區及啟動子係「可操作地締合」。除啟動子之外的其他表現控制元件，例如強化子、操縱子、阻遏子、及轉錄終止信號，亦可與編碼區可操作地締合以引導基因產物表現。
「轉錄控制序列」係指DNA調控序列，諸如啟動子、強化子、終止子、及其類似序列，其提供宿主細胞中編碼序列之表現。熟習此項技術者已知多個轉錄控制區。此等轉錄控制區包括但不限於，在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如但不限於，來自細胞巨大病毒(立即早期啟動子與內含子A之組合)、猿猴病毒40 (早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)之啟動子、及增強子區段。其他轉錄控制區包括源於脊椎動物基因，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白之彼等控制區，以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子，以及淋巴因子(lymphokine)誘導性啟動子(例如，可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地，一般熟習此項技術者已知多種轉譯控制元件。該等元件包括但不限於，核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及源自於細小核糖核酸病毒之元件(特別是內部核糖體進入位點，或IRES，又稱為CITE序列)。
如本文所用，術語「表現」係指多核苷酸藉以產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。其包括但不限於，多核苷酸轉錄成信使RNA (mRNA)、轉移RNA (tRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、或任何其他RNA產物，及mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸(例如，藉由基因轉錄產生之信使RNA)或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如多腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如甲基化、醣化、添加脂質、與其他蛋白次單元締合，或蛋白水解裂解)之多肽。如本文所使用，術語「產率」係指藉由基因之表現所產生之多肽之量。
「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何媒劑。載體可為可與另一核酸區段連接以使所連接區段複製之複製子。「複製子」係指在體內充當自主複製單元，即能夠在自身控制下複製之任何遺傳元件(例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於體外、離體、或體內將核酸引入細胞中之媒劑。此項技術中已知且使用之許多載體，包括例如質體、經修飾真核病毒、或經修飾細菌病毒。將多核苷酸插入合適載體中可藉由將適當多核苷酸片段連接至具有互補黏性末端之所選載體中來完成。
載體可經工程改造以編碼提供對已併有載體之細胞之選擇或識別的可選擇標記物或報導子。可選擇標記或報導子之表現允許識別及/或選擇併有且表現載體上含有之其他編碼區之宿主細胞。此項技術中已知且使用之可選擇標記基因之實例包括：提供對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺膦(bialaphos)除草劑、磺醯胺、及其類似物之抗性之基因；及用作表型標記之基因，即花青素調控基因、異戊基轉移酶基因、及其類似物。此項技術中已知且使用之報導子之實例包括：螢光素酶(luciferase；Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(galactosidase；LacZ)、β-葡糖醛酸酶(glucuronidase；Gus)、及其類似物。可選擇標記物亦可視為報導子。
如本文所用之術語「宿主細胞」係指例如微生物、酵母細胞、昆蟲細胞、及哺乳動物細胞，其可或已用作ssDNA之接受者或載體。該術語包括已轉導之原始細胞之子代。因此，如本文所用之「宿主細胞」一般係指已用外源性DNA序列轉導之細胞。應理解，由於天然、偶然、或有意突變，單個親本細胞之子代之形態或基因體或總DNA補體可不一定與原始親本完全相同。在一些實施例中，宿主細胞可為體外宿主細胞。
術語「可選擇標記物」係指能夠基於標記物基因之作用經選擇的識別因子，通常為抗生素或化學抗性基因，即，抗生素抗性、除草劑抗性、比色標記物、酶、螢光標記物、及其類似者，其中該作用係用於追蹤目標核酸之遺傳及/或識別已遺傳目標核酸之細胞或有機體。此項技術中已知且使用之可選擇標記基因之實例包括：提供對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺膦除草劑、磺醯胺、及其類似物之抗性之基因；及用作表型標記之基因，即花青素調控基因、異戊基轉移酶基因、及其類似物。
術語「報導子基因」係指編碼能夠基於報導子基因之作用經識別之識別因子的核酸，其中該作用係用於追蹤目標核酸之遺傳、識別已遺傳目標核酸之細胞或有機體、和/或測量基因表現誘導或轉錄。此項技術中已知且使用之報導子基因之實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸酶(Gus)、及其類似物。合適之標記物基因亦可視為報導子基因。
「啟動子」及「啟動子序列」可互換使用且係指能夠控制編碼序列或功能RNA之表現的DNA序列。一般而言，編碼序列位於啟動子序列之3'方向。啟動子可以整體形式衍生自天然基因，或由衍生自天然存在之不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成DNA片段。熟習此項技術者應理解，不同啟動子可引導基因在不同組織或細胞型中、或在不同發展階段、或回應於不同環境或生理條件之表現。使基因在大多數情況下在大多數細胞型中表現之啟動子通常稱為「組成型啟動子」。使基因在具體細胞型中表現之啟動子通常稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。使基因在發展或細胞分化之具體階段表現之啟動子通常稱為「發育特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。在用誘導啟動子之藥劑、生物分子、化學品、配位體、或其類似者暴露或處理細胞後誘導並使基因表現的啟動子通常被稱為「誘導性啟動子」或「可調控啟動子「。進一步認識到，由於在大多數情況下調控序列之確切邊界尚未完全界定，因此不同長度的DNA片段可能具有相同啟動子活性。
啟動子序列通常以其3'端轉錄其實位點為邊界且向上游(5'方向)延伸以包括在高於背景之可偵測水準下起始轉錄所必需的最少數目的鹼基或元件。在啟動子序列內將發現轉錄起始位點(例如藉由用核酸酶S1映射所便利地界定)，以及負責RNA聚合酶之結合的蛋白結合結構域(共通序列)。
在一些實施例中，核酸分子包含組織特異性啟動子。在某些實施例中，組織特異性啟動子推動治療性蛋白(例如，凝血因子)在肝(例如，在肝細胞及/或內皮細胞)中之表現。在特定實施例中，該啟動子係選自由以下所組成之群：小鼠thyretin啟動子(mTTR)、人類內源性因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、tristetraprolin (TTP)啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、及其任何組合。在一些實施例中，啟動子係選自肝特異性啟動子(例如，α1-抗胰蛋白酶(AAT))、肌肉特異性啟動子(例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、肌凝蛋白重鏈α (αMHC)、肌紅蛋白(MB)、及肌間線蛋白(DES))、合成啟動子(例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、及tMCK)及其任何組合。在一個特定實施例中，啟動子包含TTP 啟動子。
術語「限制內切核酸酶」和「限制酶」可互換使用且係指在雙股DNA內之具體核苷酸序列內結合及切割的酶。
術語「質體」係指染色體外元件，其常攜帶不為細胞之重要代謝之部分的基因，且通常呈環狀雙股DNA分子形式。此等元件可為衍生自任何來源之具有單股或雙股DNA或RNA之線性、環狀、或超螺旋自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體、或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已接合或重組成能夠將啟動子片段及所選基因產物之DNA序列連同適當3'未轉譯序列一起引入細胞中之獨特構築體。
可使用之真核病毒載體包括但不限於腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒(例如，牛痘病毒載體)、桿狀病毒載體、或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電荷脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白複合物、及生物聚合物。
「選殖載體」係指一種「複製子」，其為依序複製且包含複製起點的單位長度之核酸(諸如質體、噬菌體、或黏質體)，另一核酸區段可與其連接以達成所連接區段之複製。某些選殖載體能夠在一種細胞型(例如，細菌)中複製且在另一細胞類型(例如，真核細胞)中表現。選殖載體通常包含一或多種可用於選擇包含載體之細胞之序列及/或一或多個用於插入相關核酸序列之多選殖位點。
術語「表現載體」係指設計成使插入之核酸序列能夠在插入宿主細胞中之後表現之媒劑。插入之核酸序列係以與如上所述之調控區可操作締合之方式置放。
藉由此項技術中熟知之方法將載體引入宿主細胞中，該等方法例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉運體。如本文所用之「培養」意謂在允許細胞生長或分裂之活體外條件下培育細胞或意謂使細胞維持存活狀態。如本文所用之「培養細胞」意謂在活體外繁殖之細胞。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性聯結之單體(胺基酸)所組成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或超過兩個胺基酸之任何一或多條鏈，且不指代特定長度的產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白」、「胺基酸鏈」或用於表示具有兩個或超過兩個胺基酸之一或多個鏈之任何其他術語均包括在「多肽」之定義內且術語「多肽」可替代任何此等術語使用或可與任何此等術語互換使用。術語「多肽」亦意欲指代具有多肽之表現後修飾之產物，該等修飾不加限制地包括醣化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/阻隔基團達成之衍生化、蛋白水解裂解、或由非天然存在之胺基酸達成之修飾。多肽可衍生自天然生物來源或藉由重組技術產生，但未必自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成產生。
術語「胺基酸」包括丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(Ile或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)。非傳統胺基酸亦在本揭露之範疇內且包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸、及諸如Ellman等人 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)中所述者之其他胺基酸殘基類似物。為了產生此類非天然存在之胺基酸殘基，可使用Noren等人Science 244: 182 (1989)及Ellman等人, 同上之程序。簡言之，該等程序涉及用非天然存在之胺基酸殘基化學活化抑制因子tRNA，接著活體外轉錄及轉譯RNA。非傳統胺基酸之引入亦可使用此項技術中已知的肽化學方法達成。如本文所用，術語「極性胺基酸」包括淨電荷為零但在其側鏈之不同部分中具有部分非零電荷的胺基酸(例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。此等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。如本文所用，術語「帶電胺基酸」包括側鏈上具有非零淨電荷的胺基酸(例如，R、K、H、E、D)。此等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。
本揭露中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。術語「片段」或「變異體」在關於本揭露之多肽結合結構域或結合分子時包括保留參考多肽之至少一些性質(例如，對FcRn結合結構域或Fc變異體之FcRn結合親和力、FVIII變異體之凝血活性、或VWF片段之FVIII結合活性)之任何多肽。除在本文中其他地方論述之特定抗體片段之外，多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本揭露之多肽結合結構域或結合分子之變異體包括如上所述之片段以及胺基酸序列歸因於胺基酸取代、缺失、或插入而改變之多肽。變異體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術已知之誘變技術來產生。變異體多肽可包含保守或非保守胺基酸取代、缺失、或添加。
「保守胺基酸取代」為用具有相似側鏈之胺基酸殘基置換胺基酸殘基的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中加以定義，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸置換，則取代被視為保守性取代。在另一實施例中，可將一連串胺基酸用側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上相似的胺基酸串保守地置換。
如此項技術中已知之術語「一致性百分比」為二或更多個多肽序列或二或更多個多核苷酸序列之間的關係，如藉由比較序列所確定。在此項技術中，「一致性」亦意謂多肽或多核苷酸序列之間的序列相關程度，視情況而定，如藉由此類序列串之間的匹配所確定。「一致性」可藉由已知方法容易地計算，包括但不限於以下所述之方法：Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.編) Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W.編) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編) Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.編) Academic Press (1987)；及Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J.編) Stockton Press, New York (1991)。確定同一性之較佳方法經設計以給出測試序列之間的最佳匹配。確定身份之方法在公開可用之電腦程式中編碼。序列比對及一致性百分比計算可使用序列分析軟體進行，諸如LASERGENE生物資訊學計算套件之Megalign程式(DNASTAR Inc., Madison, WI)、GCG程式套件(Wisconsin Package 9.0版, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul等人,J. Mol. Biol. 215 :403 (1990))、及DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)。在本申請案之上下文中應理解，除非另外指定，否則在使用序列分析軟體進行分析時，分析結果將係基於所引用程式之「預設值」。如本文所用，「預設值」將意謂首次初始化時最初用軟體加載之值或參數之任何集合。出於確定本揭露之治療性蛋白(例如，凝血因子)序列與參考序列之間的一致性百分比之目的，僅使用參考序列中對應於本揭露之治療性蛋白(例如，凝血因子)序列之核苷酸計算一致性百分比。例如，當比較含有B結構域之全長FVIII核苷酸序列與本揭露之最佳化B結構域缺失(BDD) FVIII核苷酸序列時，使用包括A1、A2、A3、C1、及C2結構域之比對部分計算一致性百分比。編碼B結構域(其將導致比對中之大「間隙」)之全長FVIII序列之一部分中的核苷酸將不計為失配。此外，在確定本揭露之最佳化BDD FVIII序列或其經設計之部分(例如，SEQ ID NO:3之核苷酸58-2277及 2320-4374)與參考序列之間的一致性百分比時，藉由將匹配的核苷酸數除以如本文所述之最佳化BDD-FVIII序列(或其經設計之部分)之完整序列中之總核苷酸數來計算一致性百分比。
如本文所用，藉由比對本揭露之序列來識別對應於本揭露之特定序列中之核苷酸的核苷酸以使與參考序列之一致性最大。用於識別參考序列中之等效胺基酸之編號係基於用於識別本揭露之序列中之對應胺基酸之編號。
「融合」或「嵌合」蛋白包含第一胺基酸序列連接於在自然界中其未天然連接之第二胺基酸序列。通常存在於單獨蛋白中之胺基酸序列可集合在一起形成融合多肽，或通常存在於相同蛋白中之胺基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，該融合多肽例如為本揭露之因子VIII結構域與Ig Fc結構域之融合體。融合蛋白係例如藉由化學合成，或藉由產生並轉譯肽區以所要關係編碼之多核苷酸來產生。嵌合蛋白可進一步包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。
如本文所用，術語「插入位點」係指多肽或其片段、變異體、或衍生物中緊靠可插入異源部分之位置之上游的位置。將「插入位點」制定為數字，該數字為參考序列中之胺基酸數。例如，FVIII中之「插入位點」係指成熟天然FVIII ((SEQ ID NO: 15)中插入位點對應的胺基酸序列之編號，其緊靠插入位置之N端。例如，片語「a3在對應於SEQ ID NO: 15之胺基酸1656之插入位點包含異源部分」指示異源部分位於對應於SEQ ID NO: 15之胺基酸1656及胺基酸1657之兩個胺基酸之間。
如本文所用之片語「緊靠胺基酸之下游」係指緊接於胺基酸之末端羧基之位置。類似地，片語「緊靠胺基酸之上游」係指緊接於胺基酸之末端胺基之位置。
如本文所用，術語「插入」、「經插入」、「插入……中」、或語法相關術語係指相對於親本多肽中之類似位置，異源部分在多肽(例如，凝血因子)中之位置。例如，在某些實施例中，「插入」及其類似術語係指相對於天然成熟人類FVIII中之類似位置，異源部分在重組FVIII多肽中之位置。如本文所用，該等術語係指多肽之特徵，且不指示、暗示、或意指製備多肽之任何方法或過程。
如本文所用，術語「半衰期」係指特定多肽在體內之生物半衰期。半衰期可由自動物之循環及/或其他組織中清除向受試者投與量的一半所需的時間來表示。當構築既定多肽隨時間而變之清除曲線時，曲線通常為雙相的，即快速α相及較長β相。α相通常表示所投與Fc多肽於血管內與血管外空間之間的平衡，且部分地藉由多肽的大小來決定。β相通常表示多肽於血管內空間中的分解代謝。在一些實施例中，治療性蛋白(例如，凝血因子，例如FVIII)及包含其之嵌合蛋白為單相的，且因此不具有α相，而僅具有單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用，術語半衰期係指多肽在β相中之半衰期。
如本文所用之術語「連接」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價接合於第二胺基酸序列或核苷酸序列。第一胺基酸或核苷酸序列可直接接合或相鄰於第二胺基酸或核苷酸序列，或者介入序列可將第一序列共價接合於第二序列。術語「連接」不僅意謂第一胺基酸序列在C端或N端融合於第二胺基酸序列，而且亦包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或相應地第一胺基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列可藉由肽鍵或連接子連接於第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(用於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用於核苷酸鏈)或任何化學部分(用於多肽與多核苷酸鏈兩者)。術語「連接」亦藉由連字符(-)加以指示。
如本文所用，止血意謂停止或減緩流血或出血；或停止或減緩血液流過血管或身體部位。
如本文所用之止血障礙意謂特徵在於由於形成纖維蛋白凝塊之能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊而有自發出血或由於創傷而出血之傾向的基因遺傳性或獲得性病狀。此類病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏症)、B型血友病(因子IX缺乏症或「克雷司馬斯病(Christmas disease)」)、及C型血友病(因子XI缺乏症，輕微流血傾向)。其他止血障礙包括例如溫韋伯氏病；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X、或因子XIII缺乏症或結構異常；伯納德-蘇裡爾症候群(Bernard-Soulier syndrome)，其為一種GPIb缺陷症或缺乏症。vWF之受體GPIb可為有缺陷的且導致缺乏初級凝塊形成(初級止血)及流血傾向增加、以及格蘭茨曼(Glanzman)及內格利(Naegeli)血小板無力症(thrombasthenia)(格蘭茨曼血小板無力症)。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，由肝產生之凝血因子存在不足；此可增加流血風險。
可防治性地使用本揭露之經單離之核酸分子、經單離之多肽、或包含經單離之核酸分子之載體。如本文所用，術語「防治性治療」係指在流血事件之前投與分子。在一個實施例中，需要一般止血劑之受試者正經歷或即將經歷手術。本揭露之多核苷酸、多肽、或載體可在手術之前或之後作為防治劑投與。本揭露之多核苷酸、多肽、或載體可在手術期間或之後投與以控制急性流血事件。手術可包括但不限於肝移植、肝切除、牙齒手術、或幹細胞移植。
本揭露之經單離之核酸分子、經單離之多肽、或載體亦用於按需治療。術語「按需治療」係指回應於流血事件之症狀或在可引起流血之活動之前投與經單離之核酸分子、經單離之多肽、或載體。在一個態樣中，按需治療可在流血開始時(諸如在損傷之後)或在預期會流血時(諸如在手術之前)給予受試者。在另一態樣中，按需治療可在增加流血風險之活動(諸如接觸性運動)之前給予。
如本文所用，術語「急性流血」係指無論潛伏原因如何之流血事件。例如，受試者可具有創傷、尿毒症、遺傳性流血性病症(例如因子VII缺乏症)、血小板病症、或由於產生針對凝血因子之抗體而具有抗性。
如本文所用之治療係指例如減輕疾病或病狀之嚴重性；降低疾病病程之持續時間；改善與疾病或病狀相關之一或多種症狀；向患有疾病或病狀之受試者提供有益效應，未必治癒該疾病或病狀；或防治與疾病或病狀相關之一或多種症狀。在一個實施例中，術語「治療(treating/treatment)」意謂藉由投與本揭露之經單離之核酸分子、經單離之多肽、或載體來使受試者中之例如FVIII谷底水準維持在至少約1 IU/dL、2 IU/dL、3 IU/dL、4 IU/dL、5 IU/dL、6 IU/dL、7 IU/dL、8 IU/dL、9 IU/dL、10 IU/dL、11 IU/dL、12 IU/dL、13 IU/dL、14 IU/dL、15 IU/dL、16 IU/dL、17 IU/dL、18 IU/dL、19 IU/dL、20 IU/dL、25 IU/dL、30 IU/dL、35 IU/dL、40 IU/dL、45 IU/dL、50 IU/dL、55 IU/dL、60 IU/dL、65 IU/dL、70 IU/dL、75 IU/dL、80 IU/dL、85 IU/dL、90 IU/dL、95 IU/dL、100 IU/dL、105 IU/dL、110 IU/dL、115 IU/dL、120 IU/dL、125 IU/dL、130 IU/dL、135 IU/dL、140 IU/dL、145 IU/dL、或150 IU/dL。在另一實施例中，治療意謂使FVIII谷底水準維持在以下之間：約1與約150 IU/dL、約1與約125 IU/dL、約1與約100 IU/dL、約1與約90 IU/dL、約1與約85 IU/dL、約1與約80 IU/dL、約1與約75 IU/dL、約1與約70 IU/dL、約1與約65 IU/dL、約1與約60 IU/dL、約1與約55 IU/dL、約1與約50 IU/dL、約1與約45 IU/dL、約1與約40 IU/dL、約1與約35 IU/dL、約1與約30 IU/dL、約1與約25 IU/dL、約25與約125 IU/dL、約50與約100 IU/dL、約50與約75 IU/dL、約75與約100 IU/dL、約1與約20 IU/dL、約2與約20 IU/dL、約3與約20 IU/dL、約4與約20 IU/dL、約5與約20 IU/dL、約6與約20 IU/dL、約7與約20 IU/dL、約8與約20 IU/dL、約9與約20 IU/dL、或約10與約20 IU/dL。治療疾病或病狀亦可包括使受試者中之FVIII活性維持在與非血友病受試者中FVIII活性之至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、或150%相當的水準。治療所需之最小谷底水準可藉由一或多種已知方法測量且可針對每個人加以調整(增加或減少)。
如本文所用，「投與」意謂經由醫藥上可接受之途徑給予本揭露之醫藥上可接受之核酸分子、自其表現之多肽、或包含該核酸分子之載體。投與途徑可為靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注。其他投與途徑包括例如皮下、肌肉內、經口、經鼻及肺部投與。核酸分子、多肽、及載體可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組成物之一部分投與。
如本文所用之術語「醫藥上可接受之」係指分子實體及組成物為醫藥上可耐受的且當向人類投與時通常不產生毒性或過敏性或類似事與願違的反應，諸如胃部不適、暈眩、及其類似反應。視情況，如本文所用，術語「醫藥學上可接受之」意謂由聯邦政府或州政府之管理機構核準或列於美國藥典或其他通常認可之藥典中以在動物中，且更特定言之在人類中使用。
如本文所用，片語「有需要之受試者」包括將受益於投與本揭露之核酸分子、多肽、或載體例如以改善止血的受試者，諸如哺乳動物。在一個實施例中，受試者包括但不限於具有血友病之個體。在另一實施例中，受試者包括但不限於已產生對治療性蛋白(例如，凝血因子，例如FVIII)之抑制劑且因此需要繞過療法的個體。受試者可為成人或未成年人(例如，12歲以下)。
如本文所用，術語「治療性蛋白」係指此項技術中已知可向受試者投與的任何多肽。在一些實施例中，治療性蛋白包含選自以下之蛋白：凝血因子、生長因子、抗體、其功能片段、或其組合。如本文所用，術語「凝血因子」係指天然存在或重組產生之預防或受試者之流血事件或減少其持續時間的分子或其類似物。換言之，其意謂具有促凝血活性，即負責將纖維蛋白原轉化成不溶性纖維蛋白網使血液凝固或凝結的分子。如本文所用之「凝血因子」包括活化凝血因子、其酶原、或可活化凝血因子。「可活化凝血因子」為以非活化形式(例如，以其酶原形式)能夠轉化成活化形式的凝血因子。術語「凝血因子」包括但不限於因子I (FI)、因子II (FII)、因子V (FV)、FVII、FVIII、FIX、因子X (FX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、溫韋伯氏因子 (VWF)、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖網蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、胞漿素原、α2-抗胞漿素、組織胞漿素原活化劑(tPA)、尿激酶、胞漿素原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)、胞漿素原活化劑抑制劑-2 (PAI2)、其酶原、其活化形式、或其任何組合。
如本文所用，凝血活性意指參與一系列生化反應，最終形成纖維蛋白凝塊及/或減小出血或流血事件之嚴重性、持續時間、或頻率的能力。
如本文所用，「生長因子」包括此項技術中已知的任何生長因子，包括細胞介素及激素。在一些實施例中，生長因子係選自腎上腺髓素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌移動因子、骨成形性蛋白(BMP) (例如，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7)、睫狀神經滋養因子家族成員(例如，睫狀神經滋養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、介白素-6 (IL-6))、群落刺激因子(例如，巨噬細胞群落刺激因子(m-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF))、表皮生長因子(EGF)、ephrin (例如，ephrin A1、ephrin A2、ephrin A3、ephrin A4、ephrin A5、ephrin B1、ephrin B2、ephrin B3)、紅血球生成素(EPO)、纖維母細胞生長因子(FGF) (例如，FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23)、胎牛生長激素(FBS)、GDNF家族成員(例如，膠細胞株衍生神經滋養因子(GDNF)、neurturin、persephin、artemin)、生長分化因子-9 (GDF9)、肝細胞生長因子(HGF)、肝腫瘤衍生生長因子(HDGF)、胰島素、胰島素樣生長因子(例如，胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)或IGF-2、介白素(IL) (例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7)、角質細胞生長因子(KGF)、遷移刺激因子(MSF)、巨噬細胞刺激蛋白(MSP或肝細胞生長因子樣蛋白(HGFLP))、myostatin (GDF-8)、神經調節素(例如，神經調節素1 (NRG1)、NRG2、NRG3、NRG4)、神經滋養素(例如，腦衍生神經滋養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經滋養素-3 (NT-3)、NT-4、胎盤生長因子(PGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、腎胺酶(RNLS)、T細胞生長因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、轉形生長因子(例如，轉形生長因子α (TGF-α)、TGF-β、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、及血管內皮生長因子(VEGF)。
在一些實施例中，治療性蛋白係藉由選自以下之基因編碼：X性聯肌縮蛋白、MTM1 (肌管素)、酪胺酸羥化酶、AADC、環化水解酶、SMN1、FXN (frataxin)、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA (MPS I)、IDS (MPS II)、PAH、GAA (酸性α-葡萄糖苷酶)、或其任何組合。
如本文所用，術語「異源性」或「外源性」係指在給定情況下例如在細胞或多肽中通常不存在的分子。例如，外源性或異源性分子可被引入細胞中且僅在例如藉由轉染或其他形式的遺傳工程操縱細胞之後存在，或者異源性胺基酸序列可存在於非天然存在的蛋白中。
如本文所用，術語「異源核苷酸序列」係指不與給定多核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。在一個實施例中，異源核苷酸序列編碼能夠延長治療性蛋白(例如，凝血因子，例如FVIII)之半衰期的多肽。在另一實施例中，異源核苷酸序列編碼增加治療性蛋白(例如，凝血因子，例如FVIII)之流體動力學半徑的多肽。在其他實施例中，異源核苷酸序列編碼改善治療性蛋白之一或多個藥物動力學性質而不顯著影響其生物活性或功能(例如，促凝血活性)。在一些實施例中，治療性蛋白藉由連接子連接於異源核苷酸序列所編碼之多肽。異源核苷酸序列所編碼之多肽部分之非限制性實例包括免疫球蛋白恆定區或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、運鐵蛋白、美國專利申請案第20100292130號之PAS多肽、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單元之C端肽(CTP)、白蛋白結合小分子、XTEN序列、FcRn結合部分(例如，結合FcRn之完整Fc區或其部分)、單鏈Fc區(ScFc區，例如，如US 2008/0260738、WO 2008/012543、或WO 2008/1439545中所述)、聚甘胺酸連接子、聚絲胺酸連接子、具有小於50%至大於50%之不同程度的二級結構之選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之兩種類型胺基酸之6-40個胺基酸之肽及短多肽等、或其二或更多個組合。在一些實施例中，異源核苷酸序列所編碼之多肽連接於非多肽部分。非多肽部分之非限制性實例包括聚乙二醇(PEG)、白蛋白結合小分子、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。
如本文所用，術語「Fc區」定義為多肽中對應於天然Ig之Fc區的部分，即如藉由其兩個重鏈之各別Fc域之二聚締合所形成。天然Fc區與另一Fc區形成均二聚體。相反，如本文所用之術語「遺傳融合Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指合成二聚Fc區，其包含在單一多肽鏈內遺傳連接之Fc結構域(即，在單一鄰接遺傳序列中編碼)。
在一個實施例中，「Fc區」係指單一Ig重鏈之一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶裂解位點(即IgG中之殘基216，將重鏈恆定區之第一殘基看作114)上游之鉸鏈區中開始且在抗體之C端處結束。據此，完全Fc結構域至少包含鉸鏈結構域、CH2結構域、及CH3結構域。
視Ig同型而定，Ig恆定區之Fc區可包括CH2、CH3、及CH4結構域以及鉸鏈區。包含Ig之Fc區之嵌合蛋白對嵌合蛋白賦予若干合乎需要之性質，包括增強之穩定性、增加之血清半衰期(參見Capon等人, 1989,Nature 337:525)以及結合至Fc受體，諸如新生兒Fc受體(FcRn)(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，其以全文引用的方式併入本文。
當在本文用作與本揭露之核苷酸序列之比較時，「參考核苷酸序列」為與本揭露之核苷酸序列基本上一致的多核苷酸序列，除序列未經最佳化之外。例如，由SEQ ID NO: 1之密碼子最佳化BDD FVIII及編碼在3'末端連接於SEQ ID NO: 1之單鏈Fc區之異源核苷酸序列組成的核酸分子之參考核苷酸序列為由SEQ ID NO: 16之原始(或親本) BDD FVIII及編碼在3'末端連接於SEQ ID NO: 16之單鏈Fc區之相同異源核苷酸序列組成的核酸分子。
如本文所用，關於核苷酸序列之術語「最佳化」係指多核苷酸序列編碼多肽，其中該多核苷酸序列已突變以增強該多核苷酸序列之性質。在一些實施例中，進行最佳化以增加轉錄水準，增加轉譯水準，增加穩態mRNA水準，增加或減小諸如通用轉錄因子之調控蛋白之結合，增加或減小剪接，或增加多核苷酸序列所產生之多肽之產率。可對多核苷酸序列進行以使其最佳化的變化之實例包括密碼子最佳化、G/C含量最佳化、移除重複序列、移除富含AT之元件、移除隱蔽剪接位點、移除抑制轉錄或轉譯之順式作用元件、添加或移除聚T或聚A序列、在轉錄起始位點周圍添加增強轉錄的序列(諸如Kozak共通序列)、移除可形成莖環架構的序列、移除去穩定化序列、及其二或更多種組合。 II. 核酸分子
本揭露係關於一種質體樣、無殼體核酸分子，其編碼治療性蛋白或可調節靶蛋白之表現的基因。殼體，病毒之蛋白殼，包裹著病毒之遺傳物質。已知殼體藉由保護病毒基因體，將基因體遞送至宿主，及與宿主相互作用來輔助病毒粒子之功能。儘管如此，病毒殼體可為限制載體之包裝能力及/或誘導免疫反應之因素，尤其是當用於基因療法時。
AAV載體已成為基因療法載體之更常見類型之一。然而，殼體之存在限制AAV載體在基因療法中之效用。具體而言，殼體本身可限制載體中所包括之轉殖基因之大小低至小於4.5 kb。即使在添加調控元件之前，可實用於基因療法之各種治療性蛋白也可容易地超過此大小。
此外，構成殼體之蛋白可用作受試者免疫系統靶向的抗原。AAV在一般群體中非常常見，大多數人一生都暴露於AAV。因此，大多數潛在的基因療法接受者可能已經對AAV產生免疫反應，因此更可能拒絕該療法。
本揭露之某些態樣旨在克服AAV載體之此等缺陷。具體而言，本揭露之某些態樣係關於一種核酸分子，其包含第一ITR、第二ITR、及編碼例如治療性蛋白及/或miRNA之遺傳卡匣。在一些實施例中，核酸分子不包含編碼殼體蛋白、複製蛋白、及/或組裝蛋白之基因。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼治療性蛋白。在一些實施例中，治療性蛋白包含凝血因子。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼miRNA。在某些實施例中，遺傳卡匣定位於該第一ITR與該第二ITR之間。在一些實施例中，核酸分子進一步包含一或多個非編碼區。在某些實施例中，該一或多個非編碼區包含啟動子序列、內含子、轉錄後調控元件、3'UTR聚(A)序列、或其任何組合。
在一個實施例中，遺傳卡匣為單股核酸。在另一實施例中，遺傳卡匣為雙股核酸。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼miRNA或治療性蛋白例如凝血因子之核苷酸； 　　(e) 轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA； 　　(g) 第二ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼miRNA之核苷酸，其中該miRNA下調選自SOD1、HTT、RHO、及其任何組合之靶基因之表現； 　　(e) 轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA； 　　(g) 第二ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼以下之核苷酸：X性聯肌縮蛋白、MTM1 (肌管素)、酪胺酸羥化酶、AADC、環化水解酶、SMN1、FXN (frataxin)、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA (MPS I)、IDS (MPS II)、PAH、GAA (酸性α-葡萄糖苷酶)、或其任何組合； 　　(e) 轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA； 　　(g) 第二ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR，其為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼FVIII之核苷酸；其中該核苷酸具有與選自SEQ ID NO: 1-14或SEQ ID NO: 71之核苷酸序列至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，其中該核苷酸所編碼之FVIII保留FVIII活性； 　　(e) 轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA；及 　　(g) 第二ITR，其為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR，其為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼miRNA之核苷酸，其中該miRNA下調例如SOD1、HTT、RHO、及其任何組合之靶基因之表現； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA；及 　　(g) 第二ITR，其為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體。
在一個實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR，其為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼以下之核苷酸：X性聯肌縮蛋白、MTM1 (肌管素)、酪胺酸羥化酶、AADC、環化水解酶、SMN1、FXN (frataxin)、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA (MPS I)、IDS (MPS II)、PAH、GAA (酸性α-葡萄糖苷酶)、或其任何組合； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA；及 　　(g) 第二ITR，其為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體。
在另一實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，例如，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼miRNA或治療性蛋白例如凝血因子之核苷酸； 　　(e) 轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA；及 　　(g) 第二ITR， 　　其中該第一ITR或該第二ITR之一為微小病毒之非AAV家族成員之ITR，且另一ITR為AAV之ITR，例如AAV血清型2基因體。
在另一實施例中，核酸分子包含： 　　(a) 第一ITR； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，TTP啟動子； 　　(c) 內含子，例如，合成內含子； 　　(d) 編碼miRNA或治療性蛋白例如凝血因子之核苷酸； 　　(e) 轉錄後調控元件，例如，WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，例如，bGHpA；及 　　(g) 第二ITR， 　　其中該第一ITR為合成ITR，該第二ITR為合成ITR，或該第一ITR及該第二ITR兩者均為合成ITR。 A. 反向末端重複序列
本揭露之某些態樣係關於一種核酸分子，其包含第一ITR，例如5' ITR，及第二ITR，例如3' ITR。通常，ITR涉及自原核生物質體之小病毒(例如，AAV) DNA複製及拯救(或切除) (Samulski等人, 1983, 1987；Senapathy等人, 1984；Gottlieb及Muzyczka, 1988)。此外，ITR似乎為AAV前病毒整合及AAV DNA包裝成病毒粒子所需的最小序列(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989)。此等元件為小病毒基因體之有效增殖所必需的。假設ITR功能必不可少的最小界定元件為Rep結合位點(例如，RBS；GCGCGCTCGCTCGCTC (SEQ ID NO: 104)，AAV2)及末端拆分位點(例如，TRS；AGTTGG (SEQ ID NO: 105)，對於AAV2)加實現髮夾形成的可變回文序列。回文核苷酸區通常以順式呈DNA複製起點及呈病毒之包裝信號一起起作用。在DNA複製期間，ITR中之互補序列折疊成髮夾結構。在一些實施例中，ITR折疊成T形髮夾結構。在其他實施例中，ITR折疊成非T形髮夾結構，例如U形髮夾結構。資料表明，AAV ITR之T形髮夾結構可抑制ITR所側接之轉殖基因之表現。參見例如 ，Zhou等人,Scientific Reports 7 :5432 (2017年7月14日)。藉由利用不形成T形髮夾結構的ITR，可避免這種形式的抑制。因此，在某些態樣中，與包含形成T形髮夾的AAV ITR的多核苷酸相比，包含非AAV ITR的多核苷酸具有改善的轉殖基因表現。
在一些實施例中，ITR包含天然存在之ITR，例如ITR包含全部或一部分小病毒ITR。在一些實施例中，ITR包含合成序列。在一個實施例中，該第一ITR或該第二ITR包含合成序列。在另一實施例中，該第一ITR及該第二ITR之各者包含合成序列。在一些實施例中，該第一ITR或該第二ITR包含天然存在之序列。在另一實施例中，該第一ITR及該第二ITR之各者包含天然存在之序列。
在一些實施例中，ITR包含一部分天然存在之ITR，例如截短ITR，或由其組成。在一些實施例中，ITR包含天然存在之ITR之片段或由其組成，其中該片段包含至少約5個核苷酸、至少約10個核苷酸、至少約15個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約25個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約35個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約45個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約55個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約65個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約85個核苷酸、至少約90個核苷酸、至少約95個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約125個核苷酸、至少約150個核苷酸、至少約175個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約225個核苷酸、至少約250個核苷酸、至少約275個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約325個核苷酸、至少約350個核苷酸、至少約375個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約425個核苷酸、至少約450個核苷酸、至少約475個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約525個核苷酸、至少約550個核苷酸、至少約575個核苷酸、或至少約600個核苷酸；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在某些實施例中，ITR包含天然存在之ITR之片段或由其組成，其中該片段包含至少約129個核苷酸；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在某些實施例中，ITR包含天然存在之ITR之片段或由其組成，其中該片段包含至少約102個核苷酸；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。
在一些實施例中，ITR包含一部分天然存在之ITR或由其組成，其中該片段佔天然存在之ITR之長度之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%；其中該片段保留天然存在之ITR之功能性質。
在某些實施例中，ITR包含當恰當比對時具有與天然存在之ITR之同源部分至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%之序列一致性的序列或由其組成；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在其他實施例中，ITR包含當恰當比對時具有與天然存在之ITR之同源部分知識90%之序列一致性的序列或由其組成；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在一些實施例中，ITR包含當恰當比對時具有與天然存在之ITR之同源部分知識80%之序列一致性的序列或由其組成；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在一些實施例中，ITR包含當恰當比對時具有與天然存在之ITR之同源部分知識70%之序列一致性的序列或由其組成；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在一些實施例中，ITR包含當恰當比對時具有與天然存在之ITR之同源部分知識60%之序列一致性的序列或由其組成；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。在一些實施例中，ITR包含當恰當比對時具有與天然存在之ITR之同源部分知識50%之序列一致性的序列或由其組成；其中該ITR保留天然存在之ITR之功能性質。
在一些實施例中，ITR包含來自AAV基因體之ITR。在一些實施例中，ITR為選自以下之AAV基因體之ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、及其任何組合。在一特定實施例中，ITR為AAV2基因體之ITR。在另一實施例中，ITR為經遺傳工程改造以在其5'及3'末端包括衍生自AAV基因體之一或多者之ITR的合成序列。
在一些實施例中，ITR不衍生自AAV基因體。在一些實施例中，ITR為非AAV之ITR。在一些實施例中，ITR為來自微小病毒科病毒之非AAV基因體，該微小病毒科病毒選自但不限於由以下組成之群：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、無脊椎對蝦濃核病毒、及其任何組合。在某些實施例中，ITR衍生自紅血球病毒小病毒B19 (人類病毒)。在另一實施例中，ITR衍生自鴨源水禽小病毒(MDPV)株。在某些實施例中，MDPV株為減毒的，例如MDPV株FZ91-30。在其他實施例中，MDPV株為病原性的，例如MDPV株YY。在一些實施例中，ITR衍生自豬小病毒，例如豬小病毒U44978。在一些實施例中，ITR衍生自小鼠小病毒，例如小鼠小病毒U34256。在一些實施例中，ITR衍生自犬小病毒，例如犬小病毒M19296。在一些實施例中，ITR衍生自貂腸炎病毒，例如貂腸炎病毒D00765。在一些實施例中，ITR衍生自依賴小病毒。在一個實施例中，依賴小病毒為依賴病毒鵝小病毒(GPV)株。在一具體實施例中，GPV株為減毒的，例如GPV株82-0321V。在另一具體實施例中，GPV株為病原性的，例如GPV株B。
核酸分子之該第一ITR及該第二ITR可衍生自相同基因體，例如相同病毒之基因體，或衍生自不同基因體，例如二或更多種不同病毒基因體之基因體。在某些實施例中，該第一ITR及該第二ITR衍生自相同AAV基因體。在一具體實施例中，本發明之核酸分子中存在之兩種ITR相同且可特別為AAV2 ITR。在其他實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR不衍生自AAV基因體(例如，非AAV基因體)。在其他實施例中，該第一ITR不衍生自AAV基因體(例如，非AAV基因體)，且該第二ITR衍生自AAV基因體。在其他實施例中，該第一ITR及該第二ITR兩者均不衍生自AAV基因體(例如，非AAV基因體)。在一個特定實施例中，該第一ITR及該第二ITR相同。
在一些實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自選自由以下組成之群之基因體：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、無脊椎對蝦濃核病毒、及其任何組合。在其他實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自選自由以下組成之群之基因體：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、無脊椎對蝦濃核病毒、及其任何組合。在其他實施例中，該第一ITR及該第二ITR衍生自選自由以下組成之群之基因體：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、無脊椎對蝦濃核病毒、及其任何組合，其中該第一ITR及該第二ITR衍生自相同基因體。在其他實施例中，該第一ITR及該第二ITR衍生自選自由以下組成之群之基因體：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、無脊椎對蝦濃核病毒、及其任何組合，其中該第一ITR及該第二ITR衍生自不同基因體。
在一些實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自紅血球病毒小病毒B19 (人類病毒)。在其他實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自紅血球病毒小病毒B19 (人類病毒)。
在某些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含全部或一部分衍生自B19之ITR或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含與選自SEQ ID NO: 167、168、169、170、及171之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致之核苷酸序列或由其組成，其中該第一ITR及/或該第二ITR保留衍生其之B19 ITR之功能性質。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含與選自SEQ ID NO: 167、168、169、170、及171之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致之核苷酸序列或由其組成，其中該第一ITR及/或該第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含選自SEQ ID NO: 167、168、169、170、及171之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 167中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 168中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 169中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 170中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 171中所述之核苷酸序列或由其組成。表 1. 樣本小病毒ITR序列。
在某些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含一核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 169中所述之最小核苷酸序列，且其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 167中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致，保留衍生其之B19 ITR之功能性質。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含一核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 169中所述之最小核苷酸序列，且其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 167中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致，其中該第一ITR及/或該第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在一些實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自GPV。在其他實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自GPV。
在某些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含全部或一部分衍生自GPV之ITR或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含與選自SEQ ID NO: 172、173、174、175、及176之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致之核苷酸序列或由其組成，其中該第一ITR及/或該第二ITR保留衍生其之GPV ITR之功能性質。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含全部或一部分衍生自GPV之ITR或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含與選自SEQ ID NO: 172、173、174、175、及176之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致之核苷酸序列或由其組成，其中該第一ITR及/或該第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含選自SEQ ID NO: 172、173、174、175、及176之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 172中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 173中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 174中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 175中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 176中所述之核苷酸序列或由其組成。
在某些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含一核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 174中所述之最小核苷酸序列，且其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 172中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致，其中該第一ITR及/或該第二ITR保留衍生其之GPV ITR之功能性質。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含一核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 174中所述之最小核苷酸序列，且其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 172中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致，其中該第一ITR及/或該第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在某些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含一核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 176中所述之最小核苷酸序列，且其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 172中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致，其中該第一ITR及/或該第二ITR保留衍生其之GPV ITR之功能性質。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含一核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 176中所述之最小核苷酸序列，且其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 172中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致，其中該第一ITR及/或該第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在某些實施例中，該第一ITR或該第二ITR之一包含全部或一部分衍生自AAV2之ITR或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR或該第二ITR包含與SEQ ID NO: 177或178中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致之核苷酸序列或由其組成，其中該第一ITR及/或該第二ITR保留衍生其之AAV2 ITR之功能性質。在一些實施例中，該第一ITR或該第二ITR包含與SEQ ID NO: 177或178中所述之核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致之核苷酸序列或由其組成，其中該第一ITR及/或該第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 177或178中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 177中所述之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR包含SEQ ID NO: 178中所述之核苷酸序列或由其組成。
在一些實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自鴨源水禽小病毒(MDPV)株。在其他實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自鴨源水禽小病毒(MDPV)株。在某些實施例中，MDPV株為減毒的，例如MDPV株FZ91-30。在其他實施例中，MDPV株為病原性的，例如MDPV株YY。
在一些實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自依賴小病毒。在一些實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自依賴小病毒。在其他實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自依賴病毒鵝小病毒(GPV)株。在其他實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自依賴病毒GPV株。在某些實施例中，GPV株為減毒的，例如GPV株82-0321V。在其他實施例中，GPV株為病原性的，例如GPV株B。
在某些實施例中，該第一ITR衍生自AAV基因體，且該第二ITR衍生自選自由以下組成之群之基因體：豬小病毒，例如豬小病毒株U44978；小鼠小病毒，例如小鼠小病毒株U34256；犬小病毒，例如犬小病毒株M19296；貂腸炎病毒，例如貂腸炎病毒株D00765；及其任何組合。在其他實施例中，該第二ITR衍生自AAV基因體，且該第一ITR衍生自選自由以下組成之群之基因體：豬小病毒，例如豬小病毒株U44978；小鼠小病毒，例如小鼠小病毒株U34256；犬小病毒，例如犬小病毒株M19296；貂腸炎病毒，例如貂腸炎病毒株D00765；及其任何組合。
在另一特定實施例中，ITR為經遺傳工程改造以在其5'及3'末端包括不衍生自AAV基因體之ITR的合成序列。在另一特定實施例中，ITR為經遺傳工程改造以在其5'及3'末端包括衍生自非AAV基因體之一或多者之ITR的合成序列。本發明之核酸分子中存在之兩種ITR可為相同或不同非AAV基因體。具體而言，ITR可衍生自相同非AAV基因體。在一具體實施例中，本發明之核酸分子中存在之兩種ITR相同且可特別為AAV2 ITR。
在一些實施例中，ITR序列包含一或多個迴文序列。本文所揭示之ITR之迴文序列包括但不限於：天然迴文序列(即，自然界中存在之序列)；合成序列(即，自然界中不存在之序列)，諸如偽迴文序列；及其組合或經修飾之形式。「偽迴文序列」為迴文DNA序列(包括不完美的迴文序列)，其共有與天然AAV或非AAV迴文序列中形成二級結構之序列小於80%包括小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、或5%核酸序列一致性或無核酸序列一致性。可自本文所揭示之任何基因體獲得或衍生天然迴文序列。合成迴文序列可基於本文所揭示之任何基因體。
迴文序列可為連續的或間斷的。在一些實施例中，迴文序列為間斷的，其中迴文序列包含第二序列之插入。在一些實施例中，該第二序列包含啟動子、強化子、整合酶之整合位點(例如，Cre或Flp重組酶之位點)、基因產物之開放閱讀框、或其組合。
在一些實施例中，ITR形成髮夾環結構。在一個實施例中，該第一ITR形成髮夾結構。在另一實施例中，該第二ITR形成髮夾結構。在另一實施例中，該第一ITR及該第二ITR兩者形成髮夾結構。在一些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR不形成T形髮夾結構。在某些實施例中，該第一ITR及/或該第二ITR形成非T形髮夾結構。在一些實施例中，非T形髮夾結構包含U形髮夾結構。
在一些實施例中，本文所述之核酸分子中之ITR可為轉錄活化ITR。轉錄活化ITR可包含全部或一部分藉由包括至少一個轉錄活性元件來轉錄活化的野生型ITR。各種類型的轉錄活性元件合適用於此上下文。在一些實施例中，轉錄活性元件為組成型轉錄活性元件。組成型轉錄活性元件提供持續水準的基因轉錄，且當需要轉殖基因在持續基礎上表現時為較佳的。在其他實施例中，轉錄活性元件為誘導性轉錄活性元件。誘導性轉錄活性元件在誘導劑(或誘導條件)不存在下一般表現出低活性，且在誘導劑(或切換至誘導條件)存在下經上調。當僅在某些時間或在某些位置需要表現時，或當使用誘導劑滴定表現水準為合乎需要時，誘導性轉錄活性元件可為較佳的。轉錄活性元件亦可為組織特異性；即，其僅在某些組織或細胞型中表現出活性。
轉錄活性元件可以多種方式併入至ITR中。在一些實施例中，轉錄活性元件併入於ITR之任何部分之5'方向或ITR之任何部分之3'方向。在其他實施例中，轉錄活化ITR之轉錄活性元件位於兩個ITR序列之間。若轉錄活性元件包含二或更多個必須間隔開的元件，則該等元件可與ITR之部分交替。在一些實施例中，ITR之髮夾結構為缺失的且經轉錄元件之反向重複序列置換。後一種排列將產生模擬結構中缺失部分的髮夾。轉錄活化ITR中亦可存在多個串聯的轉錄活性元件，且此等轉錄活性元件可相鄰或間隔開。此外，可將蛋白結合位點(例如，Rep結合位點)誘導至轉錄活化ITR之轉錄活性元件中。轉錄活性元件可包含實現藉由RNA聚合酶受控轉錄DNA以形成RNA的任何序列，且可包含例如轉錄活性元件，如下文所界定。
轉錄活化ITR為核苷酸序列長度相對有限的酸分子提供轉錄活化及ITR功能，有效最大化可自核酸分子攜帶及表現的轉殖基因之長度。將轉錄活性元件併入至ITR中可以多種方式完成。ITR序列及轉錄活性元件之序列需要之比較可提供對編碼ITR內之元件之方式的深入瞭解。例如，可透過在複製轉錄活性元件之功能元件的ITR序列中引入具體變化來向ITR添加轉錄活性。此項技術中存在許多在具體位點有效添加、刪除、及/或改變特定核苷酸序列的技術(參見例如，Deng及Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88)。產生轉錄活化ITR之另一方式涉及在ITR中之所要位置引入限制位點。此外，可使用此項技術中熟知的方法將多個轉錄活性元件併入轉錄活化ITR中。
藉由說明，可藉由包括一或多種諸如以下之轉錄活性元件來產生轉錄活化ITR：TATA盒、GC盒、CCAAT盒、Sp1位點、Inr區、CRE (cAMP調控元件)位點、ATF-1/CRE位點、APBβ盒、APBα盒、CArG盒、CCAC盒、或如此項技術中已知的轉錄中涉及之任何其他元件。 B. 治療性蛋白
本揭露之某些態樣係關於一種核酸分子，其包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼一種治療性蛋白。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼多於一種治療性蛋白。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼相同治療性蛋白之二或更多個複本。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼相同治療性蛋白之二或更多個變異體。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼二或更多種不同治療性蛋白。
本揭露之某些實施例係關於一種核酸分子，其包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含凝血因子。在一些實施例中，凝血因子係選自由以下組成之群：FI、FII、FIII、FIV、FV、FVI、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII)、VWF、前激肽釋放酶、高分子量 激肽原、纖網蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、胞漿素原、α2-抗胞漿素、組織胞漿素原活化劑(tPA)、尿激酶、胞漿素原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)、胞漿素原活化劑抑制劑-2 (PAI2)、其任何酶原、其任何活性形式、及其任何組合。在一個實施例中，凝血因子包含FVIII或者其變異體或片段。在另一實施例中，凝血因子包含FIX或者其變異體或片段。在另一實施例中，凝血因子包含FVII或者其變異體或片段。在另一實施例中，凝血因子包含VWF或者其變異體或片段。1. 凝血因子
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含因子VIII多肽。除非另外指定，否則如本文所用之「因子VIII」，在本申請書通篇縮寫為「FVIII」，意謂在凝血中發揮正常作用之功能性FVIII多肽。因此，術語FVIII包括具有功能性之變異體多肽。「FVIII蛋白」可與FVIII多肽(或蛋白)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括但不限於能夠活化凝血、能夠充當因子IX之輔因子、或能夠在Ca2+ 及磷脂存在下與因子IX形成tenase複合物，然後將因子X轉化成活化形式Xa。FVIII蛋白可為人類、豬、犬、大鼠、或鼠類FVIII蛋白。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已識別可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人 , Thromb .Haemost . 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)。已知全長多肽及多核苷酸序列，亦已知許多功能性片段、突變體、及修飾型式。各種FVIII胺基酸及核苷酸序列揭示於例如美國公開案第2015/0158929 A1號、第2014/0308280 A1號、及第2014/0370035 A1號以及國際公開案第WO 2015/106052 A1號中。FVIII多肽包括例如全長FVIII、全長FVIII在N端減去Met、成熟FVIII (減去信號序列)、在N端具有另一Met之成熟FVIII、及/或B結構域全部或部分缺失之FVIII。FVIII變異體包括B結構域缺失，無論是部分還是全部缺失。a. FVIII 及編碼 FVIII 蛋白之多核苷酸序列
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含因子VIII多肽。除非另外指定，否則如本文所用之「因子VIII」，在本申請書通篇縮寫為「FVIII」，意謂在凝血中發揮正常作用之功能性FVIII多肽。因此，術語FVIII包括具有功能性之變異體多肽。「FVIII蛋白」可與FVIII多肽(或蛋白)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括但不限於能夠活化凝血、能夠充當因子IX之輔因子、或能夠在Ca2+ 及磷脂存在下與因子IX形成tenase複合物，然後將因子X轉化成活化形式Xa。FVIII蛋白可為人類、豬、犬、大鼠、或鼠類FVIII蛋白。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已識別可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人 , Thromb .Haemost . 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)。已知全長多肽及多核苷酸序列，亦已知許多功能性片段、突變體、及修飾形式。各種FVIII胺基酸及核苷酸序列揭示於例如美國公開案第2015/0158929 A1號、第2014/0308280 A1號、及第2014/0370035 A1號以及國際公開案第WO 2015/106052 A1號中。FVIII多肽包括例如全長FVIII、全長FVIII在N端減去Met、成熟FVIII (減去信號序列)、在N端具有另一Met之成熟FVIII、及/或B結構域全部或部分缺失之FVIII。FVIII變異體包括B結構域缺失，無論是部分還是全部缺失。
本文所用之嵌合蛋白中之FVIII部分具有FVIII活性。FVIII活性可藉由此項技術中之任何已知方法測量。許多測試可用於評估凝血系統之功能：活化部分凝血激素時間(aPTT)測試、顯色分析、ROTEM分析、凝血酶原時間(PT)測試(亦用於確定INR)、纖維蛋白原測試(常藉由克勞斯(Clauss)方法)、血小板計數、血小板功能測試(常藉由PFA-100)、TCT、出血時間、混合測試(若患者之血漿與正常血漿混合，則是否進行異常校正)、凝血因子分析、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試(例如，因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾氏蝰毒液時間(Russell's viper venom time，dRVVT)、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記術(TEG或Sonoclot)、凝血彈性測量術(TEM® ，例如，ROTEM® )或優球蛋白(euglobulin)溶解時間(ELT)。
aPTT測試為量度「內在」凝血途徑(亦稱為接觸活化途徑)與共同凝血途徑兩者之功效之性能指標。此測試通常用於測量可商購之重組凝血因子(例如，FVIII)之凝血活性。其結合測量外在途徑之凝血酶原時間(PT)使用。
ROTEM分析提供關於以下整個止血動力學之資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性、及溶解。凝血彈性測量術中之不同參數取決於血漿凝血系統之活性、血小板功能、纖維蛋白溶解、或影響此等相互作用之許多因素。此檢定可提供對次級止血之完全綜覽。
顯色分析機制係基於凝血級聯之原理，其中活化FVIII在活化因子IX、磷脂及鈣離子之存在下加速因子X轉化成因子Xa。藉由使針對因子Xa具有特異性之對硝基醯苯胺(pNA)受質水解來評估因子Xa活性。在405 nM下測量之對硝基苯胺之初始釋放速率與因子Xa活性成正比且因此與樣品中之FVIII活性成正比。
顯色分析由國際血栓暨止血學會(ISTH)之科學及標準化委員會(SSC)之FVIII及因子IX小組委員會所推薦。自1994年起，顯色分析亦已成為歐洲藥典對FVIII濃縮效力(FVIII concentrate potency)之分配的參考方法。因此，在一個實施例中，包含FVIII之嵌合多肽具有可與包含成熟FVIII或BDD FVIII之嵌合多肽(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的FVIII活性。
在另一實施例中，本揭露之包含FVIII之嵌合蛋白具有可與包含成熟FVIII或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的因子Xa產生率。
為了將因子X活化成因子Xa，活化因子IX (因子IXa)在Ca2+ 、膜磷脂、及FVIII因子存在下水解因子X中之一個精胺酸-異白胺酸鍵以形成因子Xa。因此，FVIII與因子IX之相互作用在凝血途徑中為關鍵的。在某些實施例中，包含FVIII之嵌合多肽可在與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合多肽(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的速率下與因子IXa相互作用。
此外，FVIII結合至溫韋伯氏因子，同時在循環中為非活性的。FVIII當未結合至VWF時快速降解，且藉由凝血酶之作用自VWF釋放。在一些實施例中，包含FVIII之嵌合多肽在可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合多肽(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的水準下結合至溫韋伯氏因子。
FVIII可在鈣及磷脂存在下藉由活化蛋白C失活。活化蛋白C裂解A1結構域中精胺酸336之後的FVIII重鏈，其破壞因子X受質相互作用位點，且在A2結構域中精胺酸562之後進行裂解，其增強A2結構域之解離以及破壞與因子IXa之相互作用位點。此裂解亦將A2結構域(43 kDa)分成兩部分且產生A2-N (18 kDa)及A2-C (25 kDa)結構域。因此，活化蛋白C可催化重鏈中之多個裂解位點。在一個實施例中，包含FVIII之嵌合多肽在可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合多肽(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的水準下藉由活化蛋白C失活。
在其他實施例中，包含FVIII之嵌合多肽具有可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的體內FVIII活性。在一特定實施例中，包含FVIII之嵌合多肽能夠在HemA小鼠尾靜脈橫切模型中在可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，ADVATE® 、REFACTO® 、或ELOCTATE® )相當的水準下保護HemA小鼠。
如本文所用之FVIII之「B結構域」與此項技術中已知之藉由內部胺基酸序列一致性及凝血酶之蛋白水解裂解位點定義之B結構域相同，例如，成熟人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648。至於成熟人類FVIII，其他人類FVIII結構域由以下胺基酸殘基定義：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，成熟FVIII之殘基Ser2173-Tyr2332。除非另外指出，否則如本文所用之不指代任何SEQ ID數值之序列殘基數值對應於無信號肽序列(19個胺基酸)之FVIII序列。A3-C1-C2序列(亦稱為FVIII重鏈)包括殘基Ser1690-Tyr2332。其餘序列(殘基Glu1649-Arg1689)通常指代為FVIII輕鏈活化肽。豬、小鼠、及犬FVIII之包括B結構域之所有域的邊界位置在此項技術中亦為已知的。在一個實施例中，缺失FVIII之B結構域(「B結構域缺失FVIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之實例為REFACTO® (重組BDD FVIII)。在一個特定實施例中，B結構域缺失FVIII變異體包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。
「B結構域缺失FVIII」可具有揭示於美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號、及第6,458,563號、以及國際公開案第WO 2015106052 A1號(PCT/US2015/010738)中之全部或部分缺失。在一些實施例中，本揭露之方法中所用之B結構域缺失FVIII序列包含在美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5處揭示之任一缺失。在另一實施例中，B結構域缺失因子VIII為S743/Q1638 B結構域缺失因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如，具有自胺基酸744至胺基酸1637之缺失之因子VIII，例如，具有成熟FVIII之胺基酸1-743及胺基酸1638-2332之因子VIII)。在一些實施例中，本揭示之方法中所用之B結構域缺失FVIII具有在美國專利第5,789,203號(以及US 6,060,447、US 5,595,886、及US 6,228,620)之第2欄第26-51行及實例5-8處揭示之缺失。在一些實施例中，B結構域缺失因子VIII具有以下文獻中描述之缺失：美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行，圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行、及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行。在一些實施例中，B結構域缺失FVIII缺失大部分B結構域，但仍然含有體內將初級轉譯產物蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需的B結構域胺基端序列，如WO 91/09122中所揭示。在一些實施例中，在缺失胺基酸747-1638，即實際上完全缺失B結構域下構築B結構域缺失FVIII。Hoeben R.C.等人 , J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)。B結構域缺失因子VIII亦可含有FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562之缺失。Meulien P.等人 Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)。作為本發明之一部分之其他B域缺失包括以下缺失：胺基酸982至1562或760至1639 (Toole等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986)83, 5939-5942))、797至1562 (Eaton等人 Biochemistry (1986)25:8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560 (Sarver等人 , DNA (1987)6:553-564))、741至1648 (Pasek(PCT申請案第88/00831號))、或816至1598或741至1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) 第82期:16-25, EP 295597))。在一個特定實施例中，B結構域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。在另一特定實施例中，B結構域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基745至1648之缺失。在一些實施例中，BDD FVIII包含含有在對應於成熟全長FVIII之胺基酸765至1652中之缺失的單鏈FVIII (亦稱為rVIII-單鏈及AFSTYLA®)。參見美國專利第7,041,635號。
在其他實施例中，BDD FVIII包括含有B結構域之保留一或多個N-連接醣化位點之片段的FVIII多肽，該等位點例如對應於全長FVIII序列之胺基酸序列之殘基757、784、828、900、963或視情況943。B結構域片段之實例包括如Miao, H.Z.等人 , Blood 103(a): 3412-3419 (2004)；Kasuda, A等人 , J .Thromb. Haemost . 6: 1352-1359 (2008)；及Pipe, S.W.等人 , J. Thromb. Haemost . 9: 2235-2242 (2011)中揭露之B結構域之226個胺基酸或163個胺基酸(即保留B結構域之前226個胺基酸或163個胺基酸)。在其他實施例中，BDD FVIII進一步包含在殘基309處之點突變(自Phe至Ser)以改良BDD FVIII蛋白之表現。參見Miao, H.Z.等人, Blood 103(a): 3412-3419 (2004)。在其他實施例中，BDD FVIII包括含有一部分B結構域，但不含有一或多個弗林蛋白酶裂解位點(例如Arg1313及Arg 1648)之FVIII多肽。參見Pipe, S.W.等人 , J. Thromb. Haemost . 9: 2235-2242 (2011)。在一些實施例中，BDD FVIII包含含有在對應於成熟全長FVIII之胺基酸765至1652中之缺失的單鏈FVIII (亦稱為rVIII-單鏈及AFSTYLA®)。參見美國專利第7,041,635號。可在任何FVIII序列中進行各前述缺失。
已知大量功能性FVIII變異體，亦如上文及下文所討論。此外，已在血友病患者中識別出出FVIII之數百個非功能性突變，且已確定，與取代基之性質相比，FVIII功能之此等突變之效果更多係由於其處於FVIII之3維結構內(Cutler等人 , Hum. Mutat. 19 :274-8 (2002))，該參考文獻以全文引用之方式併入本文中。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已識別出可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人 , Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)，該參考文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，FVIII多肽包含FVIII變異體或其片段，其中FVIII變異體或其片段具有FVIII活性。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼全長FVIII多肽。在其他實施例中，遺傳卡匣編碼B結構域缺失(BDD) FVIII多肽，其中FVIII之全部或一部分B結構域缺失。在一個特定實施例中，遺傳卡匣編碼包含具有與SEQ ID NO: 106、107、109、110、111、或112至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之胺基酸序列之多肽。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 17或其片段之多肽。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 106或其片段之多肽。在一些實施例中，遺傳卡匣包含具有與SEQ ID NO: 107至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 109或其片段之多肽。在一些實施例中，遺傳卡匣包含具有與SEQ ID NO: 16至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，遺傳卡匣包含具有與SEQ ID NO: 109至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭露之遺傳卡匣編碼包含信號肽或其片段之FVIII多肽。在其他實施例中，遺傳卡匣編碼缺乏信號肽之FVIII多肽。在一些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸1-19。
在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列經密碼子最佳化。在某些實施例中，遺傳卡匣包含國際申請案第PCT/US2017/015879號中所揭示之核苷酸序列，該案以全文引用方式併入本文。在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列經密碼子最佳化。在某些實施例中，遺傳卡匣包含具有與選自SEQ ID NO: 1-14之核苷酸序列至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，遺傳卡匣包含具有與SEQ ID NO: 71至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，遺傳卡匣包含具有與SEQ ID NO: 19至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核苷酸序列。 i. 編碼 FVIII 多肽之密碼子最佳化核苷酸序列
在一些實施例中，本揭露之核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該第一ITR及該第二ITR衍生自AAV基因體，且其中該遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列。在一些實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列編碼全長FVIII多肽。在其他實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列編碼B結構域缺失(BDD) FVIII多肽，其中FVIII之全部或一部分B結構域缺失。在一個特定實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列編碼包含具有與SEQ ID NO: 17或其片段至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之胺基酸序列之多肽。在一個實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO: 17或其片段之多肽。
在一些實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列編碼包含信號肽或其片段之FVIII多肽。在其他實施例中，密碼子最佳化序列編碼缺乏信號肽之FVIII多肽。在一些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸1-19。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791或(ii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在一個特定實施例中，該第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在另一實施例中，該第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791或SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791。
在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791或(ii) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在一個實施例中，該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791或SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791。在另一實施例中，該第二核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一個特定實施例中，該第二核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374。在另一實施例中，該第二核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374)至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一個特定實施例中，該第二核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374)。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374或(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在某些實施例中，該第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，該第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一個特定實施例中，該第二核酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374。在一些實施例中，連接於上文所列出之該第二核酸序列之該第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，連接於上文所列出之該第二核酸序列之該第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸1-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。
在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)或(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在某些實施例中，該第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，該第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一個特定實施例中，該第二核酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374或SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)。在一些實施例中，連接於上文所列出之該第二核酸序列之該第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，連接於上文所列出之該第二核酸序列之該第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸1-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸58-1791、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸58-1791、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸58-1791、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸58-1791至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在其他實施例中，該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸58-1791、SEQ ID NO: 2之核苷酸58-1791、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸58-1791、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸58-1791。
在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1-1791、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1-1791、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1-1791、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1-1791至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在一個實施例中，該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸1-1791、SEQ ID NO: 2之核苷酸1-1791、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1-1791、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1-1791。在另一實施例中，連接於該第一核苷酸序列之該第二核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一個特定實施例中，連接於該第一核苷酸序列之該第二核苷酸序列包含(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374。在其他實施例中，連接於該第一核苷酸序列之該第二核苷酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一個實施例中， 該第二核苷酸序列包含(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在一個特定實施例中，第二核酸序列包含(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374。在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374 、SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374、或SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374) 至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；且其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性。在一個實施例中，該第二核酸序列包含(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374、或(iv) SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374、或SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374)。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 1之核苷酸58至4374至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1之核苷酸58-4374)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 1之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 1之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 2之核苷酸58至4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 2之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 2之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 2之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 2之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 70之核苷酸58至4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 70之核苷酸58-4374)至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 70至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 70之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 70之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 70之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 70之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 70之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 71之核苷酸58至4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 71之核苷酸58-4374)至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 71至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 71之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 71之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 71之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 71之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 71之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸58至4374至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 3之核苷酸58-4374)至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 3至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一些實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 3之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 3之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 3之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 3之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 4之核苷酸58至4374至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 4之核苷酸58-4374)至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 4至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 4之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 4之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 4之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 4之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58至4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸58-4374)至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 5至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一些實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 5之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 5之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸58至4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸58-4374)至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 6至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。在一些實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 6之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之核苷酸1-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 6之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼信號肽之核酸序列。在某些實施例中，信號肽為FVIII信號肽。在一些實施例中，編碼信號肽之核酸序列經密碼子最佳化。在一個特定實施例中，編碼信號肽之核酸序列具有與以下至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性：(i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1至57；(ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1至57；(iii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1至57；(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1至57；(v) SEQ ID NO: 5之核苷酸1至57；(vi) SEQ ID NO: 6之核苷酸1至57；(vii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1至57；(viii) SEQ ID NO: 71之核苷酸1至57；或(ix) SEQ ID NO: 68之核苷酸1至57。
SEQ ID NO: 1-6、70、及71為SEQ ID NO: 16 (起始或「親本」或「野生型」FVIII核苷酸序列)之最佳化型式。SEQ ID NO: 16編碼B結構域缺失人類FVIII。儘管SEQ ID NO: 1-6、70、及71衍生自FVIII之具體B結構域缺失形式 (SEQ ID NO: 16)，但是應理解本揭露亦包括編碼FVIII之其他型式的核酸之最佳化型式。例如，FVIII之其他型式可包括全長FVIII、FVIII之其他B結構域缺失(本文所述)、或保留FVIII活性的FVIII之其他片段。
在一個實施例中，遺傳卡匣包含FVIII構築體，其包括如表2A-2C中所列舉之多核苷酸(6526個核苷酸)。在一個實施例中，遺傳卡匣包含FVIII構築體，其包括如表2B中所列舉之多核苷酸(6526個核苷酸)。
在某些實施例中，經單離之核酸分子包含具有與核苷酸序列SEQ ID NO: 179或182至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列一致性之核苷酸序列，其中該經單離之核酸分子保留表現功能性FVIII蛋白之能力。表 2A ： 實例性FVIII構築體 (核苷酸1-6526；SEQ ID NO: 110) 表 2B ： 實例性B19-FVIII構築體 (核苷酸1-6762；SEQ ID NO: 179) 表 2C ： 實例性GPV-FVIII構築體(核苷酸1-6830；SEQ ID NO: 182) A. 密碼子適應指數
在一個實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。例如，密碼子最佳化核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75 (75%)、至少約0.76 (76%)、至少約0.77 (77%)、至少約0.78 (78%)、至少約0.79 (79%)、至少約0.80 (80%)、至少約0.81 (81%)、至少約0.82 (82%)、至少約0.83 (83%)、至少約0.84 (84%)、至少約0.85 (85%)、至少約0.86 (86%)、至少約0.87 (87%)、至少約0.88 (88%)、至少約0.89 (89%)、至少約0.90 (90%)、至少約0.91 (91%)、至少約0.92 (92%)、至少約0.93 (93%)、至少約0.94 (94%)、至少約0.95 (95%)、至少約0.96 (96%)、至少約0.97 (97%)、至少約0.98 (98%)、或至少約0.99 (99%)。在一些實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.88 (88%)。在其他實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.91 (91%)。在其他實施例中，密碼子最佳化核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.91 (97%)。
在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75 (75%)、至少約0.76 (76%)、至少約0.77 (77%)、至少約0.78 (78%)、至少約0.79 (79%)、至少約0.80 (80%)、至少約0.81 (81%)、至少約0.82 (82%)、至少約0.83 (83%)、至少約0.84 (84%)、至少約0.85 (85%)、至少約0.86 (86%)、至少約0.87 (87%)、至少約0.88 (88%)、至少約0.89 (89%)、至少約0.90 (90%)、或至少約.91 (91%)。在一個特定實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.88 (88%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.91 (91%)。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含一核苷酸序列，其包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374或(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75 (75%)、至少約0.76 (76%)、至少約0.77 (77%)、至少約0.78 (78%)、至少約0.79 (79%)、至少約0.80 (80%)、至少約0.81 (81%)、至少約0.82 (82%)、至少約0.83 (83%)、至少約0.84 (84%)、至少約0.85 (85%)、至少約0.86 (86%)、至少約0.87 (87%)、或至少約0.88 (88%)。在一個特定實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.83 (83%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.88 (88%)。
在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75 (75%)、至少約0.76 (76%)、至少約0.77 (77%)、至少約0.78 (78%)、至少約0.79 (79%)、至少約0.80 (80%)、至少約0.81 (81%)、至少約0.82 (82%)、至少約0.83 (83%)、至少約0.84 (84%)、至少約0.85 (85%)、至少約0.86 (86%)、至少約0.87 (87%)、或至少約0.88 (88%)。在一個特定實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.75 (75%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.83 (83%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.88 (88%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.91 (91%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約.97 (97%)。
在一些實施例中，本揭露之編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列具有相對於SEQ ID NO: 16增加的最佳密碼子頻率(FOP)。在某些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之FOP為至少約40、至少約45、至少約50、至少約55、至少約60、至少約64、至少約65、至少約70、至少約75、至少約79、至少約80、至少約85、或至少約90。
在其他實施例中，本揭露之編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列具有相對於SEQ ID NO: 16增加的同義密碼子相對使用度(RCSU)。在一些實施例中，經單離之核酸分子之RCSU大於1.5。在其他實施例中，經單離之核酸分子之RCSU大於2.0。在某些實施例中，經單離之核酸分子之RCSU為至少約1.5、至少約1.6、至少約1.7、至少約1.8、至少約1.9、至少約2.0、至少約2.1、至少約2.2、至少約2.3、至少約2.4、至少約2.5、至少約2.6、或至少約2.7。
在其他實施例中，本揭露之編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列具有相對於SEQ ID NO: 16減少的有效密碼子數。在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之有效密碼子數小於約50、小於約45、小於約40、小於約35、小於約30、或小於約25。在一個特定實施例中，經單離之核酸分子之有效密碼子數為約40、約35、約30、約25、或約20。B. G/C 含量最佳化
在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列含有與SEQ ID NO: 16中之G/C核苷酸百分比相比較高的G/C核苷酸百分比。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%、至少約58%、至少約59%、或至少約60%。
在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791、(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791、(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791、或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中核苷酸序列含有與SEQ ID NO: 16中之G/C核苷酸百分比相比較高的G/C核苷酸百分比。在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%、或至少約58%。在一個特定實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列之G/C含量為至少約58%。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)、或(iv) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有與SEQ ID NO: 16中之G/C核苷酸百分比相比較高的G/C核苷酸百分比。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、或至少約57%。在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約52%。在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約55%。在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約57%。
在其他實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之(i)核苷酸58-4374或(ii)核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中核苷酸序列含有與SEQ ID NO: 16中之G/C核苷酸百分比相比較高的G/C核苷酸百分比。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約45%。在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約52%。在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約55%。在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約57%。在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約58%。在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之G/C含量為至少約60%。
「G/C含量」(或鳥嘌呤-胞嘧啶含量)或「G/C核苷酸百分比」係指DNA分子中含氮鹼基鳥嘌呤或胞嘧啶之百分比。G/C含量可使用下式計算：
人類基因之G/C含量具有高度異質性，一些基因之G/C含量低至20%，且其他基因之G/C含量高達95%。一般而言，富含G/C之基因表現更高。事實上已證明，增加基因之G/C含量可導致基因表現增加，其主要歸因於轉錄增加及較高的穩態mRNA水準。參見Kudla等人, PLoS Biol., 4(6): e180 (2006)。C. 基質連接區樣序列
在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有MARS/ARS序列。
在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有MARS/ARS序列。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)、或(iv) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有MARS/ARS序列。
在其他實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與(i) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374或(ii) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有MARS/ARS序列。
已識別與釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )自主複製序列(ARS)及核基質連接區(MAR)具有序列類似性的人類FVIII核苷酸序列中之富含AT之元件。(Fallux等人,Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996)。已證明此等元件之一體外結合核因子且抑制氯黴素乙醯轉移酶(CAT)報導子基因之表現。同上。 已假設此等序列可促成人類FVIII基因之轉錄抑制。因此，在一個實施例中，在本揭露之編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列中消除全部MAR/ARS序列。親本FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中有四個MAR/ARS ATATTT序列(SEQ ID NO: 21)及三個MAR/ARS AAATAT序列(SEQ ID NO: 22)。使所有此等位點突變以破壞最佳化FVIII序列中之MAR/ARS序列(SEQ ID NO: 1-6)。此等元件中之各者之位置及最佳化序列中對應核苷酸之序列顯示於以下表3中。表 3 ： 代表性元件之變化之概述 D. 去穩定化序列
在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有去穩定化元件。
在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的去穩定化元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有去穩定化元件。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)、或(iv) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的去穩定化元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有去穩定化元件。
在其他實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個去穩定化元件。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有去穩定化元件。
親本FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中有十個去穩定化元件：六個ATTTA序列(SEQ ID NO: 23)及四個TAAAT序列(SEQ ID NO: 24)。在一個實施例中，使此等位點之序列突變以破壞最佳化FVIII SEQ ID NO: 1-6、70、及71中之去穩定化元件。此等元件中之各者之位置及最佳化序列中對應核苷酸之序列顯示於表3中。E. 潛在的啟動子結合位點
在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有潛在的啟動子結合位點。
在一個特定實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有潛在的啟動子結合位點。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)、或(iv) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有潛在的啟動子結合位點。
在其他實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16較少的潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、或至多5個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個、或至多1個潛在的啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列不含有潛在的啟動子結合位點。
TATA盒為常在真核生物之啟動子區中存在之調控序列。其充當通用轉錄因子TATA結合蛋白(TBP)之結合位點。TATA盒通常包含序列TATAA (SEQ ID NO: 28)或接近的變異體。然而，編碼序列內之TATA盒可抑制全長蛋白之轉譯。野生型BDD FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中有十個潛在的啟動子結合序列：五個TATAA序列(SEQ ID NO: 28)及五個TTATA序列(SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，在本揭露之FVIII基因中消除至少1個、至少2個、至少3個、或至少4個啟動子結合位點。在一些實施例中，在本揭露之FVIII基因中消除至少5個啟動子結合位點。在其他實施例中，在本揭露之FVIII基因中消除至少6個、至少7個、或至少8個啟動子結合位點。在一個實施例中，在本揭露之FVIII基因中消除至少9個啟動子結合位點。在一個特定實施例中，在本揭露之FVIII基因中消除全部啟動子結合位點。此等潛在的啟動子結合位點中之各者之位置及最佳化序列中對應核苷酸之序列顯示於表3中。F. 其他順式作用負調控元件
除上文所述之MAR/ARS序列、去穩定化元件、及潛在的啟動子位點之外，可在野生型BDD FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中識別出若干額外潛在抑制性序列。在非最佳化BDD FVIII序列中可識別出兩種富含AU之序列元件(ARE) (ATTTTATT (SEQ ID NOs: 30)；及ATTTTTAA (SEQ ID NO: 31))，連同聚A位點(AAAAAAA；SEQ ID NO: 26)、聚T位點(TTTTTT；SEQ ID NO: 25)、及剪接位點(GGTGAT；SEQ ID NO: 27)。可自最佳化FVIII序列中移除此等元件中之一或多者。此等位點中之各者之位置及最佳化序列中對應核苷酸之序列顯示於表3中。
在某些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有一或多種順式作用負調控元件，例如剪接位點、聚T序列、聚A序列、ARE序列、或其任何組合。
在另一實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374、(ii) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374、(iii) SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)、或(iv) SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有一或多種順式作用負調控元件，例如剪接位點、聚T序列、聚A序列、ARE序列、或其任何組合。
在其他實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有一或多種順式作用負調控元件，例如剪接位點、聚T序列、聚A序列、ARE序列、或其任何組合。
在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有剪接位點GGTGAT (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有聚T序列(SEQ ID NO: 25)。在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有聚A序列(SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列包含編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i) SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii) SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性；其中N端部分及C端部分在一起具有FVIII多肽活性；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有ARE元件(SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31)。
在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有剪接位點GGTGAT (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有聚T序列(SEQ ID NO: 25)。在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有聚A序列(SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，遺傳卡匣包含編碼FVIII多肽之密碼子最佳化核苷酸序列，其中密碼子最佳化核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374 (即，在無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸之情況下，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70、或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性之核酸序列；且其中密碼子最佳化核苷酸序列不含有ARE元件(SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31)。
在其他實施例中，本揭露之最佳化FVIII序列不包含抗病毒基序，莖-環結構、及重複序列中之一或多者。
在其他實施例中，將轉錄起始位點周圍的核苷酸改變為kozak共通序列(GCCGCCACCATG C (SEQ ID NO: 32)，其中加下劃線之核苷酸為起始密碼子)。在其他實施例中，可添加或移除限制位點以促進選殖過程。b. FIX 及編碼 FIX 蛋白之多核苷酸序列
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含FIX多肽。在一些實施例中，FIX多肽包含FIX或其變異體或片段，其中FIX或其變異體或片段具有FIX活性。
人類FIX為一種絲胺酸蛋白酶，其為凝血級聯之固有路徑中的重要組成部分。如本文所用，「因子IX」或「FIX」係指凝血因子蛋白及其種類及序列變異體，且包括但不限於人類FIX前驅多肽之具有461個胺基酸之單鏈序列(「前原」)、成熟人類FIX之具有415個胺基酸之單鏈序列(SEQ ID NO: 125)及R338L FIX (Padua)變異體(SEQ ID NO: 126)。FIX包括具有凝血FIX之典型特徵的任何形式之FIX分子。如本文所用，「因子IX」及「FIX」意欲涵蓋包含結構域Gla (含有γ-羧基麩胺酸殘基之區域)、EGF1及EGF2 (含有與人表皮生長因子同源之序列的區域)、活化肽(「AP」，由成熟FIX之殘基R136-R180形成)及C端蛋白酶結構域(「Pro」)，或此項技術中已知的該等結構域之同義詞，或可為保持原生蛋白之至少一部分生物活性的截短片段或序列變異體。FIX或序列變異體已經選殖，如美國專利第4,770,999號及第7,700,734號中所描述，且編碼人類FIX之cDNA已經單離，表徵且被選殖至表現載體中(參見例如，Choo等人, Nature 299:178-180 (1982)；Fair等人, Blood 64:194-204 (1984)；及Kurachi等人, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982))。一個特定FIX變異體為由Simioni等人, 2009表徵之R338L FIX (Padua)變異體(SEQ ID NO: 2)，其包含功能獲得突變，該突變與Padua變異體活性相對於原生FIX有近8倍增加相關(表4)。FIX變異體亦可包括具有一或多個保守胺基酸取代之任何FIX多肽，該一或多個取代不會影響FIX多肽之FIX活性。在一些實施例中，FIX變異體包含由可裂解連接子融合之rFIX-白蛋白，例如，IDELVION®。參見US 7,939,632，其以全文引用之方式倂入本文。表 4 ： 實例性FIX序列 *灰色陰影=信號肽；下劃線=XTEN序列；粗體=Fc。 **美國專利第9,856,468號之SEQ ID NO: 67，其以全文引用之方式併入本文。
FIX多肽為55 kDa，以由以下三個區構成之前體多肽原鏈(SEQ ID NO: 125)形式合成：具有28個胺基酸之信號肽(SEQ ID NO: 127之胺基酸1至28)、麩胺酸殘基γ-羧基化所需的具有18個胺基酸之前肽(胺基酸29至46)、及具有415個胺基酸之成熟因子IX (SEQ ID NO: 125或126)。前肽係在γ-羧基麩胺酸域N端之具有18個胺基酸殘基之序列。前肽結合維生素K依賴性γ羧化酶，且接著經內源蛋白酶，最可能是PACE (成對鹼性胺基酸裂解酶，又稱為弗林蛋白酶(furin)或PCSK3)自FIX之前驅多肽裂解。若不發生γ羧基化，則Gla結構域無法結合鈣以呈現將蛋白錨定於帶負電之磷脂表面所需之正確構形，由此使因子IX沒有功能。即使其經羧基化，Gla結構域亦取決於前肽之裂解而獲得適當功能，因為保留之前肽干擾Gla結構域與鈣及磷脂最佳結合所需之構形變化。在人體中，所得成熟因子IX係由肝細胞以無活性酶原形式分泌至血流中，該酶原為以重量計含有約17%碳水化合物的具有415個胺基酸殘基之單鏈蛋白(Schmidt, A. E.等人(2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39)。
成熟FIX係由若干結構域構成，該等結構域以N端至C端配置為：GLA結構域、EGF1結構域、EGF2結構域、活化肽(AP)結構域、及蛋白酶(催化)結構域。短連接子將EGF2結構域與AP結構域相連接。FIX含有分別由R145-A146及R180-V181形成之兩個活化肽。活化後，單鏈FIX變為具有2條鏈之分子，其中該兩條鏈係藉由二硫鍵連接。凝血因子可藉由置換其活化肽引起活化特異性之改變來進行工程改造。在哺乳動物中，成熟FIX必須由活化因子XI活化以得到因子IXa。在FIX活化成FIXa之後，蛋白酶結構域提供FIX之催化活性。活化因子VIII (FVIIIa)係完整表現FIXa活性之特定輔因子。
在某些實施例中，FIX多肽包含血漿衍生之FIX之Thr148等位基因形式且具有與內源FIX類似之結構及功能特徵。
許多功能性FIX變異體為此項技術中已知。國際公開案第WO 02/040544 A3號在第4頁第9-30行及第15頁第6-31列揭示了對肝素抑制作用之展現較高抗性的突變體。國際公開案第WO 03/020764 A2號在表2及表3(第14-24頁)中及在第12頁第1-27行揭示T細胞免疫原性降低之FIX突變體。國際公開案第WO 2007/149406 A2號在第4頁第1行至第19頁第11列揭示展現較高蛋白穩定性、較長體內及體外半衰期、及較高的對蛋白酶之抗性的功能性突變FIX分子。WO 2007/149406 A2亦在第19頁第12行至第20頁第9行揭示嵌合及其他變異體FIX分子。國際公開案第WO 08/118507 A2號在第5頁第14行至第6頁第5行揭示展現較高凝血活性之FIX突變體。國際公開案第WO 09/051717 A2號在第9頁第11行至第20頁第2行揭示具有使半衰期及/或回收率增加之增加數目之N-連接及/或O-連接醣化位點的FIX突變體。國際公開案第WO 09/137254 A2號亦在第2頁第[006]段至第5頁第[011]段及第16頁第[044]段至第24頁第[057]段揭示醣化位點數增加之因子IX突變體。國際公開案第WO 09/130198 A2號在第4頁第26行至第12頁第6行揭示具有使半衰期增加之增加數目之醣化位點的功能性突變FIX分子。國際公開案第WO 09/140015 A2號在第11頁第[0043]段至第13頁第[0053]段揭示可用於聚合物(例如PEG)偶聯之Cys殘基之數目增加的功能性FIX突變體。2011年7月11日申請且在2012年1月12日以WO 2012/006624公開之國際申請案第PCT/US2011/043569號中所述之FIX多肽亦以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，FIX多肽包含融合至白蛋白之FIX多肽，例如FIX-白蛋白。在某些實施例中，FIX多肽為IDELVION®或rIX-FP。
此外，已在血友病受試者中識別出數百種FIX非功能性突變，其中許多揭示於國際公開案第WO 09/137254 A2號第11-14頁之表6中。此等非功能性突變不包括在本發明中，但提供有關哪些突變很可能或不太可能產生功能性FIX多肽之額外指導。
在一個實施例中，FIX多肽(或融合多肽之因子IX部分)包含與SEQ ID NO: 1或2中所述之序列(SEQ ID NO: 125或126之胺基酸1至415)至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，或者具有前肽序列，或具有前肽及信號序列(全長FIX)。在另一實施例中，FIX包含與SEQ ID NO: 2中所述之序列至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
FIX凝血活性係以(一或多個)國際單位(IU)表示。一個IU之FIX活性近似對應於一毫升正常人類血漿中FIX之量。若干分析可用於測量FIX活性，包括單級凝結分析(部分活化凝血激酶時間；aPTT)、凝血酶產生時間(TGA)、及旋轉式血栓彈力分析儀(ROTEM® )。本發明涵蓋與FIX序列具有同源性之序列、天然序列片段(諸如來自人類；非人類靈長類動物；哺乳動物，包括家養動物)，及保持FIX之至少一部分生物活性或生物功能及/或可用於預防、治療、介導或改善凝血因子相關疾病、缺乏、病症或病狀(例如與外傷、手術或凝血因子缺乏相關之出血事件)的非天然序列變異體。與人FIX同源之序列可藉由標準同源性搜索技術，諸如NCBI BLAST發現。
在某些實施例中，FIX序列經密碼子最佳化。密碼子最佳化FIX序列之實例包括但不限於國際公開案第WO 2016/004113 A1號之SEQ ID NO: 1及54-58，該案以全文引用之方式併入本文。c. FVII 及編碼 FVII 蛋白之多核苷酸序列
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含因子VII多肽。在一些實施例中，FVII多肽包含FVII或其變異體或片段，其中其變異體或片段具有FVII活性。
「因子VII」(「FVII」、「F7」；亦稱為因子7、凝血因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原轉化促進劑、SPCA、前轉化素(proconvertin)及、依他凝血素α (eptacog alpha))為一種絲胺酸蛋白酶，其為凝血級聯之部分。在一個實施例中，本文所述之核酸中之凝血因子為FVII。重組活化因子VII (「FVII」)已廣泛地用於治療重度流血，諸如發生於患有A型或B型血友病，凝血因子XI、FVII缺乏，血小板功能不全，血小板減少症或溫韋伯氏病之患者中的重度流血。
重組活化FVII (rFVIIa；Novoseven® )為用於治療以下中的流血事件(i)具有抵抗FVIII或FIX之中和抗體(抑制劑)的血友病患者，(ii)缺乏FVII之患者，或(iii)經歷手術程序的具有抑制劑之A型或B型血友病患者。然而，Novoseven® 顯示不良的功效。通常需要在高濃度下FVIIa之重複劑量來控制流血，因為其對活化血小板之親和力低、半衰期短且在不存在組織因子的情況下酶活性不良。因此，對用於具有FVIII及FIX抑制劑及/或缺乏FVII之血友病患者的更好治療及預防選擇存在尚未滿足的醫學需要。
在一個實施例中，遺傳卡匣編碼FVII之成熟形式或其變異體。FVII包括Gla結構域、兩個EGF結構域(EGF-1及EGF-2)、及絲胺酸蛋白酶結構域(或肽酶S1結構域)，絲胺酸蛋白酶結構域在絲胺酸蛋白酶之肽酶S1家族的所有成員中為高度保守的，諸如例如胰凝乳蛋白酶的情況。FVII以單鏈酶原(即，可活化FVII)及完全活化的雙鏈形式存在。 C. 生長因子
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含生長因子。生長因子可選自此項技術中已知的任何生長因子。在一些實施例中，生長因子為激素。在其他實施例中，生長因子為細胞介素。在一些實施例中，生長因子為趨化介素。
在一些實施例中，生長因子為腎上腺髓素(AM)。在一些實施例中，生長因子為血管生成素(Ang)。在一些實施例中，生長因子為自分泌移動因子。在一些實施例中，生長因子為骨成形性蛋白(BMP)。在一些實施例中，BMP係選自BMP2、BMP4、BMP5、及BMP7。在一些實施例中，生長因子為睫狀神經滋養因子家族成員。在一些實施例中，睫狀神經滋養因子家族成員係選自睫狀神經滋養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、介白素-6 (IL-6)。在一些實施例中，生長因子為群落刺激因子。在一些實施例中，群落刺激因子係選自巨噬細胞群落刺激因子(m-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、及顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。在一些實施例中，生長因子為表皮生長因子(EGF)。在一些實施例中，生長因子為ephrin。在一些實施例中，ephrin係選自ephrin A1、ephrin A2、ephrin A3、ephrin A4、ephrin A5、ephrin B1、ephrin B2、及ephrin B3。在一些實施例中，生長因子為紅血球生成素(EPO)。在一些實施例中，生長因子為纖維母細胞生長因子(FGF)。在一些實施例中，FGF係選自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、及FGF23。在一些實施例中，生長因子為胎牛生長激素(FBS)。在一些實施例中，生長因子為GDNF家族成員。在一些實施例中，GDNF家族成員係選自膠細胞株衍生神經滋養因子(GDNF)、neurturin、persephin、及artemin。在一些實施例中，生長因子為生長分化因子-9 (GDF9)。在一些實施例中，生長因子為肝細胞生長因子(HGF)。在一些實施例中，生長因子為肝腫瘤衍生生長因子(HDGF)。在一些實施例中，生長因子為胰島素。在一些實施例中，生長因子為胰島素樣生長因子。在一些實施例中，胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)或IGF-2。在一些實施例中，生長因子為介白素(IL)。在一些實施例中，IL係選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、及IL-7。在一些實施例中，生長因子為角質細胞生長因子(KGF)。在一些實施例中，生長因子為遷移刺激因子(MSF)。在一些實施例中，生長因子為巨噬細胞刺激蛋白(MSP或肝細胞生長因子樣蛋白(HGFLP))。在一些實施例中，生長因子為myostatin (GDF-8)。在一些實施例中，生長因子為神經調節素。在一些實施例中，神經調節素係選自神經調節素1 (NRG1)、NRG2、NRG3、及NRG4。在一些實施例中，生長因子為神經滋養素。在一些實施例中，生長因子為腦衍生神經滋養因子(BDNF)。在一些實施例中，生長因子為神經生長因子(NGF)。在一些實施例中，NGF為神經滋養素-3 (NT-3)或NT-4。在一些實施例中，生長因子為胎盤生長因子(PGF)。在一些實施例中，生長因子為血小板衍生生長因子(PDGF)。在一些實施例中，生長因子為腎胺酶(RNLS)。在一些實施例中，生長因子為T細胞生長因子(TCGF)。在一些實施例中，生長因子為血小板生成素(TPO)。在一些實施例中，生長因子為轉形生長因子。在一些實施例中，轉形生長因子為轉形生長因子α (TGF-α)或TGF-β。在一些實施例中，生長因子為腫瘤壞死因子-α (TNF-α)。在一些實施例中，生長因子為血管內皮生長因子(VEGF)。 D. 微小RNA (miRNA)
微小RNA (miRNA)為小的非編碼RNA分子(約18-22個核苷酸)，其藉由抑制轉譯或誘導信使RNA (mRNA)降解來負調控基因表現。自從被發現以來，miRNA已經涉及各種細胞過程，包括細胞凋亡、分化、及細胞增殖，且其已顯示在誘癌中起關鍵作用。miRNA調控基因表現之能力使體內miRNA之表現成為基因療法中的有價值的工具。
本揭露之某些態樣係關於質體樣核酸分子，其包含第一ITR、第二ITR、及編碼miRNA之遺傳卡匣，其中該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒之ITR (例如，該第一ITR及/或該第二ITR來自非AAV)。miRNA可為此項技術中已知的任何miRNA。在一些實施例中，miRNA下調靶基因之表現。在某些實施例中，靶基因係選自SOD1、HTT、RHO、或其任何組合。
在一些實施例中，遺傳卡匣編碼一種miRNA。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼多於一種miRNA。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼二或更多種不同miRNA。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼相同miRNA之二或更多個複本。在一些實施例中，遺傳卡匣編碼相同治療性蛋白之二或更多個變異體。在某些實施例中，遺傳卡匣編碼一或多種miRNA及一或多種治療性蛋白。
在一些實施例中，miRNA為天然存在之miRNA。在一些實施例中，miRNA為經工程改造之miRNA。在一些實施例中，miRNA為人工miRNA。在某些實施例中，miRNA包含Evers等人,Molecular Therapy 26(9) :1-15 (2018年6月印刷前之電子版)所揭示之miHTT工程改造之miRNA。在某些實施例中，miRNA包含Dirren等人,Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2) :167-84 (2015年2月)所揭示之miR SOD1人工miRNA。在某些實施例中，miRNA包含miR-708，其靶向RHO (參見Behrman等人,JCB 192(6) :919-27 (2011)。
在一些實施例中，miRNA藉由下調基因抑制劑之表現來上調一基因之表現。在一些實施例中，抑制劑為天然(例如，野生型)抑制劑。在一些實施例中，抑制劑產生自突變、異源、及/或錯誤表現之基因。 E. 異源部分
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣，其中該治療性蛋白包含至少一個異源部分。在一些實施例中，異源部分融合至治療性蛋白之N端或C端。在其他實施例中，異源部分插入在治療性蛋白內之兩個胺基酸之間。
在一些實施例中，治療性蛋白包含FVIII多肽及異源部分，該異源部分插入在FVIII多肽內之兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源部分在選自表5之一或多個插入位點插入於FVIII多肽內。在一些實施例中，異源胺基酸序列可在國際公開案第WO 2013/123457 A1號、第WO 2015/106052 A1號、或美國公開案第2015/0158929 A1號中所揭示之任何位點插入於本揭露之核酸分子所編碼之凝血因子多肽內，該等案以全文引用之方式併入本文。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FVIII及異源部分，其中異源部分緊鄰相對於成熟FVIII之胺基酸745之下游插入於FVIII內。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FVIII及XTEN，其中XTEN緊鄰相對於成熟FVIII之胺基酸745之下游插入於FVIII內。在一個特定實施例中，FVIII包含胺基酸746-1646之缺失，其對應於成熟 人類FVIII (SEQ ID NO:15)，且異源部分緊鄰對應於成熟人類FVIII (SEQ ID NO:15)之胺基酸745之下游插入。表 5 ： FVIII異源部分插入位點
在一些實施例中，治療性蛋白包含FIX多肽及異源部分，該異源部分插入在FIX多肽內之兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源部分在選自表5之一或多個插入位點插入於FIX多肽內。在一些實施例中，異源胺基酸序列可在國際申請案第PCT/US2017/015879號中所揭示之任何位點插入於本揭露之核酸分子所編碼之凝血因子多肽內，該案以全文引用之方式併入本文。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FIX多肽及異源部分，其中異源部分緊鄰相對於成熟FIX之胺基酸166之下游插入於FIX多肽內。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FIX及XTEN，其中XTEN緊鄰相對於成熟FVIII之胺基酸166之下游插入於FIX內。表 6 ： FIX異源部分插入位點
在其他實施例中，本揭露之治療性蛋白進一步包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、或8個異源核苷酸序列。在一些實施例中，全部異源部分皆相同。在一些實施例中，至少一個異源部分與其他異源部分不同。在一些實施例中，本揭露可包含2個、3個、4個、5個、6個、或多於7個串聯的異源部分。
在一些實施例中，異源部分增加治療性蛋白之半衰期(為「半衰期延長因子」)。
在一些實施例中，異源部分為當併入本揭露之蛋白中時具有與體內半衰期之延長相關的非結構化或結構化特徵的肽或多肽。非限制性實例包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白之Fc片段、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單元之C端肽(CTP)、HAP序列、XTEN序列、運鐵蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘胺酸連接子、聚絲胺酸連接子、白蛋白結合部分、或者此等多肽之任何片段、衍生物、變異體、或組合。在一個特定實施例中，異源胺基酸序列為免疫球蛋白恆定區或其部分、運鐵蛋白、白蛋白、或PAS序列。在一些態樣中，異源部分包括溫韋伯氏因子或其片段。在其他相關態樣中，異源部分可包括諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸、或此等元件之任何衍生物、變異體、或組合之非多肽部分之連接位點(例如，半胱胺酸胺基酸)。在一些態樣中，異源部分包含用作非多肽部分之連接位點的半胱胺酸胺基酸，該非多肽部分諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸、或此等元件之任何衍生物、變異體、或組合。
在一個具體實施例中，第一異源部分為此項技術中已知的半衰期延長分子，且第二異源部分為此項技術中已知的半衰期延伸分子。在某些實施例中，該第一異源部分(例如，第一Fc部分)及該第二異源部分(例如，第二Fc部分)彼此締合形成二聚體。在一個實施例中，該第二異源部分為第二Fc部分，其中該第二Fc部分與該第一異源部分(例如，該第一Fc部分)連接或締合。例如，該第二異源部分(例如，該第二Fc部分)可藉由連接子連接至該第一異源部分(例如，該第一Fc部分)或藉由共價或非共價鍵與該第一異源部分締合。
在一些實施例中，異源部分為包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成的多肽：至少約10、至少約100、至少約200、至少約300、至少約400、至少約500、至少約600、至少約700、至少約800、至少約900、至少約1000、至少約1100、至少約1200、至少約1300、至少約1400、至少約1500、至少約1600、至少約1700、至少約1800、至少約1900、至少約2000、至少約2500、至少約3000、或至少約4000個胺基酸。在其他實施例中，異源部分為包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成的多肽：約100至約200個胺基酸、約200至約300個胺基酸、約300至約400個胺基酸、約400至約500個胺基酸、約500至約600個胺基酸、約600至約700個胺基酸、約700至約800個胺基酸、約800至約900個胺基酸、或約900至約1000個胺基酸。
在某些實施例中，異源部分改善治療性蛋白之一或多個藥物動力學性質，而不顯著影響其生物活性或功能。
在某些實施例中，異源部分增加本揭露之治療性蛋白之體內及/或體外半衰期。在其他實施例中，異源部分促進本揭露之治療性蛋白或其片段(例如，在蛋白水解裂解FVIII蛋白之後包含異源部分之片段)之可視化或定位。本揭露之治療性蛋白或其片段之可視化和/或定位可為體內、體外、離體、或其組合。
在其他實施例中，異源部分增加本揭露之治療性蛋白或其片段(例如，在蛋白水解裂解治療性蛋白(例如，凝血因子)之後包含異源部分之片段)之穩定性。如本文所用，術語「穩定性」係指維持治療性蛋白中回應於環境條件(例如，升高或降低的溫度)之一或多個物理性質的業內公認之量度。在某些態樣中，物理性質可為維持治療性蛋白之共價結構(例如，不存在蛋白水解裂解、非所要氧化、或去醯胺)。在其他態樣中，物理性質亦可為治療性蛋白以適當折疊狀態存在(例如，不存在可溶性或不溶性聚集物或沈澱物)。在一個態樣中，治療性蛋白之穩定性係藉由檢定治療性蛋白之生物物理性質來測量，例如熱穩定性、pH解折疊曲線、穩定移除醣化、溶解性、生物化學功能(例如，結合至蛋白、受體、或配位體的能力)等、及/或其組合。在另一態樣中，生物化學功能係藉由相互作用之結合親和力來說明。在一個態樣中，蛋白穩定性之量度為熱穩定性，即對熱激發之抗性。可使用此項技術中已知之方法，諸如HPLC (高效液相層析)、SEC (尺寸排阻層析)、DLS (動態光散射)等來測量穩定性。測量熱穩定性之方法包括但不限於示差掃描量熱法(DSC)、示差掃描螢光法(DSF)、圓偏光二色性(CD)、及熱激發檢定。
在不同態樣中，本揭露之核酸分子所編碼之治療性蛋白包含至少一種半衰期延長因子，即異源部分，其相對於缺乏此異源部分之對應治療性蛋白之體內半衰期增加治療性蛋白之體內半衰期。治療性蛋白之體內半衰期可藉由熟習此項技術者已知的任何方法確定，例如，活性檢定(例如，顯色檢定或單級凝結aPTT檢定，其中治療性蛋白包含FVIII多肽)、ELISA、ROTEM® 等。
在一些實施例中，一或多種半衰期延長因子之存在致使治療性蛋白之半衰期相較於缺乏此等一或多種半衰期延長因子的對應蛋白之半衰期增加。包含半衰期延長因子之治療性蛋白之半衰期比缺乏此半衰期延長因子之對應治療性蛋白之體內半衰期長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、或至少約12倍。
在一個實施例中，包含半衰期延長因子之治療性蛋白之半衰期比缺乏此半衰期延長因子之對應蛋白之體內半衰期長約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約15倍、或約1.5倍至約10倍。在另一實施例中，包含半衰期延長因子之治療性蛋白之半衰期比缺乏此半衰期延長因子之對應蛋白之體內半衰期長約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2.5倍至約10倍、約2.5倍至約9倍、約2.5倍至約8倍、約2.5倍至約7倍、約2.5倍至約6倍、約2.5倍至約5倍、約2.5倍至約4倍、約2.5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍、或約6倍至約8倍。
在其他實施例中，包含半衰期延長因子之治療性蛋白之半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時、或至少約108小時。
在其他實施例中，包含半衰期延長因子之治療性蛋白之半衰期為約15小時至約兩週、約16小時至約一週、約17小時至約一週、約18小時至約一週、約19小時至約一週、約20小時至約一週、約21小時至約一週、約22小時至約一週、約23小時至約一週、約24小時至約一週、約36小時至約一週、約48小時至約一週、約60小時至約一週、約24小時至約六天、約24小時至約五天、約24小時至約四天、約24小時至約三天、或約24小時至約兩天。
在一些實施例中，包含半衰期延長因子之治療性蛋白之每位受試者之平均半衰期為約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時(1天)、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約40小時、約44小時、約48小時(2天)、約54小時、約60小時、約72小時(3天)、約84小時、約96小時(4天)、約108小時、約120小時(5天)、約六天、約七天(一週)、約八天、約九天、約10天、約11天、約12天、約13天、或約14天。
一或多個半衰期延長因子可融合至治療性蛋白之C端或N端或插入於治療性蛋白內。1. 免疫球蛋白恆定區或其部分
在另一態樣中，異源部分包含一或多個免疫球蛋白恆定區或其部分(例如，Fc區)。在一個實施例中，本揭露之經單離之核酸分子進一步包含編碼免疫球蛋白恆定區或其部分之異源核酸序列。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區其部分為Fc區。
免疫球蛋白恆定區包含表示為CH (恆定重)結構域(CH1、CH2等)之結構域。視同型(即IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE)而定，恆定區可包含三或四個CH結構域。一些同型(例如IgG)恆定區亦含有鉸鏈區。參見Janeway等人 2001,Immunobiology , Garland Publishing, N.Y., N.Y。
本揭露之免疫球蛋白恆定區或其部分可獲自許多不同來源。在一個實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分衍生自人類免疫球蛋白。然而，應理解免疫球蛋白恆定區或其部分可衍生自另一哺乳動物物種之免疫球蛋白，該哺乳動物物種包括例如齧齒動物(例如，小鼠、大鼠、兔、天竺鼠(guinea pig))或非人類靈長類動物(例如，黑猩猩、獼猴)物種。此外，免疫球蛋白恆定區或其部分可衍生自任何免疫球蛋白類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA、及IgE)及任何免疫球蛋白同型(包括IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4)。在一個實施例中，使用人類同型IgG1。
多種免疫球蛋白恆定區基因序列(例如，人類恆定區基因序列)可以公開可得之寄存物形式獲得。可選擇具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有用以降低免疫原性之特定修飾之恆定區結構域序列。許多抗體及抗體編碼基因序列已經公開且可使用業內公認之技術自此等序列獲得合適Ig恆定區序列(例如，鉸鏈、CH2、及/或CH3序列或其部分)。使用任何上述方法獲得之遺傳物質可接著加以改變或合成以獲得本揭露之多肽。應進一步瞭解本揭露之範疇涵蓋恆定區DNA序列之對偶基因、變異體、及突變。
免疫球蛋白恆定區或其部分之序列可例如使用經選擇用以擴增相關結構域之聚合酶鏈反應及引物來選殖。為自抗體選殖免疫球蛋白恆定區或其部分之序列，可自融合瘤、脾、或淋巴細胞單離mRNA，逆轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳述於美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號；第4,965,188號中；及例如「PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications」 Innis等人編, Academic Press, San Diego, CA(1990)；Ho等人 1989. Gene 77:51；Horton等人 1993.Methods Enzymol . 217:270中。PCR可藉由共通恆定區引物或藉由基於公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列之更特異性引物來起始。PCR亦可用於單離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，可藉由共通引物或較大同源探針(諸如小鼠恆定區探針)來篩選文庫。合適於擴增抗體基因之眾多引物組為此項技術中已知的，例如基於純化抗體之N端序列(Benhar及Pastan. 1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端之快速擴增物(Ruberti, F.等人 1994.J. Immunol. Methods 173:33)；抗體前導序列(Larrick等人 1989Biochem. Biophys. Res. Commun . 160:1250)之5'引子。抗體序列之選殖進一步描述於Newman等人在1995年1月25日申請之美國專利第5,658,570號中，該案以引用之方式併入本文。
本文所用之免疫球蛋白恆定區可包括所有結構域及鉸鏈區或其部分。在一個實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分包含CH2結構域、CH3結構域、及鉸鏈區，即Fc區或FcRn結合搭配物。
如本文所用，術語「Fc區」定義為多肽中對應於天然Ig之Fc區的部分，即如藉由其兩個重鏈之各別Fc域之二聚締合所形成。天然Fc區與另一Fc區形成均二聚體。相反，如本文所用之術語「遺傳融合Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指合成二聚Fc區，其包含在單一多肽鏈內遺傳連接之Fc結構域(即，在單一鄰接遺傳序列中編碼)。參見國際公開案第WO 2012/006635號，其以全文引用之方式併入本文。
在一個實施例中，「Fc區」係指單一Ig重鏈之一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶裂解位點(即IgG中之殘基216，將重鏈恆定區之第一殘基看作114)上游之鉸鏈區中開始且在抗體之C端處結束。據此，完全Fc區至少包含鉸鏈結構域、CH2結構域、及CH3結構域。
免疫球蛋白恆定區或其部分可為FcRn結合搭配物。FcRn在成人上皮組織中具有活性且表現在腸腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結腸、及直腸表面中(美國專利第6,485,726號)。FcRn結合搭配物為免疫球蛋白之結合FcRn之部分。
已自包括人類之若干哺乳動物物種單離出FcRn受體。已知人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn、及小鼠FcRn之序列(Story等人 1994, J. Exp. Med. 180:2377)。FcRn受體在相對較低之pH值下結合IgG (但不結合其他免疫球蛋白類別，諸如IgA、IgM、IgD、及IgE)，以細胞腔至漿膜方向跨細胞主動轉運IgG，且接著在間隙液中存在之相對較高pH值下釋放IgG。其表現在成人上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺及腸上皮(Israel等人1997, Immunology 92:69)、腎近端管狀上皮(Kobayashi等人2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)以及鼻上皮；陰道表面；及膽系表面中。
實用於本揭露中之FcRn結合搭配物涵蓋可由FcRn受體特異性結合之分子，包括完整IgG、IgG之Fc片段、及包括FcRn受體之完全結合區之其他片段。與FcRn受體結合之IgG之Fc部分的區域已基於X-射線晶體衍射得以描述(Burmeister等人，1994，Nature 372:379)。Fc與FcRn之主要接觸區域接近CH2結構域與CH3結構域之接合點。Fc-FcRn接觸全部在單一Ig重鏈內。FcRn結合搭配物包括完整IgG、IgG之Fc片段、及IgG之包括FcRn之完全結合區之其他片段。主要接觸位點包括CH2結構域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311、及314，及CH3結構域之胺基酸殘基385-387、428、及433-436。對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段之胺基酸編號所作之提及皆基於Kabat等人 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md。
結合於FcRn之Fc區或FcRn結合搭配物可藉由FcRn有效地跨越上皮障壁穿梭，由此提供一種全身性投與所要治療分子之非侵襲性手段。另外，包含Fc區或FcRn結合搭配物之融合蛋白由表現FcRn之細胞胞飲。但替代被標記以進行降解，此等融合蛋白再次重複利用進入循環中，由此增加此等蛋白之體內半衰期。在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區之部分為Fc區或FcRn結合搭配物，其通常經由二硫鍵及其他非特異性相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合搭配物締合以形成二聚體及更高級多聚體。
兩個FcRn受體可結合單一Fc分子。結晶學資料表明各FcRn分子結合Fc均二聚體之單一多肽。在一個實施例中，將FcRn結合搭配物(例如IgG之Fc片段)連接於生物活性分子會提供一種經口、經頰、舌下、經直腸、經陰道、以經鼻、或經由肺途徑投與之氣溶膠形式、或經由眼途徑遞送該生物活性分子之手段。在另一實施例中，可侵襲性投與凝血因子蛋白，例如皮下、靜脈內。
FcRn結合搭配物區域為可由FcRn受體特異性結合，隨後由Fc區之FcRn受體主動轉運之分子或其部分。特異性結合係指兩個分子在生理條件下形成相對穩定之複合物。特異性結合之特徵在於親和力較高且能力較低至中等，如與通常親和力較低且能力中等至較高之非特異性結合相區分。通常，當親和力常數KA高於106 M-1 或高於108 M-1 時，結合被視為特異性結合。必要時，可藉由改變結合條件來降低非特異性結合而不實質上影響特異性結合。諸如分子濃度、溶液之離子強度、溫度、允許結合時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等之適當結合條件可由熟練技術人員使用常規技術加以最佳化。
在某些實施例中，本揭露之核酸分子所編碼之治療性蛋白包含一或多個截短Fc區，儘管如此，該等Fc區仍然足以對Fc區賦予Fc受體(FcR)結合性質。例如，Fc區之結合FcRn之部分(即，FcRn結合部分)包含IgG1之約胺基酸282-438 (EU編號)(其中主要接觸位點為CH2結構域之胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311、及314及CH3結構域之胺基酸殘基385-387、428、及433-436)。因此，本揭露之Fc區可包含FcRn結合部分或由其組成。FcRn結合部分可衍生自包括IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4之任何同型之重鏈。在一個實施例中，使用來自具有人類同型IgG1之抗體之FcRn結合部分。在另一實施例中，使用來自具有人類同型IgG4之抗體之FcRn結合部分。
Fc區可獲自許多不同來源。在一個實施例中，多肽之Fc區衍生自人類免疫球蛋白。然而，應理解Fc部分可衍生自另一哺乳動物物種之免疫球蛋白，該哺乳動物物種包括例如齧齒動物(例如，小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如，黑猩猩、獼猴)物種。此外，Fc結構域或其部分之多肽可衍生自任何免疫球蛋白類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA、及IgE)及任何免疫球蛋白同型(包括IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4)。在另一實施例中，使用人類同型IgG1。
在某些實施例中，Fc變異體賦予由包含該野生型Fc結構域之Fc部分賦予之至少一種效應功能的變化(例如，Fc區結合於Fc受體(例如，FcγRI、FcγRII、或FcγRIII)或補體蛋白(例如，C1q)、或觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或補體依賴性細胞毒性(CDCC)之能力改良或降低)。在其他實施例中，Fc變異體提供工程改造之半胱胺酸殘基。
本揭露之Fc區可採用業內公認之已知會賦予效應功能及/或FcR或FcRn結合變化(例如增強或降低)之Fc變異體。特定言之，本揭露之Fc區可包括例如在以下揭示之一或多個胺基酸位置處之變化(例如，取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、及WO06/085967A2；美國專利申請案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第US20070248603號、第US20070286859號、第US20080057056號；或美國專利5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253、7,083,784、7,404,956、及7,317,091，該等案各自以引用方式併入本文。在一個實施例中，可在一或多個揭示之胺基酸位置處進行具體變化(例如，此項技術中揭示之一或多個胺基酸之具體取代)。在另一實施例中，可在一或多個揭示之胺基酸位置處進行不同變化(例如，此項技術中揭示之一或多個胺基酸位置之不同取代)。
IgG之Fc區或FcRn結合搭配物可根據充分認可之程序(諸如定點誘變及其類似程序)加以修飾以產生將由FcRn結合之經修飾IgG或其Fc片段或部分。此等修飾包括保持或甚至增強與FcRn之結合的遠離FcRn接觸位點之修飾以及在接觸位點內之修飾。例如，可取代人類IgG1 Fc(Fc γ1)中之以下單一胺基酸殘基而不顯著損失Fc對FcRn之結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A、及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238處野生型脯胺酸經丙胺酸取代。例如，一具體實施例併有N297A突變，從而移除高度保守之N-醣化位點。除丙胺酸之外，其他胺基酸亦可在以上指定位置處取代野生型胺基酸。突變可逐一引入Fc中，從而產生多於一百個不同於天然Fc之Fc區。另外，兩個、三個或更多個此等個別突變之組合可一起引入，從而產生數百個以上Fc區。
某些以上突變可對Fc區或FcRn結合搭配物賦予新功能性。例如，一個實施例併有N297A，從而移除高度保守之N-醣化位點。此突變之作用在於降低免疫原性，藉此增強Fc區之循環半衰期，及在不損害對FcRn之親和力下致使Fc區不能結合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、及FcγRIIIA (Routledge等人 1995, Transplantation 60:847；Friend等人 1999, Transplantation 68:1632；Shields等人 1995, J. Biol. Chem. 276:6591)。作為由上述突變產生之新功能之另一實例，在一些情況下可提高對FcRn之親和力使其超過野生型之親和力。此親和力增大可反映「吸附」速率提高、「脫附」速率降低、或「吸附」速率提高與「脫附」速率降低兩者。咸信會賦予對FcRn之親和力增加之突變的實例包括但不限於T256A、T307A、E380A、及N434A (Shields等人 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)。
另外，至少三種人類Fcγ受體似乎識別IgG上在下鉸鏈區內之結合位點，通常為胺基酸234-237。因此，新功能及潛在降低之免疫原性之另一實例可由於此區之突變而產生，例如藉由將人類IgG1之胺基酸233-236「ELLG」(SEQ ID NO: 45)置換成來自IgG2之相應序列「PVA」(其中有一個胺基酸缺失)來產生。已顯示當已引入此等突變時，介導各種效應功能之FcγRI、FcγRII、及FcγRIII將不結合IgG1。Ward及Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77及Armour等人 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613。
在另一實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分包含在鉸鏈區或其部分中之與第二免疫球蛋白恆定區或其部分形成一或多個二硫鍵的胺基酸序列。該第二免疫球蛋白恆定區或其部分可連接於第二多肽，將治療性蛋白及該第二多肽結合在一起。在一些實施例中，該第二多肽為強化子部分。如本文所用，術語「強化子部分」係指能夠增強治療性蛋白之活性的分子、其片段、或多肽之組分。強化子部分可為輔因子，諸如，其中治療性蛋白為凝血因子、可溶性組織因子(sTF)、或促凝血肽。因此，當活化凝血因子時，強化子部分可用於增強凝血因子活性。
在某些實施例中，本揭露之核酸分子所編碼之治療性蛋白包含對免疫球蛋白恆定區或其部分之胺基酸取代(例如，Fc變異體)，其改變Ig恆定區之抗原非依賴性效應功能，特定言之改變蛋白之循環半衰期。2. scFc 區
在另一態樣中，異源部分包含scFc (單鏈Fc)區。在一個實施例中，本揭露之經單離之核酸分子進一步包含編碼scFc區之異源核酸序列。scFc區在相同線性多肽鏈內包含至少兩個免疫球蛋白恆定區或其部分(例如，Fc部分或Fc結構域(例如，2、3、4、5、6或更多個Fc部分或結構有))，其能夠折疊(例如，分子內折疊或分子間折疊)以形成一個由Fc肽連接子連接的功能性scFc區。例如，在一個實施例中，本揭露之多肽能夠經由其scFc區結合至至少一個Fc受體(例如，FcRn、FcγR受體(例如，FcγRIII))或補體蛋白(例如，C1q))以延長半衰期或觸發免疫效應功能(例如，抗體依賴細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或補體依賴細胞毒性(CDCC)、及/或改良可製造性)。 3. CTP
在另一態樣中，異源部分包含人類絨毛促性腺激素之β亞單元之一個C端肽(CTP)或其片段、變異體、或衍生物。已知一或多個插入重組蛋白中之CTP肽會增加該蛋白之體內半衰期。參見例如美國專利第5,712,122號，其以全文引用之方式併入本文。
示範性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO: 33)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO: 34)。參見例如美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號，其以引用之方式併入本文。 4. XTEN序列
在一些實施例中，異源部分包含一或多個XTEN序列、其片段、變異體、或衍生物。如本文所用，「XTEN序列」係指具有非天然存在、實質上非重複、主要包含小親水性胺基酸之序列的長度延長之多肽，該序列在生理條件下具有較低程度之二級或三級結構或無二級或三級結構。作為異源部分，XTEN可充當半衰期延長部分。此外，XTEN可提供合乎需要之性質，包括但不限於增強的藥物動力學參數及可溶性特徵。
將包含XTEN序列之異源部分併入至本揭露之蛋白中可賦予蛋白一或多種以下有利性質：構形可撓性、增強之水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體之低結合作用、或增加之流體動力學(或斯托克斯(Stokes))半徑。
在某些態樣中，XTEN序列可增加藥物動力學性質，諸如較長的體內半衰期或增加的曲線下面積(AUC)，使得本揭露之蛋白相較於無XTEN異源部分之蛋白體內停留且具有促凝血活性達增加之時段。
在一些實施例中，實用於本揭露之XTEN序列為具有超過約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有超過約20至約3000個胺基酸殘基、超過30至約2500個殘基、超過40至約2000個殘基、超過50至約1500個殘基、超過60至約1000個殘基、超過70至約900個殘基、超過80至約800個殘基、超過90至約700個殘基、超過100至約600個殘基、超過110至約500個殘基、或超過120至約400個殘基之肽或多肽。在一特定實施例中，XTEN包含長度長於42個胺基酸且短於144個胺基酸之胺基酸序列。
本揭露之XTEN序列可包含一或多個具有5至14個(例如，9至14個)胺基酸殘基之序列基序或與該序列基序至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致之胺基酸序列，其中該基序包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自由甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)、及脯胺酸(P)組成之群的4至6種類型之胺基酸(例如5個胺基酸)。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含不重疊序列基序，其中約80%、或至少約85%、或至少約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%、或約100%之序列由多個選自由表7選擇之單一基元家族之不重疊序列之單元組成，從而產生家族序列。如本文所用，「家族」意謂XTEN之基序僅選自表7之單個基序類別；即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、或BD XTEN，且選擇並非來自家族基序的XTEN中任何其他胺基酸以達成所需性質，諸如允許藉由編碼核苷酸併入限制位點、併入裂解序列或以達成對治療性蛋白的更好鍵聯。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含以下者之非重疊序列基序之多個單元：AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族、或BD家族，所得XTEN顯示上文所述之同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表7中二或更多個基序家族之基序序列的多個單元。此等序列可經選擇以達成所需物理/化學特徵，包括諸如淨電荷、親水性、缺乏二級結構、或缺乏重複性之特性，該等特性係由基序之胺基酸組成賦予，下文將更全面地描述。在以上本段描述之實施例中，併入XTEN中之基序可使用本文所述之方法選擇及組裝以獲得具有約36至約3000個胺基酸殘基之XTEN。表 7. 具有12個胺基酸之XTEN序列基序及基序家族 *表示當以各種排列一起使用時產生「家族序列」之個別基序序列
可用作本揭露之治療性蛋白中之異源部分的XTEN序列之實例揭示於例如美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號、或第2011/0172146 A1號，或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號、或第WO 2011028344 A2號中，該等案各自以全文引用的方式併入本文。
XTEN可具有不同長度以供插入治療性蛋白中或與其連接。在一個實施例中，基於欲在融合蛋白中達成之性質或功能選擇(一或多個)XTEN序列之長度。取決於預期特性或功能，XTEN可為可充當載劑的短或中等長度序列或較長序列。在某些實施例中，XTEN包括具有約6至約99個胺基酸殘基的短區段、具有約100至約399個胺基酸殘基的中等長度區段，及具有約400至約1000個且高達約3000個胺基酸殘基的長度較長之區段。因此，插入治療性蛋白中或與其連接之XTEN之長度可為約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500、或至多約3000個胺基酸殘基長。在其他實施例中，XTEN序列長度為約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000、或約2000至約3000個胺基酸殘基。插入治療性蛋白中或與其連接之XTEN之精確長度可不同，而不會不利地影響治療性蛋白之活性。在一個實施例中，本文所用之一或多個XTEN具有42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸、或864個胺基酸長度且可選自一或多個XTEN家族序列；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、或BD。
在一些實施例中，治療性蛋白包含FVIII多肽及XTEN，其中XTEN包含288個胺基酸。在一個實施例中，治療性蛋白包含FVIII多肽及XTEN，其中XTEN包含288個胺基酸，且XTEN插入於FVIII多肽之B結構域內。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FVIII多肽及包含SEQ ID NO:109之XTEN，且XTEN插入於FVIII多肽之B結構域內。在一個特定實施例中，治療性蛋白包含FVIII多肽及包含SEQ ID NO:109之XTEN，且XTEN緊鄰成熟FVIII之胺基酸745之下游插入於FVIII多肽內。
在一些實施例中，治療性蛋白包含FIX多肽及XTEN，其中XTEN包含72個胺基酸。在一個實施例中，治療性蛋白包含FIX多肽及XTEN，其中XTEN包含72個胺基酸，且XTEN緊鄰成熟FIX之胺基酸166之下游插入於FIX多肽內。
在一些實施例中，本揭露中所用之XTEN序列與選自由以下組成之群之序列至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004、及其任何組合。參見US 2010-0239554 A1。在一特定實施例中，XTEN包含AE42、AE72、AE144、AE288、AE576、AE864、AG42、AG72、AG144、AG288、AG576、AG864、或其任何組合。
可用作本揭露之治療性蛋白之異源部分之示範性XTEN序列包括：XTEN AE42-4 (SEQ ID NO: 46，由SEQ ID NO: 47編碼)、XTEN AE144-2A (SEQ ID NO: 48，由SEQ ID NO: 49編碼)、XTEN AE144-3B (SEQ ID NO: 50，由SEQ ID NO: 51編碼)、XTEN AE144-4A (SEQ ID NO: 52，由SEQ ID NO: 53編碼)、XTEN AE144-5A (SEQ ID NO: 54，由SEQ ID NO: 55編碼)、XTEN AE144-6B (SEQ ID NO: 56，由SEQ ID NO: 57編碼)、XTEN AG144-1 (SEQ ID NO: 58，由SEQ ID NO: 59編碼)、XTEN AG144-A (SEQ ID NO: 60，由SEQ ID NO: 61編碼)、XTEN AG144-B (SEQ ID NO: 62，由SEQ ID NO: 63編碼)、XTEN AG144-C (SEQ ID NO: 64，由SEQ ID NO: 65編碼)、及XTEN AG144-F (SEQ ID NO: 66，由SEQ ID NO: 67編碼)。在一個特定實施例中，XTEN由SEQ ID NO:18編碼。
在另一實施例中，XTEN序列係選自由以下組成之群：AE36 (SEQ ID NO: 130)、AE42 (SEQ ID NO: 131)、AE72 (SEQ ID NO: 132)、AE78 (SEQ ID NO: 133)、AE144 (SEQ ID NO: 134)、AE144_2A (SEQ ID NO: 48)、AE144_3B (SEQ ID NO: 50)、AE144_4A (SEQ ID NO: 52)、AE144_5A (SEQ ID NO: 54)、AE144_6B (SEQ ID NO: 135)、AG144 (SEQ ID NO: 136)、AG144_A (SEQ ID NO: 137)、AG144_B (SEQ ID NO: 62)、AG144_C (SEQ ID NO: 64)、AG144_F (SEQ ID NO: 66)、AE288 (SEQ ID NO: 138)、AE288_2 (SEQ ID NO: 139)、AG288 (SEQ ID NO: 140)、AE576 (SEQ ID NO: 141)、AG576 (SEQ ID NO: 142)、AE864 (SEQ ID NO: 143)、AG864 (SEQ ID NO: 144)、XTEN_AE72_2A_1 (SEQ ID NO:145)、XTEN_AE72_2A_2 (SEQ ID NO: 146)、XTEN_AE72_3B_1 (SEQ ID NO: 147)、XTEN_AE72_3B_2 (SEQ ID NO: 148)、XTEN_AE72_4A_2 (SEQ ID NO: 149)、XTEN_AE72_5A_2 (SEQ ID NO: 150)、XTEN_AE72_6B_1 (SEQ ID NO: 151)、XTEN_AE72_6B_2 (SEQ ID NO: 152)、XTEN_AE72_1A_1 (SEQ ID NO: 153)、XTEN_AE72_1A_2 (SEQ ID NO: 154)、XTEN_AE144_1A (SEQ ID NO: 155)、AE150 (SEQ ID NO: 156)、AG150 (SEQ ID NO: 157)、AE294 (SEQ ID NO: 158)、AG294 (SEQ ID NO: 159)、及其任何組合。在一具體實施例中，XTEN序列係選自由以下組成之群：AE72、AE144、及AE288。本發明之某些XTEN序列之胺基酸序列顯示於表8中。表 8. XTEN序列
在一些實施例中，XTEN中少於100%之胺基酸係選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)、及脯胺酸(P)，或少於100%之序列由來自表7之序列基序或本文所提供之XTEN序列組成。在此類實施例中，XTEN之其餘胺基酸殘基係選自其他14種天然L-胺基酸中之任一者，但可優先選自親水性胺基酸，使得XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%之親水性胺基酸。綴合構築體中使用之XTEN中疏水性胺基酸之含量可低於5%、或低於2%、或低於1%之疏水性胺基酸含量。較少用於構築XTEN之疏水性殘基包括色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、及甲硫胺酸。此外，XTEN序列可含有少於5%、或少於4%、或少於3%、或少於2%、或少於1%、或無以下胺基酸：甲硫胺酸(例如，用以避免氧化)、或天冬醯胺、及麩醯胺酸(用以避免脫醯胺)。
一或多個XTEN序列可插入於治療性蛋白之C端或N端或插入於治療性蛋白之胺基酸序列中兩個胺基酸之間。例如，當治療性蛋白包含FVIII多肽時，XTEN可在選自表5之一或多個插入位點插入於兩個胺基酸之間。當治療性蛋白包含FIX多肽時，XTEN可在選自表5之一或多個插入位點插入於兩個胺基酸之間。
可根據本發明使用之XTEN序列之額外實例揭示於美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號、或第2011/0172146 A1號；或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號、第WO 2011028344 A2號、第WO 2014/011819 A2號、或第WO 2015/023891號中。 5. 白蛋白或其片段、衍生物、或變異體
在一些實施例中，異源部分包含白蛋白或功能性片段。人類血清白蛋白(HSA或HA)為以全長形式時具有609個胺基酸之蛋白，負責顯著比例的血清滲透壓且亦充當內源及外源配位體之攜帶物。如本文所用之術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變異體、衍生物、或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第2008/0194481A1號、第2008/0004206 A1號、第2008/0161243 A1號、第2008/0261877 A1號、或第2008/0153751 A1號；或PCT申請公開案第2008/033413 A2號、第2009/058322 A1號、或第2007/021494 A2號中，該等案以全文引用的方式併入本文。
在一個實施例中，本揭露之治療性蛋白包含進一步連接於選自由以下組成之群之第二異源部分的白蛋白、其片段或變異體：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如，Fc區)、PAS序列、HES、PEG、及其任何組合。 6. 白蛋白結合部分
在某些實施例中，異源部分為白蛋白結合部分，其包含白蛋白結合肽、細菌白蛋白結合結構域、白蛋白結合抗體片段、或其任何組合。
例如，白蛋白結合蛋白可為細菌白蛋白結合蛋白、抗體、或抗體片段，包括結構域抗體(參見美國專利第6,696,245號)。例如白蛋白結合蛋白可為細菌白蛋白結合結構域，諸如鏈球菌蛋白G之白蛋白結合結構域(Konig, T.及Skerra, A. (1998)J. Immunol. Methods 218, 73-83)。可用作綴合搭配物之白蛋白結合肽之其他實例為例如具有Cys-Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa4 -Cys共通序列者，其中Xaa1 為Asp、Asn、Ser、Thr、或Trp；Xaa2 為Asn、Gln、His、Ile、Leu、或Lys；Xaa3 為Ala、Asp、Phe、Trp、或Tyr；且Xaa4 為Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、或Thr，如美國專利申請案2003/0069395或Dennis等人(Dennis等人 (2002)J. Biol. Chem. 277, 35035-35043)中所述。
如Kraulis等人 , FEBS Lett. 378:190-194 (1996)及Linhult等人 , Protein Sci. 11:206-213 (2002)所揭示，來自鏈球菌蛋白G之結構域3為細菌白蛋白結合結構域之實例。白蛋白結合肽之實例包括一系列具有核心序列DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 35)之肽。參見例如Dennis等人 , J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭露於Muller及Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007)；Roovers等人 , Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007)；及Holt等人 , Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)中，該等參考文獻以全文引用的方式併入本文。此類白蛋白結合部分之實例為如Trussel等人 , Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)揭示之2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。
可使用脂肪酸，尤其是長鏈脂肪酸(LCFA)及長鏈脂肪酸樣白蛋白結合化合物，來延長本揭露之凝血因子蛋白之體內半衰期。LCFA樣白蛋白結合化合物之實例為16-(1-(3-(9-(((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)羰基氧基)-甲基)-7-磺基-9H-茀-2-基胺基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基硫基)十六酸(參見例如WO 2010/140148)。 7. PAS序列
在其他實施例中，異源部分為PAS序列。如本文所用之PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸、及脯胺酸殘基的胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成隨機捲曲構形。因此，PAS序列為包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成之可用作嵌合蛋白中之異源部分之一部分的構築嵌段、胺基酸聚合物、或序列卡匣：丙胺酸、絲胺酸、及脯胺酸。然而，熟習此項技術者應明白，當將不同於丙胺酸、絲胺酸、及脯胺酸之殘基作為次要成分添加於PAS序列中時，胺基酸聚合物亦可形成隨機捲曲構形。本文所用之術語「次要成分」意謂，可將不同於丙胺酸、絲胺酸、及脯胺酸之胺基酸在一定程度上添加於PAS序列中，例如高達約12% (即PAS序列之100個胺基酸中有約12個胺基酸)、高達約10% (即PAS序列之100個胺基酸中有約10個胺基酸)、高達約9% (即PAS序列之100個胺基酸中有約9個胺基酸)、高達約8% (即PAS序列之100個胺基酸中有約8個胺基酸)、約6% (即100個胺基酸中有約6個胺基酸)、約5% (即100個胺基酸中有約5個胺基酸)、約4% (即100個胺基酸中有約4個胺基酸)、約3% (即100個胺基酸中有約3個胺基酸)、約2% (即100個胺基酸中有約2個胺基酸)、約1% (即100個胺基酸中有約1個胺基酸)。不同於丙胺酸、絲胺酸、及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、及Val。
在生理條件下，PAS序列鏈段形成隨機捲曲構形且由此可介導凝血因子蛋白之提高的體內及/或體外穩定性。由於隨機捲曲結構域不採用穩定結構或藉由自身起作用，因而由凝血因子蛋白介導之生物活性基本上得以保存。在其他實施例中，形成隨機捲曲結構域的PAS序列為生物學插入物，尤其相對於血漿之蛋白水解、免疫原性、等電點/靜電行為、結合至細胞表面受體、或內化而言，然而其仍為生物可降解的，其提供超過諸如PEG之合成聚合物的優勢。
形成隨機捲曲構形的PAS序列之非限制性實例包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 36)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 37)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 38)、APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 39)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 40)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 41)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 42)、及其任何組合。PAS序列之額外實例根據例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號及PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號可知。 8. HAP序列
在某些實施例中，異源部分為富含甘胺酸之均聚胺基酸聚合物(HAP)。HAP序列可包含甘胺酸之重複序列，其長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸、或500個胺基酸。在一個實施例中，HAP序列能夠延長融合或連接至HAP序列的部分之半衰期。HAP序列之非限制性實例包括但不限於(Gly)n 、(Gly4 Ser)n 、或S(Gly4 Ser)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40。在一個實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200。 9. 運鐵蛋白或其片段
在某些實施例中，異源部分為運鐵蛋白或其片段。任何運鐵蛋白可用於製備本揭露之凝血因子蛋白。例如，野生型人類TF (TF)為具有679個胺基酸之蛋白(近似75 KDa (未考慮醣化)，其具有似乎起源於基因複製之兩個主要結構域，即N結構域(約330個胺基酸)及C結構域(約340個胺基酸)。參見GenBank登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847、及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其全部以全文引用的方式併入本文。運鐵蛋白包含兩個結構域，即N結構域及C結構域。N結構域包含兩個子結構域，即N1結構域及N2結構域，且C結構域包含兩個子結構域，即C1結構域及C2結構域。
在一個實施例中，運鐵蛋白異源部分包括運鐵蛋白剪接變異體。在一個實例中，運鐵蛋白剪接變異體可為人類運鐵蛋白之剪接變體，例如Genbank登錄AAA61140。在另一實施例中，嵌合蛋白之運鐵蛋白部分包括運鐵蛋白序列之一或多個結構域，例如N結構域、C結構域、N1結構域、N2結構域、C1結構域、C2結構域、或其任何組合。 10. 清除受體
在某些實施例中，異源部分為清除受體、其片段、變異體、或衍生物。LRP1為600 kDa膜主體蛋白，其涉及諸如因子X之多種蛋白之受體介導清除。參見例如，Narita等人, Blood 91:555-560 (1998)。 11. 溫韋伯氏因子或其片段
在某些實施例中，異源部分為溫韋伯氏因子(VWF)或其一或多個片段。
VWF(亦稱為F8VWF)為一種存在於血漿中且在內皮(在懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中)、巨核細胞(血小板之α-顆粒)、及內皮下結締組織中組成性產生之大型多聚醣蛋白。基本VWF單體為具有2813個胺基酸之蛋白。每個單體含有許多具有具體功能之具體結構域，即D'及D3結構域(其一起結合因子VIII)、A1結構域(其結合血小板GPIb受體、肝素、及/或可能膠原蛋白)、A3結構域(其結合膠原蛋白)、C1結構域(其中RGD結構域在此結構域活化時結合血小板整合素αIIbβ3)、及在蛋白之C端之「半胱胺酸結」結構域(VWF與血小板源性生長因子(PDGF)、轉形生長因子-β (TGFβ)、及β-人類絨毛膜促性腺素(βHCG)共有該結構域)。
人類VWF之具有2813個單體胺基酸之序列在Genbank中報導為登錄號NP000543.2。編碼人類VWF之核苷酸序列在Genbank中報導為登錄號NM000552.3。SEQ ID NO: 129為由SEQ ID NO: 128編碼之胺基酸序列。D'結構域包括SEQ ID NO: 129之胺基酸764至866。D3結構域包括SEQ ID NO: 44之胺基酸867至1240。
在血漿中，95-98%之FVIII以與全長VWF之緊密非共價複合物形式循環。此複合物之形成對於維持體內FVIIII之適當血漿水準而言為重要的。Lenting等人 .,Blood. 92(11): 3983-96 (1998)；Lenting等人 .,J. Thromb. Haemost . 5(7): 1353-60 (2007)。當FVIII由於在重鏈中之位置372及740處及在輕鏈中之位置1689處之蛋白水解而活化時，結合於FVIII之VWF自活化FVIII移除。
在某些實施例中，異源部分為全長溫韋伯氏因子。在其他實施例中，異源部分為溫韋伯氏因子片段。如本文所用，術語「VWF片段」意謂與FVIII相互作用且保留至少一或多種通常由全長VWF對FVIII提供之性質之任何VWF片段，該等性質例如防止過早活化成FVIIIa、防止過早蛋白水解、防止與磷脂膜進行可導致過早清除之締合、防止結合可結合裸露FVIII而非VWF結合之FVIII之FVIII清除受體、及/或穩定化FVIII重鏈及輕鏈相互作用。在一具體實施例中，異源部分為包含VWF之D'結構域及D3結構域之(VWF)片段。包含D'域及D3域之VWF片段可進一步包含選自由以下組成之群之VWF結構域：A1結構域、A2結構域、A3結構域、D1結構域、D2結構域、D4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、C1結構域、C2結構域、CK結構域、其一或多個片段及其任何組合。融合至VWF片段之具有FVIII活性之多肽之額外實例揭示於2012年7月3日申請之美國臨時專利申請案第61/667,901號及美國公開案第2015/0023959 A1號，該等案以全文引用之方式併入本文。 12. 連接子部分
在某些實施例中，異源部分為肽連接子。
如本文所用，術語「肽連接子」或「連接子部分」係指將兩個結構域以多肽鏈之線性胺基酸序列來連接的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。
在一些實施例中，肽連接子可插入於本揭露之治療性蛋白與上文所述之異源部分(諸如白蛋白)之間。肽連接子可為嵌合多肽分子提供可撓性。連接子通常不經裂解，然而，此裂解可為合乎需要的。在一個實施例中，此等連接子在加工期間不經移除。
可存在於本揭露之嵌合蛋白中的連接子之類型為蛋白酶可裂解連接子，其包含裂解位點(即，蛋白酶裂解位點受質，例如因子XIa、Xa，或凝血酶裂解位點)且其可在裂解位點之N端或C端或兩側包括額外連接子。當併入至本揭露之構築體中時，此等可裂解連接子得到具有異源裂解位點之嵌合分子。
在一個實施例中，本揭露之核酸分子所編碼之治療性蛋白包含二或更多個Fc結構域或部分，其經由cscFc連接子連接以形成包含於單一多肽鏈中之Fc區。cscFc連接子側接至少一個細胞內加工位點，即藉由細胞內酶裂解之位點。在該至少一個細胞內加工位點處之多肽之裂解得到包含至少兩個多肽鏈的多肽。
其他肽連接子可視情況用於本揭露之構築體中例如以將凝血因子蛋白連接至Fc區。可結合本揭露使用之一些示範性連接子包括例如下文更詳細所述之包含GlySer胺基酸之多肽。
在一個實施例中，肽連接子為合成的，即非天然存在的。在一個實施例中，肽連接子包括以下肽(或多肽)(其可為或可不為天然存在的)，其包含將第一線性胺基酸序列連接或基因融合至其在自然界中不天然連接或基因融合的第二線性胺基酸序列的胺基酸序列。例如，在一個實施例中，肽連接子可包含非天然存在之多肽，其為天然存在之多肽之經修飾形式(例如，包含諸如添加、取代、或缺失之突變)。在另一實施例中，肽連接子可包含非天然存在之胺基酸。在另一實施例中，肽連接子可在不存在於自然界中之線性序列中存在的天然存在之胺基酸。在另一實施例中，肽連接子可包含天然存在之多肽序列。
例如，在某些實施例中，肽連接子可用於融合相同的Fc部分，由此形成均二聚scFc區。在其他實施例中，肽連接子可用於融合不同的Fc部分(例如，野生型Fc部分及Fc部分變異體)，由此形成異二聚scFc區。
在另一實施例中，肽連接子包含gly-ser連接子或由其組成。在一個實施例中，scFc或cscFc連接子至少包含免疫球蛋白鉸鏈之一部分及gly-ser連接子。如本文所用，術語「gly-ser連接子」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。在某些實施例中，該gly-ser連接子可插入於肽連接子之兩個其他序列之間。在其他實施例中，gly-ser連接子連接於肽連接子之另一序列之一或兩個末端。在其他實施例中，將二或更多gly-ser連接子以串聯形式併入肽連接子中。在一個實施例中，本揭露之肽連接子包含上鉸鏈區之至少一部分(例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4分子)、中鉸鏈區之至少一部分(例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4分子)、及一系列gly/ser胺基酸殘基。
本揭露之肽連接子至少一個胺基酸長且可具有不同長度。在一個實施例中，本揭露之肽連接子之長度為約1至約50個胺基酸。如此情形中所用，術語「約」指示+/-兩個胺基酸殘基。因為連接子長度必須為正整數，所以長度為約1至約50個胺基酸長意謂長度為1-3至48-52個胺基酸長。在另一實施例中，本揭露之肽連接子之長度為約10至約20個胺基酸。在另一實施例中，本揭露之肽連接子之長度為約15至約50個胺基酸。在另一實施例中，本揭露之肽連接子之長度為約20至約45個胺基酸。在另一實施例中，本揭露之肽連接子之長度為約15至約35或約20至約30個胺基酸。在另一實施例中，本揭露之肽連接子之長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、或2000個胺基酸。在一個實施例中，本揭露之肽連接子之長度為20或30個胺基酸。
在一些實施例中，肽連接子可包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、或至少100個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子可包含至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個、或至少1,000個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000個胺基酸。肽連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸、或900-1000個胺基酸。
可使用此項技術中已知的技術將肽連接子引入多肽序列中。可藉由DNA序列分析確認修飾。可使用質體DNA來轉形宿主細胞以便穩定地產生多肽產物。 13. 單體-二聚體雜交物
在一些實施例中，本揭露之治療性蛋白包含有包含凝血因子之單體-二聚體雜交分子。
本文使用之術語「單體-二聚體雜交物」係指包含藉由二硫鍵彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈之嵌合蛋白，其中該第一鏈包含凝血因子(例如，FVIII)及第一Fc區，且該第二鏈包含無凝結因子之第二Fc區、基本上由其組成、或由其組成。因此，單體-二聚體雜交物構築體為一種雜交物，其包含僅具有一個凝血因子之單體態樣及具有兩個Fc區之二聚體態樣。14. 表現控制序列
在一些實施例中，本揭露之核酸分子進一步包含至少一個表現控制序列。如本文所用之表現控制序列為有助於可操作地連接之編碼核酸之高效轉錄及轉譯的任何調控性核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-強化子組合。例如，本揭露之核酸分子可以可操作地連接至至少一個轉錄控制序列。基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成型或誘導性啟動子。
組成型哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子、及其他組成型啟動子。在真核細胞中組成性起作用之示範性病毒啟動子包括例如來自細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒(例如，SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、細胞巨大病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)、及其他反轉錄病毒之啟動子、及單純性皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。一般熟習此項技術者已知其他組成型啟動子。實用作本揭露之基因表現序列之啟動子亦包括誘導性啟動子。誘導性啟動子在誘導劑存在下表現。例如，誘導金屬硫蛋白啟動子以促進在某些金屬離子存在下之轉錄及轉譯。其他誘導性啟動子為一般熟習此項技術者所已知。
在一個實施例中，本揭露包括轉殖基因在組織特異性啟動子及/或強化子之控制下的表現。在另一實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性增強肝細胞中轉殖基因之表現。在某些實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性增強肝細胞、竇狀細胞、及/或內皮細胞中轉殖基因之表現。在一個特定實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性增強內皮細胞中轉殖基因之表現。在某些實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性增強基細胞、中樞神經系統、眼睛、肝、心臟、或其任何組合中轉殖基因之表現。肝特異性啟動子之實例包括但不限於小鼠thyretin啟動子(mTTR)、內源性人類因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子、及小鼠白蛋白啟動子。在一特定實施例中，啟動子包含mTTR啟動子。mTTR啟動子描述於R. H. Costa等人, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697。F8啟動子描述於Figueiredo及Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838。在一些實施例中，啟動子係選自肝特異性啟動子(例如，α1-抗胰蛋白酶(AAT))、肌肉特異性啟動子(例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、肌凝蛋白重鏈α (αMHC)、肌紅蛋白(MB)、及肌間線蛋白(DES))、合成啟動子(例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、及tMCK)、及其任何組合。
在一個實施例中，該啟動子係選自由以下所組成之群：小鼠thyretin啟動子(mTTR)、人類內源性因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、TTPp、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌凝蛋白重鏈α (αMHC)、肌紅蛋白(MB)、肌間線蛋白(DES)、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、及tMCK、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、及其任何組合。
表現水準可使用一或多個強化子經進一步增強以達成治療功效。一或多個強化子可單獨或與一或多個啟動子元件一起提供。通常，表現控制序列包含複數個強化子元件及一組織特異性啟動子。在一個實施例中，強化子包含α-1-微球蛋白/比庫蛋白(bikunin)強化子之一或多個複本(Rouet等人, 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773；Rouet等人, 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404；Rouet等人, 1998, Biochem. J. 334:577-584；Ill等人, 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30)。在另一實施例中，強化子衍生自肝特異性轉錄因子結合位點，諸如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、及Enh1，其包含HNF1、(意義)-HNF3、(意義)-HNF4、(反義)-HNF1、(反義)-HNF6、(意義)-EBP、(反義)-HNF4 (反義)。
在一特定實例中，實用於本揭露之啟動子包含SEQ ID NO: 69 (即，ET啟動子)，其亦稱為GenBank編號AY661265。亦參見Vigna等人,Molecular Therapy 11(5) :763 (2005)。其他合適之載體及基因調控元件之實例描述於WO 02/092134、EP1395293、或美國專利第6,808,905號、第7,745,179號或第7,179,903號，該等案以全文引用之方式併入本文。
在一個實施例中，本揭露之核酸分子進一步包含內含子序列。在一些實施例中，內含子序列定位於編碼FVIII多肽之核酸序列之5'方向。在一些實施例中，內含子序列為天然存在之內含子序列。在一些實施例中，內含子序列為合成序列。在一些實施例中，內含子序列衍生自天然存在之內含子序列。在某些實施例中，內含子序列包含SV40小T內含子。在一個實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 115。
在一些實施例中，核酸分子進一步包含轉錄後調控元件。在某些實施例中，轉錄後調控元件包含突變土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。在一個特定實施例中，轉錄後調控元件包含SEQ ID NO: 120。
在一些實施例中，核酸分子包含微小RNA (miRNA)結合位點。在一個實施例中，miRNA結合位點為miR-142-3p之miRNA結合位點。在其他實施例中，miRNA結合位點係選自Rennie等人,RNA Biol. 13(6) :554-560 (2016)及可在http://sfold.wadsworth.org/starmirDB.php獲得之STarMirDB所揭示之miRNA結合位點，其以全文引用之方式併入本文。
在一些實施例中，核酸分子包含一或多個DNA核靶向序列(DTS)。DTS促進含有此類序列之DNA分子易位至細胞核中。在某些實施例中，DTS包含SV40強化子序列。在某些實施例中，DTS包含c-Myc強化子序列。在一些實施例中，DTS在該第一ITR與該第二ITR之間。在一些實施例中，DTS在該第一ITR之3'方向及治療性蛋白之5'方向。在其他實施例中，DTS在治療性蛋白之3'方向及該第二ITR之5'方向。
在一些實施例中，核酸分子進一步包含3'UTR聚(A)尾序列。在一個實施例中，3'UTR聚(A)尾序列包含bGH聚(A)。在一個實施例中，3'UTR聚(A)尾包含肌動蛋白聚(A)位點。在一個實施例中，3'UTR聚(A)尾包含肌動蛋白聚(A)位點。
在一個特定實施例中，3'UTR聚(A)尾序列包含SEQ ID NO: 122。 III. 組織特異性表現
在某些實施例中，在載體內包括一或多個miRNA靶序列為實用的，該一或多個miRNA序列可操作地連接至凝血因子轉殖基因。因此，本揭露亦提供至少一個可操作地連接至凝血因子核苷酸序列或以其他方式插入於載體內的miRNA靶序列。載體中包括多於一個miRNA靶序列複本可增加系統之有效性。亦包括不同的miRNA靶序列。例如，表現多於一個轉殖基因的載體可具有在多於一個可相同或不同的miRNA靶序列之控制下的轉殖基因。miRNA靶序列可為串聯的，但亦可包括其他排列。含有miRNA靶序列之轉殖基因表現卡匣亦可以反義定向插入於載體內。反義定向可實用於產生避免表現基因產物的病毒粒子，否則該等基因產物可能對生產細胞具有毒性。在其他實施例中，載體包含相同或不同miRNA靶序列之1、2、3、4、5、6、7、或8個複本。然而，在某些其他實施例中，載體將不包括任何miRNA靶序列。選擇是否包括miRNA靶序列(及多少miRNA靶序列)將藉由已知參數諸如預期靶組織、所需表現水準等來導引。
在一個實施例中，靶序列為miR-223靶標，據報導其在骨髓定向祖細胞中最有效地阻斷表現且在更原始的HSPC中至少部分地阻斷表現。miR-223靶標可阻斷分化骨髓細胞中之表現，包括顆粒球、單核球、巨噬細胞、骨髓樹突細胞。miR-223靶標亦可合適用於依賴於類淋巴球或類紅血球系中穩健的轉殖基因表現的基因療法應用。miR-223靶標亦可在人類HSC中非常有效地阻斷表現。
在另一實施例中，靶序列為miR142靶標(tccataaagt aggaaacact aca (SEQ ID NO: 43))。在一個實施例中，載體包含miR-142靶序列之4個複本。在某些實施例中，將造血特異性微小RNA之互補序列(諸如miR-142 (142T))併入例如慢病毒載體(LV)之載體之3'未轉譯區中，使編碼轉殖基因之轉錄本易受miRNA介導之下調。藉由此方法，可防止造血系抗原呈現細胞(APC)中之轉殖基因表現，同時維持非造血細胞中之轉殖基因表現(Brown等人, Nat Med 2006)。此策略可以對轉殖基因表現施加嚴格的轉錄後控制，且因此實現穩定遞送及轉殖基因之長期表現。在一些實施例中，miR-142調控防止經轉導細胞之免疫介導之清除及/或誘導抗原特異性調控T細胞(T reg)且介導穩健的對轉殖基因編碼之抗原之免疫耐受性。
在一些實施例中，靶序列為miR181靶標。Chen C-Z及Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165揭示miR-181，其為在小鼠骨髓內之B細胞中特異性表現之miRNA (Chen及Lodish, 2005)。亦揭示一些人類miRNA與白血病相關。
靶序列可完全或部分與miRNA互補。術語「完全互補」意謂靶序列具有與識別其之miRNA之序列100%互補的核酸序列。術語「部分互補」意謂靶序列僅與識別其之miRNA之序列部分互補，由此部分互補序列仍由該miRNA識別。換言之，在本揭露之上下文中，部分互補靶序列有效識別對應miRNA且有效防止或減少表現該miRNA之細胞中之轉殖基因表現。miRNA靶序列之實例描述於WO2007/000668、WO2004/094642、WO2010/055413、或WO2010/125471，該等案以全文引用之方式併入本文。
在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向肝。在某些實施例中，轉殖基因表現係靶向肝細胞。在其他實施例中，轉殖基因表現係靶向內皮細胞。在一個特定實施例中，轉殖基因表現係靶向天然表現內源FVIII之任何組織。
在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向中樞神經系統。在某些實施例中，轉殖基因表現係靶向神經元。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向傳入神經元。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向傳出神經元。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向中間神經元。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向膠細胞。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向星狀細胞。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向寡樹突細胞。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向微膠細胞。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向室管膜細胞。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向許旺細胞(Schwann cell)。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向衛星細胞。
在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向肌肉組織。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向平滑肌。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向心肌。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向骨骼肌。
在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向眼睛。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向感光細胞。在一些實施例中，轉殖基因表現係靶向視網膜節細胞。 IV. 宿主細胞
本揭露亦提供一種宿主細胞，其包含本揭露之核酸分子或載體。如本文所用，術語「轉形」應以廣義使用以指將DNA引入接受者宿主細胞，其改變基因型，因此產生接受者細胞變化。
「宿主細胞」係指已由載體轉形的細胞，該等載體使用重組DNA技術構築且編碼至少一個異源性基因。本揭露之宿主細胞較佳為哺乳動物來源；最佳為人類或小鼠來源。熟習此項技術者能夠優先確定最適合其目的的特定宿主細胞株。示範性宿主細胞株包括但不限於CHO、DG44及DUXB11 (中國倉鼠卵巢細胞株，DHFR-)、HELA (人類子宮頸癌)、CVI (猴腎細胞株)、COS (具有SV40 T抗原之CVI衍生物)、R1610 (中國倉鼠纖維母細胞) BALBC/3T3 (小鼠纖維母細胞)、HAK (倉鼠腎細胞株)、SP2/O (小鼠骨髓瘤)、P3×63-Ag3.653 (小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT (牛內皮細胞)、RAJI (人類淋巴球)、PER.C6® 、NS0、CAP、BHK21、及HEK 293 (人類腎)。在一個特定實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6® 細胞、NS0細胞、CAP細胞、及其任何組合。在一些實施例中，本揭露之宿主細胞為昆蟲來源。在一個特定實施例中，宿主細胞為SF9細胞。宿主細胞株通常可自商業服務、美國組織培養收藏中心(American Tissue Culture Collection)、或自公開文獻得到。
將本揭露之核酸分子或載體引入宿主細胞中可藉由熟習此項技術者所熟知的各種技術來實現。此等技術包括但不限於轉染(包括電泳及電穿孔)、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、細胞與包膜DNA之融合、微注射、及完整病毒感染。參見Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors " 第24.2章, 第470-472頁, Vectors, Rodriguez及Denhardt編(Butterworths, Boston, Mass. 1988)。最佳地，經由電穿孔將質體引入宿主中。轉形細胞在適於產生輕鏈及重鏈的條件下生長，並對該等轉形細胞檢定重鏈及/或輕鏈蛋白合成。示範性檢定技術包括酶聯結免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、或螢光活化細胞分選器分析(FACS)、免疫組織化學、及其類似技術。
包含本揭露之經單離之核酸分子或載體的宿主細胞生長於適當生長培養基中。如本文所用，術語「適當生長培養基」意謂含有為細胞生長所需之養分之培養基。為細胞生長所需之養分可包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物質、及生長因子。視情況，培養基可含有一或多種選擇因子。視情況，培養基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一個實施例中，培養基實質上不含有IgG。生長培養基將通常藉由例如藥物選擇或缺乏必需養分來選擇含有DNA構築體之細胞，該必需養分由DNA構築體上或與DNA構築體共轉染之可選擇標記補充。所培養哺乳動物細胞通常生長在市售含血清或不含血清培養基(例如MEM、DMEM、DMEM/F12)中。在一個實施例中，培養基為CDoptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA.)。在另一實施例中，培養基為CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.)。對適於所用特定細胞株之培養基之選擇屬於一般熟習此項技術者之水準。 V. 多肽之製備
本揭露亦提供由本揭露之核酸分子編碼之多肽。在其他實施例中，本揭露之多肽由包含本揭露之核酸分子之載體編碼。在其他實施例中，本揭露之多肽由包含本揭露之核酸分子之宿主細胞產生。
在其他實施例中，本揭露亦提供一種產生具有凝血因子例如FVIII活性之多肽之方法，其包含在產生具有凝血因子例如FVIII活性之多肽的條件下培養本揭露之宿主細胞，及回收具有凝血因子例如FVIII活性之多肽。在一些實施例中，具有凝血因子例如FVIII活性之多肽之表現相對於在相同條件下培養但包含參考核苷酸序列(例如，SEQ ID NO: 16，親本FVIII基因序列)的宿主細胞增加。
在其他實施例中，本揭露提供一種增加具有凝血因子例如FVIII活性之多肽之表現的方法，其包含在核酸分子表現具有凝血因子例如FVIII活性之多肽的條件下培養本揭露之宿主細胞，其中具有凝血因子例如FVIII活性之多肽之表現相對於在相同條件下培養、包含參考核酸分子(例如，SEQ ID NO: 16，親本FVIII基因序列)之宿主細胞增加。
在其他實施例中，本揭露提供一種提高具有凝血因子例如FVIII活性之多肽之產率的方法，其包含在本文所揭示之核酸分子產生具有凝血因子例如FVIII活性之多肽的條件下培養宿主細胞，其中具有凝血因子例如FVIII活性之多肽之產率相對於在相同條件下培養、包含參考核酸序列(例如，SEQ ID NO: 16，親本FVIII基因序列)之宿主細胞增加。
本揭露之治療性蛋白(例如凝血因子)可在基因轉殖動物中合成，諸如齧齒動物、山羊、綿羊、豬、或奶牛。術語「基因轉殖動物」係指將外來基因併入其基因組中的非人類動物。因為此基因存在於生殖系組織中，所以其自親代傳遞至子代。將外源基因引入單細胞胚胎中(Brinster等人 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438)。產生基因轉殖動物之方法為此項技術中已知的，其包括產生免疫球蛋白分子的基因轉殖方法(Wagner等人 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376；McKnight等人 1983, Cell 34 : 335；Brinster等人 1983, Nature 306: 332；Ritchie等人 1984, Nature 312: 517；Baldassarre等人 2003, Theriogenology 59 : 831；Robl等人 2003, Theriogenology 59: 107；Malassagne等人 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267)。 VII. 醫藥組成物
含有本揭露之核酸分子、核酸分子編碼之多肽、載體、或宿主細胞之組成物可含有合適的醫藥上可接受之載劑。例如，其可含有有助於將活性化合物加工成設計用於遞送至作用部位之製劑之賦形劑及/或助劑。
在一個實施例中，本揭露係關於一種醫藥組成物，其包含(a)本文所揭示之核酸分子、載體、多肽、或宿主細胞；及(b)醫藥上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組成物進一步包含遞送藥劑。在某些實施例中，遞送藥劑包含脂質奈米粒子(LNP)。在其他實施例中，醫藥組成物進一步包含脂質體、其他聚合分子、及外切酶體。
醫藥組成物可經調配以用於藉由彈丸注射進行腸胃外投與(即，靜脈內、皮下、或肌肉內投與)。注射用調配物可以例如於安瓿或多劑量容器中之添加有防腐劑的單位劑型提供。組成物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液、或乳液之形式，且可含有調配劑，諸如助懸劑、穩定劑、及/或分散劑。或者，活性成分可呈用於以合適媒劑(例如無熱原水)復原之粉末形式。
適用於腸胃外投與之調配物亦包括呈水溶性形式(例如水溶性鹽)之活性化合物之水溶液。此外，可投與呈適當油性注射懸浮液形式之活性化合物懸浮液。合適親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或三酸甘油酯)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、及葡聚糖。視情況，懸浮液亦可含有穩定劑。脂質體亦可用於囊封本揭露之分子以遞送至細胞或間質間隙中。示範性醫藥上可接受之載劑為生理學可相容溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑、水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、及其類似物。在一些實施例中，組成物包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化鈉。在其他實施例中，組成物包含增強活性成分之保存期限或有效性之醫藥上可接受之物質，諸如濕潤劑或少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑、或緩衝劑。
本揭露之組成物可呈多種形式，包括例如液體(例如，可注射及可輸注溶液)、分散液、懸浮液、半固體、及固體劑型。較佳形式取決於投與模式及治療應用。
組成物可調配成溶液、微乳液、分散液、脂質體、或適於高藥物濃度之其他有序結構。可藉由將活性成分以所需量在必要時與以上列舉之一種成分或成分之組合一起併入適當溶劑中，隨後進行過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性成分併入含有基本分散介質及來自以上列舉之成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分外加來自先前無菌過濾溶液之任何其他所要成分的粉末。溶液之適當流動性可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂(lecithin))、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑加以維持。可注射組成物之延長吸收可藉由在組成物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
活性成分可與控制釋放調配物或裝置一起調配。此等調配物及裝置之實例包括植入物、經皮貼片、及微囊封遞送系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、及聚乳酸。製備此等調配物及裝置之方法在此項技術中為已知的。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
可注射儲槽調配物可藉由在諸如聚丙交酯-聚乙交酯之生物可降解聚合物中形成微囊封藥物基質來製備。視藥物與聚合物之比率及所用聚合物之性質而定，可控制藥物釋放速率。其他示範性生物可降解聚合物為聚原酸酯及聚酸酐。儲槽可注射調配物亦可藉由將藥物包埋在脂質體或微乳液中來製備。
補充性活性化合物可併入組成物中。在一個實施例中，本揭露之核酸分子與凝血因子、或其變異體、片段、類似物、或衍生物一起調配。例如，凝血因子包括但不限於因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、溫韋伯氏因子或重組可溶性組織因子(rsTF)、或任何前述因子之活化形式。止血劑之凝血因子亦可包括抗纖維蛋白溶解藥物，例如ε-胺基-己酸、胺甲環酸。
可調整劑量方案以提供最佳所要反應。例如，可投與單次推注，可隨時間推移投與幾次分開劑量，或者可按照治療情形之緊張程度所指示，按比例減少或增加劑量。有利的是以劑量單位形式調配非經腸組成物以易於投與及達成劑量均一性。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)。
除活性化合物之外，液體劑型亦可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇、及脫水山梨醇之脂肪酸酯。
合適醫藥載劑之非限制性實例亦描述於由E. W. Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑之一些實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、及其類似物。組成物亦可含有pH緩衝試劑及濕潤劑或乳化劑。
對於經口投與，醫藥組成物可採取藉由習知手段製備之錠劑或膠囊之形式。亦可將組成物製備成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物、或氫化可食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如，杏仁油、油脂、乙醇、或分餾植物油)及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。製劑亦可包括調味劑、著色劑、及甜味劑。或者，組成物可提供為乾燥產品，以供用水或其他適合媒劑復原。
對於經頰投與，組成物可採用根據習知方案之錠劑或口含錠之形式。
對於藉由吸入投與，供根據本揭露使用之化合物宜以有或無賦形劑之噴霧氣溶膠形式或以來自視情況具有推進劑之加壓包裝或噴霧器之氣溶膠噴霧形式遞送，該推進劑例如為二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳、或其他合適氣體。在加壓氣溶膠之情況下，劑量單位可藉由提供用以遞送經計量之量的閥來確定。可調配用於吸入器或吹入器中之例如明膠之膠囊及藥筒，其含有化合物與諸如乳糖或澱粉之合適粉末基質之粉末混合物。
醫藥組成物亦可經調配以栓劑或保留灌腸形式用於經腸投與，例如其含有習知栓劑基質，諸如可可脂或其他甘油酯。
在一些實施例中，組成物係藉由選自由以下組成之群之途徑投與：局部投與、眼內投與、腸胃外投與、鞘內投與、硬膜下投與、及經口投與。非經腸投與可為靜脈內或皮下投與。 VIII. 治療方法
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR、及遺傳卡匣，其中遺傳卡匣包含凝血因子，且其中核酸分子用於治療有需要之受試者之流血性疾病或病狀。流血性疾病或病狀係選自由以下組成之群：流血凝血障礙、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血、髂腰肌鞘中流血、及其任何組合。在其他實施例中，安排受試者經歷手術。在其他實施例中，治療為防治性或按需治療。
本揭露提供一種治療流血性病症之方法，其包含向有需要之受試者投與本揭露之核酸分子、載體、或多肽。在一些實施例中，流血性病症係之特徵在於凝血因子(例如FVIII)缺乏。在一些實施例中，流血性病症為血友病。在一些實施例中，流血性病症為A型血友病。在治療流血性病症之方法之一些實施例中，在投與之後24小時，凝血因子(例如，FVIII)之血漿活性相對於投與參考核酸分子(例如，SEQ ID NO: 16，親本FVIII基因序列)、包含參考核酸分子之載體、或由參考核酸分子編碼之多肽之受試者增加。
本揭露亦關於一種治療、改善、或預防受試者之止血障礙之方法，其包含投與治療有效量的本揭露之經單離之核酸分子或由本揭露之核酸分子編碼之具有凝血因子(例如，FVIII)活性之多肽。藉由經單離之核酸分子或經編碼之多肽的治療、改善、及預防可為繞道療法。接受繞道療法之受試者可已經發展凝血因子(例如，FVIII)之抑制劑，或傾向於發展凝血因子抑制劑。
本揭露之核酸分子、載體、或多肽藉由促進纖維蛋白凝塊之形成來治療或預防止血障礙。由本揭露之核酸分子編碼之具有凝血因子(例如，FVIII)活性之多肽可活化凝血級聯之成員。凝血因子可參與外在途徑、內在途徑、或兩者。
本揭露之核酸分子、載體、或多肽可用於治療已知可用凝血因子治療之止血障礙。可使用本揭露之方法治療之止血障礙包括但不限於A型血友病；B型血友病；溫韋伯氏病；因子XI缺乏(PTA缺乏)；因子XII缺乏；以及纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X、或因子XIII之缺乏或結構異常；關節積血；肌肉流血；口腔流血；出血；向肌肉中出血；口腔出血；創傷；頭部創傷；胃腸流血；顱內出血；腹內出血；胸內出血；骨折；中樞神經系統流血；咽後間隙中流血；腹膜後間隙中流血；及髂腰肌鞘中流血。
在一些實施例中，止血障礙為遺傳性病症。在一個實施例中，受試者患有A型血友病。在其他實施例中，止血障礙係由凝血因子缺乏引起。在其他實施例中，止血障礙係由FVIII缺乏引起。在其他實施例中，止血障礙可由缺陷型FVIII凝血因子引起。
在另一實施例中，止血障礙可為後天病症。後天病症可由潛在繼發性疾病或病狀導致。例如，無關病狀可為但不限於癌症、自體免疫疾病、或妊娠。後天病症可由高齡或由治療潛在繼發性病症之藥劑(例如，癌症化療)導致。
本揭露亦關於治療未患有止血障礙或導致獲得止血障礙的繼發性疾病或病狀的受試者的方法。因此，本揭露係關於一種治療需要止血劑之受試者之方法，其包含投與治療有效量的本揭露之經單離之核酸分子、載體、或多肽。例如，在一個實施例中，需要一般止血劑之受試者正經歷或將經歷手術。本揭露之經單離之核酸分子、載體、或多肽可在手術之前後之後作為防治劑投與。本揭露之經單離之核酸分子、載體、或多肽可在手術期間或之後投與以控制急性流血事件。手術可包括但不限於肝移植、肝切除、或幹細胞移植。
在另一實施例中，本揭露之經單離之核酸分子、載體、或多肽可用於治療未患有止血障礙而具有急性流血事件的受試者。急性出血事件可由嚴重外傷導致，例如手術、車禍、創傷、槍擊裂傷(laceration gun shot)或導致不受控制之出血的任何其他創傷性事件。
經單離之核酸分子、載體、或蛋白可用於防治性地治療具有止血障礙之受試者。經單離之核酸分子、載體、或蛋白可用於治療具有止血障礙之受試者之急性流血事件。
在另一實施例中，藉由投與本揭露之經單離之核酸分子或載體來表現凝血因子不誘導受試者之免疫反應。在一些實施例中，免疫反應包含產生針對凝血因子之抗體。在一個實施例中，免疫反應包含產生針對FVIII之抗體。在一些實施例中，免疫反應包含細胞介素分泌。在一些實施例中，免疫反應包含活化B細胞、T細胞、或B細胞及T細胞兩者。在一些實施例中，免疫反應為抑制性免疫反應，其中相對於未產生免疫反應之受試者中凝血因子之活性，受試者中之免疫反應減少凝血因子蛋白之活性。在某些實施例中，藉由投與本揭露之經單離之核酸分子或載體來表現凝血因子預防針對該凝血因子蛋白或自該經單離之核酸分子或該載體表現之凝血因子蛋白之抑制性免疫反應。
在一些實施例中，本揭露之經單離之核酸分子、載體、或蛋白組成物係與至少一種促進止血之其他藥劑組合投與。該其他藥劑促進治療中之止血證明凝血活性。作為實例而不作為限制，止血劑可包括FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、凝血酶原、或血纖維蛋白原、或前述任一者之活化形式。凝血因子或止血劑亦可包括抗血纖維蛋白分解藥，例如ε-胺基-己酸、胺甲環酸(tranexamic acid)。
在本揭露之一個實施例中，組成物(例如，經單離之核酸分子、載體、或多肽)為當向受試者投與時凝血因子以可活化形式存在的組成物。此一可活化分子可在向受試者投與之後體內在凝血部位經活化。
經單離之分子、載體、或多肽可靜脈內、皮下、肌肉內或經由任何黏膜表面，例如經口、舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經陰道、經由肺途徑投與。可將凝血因子蛋白植入生物聚合物固體支撐物內或連接至生物聚合物固體支撐物，從而允許嵌合蛋白緩慢釋放至所要部位。
對於經口投與，醫藥組成物可採取藉由習知手段製備之錠劑或膠囊之形式。亦可將組成物製備成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物、或氫化可食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如杏仁油、油脂、乙醇、或分餾植物油)及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。製劑亦可包括調味劑、著色劑、及甜味劑。或者，組成物可提供為乾燥產品，以供用水或其他適合媒劑復原。
對於經頰及舌下投與，組成物可根據習知方案採取錠劑、糖錠、或速溶膜形式。
對於藉由吸入投與，供根據本揭露使用之具有凝血因子活性之多肽宜與合適的推進劑一起以自加壓包裝或噴霧器之氣溶膠噴霧之形式(例如，於PBS中)遞送，該推進劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳、或其他合適氣體。在加壓氣溶膠之情況下，劑量單位可藉由提供用以遞送經計量之量的閥來確定。可調配用於吸入器或吹入器中之例如明膠之膠囊及藥筒，其含有化合物與諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物。
在一個實施例中，經單離之核酸分子、載體、或多肽之投與途徑為腸胃外投與。如本文所用之術語腸胃外包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、經直腸、或經陰道投與。腸胃外投與之靜脈內形式較佳。儘管所有此等投與形式皆明確涵蓋於本揭露之範疇內，但用於投與之形式將為注射用溶液，尤其靜脈內或動脈內注射或滴注用溶液。通常，合適的注射用醫藥組成物可包含緩衝液(例如，乙酸鹽、磷酸鹽、或檸檬酸鹽緩衝液)、界面活性劑(例如，聚山梨醇酯)、視情況選用之穩定劑(例如，人類白蛋白)等。然而，在其他與本文教示相容的方法中，可將經單離之核酸分子、載體、或多肽直接遞送至不良細胞群體位點，從而增加患病組織於治療劑之暴露。
用於腸胃外投與的製劑包括無菌水溶液或非水溶液，懸浮液、及乳液。非水溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)、及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳劑、或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。在本揭露中，醫藥上可接受之載劑包括但不限於0.01-0.1 M及較佳0.05 M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常用腸胃外媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液、或不揮發油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液，諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充液及類似者。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、及惰性氣體、及其類似者。
更特定而言，合適於注射用途的醫藥組成物包括無菌水溶液(水溶性的情況)或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在此類等情況下，組成物必須無菌且應為流體(至存在輕易可注射性之程度)。其必須在製造及儲存條件下穩定且較佳針對諸如細菌及真菌之微生物的污染作用進行保藏。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇、及其類似者)、及其合適的混合物。適當流動性可例如藉由使用塗層(諸如卵磷脂)，在分散液之情況下藉由維持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維持。
醫藥組成物亦可經調配以栓劑或保留灌腸形式用於經腸投與，例如其含有習知栓劑基質，諸如可可脂或其他甘油酯。
用於治療病狀的本揭露之組成物的有效劑量視許多不同因素而變化，包括投與方式、靶位點、患者的生理狀態、患者為人類還是動物、所投與的其他藥劑、及治療為防治性還是治療性。通常，患者為人類，然而，亦可治療包括基因轉殖哺乳動物之非人類哺乳動物。治療劑量可使用此項技術者已知的常規方法滴定以最佳化安全性及效力。
可視情況將本揭露之核酸分子、載體、或多肽與在治療需要治療(例如，防治性或治療性)的病症或病狀中有效的其他藥劑組合投與。
如本文所用，將本揭露之經單離之核酸分子、載體、或多肽與輔助治療結合或組合投與意謂順序、同時、同時擴展、並行、相伴、或同時期投與或應用療法及所揭示的多肽。熟習此項技術者應理解，可對投與或應用組合治療方案的各種組分進行定時，以增強治療之總體有效性。熟練技術人員(例如，醫師)將能夠基於所選擇輔助治療及本說明書之教示，在沒有不當實驗的情況下輕易識別有效的組合治療方案。
應進一步理解，本揭露之經單離之核酸分子、載體、或多肽可與一或多種藥劑結合或組合使用(例如，以提供組合治療方案)。可與本揭露之多肽或多核苷酸組合的示範性藥劑包括代表當前用於所治療特定病症之護理標準的藥劑。該等藥劑本質上可具化學性或生物性。術語「生物的」或「生物藥劑」係指自活有機體及/或其產物製得的意欲用作治療劑的任何醫藥活性劑。
欲與本揭露之多核苷酸或多肽組合使用的藥劑的量可隨受試者而變化或可根據此項技術中所知來投與。參見例如，Bruce A Chabner等人 ,Antineoplastic Agents, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman等人 編, 第9版 1996)。在另一實施例中，投與符合護理標準之量的此藥劑。
在一個實施例中，本文亦提供一種套組，其包含本文所揭示之核酸分子及用於向有需要之受試者投與該核酸分子的說明書。在另一實施例中，本文揭示一種桿狀病毒系統，其用於產生本文所提供之核酸分子。核酸分子產生於昆蟲細胞中。在另一實施例中，提供一種表現構築體之奈米粒子遞送系統。表現構築體本文所揭示之核酸分子。 IX. 基因療法
本揭露之某些態樣提供一種在受試者中表現遺傳構築體之方法，其包含向有需要之受試者投與本揭露之經單離之核酸分子。在一些態樣中，本揭露提供一種在增加受試者中多肽之表現的方法，其包含向有需要之受試者投與本揭露之經單離之核酸分子。在其他態樣中，本揭露提供一種調節有需要之受試者中多肽之表現的方法，其包含向該受試者投與本揭露之經單離之核酸分子，例如構成miRNA之核酸序列。在一些態樣中，本揭露提供一種下調有需要之受試者中靶基因之表現的方法，其包含向該受試者投與本揭露之經單離之核酸分子，例如構成miRNA之核酸序列。
已作為對於多種病症包括但不限於A型血友病之可能治療對體細胞基因療法進行探索。基因療法為對於血友病特別有吸引力的治療，因為其有可能透過在單次投與載體後連續內源性產生凝血因子(例如，FVIII)來治癒疾病。A型血友病非常適合基因置換方法，因為其臨床表現完全可歸因於缺乏在血漿中以微量(200ng/ml)循環的單一基因產物(例如，FVIII)。
本揭露之凝血因子可在哺乳動物(例如，人類患者)中體內產生，使用基因療法方法來治療出血疾病或病症將具有治療上之益處，該出血疾病或病症選自由以下組成之群：出血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔出血、失血、向肌肉內出血、口腔流血、創傷、頭創傷、胃腸流血、顱內失血、腹內失血、胸內失血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血、及髂腰肌鞘中流血。在一個實施例中，流血性疾病或病症為血友病。在另一實施例中，流血性疾病或病症為A型血友病。
其他病狀亦合適於使用本文所揭示之核酸分子之治療。在某些實施例中，本文所述之方法用於治療影響選自以下之靶器官的疾病或病狀：肌肉、中樞神經系統(CNS)、眼睛、肝、心臟、腎、胰臟、肺、皮膚、膀胱、尿路、或其任何組合。在某些實施例中，本文所述之方法實用於治療選自以下之疾病或病狀：DMD (裘馨氏肌肉失養症)、XLMTM (X性聯肌小管肌病變)、帕金森氏病、SMA (脊髓性肌萎縮)、弗裡德賴希氏共濟失調、GUCY2D-LCA (萊伯氏先天性黑矇症)、XLRS (X性聯視網膜劈裂)、AMD (年齡相關黃斑退化)、ACHM (色盲)、RPF65介導之IRD (表9)。表 9. 可藉由本文所揭示之方法治療之疾病及病狀。 1：SOD1基因之突變導致20%的遺傳性ALS病例。野生型SOD1已顯示在神經培養物中之抗細胞凋亡性質，而突變體SOD1已經觀察為促進脊髓粒線體中之細胞凋亡，但是在肝線粒體中不促進細胞凋亡，但是其在兩者中同等地表現。下調突變SOD1表現可抑制ALS中之運動神經元退化。2：HD為若干三核苷酸重複病症之一，該等三核苷酸重複病症由基因之重複部份之長度超過正常範圍所引起。HTT 含有三DNA鹼基序列，重複多次的胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG) (即，CAGCAGCAG)，被稱為三核苷酸重複序列。CAG為胺基酸麩醯胺酸之3字母遺傳密碼(密碼子)，所以一系列CAG導致產生稱為聚麩醯胺酸束(polyglutamine tract)(或聚Q束(polyQ tract))之麩醯胺酸鏈及該基因之重複部分聚 Q 區 。一般而言，人們在聚Q區中具有少於36個重複的麩醯胺酸，這導致產生細胞質蛋白質亨丁頓蛋白(Huntingtin)。然而，具有36或更多個麩醯胺酸之序列導致產生具有不同特徵的蛋白。此改變形式稱為突變亨丁頓蛋白(mHTT)，增加某些類型神經元之衰變速率。一般而言，CAG重複序列之數目與此過程受影響的程度有關，並且導致約60%的症狀發作年齡變化。其餘變化歸因於環境及其他改變HD機制之基因。36-39個重複序列導致疾病之外顯率降低，其中發作晚得多且症狀進展較慢。在一些病例中，發作可能太晚，以至於症狀從未被注意到。在非常大的重複序列計數之情況下，HD具有全外顯率且當其稱為青少年HD、失動-僵硬、或威斯特佛爾(Westphal)變異體HD時，可在低於20歲時發生。這導致約7% HD攜帶者。3：導致視網膜色素變性的大多數RHO基因突變改變視紫質蛋白之折疊或轉運。一些突變導致視紫質經組成型活化而非回應於光經激活。研究表明，視紫質之變型干擾必需的細胞功能，導致視桿自毀(經歷細胞凋亡)。因為在弱光條件下視桿為視力所必需的，所以此等細胞之損失導致具有網膜色素變性的人之進行性夜盲。
在一些實施例中，本文所述之方法用於治療溶酶體儲積症。在一些實施例中，溶酶體儲積症係選自MLD (異染性白質失養症)、MPS (黏多醣症)、PKU (苯酮尿症)、龐貝氏肝醣儲積症第II型、或其任何組合。
在一些實施例中，本文所述之方法用於微小RNA (miRNA)療法。在一些實施例中，miRNA治療由基因或蛋白之過表現引起之病狀。在一些實施例中，miRNA治療由蛋白之聚積引起之病狀。在一些實施例中，miRNA治療由基因或蛋白之錯誤表現引起之病狀。在一些實施例中，miRNA治療由突變基因之表現引起之病狀。在一些實施例中，miRNA治療由異源基因之表現引起之病狀。在某些實施例中，miRNA療法治療選自以下之病狀：ALS (肌萎縮側索硬化症)、亨丁頓氏病、AdRP (體染色體顯性視網膜色素變性)、及其任何組合。在某些實施例中，本揭露之方法包含藉由投與本文所揭示之核酸分子靶向治療ALS，其中該核酸分子包含編碼miRNA之遺傳卡匣，其中該miRNA靶向SOD1之表現。在某些實施例中，miRNA包含Dirren等人,Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2) :167-84 (2015年2月)所揭示之miR SOD1人工miRNA。SOD1基因之突變導致20%的遺傳性ALS病例。野生型SOD1已顯示在神經培養物中之抗細胞凋亡性質，而突變體SOD1已經觀察為促進脊髓粒線體中之細胞凋亡，但是在肝線粒體中不促進細胞凋亡，但是其在兩者中同等地表現。下調突變SOD1表現可抑制ALS中之運動神經元退化。
在某些實施例中，本揭露之方法包含藉由投與本文所揭示之核酸分子靶向治療亨丁頓氏病，其中該核酸分子包含編碼miRNA之遺傳卡匣，其中該miRNA靶向HTT之表現。在某些實施例中，miRNA包含Evers等人,Molecular Therapy 26(9) :1-15 (2018年6月印刷前之電子版)所揭示之miHTT工程改造之miRNA。亨丁頓氏病為若干三核苷酸重複病症之一，該等三核苷酸重複病症由基因之重複部份之長度超過正常範圍所引起。HTT含有三DNA鹼基序列，重複多次的胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG) (即，CAGCAGCAG)，其稱為三核苷酸重複序列。CAG為胺基酸麩醯胺酸之3字母遺傳密碼(密碼子)，所以一系列此等重複序列導致產生稱為聚麩醯胺酸束(或聚Q束)之麩醯胺酸鏈及該基因之重複部分聚Q區。一般而言，人們在聚Q區中具有少於36個重複的麩醯胺酸，這導致產生細胞質蛋白質亨丁頓蛋白。然而，具有36或更多個麩醯胺酸之序列導致產生具有不同特徵的蛋白。此改變形式稱為突變亨丁頓蛋白(mHTT)，增加某些類型神經元之衰變速率。一般而言，CAG重複序列之數目與此過程受影響的程度有關，並且導致約60%的症狀發作年齡變化。其餘變化歸因於環境及其他改變亨丁頓氏病機制之基因。36-39個重複序列導致疾病之外顯率降低，其中發作晚得多且症狀進展較慢。在一些病例中，發作可能太晚，以至於症狀從未被注意到。在非常大的重複序列計數之情況下，亨丁頓氏病具有全外顯率且當其稱為青少年亨丁頓氏病、失動-僵硬、或威斯特佛爾變異體亨丁頓氏病時，可在低於20歲時發生。這導致約7%亨丁頓氏病攜帶者。
在某些實施例中，本揭露之方法包含藉由投與本文所揭示之核酸分子靶向治療體染色體顯性視網膜色素變性(AdRP)，其中該核酸分子包含編碼miRNA之遺傳卡匣，其中該miRNA靶向RHO (視紫質)之表現。在某些實施例中，miRNA包含miR-708 (參見Behrman等人,JCB 192(6) :919-27 (2011)。導致視網膜色素變性的大多數RHO基因突變改變視紫質蛋白之折疊或轉運。一些突變導致視紫質經組成型活化而非回應於光經激活。研究表明，視紫質之變型干擾必需的細胞功能，導致視桿自毀(經歷細胞凋亡)。因為在弱光條件下視桿為視力所必需的，所以此等細胞之損失導致具有網膜色素變性的人之進行性夜盲。
本文所述之所有各個態樣、實施例、及可選方案可組合成任何及所有變型。
本說明書中提及之所有公開案、專利、及專利申請案均以引用之方式併入本文，達到如同明確及個別地指示將各個個別公開案、專利、或專利申請案以引用之方式併入的相同程度。
已一般性地描述本揭露，藉由參考本文所提供之實例可獲得進一步的理解。僅出於說明目的提供此等實例，並且不意欲具有限制性。實例 實例 1. 攜帶 AAV 及非 AAV 小病毒 ITR 之 FVIII 表現構築體之產生。 實例 1a. 密碼子最佳化 FVIII 基因及反向末端重複序列 (ITR) 區自 AAV 至遺傳卡匣中之選殖。
基於AAV血清型2之基因體產生FVIII遺傳卡匣。然而，來源於任何血清型(包括合成的)之ITR區均可用於此方法(圖1A)。
設計用於體外及體內表現之側接來自AAV (AAV-FVIII)之反向末端重複序列(ITR)的表現質體AAV2-FVIIIco6XTEN，其在肝特異性啟動子(TTPp，圖1A及1B)之調控下編碼密碼子最佳化FVIII編碼序列，如圖1B中所示。遺傳卡匣亦含有WPRE及bGHpA元件以供轉殖基因之最佳表現(圖1A及1B)。將側接ITR之密碼子最佳化FVIII序列選殖至質體主鏈中，該質體主鏈包含ColE1複製起源及β-內醯胺酶之表現卡匣，其賦予胺苄青黴素抗性(圖1B)。將側接表現卡匣之限制內切酶PvuII之識別位點工程改造，以允許在PvuII消化後精確切除AAV-FVIII構築體(圖1B)。實例 1b. 密碼子最佳化 FVIII 基因及反向末端重複序列 (ITR) 區自非 AAV 小病毒至遺傳卡匣中之選殖。
基於AAV所屬之小病毒科病毒之成員之間的系統發生關係(圖2A)，假設依賴病毒屬之其他非AAV成員及紅血球病毒屬之成員(及可能病毒科之所有/許多其他成員)利用類似的細胞機制以供維持病毒生命週期，且最重要的是建立持久的潛伏性感染。因此，源自此等病毒之基因體之ITR區可用於開發AAV樣(但不是基於AAV)的遺傳表達卡匣。測試以下小病毒之ITR區是否合適用於基因療法應用之遺傳構築體之開發：依賴病毒鵝小病毒(GPV)株B及紅血球病毒B19小病毒(圖2A)。
細菌細胞中質體載體繁殖期間小病毒ITR區之不穩定性為遺傳構築體之產生及操縱之熟知的障礙。儘管含有全長AAV2 ITR (145 nt)之遺傳構築體已由包括我們在內的若干小組成功產生，但此等構築體非常不穩定，且大多數基於AAV2 ITR之質體含有截短130 nt型式的ITR區(例示於表1中)。類似地，攜帶B19及GPV ITR之全長序列之質體構築體在細菌宿主中表現出高度不穩定性(數據未示出)，這顯著限制此等ITR用於開發基因療法應用之遺傳載體之效用。
以前，已開發出用於拯救重組B19病毒之反向遺傳系統，其攜帶截短型式的ITR (Manaresi等人, 2017, Virology, doi: 10.1016/j.virol.2017.05.006) (表2B，ITR ID: B19d135)。因此，我們利用B19d135 ITR產生遺傳穩定的FVIII表現質體B19-FVIIIco6XTEN (圖1C)。為了進一步利用此方法合成基於GPV ITR之構築體，我們比較B19、GPV、及AAV2 ITR之全長野生型序列(圖3A)。基於與B19及AVV2 ITR序列之前135和15個核苷酸(其為ITR功能非必要的)之同源性，我們假設可移除GPV ITR之前162個核苷酸以合成穩定的具有全功能性ITR之遺傳構築體(圖3A，序列以灰色陰影表示)。因此，類似於攜帶其對於ITR之截短型式的構築體AAV2-FVIIIco6XTEN及B19-FVIIIco6XTEN，我們使用GPVd162 (表2C)產生穩定的FVIII表現質體構築體GPV-FVIIIco6XTEN (圖1D)。值得注意的是，全長B19及GPV ITR兩者均比全長AAV2 ITR長得多(表1)，且不形成AAV ITR之獨特T形髮夾結構(圖2B)。
如實例1a中所述產生含有側接非AAV小病毒ITR (B19d135-FVIII及GPVd162-FVIII)之FVIII表現卡匣之質體B19-FVIIIco6XTEN(圖1C；表2B)及GPV-FVIIIco6XTEN (圖1D；表2C)。限制內切酶LguI之識別位點用於側接兩個FVIII表現卡匣(圖1C及1D)。實例 1c. 含有側接有 AAV 及非 AAV 小病毒 ITR 之 FVIII 表現卡匣之單股 DNA 片段之製備。
假設在側接FVIII表現卡匣之ITR區內髮夾結構之形成將推動靶細胞的持續轉導。對於概念驗證研究，分別用PvuII及LguI消化基於AAV ITR之質體AAV2-FVIIIco6XTEN以及基於非AAV ITR之質體B19-FVIIIco6XTEN及GPV-FVIIIco6XTEN。藉由在95℃下將PvuII或LguI消化之雙股DNA片段產物(FVIII表現卡匣及質體主鏈)變性，然後在4℃下冷卻以使回文ITR序列折疊來產生形成髮夾ITR結構之單股(ss) AAV-FVIII、B19-FVIII、或GPV-FVIII片段(圖1A)。在HemA (A型友病A)小鼠模型中測試所得ssAAV-FVIII、ssB19-FVIII、或ssGPV-FVIII之建立肝細胞之持續轉導的能力。實例 1d. 使用桿狀病毒表現系統產生 FVIII 表現構築體
利用Li等人 ., PLoS ONE 8(8): e69879 (2013)中所述之桿狀病毒表現系統，其用於在昆蟲細胞中以封閉型DNA (ceDNA)分子之形式產生AAV-FVIII、B19-FVIII、及GPV-FVIII構築體。已證明ceDNA表現卡匣之全身遞送建立肝細胞之持續轉導且推動肝中之穩定長期的轉殖基因表現。實例 2. 包含側接 AAV 及非 AAV 小病毒 ITR 之 FVIII 表現卡匣之遺傳構築體之全身注射導致 HemA 小鼠中長期的 FVIII 表現。 實例 2a. ssAAV-FVIII 介導之 FVIII 表現之體內評估。
為了驗證攜帶AAV ITR區之ssAAV-FVIII體內介導持續轉殖基因表現的能力，在5-12週齡Hem A小鼠(4只動物/組)中藉由高壓注射(HDI)以5 μg、10 μg、或20 μg的ssDNA遺傳表現卡匣(ssAAV-FVIII)全身遞送遺傳表現卡匣(圖4A)。HDI導致注射材料主要遞送至實驗動物之肝中。用5 ug/小鼠親本表現質體注射之對照動物在投與之後不久顯示出高水準的FVIII血漿活性。然而，循環FVIII之水準迅速下降並且在注射後(p.i.) 15天變得不可偵測。在單一高壓注射ssAAV-FVIII之後18小時、3天、2週、3週、1個月、2個月、3個月、及4個月自實驗動物收集血漿樣本。藉由顯色FVIII活性檢定分析血液中之FVIII血漿活性。以5、10、及20 ug/小鼠的ssAAV-FVIII注射之實驗動物產生轉殖基因之長期表現，其中循環FVIII之穩定水準分別為正常FVIII水準之8、16、及32% (圖4A)。應該強調的是，我們觀察到強烈的劑量反應，表明注射劑量於治療結果之間存在高度相關。實例 2b. ssB19-FVIII 及 ssGPV-FVIII 介導之 FVIII 表現之 體內評估。
為了評估來自分別攜帶非AAV小病毒ITR區B19d135及GPVd162之ssB19-FVIII及ssGPV-FVIII之FVIII之體內表現，經由HDI將10或20 μg/小鼠的ssB19-FVIII及10或50 μg/小鼠的ssGPV-FVIII遺傳表現卡匣全身遞送於5-12週齡的A型血友病(HemA)小鼠中。在第1、3、7、14、21、及28天p.i.收集血液樣本，且藉由顯色FVIII活性檢定分析血液中之FVIII活性。如先前在用AAV-FVIII構築體之實驗中所觀察，注射5 μg/小鼠親本FVIII表現質體之對照動物顯示在p.i.的24小時的高水準FVIII血漿活性，在14天p.i.後迅速下降且變得不可偵測。注射ssB19-FVIII之實驗動物顯示在24小時p.i.的峰值FVIII血漿活性，然後其在21天之時期內逐漸下降，且在28天p.i.左右穩定(圖4B)另一方面，注射ssGPV-FVIII之HemA小鼠在第7天快速產生穩定水準的FVIII血漿活性，其在28天的整個觀察期內維持(圖4C)。應注意，注射10 μg/小鼠的ssAAV-FVIII (圖4A)或ssGPV-FVIII (圖4C)之動物產生高度類似的穩定水準的FVIII血漿活性，表明AAV2及GPV ITR區兩者均包含有效建立靶細胞之持續轉導所需的遺傳因子。實例 3. 攜帶 B19d135 及 GPVd162 非 AAV 小病毒 ITR 之衍生物之 FVIII 表現構築體之產生及體內評估。 實例 3a. B19 及 GPV ITR 之最小基本序列之確定。
基於依賴病毒AAV2及GPV之ITR序列與紅血球病毒B19 (分別為Gene Bank登錄號NC_001401.2、U25749.1、及KY940273.1)的比較，我們設計了GPV及B19小病毒ITR之最小序列，其需要有或沒有額外序列(間隔、插入、反轉、添加、及/或與其他小病毒ITR之野生型序列重組)以用於攜帶此類ITR之遺傳構築體之真核細胞之持續轉導(圖3A及3B)。因此，AAV2、GPV、及B19 ITR之序列比對揭示表2A-2C中呈現之所有三種病毒物種之間的保守區B19v1及GPVv1為沒有可變序列之間隔區之連續序列。同樣，基於B19與GPV ITR之間的序列比較設計最小的基本序列變異體B19v3及GPVv3。因為攜帶GPVd162 ITR之FVIII表現構築體在體內實驗中比攜帶B19d135 ITR之遺傳構築體表現更好，我們假設GPV ITR序列中存在持續轉導所需的所有遺傳因子；然而，B19 ITR序列缺乏一些遺傳因子。因此，B19v3序列包含在B19與GPV ITR序列之間保守的最小B19 ITR序列區，且GPVv3序列包含存在於GPV ITR序列中且B19 ITR序列缺乏的最小GPV ITR序列區(表2B及2C)。藉由分別排除B19及GPV ITR序列之ITR回文區中的前135及162個核苷酸以及對應的互補135及162個核苷酸來產生序列B19v2及GPVv2 (表2B及2C)。實例 3b. B19 及 GPV ITR 及其衍生物之回文區在功能性遺傳構築體上的定向。
部分小病毒ITR由自身互補的回文區組成。先前已證明，對於重組感染性B19小病毒而言，攜帶直接及反向定向之回文區的拯救病毒表現出的類似的生長特性(Manaresi等人, 2017, Virology, doi: 10.1016/j.virol.2017.05.006)。因此，我們提出攜帶B19及GPV ITR及其衍生物之遺傳表現構築體將保持功能性，無論此類ITR之回文區與5'及3' ITR關於遺傳表現卡匣為直接、反向、或任何可能的組合。實例 3c. 在 HemA 小鼠中全身注射攜帶 B19d135 及 GPVd162 非 AAV 小病毒 ITR 之衍生物的遺傳構築體。
為了評估攜帶B19d135及GPVd162非AAV小病毒ITR之衍生物之ssDNA構築體的FVIII體內表現，經HDI將5、10、20、或50 μg/小鼠的各ssDNA遺傳表現卡匣全身遞送於5-12週齡的HemA小鼠中。將在1、3、7、14、21、及28天p.i.下收集血液樣本，然後每月一次，持續4個月。將藉由顯色FVIII活性檢定分析血液中之FVIII活性。實例 4. 在昆蟲細胞中攜帶 B19d135 及 GPVd162 非 AAV 小病毒 ITR 之衍生物之 ceDNA 表現構築體之產生及體內評估 實例 4a. 使用桿狀病毒表現系統產生攜帶 B19d135 及 GPVd162 ITR 之衍生物之 ceDNA 表現構築體
與實例1d中所述之AAV-FVIII、B19-FVIII、及GPV-FVIII構築體類似，我們將使用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞中產生以ceDNA之形式的攜帶B19d135及GPVd162非AAV小病毒ITR之衍生物的遺傳構築體之FVIII表現。實例 4b. 在 HemA 小鼠中全身注射攜帶 B19d135 及 GPVd162 非 AAV 小病毒 ITR 之衍生物的 ceDNA 表現構築體。
為了評估攜帶B19d135及GPVd162非AAV小病毒ITR之衍生物之ceDNA構築體的FVIII體內表現，經HDI將5、10、20、或50 μg/小鼠的各ceDNA遺傳表現卡匣全身遞送於5-12週齡的HemA小鼠中。將在1、3、7、14、21、及28天p.i.下收集血液樣本，然後每月一次，持續4個月。將藉由顯色FVIII活性檢定分析血液中之FVIII活性。實例 5. ssDNA 及 ceDNA FVIII 表現構築體之脂質奈米粒子製劑之產生
在如實例1及4中所述產生各ssDNA或ceDNA後，藉由微流體混合(LNP-ssDNA及LNP-ceDNA)使用適當的脂質組成物將各遺傳構築體調配成脂質納米粒子(LNP)。將調配成LNP之編碼側接AAV或非AAV小病毒ITR之FVIII表現卡匣之親本質體用作轉導效率之對照。實例 6. LNP-ssDNA 及 LNP-ceDNA 之體外及體內評估 實例 6a. 培養肝細胞中 ssDNA 及 ceDNA 介導之 FVIII 表現之體內評估。
如實例5中所述，將ssDNA或ceDNA FVIII表現遺傳構築體及對應的親本對照質體調配成LNP，以用於靶向基因遞送。將Huh7或HEK293T (非肝細胞對照)細胞以7×104 個細胞/孔接種至24孔組織培養盤中並孵育隔夜。第二天，將LNP-ssDNA或LNP-ceDNA調配物以1000、500、250、125、及62.5 ng/孔添加至細胞上。將在轉導後24及48小時收穫培養基及細胞。將藉由顯色FVIII活性檢定測量培養基中之FVIII活性。亦結構西方墨點法分析細胞中FVIII之表現。
此外，文獻中已經顯示細胞組蛋白沿著rAAV游離基因體規律地定位，產生類似於細胞染色體DNA核小體模式的染色質樣結構。因此，亦將藉由南方墨點法評估此等構築體建立持久轉導靶細胞所需的染色質樣核小體結構的能力。實例 6b. 靜脈內投與之後 HemA 小鼠中 LNP 調配之 ssDNA 及 ceDNA 介導之長期 FVIII 表現之評估。
將對5-12週齡的HemA小鼠經由IV注射投與5、10、20、40、100 ug/小鼠的LNP-ssDNA、LNP-ceDNA、或LNP-pDNA (質體對照)，N=4/組。將在注射後48小時至6個月的選擇時間點收集血液樣本，且將藉由顯色FVIII活性檢定分析血液中之FVIII活性。針對實例1及4中所述之各遺傳構築體，將經LNP-ssDNA或LNP-ceDNA處理之小鼠中之FVIII表現概況與經LNP-pDNA處理之小鼠中之FVIII表現概況進行比較。實例 6c. 補強注射之後 ssDNA 或 ceDNA 介導之 FVIII 活性之體內評估。
在初始注射後2個月，將以相同劑量對實例6b中經LNP-ssDNA或LNP-ceDNA處理之小鼠亞組進行額外的IV注射補強對應的LNP。將在補強注射之後48小時至6個月選擇的時間點收集血液樣本。將藉由顯色FVIII活性檢定分析血液中之FVIII活性。將經LNP-ssDNA或LNP-ceDNA處理之小鼠中之FVIII表現概況與經對應的LNP-pDNA處理之小鼠中之FVIII表現概況進行比較。實例 7. 攜帶 B19 或 GPV 來源之 ITR 之遺傳表現構築體對於基因療法之一般使用之效用。 實例 7a. 攜帶 B19 或 GPV 來源之 ITR 之報導遺傳構築體之產生。
為了證明基於非AAV ITR之遺傳表現系統作為基因療法應用中的一般使用之平台的效用，將針對基於實例1b中所述之構築體側接B19d135或GPVd162 ITR之綠色螢光蛋白(GFP)或螢光素酶(luc)產生包含表現卡匣之報導構築體。因此，將藉由習知分子選殖技術用GFP之開放閱讀框(ORF)或luc置換B19-FVIIIco6TEN (圖1C)及GPV-FVIIIco6XTEN (圖1D)中FVIII之ORF。
亦將產生側接B19d135或GPVd162 ITR之表現卡匣用於苯丙胺酸羥化酶(PAH)，其將用於評估相關小鼠模型中之PAH表現。實例 7b. 攜帶 B19 或 GPV 來源之 ITR 之 ssDNA 報導遺傳構築體之製備。
將如實例1c中所述製備ssDNA報導子/PAH構築體。簡言之，用LguI消化質體。藉由在95℃下將LguI消化之雙股DNA片段產物(報導子表現卡匣及質體主鏈)變性，然後在4℃下冷卻以使回文ITR序列折疊來產生形成髮夾ITR結構之ssDNA片段(圖1A)。將測試所得ssDNA構築體在小鼠中建立肝、肌肉組織、眼睛中之光感受器、及中樞神經系統(CNS)之持續轉導的能力。實例 7c. ssDNA介導之報導子表現之體內評估。
為了驗證實例7b中所述之ssDNA報導構築體介導體內持續的轉殖基因表現的能力，將5-12週齡小鼠(4只動物/組)注射5、10、或20 μg/小鼠的報導子ssDNA，以全身、局部靶向肌肉組織及CNS細胞及/或視網膜下靶向感光細胞。
為了評估來自基於B19及GPV ITR之表現構築體之PAH之表現，將使用相關疾病小鼠模型。此等遺傳構築體將藉由HDI全身遞送以靶向肝。實施例
E1. 一種核酸分子，其包含第一反向末端重複序列(ITR)、第二ITR、及編碼治療性蛋白之遺傳卡匣；其中該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒(非AAV)之ITR，其中該遺傳卡匣定位於該第一ITR與該第二ITR之間，且其中該治療性蛋白包含凝血因子。
E2. 如E1之核酸分子，其中該非AAV係選自由微小病毒科病毒之成員組成之群。
E3. 如E1或E2之核酸分子，其中該第一ITR為非AAV之ITR，且該第二ITR為腺相關病毒(AAV)之ITR，或其中該第一ITR為AAV之ITR，且該第二ITR為非AAV之ITR。
E4. 如E1或E2之核酸分子，其中該第一ITR及該第二ITR為非AAV之ITR。
E5. 如E1、E2、及E4中任一項之核酸分子，其中該第一ITR及該第二ITR相同。
E6. 如E1至E5中任一項之核酸分子，其中該第一ITR及/或該第二ITR包含不間斷的迴文序列。
E7. 如E1至E5中任一項之核酸分子，其中該第一ITR及/或該第二ITR包含間斷的迴文序列。
E8. 如E1至E7中任一項之核酸分子，其中該非AAV為微小病毒科病毒之成員。
E9. 如E8之核酸分子，其中該微小病毒科之該成員係選自由以下組成之群：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、及無脊椎對蝦濃核病毒。
E10. 如E8之核酸分子，其中該微小病毒科病毒之該成員為紅血球病毒小病毒B19 (人類病毒)。
E11. 如E8之核酸分子，其中該微小病毒科病毒之該成員為鴨源水禽小病毒(MDPV)株。
E12. 如E11之核酸分子，其中該MDPV株為減毒FZ91-30。
E13. 如E11之核酸分子，其中該MDPV株為病原YY。
E14. 如E8之核酸分子，其中依賴小病毒為依賴病毒鵝小病毒(GPV)株。
E15. 如E14之核酸分子，其中該GPV株為減毒82-0321V。
E16. 如E14之核酸分子，其中該GPV株為病原B。
E17. 如E8之核酸分子，其中該微小病毒科病毒之該成員係選自由以下組成之群：豬小病毒(U44978)、小鼠小病毒(U34256)、犬小病毒(M19296)、及貂腸炎病毒(D00765)。
E18. 如E1至E17中任一項之核酸分子，其進一步包含啟動子。
E19. 如E18之核酸分子，其中該啟動子為組織特異性啟動子。
E20. 如E18或E19之核酸分子，其中該啟動子推動肝細胞、內皮細胞、肌細胞、竇狀細胞、或其任何組合中該治療性蛋白之表現。
E21. 如E18或E19之核酸分子，其中該啟動子推動肝細胞中該治療性蛋白之表現。
E22. 如E18至E21中任一項之核酸分子，其中該啟動子定位於編碼該凝血因子之該核酸序列之5'方向。
E23. 如E18至E22中任一項之核酸分子，其中該啟動子係選自由以下所組成之群：小鼠thyretin啟動子(mTTR)、人類內源性因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、tristetraprolin (TTP)啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌凝蛋白重鏈α (αMHC)、肌紅蛋白(MB)、肌間線蛋白(DES)、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、tMCK、及磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。
E24. 如E18至E23中任一項之核酸分子，其中該啟動子包含TTP啟動子。
E25. 如E1至E24中任一項之核酸分子，其中該核苷酸序列進一步包含內含子序列。
E26. 如E25之核酸分子，其中該內含子序列定位於編碼該凝血因子之該核酸序列之5'方向。
E27. 如E25或E26之核酸分子，其中該內含子序列定位於該啟動子之3'方向。
E28. 如E25至E27中任一項之核酸分子，其中該內含子序列包含合成內含子序列。
E29. 如E25至E28中任一項之核酸分子，其中該內含子序列包含SEQ ID NO: 115。
E30. 如E1至E29中任一項之核酸分子，其中該遺傳卡匣進一步包含轉錄後調控元件。
E31. 如E30之核酸分子，其中該轉錄後調控元件定位於表現該凝血因子之該核酸序列之3'方向。
E32. 如E30或E31之核酸分子，其中該轉錄後調控元件包含經突變之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)、微小RNA結合位點、DNA核靶向序列、或其任何組合。
E33. 如E32之核酸分子，其中該微小RNA結合位點包含至miR142-3p之結合位點。
E34. 如E1至E33中任一項之核酸分子，其中該遺傳卡匣進一步包含3'UTR聚(A)尾序列。
E35. 如E34之核酸分子，其中該3'UTR聚(A)尾序列係選自由以下組成之群：bGH聚(A)、肌動蛋白聚(A)、肌動蛋白聚(A)、及其任何組合。
E36. 如E34或E35之核酸分子，其中該3'UTR聚(A)尾序列包含bGH聚(A)。
E37. 如E1至E36中任一項之核酸分子，其中該遺傳卡匣進一步包含強化子序列。
E38. 如E37之核酸分子，其中該強化子序列定位於該第一ITR與該第二ITR之間。
E39. 如E1至E38中任一項之核酸分子，其中該核酸分子以下列順序包含：該第一ITR、該遺傳卡匣、及該第二ITR；其中該遺傳卡匣包含組織特異性啟動子序列、內含子序列、編碼該凝血因子之該核酸序列、轉錄後調控元件、及3'UTR聚(A)尾序列。
E40. 如E39之核酸分子，其中該遺傳卡匣以下列順序包含：組織特異性啟動子序列、內含子序列、編碼該FVIII多肽之該核酸序列、轉錄後調控元件、及3'UTR聚(A)尾序列。
E41. 如E38或E39之核酸分子，其中：
(a) 該第一ITR為微小病毒之非AAV家族成員之ITR；
(b) 該組織特異性啟動子序列包含TTP啟動子；
(c) 該內含子為合成內含子；
(d) 編碼凝血因子之該核苷酸序列；
(e) 該轉錄後調控元件包含WPRE；
(f) 該3'UTR聚(A)尾序列包含bGHpA；及
(g) 該第二ITR為微小病毒之非AAV家族成員之ITR。
E42. 如E1至E41中任一項之核酸分子，其中該遺傳卡匣包含單股核酸。
E43. 如E1至E41中任一項之核酸分子，其中該遺傳卡匣包含雙股核酸。
E44. 如E1至E43中任一項之核酸分子，其中該凝血因子係由以下表現：肝細胞、內皮細胞、肌細胞、竇狀細胞、或其任何組合。
E45. 如E1至E44中任一項之核酸分子，其中該凝血因子包含因子I (FI)、因子II (FII)、因子V (FV)、因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII (FVIII)、溫韋伯氏因子(VWF)、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖網蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、胞漿素原、α2-抗胞漿素、組織胞漿素原活化劑(tPA)、尿激酶、胞漿素原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)、胞漿素原活化劑抑制劑-2 (PAI2)、或其任何組合。
E46. 如E1至E45中任一項之核酸分子，其中該凝血因子為FVIII。
E47. 如E46之核酸分子，其中該FVIII包含全長成熟FVIII。
E48. 如E47之核酸分子，其中該FVIII包含與具有SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致的胺基酸序列。
E49. 如E46之核酸分子，其中該FVIII包含A1結構域、A2結構域、A3結構域、C1結構域、C2結構域、及部分B結構域或沒有B結構域。
E50. 如E49之核酸分子，其中該FVIII包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 109至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致的胺基酸序列。
E51. 如E1至E50中任一項之核酸分子，其中該凝血因子包含異源部分。
E52. 如E51之核酸分子，其中該異源部分係選自由以下組成之群：白蛋白或其片段、免疫球蛋白Fc區、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單元之C端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、白蛋白結合部分、其衍生物、或其任何組合。
E53. 如E51或E52之核酸分子，其中該異源部分連接於該FVIII之N端或C端或插入於該FVIII中之兩個胺基酸之間。
E54. 如E53之核酸分子，其中該異源部分係於選自表5中所列之插入位點的一或多個插入位點來插入於兩個胺基酸之間。
E55. 如E45至E54中任一項之核酸分子，其中該FVIII進一步包含A1結構域、A2結構域、C1結構域、C2結構域、視情況選用之B結構域、及異源部分，其中該異源部分經插入緊鄰對應於成熟FVIII (SEQ ID NO:106)之胺基酸745之下游。
E56. 如E53至E55中任一項之核酸分子，其中該FVIII進一步包含FcRn結合搭配物。
E57. 如E56之核酸分子，其中該FcRn結合搭配物包含免疫球蛋白恆定結構域之Fc區。
E58. 如E45至E57中任一項之核酸分子，其中編碼該FVIII之該核酸序列經密碼子最佳化。
E59. 如E45至E58中任一項之核酸分子，其中編碼該FVIII之該核酸序列經密碼子最佳化以供在人類中表現。
E60. 如E59之核酸分子，其中編碼該FVIII之該核酸序列包含與核苷酸序列SEQ ID NO: 107至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%一致的核苷酸序列。
E61. 如E59之核酸分子，其中編碼該FVIII之該核酸序列包含與核苷酸序列SEQ ID NO: 71至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%一致的核苷酸序列。
E62. 如E1至E61中任一項之核酸分子，其中該核酸分子係與遞送劑一起調配。
E63. 如E62之核酸分子，其中該遞送劑包含脂質奈米粒子。
E64. 如E63之核酸分子，其中該遞送劑係選自由以下組成之群：脂質體、非脂質聚合分子、胞內體、及其任何組合。
E65. 如E1至E64中任一項之核酸分子，其中該核酸分子經調配以供靜脈內遞送、經皮遞送、皮內遞送、皮下遞送、肺部遞送、或口服遞送、或其任何組合。
E66. 如E65之核酸分子，其中該核酸分子經調配以供靜脈內遞送。
E67. 一種載體，其包含如E1至E66中任一項之核酸分子。
E68. 一種多肽，其由如E1至E66中任一項之核酸分子編碼。
E69. 一種宿主細胞，其包含如E1至E66中任一項之核酸分子。
E70. 一種醫藥組成物，其包含(a)如E1至E66中任一項之核酸、如E67之載體、如E68之多肽、或如E69之宿主細胞；(b) LNP；及(c)醫藥上可接受之賦形劑。
E71. 一種套組，其包含如E1或E66中任一項之核酸分子及用於向有需要之受試者投與該核酸分子的說明書。
E72. 一種桿狀病毒系統，其用於產生如E1至E66中任一項之核酸分子。
E73. 如E72之桿狀病毒系統，其中如E1至E66中任一項之核酸分子係於昆蟲細胞中產生。
E74. 一種表現構築體之奈米粒子遞送系統，其中該表現構築體包含如E1至E66中任一項之核酸分子。
E75. 一種產生具有凝血活性之多肽之方法，其包含：在合適條件下培養如E69之宿主細胞；及回收該具有凝血活性之多肽。
E76. 一種在有需要之受試者中表現凝血因子之方法，其包含向該受試者投與如E1至E66中任一項之核酸分子、如E67之載體、如E68之多肽、或如E70之醫藥組成物。
E77. 一種治療患有凝血因子缺乏症之受試者之方法，其包含向該受試者投與如E1至E66中任一項之核酸分子、如E67之載體、如E68之多肽、或如E70之醫藥組成物。
E78. 如E76或E77之方法，其中該核酸分子係以以下方式投與：靜脈內、經皮、皮內、皮下、口服、肺部、或其任何組合。
E79. 如E78之方法，其中該核酸分子係靜脈內投與。
E80. 如E76至E79中任一項之方法，其進一步包含向該受試者投與第二藥劑。
E81. 如E76至E80中任一項之方法，其中該受試者為哺乳動物。
E82. 如E76至E81中任一項之方法，其中該受試者為人類。
E83. 如E76至E82中任一項之方法，其中相對於該投與之前該受試者中之FVIII活性，向該核酸分子向該受試者之該投與導致增加的FVIII活性，其中該FVIII活性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、或至少約100倍。
E84. 如E76至E83中任一項之方法，其中該受試者患有流血性病症。
E85. 如E84之方法，其中該流血性病症為血友病。
E86. 如E84或E85之方法，其中該流血性病症為A型血友病。
E83. 如E76至E82、E85、及E86中任一項之方法，其中相對於該投與之前該受試者中之FVIII活性，該核酸分子向該受試者之該投與導致增加的FVIII活性，其中相對於正常FVIII活性，該FVIII活性增加至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%。
圖 1A 為單股凝血因子(例如，FVIII)表現卡匣之示意性表示。顯示來自非AAV之5' ITR (在ssDNA結構之末端具有髮夾環)、來自非AAV之3' ITR (具有髮夾環)、啟動子序列(例如，TTPp)、及轉殖基因序列(例如，插入於B結構域內具有XTEN144之FVIIIco6XTEN序列)之位置。示範性表現卡匣亦顯示額外可能的元件，例如，內含子序列、WPREmut序列、及bGHpA序列。
圖 1B-1D 為用於製備單股凝血因子表現卡匣(諸如圖1A中所示之卡匣)之質體之示意性表示，其中卡匣之ITR衍生自AAV2 (圖1B)、B19 (圖1C)、或GPV (圖1D)。如所顯示之包含ssFVIII表現卡匣之質體構築體經PvuII (在PvuII位點) (圖1B)或LguI (在LguI位點) (圖1C及1D)消化以釋放病毒基因體。將雙股DNA加熱至95℃以產生ssDNA，然後在4℃下孵育以實現ITR結構形成。
圖 2A 為繪示小病毒科病毒成員之間的關係的系統發生樹。B19、AAV-2、及GPV由方框標識。
圖 2B 為各種卡匣之示意圖，包括髮夾結構。
圖 3A 及 3B 為B19、GPV、及AAV2之ITR (FIG.3A)以及B19及GPV (圖3B)之比對。灰色陰影顯示同源性。
圖 4A-4C 顯示經由在Hem A小鼠中之高壓注射(hydrodynamic injection；HDI)之雙股FVIII-AAV 裸DNA (ssAAV-FVIII；圖2A)、ssDNA-B19 FVIII (圖2B)、或ssDNA-GPV FVIII (圖2C)投與之後的FVIII血漿活性。在24小時、3天、2週、3週、1個月、2個月、3個月、及4個月時測量經以50 µg/小鼠(圖2C)、20 µg/小鼠(圖2A及2B)、10 µg/小鼠(圖2A及2C)、或5 µg/小鼠(圖2A)之ssDNA之單一HDI處理之小鼠中血漿樣本中之FVIII活性(以對照之百分比之形式)。給出5 µg/小鼠的質體DNA之HDI作為對照(圖2A-2C)。

Claims (21)

  1. 一種核酸分子，其包含第一反向末端重複序列(ITR)、第二ITR、及遺傳卡匣； 　　其中該第一ITR及/或該第二ITR為非腺相關病毒(非AAV)之ITR，其中該遺傳卡匣定位於該第一ITR與該第二ITR之間，且其中該遺傳卡匣編碼治療性蛋白、miRNA、或治療性蛋白及miRNA兩者。
  2. 如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該治療性蛋白包含凝血因子。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之核酸分子，其中該非AAV係選自由微小病毒科病毒之成員組成之群。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之核酸分子，其中該第一ITR及該第二ITR為非AAV之ITR。
  5. 如申請專利範圍第3項或第4項之核酸分子，其中該微小病毒科病毒之該成員係選自由以下組成之群：博卡病毒、依賴病毒、紅血球病毒、阿留申病毒、小病毒、濃核病毒、艾特拉病毒、康特拉病毒、Aveparvovirus 、Copiparvovirus 、Protoparvovirus 、Tetraparvovirus 、Ambidensovirus 、短濃核病毒、肝胰濃核病毒、無脊椎對蝦濃核病毒、鴨源水禽小病毒(MDPV)株、豬小病毒(U44978)、小鼠小病毒(U34256)、犬小病毒(M19296)、及貂腸炎病毒(D00765)。
  6. 如申請專利範圍第3項至第5項中任一項之核酸分子，其中該微小病毒科病毒之該成員為紅血球病毒小病毒B19 (人類病毒)。
  7. 如申請專利範圍第3項至第5項中任一項之核酸分子，其中該微小病毒科病毒為依賴病毒鵝小病毒(GPV)株。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之核酸分子，其進一步包含組織特異性啟動子。
  9. 如申請專利範圍第8項之核酸分子，其中該啟動子推動肝細胞、內皮細胞、肌細胞、竇狀細胞、或其任何組合中該治療性蛋白之表現。
  10. 如申請專利範圍第8項或第9項之核酸分子，其中該啟動子係選自由以下所組成之群：小鼠thyretin啟動子(mTTR)、人類內源性因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、tristetraprolin (TTP)啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌凝蛋白重鏈α (αMHC)、肌紅蛋白(MB)、肌間線蛋白(DES)、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、tMCK、及磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之核酸分子，其中核苷酸序列進一步包含： 　　(a) 內含子序列， 　　(b) 轉錄後調控元件， 　　(c) 3'UTR聚(A)尾序列， 　　(d) 強化子序列，或 　　(e) (a) - (d)之任何組合。
  12. 如申請專利範圍第11項之核酸分子，其中： 　　(a) 該內含子序列定位於編碼該凝血因子之該核酸序列之5'方向； 　　(b) 該轉錄後調控元件包含經突變之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)、微小RNA結合位點、DNA核靶向序列、或其任何組合； 　　(c) 該3'UTR聚(A)尾序列係選自由以下組成之群：bGH聚(A)、肌動蛋白聚(A)、肌動蛋白聚(A)、及其任何組合；或 　　(d) (a) - (c)之任何組合。
  13. 如申請專利範圍第12項之核酸分子，其中： 　　(a) 該內含子序列包含SEQ ID NO: 115； 　　(b) 該微小RNA結合位點包含至miR142-3p之結合位點； 　　(c) 該3'UTR聚(A)尾序列包含bGH聚(A)；或 　　(d) (a) - (c)之任何組合。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之核酸分子，其中該核酸分子以下列順序包含： 　　(a) 該第一ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR； 　　(b) 組織特異性啟動子序列，其包含TTP啟動子； 　　(c) 內含子，其為合成內含子； 　　(d) 核苷酸序列，其編碼凝血因子； 　　(e) 轉錄後調控元件，其包含WPRE； 　　(f) 3'UTR聚(A)尾序列，其包含bGHpA；及 　　(g) 該第二ITR，其為微小病毒之非AAV家族成員之ITR。
  15. 如申請專利範圍第2項至第14項中任一項之核酸分子，其中該凝血因子包含因子I (FI)、因子II (FII)、因子V (FV)、因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII (FVIII)、溫韋伯氏因子(VWF)、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖網蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關蛋白酶抑制劑(ZPI)、胞漿素原、α2-抗胞漿素、組織胞漿素原活化劑(tPA)、尿激酶、胞漿素原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)、胞漿素原活化劑抑制劑-2 (PAI2)、或其任何組合。
  16. 如申請專利範圍第15項之核酸分子，其中該FVIII包含與選自SEQ ID NO: 71、106、107、及109之序列中所述之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%一致的胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之核酸分子，其中該凝血因子包選自由以下組成之群之異源部分：白蛋白或其片段、免疫球蛋白Fc區、人類絨毛膜促性腺激素之β亞單元之C端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、白蛋白結合部分、其衍生物、或其任何組合。
  18. 如申請專利範圍第15項至第17項中任一項之核酸分子，其中該FVIII進一步包含FcRn結合搭配物。
  19. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之核酸分子，其中該核酸分子係與包含脂質奈米粒子之遞送劑一起調配。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之核酸分子及醫藥上可接受之載劑。
  21. 一種在有需要之受試者中表現凝血因子之方法，其包含向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之核酸分子或如申請專利範圍第20項之醫藥組成物。
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