KR20200035130A - 핵산 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20200035130A
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통야오 리우
수잔나 파타로요-화이트
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로버트 티. 페터스
지아윤 리우
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바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

본 개시내용은 제1 역 말단 반복부(ITR), 제2 ITR, 및 miRNA 및/또는 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 일정 구현예에서, 치료적 단백질은 응고 인자, 예를 들어, FVIII 폴리펩타이드, FIX 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스(AAV)의 ITR이다. 본 개시내용은 또한 출혈 장애, 예컨대, 혈우병을 치료하는 방법으로서, 핵산 분자 또는 이에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

핵산 분자 및 이의 용도
전자 제출된 서열 목록의 참조
ASCII 텍스트 파일(파일명: 4159_493PC01_ST25; 크기: 434,561 바이트; 및 생성일: 2018년 8월 9일)로 전자 제출된 서열 목록의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
유전자 요법은 다양한 질병들을 치료하는 지속적인 수단을 제공한다. 과거에, 유전자 요법은 전형적으로 바이러스의 사용에 의존했다. 이러한 목적을 위해 선택될 수 있는 많은 바이러스 작용제가 있으며, 이들 각각은 유전자 요법에 이들을 다소 적합하게 만들 독특한 특성들을 갖는다. 문헌[Zhou et al., Adv Drug Deliv Rev. 106(Pt A):3-26, 2016]. 그러나, 이들의 면역원성 프로파일 또는 이들의 암 유발 경향성을 포함하여 일부 바이러스 벡터의 바람직하지 않은 특성으로 인해, 임상적 안전성 문제가 발생했으며, 최근까지, 병원에서 특정 적용, 예를 들어, 백신 및 종양세포붕괴성 전략에 있어 현재 이들의 사용이 제한되었다. 문헌[Cotter et al., Front Biosci. 10:1098-105 (2005)].
아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus: AAV)는 가장 흔히 연구되는 유전자 요법 벡터들 중 하나이다. AAV는 대략 4.8 킬로베이스(kb)의 작은 단일-가닥 DNA 게놈을 둘러싸고 보호하는 단백질 외각이다. 문헌[Naso et al., BioDrugs, 31(4): 317-334, 2017]. AAV는 파르보바이러스 패밀리에 속하고, 복제하기 위해 다른 바이러스, 주로 아데노바이러스와의 동시-감염에 의존한다. 마찬가지로, 이의 단일-가닥 게놈은 세 개의 유전자, Rep(복제), Cap(캡시드), 및 aap(조립)을 함유한다. 마찬가지로, 이러한 코딩 서열은 게놈 복제 및 패키징에 필요한 역 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)가 측접된다. 마찬가지로, 2 개의 시스-작용 AAV ITR은 DNA 복제의 개시 동안 프라이머로서 기능하는 T 자형 헤어핀 구조로 폴딩할 수 있는 비연속적 회문 서열로, 대략 145 개 뉴클레오타이드 길이이다.
그러나, 유전자 전달 벡터로서의 통상적인 AAV의 사용은 일부 단점을 초래하였다. 주요 단점 중 하나는 약 4.5 kb의 이종 DNA의 AAV 제한 바이러스 패키징 용량과 관련이 있다. (문헌[Dong et al., Hum Gene Ther. 7(17): 2101-12, 1996]). 또한, AAV 벡터의 투여는 인간에게서 면역 반응을 유발할 수 있다. AAV가 일부 다른 바이러스(즉, 아데노바이러스)보다 면역원성이 적은 것으로 나타났지만, 캡시드 단백질은 인간 면역계의 다양한 구성요소를 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Naso et al., 2017] 참조. AAV는 인간 집단에서 흔한 바이러스이고, 대부분의 사람들이 AAV에 노출되어 있으며, 이에 따라 대부분의 사람들은 이들이 이전에 노출되었던 특정 변이체에 대항하는 면역 반응이 이미 생성시켰다. 이러한 기존의 적응 반응은 AAV로의 후속 재감염, 및/또는 형질도입된 세포의 제거의 임상적 효능을 감소시킬 수 있는 NAb 및 T 세포를 포함할 수 있는데, 이는 기존의 항-AAV 면역성을 갖는 환자를 AVV 기반 유전자 요법 치료에 부적격하게 만든다. 국소로 또는 전신으로 투여되는지에 상관없이, 바이러스는 외래 단백질로 보일 것이고, 이에 따라 적응 면역계가 이를 제거하려고 시도할 것이다. 또한, AAV 치료에 의해 유발된 항-AAV 중화 항체는 치료 수준의 효능이 처음 AAV 치료에 의해 달성되지 않았을 때 AAV에 의한 반복 치료를 저해한다. 게다가, AAV ITR의 T 자형 헤어핀 루프가 AAV ITR의 T 자형 헤어핀 구조에 결합하는 숙주 세포 단백질/단백질 복합체에 의해 저해되기 쉽다는 것을 시사하는 증거가 있다. 예를 들어, 문헌[Zhou et al., Scientific Reports 7:5432 (July 14, 2017)] 참고.
따라서, 일부 의도치 않은 결과 및 기존 AAV 벡터 기술의 제한을 방지하면서, 표적 서열, 예를 들어, 치료적 단백질 및/또는 miRNA를 시험관내 및 생체내 환경에서 효율적이고 지속적으로 발현시키려는 요구가 당업계에 존재한다.
본 개시내용의 일 양태는 제1 역 말단 반복부(ITR), 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자로서; 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스(비-AAV)의 ITR이고, 유전자 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치하고, 치료적 단백질은 응고 인자를 포함하는, 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 비-AAV는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과(Parvoviridae)의 일원 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 비-AAV의 ITR이고, 제2 ITR은 아데노-관련 바이러스(AAV)의 ITR이거나, 제1 ITR은 AAV의 ITR이고, 제2 ITR은 비-AAV의 ITR이다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 비-AAV의 ITR이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 연속적인 회문 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비연속적인 회문 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에서 비-AAV는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원이다. 일부 구현예에서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 보카바이러스(Bocavirus), 데펜도바이러스(Dependovirus), 에리스로바이러스(Erythrovirus), 암도바이러스(Amdovirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus), 콘트라바이러스(Contravirus), 아베파르보바이러스(Aveparvovirus), 코피파르보바이러스(Copiparvovirus), 프로토파르보바이러스(Protoparvovirus), 테트라파르보바이러스(Tetraparvovirus), 암비덴소바이러스(Ambidensovirus), 브레비덴소바이러스(Brevidensovirus), 헤판덴소바이러스(Hepandensovirus), 펜스틸덴소바이러스(Penstyldensovirus) 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 머스코비 오리 파르보바이러스(Muscovy duck parvovirus: MDPV) 균주이다. 일부 구현예에서, MDPV 균주는 약독화 FZ91-30이다. 일부 구현예에서, MDPV 균주는 병원성 YY이다. 추가의 일부 구현예에서, 데펜도파르보바이러스는 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(Goose parvovirus: GPV) 균주이다. 일부 구현예에서, GPV 균주는 약독화 82-0321V이다. 일부 구현예에서, GPV 균주는 병원성 B이다. 일부 구현예에서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 돼지 파르보바이러스(U44978), 미세 생쥐 바이러스(U34256), 개 파르보바이러스(M19296), 밍크 장염 바이러스(D00765) 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간세포, 내피 세포, 근세포, 동모양 세포, 또는 이들의 임의의 조합에서 치료적 단백질의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-항트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 TTP 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 인트론 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 프로모터에 대해 3'에 위치한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 합성 인트론 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 115를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 전사 후 조절 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 돌연변이된 마멋 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), 마이크로RNA 결합 부위, DNA 핵 표적화 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 마이크로RNA 결합 부위는 miR142-3p에 대한 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 인핸서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인핸서 서열은 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 유전자 카세트, 및 제2 ITR의 순서로 이들을 포함하고; 유전자 카세트는 조직-특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자, 또는 miRNA를 인코딩하는 핵산 서열, 전사 후 조절 요소, 및 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 전사 후 조절 요소, 및 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열의 순서로 이들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자, 또는 miRNA를 인코딩하는, 뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA; 및
(g) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제2 ITR.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트를 이중 가닥 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자를 인코딩하는 유전자를 포함하고, 여기서 응고 인자는 간세포, 내피 세포, 근세포, 동모양 세포, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 응고 인자는 인자 I(FI), 인자 II(FII), 인자 V(FV), 인자 VII(FVII), 인자 VIII(FVIII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 인자 XIII(FVIII), 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand factor: VWF), 프리칼리크레인(prekallikrein), 고분자량 키니노젠, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성화제 저해제-2(PAI2), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 응고 인자는 FVIII이다. 일부 구현예에서, FVIII는 전장 성숙 FVIII를 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, C1 도메인, C2 도메인을 포함하고, B 도메인을 일부만 포함하거나 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII는 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 응고 인자는 이종 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 영역, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩타이드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 알부민-결합 모이어티, 이의 유도체, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이종 모이어티는 FVIII의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나 FVIII에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 모이어티는 표 5에 열거된 삽입 부위로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 선택적인 B 도메인, 및 이종 모이어티를 추가로 포함하고, 여기서 이종 모이어티는 성숙 FVIII(SEQ ID NO: 106)에 상응하는 아미노산 745의 바로 다운스트림에 삽입된다.
일부 구현예에서, FVIII는 FcRn 결합 파트너를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, FcRn 결합 파트너는 면역글로불린 불변 도메인의 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 구현예에서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 107의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 전달제와 제형화된다. 일부 구현예에서, 전달제는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달제는 리포좀, 비-지질 중합체 분자, 엔도좀 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내, 경피, 피내, 피하, 폐, 또는 경구 전달, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, (a) 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드, 또는 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포; (b) LNP; 및 (c) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 핵산 분자, 및 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자가 곤충 세포에서 생산되는, 바큘로바이러스 시스템이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 발현 작제물을 위한 나노입자 전달 시스템으로서, 발현 작제물은 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 나노입자 전달 시스템이 본원에 제공된다.
또한, 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 적합한 조건 하에서 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하고, 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 회수하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 응고 인자를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법으로서, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 본원에 개시된 폴리펩타이드, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 응고 인자 결핍을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 본원에 개시된 폴리펩타이드, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내로, 경피로, 피내로, 피하로, 경구로, 폐로, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 대상체에게 핵산 분자를 투여하는 것은 투여 전 대상체의 FVIII 활성에 비해서 증가된 FVIII 활성을 야기하며, FVIII 활성은 적어도 약 2 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 8 배, 적어도 약 9 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 11 배, 적어도 약 12 배, 적어도 약 13 배, 적어도 약 14 배, 적어도 약 15 배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25 배, 적어도 약 30 배, 적어도 약 35 배, 적어도 약 40 배, 적어도 약 50 배, 적어도 약 60 배, 적어도 약 70 배, 적어도 약 80 배, 적어도 약 90 배, 적어도 약 100 배만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 대상체는 출혈 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병이다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병 A이다.
도 1a는 단일 가닥 응고 인자(예를 들어, FVIII) 발현 카세트의 개략도이다. 비-AAV로부터 5' ITR(ssDNA 구조의 말단에 헤어핀 루프 있음), 비-AAV로부터 3' ITR(헤어핀 루프 있음), 프로모터 서열(예를 들어, TTPp), 및 전이유전자 서열, 예를 들어, B 도메인 내에 XTEN144가 삽입된 FVIIIco6XTEN 서열의 위치가 나타나 있다. 예시적인 발현 카세트는 또한 추가의 가능한 요소, 예를 들어, 인트론 서열, WPREmut 서열, 및 bGHpA 서열을 나타낸다.
도 1b 내지 도 1d는 도 1a에 나타나 있는 카세트와 같은 단일 가닥 응고 인자 발현 카세트를 제조하는 데 사용된 플라스미드의 개략도이고, 여기서 카세트의 ITR은 AAV2(도 1b), B19(도 1c), 또는 GPV(도 1d)로부터 유래된다. 여기에 나타나 있는 바와 같이 ssFVIII 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 작제물은 PvuII(PvuII 부위에서)(도 1b) 또는 LguI(LguI 부위에서)(도 1c 및 도 1d)로 분해되어 바이러스 게놈을 방출하였다. 이중 가닥 DNA는 95℃에서까지 가열되어 ssDNA를 생산하였고, 이후 4℃에서 인큐베이션되어 ITR 구조 형성을 가능하게 하였다.
도 2a는 다양한 파르보바이러스 패밀리 일원들 간의 관계를 도시하는 계통수이다. B19, AAV-2, 및 GPV는 윤곽이 있는 박스로 표시되어 있다.
도 2b는 헤어핀 구조를 포함하는 다양한 카세트의 개략 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 B19, GPV, 및 AAV2(도 3a) 및 B19 및 GPV(도 3b)의 ITR의 배열이다. 회색 음영은 상동성을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 Hem A 마우스에서 수력학 주사(hydrodynamic injection: HDI)를 통한 단일-가닥 FVIII-AAV 네이키드 DNA(ssAAV-FVIII; 도 2a), ssDNA-B19 FVIII(도 2b), 또는 ssDNA-GPV FVIII(도 2c) 투여 후 FVIII 혈장 활성을 나타낸 것이다. FVIII 활성은 50 μg/마우스(도 2c), 20 μg/마우스(도 2a 및 도 2b), 10 μg/마우스(도 2a 및 도 2c), 또는 5 μg/마우스(도 2a)의 ssDNA의 단일 HDI로 처리된 마우스에서 24 시간, 3 일, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 및 4 개월에 혈장 샘플에서 (대조의 비율로서) 측정되었다. 5 μg/마우스의 플라스미드 DNA의 HDI가 대조로서 주어졌다(도 2a 내지 도 2c).
본 개시내용에는 제1 역 말단 반복부(ITR), 제2 ITR, 및 유전자 카세트, 예를 들어, 치료적 단백질 또는 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 플라스미드-유사 핵산 분자로서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스의 ITR(예를 들어, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-AAV로부터임)인, 플라스미드-유사 핵산 분자가 기재된다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 치료적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불린), 티로신 하이드록실라제, AADC, 사이클로하이드로라제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다제), 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 응고 인자를 포함한다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 FVIII 또는 FIX 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 miRNA를 인코딩한다. 일정 구현예에서, miRNA는 SOD1, HTT, RHO, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 표적 유전자의 발현을 하향 조절한다.
일정 구현예에서, 비-AAV는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 개시내용은 추가로 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자, 예를 들어, FVIII를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법으로서, 제1 역 말단 반복부(ITR), 제2 ITR, 및 유전자 카세트, 예를 들어, 치료적 단백질 또는 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스(비-AAV)의 ITR인, 방법에 관한 것이다. 일정 구현예에서, 본 개시내용에는 SEQ ID NO: 113 및 120으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 서열 상동성을 갖는, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 기재된다.
본 개시내용의 예시적인 작제물은 첨부된 도면 및 서열 목록에서 예시된다. 명세서 및 청구항의 명확한 이해를 제공하기 위해, 하기 정의들이 이하에 제공된다.
I. 정의
단수 표현("a" 또는 "an")의 엔티티(entity)는 하나 이상의 엔티티를 지칭한다; 예를 들어, "뉴클레오타이드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 유사하게, "치료적 단백질" 및 "miRNA"는 각각, 하나 이상의 치료적 단백질 그리고 하나 이상의 miRNA를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 단수 표현, "하나 이상," 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
용어 "약(about)"은 본원에서 대략, 거의, 쯤, 또는 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약(about)"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 제시된 수치 값의 위와 아래로 경계를 확장함으로써 그 범위를 조정한다. 일반적으로, 용어 "약(about)"은 본원에서 10 퍼센트, 위 또는 아래(더 높거나 더 낮게)로의 변량으로 명시된 값보다 높고 낮은 숫자 값을 수식하는 데 사용된다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 관련이 있는 열거된 항목들 중 하나 이상의 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석되는 경우 비조합을 지칭하고 이들을 포괄한다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드(들) 서열", 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 교환적으로 사용되고, 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 사이티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시타이미딘 또는 데옥시사이티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 임의의 이의 포스포에스테르 유사체, 예컨대 단일 가닥 형태, 또는 이중 가닥 나선의 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일-가닥 DNA(ssDNA) 또는 단일-가닥 RNA(ssRNA)를 지칭한다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 오직 분자의 1차 및 2차 구조를 의미하고, 이것을 임의의 특정한 3차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편)로 특히 발견되는 이중 가닥 DNA, 플라스미드, 슈퍼코일 DNA 및 염색체를 포함한다. 특정한 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 기재하는 데 있어서, 서열은 DNA의 비전사된 가닥(즉, mRNA에 서열 상동성을 갖는 가닥)을 따라 오직 5'→3' 방향의 서열을 제공하는 일반 관계에 따라 본 명세서에 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 "핵산 조성물"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본원에서 사용되는 "역 말단 반복부"(또는 "ITR")는 일련의 뉴클레오타이드(초기 서열)에 다운스트림으로 뒤따르는 이의 역 상보물, 즉, 회문 서열을 포함하는, 단일 가닥 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치된 핵산 하위서열을 지칭한다. 초기 서열과 역 상보물 사이의 뉴클레오타이드의 개재 서열은 0(제로)을 포함하는 임의의 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시내용에 유용한 ITR은 하나 이상의 "회문 서열"을 포함한다. ITR은 수많은 기능들을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 T 자형 헤어핀 구조를 형성시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 비-T 자형 헤어핀 구조, 예를 들어, U 자형 헤어핀 구조를 형성시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 장기간 생존을 증진시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 영구 생존을 증진시킨다(예를 들어, 세포의 전수명(entire life-span) 동안). 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 안정성을 증진시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 보유를 증진시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 지속성을 증진시킨다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 분해를 저해하거나 방지한다.
일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 2 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 550 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 500 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 450 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 400 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 350 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 300 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 2 내지 250 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 5 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 15 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 25 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 30 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 35 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 45 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 50 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 60 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 70 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 80 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 90 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 100 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 150 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 200 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 300 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 350 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 400 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 450 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 약 500 내지 600 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 550 내지 600 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 5 내지 550 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 500 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 450 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 400 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 350 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 300 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5 내지 250 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 10 내지 550 개의 뉴클레오타이드, 약 15 내지 500 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 450 개의 뉴클레오타이드, 약 25 내지 400 개의 뉴클레오타이드, 약 30 내지 350 개의 뉴클레오타이드, 약 35 내지 300 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 40 내지 250 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일정 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 225 개의 뉴클레오타이드, 약 250 개의 뉴클레오타이드, 약 275 개의 뉴클레오타이드, 약 300 개의 뉴클레오타이드, 약 325 개의 뉴클레오타이드, 약 350 개의 뉴클레오타이드, 약 375 개의 뉴클레오타이드, 약 400 개의 뉴클레오타이드, 약 425 개의 뉴클레오타이드, 약 450 개의 뉴클레오타이드, 약 475 개의 뉴클레오타이드, 약 500 개의 뉴클레오타이드, 약 525 개의 뉴클레오타이드, 약 550 개의 뉴클레오타이드, 약 575 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 600 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 400 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 2 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 30 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 50 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 60 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 70 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 80 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 90 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 100 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 125 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 약 150 내지 200 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 175 내지 200 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 2 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 30 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 50 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 75 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 약 100 내지 150 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 125 내지 150 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 2 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 약 5 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 약 30 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 약 50 내지 100 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 75 내지 100 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 약 2 내지 50 개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 50 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 50 개의 뉴클레오타이드, 약 30 내지 50 개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 50 개의 뉴클레오타이드, 약 3 내지 30 개의 뉴클레오타이드, 약 4 내지 20 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5 내지 10 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역 상보물은 2 개의 뉴클레오타이드, 3 개의 뉴클레오타이드, 4 개의 뉴클레오타이드, 5 개의 뉴클레오타이드, 6 개의 뉴클레오타이드, 7 개의 뉴클레오타이드, 8 개의 뉴클레오타이드, 9 개의 뉴클레오타이드, 10 개의 뉴클레오타이드, 11 개의 뉴클레오타이드, 12 개의 뉴클레오타이드, 13 개의 뉴클레오타이드, 14 개의 뉴클레오타이드, 15 개의 뉴클레오타이드, 16 개의 뉴클레오타이드, 17 개의 뉴클레오타이드, 18 개의 뉴클레오타이드, 19 개의 뉴클레오타이드, 또는 20 개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 다른 구현예에서, 초기 서열과 역 상보물 사이의 개입 뉴클레오타이드는 0 개의 뉴클레오타이드, 1 개의 뉴클레오타이드, 2 개의 뉴클레오타이드, 3 개의 뉴클레오타이드, 4 개의 뉴클레오타이드, 5 개의 뉴클레오타이드, 6 개의 뉴클레오타이드, 7 개의 뉴클레오타이드, 8 개의 뉴클레오타이드, 9 개의 뉴클레오타이드, 10 개의 뉴클레오타이드, 11 개의 뉴클레오타이드, 12 개의 뉴클레오타이드, 13 개의 뉴클레오타이드, 14 개의 뉴클레오타이드, 15 개의 뉴클레오타이드, 16 개의 뉴클레오타이드, 17 개의 뉴클레오타이드, 18 개의 뉴클레오타이드, 19 개의 뉴클레오타이드, 또는 20 개의 뉴클레오타이드이다(예를 들어, 이로 구성된다).
따라서, 본원에서 사용된 "ITR"은 자발적으로 다시 폴딩되고, 이중 가닥 절편을 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 서열 GATCXXXXGATC는 폴딩되어 이중 나선을 형성시킬 때 GATC의 초기 서열 및 이의 상보물(3'CTAG5')을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 초기 서열과 역 상보물 사이에 연속 회문 서열(예를 들어, GATCGATC)을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 초기 서열과 역 상보물 사이에 비연속 회문 서열(예를 들어, GATCXXXXGATC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 연속 또는 비연속 회문 서열의 상보적 섹션은 서로 상호 작용하여 "헤어핀 루프" 구조를 형성시킨다. 본원에서 사용되는 "헤어핀 루프" 구조는 단일-가닥 뉴클레오타이드 분자 염기-쌍 상에 적어도 2 개의 상보적 서열로 이중 가닥 섹션을 형성시킬 때 생성된다. 일부 구현예에서, ITR의 단지 일부만이 헤어핀 루프를 형성한다. 다른 구현예에서, ITR 전체가 헤어핀 루프를 형성시킨다.
본 개시내용에서, 적어도 하나의 ITR은 비-아데노바이러스 관련 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 일정 구현예에서, ITR은 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 비-AAV 일원의 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 데펜도바이러스속 또는 에리스로바이러스속의 비-AAV 일원의 ITR이다. 특정 구현예에서, ITR은 거위 파르보바이러스(GPV), 머스코비 오리 파르보바이러스(MDPV), 또는 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(파르보바이러스 B19, 영장류 에리스로파르보바이러스 1, B19 바이러스, 및 에리스로바이러스로도 알려짐)의 ITR이다. 일정 구현예에서, 2 개의 ITR 중 하나의 ITR은 AAV의 ITR이다. 다른 구현예에서, 작제물에서 2 개의 ITR 중 하나의 ITR은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 혈청형의 ITR이다. 일 구체적 구현예에서, ITR은 AAV 혈청형 2로부터 유래되고, 예를 들어, AAV 혈청형 2의 ITR이다.
본 개시내용의 일정 양태에서, 핵산 분자는 2 개의 ITR, 즉, 5' ITR 및 3' ITR을 포함하고, 여기서, 5' ITR은 핵산 분자의 5' 말단에 위치하고, 3' ITR은 핵산 분자의 3' 말단에 위치한다. 5' ITR 및 3' ITR은 동일한 바이러스 또는 상이한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일정 구현예에서, 5' ITR은 AAV로부터 유래되고, 3' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV). 일부 구현예에서, 3' ITR은 AAV로부터 유래되고, 5' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV). 다른 구현예에서, 5' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않고(예를 들어, 비-AAV), 3' ITR은 동일하거나 상이한 비-AAV 바이러스로부터 유래된다.
본원에서 사용된 용어 "파르보바이러스"는 자율-복제 파르보바이러스 및 데펜도바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 패밀리 파르보바이러스과를 포괄한다. 자율성 파르보파이러스는, 예를 들어, 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 및 펜스틸덴소바이러스 속의 일원을 포함한다.
예시적인 자율성 파르보바이러스는 돼지 파르보바이러스, 미세 생쥐 바이러스, 개 파르보바이러스, 밍크 장염 바이러스, 소 파르보바이러스, 닭 파르보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파르보바이러스, 거위 파르보바이러스, H1 파르보바이러스, 머스코비 오리 파르보바이러스, 뱀 파르보바이러스, 및 B19 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 자율성 파르보바이러스가 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참고.
본원에서 사용된 용어 "비-AAV"는 핵산, 단백질, 및 파르보바이러스과 패밀리의 임의의 아데노-관련 바이러스(AAV)를 제외한 패밀리 파르보바이러스과로부터의 바이러스를 포괄한다. "비-AAV"는 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 및 펜스틸덴소바이러스 속의 자율-복제 일원을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "아데노-관련 바이러스"(AAV)는 AAV 타입 1, AAV 타입 2, AAV 타입 3(타입 3A 및 3B 포함), AAV 타입 4, AAV 타입 5, AAV 타입 6, AAV 타입 7, AAV 타입 8, AAV 타입 9, AAV 타입 10, AAV 타입 11, AAV 타입 12, AAV 타입 13, 뱀 AAV, 새 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 문헌[Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004))] 및 문헌[Moris et al. (Virol. 33:375 (2004))]에 개시된 AAV 혈청형 및 클레이드, 및 현재 공지되어 있거나 추후 발견된 임의의 다른 AAV를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참고.
본원에서 사용된 용어 "~로부터 유래된"은 명시된 분자 또는 유기체로부터 단리되거나 이를 사용하여 제조된 구성요소, 또는 명시된 분자 또는 유기체로부터의 정보(예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 제2 핵산 서열(예를 들어, ITR)로부터 유래된 핵산 서열(예를 들어, ITR)은 제2 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 경우에, 유래된 종은, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이유발, 인공 유도 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 유래하도록 사용된 돌연변이유발은 의도적으로 유도되거나 의도적으로 무작위화되거나, 각각의 혼합일 수 있다. 첫 번째로부터 유래된 것과 상이한 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 생성시키는 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 돌연변이유발은 무작위의 사건일 수 있으며(예를 들어, 중합효소 부정에 의해 일어남), 유래된 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 식별은, 예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같은 적절한 스크리닝 방법에 의해 이루어질 수 있다. 폴리펩타이드의 돌연변이유발은 전형적으로 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조작을 수반한다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은, 각각, 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가지며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)에 대해 적어도 90% 동일하며, 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)에 대해 적어도 80% 동일하며, 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)에 대해 적어도 70% 동일하며, 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)에 대해 적어도 60% 동일하며, 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)에 대해 적어도 50% 동일하며, 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다.
일정 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 적어도 약 5 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 10 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 15 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 30 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 35 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 40 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 45 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 50 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 55 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 60 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 65 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 70 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 75 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 80 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 85 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 90 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 95 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 125 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 150 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 175 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 200 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 225 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 250 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 275 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 300 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 325 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 350 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 375 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 400 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 425 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 450 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 475 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 500 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 525 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 550 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 575 개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 600 개의 뉴클레오타이드를 포함하고; 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다. 일정 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 적어도 약 129 개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다. 일정 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 적어도 약 102 개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 기능적 특성을 보유한다.
비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 비-AAV(또는 AAV) ITR의 길이의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 포함한다.
일정 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은, 각각, 적절히 정렬되었을 경우, 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 상동성 부분과 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가지며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 상동성 부분에 대해 적어도 90% 동일하며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 상동성 부분에 대해 적어도 80% 동일하며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 상동성 부분에 대해 적어도 70% 동일하며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 상동성 부분에 대해 적어도 60% 동일하며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 비-AAV ITR(또는 AAV ITR, 각각)의 상동성 부분에 대해 적어도 50% 동일하며, 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다.
"무-캡시드(capsid-free)" 또는 "저-캡시드(capsid-less)" 벡터 또는 핵산 분자는 캡시드가 없는 벡터 작제물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 저-캡시드 벡터 또는 핵산 분자는, 예를 들어, AAV Rep 단백질을 인코딩하는 서열을 함유하지 않는다.
본원에서 사용된 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 구성된 폴리뉴클레오타이드의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않음에도, 코딩 영역의 부분인 것으로 고려될 수 있지만, 임의의 측접 서열(flanking sequence), 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 터미네이터, 인트론 등은 코딩 영역의 부분이 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 인코딩하는, 5' 말단의 개시 코돈, 및 생성된 폴리펩타이드의 카르복실 말단을 인코딩하는, 3' 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 2 개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물, 예를 들어 단일 벡터 상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 작제물, 예를 들어 별도의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 그 후, 단일 벡터는 단지 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 2 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다.
포유류 세포에 의해 분비되는 일정 단백질은 분비 신호 펩타이드와 회합되며, 이는 일단 성장하는 단백질 쇄의 방출이 조면소포체를 통과해 개시되면 성숙 단백질로부터 절단된다. 당업자는 신호 펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 융합되고, 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩타이드를 생산함을 알고 있다. 일정 구현예에서, 이와 작동 가능하게 회합되어 있는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 천연 신호 펩타이드 또는 그 서열의 기능성 유도체. 대안적으로, 이종 포유류 신호 펩타이드, 예를 들어, 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제 신호 펩타이드, 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다.
용어 "다운스트림"은 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 3'에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일정 구현예에서, 다운스트림 뉴클레오타이드 서열은 전사의 개시점 다음에 있는 서열과 관련된다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 개시 부위의 다운스트림에 위치한다.
용어 "업스트림"은 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 5'에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일정 구현예에서, 업스트림 뉴클레오타이드 서열은 코딩 영역 또는 전사 개시점의 5' 측에 위치하는 서열과 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사 개시 부위의 업스트림에 위치한다.
본원에서 사용된 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 코딩 영역의 업스트림(5' 비-코딩 서열)에, 내부에, 또는 다운스트림(3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 회합된 코딩 영역의 전사, RNA 가공, 안정성, 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터 결합 부위, 또는 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서의 발현을 위해 의도된 것이라면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 대개 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
산물, 예를 들어 miRNA 또는 유전자 산물(예를 들어, 치료적 단백질과 같은 폴리펩타이드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 발현(예를 들어, 전사 또는 번역) 제어 유전요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 회합에서 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역은 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 배치하는 것과 같은 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 회합된다. 예를 들어, 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 인코딩되는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하고, 프로모터와 코딩 영역 사이의 링키지의 본질이 프로모터가 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는다면, 코딩 영역과 프로모터는 "작동 가능하게 회합"된 것이다. 프로모터 외의, 다른 발현 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호 또한 유전자 산물 발현을 지시하기 위해 코딩 영역과 작동 가능하게 회합될 수 있다.
"전사 제어 서열"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 지칭한다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 사이토메갈로바이러스(전초기 프로모터, 인트론-A와 함께), 시미안 바이러스 40(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(라우스(Rous) 육종 바이러스) 유래의 프로모터 및 인핸서 절편과 같으나 이에 한정되지 않는, 척추동물 세포에서 기능하는, 전사 제어 영역을, 제한 없이 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 액틴, 열 쇼크 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 림포카인-유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도 가능한 프로모터)뿐만 아니라 조직-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스(구체적으로 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, CITE 서열로도 지칭됨) 유래 요소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이는 폴리뉴클레오타이드의 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 기타 RNA 산물로의 전사, 및 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역을 제한없이 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 사용된 유전자 산물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생산되는 메신저 RNA, 또는 전사물로부터 번역되는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 또는 단백질 분해성 절단을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "수율"은 유전자의 발현에 의해 생성된 폴리펩타이드의 양을 지칭한다.
"벡터"는 숙주 세포 내로의 핵산의 클로닝 및/또는 전달을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 부착된 절편의 복제를 야기하기 위해 또 다른 핵산 절편이 부착될 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 생체내 자율 복제 단위로서 기능하는, 즉 그 자체의 제어 하에서 복제할 수 있는 임의의 유전적 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 비히클을 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵세포 바이러스, 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함하는 다수의 벡터가 당업계에 공지되어 있고 사용된다. 적합한 벡터 내로의 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오타이드 단편을 상보적인 부착(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터 내에 연결시킴으로써 달성될 수 있다.
벡터는 벡터를 포함시킨 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택 가능한 마커 또는 리포터를 인코딩하도록 조작될 수 있다. 선택 가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터 상에 함유된 다른 코딩 영역을 포함하고 발현하는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 가능하게 한다. 당업계에 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예로는: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아미드 등에 대한 저항성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스페라제 유전자 등이 포함된다. 당업계에 공지되고 사용되는 리포터의 예로는: 루시페라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등이 포함된다. 선택 가능한 마커는 리포터로 고려될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는, 예를 들어, ssDNA 또는 벡터의 수용자일 수 있거나, 수용자였을 수 있거나, 수용자로 이용될 수 있는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 지칭한다. 이 용어는 형질도입되었던 모 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이,"숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질도입되었던 세포를 지칭한다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적 돌연변이로 인해, 원래 모체와 형태 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체가 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 시험관내 숙주 세포일 수 있다.
용어 "선택 가능한 마커"는 식별 인자, 보통 마커 유전자의 효과에 기초하여 선택될 수 있는 항생제 또는 화학물질 저항성 유전자, 즉 항생제에 대한 저항성, 제초제에 대한 저항성, 비색 마커, 효소, 형광성 마커 등을 지칭하고, 여기서 효과는 관심 대상의 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 대상의 핵산을 유전한 세포 또는 유기체를 식별하도록 이용된다. 당업계에 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예로는: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아미드 등에 대한 저항성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스페라제 유전자 등이 포함된다.
용어 "리포터 유전자"는 리포터 유전자의 효과에 기초하여 식별될 수 있는 식별 인자를 인코딩하는 핵산을 지칭하고, 여기서 효과는 관심 대상의 핵산의 유전성을 추적하고/추적하거나, 관심 대상의 핵산을 유전한 세포 또는 유기체를 식별하고/식별하거나, 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하도록 이용된다. 당업계에 공지되고 사용되는 리포터 유전자의 예로는: 루시페라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등이 포함된다. 선택 가능한 마커 유전자는 또한 리포터 유전자인 것으로 간주될 수 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 상호 교환적으로 사용되고, 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 이의 전체가 원상태 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 확인되는 상이한 프로모터로부터 유래되는 상이한 요소로 이루어질 수 있거나, 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업자에게는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 조건 및 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 이해된다. 유전자가 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 유도하는 프로모터는 일반적으로 "구성성 프로모터"로 언급된다. 특이적 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "세포 특이적 프로모터" 또는 "조직 특이적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 발생 또는 세포 분화의 특정한 단계에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "발생적 특이적 프로모터" 또는 "세포 분화 특이적 프로모터"라 흔히 지칭된다. 프로모터를 유도하는 작용제, 생물학적 분자, 화학, 리간드, 광 등으로 세포를 노출시키거나 처리한 후에 유전자를 발현시키고 유도하는 프로모터는 "유도성 프로모터" 또는 "조절 가능한 프로모터"라 흔히 지칭된다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완벽하게 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
프로모터 서열은 통상적으로 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되고, 백그라운드 위의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시시키기 위해 필요한 최소한의 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 업스트림(5' 방향)으로 연장한다. (편리하게는 예를 들어 뉴클레아제 S1에 의한 맵핑에 의해 한정된) 전사 개시 부위, 및 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(공통 서열)이 프로모터 서열 내에 발견될 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일정 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 간에서, 예를 들어, 간세포 및/또는 내피 세포에서 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자의 발현을 유도한다. 특히, 구현예, 프로모터는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 특이적 프로모터(예를 들어, α1-항트립신(AAT)), 근육 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 및 데스민(DES)), 합성 프로모터(예를 들어, SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, 및 tMCK) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일 구체적 구현예에서, 프로모터는 TPP 프로모터를 포함한다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 상호 교환적으로 사용되고, 이중 가닥 DNA 내의 특이적 뉴클레오타이드 서열을 결합하고 절단하는 효소를 지칭한다.
용어 "플라스미드"는 종종 세포의 중심 대사의 부분이 아닌 유전자를 운반하고, 대개 원형 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 염색체-외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된, 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열, 선형, 원형, 또는 슈퍼코일일 수 있으며, 여기서 다수의 뉴클레오타이드 서열은 적절한 3' 비번역 서열과 함께 프로모터 단편 및 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 작제물로 합쳐지거나 재조합된다.
사용될 수 있는 진핵세포 바이러스 벡터로는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 폭스바이러스, 예를 들어, 우두 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 또는 헤르페스바이러스 벡터가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 비-바이러스 벡터로는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 충전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 생체고분자가 포함된다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하고 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기점을 포함하는 핵산의 단위 길이인 "레플리콘"을 지칭하며, 여기에 또 다른 핵산 절편이 부착된 절편의 복제를 야기하기 위해 부착될 수 있다. 일정 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형, 예를 들어 박테리아에서 복제할 수 있고 또 다른 것, 예를 들어, 진핵 세포에서 발현할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 관심있는 핵산 서열의 삽입을 위한 벡터 및/또는 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열을 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로의 삽입 후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하도록 설계된 비히클을 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 상기 기재된 조절 영역과 작동 가능하게 회합되어 배치된다.
벡터는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 형질감염, 전기천공, 마이크로주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 운반체에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 본원에서 사용된 "배양", "배양하는 것" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 가능하게 하거나 세포를 살아있는 상태로 유지시키는 시험관내 조건 하에서 세포를 인큐베이션하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 "배양된 세포"는 시험관내에서 증식된 세포를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포괄하는 것으로 의도되며, 아미드 결합(펩타이드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하며, 생산물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 쇄," 또는 둘 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하는 데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 중 임의의 것 대신에, 또는 이와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해성 절단, 또는 비-천연적으로 발생한 아미노산에 의한 변형을 제한 없이 포함하는, 폴리펩타이드의 발현-후 변형의 산물을 지칭하는 것으로 또한 의도된다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원 또는 생산된 재조합 기술로부터 유래될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학 합성을 포함하는, 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
용어 "아미노산"은 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(Glu 또는 E); 글리신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 이소류신(Ile 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 리신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 티로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(Val 또는 V)을 포함한다. 비전통적인 아미노산은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있고, 노르류신, 오미틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌[Ellman et al.Meth.Enzym.202:301-336 (1991)]에 기재된 것을 포함한다. 이러한 비천연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌[Noren et al.Science 244:182 (1989)] 및 상기 Ellman 등의 문헌의 절차를 이용할 수 있다. 간단히 말하면, 이들 절차는 비천연 발생 아미노산 잔기에 의한 억제자 tRNA의 화학적 활성화, 이어서 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다. 비전통적인 아미노산의 도입은 당해 분야에 공지된 펩타이드 화학을 이용하여 또한 달성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "극성 아미노산"은 0의 순 전하를 갖지만 이의 측쇄의 상이한 부분에서 0이 아닌 부분 전하를 갖는 아미노산(예를 들어, M, F, W, S, Y, N, Q, C)을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "하전된 아미노산"은 이의 측쇄에서 0이 아닌 순 전하를 가질 수 있는 아미노산(예를 들어, R, K, H, E, D)을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용에 참여할 수 있다.
폴리펩타이드의 단편 또는 변이체, 및 이의 임의의 조합도 본 개시내용에 또한 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자를 지칭할 때 용어 "단편" 또는 "변이체"는 기준 폴리펩타이드의 특성 중 적어도 일부(예를 들어, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화성, FVIII 변이체에 대한 응고 활성, 또는 VWF 단편에 대한 FVIII 결합 활성)를 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드의 단편은 본원의 다른 부분에서 논의된 특정 항체 단편에 더하여, 단백질 분해성 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함하나, 천연적으로 발생한 전장 폴리펩타이드(또는 성숙 폴리펩타이드)는 포함하지 않는다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기 기재된 단편을 포함하고, 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 천연적 또는 비-천연적으로 발생할 수 있다. 비-천연적으로 발생한 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되면, 치환은 보존적인 것으로 고려된다. 또 다른 구현예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 일원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같은 용어 "동일성 백분율"은, 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같은, 2 개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 관계이다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한, 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정된 바대로, 그 경우에서처럼, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최고의 매치를 주도록 설계된다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 공공으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산은 서열 분석 소프트웨어, 예컨대 LASERGENE bioinformatics computing suite의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc.(위스콘신주 매디슨)), 프로그램의 GCG 스위트(Wisconsin Package 버전 9.0, Genetics Computer Group (GCG)(위스콘신주 매디슨)), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403 (1990)) 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc.(미국 위스콘신주 53715 매디슨 스트리트 에스. 파크 1228))을 이용하여 수행될 수 있다. 본 출원의 맥락 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석의 결과가, 달리 기재되지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기반한다고 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "디폴트 값"은 처음에 초기설정될 때 소프트웨어에 의해 원래 로딩되는 값, 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미할 것이다. 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자, 본 개시내용의 서열 및 기준 서열 간의 동일성 백분율을 결정하려는 목적을 위하여, 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자, 본 개시내용의 서열에서의 뉴클레오타이드에 상응하는 기준 서열에서의 뉴클레오타이드만이 동일성 백분율을 계산하는 데 사용된다. 예를 들어, B 도메인을 함유하는 전장 FVIII 뉴클레오타이드 서열을 본 개시내용의 최적화된 B 도메인 결실된(BDD) FVIII 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때, A1, A2, A3, C1 및 C2 도메인을 포함하는 정렬의 부분을 사용하여 동일성 백분율을 계산한다. (정렬에서의 큰 "갭"을 생성시키는) B 도메인을 인코딩하는 전장 FVIII 서열의 부분에서의 뉴클레오타이드는 미스매치로서 계산되지 않을 것이다. 또한, 본 개시내용의 최적화된 BDD FVIII 서열, 또는 이의 지정된 부분(예를 들어, SEQ ID NO:3의 58번 내지 2277번 및 2320번 내지 4374번 뉴클레오타이드)과 기준 서열 사이의 동일성 백분율을 결정하는 데 있어서, 동일성 백분율은 본 명세서에서 언급된 바와 같은 최적화된 BDD-FVIII 서열, 또는 이의 지정된 부분의 완전한 서열에서의 뉴클레오타이드의 전체 수로 매칭된 뉴클레오타이드의 수를 나눈 것을 정렬함으로써 계산될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 특정 서열에서의 뉴클레오타이드에 상응하는 뉴클레오타이드는 기준 서열과의 동일성을 최대화하기 위해 본 개시내용의 서열의 정렬을 정렬함으로써 식별된다. 기준 서열 내에서 등가 아미노산을 식별하는 데 사용되는 번호는 본 개시내용의 서열 내에서 상응하는 아미노산을 식별하는 데 사용되는 번호에 기반한다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 자연에서 천연적으로는 연결되어 있지 않은 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 정상적으로 별도의 단백질에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩타이드 내에서 합쳐질 수 있거나, 정상적으로 동일한 단백질에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩타이드, 예를 들어 본 개시내용의 인자 VIII 도메인의 Ig Fc 도메인과의 융합 내에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 원하는 관계로 인코딩되는 폴리뉴클레오타이드를 생성 및 번역함으로써 생성된다. 키메라 단백질은 공유 결합, 비-펩타이드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "삽입 부위"는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체에서의 위치를 지칭하며, 이는 이종 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 바로 업스트림이다. "삽입 부위"는 번호로서 특정되고, 번호는 기준 서열에서의 아미노산 번호이다. 예를 들어, FVIII에서의 "삽입 부위"는 삽입 위치에 대해 바로 N-말단인, 삽입 부위가 상응하는 성숙 천연 FVIII(SEQ ID NO: 15)에서의 아미노산 서열 번호를 지칭한다. 예를 들어, 문구 "a3 도메인은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1656에 상응하는 삽입 부위에서 이종 모이어티를 포함한다"는 이종 모이어티가 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1656과 아미노산 1657에 상응하는 2 개의 아미노산 사이에 위치함을 나타낸다.
본원에서 사용된 문구 "아미노산의 바로 다운스트림"은 아미노산의 말단 카르복실기 바로 옆 위치를 지칭한다. 유사하게, 문구 "아미노산의 바로 업스트림"은 아미노산의 말단 아민기 바로 옆 위치를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "삽입된", "삽입되는", "로 삽입된" 또는 문법상 관련된 용어는 모 폴리펩타이드에서 유사한 위치에 대한 폴리펩타이드(예를 들어, 응고 인자)에서의 이종 모이어티의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 일정 구현예에서, "삽입된"과 같은 말은, 천연의 성숙 인간 FVIII에서의 유사한 위치에 대한, 재조합 FVIII 폴리펩타이드에서의 이종 모이어티의 위치를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어는 폴리펩타이드의 특성을 지칭하며, 폴리펩타이드가 제조되는 임의의 방법 또는 과정을 나타내거나, 암시하거나, 추론하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "반감기"는 생체내 구체적인 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 대상체에게 투여되는 양의 절반이 동물의 순환 및/또는 다른 조직으로부터 제거되는 데에 필요한 시간으로 표현될 수 있다. 주어진 폴리펩타이드의 청소율(clearance) 곡선이 시간의 함수로서 구성될 때, 곡선은 일반적으로 빠른 α-상 및 더 긴 β-상을 갖는 2 상이다. α-상은 전형적으로 혈관-내 및 혈관-외 공간 사이에서의 투여된 Fc 폴리펩타이드의 평형을 나타내며, 부분적으로는, 폴리펩타이드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서의 폴리펩타이드의 이화 작용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 및 상기를 포함하는 키메라 단백질은 단상성이며, 이에 따라 알파 상을 갖지 않고, 단일 베타 상만을 갖는다. 따라서, 일정 구현예에서, 본원에서 사용된 용어 반감기는 β-상에서 폴리펩타이드의 반감기를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "연결된"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 공유 결합 또는 비-공유 결합으로 합쳐진 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 직접 합쳐지거나 병치될 수 있거나 또는 대안적으로 개재 서열이 제1 서열을 제2 서열에 공유 결합으로 연결할 수 있다. 용어 "연결된"은 C-말단 또는 N-말단에서의 제1 아미노산 서열의 제2 아미노산 서열로의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 제2 아미노산 서열(또는 제1 아미노산 서열)의 임의의 2 개의 아미노산 내로의 전체 제1 아미노산 서열(또는, 각각, 제2 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 아미노산 서열은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 제1 뉴클레오타이드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(폴리펩타이드 쇄에 대하여) 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쇄(뉴클레오타이드 쇄에 대하여) 또는 임의의 화학적 모이어티(폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 쇄 둘 모두에 대하여)일 수 있다. 용어 "연결된"은 하이픈(-)으로도 표시된다.
본원에서 사용된 지혈은 출혈(bleeding 또는 hemorrhage)의 정지 또는 지연; 또는 혈관 또는 신체 부위를 통한 혈류의 정지 또는 지연을 의미한다.
본원에서 사용된 지혈 장애는 피브린 응고 형성 능력 손상 또는 불능으로 인해, 자발적으로 또는 외상의 결과로서, 출혈하는 경향을 특징으로 하는 유전적으로 유전되는 또는 획득되는 질환을 의미한다. 이러한 장애의 예에는 혈우병이 포함된다. 세 가지 주요 형태는 혈우병 A(인자 VIII 결핍), 혈우병 B(인자 IX 결핍 또는 "크리스마스 병") 및 혈우병 C(인자 XI 결핍, 경미한 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애로는, 예를 들어, 폰 빌레브란트(von Willebrand) 병, 인자 XI 결핍(PTA 결핍), 인자 XII 결핍, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 Ⅴ, 인자 VII, 인자 Ⅹ 또는 인자 XIII의 결핍 또는 구조적 이상, GPIb의 결손 또는 결핍인, 버나드-슐리에(Bernard-Soulier) 증후군. vWF의 수용체인 GPIb는 결손이 있어 1 차 혈전 형성(1 차 지혈) 결여 및 출혈 경향 증가를 초래할 수 있다), 및 글란즈만 및 네겔리(Glanzman and Naegeli) 혈소판무력증(글란즈만 혈소판무력증, Glanzmann thrombasthenia)이 포함된다. 간 부전(급성 및 만성 형태)에서는, 간에 의한 응고 인자 생산이 불충분하다; 이것은 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드, 또는 본 개시내용의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터는 예방적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "예방적 치료"는 출혈 에피소드 이전 분자의 투여를 지칭한다. 일 구현예에서, 일반적인 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나, 수술을 받기 직전에 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 벡터는 수술 전 또는 후에 예방적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 벡터는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 중 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 치과 수술, 또는 줄기 세포 이식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드, 또는 벡터는 온-디맨드(on-demand) 치료에 또한 사용된다. 용어 "온-디맨드 치료"는 출혈 에피소드의 증상에 대응하여 또는 출혈을 일으킬 수 있는 활동 전에 단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드, 또는 벡터를 투여하는 것을 지칭한다. 일 양태에서, 온-디맨드 치료는, 부상 후와 같이 출혈이 시작될 때, 또는 수술 전과 같이 출혈이 예상될 때 대상체에게 제공될 수 있다. 또 다른 양태에서, 온-디맨드 치료는, 접촉 스포츠와 같은, 출혈 위험을 증가시키는 활동 전에 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "급성 출혈"은 기저 원인에 관계없이 출혈 에피소드를 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애(예를 들어, 인자 VII 결핍), 혈소판 장애, 또는 응고 인자에 대한 항체 발달로 인한 저항성을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 치료하다, 치료, 또는 치료하는,은, 예를 들어 질병 또는 질환의 중증도 감소; 질병 경과 기간 감소; 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개선; 질병 또는 질환을 반드시 완치하지 않고도, 질병 또는 질환을 갖는 대상체에게의 유익한 효과 제공, 또는 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 예방을 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드 또는 벡터를 투여함으로써 대상체에서, 예를 들어, 적어도 약 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, 20 IU/dL, 25 IU/dL, 30 IU/dL, 35 IU/dL, 40 IU/dL, 45 IU/dL, 50 IU/dL, 55 IU/dL, 60 IU/dL, 65 IU/dL, 70 IU/dL, 75 IU/dL, 80 IU/dL, 85 IU/dL, 90 IU/dL, 95 IU/dL, 100 IU/dL, 105 IU/dL, 110 IU/dL, 115 IU/dL, 120 IU/dL, 125 IU/dL, 130 IU/dL, 135 IU/dL, 140 IU/dL, 145 IU/dL, 또는 150 IU/dL의 FVIII 저점 수준을 유지하는 것을 의미한다. 또 다른 구현예에서, 치료하는 것 또는 치료는 약 1 내지 약 150 IU/dL, 약 1 내지 약 125 IU/dL, 약 1 내지 약 100 IU/dL, 약 1 내지 약 90 IU/dL, 약 1 내지 약 85 IU/dL, 약 1 내지 약 80 IU/dL, 약 1 내지 약 75 IU/dL, 약 1 내지 약 70 IU/dL, 약 1 내지 약 65 IU/dL, 약 1 내지 약 60 IU/dL, 약 1 내지 약 55 IU/dL, 약 1 내지 약 50 IU/dL, 약 1 내지 약 45 IU/dL, 약 1 내지 약 40 IU/dL, 약 1 내지 약 35 IU/dL, 약 1 내지 약 30 IU/dL, 약 1 내지 약 25 IU/dL, 약 25 내지 약 125 IU/dL, 약 50 내지 약 100 IU/dL, 약 50 내지 약 75 IU/dL, 약 75 내지 약 100 IU/dL, 약 1 내지 약 20 IU/dL, 약 2 내지 약 20 IU/dL, 약 3 내지 약 20 IU/dL, 약 4 내지 약 20 IU/dL, 약 5 내지 약 20 IU/dL, 약 6 내지 약 20 IU/dL, 약 7 내지 약 20 IU/dL, 약 8 내지 약 20 IU/dL, 약 9 내지 약 20 IU/dL, 또는 약 10 내지 약 20 IU/dL의 FVIII 저점 수준을 유지하는 것을 의미한다. 질병 또는 질환의 치료 또는 치료하는 것은 또한 비-혈우병 대상체에서 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 또는 150%의 FVIII 활성에 상당한 수준으로 대상체의 FVIII 활성을 유지하는 것을 포함할 수 있다. 치료에 요구되는 최소 저점 수준은 하나 이상의 알려진 방법으로 측정될 수 있고 각각의 사람에 대해 조정(증가 또는 감소)될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "투여하는"은 약제학적으로 허용 가능한 경로를 통해 대상체에게 약제학적으로 허용 가능한 핵산 분자, 그로부터 발현된 폴리펩타이드, 또는 본 개시내용의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 의미한다. 투여 경로는 정맥내, 예를 들어 정맥내 주사 및 정맥내 점적주사일 수 있다. 추가 투여 경로는 예를 들어 피하, 근육내, 경구, 비강 및 폐 투여를 포함한다. 핵산 분자, 폴리펩타이드 및 벡터는 적어도 하나의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일환으로서 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 인간에게 투여될 때 생리학적으로 허용 가능하고, 전형적으로 독성 또는 알러지 또는 유사한 부반응, 예컨대, 위 경련, 및 현기증 등을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다. 선택적으로, 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 및 보다 구체적으로 인간에서의 사용을 위한 다른 일반적으로 공인된 약전에 기재되어 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 문구 "이를 필요로 하는 대상체"는, 본 개시내용의 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 벡터의 투여로 인해 수혜를 받을(예를 들어, 지혈 개선) 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 혈우병을 가진 개인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 치료적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII 저해가 생김으로써 우회 요법을 필요로 하는 개인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대상체는 성인 또는 미성년자(예를 들어, 12세 미만)일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료적 단백질"은 대상체에게 투여될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 응고 인자, 성장 인자, 항체, 이의 기능적 단편, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "응고 인자"는 대상체에서의 출혈 에피소드를 예방하거나 이의 기간을 감소시키는, 천연 발생 또는 재조합으로 생산된, 분자, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 달리 말해, 이것은 응고촉진 활성을 갖는 분자를 의미하고, 즉, 혈액이 응고되도록(coagulate 또는 clot) 불용성 피브린의 메쉬로 피브리노겐의 전환을 담당한다. 본원에서 사용된 "응고 인자"는 활성 응고 인자, 이의 효소원, 또는 활성화 가능한 인자를 포함한다. "활성화 가능한 응고 인자"는 활성 형태로 전환될 수 있는 불활성 형태의(예를 들어, 이의 효소원 형태의) 응고 인자이다. 용어 "응고 인자"는 인자 I(FI), 인자 II(FII), 인자 V(FV), FVII, FVIII, FIX, 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 인자 XIII(FXIII), 폰 빌레브란트 인자(VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노젠, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성화제 저해제-2(PAI2), 이의 효소원, 이의 활성 형태, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 응고 활성은 피브린 혈전의 형성에서 절정을 이루고/이루거나, 대출혈 또는 출혈 에피소드의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키는 생화학적 반응의 캐스케이드에 참여하는 능력을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "성장 인자"는 사이토카인 및 호르몬을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 아드레노메둘린(AM), 앙기오포이테인(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형성 단백질(BMP)(예를 들어, BMP2, BMP4, BMP5, BMP7), 섬모 신경영양인자 패밀리 일원(예를 들어, 섬모 신경영양인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 인터루킨-6(IL-6)), 집락-자극 인자(예를 들어, 대식세포 집락-자극 인자(m-CSF), 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF)), 상피 성장 인자(EGF), 에프린(예를 들어, 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자 (FGF) (예를 들어, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23), 소 태아 소마토트로핀(FBS), GDNF 패밀리 일원(예를 들어, 글리알 세포주-유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 페르세핀, 아르테민), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간세포암-유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(예를 들어, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2, 인터루킨(IL)(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7), 각질세포 성장 인자(KGF), 이동-자극 인자(MSF), 대식세포-자극 단백질(MSP 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP)), 마이오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린(예를 들어, 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3, NRG4), 신경영양(예를 들어, 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 신경영양-3(NT-3), NT-4, 태반 성장 인자(PGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 레날라제(RNLS), T-세포 성장 인자(TCGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자(예를 들어, 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), TGF-β, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불린), 티로신 하이드록실라제, AADC, 사이클로하이드로라제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다제), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 사용된 용어 "이종" 또는 "외인성"은 소정의 환경, 예를 들어 세포 또는 폴리펩타이드에서 보통 발견되지 않는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 외인성 또는 이종 분자는 세포로 도입될 수 있고, 예를 들어 형질감염 또는 다른 형태의 유전자 조작에 의해 세포를 조작한 후에만 존재하거나, 이종 아미노산 서열은 이것이 천연적으로 발견되지 않는 단백질에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "이종 뉴클레오타이드 서열"은 소정의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 천연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 치료적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 반감기를 연장시킬 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 치료적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 수력학적 반경을 증가시키는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 이의 생물학적 활성 또는 기능(예를 들어, 이의 응고촉진 활성)에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 치료적 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 링커에 의해 이종 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에 결합되거나 연결된다. 이종 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 모이어티의 비제한적인 예는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분, 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, 트랜스페린, 미국 특허 출원 번호 20100292130의 PAS 폴리펩타이드, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩타이드(CTP), 알부민 결합 소분자, XTEN 서열, FcRn 결합 모이어티(예를 들어, FcRn에 결합하는 완전한 Fc 영역 또는 이의 부분), 단일 쇄 Fc 영역(예를 들어, US 2008/0260738, WO 2008/012543 또는 WO 2008/1439545에 기재된 바와 같은 ScFc 영역), 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 펩타이드, 및 무엇보다도 50% 미만 내지 50% 초과의 다양한 정도의 2차 구조를 갖는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 아미노산의 2 종의 아미노산으로 된 6 개 내지 40 개의 아미노산의 펩타이드 및 짧은 폴리펩타이드, 또는 2 개 이상의 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 비-폴리펩타이드 모이어티에 연결된다. 비-폴리펩타이드 모이어티의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알부민 결합 소분자, 폴리시알산, 하이드록시에틸 전분(HES), 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 상응하는 폴리펩타이드의 부분, 즉 이의 2 개의 중쇄의 Fc 도메인 각각의 이합체 회합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 네이티브 Fc 영역은 또 다른 Fc 영역과 동종이합체를 형성한다. 반대로, 본원에 사용된 용어 "유전자 융합된 Fc 영역" 또는 "단일-쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 유전적으로 연결된(즉, 단일 인접한 유전자 서열에서 인코딩된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이합체 Fc 영역을 지칭한다.
일 구현예에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG에서의 216번 잔기, 114번일 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 취함)의 바로 업스트림의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C 말단에서 끝나는 단일 Ig 중쇄의 부분을 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
Ig 불변 영역의 Fc 영역은, Ig 이소타입에 따라, CH2, CH3 및 CH4 도메인, 및 힌지 영역을 포함할 수 있다. Ig의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 증가된 안정성, 증가된 혈청 반감기(문헌[Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조), 및 Fc 수용체, 예컨대 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합(미국 특허 번호 6,086,875, 제6,485,726호, 제6,030,613호; WO 03/077834; US2003-0235536A1)(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 포함하는 키메라 단백질에 대한 몇몇 원하는 특성을 부여한다.
"기준 뉴클레오타이드 서열"은, 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열에 대한 비교로서 본원에서 사용될 때, 서열이 최적화되지 않는다는 것을 제외하고 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열과 본질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 코돈 최적화된 BDD FVIII로 이루어진 핵산 분자에 대한 기준 뉴클레오타이드 서열 및 3' 말단에서의 SEQ ID NO: 1에 연결된 단일 쇄 Fc 영역을 인코딩하는 이종 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16의 원래의(또는 "모") BDD FVIII(도 1i) 및 3' 말단에서 SEQ ID NO: 16에 연결된 단일 쇄 Fc 영역을 코딩하는 동일한 이종 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자이다.
뉴클레오타이드 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "최적화된"은 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리뉴클레오타이드 서열의 특성을 향상시키도록 돌연변이된, 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 최적화는 전사 수준을 증가시키거나, 번역 수준을 증가시키거나, 정상-상태 mRNA 수준을 증가시키거나, 일반적인 전사 인자와 같은 조절 단백질의 결합을 증가시키거나 감소시키거나, 스플라이싱을 증가시키거나 감소시키거나, 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 생산되는 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위해 수행된다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 최적화시키도록 이에 대해 이루어질 수 있는 변화의 예는 코돈 최적화, G/C 함량 최적화, 반복 서열의 제거, AT 풍부 요소의 제거, 부정확한 스플라이스 부위의 제거, 전사 또는 번역을 억제하는 시스-작용 요소의 제거, 폴리-T 또는 폴리-A 서열의 첨가 또는 제거, 코작(Kozak) 공통 서열과 같이 전사를 향상시키는 전사 개시 부위 주변에 서열 첨가, 스템 루프 구조를 형성시킬 수 있는 서열의 제거, 탈안정화 서열의 제거, 및 이들의 둘 이상의 조합을 포함한다.
II. 핵산 분자
본 개시내용은 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 치료적 단백질 또는 유전자를 인코딩하는 플라스미드-유사의 무-캡시드 핵산 분자에 관한 것이다. 바이러스의 단백질 외각인 캡시드는 바이러스의 유전 물질을 둘러 싸고 있다. 캡시드는 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 숙주에 전달하고, 숙주와 상호작용함으로써 비리온의 기능을 돕는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 캡시드는 특히 유전자 요법에서 사용되는 경우, 벡터의 패키징 용량을 제한하고/하거나 면역 반응을 유발하는 인자일 수 있다.
AAV 벡터는 유전자 요법 벡터의 보다 흔한 타입 중 하나로 나타났다. 그러나, 캡시드의 존재는 유전자 요법에서 AAV 벡터의 사용을 제한한다. 특히, 캡시드 자체는 벡터에 포함되는 전이유전자의 크기를 4.5 kb 미만만큼 작게 제한할 수 있다. 유전자 요법에 유용할 수 있는 다양한 치료적 단백질은 조절 요소가 첨가되기 전에도 이러한 크기를 쉽게 초과할 수 있다.
게다가, 캡시드를 구성하는 단백질은 대상체의 면역계에 의해 표적화될 수 있는 항원으로서 작용할 수 있다. AAV는 일반 대중에게 매우 흔하며, 대부분의 사람들은 전 생애에 걸쳐 AAV에 노출되고 있다. 결과적으로, 대부분의 잠재적 유전자 요법 수용자는 AAV에 대한 면역 반응을 이미 생성시켰을 가능성이 있고, 이에 따라 요법을 거부할 가능성이 높다.
본 개시내용의 일정 양태는 AAV 벡터의 결핍을 극복하는 것이 목적이다. 특히, 본 개시내용의 일정 양태는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 유전자 카세트, 예를 들어, 치료적 단백질 및/또는 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일정 구현예에서, 핵산 분자는 캡시드 단백질, 복제 단백질, 및/또는 조립 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 치료적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 응고 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 miRNA를 인코딩한다. 일정 구현예에서, 유전자 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 비코딩 영역을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 비-코딩 영역은 프로모터 서열, 인트론, 전사 후 조절 요소, 3'UTR 폴리(A) 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 유전자 카세트는 단일 가닥 핵산이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 카세트는 이중 가닥 핵산이다.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) miRNA 또는 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자를 인코딩하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA;
(g) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제2 ITR.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) miRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드로서, miRNA는 SOD1, HTT, RHO, 및 이들의 임의의 조합으로부터 생성된 표적 유전자의 발현을 하향 조절하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA;
(g) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제2 ITR.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불린), 티로신 하이드록실라제, AADC, 사이클로하이드로라제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다제), 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA;
(g) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제2 ITR.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) FVIII를 인코딩하는 뉴클레오타이드로서, 뉴클레오타이드가 SEQ ID NO: 1 내지 14 또는 SEQ ID NO: 71로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 FVIII는 FVIII 활성을 보유하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA; 및
(g) AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인, 제2 ITR.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) miRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드로서, miRNA가 표적 유전자, 예를 들어, SOD1, HTT, RHO, 및 이들의 임의의 조합의 발현을 하향 조절하는, 뉴클레오타이드;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA; 및
(g) AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인, 제2 ITR.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함한다:
(a) AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인, 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불린), 티로신 하이드록실라제, AADC, 사이클로하이드로라제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다제), 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는, 뉴클레오타이드;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA; 및
(g) AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인, 제2 ITR.
또 다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) miRNA 또는 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자를 인코딩하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA; 및
(g) 제2 ITR을 포함하며,
여기서, 제1 ITR 또는 제2 ITR 중 하나는 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR이고, 다른 ITR은 AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2 게놈의 ITR이다.
또 다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어, 합성 인트론;
(d) miRNA 또는 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자를 인코딩하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사 후 조절 요소, 예를 들어, WPRE;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어, bGHpA; 및
(g) 제2 ITR을 포함하며,
여기서, 제1 ITR은 합성 ITR이거나, 제2 ITR은 합성 ITR이거나, 제1 ITR과 제2 ITR 둘 모두는 합성 ITR이다.
A. 역 말단 반복부
본 개시내용의 일정 양태는 제1 ITR, 예를 들어, 5' ITR, 및 제 2 ITR, 예를 들어, 3' ITR을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 전형적으로, ITR은 원핵생물 플라스미드로부터 파르보바이러스(예를 들어, AAV) DNA 복제 및 복구, 또는 절단에 관여한다(문헌[Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb and Muzyczka, 1988]). 또한, ITR은 AAV 프로바이러스 통합, 및 AAV DNA의 비리온으로의 패키징에 필요한 최소 서열인 것으로 보인다(문헌[McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989]). 이러한 요소는 파르보바이러스 게놈의 효율적인 증식에 필수적이다. ITR 기능에 필수불가결한 최소 결정 요소는 Rep-결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2의 경우 GCGCGCTCGCTCGCTC(SEQ ID NO: 104)), 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변적 회문 서열에 더하여 말단 분해 부위(예를 들어, TRS; AAV2의 경우 AGTTGG (SEQ ID NO: 105))라는 가설이 세워진다. 회문 뉴클레오타이드 영역은 일반적으로 DNA 복제의 기점으로서 그리고 바이러스에 대한 패키징 신호로서 시스에서 함께 기능한다. ITR에서 상보적 서열은 DNA 복제 동안 헤어핀 구조로 폴딩된다. 일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 T 자형 구조로 폴딩된다. 다른 구현예에서, ITR은 비-T 자형 헤어핀 구조로, 예를 들어, U 자형 헤어핀 구조로 폴딩된다. 데이터는 AAV ITR의 T 자형 헤어핀 구조가 ITR이 측접된 전이유전자의 발현을 저해할 수 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, 문헌[Zhou et al., Scientific Reports 7:5432 (July 14, 2017)] 참고. T 자형 헤어핀 구조를 형성시키지 않는 ITR을 사용함으로써, 이러한 형태의 저해가 방지될 수 있다. 그러므로, 일정 양태에서, 비-AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 T 자형 헤어핀을 형성시키는 AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 비해 개선된 전이유전자 발현을 갖는다.
일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR을 포함하고, 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 ITR의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 합성 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 합성 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 각각은 합성 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 천연 발생 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 각각은 천연 발생 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 일부, 예를 들어, 절단된 ITR을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 적어도 약 5 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 10 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 15 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 30 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 35 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 40 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 45 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 50 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 55 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 60 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 65 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 70 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 75 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 80 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 85 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 90 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 95 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 125 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 150 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 175 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 200 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 225 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 250 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 275 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 300 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 325 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 350 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 375 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 400 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 425 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 450 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 475 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 500 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 525 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 550 개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 575 개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 600 개의 뉴클레오타이드를 포함하고; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일정 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 적어도 약 129 개의 뉴클레오타이드를 포함하고, ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일정 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 적어도 약 102 개의 뉴클레오타이드를 포함하고, ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 부분을 포함하거나 이로 구성되며, 단편은 천연 발생 ITR의 길이의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 포함하고; 단편은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다.
일정 구현예에서, ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 구성되며, ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 다른 구현예에서, ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 구성되며; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 구성되며; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 70%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 구성되며; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 60%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 구성되며; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은, 적절히 정렬되었을 경우, 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 50%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 구성되며; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, ITR은 AAV 게놈으로부터의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈의 ITR이다. 특정 구현예에서, ITR은 AAV2 게놈의 ITR이다. 또 다른 구현예에서, ITR은 이의 5' 및 3' 말단에서 AAV 게놈들 중 하나 이상으로부터 유래된 ITR을 포함하도록 유전적으로 조작된 합성 서열이다.
일부 구현예에서, ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, ITR은 비-AAV의 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과로부터의 비-AAV 게놈의 ITR이다. 일정 구현예에서, ITR은 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, ITR은 머스코비 오리 파르보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 일정 구현예에서, MDPV 균주는 약독화, 예를 들어, MDPV 균주 FZ91-30이다. 다른 구현예에서, MDPV 균주는 병원성, 예를 들어, MDPV 균주 YY이다. 일부 구현예에서, ITR은 돼지 파르보바이러스, 예를 들어, 돼지 파르보바이러스 U44978로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 미세 생쥐 바이러스, 예를 들어, 미세 생쥐 바이러스 U34256으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 개 파르보바이러스, 예를 들어, 개 파르보바이러스 M19296으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 밍크 장염 바이러스, 예를 들어, 밍크 장염 바이러스 D00765로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 데펜도파르보바이러스로부터 유래된다. 일 구현예에서, 데펜도파르보바이러스는 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주이다. 특정 구현예에서, GPV 균주는 약독화, 예를 들어, GPV 균주 82-0321V이다. 또 다른 특정 구현예에서, GPV 균주는 병원성, 예를 들어, GPV 균주 B이다.
핵산 분자의 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 게놈으로부터, 예를 들어, 동일한 바이러스의 게놈으로부터, 또는 상이한 게놈으로부터, 예를 들어, 둘 이상의 상이한 바이러스 게놈들의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일정 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 AAV 게놈으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 존재하는 2 개의 ITR은 동일하며, 특히 AAV2 ITR일 수 있다. 다른 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV 게놈). 다른 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않고(예를 들어, 비-AAV 게놈), 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래된다. 추가의 다른 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR 둘 모두가 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV 게놈). 일 구체적 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래되고, 여기서 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래되고, 여기서 제1 ITR 및 제2 ITR은 상이한 게놈으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다.
일정 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 B19로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 167, 168, 169, 170, 및 171로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 유래되는 B19 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 167, 168, 169, 170, 및 171로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 헤어핀 구조는 T자형 헤어핀을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 167, 168, 169, 170, 및 171로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 167에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 168에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 169에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 170에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 171에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
[표 1]
샘플 파르보바이러스 ITR 서열.
Figure pct00001
Figure pct00002
일정 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 169에 제시된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 167에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하고, 유래되는 B19 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 169에 제시된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 167에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 헤어핀 구조는 T자형 헤어핀을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 GPV로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 GPV로부터 유래된다.
일정 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 GPV로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 172, 173, 174, 175, 및 176으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 유래되는 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 GPV로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 172, 173, 174, 175, 및 176으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 헤어핀 구조는 T자형 헤어핀을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 172, 173, 174, 175, 및 176으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 172에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 173에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 174에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 175에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 176에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
일정 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 174에 제시된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 172에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 유래되는 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 174에 제시된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 172에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 헤어핀 구조는 T자형 헤어핀을 포함하지 않는다.
일정 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 176에 제시된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 172에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 유래되는 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 176에 제시된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 172에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 헤어핀 구조는 T자형 헤어핀을 포함하지 않는다.
일정 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR 중 하나는 AAV2로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 177 또는 178에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 유래되는 AAV2 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 177 또는 178에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 헤어핀 구조는 T자형 헤어핀을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 177 또는 178에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 177에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 SEQ ID NO: 178에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 머스코비 오리 파르보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 머스코비 오리 파르보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 일정 구현예에서, MDPV 균주는 약독화, 예를 들어, MDPV 균주 FZ91-30이다. 다른 구현예에서, MDPV 균주는 병원성, 예를 들어, MDPV 균주 YY이다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 데펜도파르보바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 데펜도파르보바이러스로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 데펜도바이러스 GPV 균주로부터 유래된다. 일정 구현예에서, GPV 균주는 약독화, 예를 들어, GPV 균주 82-0321V이다. 다른 구현예에서, GPV 균주는 병원성, 예를 들어, GPV 균주 B이다.
일정 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 돼지 파르보바이러스, 예를 들어, 돼지 파르보바이러스 균주 U44978; 미세 생쥐 바이러스, 예를 들어, 미세 생쥐 바이러스 균주 U34256; 개 파르보바이러스, 예를 들어, 개 파르보바이러스 균주 M19296; 밍크 장염 바이러스, 예를 들어, 밍크 장염 바이러스 균주 D00765; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 돼지 파르보바이러스, 예를 들어, 돼지 파르보바이러스 균주 U44978; 미세 생쥐 바이러스, 예를 들어, 미세 생쥐 바이러스 균주 U34256; 개 파르보바이러스, 예를 들어, 개 파르보바이러스 균주 M19296; 밍크 장염 바이러스, 예를 들어, 밍크 장염 바이러스 균주 D00765; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다.
또 다른 구체적 구현예에서, ITR은 이의 5′ 및 3′ 말단에서 AAV 게놈으로부터 유래되지 않은 ITR을 포함하도록 유전적으로 조작된 합성 서열이다. 또 다른 구체적 구현예에서, ITR은 이의 5' 및 3' 말단에서 비-AAV 게놈 중 하나 이상으로부터 유래된 ITR을 포함하도록 유전적으로 조작된 합성 서열이다. 본 발명의 핵산 분자에 존재하는 2 개의 ITR은 동일하거나 상이한 비-AAV 게놈일 수 있다. 특히, ITR은 동일한 비-AAV 게놈으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 존재하는 2 개의 ITR은 동일하며, 특히 AAV2 ITR일 수 있다.
일부 구현예에서, ITR 서열은 하나 이상의 회문 서열을 포함한다. 본원에 개시된 ITR의 회문 서열은 천연 회문 서열(즉, 자연에서 확인된 서열), 합성 서열(즉, 자연에서 확인되지 않는 서열), 예컨대, 유사 회문 서열, 및 이의 조합 또는 변형 형태를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "유사 회문 서열"은 이차 구조를 형성시키는 천연 AAV 또는 비-AAV 회문 서열에서의 서열과 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만(또는 없음)을 포함하여 80% 미만의 핵산 서열 동일성을 공유하는 불완전 회문 서열을 포함하는 회문 DNA 서열이다. 천연 회문 서열은 본원에 개시된 임의의 게놈으로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 합성 회문 서열은 본원에 개시된 임의의 게놈에 기반할 수 있다.
회문 서열은 연속적 또는 비연속적일 수 있다. 일부 구현예에서, 회문 서열은 비연속적이고, 여기서 회문 서열은 제2 서열의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 서열은 프로모터, 인핸서, 인테그라제를 위한 통합 부위(예를 들어, Cre 또는 Flp 재조합효소를 위한 부위), 유전자 산물을 위한 개방형 해독틀, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 루프 구조를 형성시킨다. 일 구현예에서, 제1 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킨다. 또 다른 구현예에서, 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성시킨다. 추가의 또 다른 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR 둘 모두는 헤어핀 구조를 형성시킨다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 T 자형 헤어핀 구조를 형성시키지 않는다. 일정 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-T 자형 헤어핀 구조를 형성시킨다. 일부 구현예에서, 비-T 자형 헤어핀 구조는 U 자형 헤어핀 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자에서 ITR은 전사 활성화된 ITR일 수 있다. 전사-활성화된 ITR은 적어도 하나의 전사 활성 요소를 포함함으로써 전사 활성화된 야생형 ITR의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다양한 유형의 전사 활성 요소가 이러한 맥락에서 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 전사 활성 요소는 구성성 전사 활성 요소이다. 구성성 전사 활성 요소는 지속적인 수준의 유전자 전사를 제공하고, 전이유전자가 지속적으로 발현되는 것이 요망되는 경우에 바람직하다. 다른 구현예에서, 전사 활성 요소는 유도성 전사 활성 요소이다. 유도성 전사 활성 요소는 일반적으로 유도제(또는 유도 조건)의 부재 하에서 낮은 활성을 나타내고, 유도제의 존재 하에서 상향 조절된다(또는 유도 조건으로 바꾼다). 유도성 전사 활성 요소는 발현이 특정 시간 또는 특정 위치에서만 요망되는 경우, 또는 유도제를 사용하여 발현의 수준을 적정하는 것이 요망되는 경우 바람직할 수 있다. 전사 활성 요소는 또한 조직-특이적일 수 있다; 즉, 이들은 일정 조직 또는 세포 유형에서만 활성을 나타낸다.
전사 활성 요소는 다양한 방식으로 ITR에 편입될 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 활성 요소는 ITR의 임의 위치에 대해 5'에 도입되거나 ITR의 임의 위치에 대해 3'에 편입된다. 다른 구현예에서, 전사-활성화된 ITR의 전사 활성 요소는 2 개의 ITR 서열 사이에 있다. 전사 활성 요소가 이격되어야만 하는 둘 이상의 요소들을 포함하는 경우, 그러한 요소들은 ITR의 일부와 교대될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR의 헤어핀 구조는 결실되고, 전사 요소의 역반복부로 대체된다. 이러한 후자 배열은 구조에서 결실된 부분을 모사하는 헤어핀을 생성시킬 것이다. 다중 탠덤 전사 활성 요소가 또한 전사-활성화된 ITR에 존재할 수 있고, 이들은 인접하거나 이격되어 있을 수 있다. 또한, 단백질 결합 부위(예를 들어, Rep 결합 부위)는 전사-활성화된 ITR의 전사 활성 요소에 도입될 수 있다. 전사 활성 요소는 RNA 중합효소에 의한 DNA의 제어된 전사가 RNA를 형성시킬 수 있게 하는 임의의 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, 하기 정의된 바와 같은 전사 활성 요소를 포함할 수 있다.
전사-활성화된 ITR은 핵산 분자로부터 운반되고 발현될 수 있는 전이유전자의 길이를 효과적으로 최대화시키는 비교적 제한된 뉴클레오타이드 서열 길이로 핵산 분자에 전사 활성화와 ITR 기능 둘 모두를 제공한다. ITR로의 전사 활성 요소의 편입은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. ITR 서열의 비교, 및 전사 활성 요소의 서열 요건은 ITR 내에 요소를 인코딩하는 방식에 통찰력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 전사 활성은 전사 활성 요소의 기능 요소를 복제하는 ITR 서열에서 특이적 변화의 도입을 통해 ITR에 부가될 수 있다. 특이적 부위에서 특정 뉴클레오타이드 서열을 효율적으로 첨가하고/하거나, 결실시키고/시키거나, 변화시키는 다수의 기술들이 당업계에 존재한다(예를 들어, 문헌[Deng and Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88] 참조). 전사-활성화된 ITR을 생성시키는 또 다른 방식은 ITR에서 요망되는 위치에 제한 부위를 도입하는 것을 수반한다. 또한, 다중 전사 활성 요소는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 전사-활성화된 ITR에 편입될 수 있다.
예로서, 전사-활성화된 ITR은 TATA 박스, GC 박스, CCAAT 박스, Sp1 부위, Inr 영역, CRE(cAMP 조절 요소) 부위, ATF-1/CRE 부위, APBβ 박스, APBα 박스, CArG 박스, CCAC 박스, 또는 당업계에 공지된 바와 같은 전사에 관여하는 임의의 다른 요소와 같은 하나 이상의 전사 활성 요소를 포함함으로써 생성될 수 있다.
B. 치료적 단백질
본 개시내용의 일정 양태는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 하나의 치료적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 하나 초과의 치료적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 동일한 치료적 단백질의 둘 이상의 카피를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 동일한 치료적 단백질의 둘 이상의 변이체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 둘 이상의 상이한 치료적 단백질을 인코딩한다.
본 개시내용의 일정 구현예는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자로서, 치료적 단백질은 응고 인자를 포함하는, 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 응고 인자는 FI, FII, FIII, FIV, FV, FVI, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII), VWF, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노젠, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성화제 저해제-2(PAI2), 이들의 임의의 효소원, 이들의 임의의 이의 활성 형태, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 응고 인자는 FVIII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FVII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 VWF 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
1. 응고 인자
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 치료적 단백질은 인자 VIII 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "FVIII"로서 본 출원 전반에 걸쳐 약칭된 "인자 VIII"는, 달리 명시되지 않는 한, 응고 시 이의 정상적인 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. "하나의 FVIII 단백질"은 FVIII 폴리펩타이드(또는 단백질) 또는 FVIII와 상호교환 가능하게 사용된다. FVIII 기능의 예는 응고를 활성화시키는 능력, 인자 IX를 위한 보조인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에서 인자 IX와 테나제 복합체를 형성시키고, 이후 인자 X를 활성화된 형태 Xa로 전환시키는 능력을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. FVIII 단백질은 인간, 돼지, 개, 래트, 또는 뮤린 FVIII 단백질일 수 있다. 또한, 인간과 다른 종들로부터의 FVIII를 비교함으로써, 기능에 필요할 가능성이 있는 보존된 잔기가 식별되었다(문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; US 6,251,632). 전장 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 다수의 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 버전에 따라 공지되어 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 미국 공개 번호 2015/0158929 A1, 2014/0308280 A1, 및 2014/0370035 A1 및 국제 공개 번호 WO 2015/106052 A1에 개시되어 있다. FVIII 폴리펩타이드는, 예를 들어, 전장 FVIII, N-말단에서의 Met가 없는 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열 없음), N-말단에서의 추가 Met가 있는 성숙 FVIII, 및/또는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실이 있는 FVIII를 포함한다. FVIII 변이체는 부분 또는 완전 결실에 상관없이 B 도메인 결실을 포함한다.
a. FVIII, 및 FVIII 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 치료적 단백질은 인자 VIII 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "FVIII"로서 본 출원 전반에 걸쳐 약칭된 "인자 VIII"는, 달리 명시되지 않는 한, 응고 시 이의 정상적인 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. "하나의 FVIII 단백질"은 FVIII 폴리펩타이드(또는 단백질) 또는 FVIII와 상호교환 가능하게 사용된다. FVIII 기능의 예는 응고를 활성화시키는 능력, 인자 IX를 위한 보조인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에서 인자 IX와 테나제 복합체를 형성시키고, 이후 인자 X를 활성화된 형태 Xa로 전환시키는 능력을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. FVIII 단백질은 인간, 돼지, 개, 래트, 또는 뮤린 FVIII 단백질일 수 있다. 또한, 인간과 다른 종들로부터의 FVIII를 비교함으로써, 기능에 필요할 가능성이 있는 보존된 잔기가 식별되었다(문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; US 6,251,632). 전장 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 다수의 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 버전에 따라 공지되어 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 미국 공개 번호 2015/0158929 A1, 2014/0308280 A1, 및 2014/0370035 A1 및 국제 공개 번호 WO 2015/106052 A1에 개시되어 있다. FVIII 폴리펩타이드는, 예를 들어, 전장 FVIII, N-말단에서의 Met가 없는 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열 없음), N-말단에서의 추가 Met가 있는 성숙 FVIII, 및/또는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실이 있는 FVIII를 포함한다. FVIII 변이체는 부분 또는 완전 결실에 상관없이 B 도메인 결실을 포함한다.
본원에 사용된 키메라 단백질에서 FVIII 부분은 FVIII 활성을 갖는다. FVIII 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 다수의 검사들이 이용 가능하다: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: aPTT) 검사, 발색 분석, ROTEM 분석, 프로트롬빈 시간(prothrombin time: PT) 검사(INR을 결정하는 데에도 이용됨), 피브리노겐 검사(흔히 Clauss 방법에 의해), 혈소판 계수, 혈소판 기능 검사(흔히 PFA-100에 의해), TCT, 출혈 시간, 혼합 검사(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되는 경우, 이상증이 고쳐지는지의 여부), 응고 인자 분석, 항인지질 항체, D-이합체, 유전자 검사(예를 들어, 인자 V 레이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀의 살모사독 시간(dilute Russell's viper venom time: dRVVT), 다양한 혈소판 기능 검사, 트롬보엘라스토그래피(TEG 또는 Sonoclot), 트롬보엘라스토메트리(TEM®, 예를 들어, ROTEM®), 또는 유글로불린 용해 시간(euglobulin lysis time: ELT).
aPTT 검사는 "내재적"(접촉 활성화 경로로도 지칭됨) 및 일반적인 응고 경로 둘 모두의 효능을 측정하는 성능 지표이다. 이 검사는 상업적으로 입수 가능한 재조합 응고 인자, 예를 들어, FVIII의 응고 활성을 측정하기 위해 흔히 사용된다. 이는 외재적 경로를 측정하는 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다.
ROTEM 분석은 지혈의 전반적인 동력학에 대한 정보를 제공한다: 응고 시간, 혈전 형성, 혈전 안정성 및 용해. 트롬보엘라스토메트리에서 상이한 매개변수는 혈장 응고 시스템의 활성, 혈소판 기능, 섬유소용해, 또는 이러한 상호작용에 영향을 미치는 다수 인자들에 의해 좌우된다. 이 분석은 이차 지혈에 대한 철저한 예측을 제공할 수 있다.
발색 분석 메카니즘은 혈액 응고 캐스케이드의 원리에 기초하며, 여기서 활성화된 FVIII는 활성화된 인자 IX, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에서 인자 X의 인자 Xa로의 전환을 촉진한다. 인자 Xa 활성은 인자 Xa에 특이적인 p-니트로아닐리드(pNA) 기질의 가수분해에 의해 평가된다. 405 nM에서 측정된 p-니트로아닐린의 초기 방출 속도는 인자 Xa 활성에 직접적으로 비례하고 따라서 샘플에서의 FVIII 활성에 비례한다.
발색 분석은 국제 혈전증 및 지혈 학회(International Society on Thrombosis and Hemostatsis, ISTH)의 과학 및 표준화 위원회(Scientific and Standardization Committee, SSC)의 FVIII 및 인자 IX 소위원회에 의해 권고된다. 1994년 이래로, 발색 분석은 또한 FVIII 집중 효능의 작용에 대한 유럽 약전의 기준 방법이었다. 따라서, 일 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드에 필적 가능한 FVIII 활성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 FVIII를 포함하는 키메라 단백질은 성숙 FVIII 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 단백질에 필적 가능한 인자 Xa 발생률을 갖는다.
인자 X를 인자 Xa로 활성화시키기 위해, 활성화된 인자 IX(인자 IXa)는 Ca2+, 막 인지질, 및 FVIII 보조인자의 존재 하에 인자 X에서 하나의 아르기닌-이소류신 결합을 가수 분해하여 인자 Xa를 형성시킨다. 따라서, 인자 IX와 FVIII의 상호작용은 응고 경로에서 중요하다. 일정 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드에 필적 가능한 속도로 인자 IXa와 상호작용할 수 있다.
또한, FVIII는 순환이 비활성인 동안 폰 빌레브란트 인자에 결합된다. FVIII는 VWF에 결합되지 않을 때 빠르게 분해되고, 트롬빈의 작용에 의해 VWF로부터 방출된다. 일부 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드에 필적 가능한 수준으로 폰 빌레브란트 인자에 결합한다.
FVIII는 칼슘 및 인지질의 존재 하에서 활성화된 단백질 C에 의해 비활성화될 수 있다. 활성화된 단백질 C는 FVIII 중쇄를 A1 도메인에서 아르기닌 336 이후에 절단하고(이는 인자 X 기질 상호작용 부위를 방해함), A2 도메인에서 아르기닌 562 이후에 절단한다(이는 A2 도메인의 해리를 증가시킬 뿐만 아니라 인자 IXa와의 상호작용 부위를 방해함). 이러한 절단은 또한 A2 도메인(43 kDa)을 이등분하고, A2-N(18 kDa) 및 A2-C(25 kDa) 도메인을 생성시킨다. 따라서, 활성화된 단백질 C는 중쇄에서 다중 절단 부위를 촉매화할 수 있다. 일 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드에 필적 가능한 수준으로 활성화된 단백질 C에 의해 비활성화된다.
다른 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 단백질은 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드에 필적 가능한 생체내 FVIII 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 HemA 마우스 꼬리 정맥 절개 모델에서 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO®, 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드에 필적 가능한 수준으로 HemA 마우스를 보호할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, FVIII의 "B 도메인"은 트롬빈, 예를 들어, 성숙 인간 FVIII의 잔기 Ser741-Arg1648에 의한 단백질 분해성 절단의 부위 및 내부 아미노산 서열 동일성으로 규정되는 당업계에 공지된 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 성숙 인간 FVIII와 관련하여 다음 아미노산 잔기로 규정된다: 성숙 FVIII의, A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Ile2032; C1, 잔기 Arg2033-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. 임의의 SEQ ID 번호를 지칭하지 않고 본원에서 사용되는 서열 잔기 번호는 달리 지시되지 않는 한, 신호 펩타이드 서열(19 개의 아미노산)이 없는 FVIII 서열에 상응한다. FVIII 중쇄로도 알려진 A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 나머지 서열, 잔기 Glu1649-Arg1689는 대개 FVIII 경쇄 활성화 펩타이드로 지칭된다. 돼지, 마우스 및 개의 경우에 B 도메인을 포함한 모든 도메인에 대한 경계 위치가 또한 당업계에 공지되어 있다. 일 구현예에서, FVIII의 B 도메인은 결실된다("B-도메인-결실 FVIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 예로는 REFACTO®(재조합 BDD FVIII)이 있다. 일 구체적 구현예에서, B 도메인 결실 FVIII 변이체는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함한다.
"B-도메인-결실 FVIII"는 미국 특허 번호 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, 및 6,458,563 및 국제 공개 번호 WO 2015106052 A1(PCT/US2015/010738)에 개시된 완전 또는 부분 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에서 사용되는 B-도메인-결실 FVIII 서열은 미국 특허 번호 6,316,226(또한 US 6,346,513)의 4단 4줄 내지 5단 28줄 및 실시예 1 내지 실시예 5에 개시된 결실들 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 구현예에서, B-도메인 결실 인자 VIII는 S743/Q1638 B-도메인 결실 인자 VIII(SQ BDD FVIII)(예를 들어, 아미노산 744 내지 아미노산 1637의 결실을 갖는 인자 VIII, 예를 들어, 성숙 FVIII의 아미노산 1 내지 743 및 아미노산 1638 내지 2332를 갖는 인자 VIII)이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에서 사용되는 B-도메인-결실 FVIII는 미국 특허 5,789,203(또한, US 6,060,447, US 5,595,886, 및 US 6,228,620)의 2단 26줄 내지 51줄 및 실시예 5 내지 실시예 8에 개시된 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실 인자 VIII는 미국 특허 번호 5,972,885의 1 단 25 줄 내지 2 단 40 줄; 미국 특허 번호 6,048,720의 6 단 1 줄 내지 22 줄 및 실시예 1; 미국 특허 번호 5,543,502의 2 단 17 줄 내지 46 줄; 미국 특허 번호 5,171,844의 4 단 22 줄 내지 5 단 36 줄; 미국 특허 번호 5,112,950의 2 단 55 줄 내지 68 줄, 도 2, 및 실시예 1; 미국 특허 번호 4,868,112의 2 단 2 줄 내지 19 단 21 줄 및 표 2; 미국 특허 번호 7,041,635의 2 단 1 줄 내지 3 단 19 줄, 3 단 40 줄 내지 4 단 67 줄, 7 단 43 줄 내지 8 단 26 줄, 및 11 단 5 줄 내지 13 단 39 줄; 또는 미국 특허 번호 6,458,563의 4 단 25 줄 내지 53 줄에 기재된 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는, WO 91/09122에 개시된 바와 같이, 대부분의 B 도메인의 결실을 갖지만, 2 개의 폴리펩타이드 쇄로의 일차 번역 산물의 생체내 단백질 분해 가공에 필수적인 B 도메인의 아미노-말단 서열을 여전히 함유한다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 아미노산 747 내지 1638의 결실, 즉, B 도메인의 사실상 완전한 결실로 구성된다. 문헌[Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)] B-도메인-결실 인자 VIII는 또한 FVIII의 아미노산 771 내지 1666 또는 아미노산 868 내지 1562의 결실을 함유할 수 있다. 문헌[Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)]. 본 발명의 일부인 추가의 B 도메인 결실은 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639(문헌[Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942]), 797 내지 1562(문헌[Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347]), 741 내지 1646(Kaufman(PCT 출원 공개 번호 WO 87/04187)), 747 내지 1560(문헌[Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564]), 741 내지 1648(Pasek (PCT 출원 번호 88/00831)), 또는 816 내지 1598 또는 741 내지 1648(문헌[Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)])의 결실을 포함한다. 일 구체적 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함한다. 또 다른 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 745 내지 1648의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, BDD FVIII는 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 765 내지 1652에서 결실을 함유하는 단일 쇄 FVIII를 포함한다(rVIII-단일쇄 및 AFSTYLA®로도 알려짐). 미국 특허 번호 7,041,635 참고.
다른 구현예에서, BDD FVIII는 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위, 예를 들어, 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 상응하는 잔기 757, 784, 828, 900, 963, 또는 선택적으로 943을 보유하는 B-도메인의 단편을 함유하는 FVIII 폴리펩타이드를 포함한다. B-도메인 단편의 예는 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), and Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]에 개시된 바와 같이 B-도메인의 226 개의 아미노산 또는 163 개의 아미노산을 포함한다(즉, B 도메인의 처음 226 개의 아미노산 또는 163 개의 아미노산이 보유됨). 추가의 다른 구현예에서, BDD FVIII는 BDD FVIII 단백질의 발현을 향상시키기 위해 잔기 309에서 (Phe에서 Ser로의) 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)] 참조. 추가의 다른 구현예에서, BDD FVIII는 B-도메인의 일부를 함유하지만 하나 이상의 푸린 절단 부위를 함유하지 않는 FVIII 폴리펩타이드를 포함한다(예를 들어, Arg1313 및 Arg 1648). 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)] 참조. 일부 구현예에서, BDD FVIII는 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 765 내지 1652에서 결실을 함유하는 단일 쇄 FVIII를 포함한다(rVIII-단일쇄 및 AFSTYLA®로도 알려짐). 미국 특허 번호 7,041,635 참고. 상기 결실들 각각은 임의의 FVIII 서열에서 이루어질 수 있다.
상기 및 하기에 논의된 바와 같이, 상당히 많은 기능적 FVIII 변이체가 공지되어 있다. 또한, FVIII에서 수백 개의 비기능적 돌연변이가 혈우병 환자에서 식별되었고, FVIII 기능에 대한 이러한 돌연변이의 효과는 이들이 치환의 성질보다는 FVIII의 3-차원 구조 내에 있는 경우에 기인한 것으로 결정되었다(그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)]). 또한, 인간과 다른 종들로부터의 FVIII를 비교함으로써, 기능에 필요할 가능성이 있는 보존된 잔기가 식별되었다(그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; US 6,251,632).
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드는 FVIII 변이체 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 FVIII 변이체 또는 이의 단편은 FVIII 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 전장 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 유전자 카세트는 B 도메인-결실(BDD) FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하고, 여기서 FVIII의 B 도메인의 전부 또는 일부가 결실된다. 일 구체적 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 106, 107, 109, 110, 111, 또는 112와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 107과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 16과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 109과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 유전자 카세트는 신호 펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 유전자 카세트는 신호 펩타이드가 결여된 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 1 내지 19를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 유전자 카세트는 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 국제 출원 번호 PCT/US2017/015879에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 1 내지 14로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 71과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 SEQ ID NO: 19와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
i. FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 전장 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 B 도메인-결실 (BDD) FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하고, 여기서 FVIII의 B 도메인의 전부 또는 일부가 결실된다. 일 구체적 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 17과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 신호 펩타이드가 결여된 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 1 내지 19를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791 또는 (ii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791을 포함한다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791 또는 (ii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791, 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3의 1792번 내지 4374번 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 4의 1792번 내지 4374번 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 4의 1792 내지 4374를 포함한다. 추가의 또 다른 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374 또는 SEQ ID NO: 4의 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374 또는 SEQ ID NO: 4의 1792 내지 4374)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 4의 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 4의 1792 내지 4374)를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일정 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 6의 1792 내지 4374를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 58번 내지 1791번 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 6의 58번 내지 1791번 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 1번 내지 1791번 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 6의 1번 내지 1791번 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374) 또는 (ii) SEQ ID NO: 6의 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일정 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 6의 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 6의 1792 내지 4374)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 58번 내지 1791번 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 6의 58번 내지 1791번 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5의 1번 내지 1791번 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 6의 1번 내지 1791번 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 1791 또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 1791, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 1791, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 1791과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 1791, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 1791, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 1791, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 1791을 포함한다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1 내지 1791 또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1791, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1 내지 1791, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1 내지 1791, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1791, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1 내지 1791, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1 내지 1791을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열에 연결된 제2 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, SEQ ID NO: 2의 1792 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열에 연결된 제2 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374를 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열에 연결된 제2 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374를 포함한다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374를 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, (iii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374, 또는 (iv) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374, 또는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374와 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2와 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 70과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 71과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3과 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 4와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5과 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 58 내지 4374와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 6과 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 58 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 58 내지 4374를 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1 내지 4374) 또는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1 내지 4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 신호 펩타이드는 FVIII 신호 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 일 구체적 구현예에서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (ii) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (iii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (v) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (vi) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (vii) SEQ ID NO: 70의 뉴클레오타이드 1 내지 57; (viii) SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 1 내지 57; 또는 (ix) SEQ ID NO: 68의 뉴클레오타이드 1 내지 57과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
SEQ ID NO: 1 내지 6, 70, 및 71은 SEQ ID NO: 16, 출발 또는 "모" 또는 "야생형" FVIII 뉴클레오타이드 서열의 최적화된 버전이다. SEQ ID NO: 16은 B 도메인-결실 인간 FVIII를 인코딩한다. SEQ ID NO: 1 내지 6, 70, 및 71은 FVIII(SEQ ID NO: 16)의 특이적 B 도메인-결실 형태로부터 유래되지만, 본 개시내용은 또한 FVIII의 다른 버전을 인코딩하는 핵산의 최적화된 버전을 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, FVIII의 다른 버전은 전장 FVIII, FVIII(본원에 기재됨)의 다른 B-도메인 결실, 또는 FVIII 활성을 보유하는 FVIII의 다른 단편을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 유전자 카세트는 표 2A 내지 표 2C에 열거된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열(6526 개의 뉴클레오타이드)을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 카세트는 표 2B에 열거된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열(6526 개의 뉴클레오타이드)을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다.
일정 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 179 또는 182의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 단리된 핵산 분자는 기능적 FVIII 단백질을 발현하는 능력을 보유한다.
[표 2A]
예시적 FVIII 작제물(뉴클레오타이드 1 내지 6526; SEQ ID NO: 110)
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 2B]
예시적 B19-FVIII 작제물(뉴클레오타이드 1 내지 6762; SEQ ID NO: 179)
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 2C]
예시적 GPV-FVIII 작제물(뉴클레오타이드 1 내지 6830; SEQ ID NO: 182)
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
A. 코돈 적응 지수
일 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 SEQ ID NO: 16에 비해 증가된다. 예를 들어, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75 (75%), 적어도 약 0.76 (76%), 적어도 약 0.77 (77%), 적어도 약 0.78 (78%), 적어도 약 0.79 (79%), 적어도 약 0.80 (80%), 적어도 약 0.81 (81%), 적어도 약 0.82 (82%), 적어도 약 0.83 (83%), 적어도 약 0.84 (84%), 적어도 약 0.85 (85%), 적어도 약 0.86 (86%), 적어도 약 0.87 (87%), 적어도 약 0.88 (88%), 적어도 약 0.89 (89%), 적어도 약 0.90 (90%), 적어도 약 0.91 (91%), 적어도 약 0.92 (92%), 적어도 약 0.93 (93%), 적어도 약 0.94 (94%), 적어도 약 0.95 (95%), 적어도 약 0.96 (96%), 적어도 약 0.97 (97%), 적어도 약 0.98 (98%), 또는 적어도 약 0.99 (99%)인 인간 코돈 적응 지수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .91(91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .91(97%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 SEQ ID NO: 16에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75 (75%), 적어도 약 0.76 (76%), 적어도 약 0.77 (77%), 적어도 약 0.78 (78%), 적어도 약 0.79 (79%), 적어도 약 0.80 (80%), 적어도 약 0.81 (81%), 적어도 약 0.82 (82%), 적어도 약 0.83 (83%), 적어도 약 0.84 (84%), 적어도 약 0.85 (85%), 적어도 약 0.86 (86%), 적어도 약 0.87 (87%), 적어도 약 0.88 (88%), 적어도 약 0.89 (89%), 적어도 약 0.90 (90%), 또는 적어도 약 .91 (91%)인 인간 코돈 적응 지수를 가진다. 일 구체적 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .91 (91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 6의 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 SEQ ID NO: 16에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75 (75%), 적어도 약 0.76 (76%), 적어도 약 0.77 (77%), 적어도 약 0.78 (78%), 적어도 약 0.79 (79%), 적어도 약 0.80 (80%), 적어도 약 0.81 (81%), 적어도 약 0.82 (82%), 적어도 약 0.83 (83%), 적어도 약 0.84 (84%), 적어도 약 0.85 (85%), 적어도 약 0.86 (86%), 적어도 약 0.87 (87%), 또는 적어도 약 0.88 (88%)인 인간 코돈 적응 지수를 가진다. 일 구체적 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .83(83%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .88 (88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 SEQ ID NO: 16에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75 (75%), 적어도 약 0.76 (76%), 적어도 약 0.77 (77%), 적어도 약 0.78 (78%), 적어도 약 0.79 (79%), 적어도 약 0.80 (80%), 적어도 약 0.81 (81%), 적어도 약 0.82 (82%), 적어도 약 0.83 (83%), 적어도 약 0.84 (84%), 적어도 약 0.85 (85%), 적어도 약 0.86 (86%), 적어도 약 0.87 (87%), 또는 적어도 약 0.88 (88%)인 인간 코돈 적응 지수를 가진다. 일 구체적 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .75(75%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .83(83%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .88 (88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .91 (91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 .97(97%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 증가된 최적 코돈 빈도(frequency of optimal codon: FOP)를 갖는다. 일정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열의 FOP는 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 64, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 79, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 또는 적어도 약 90이다.
다른 구현예에서, 본 개시내용의 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 증가된 상대 동의 코돈 사용(relative synonymous codon usage: RCSU)을 갖는다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자의 RCSU는 1.5 초과이다. 다른 구현예에서, 단리된 핵산 분자의 RCSU는 2.0 초과이다. 일정 구현예에서, 단리된 핵산 분자의 RCSU는 적어도 약 1.5, 적어도 약 1.6, 적어도 약 1.7, 적어도 약 1.8, 적어도 약 1.9, 적어도 약 2.0, 적어도 약 2.1, 적어도 약 2.2, 적어도 약 2.3, 적어도 약 2.4, 적어도 약 2.5, 적어도 약 2.6, 또는 적어도 약 2.7이다.
추가의 다른 구현예에서, 본 개시내용의 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 감소된 유효 코돈 수(effective number of codon)를 갖는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 약 50 개 미만, 약 45 개 미만, 약 40 개 미만, 약 35 개 미만, 약 30 개 미만, 또는 약 25 개 미만의 유효 코돈 수를 갖는다. 일 구체적 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 약 40 개, 약 35 개, 약 30 개, 약 25 개, 또는 약 20 개의 유효 코돈 수를 갖는다.
B. G/C 함량 최적화
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에서의 G/C 뉴클레오타이드 백분율에 비해 더 높은 G/C 뉴클레오타이드 백분율을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 또는 적어도 약 60%인 G/C 함량을 갖는다.
일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에서의 G/C 뉴클레오타이드 백분율에 비해 더 높은 G/C 뉴클레오타이드 백분율을 함유한다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 또는 적어도 약 58%인 G/C 함량을 포함한다 갖는다. 일 구체적 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 58%인 G/C 함량을 갖는다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (ii) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (iii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374), 또는 (iv) SEQ ID NO: 6의 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에서의 G/C 뉴클레오타이드 백분율에 비해 더 높은 G/C 뉴클레오타이드 백분율을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 또는 적어도 약 57%인 G/C 함량을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 52%인 G/C 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 55%인 G/C 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 57%인 G/C 함량을 갖는다.
다른 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에서의 G/C 뉴클레오타이드 백분율에 비해 더 높은 G/C 뉴클레오타이드 백분율을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%인 G/C 함량을 갖는다. 일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 52%인 G/C 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 55%인 G/C 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 57%인 G/C 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 58%인 G/C 함량을 갖는다. 추가의 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 n 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 60%인 G/C 함량을 갖는다.
"G/C 함량"(또는 구아닌-사이토신 함량), 또는 "G/C 뉴클레오타이드의 비율"은 구아닌 또는 사이토신인 DNA 분자에서 질소성 염기의 백분율을 지칭한다. G/C 함량은 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다:
Figure pct00015
(III)
인간 유전자는 이들의 G/C 함량이 매우 불균일한데, 일부 유전자가 20%만큼 낮은 G/C 함량을 갖고, 다른 유전자는 95%만큼 높은 G/C 함량을 갖는다. 일반적으로, G/C 풍부 유전자는 더 고도로 발현된다. 실제로, 유전자의 G/C 함량을 증가시키면, 주로 전사의 증가 및 더 높은 정상 상태 mRNA 수준으로 인해, 유전자의 발현 증가가 초래될 수 있는 것으로 입증되었다. 문헌[Kudla et al., PLoS Biol., 4(6): e180 (2006)] 참조.
C. 기질 부착 영역-유사 서열
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6 개, 최대 5 개, 최대 4 개, 최대 3 개, 또는 최대 2 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 최대 6 개, 최대 5 개, 최대 4 개, 최대 3 개, 또는 최대 2 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (ii) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (iii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374); 또는 (iv) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6 개, 최대 5 개, 최대 4 개, 최대 3 개, 또는 최대 2 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6 개, 최대 5 개, 최대 4 개, 최대 3 개, 또는 최대 2 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1 개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 자율 복제 서열(ARS) 및 핵-기질 부착 영역(MAR)과 서열 유사성을 공유하는 인간 FVIII 뉴클레오타이드 서열에서 AT-풍부 요소가 식별되었다. (문헌[Fallux et al., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996)]). 이러한 요소들 중 하나는 시험관 내에서 핵 인자를 결합하고, 클로람페니콜 아세틸트란스페라제(CAT) 리포터 유전자의 발현을 억제하는 것으로 입증되었다. 마찬가지로, 이러한 서열은 인간 FVIII 유전자의 전사 억제에 기여할 수 있다는 가설이 세워졌다. 따라서, 일 구현예에서, 모든 MAR/ARS 서열은 본 개시내용의 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열에서 없어진다. 모 FVIII 서열(SEQ ID NO: 16)에는 네 개의 MAR/ARS ATATTT 서열(SEQ ID NO: 21) 및 세 개의 MAR/ARS AAATAT 서열(SEQ ID NO: 22)이 있다. 이들 부위 모두는 최적화된 FVIII 서열(SEQ ID NO: 1 내지 6)에서 MAR/ARS 서열을 파괴하도록 돌연변이되었다. 각각의 이들 요소의 위치, 및 최적화된 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드의 서열은 하기 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
억제 요소에 대한 변화의 요약
Figure pct00016
Figure pct00017
D. 탈안정화 서열
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 유전요소를 함유하지 않는다.
일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 유전요소를 함유하지 않는다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (ii) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (iii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374); 또는 (iv) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 유전요소를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 탈안정화 유전요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 유전요소를 함유하지 않는다.
모 FVIII 서열(SEQ ID NO: 16)에는 10 개의 탈안정화 유전요소가 있다: 6 개의 ATTTA 서열(SEQ ID NO: 23) 및 4 개의 TAAAT 서열(SEQ ID NO: 24). 일 구현예에서, 이들 부위의 서열은 최적화된 FVIII SEQ ID NO: 1 내지 6, 70, 및 71에서 탈안정화 유전요소를 파괴하도록 돌연변이되었다. 이들 각 요소의 위치, 및 최적화된 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드의 서열은 표 3에 나타나 있다.
E. 잠재적 프로모터 결합 부위
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
일 구체적 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (ii) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (iii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374); 또는 (iv) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 또는 최대 5 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
TATA 박스는 진핵세포의 프로모터 영역에서 흔히 발견되는 조절 서열이다. 이들은 TATA 결합 단백질(TBP)의 결합 부위로서 일반적인 전사 인자로 작용한다. TATA 박스는 대개 서열 TATAA(SEQ ID NO: 28) 또는 가까운 변이체를 포함한다. 그러나, 코딩 서열 내 TATA 박스는 전장 단백질의 번역을 저해할 수 있다. 야생형 BDD FVIII 서열(SEQ ID NO: 16)에는 10 개의 잠재적 프로모터 결합 서열이 있다: 5 개의 TATAA 서열(SEQ ID NO: 28) 및 5 개의 TTATA 서열(SEQ ID NO: 29). 일부 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 1 개, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 또는 적어도 4 개가 본 개시내용의 FVIII 유전자에서 없어진다. 일부 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 5 개가 본 개시내용의 FVIII 유전자에서 없어진다. 다른 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 6 개, 적어도 7 개, 또는 적어도 8 개가 본 개시내용의 FVIII 유전자에서 없어진다. 일 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 9 개가 본 개시내용의 FVIII 유전자에서 없어진다. 일 구체적 구현예에서, 모든 프로모터 결합 부위가 본 개시내용의 FVIII 유전자에서 없어진다. 각각의 잠재적 프로모터 결합 부위의 위치, 및 최적화된 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드의 서열은 표 3에 나타나 있다.
F. 그 밖의 시스 작용 음성 조절 요소
MAR/ARS 서열 외에, 탈안정화 유전요소, 및 상술된 잠재적 프로모터 부위, 여러 추가의 잠재적 저해 서열이 야생형 BDD FVIII 서열(SEQ ID NO: 16)에서 식별될 수 있다. 2 개의 AU 풍부 서열 요소(ARE)는 비-최적화된 BDD FVIII 서열에서 폴리-A 부위(AAAAAAA; SEQ ID NO: 26), 폴리-T 부위(TTTTTT; SEQ ID NO: 25), 및 스플라이스 부위(GGTGAT; SEQ ID NO: 27)와 함께 ATTTTATT(SEQ ID NO: 30); 및 ATTTTTAA(SEQ ID NO: 31)에서 식별될 수 있다. 이러한 요소들 중 하나 이상이 최적화된 FVIII 서열로부터 제거될 수 있다. 이들 각 부위의 위치, 및 최적화된 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드의 서열은 표 3에 나타나 있다.
일정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 시스-작용 음성 조절 요소, 예를 들어, 스플라이스 부위, 폴리-T 서열, 폴리-A 서열, ARE 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하지 않는다.
또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (ii) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374; (iii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374); 또는 (iv) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 1792 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 시스-작용 음성 조절 요소, 예를 들어, 스플라이스 부위, 폴리-T 서열, 폴리-A 서열, ARE 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 시스-작용 음성 조절 요소, 예를 들어, 스플라이스 부위, 폴리-T 서열, 폴리-A 서열, ARE 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 스플라이스 부위 GGTGAT(SEQ ID NO: 27)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-T 서열(SEQ ID NO: 25)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-A 서열(SEQ ID NO: 26)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N-말단 부분을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C-말단 부분을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 1791; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 58 내지 1791; 또는 (iv) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1791에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N-말단 부분과 C-말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 ARE 요소(SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31)를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 스플라이스 부위 GGTGAT(SEQ ID NO: 27)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-T 서열(SEQ ID NO: 25)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-A 서열(SEQ ID NO: 26)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 4374 또는 (ii) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58 내지 2277 및 2320 내지 4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70, 또는 71의 뉴클레오타이드 58 내지 4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 ARE 요소(SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31)를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 개시내용의 최적화된 FVIII 서열은 항바이러스 모티프, 스텝-루프 구조, 및 반복 서열 중 하나 이상을 포함하지 않는다.
추가의 다른 구현예에서, 전사 개시 부위 주변의 뉴클레오타이드는 코작 공통 서열(GCCGCCACCATGC(SEQ ID NO: 32), 여기서 밑줄 그어진 뉴클레오타이드는 개시 코돈임)로 변한다. 다른 구현예에서, 제한 부위는 클로닝 과정을 용이하게 하기 위해 추가되거나 제거될 수 있다.
b. FIX, 및 FIX 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 치료적 단백질은 FIX 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 여기서 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편은 FIX 활성을 갖는다.
인간 FIX는 혈액 응고 캐스케이드의 내재적 경로의 중요한 성분인 세린 프로테아제이다. 본원에서 사용된 "인자 IX" 또는 "FIX"는 응고 인자 단백질 및 이의 종 및 서열 변이체를 지칭하며, 인간 FIX 전구체 폴리펩타이드의 461 개 단일-쇄 아미노산 서열("프리프로(prepro)"), 성숙 인간 FIX의 415 개 단일-쇄 아미노산 서열(SEQ ID NO: 125), 및 R338L FIX(파두아) 변이체(SEQ ID NO: 126)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. FIX는 혈액 응고 FIX의 전형적인 특성을 갖는 임의의 형태의 FIX 분자를 포함한다. 본원에서 사용된 "인자 IX" 및 "FIX"는 도메인 Gla(γ-카르복시글루탐산 잔기 함유 영역), EGF1 및 EGF2(인간 상피 성장 인자 상동 서열 함유 영역), 활성화 펩타이드("AP," 성숙 FIX의 잔기 R136-R180에 의해 형성됨), 및 C-말단 프로테아제 도메인("프로"), 또는 당업계에 공지된 이들 도메인의 동의어를 포함하는 폴리펩타이드를 포괄하는 것으로 의도되거나, 절단된 단편 또는 천연 단백질의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 서열 변이체일 수 있다. FIX 또는 서열 변이체는 미국 특허 번호 4,770,999 및 7,700,734에 기재된 바와 같이 클로닝되고, 인간 FIX를 코딩하는 cDNA는 단리되고, 특성 분석되고, 발현 벡터 내에 클로닝된다(예를 들어, 문헌[Choo et al., Nature 299:178-180 (1982); Fair et al., Blood 64:194-204 (1984); and Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982)] 참고). 시미오니 등(Simioni et al, 2009)에 의해 특성 분석된 FIX의 일 구체적 변이체, R338L FIX(파두아) 변이체(SEQ ID NO: 2)는, 천연 FIX 대비 파두아 변이체의 활성에서의 거의 8-배 증가와 상관관계 있는, 기능-획득 돌연변이를 포함한다(표 4). FIX 변이체는 또한, FIX 폴리펩타이드의 FIX 활성에 영향을 미치지 않는, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 FIX 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FIX 변이체는 절단 가능한 링커, 예를 들어, IDELVION®에 의해 융합된 rFIX-알부민을 포함한다. 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 US 7,939,632 참고.
[표 4]
예시적 FIX 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
* 회색 음영 = 신호 펩타이드; 밑줄 = XTEN 서열; 볼드체 = Fc.
** 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 9,856,468의 SEQ ID NO: 67.
FIX 폴리펩타이드는 55 kDa이고, 3 개의 영역으로 구성된 프리프로폴리펩타이드 쇄(SEQ ID NO: 125)로서 합성된다: 28 개 아미노산의 신호 펩타이드(SEQ ID NO: 127의 아미노산 1 내지 28), 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화에 필요한, 18 개 아미노산의 프로펩타이드(아미노산 29 내지 46), 및 415 개 아미노산(SEQ ID NO: 125 또는 126)의 성숙 인자 IX. 프로펩타이드는 감마-카르복시글루타메이트 도메인에 대해 N-말단의 18 개-아미노산 잔기 서열이다. 프로펩타이드는 비타민 K-의존성 감마 카르복실라제에 결합하고, 이후, 내인성 프로테아제, 대개, 푸린 또는 PCSK3으로도 알려진, PACE(쌍 염기성 아미노산 절단 효소)에 의해 FIX의 전구체 폴리펩타이드로부터 절단된다. 감마 카르복실화가 없으면, Gla 도메인은 단백질을 음으로 하전된 인지질 표면에 앵커링하는 데 필요한 올바른 구조를 띠기 위해 칼슘에 결합할 수 없으므로, 인자 IX를 비기능적으로 만든다. 카르복실화되더라도, 보유된 프로펩타이드가 칼슘 및 인지질에 대한 최적의 결합에 필요한 Gla 도메인의 구조 변화를 방해하기 때문에, Gla 도메인은 또한 적절한 기능을 위해 프로펩타이드의 절단에 의존한다. 인간에서, 생성된 성숙 인자 IX는 비활성인 효소원, 중량으로 약 17%의 탄수화물을 함유하는 415 개 아미노산 잔기의 단일 쇄 단백질로서 간세포에 의해 혈류로 분비된다(Schmidt, AE, et al.(2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39).
성숙 FIX는 N-에서 C-말단 배치로 GLA 도메인, EGF1 도메인, EGF2 도메인, 활성화 펩타이드(AP) 도메인, 및 프로테아제(또는 촉매) 도메인인 몇몇 도메인으로 구성된다. 짧은 링커는 EGF2 도메인을 AP 도메인과 연결한다. FIX는 각각 R145-A146 및 R180-V181에 의해 형성된 2 개의 활성화 펩타이드를 함유한다. 활성화 후, 단일-쇄 FIX는 2-쇄 분자가 되며, 여기서 2 개의 쇄는 디설파이드 결합으로 연결된다. 응고 인자는 그들의 활성화 펩타이드를 대체하여 활성화 특이성을 변경시킴으로써 조작될 수 있다. 포유류에서 성숙 FIX는 활성화된 인자 XI에 의해 활성화되어 인자 IXa를 생산해야 한다. 프로테아제 도메인은 FIX의 FIXa로의 활성화 즉시, FIX의 촉매 활성을 제공한다. 활성화된 인자 VIII(FVIIIa)은 FIXa 활성의 완전한 발현을 위한 특이적 보조인자이다.
일정 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 혈장 유래 FIX의 Thr148 대립유전자 형태를 포함하고, 내인성 FIX와 유사한 구조 및 기능적 특징을 갖는다.
많은 기능적 FIX 변이체가 당업계에 공지되어 있다. 국제 공개 번호 WO 02/040544 A3은 4 페이지, 9 내지 30 행 및 15 페이지, 6 내지 31 행에서 헤파린에 의한 저해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 번호 WO 03/020764 A2는 표 2 및 3(14 내지 24 페이지), 및 12 페이지, 1 내지 27 행에서 감소된 T 세포 면역원성을 갖는 FIX 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 번호 WO 2007/149406 A2는 4페이지, 1 행 내지 19 페이지, 11 행에서 증가된 단백질 안정성, 증가된 생체내 및 시험관내 반감기, 및 프로테아제에 대한 증가된 저항성을 나타내는 기능적 돌연변이체 FIX 분자를 개시한다. WO 2007/149406 A2는 또한 19 페이지, 12 행 내지 20 페이지, 9 행에서 키메라 및 다른 변이체 FIX 분자를 개시한다. 국제 공개 번호 WO 08/118507 A2는 5 페이지, 14 행 내지 6 페이지, 5 행에서 증가된 응고 활성을 나타내는 FIX 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 번호 WO 09/051717 A2는 9 페이지, 11 행 내지 20 페이지, 2 행에서 증가된 수의 N-연결된 및/또는 O-결합된 글리코실화 부위를 가져, 증가된 반감기 및/또는 회수율을 초래하는 FIX 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 번호 WO 09/137254 A2는 2 페이지, 단락 [006] 내지 5 페이지, 단락 [011] 및 16 페이지, 단락 [044] 내지 24 페이지, 단락 [057]에서 증가된 수의 글리코실화 부위를 갖는 인자 IX 돌연변이체를 또한 개시한다. 국제 공개 번호 WO 09/130198 A2는 4 페이지, 26 행 내지 12 페이지, 6 행에서 증가된 수의 글리코실화 부위를 가져, 증가된 반감기를 초래하는 기능적 돌연변이체 FIX 분자를 개시한다. 국제 공개 번호 WO 09/140015 A2는 11 페이지, 단락 [0043] 내지 13 페이지, 단락 [0053]에서, 중합체(예를 들어, PEG) 접합에 사용될 수 있는, Cys 잔기 수가 증가된 기능적 FIX 돌연변이체를 개시한다. 2011 년 7 월 11 일 출원되고 2012 년 1 월 12 일에 WO 2012/006624로 공개된 국제 출원 번호 PCT/US2011/043569에 기재된 FIX 폴리펩타이드 또한 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 알부민, 예를 들어, FIX-알부민에 융합된 FIX 폴리펩타이드를 포함한다. 일정 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 IDELVION® 또는 rIX-FP이다.
또한, FIX에서의 수많은 비기능성 돌연변이가 혈우병 대상체에서 식별되었으며, 이 중 다수가 국제 공개 번호 WO 09/137254 A2의 표 6, 11 내지 14 페이지에 개시되어 있다. 이러한 비기능적 돌연변이는 본 발명에 포함되어 있지 않으나, 돌연변이가 전반적으로 기능적 FIX 폴리펩타이드를 초래할 가능성이 있는 것에 대해 추가의 지침을 제공한다.
일 구현예에서, FIX 폴리펩타이드(또는 융합 폴리펩타이드의 인자 IX 부분)는 SEQ ID NO: 1 또는 2(SEQ ID NO: 125 또는 126의 아미노산 1 내지 415)에 제시된 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을, 또는 대안적으로 프로펩타이드 서열과 함께, 또는 프로펩타이드 및 신호 서열과 함께(전장 FIX) 포함한다. 또 다른 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2에 제시된 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
FIX 응고제 활성은 국제 단위(들)(IU)로서 표현된다. FIX 활성 1 IU는 정상 인간 혈장 1 밀리리터 중의 FIX 양에 대략 해당한다. 1 단계 응고 분석(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간, aPTT), 트롬빈 생성 시간(TGA) 및 회전 혈액응괴분석(ROTEM®)을 포함하는, 몇몇 분석이 FIX 활성 측정을 위해 이용 가능하다. 본 발명은 FIX의 생물학적 활성 또는 생물학적 기능의 적어도 일부를 보유하고/하거나 응고 인자-관련 질병, 결핍, 장애 또는 질환(예를 들어, 외상, 수술, 응고 인자 결핍과 관련된 출혈 에피소드)를 예방, 치료, 조정, 또는 개선하기에 유용한 FIX 서열에 상동성을 갖는 서열, 인간, 비인간 영장류, 포유류(가축 포함) 유래와 같은 천연 서열 단편, 및 비천연 서열 변이체를 고려한다. 인간 FIX에 상동성을 갖는 서열은, NCBI BLAST와 같은 표준 상동성 검색 기술에 의해 발견될 수 있다.
일정 구현예에서, FIX 서열은 코돈-최적화된다. 코돈-최적화된 FIX 서열의 예는 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 국제 공개 번호 WO 2016/004113 A1의 SEQ ID NO: 1 및 54 내지 58을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
c. FVII, 및 FVII 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 치료적 단백질은 인자 VII 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, FVII 폴리펩타이드는 FVII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 여기서 이의 변이체 또는 단편은 FVII 활성을 갖는다.
"인자 VII"("FVII" 또는 "F7"; 인자 7, 응고 인자 VII, 혈청 인자 VII, 혈청 프로트롬빈 전환 촉진제, SPCA, 프로콘버틴(proconvertin) 및 엡타코그 알파(eptacog alfa)로도 지칭됨)는 응고 캐스케이드의 일부인 세린 프로테아제이다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 핵산에서 응고 인자는 FVII이다. 재조합 활성화된 인자 VII ("FVII")는 혈우병 A 또는 B, 응고 인자 XI, FVII의 결핍, 혈소판 기능 결손, 혈소판 감소증, 또는 폰 빌레브란트 병을 가진 환자에게서 발생하는 것과 같은 주요한 출혈의 치료에 널리 사용되고 있다.
재조합 활성화된 FVII(rFVIIa; Novoseven®)는 (i) FVIII 또는 FIX(저해제)에 대항하는 중화 항체가 있는 혈우병 환자, (ii) FVII 결핍이 있는 환자, 또는 (iii) 수술 절차가 진행 중인, 저해제가 있는 혈우병 A 또는 B의 환자에서 출혈 에피소드를 치료하기 위해 사용된다. 그러나, Novoseven®는 약한 효능을 나타낸다. 고농도 FVIIa의 반복 투여는 활성화된 혈소판에 대한 이의 낮은 친화성, 짧은 반감기, 및 조직 인자의 부재 하의 효소 활성 불량으로 인한 출혈을 제어하는 데 흔히 필요하다. 이에 따라, FVIII 및 FIX 저해제 및/또는 FVII 결핍이 있는 혈우병 환자를 위한 보다 우수한 치료 및 예방 선택에는 충족되지 않은 의학적 요구가 있다.
일 구현예에서, 유전자 카세트는 성숙 형태의 FVII 또는 이의 변이체를 인코딩한다. FVII는 Gla 도메인, 2 개의 EGF 도메인(EGF-1 및 EGF-2), 및 예를 들어, 키모트립신과 같이, 세린 프로테아제의 펩티다제 S1 패밀리의 모든 일원들 중 고도로 보존된 세린 프로테아제 도메인(또는 펩티다제 S1 도메인)을 포함한다. FVII는 단일 쇄 효소원(즉, 활성화 가능한 FVII) 및 완전 활성화된 2-쇄 형태로 발생된다.
C. 성장 인자
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 치료적 단백질은 성장 인자를 포함한다. 성장 인자는 당업계에 공지된 임의의 성장 인자로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 호르몬이다. 다른 구현예에서, 성장 인자는 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 케모카인이다.
일부 구현예에서, 성장 인자는 아드레노메둘린(AM)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 앙기오포이테인(Ang)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 자가분비 운동성 인자이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 골 형성 단백질(BMP)이다. 일부 구현예에서, BMP는 BMP2, BMP4, BMP5, 및 BMP7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬모 신경영양인자 패밀리 일원이다. 일부 구현예에서, 섬모 신경영양인자 패밀리 일원은 섬모 신경영양인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 인터루킨-6(IL-6)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 집락-자극 인자이다. 일부 구현예에서, 집락-자극 인자는 대식세포 집락-자극 인자(m-CSF), 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 및 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 상피 성장 인자(EGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 에프린이다. 일부 구현예에서, 에프린은 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 및 에프린 B3으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 에리스로포이에틴(EPO)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF)이다. 일부 구현예에서, FGF는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, 및 FGF23으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 소 태아 소마토트로핀(FBS)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 GDNF 패밀리 일원이다. 일부 구현예에서, GDNF 패밀리 일원은 글리알 세포주-유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 페르세핀, 및 아르테민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 성장 분화 인자-9(GDF9)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 간세포 성장 인자(HGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 간세포암-유래 성장 인자(HDGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인슐린이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인슐린-유사 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 인슐린-유사 성장 인자는 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인터루킨(IL)이다. 일부 구현예에서, IL은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 각질세포 성장 인자(KGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 이동-자극 인자(mSF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 대식세포-자극 단백질(MSP 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP))이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 마이오스타틴(GDF-8)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뉴레귤린이다. 일부 구현예에서, 뉴레귤린은 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3, 및 NRG4로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 신경영양성이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 신경 성장 인자(NGF)이다. 일부 구현예에서, NGF는 신경영양-3(NT-3) 또는 NT-4이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 태반 성장 인자(PGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 레날라제(RNLS)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 T-세포 성장 인자(TCGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 트롬보포이에틴(TPO)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 형질전환 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 형질전환 성장 인자는 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α) 또는 TGF-β이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다.
D. 마이크로 RNA(miRNA)
마이크로RNA(miRNA)는 번역을 저해하거나 메신저 RNA(mRNA) 분해를 유발함으로써 유전자 발현을 음성 조절하는 작은 비-코딩 RNA 분자(약 18 개 내지 22 개의 뉴클레오타이드)이다. 이들의 발견 이후, miRNA는 세포자멸, 분화 및 세포 증식을 포함하는 다양한 세포 과정에 연루되었고, 이들은 발암에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 유전자 발현을 조절하는 miRNA의 능력은 생체내 miRNA의 발현을 유전자 요법에서 유용한 도구로 만든다.
본 개시내용의 일정 양태는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 플라스미드-유사 핵산 분자로서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스의 ITR(예를 들어, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-AAV로부터임)인, 플라스미드-유사 핵산 분자에 관한 것이다. miRNA는 당업계에 공지된 임의의 miRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 표적 유전자의 발현을 하향 조절한다. 일정 구현예에서, 표적 유전자는 SOD1, HTT, RHO, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 유전자 카세트는 하나의 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 하나 초과의 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 둘 이상의 상이한 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 동일한 miRNA의 둘 이상의 카피를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 카세트는 동일한 치료적 단백질의 둘 이상의 변이체를 인코딩한다. 일정 구현예에서, 유전자 카세트는 하나 이상의 miRNA 및 하나 이상의 치료적 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, miRNA는 천연 발생 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 조작된 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 인공 miRNA이다. 일정 구현예에서, miRNA는 문헌[Evers et al., Molecular Therapy 26(9):1-15 (epub ahead of print June 2018)]에 개시된 miHTT 조작된 miRNA를 포함한다. 일정 구현예에서, miRNA는 문헌[Dirren et al., Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2):167-84 (February 2015)]에 개시된 miR SOD1 인공 miRNA를 포함한다. 일정 구현예에서, miRNA는 RHO를 표적으로 하는 miR-708을 포함한다(문헌[Behrman et al., JCB 192(6):919-27 (2011)] 참조).
일부 구현예에서, miRNA는 유전자의 저해제의 발현을 하향 조절함으로써 유전자의 발현을 상향 조절한다. 일부 구현예에서, 저해제는 천연, 예를 들어, 야생형 저해제이다. 일부 구현예에서, 저해제는 돌연변이, 이종, 및/또는 오발현 유전자로부터 초래된다.
E. 이종 모이어티
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 치료적 단백질은 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 모이어티는 치료적 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 이종 모이어티는 치료적 단백질 내에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입된다.
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드, 및 FVIII 폴리펩타이드 내에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입되는 이종 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 모이어티는 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 FVIII 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 국제 공개 번호 WO 2013/123457 A1, WO 2015/106052 A1 또는 미국 공개 번호 2015/0158929 A1에 개시된 임의의 부위에서 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩된 응고 인자 폴리펩타이드 내에 삽입될 수 있다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 FVIII 및 이종 모이어티를 포함하고, 여기서 이종 모이어티는 성숙 FVIII에 대한 아미노산 745의 바로 다운스트림으로 FVIII 내에 삽입된다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 FVIII 및 XTEN를 포함하고, 여기서 XTEN은 성숙 FVIII에 대한 아미노산 745의 바로 다운스트림으로 FVIII 내에 삽입된다. 일 구체적 구현예에서, FVIII는 성숙 인간 FVIII(SEQ ID NO:15)에 상응하는 아미노산 746 내지 1646의 결실을 포함하고, 이종 모이어티는 성숙 인간 FVIII(SEQ ID NO:15)에 상응하는 아미노산 745의 바로 다운스트림에 삽입된다.
[표 5]
FVIII 이종 모이어티 삽입 부위
Figure pct00021
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 FIX 폴리펩타이드, 및 FIX 폴리펩타이드 내에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입되는 이종 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 모이어티는 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 국제 출원 번호 PCT/US2017/015879에 개시된 임의의 부위에서 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩된 응고 인자 폴리펩타이드 내에 삽입될 수 있다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 이종 모이어티를 포함하고, 여기서 이종 모이어티는 성숙 FIX에 대한 아미노산 166의 바로 다운스트림으로 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN를 포함하고, 여기서 XTEN은 성숙 FVIII에 대한 아미노산 166의 바로 다운스트림으로 FIX 내에 삽입된다.
[표 6]
FIX 이종 모이어티 삽입 부위
Figure pct00022
다른 구현예에서, 본 개시내용의 치료적 단백질은 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 또는 8 개의 이종 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 이종 모이어티는 동일하다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 다른 이종 모이어티와 상이하다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 또는 7 개 초과의 이종 모이어티를 동시에 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 치료적 단백질의 반감기를 증가시킨다("반감기 연장제"이다).
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 본 개시내용의 단백질에 편입될 때 생체내 반감기의 연장과 관련된 비구조화 또는 구조화 특징을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 비-제한적 예로는 알부민, 알부민 단편, 면역글로불린의 Fc 단편, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩타이드(CTP), HAP 서열, XTEN 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, PAS 폴리펩타이드, 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 알부민-결합 모이어티, 또는 이들 폴리펩타이들의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합이 포함된다. 일 구체적 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분, 트랜스페린, 알부민, 또는 PAS 서열이다. 일부 양태에서, 이종 모이어티는 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 관련 양태에서 이종 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 유전요소의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합과 같은 비-폴리펩타이드 모이어티에 대한 부착 부위(예를 들어, 시스테인 아미노산)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이종 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 요소의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합과 같은 비-폴리펩타이드 모이어티에 대한 부착 부위로서 기능하는 시스테인 아미노산을 포함한다.
일 특정 구현예에서, 제1 이종 모이어티는 당업계에 공지된 반감기 연장 분자이고, 제2 이종 모이어티는 당업계에 공지된 반감기 연장 분자이다. 일정 구현예에서, 제1 이종 모이어티(예를 들어, 제1 Fc 모이어티)와 제2 이종 모이어티(예를 들어, 제2 Fc 모이어티)는 서로 회합되어 이합체를 형성한다. 일 구현예에서, 제2 이종 모이어티는 제2 Fc 모이어티이고, 여기서 제2 Fc 모이어티는 제1 이종 모이어티, 예를 들어, 제1 Fc 모이어티에 연결되거나 이와 회합된다. 예를 들어, 제2 이종 모이어티(예를 들어, 제2 Fc 모이어티)는 링커에 의해 제1 이종 모이어티(예를 들어, 제1 Fc 모이어티)에 연결되거나 공유 또는 비-공유 결합에 의해 제1 이종 모이어티와 회합될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 적어도 약 10 개, 적어도 약 100 개, 적어도 약 200 개, 적어도 약 300 개, 적어도 약 400 개, 적어도 약 500 개, 적어도 약 600 개, 적어도 약 700 개, 적어도 약 800 개, 적어도 약 900 개, 적어도 약 1000 개, 적어도 약 1100 개, 적어도 약 1200 개, 적어도 약 1300 개, 적어도 약 1400 개, 적어도 약 1500 개, 적어도 약 1600 개, 적어도 약 1700 개, 적어도 약 1800 개, 적어도 약 1900 개, 적어도 약 2000 개, 적어도 약 2500 개, 적어도 약 3000 개, 또는 적어도 약 4000 개의 아미노산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩타이드이다. 다른 구현예에서, 이종 모이어티는 약 100 개 내지 약 200 개의 아미노산, 약 200 개 내지 약 300 개의 아미노산, 약 300 개 내지 약 400 개의 아미노산, 약 400 개 내지 약 500 개의 아미노산, 약 500 개 내지 약 600 개의 아미노산, 약 600 개 내지 약 700 개의 아미노산, 약 700 개 내지 약 800 개의 아미노산, 약 800 개 내지 약 900 개의 아미노산, 또는 약 900 개 내지 약 1000 개의 아미노산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩타이드이다.
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 치료적 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 이의 생물학적 활성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 개선한다.
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 본 개시내용의 치료적 단백질의 생체내 및/또는 시험관내 반감기를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 이종 모이어티는 본 개시내용의 치료적 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, FVIII 단백질의 단백질 분해성 절단 이후 이종 모이어티를 포함하는 단편)의 가시화 또는 국소화를 용이하게 한다. 본 개시내용의 치료적 단백질 또는 이의 단편의 가시화 및/또는 국소화는 생체내, 시험관내, 생체외, 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 구현예에서, 이종 모이어티는 본 개시내용의 치료적 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자의 단백질 분해성 절단 이후 이종 모이어티를 포함하는 단편)의 안정성을 증가시킨다. 본원에서 사용된 용어 "안정성"은 환경 조건(예를 들어, 상승 또는 하강된 온도)에 대응한 치료적 단백질의 하나 이상의 물리적 특성의 유지에 대한 당업계-공인된 척도를 지칭한다. 일정 양태에서, 물리적 특성은 치료적 단백질의 공유 결합 구조의 유지(예를 들어, 단백질 분해성 절단, 원하지 않는 산화 또는 탈아미드화의 부재)일 수 있다. 다른 양태에서, 물리적 특성은 치료적 단백질이 적절하게 폴딩된 상태로 존재하는 것(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집체 또는 침전물의 부재)일 수도 있다. 일 양태에서, 치료적 단백질의 안정성은 치료적 단백질의 생물리학적 특성, 예를 들어, 열 안정성, pH 언폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정적 제거, 가용성, 생화학적 기능(예를 들어, 단백질, 수용체 또는 리간드에 결합하는 능력) 등, 및/또는 이들의 조합을 분석함으로써 측정된다. 또 다른 양태에서, 생화학적 기능은 상호 작용의 결합 친화성에 의해 입증된다. 일 양태에서, 단백질 안정성의 척도는 열 안정성, 즉, 열적 도전에 대한 저항성이다. 안정성은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), SEC(크기 배제 크로마토그래피), DLS(동적 광 산란) 등과 같은, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 열 안정성을 측정하는 방법으로는 시차 주사 열량측정(DSC), 시차 주사 형광측정(DSF), 원편광 이색성(CD), 및 열적 도전 분석이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일정 양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 치료적 단백질은 적어도 하나의 반감기 연장제, 즉, 이종 모이어티가 결여된 상응하는 치료적 단백질의 생체내 반감기에 비해, 치료적 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 그러한 이종 모이어티를 포함한다. 치료적 단백질의 생체내 반감기는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 활성 분석(예를 들어, 발색 분석 또는 일 단계 클로팅 aPPT 분석(치료적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 포함)), ELISA, ROTEM® 등에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 반감기 연장제의 존재는 그러한 하나 이상의 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 반감기에 비해 치료적 단백질의 반감기가 증가되는 것을 야기한다. 반감기 연장제를 포함하는 치료적 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 치료적 단백질의 생체내 반감기보다 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 2.5 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 8 배, 적어도 약 9 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 11 배, 또는 적어도 약 12 배 길다.
일 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료적 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 생체내 반감기보다 약 1.5-배 내지 약 20-배, 약 1.5-배 내지 약 15-배, 또는 약 1.5-배 내지 약 10-배 길다. 또 다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료적 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 생체내 반감기에 비해 약 2-배 내지 약 10-배, 약 2-배 내지 약 9-배, 약 2-배 내지 약 8-배, 약 2-배 내지 약 7-배, 약 2-배 내지 약 6-배, 약 2-배 내지 약 5-배, 약 2-배 내지 약 4-배, 약 2-배 내지 약 3-배, 약 2.5-배 내지 약 10-배, 약 2.5-배 내지 약 9-배, 약 2.5-배 내지 약 8-배, 약 2.5-배 내지 약 7-배, 약 2.5-배 내지 약 6-배, 약 2.5-배 내지 약 5-배, 약 2.5-배 내지 약 4-배, 약 2.5-배 내지 약 3-배, 약 3-배 내지 약 10-배, 약 3-배 내지 약 9-배, 약 3-배 내지 약 8-배, 약 3-배 내지 약 7-배, 약 3-배 내지 약 6-배, 약 3-배 내지 약 5-배, 약 3-배 내지 약 4-배, 약 4-배 내지 약 6 배, 약 5-배 내지 약 7-배, 또는 약 6-배 내지 약 8 배 연장된다.
다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료적 단백질의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
추가의 다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료적 단백질의 반감기는 약 15 시간 내지 약 2 주, 약 16 시간 내지 약 1 주, 약 17 시간 내지 약 1 주, 약 18 시간 내지 약 1 주, 약 19 시간 내지 약 1 주, 약 20 시간 내지 약 1 주, 약 21 시간 내지 약 1 주, 약 22 시간 내지 약 1 주, 약 23 시간 내지 약 1 주, 약 24 시간 내지 약 1 주, 약 36 시간 내지 약 1 주, 약 48 시간 내지 약 1 주, 약 60 시간 내지 약 1 주, 약 24 시간 내지 약 6 일, 약 24 시간 내지 약 5 일, 약 24 시간 내지 약 4 일, 약 24 시간 내지 약 3 일, 또는 약 24 시간 내지 약 2일이다.
일부 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료적 단백질의 대상체 당 평균 반감기는 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간(1 일), 약 25 시간, 약 26 시간, 약 27 시간, 약 28 시간, 약 29 시간, 약 30 시간, 약 31 시간, 약 32 시간, 약 33 시간, 약 34 시간, 약 35 시간, 약 36 시간, 약 40 시간, 약 44 시간, 약 48 시간(2 일), 약 54 시간, 약 60 시간, 약 72 시간(3 일), 약 84 시간, 약 96 시간(4 일), 약 108 시간, 약 120 시간(5 일), 약 6 일, 약 7 일(1 주), 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 또는 약 14 일이다.
하나 이상의 반감기 연장제는 치료적 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 융합되거나, 치료적 단백질 내에 삽입될 수 있다.
1. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분
또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 영역)을 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분을 인코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 Fc 영역이다.
면역글로불린 불변 영역은 CH(불변 중쇄) 도메인(CH1, CH2 등)을 나타내는 도메인을 포함한다. 이소타입(즉, IgG, IgM, IgA IgD, 또는 IgE)에 따라, 불변 영역은 3 개 또는 4 개의 CH 도메인으로 구성될 수 있다. 일부 이소타입(예를 들어, IgG) 불변 영역은 또한 힌지 영역을 함유한다. 문헌[Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.] 참조.
본 개시내용의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그) 또는 비-인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 또 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 더욱이, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 이소타입으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 이소타입 IgG1이 사용된다.
다양한 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 액세스 가능한 기탁의 형태로 입수 가능하다. 특정 이펙터 기능을 갖거나(또는 특정 이펙터 기능이 결여되거나) 또는 면역원성을 감소시키는 특정 변형이 있는 불변 영역 도메인 서열이 선택될 수 있다. 항체 및 항체-인코딩 유전자의 많은 서열이 공개되어 있고, 적합한 Ig 불변 영역 서열(예를 들어, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 부분)이 당업계-공인된 기술을 이용하여 이러한 서열들로부터 유래될 수 있다. 임의의 상기 방법들을 이용하여 얻어진 유전 물질은 이후에 본 개시내용의 폴리펩타이드를 얻기 위해 변경되거나 합성될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 범위는 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포괄하는 것이 인지될 것이다.
면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분의 서열은, 예를 들어, 관심 대상의 도메인을 증폭시키도록 선택된 프라이머 및 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분의 서열을 클로닝하기 위해, mRNA는 하이브리도마, 비장, 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, PCR에 의해 항체 유전자가 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 및, 예를 들어, 문헌["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270]에 상세하게 기재되어 있다. PCR은 공통 불변 영역 프라이머에 의해, 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기반으로 하는 보다 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 동종 프로브, 예컨대, 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 많은 프라이머 세트가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 정제된 항체의 N-말단 서열에 기반한 5' 프라이머(Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 말단의 급속 증폭(Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 리더 서열(Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)). 항체 서열의 클로닝은 추가로, 참조로서 본원에 포함되는, 1995년 1월 25일자로 출원된 Newman 등의 미국 특허 번호 5,658,570에 기재되어 있다.
본원에 사용된 면역글로불린 불변 영역은 모든 도메인 및 힌지 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 CH2 도메인, CH3 도메인, 및 힌지 영역, 즉, Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 상응하는 폴리펩타이드의 부분, 즉 이의 2 개의 중쇄의 Fc 도메인 각각의 이합체 회합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 네이티브 Fc 영역은 또 다른 Fc 영역과 동종이합체를 형성한다. 반대로, 본원에 사용된 용어 "유전자 융합된 Fc 영역" 또는 "단일-쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 유전적으로 연결된(즉, 단일 인접한 유전자 서열에서 인코딩된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이합체 Fc 영역을 지칭한다. 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 국제 공개 번호 WO 2012/006635 참조.
일 구현예에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG에서의 216번 잔기, 114번일 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 취함)의 바로 업스트림의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C 말단에서 끝나는 단일 Ig 중쇄의 부분을 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 영역은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 FcRn 결합 파트너일 수 있다. cRn은 성인 상피 조직에서 활성이며, 장의 내강, 폐기도, 비강 표면, 질 표면, 결장 및 직장 표면에서 발현된다(미국 특허 번호 6,485,726). FcRn 결합 파트너는 FcRn에 결합하는 면역글로불린의 일부이다.
FcRn 수용체는 인간을 포함한 여러 포유류 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 래트 FcRn, 및 마우스 FcRn의 서열은 공지되어 있다(문헌[Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377]). FcRn 수용체는 비교적 낮은 pH에서 IgG(다른 면역글로불린 부류, 예컨대, IgA, IgM, IgD, 및 IgE는 아님)를 결합하고, IgG를 세포투과로 내강에서 장막 방향으로 활발히 운반한 후, 간질액에서 확인되는 비교적 더 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이는 폐 및 장 상피(Israel et al. 1997, Immunology 92:69) 신장 근위 관상피(Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), 뿐만 아니라 비강 상피, 질 표면, 및 담도 표면을 포함하는 성인 상피 조직에서 발현된다(미국 특허 번호 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
본 개시내용에 유용한 FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 다른 단편을 포함하는 FcRn 수용체의 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포괄한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X-선 결정학에 기반하여 기술되었다(문헌[Burmeister et al. 1994, Nature 372:379]). FcRn과 Fc의 주요 접촉 영역은 CH2 도메인과 및 CH3 도메인의 연결부 근처에 있다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함한다. 주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250 내지 257, 272, 285, 288, 290 내지 291, 308 내지 311, 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385 내지 387, 428, 및 433 내지 436을 포함한다. 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대한 언급은 모두 문헌[Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md]에 기초한다.
FcRn에 결합된 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 상피 장벽을 가로 질러 효과적으로 왕복됨으로써, 요망되는 치료적 분자를 전신 투여하기 위한 비-침습적 수단을 제공할 수 있다. 추가로, Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 융합 단백질은 FcRn을 발현하는 세포에 의해 흡수된다(endocytose). 그러나, 분해로 표시되는 대신에, 이들 융합 단백질은 다시 순환으로 재순환되어 이러한 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다. 일정 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역의 일부는, 전형적으로 디설파이드 결합 및 다른 비-특이적 상호작용을 통해 또 다른 Fc 영역 또는 또 다른 FcRn 결합 파트너와 회합하여 이합체 및 더 고차원의 다합체를 형성시키는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너이다.
2 개의 FcRn 수용체가 단일 Fc 분자를 결합할 수 있다. 결정학적 데이터는 각각의 FcRn 분자가 Fc 동종이합체의 단일 폴리펩타이드를 결합한다는 것을 시사한다. 일 구현예에서, FcRn 결합 파트너, 예를 들어, IgG의 Fc 단편을 생물학적 활성 분자에 연결하는 것은 경구로, 구강으로, 설하로, 직장으로, 질로, 비강으로 투여되는 에어로졸로서 또는 폐 경로를 통해, 또는 안구 경로를 통해 생물학적 활성 분자를 전달하는 수단을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 단백질은 침습적으로, 예를 들어, 피하로, 정맥내로 투여될 수 있다.
FcRn 결합 파트너 영역은 Fc 영역의 FcRn 수용체에 의한 일관된 능동 수송으로 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 또는 이의 부분이다. 특이적으로 결합되는 것은 생리학적 조건 하에 비교적 안정한 복합체를 형성시키는 2 개의 분자를 지칭한다. 특이적 결합은 대개 중간 수준 내지 높은 수준의 커패시티와 낮은 친화성을 갖는 비특이적 결합과는 구별되는 높은 친화성, 및 낮은 수준 내지 중간 수준의 커패시티로 특성 분석된다. 전형적으로, 결합은 친화성 상수(KA)가 106 M-1 초과, 또는 108 M-1 초과일 때 특이적인 것으로 여겨진다. 필요한 경우, 비-특이적 결합은 결합 조건을 달리함으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 감소될 수 있다. 적절한 결합 조건, 예컨대, 분자의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용되는 시간, 차단제(예를 들어, 혈청 알부민, 밀크 카제인)의 농도 등은 통상적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
일정 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 치료적 단백질은 절단된 Fc 영역이지만 Fc 영역에 Fc 수용체(FcR) 결합 특성을 부여하기에 충분한 Fc 영역을 하나 이상 포함한다. 예를 들어, FcRn에 결합하는 Fc 영역의 부분(즉, FcRn 결합 부분)은 EU 넘버링으로 IgG1의 대략 아미노산 282 내지 438를 포함한다(일차 접촉 부위가 CH2 도메인의 아미노산 248, 250 내지 257, 272, 285, 288, 290 내지 291, 308 내지 311, 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385 내지 387, 428, 및 433 내지 436임). 따라서, 본 개시내용의 Fc 영역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 이소타입 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 또 다른 구현예에서, 인간 이소타입 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다.
Fc 영역은 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드의 Fc 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, Fc 모이어티는, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그) 또는 비-인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 또 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 더욱이, Fc 도메인 또는 이의 부분의 폴리펩타이드는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 이소타입으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 이소타입 IgG1이 사용된다.
일정 구현예에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 모이어티에 의해 제공되는 적어도 하나의 이펙터 기능에 변화를 준다(예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q)에 결합하거나, 항체-의존 세포독성(ADCC), 식세포작용, 또는 보체-의존 세포독성(CDCC)을 촉발시키는 Fc 영역의 능력 향상 또는 감소). 다른 구현예에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 개시내용의 Fc 영역은 이펙터 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합에 변화(예를 들어, 향상 또는 감소)를 주는 것으로 알려진, 당업계에 공인된 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 Fc 영역은, 예를 들어, 각각 참조로서 본원에 포함되는, 국제 PCT 공개 번호 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2; 미국 특허 공개 번호 US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; 또는 미국 특허 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, 및 7,317,091에 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서의 변화(예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 특정 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정 치환)는 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 상이한 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.
IgG의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 결합될 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 이의 부분을 수득하기 위해 부위 지정 돌연변이유발(site directed mutagenesis) 등과 같은 널리 공인된 절차에 따라 변형될 수 있다. 이러한 변형은, FcRn에 대한 결합을 보존하거나 심지어 증진시키는, FcRn 접촉 부위 외의 변형뿐만 아니라 접촉 부위 내의 변형을 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1 Fc(Fc γ1)에서 다음 단일 아미노산 잔기가 FcRn에 대한 Fc 결합 친화성의 유의한 손실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, 및 K447A(여기서, 예를 들어, P238A는 위치 238 번에서 알라닌에 의해 치환된 야생형 프롤린을 나타냄). 예로서, 특정 구현예는 고도 보존된 N-글리코실화 부위를 제거하는 N297A 돌연변이를 편입한다. 알라닌 외에 다른 아미노산이 상기 명시된 위치에서 야생형 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 돌연변이는 Fc로 하나씩 도입되어 천연 Fc와 별개인 Fc 영역을 100 개 초과로 만들 수 있다. 추가로, 이들 개별 돌연변이의 둘, 셋, 또는 그 초과의 조합이 함께 도입되어 Fc 영역을 수백 개 넘게 만들 수 있다.
상기 돌연변이 중 어떤 것은 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너에 새로운 기능을 줄 수 있다. 예를 들어, 일 구현예는 고도 보존된 N-글리코실화 부위를 제거하는 N297A를 편입한다. 이러한 돌연변이의 효과는, FcRn에 대한 친화성을 저해하지 않으면서, 면역원성을 감소시키고, 이에 의해 Fc 영역의 순환 반감기를 향상시키고, Fc 영역을 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 만드는 것이다(문헌[Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591]). 상술된 돌연변이로부터 야기되는 새로운 기능의 추가 예로서, FcRn에 대한 친화성은 일부 경우에 야생형의 친화성을 능가하여 증가될 수 있다. 이러한 증가된 친화성은 증가된 "온" 레이트, 감소된 "오프" 레이트, 또는 증가된 "온" 레이트와 감소된 "오프" 레이트 둘 모두를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 증가된 친화성을 제공하는 것으로 여겨지는 돌연변이의 예는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌[Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591]).
추가로, 적어도 세 개의 인간 Fc 감마 수용체는 하위 힌지 영역, 일반적으로 아미노산 234 내지 237 내에서 IgG에 대한 결합 부위를 인식하는 것으로 보인다. 따라서, 신규한 기능 및 잠재적으로 감소되는 면역원성의 또 다른 예는 이러한 영역의 돌연변이로부터, 예로서, 인간 IgG1 "ELLG"(SEQ ID NO: 45)의 아미노산 233 내지 236을 IgG2 "PVA"로부터 상응하는 서열로 대체함으로써(하나의 아미노산 결실) 야기될 수 있다. 다양한 이펙터 기능을 매개하는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII는 그러한 돌연변이가 도입되지 않는 경우에 IgG1에 결합하지 않을 것으로 나타났다. 문헌[Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613].
또 다른 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분과 하나 이상의 디설파이드 결합을 형성시키는 힌지 영역 또는 이의 부분에서 아미노산 서열을 포함한다. 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 제2 폴리펩타이드에 연결되어 치료적 단백질 및 제2 폴리펩타이드를 함께 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 인핸서 모이어티이다. 본원에 사용된 용어 "인핸서 모이어티"는 치료적 단백질의 활성을 향상시킬 수 있는 폴리펩타이드의 분자, 이의 단편 또는 구성요소를 지칭한다. 인핸서 모이어티는 보조인자일 수 있는데, 예컨대, 치료적 단백질은 응고 인자, 가용성 조직 인자(sTF), 또는 응고촉진 펩타이드이다. 따라서, 응고 인자의 활성화 시, 응고 인자 활성을 향상시키기 위해 인핸서 모이어티가 이용 가능하다.
일정 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 치료적 단백질은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 변이체)에 대한 아미노산 치환을 포함하는데, 이는 Ig 불변 영역의 항원-독립성 이펙터 기능, 특히, 단백질의 순환 반감기를 변경한다.
2. scFc 영역
또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 scFc(단일 쇄 Fc) 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자는 scFc 영역을 인코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함한다. scFc 영역은 Fc 펩타이드 링커에 의해 연결된 하나의 기능적 scFc 영역을 형성시키기 위해 폴딩(예를 들어, 분자내 또는 분자간 폴딩)할 수 있는 동일한 선형 폴리펩타이드 쇄 내에 적어도 2 개의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 모이어티 또는 도메인(예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 또는 그 초과의 Fc 모이어티 또는 도메인))을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 반감기를 향상시키거나 면역 이펙터 기능(예를 들어, 항체-의존 세포독성(ADCC), 식세포작용, 또는 보체-의존 세포독성(CDCC)을 촉발시키고/시키거나 생산성을 향상시키기 위해, 이의 scFc 영역을 통해, 적어도 하나의 Fc 수용체(예를 들어, FcRn, FcγR 수용체(예를 들어, FcγRIII), 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q))에 결합할 수 있다.
3. CTP
또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 하나의 C-말단 펩타이드(CTP) 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 재조합 단백질 내로 삽입되는 하나 이상의 CTP 펩타이드는 그 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 미국 특허 번호 5,712,122 참고.
예시적인 CTP 펩타이드는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO: 33) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO: 34)를 포함한다. 예를 들어, 참조로서 포함되는, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2009/0087411 A1 참고.
4. XTEN 서열
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 하나 이상의 XTEN 서열, 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 “XTEN 서열”은 생리학적 조건 하에서 서열이 2 차 또는 3 차 구조를 낮은 정도로 갖는 또는 갖지 않는, 작은 친수성 아미노산으로 주로 구성되는 비천연적으로 발생하고, 실질적으로 비반복적인 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이종 모이어티로서, XTEN은 반감기 연장 모이어티로서 작용할 수 있다. 또한, XTEN은 향상된 약동학적 매개변수 및 가용성 특징을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 요망되는 특성들을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 단백질로의, XTEN 서열을 포함하는 이종 모이어티의 편입은 단백질에 다음 유리한 특성들 중 하나 이상을 제공할 수 있다: 입체형태해석 융통성, 향상된 수용성, 고도의 프로테아제 저항성, 낮은 면역원성, 포유류 수용체로의 낮은 결합성, 또는 증가된 수력학적(또는 스토크스(Stokes)) 반경.
일정 양태에서, XTEN 서열은, 본 개시내용의 단백질이 생체내에서 지속되고, 동일하지만 XTEN 이종 모이어티가 없는 단백질에 비해 증가된 기간 동안 응고촉진 활성을 갖도록, 생체내 반감기 연장 또는 곡선하면적(AUC) 증가와 같은 약동학적 특성을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 유용한 XTEN 서열은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000 개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 일정 구현예에서, XTEN은 약 20 내지 약 3000 개 초과의 아미노산 잔기, 30 내지 약 2500 개 초과의 잔기, 40 내지 약 2000 개 초과의 잔기, 50 내지 약 1500 개 초과의 잔기, 60 내지 약 1000 개 초과의 잔기, 70 내지 약 900 개 초과의 잔기, 80 내지 약 800 개 초과의 잔기, 90 내지 약 700 개 초과의 잔기, 100 내지 약 600 개 초과의 잔기, 110 내지 약 500 개 초과의 잔기, 또는 120 내지 약 400 개 초과의 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 일 구체적 구현예에서, XTEN은 길이가 42 개 아미노산보다 길고 144 개 아미노산보다 짧은 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 XTEN 서열은 5 내지 14 개(예를 들어, 9 내지 14 개)의 아미노산 잔기의 하나 이상의 서열 모티프 또는 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트€ 및 프롤린(P)으로 구성된 군으로부터 선택되는 4 내지 6 종의 아미노산(예를 들어, 5 개 아미노산)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. US 2010-0239554 A1 참고.
일부 구현예에서, XTEN은 서열의 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 또는 약 100%가 표 7에서 선택되는 단일 모티프 패밀리로부터 선택되는 비중첩 서열의 다중 단위로 구성되어, 패밀리 서열을 초래하는 비중첩 서열 모티프를 포함한다. 본원에서 사용된 “패밀리”는 XTEN이 표 7의 단일 모티프 카테고리; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN,에서만 선택되는 모티프를 가짐, 및 패밀리 모티프 유래가 아닌 XTEN 내 임의의 다른 아미노산은, 인코딩 뉴클레오타이드에 의한 제한 부위 편입, 절단 서열 편입을 가능하게 하는 것과 같은, 필요한 특성을 달성하기 위해, 또는 치료적 단백질에 대한 더욱 양호한 링키지를 달성하기 위해 선택됨을 의미한다. XTEN 패밀리의 일부 구현예에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리, 또는 AE 모티프 패밀리, 또는 AF 모티프 패밀리, 또는 AG 모티프 패밀리, 또는 AM 모티프 패밀리, 또는 AQ 모티프 패밀리, 또는 BC 패밀리, 또는 BD 패밀리의 비중첩 서열 모티프의 다중 단위를 포함하여, 생성된 XTEN은 상기 기재된 상동성 범위를 나타낸다. 다른 구현예에서, XTEN은 표 7의 모티프 패밀리 중 2 개 이상 유래 모티프 서열의 다중 단위를 포함한다. 이들 서열은 하기에 더욱 상세히 기재되는, 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여되는 순전하, 친수성, 2 차 구조의 부재, 또는 반복성의 부재와 같은 특성을 포함하는, 원하는 물리적/화학적 특성을 달성하기 위해 선택될 수 있다. 본 단락에서 기재된 상기본원의 구현예에서, XTEN 내로 편입된 모티프는 약 36 내지 약 3000 개 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하여 선택 및 조립될 수 있다.
[표 7]
12 개의 아미노산의 XTEN 서열 모티프 및 모티프 패밀리
Figure pct00023
Figure pct00024
*는 다양한 순열로 함께 사용될 때 "패밀리 서열"을 생성시키는 개별 모티프 서열을 나타냄
본 개시내용의 치료적 단백질에서 이종 모이어티로서 사용될 수 있는 XTEN 서열의 예는, 예를 들어, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 미국 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, 또는 WO 2011028344 A2에 개시되어 있다.
XTEN은 치료적 단백질 내로의 삽입 또는 치료적 단백질에 대한 링키지를 위해 다양한 길이를 가질 수 있다. 일 구현예에서, XTEN 서열(들)의 길이는 융합 단백질에서 달성될 특성 또는 기능에 기반하여 선택된다. 의도된 특성 또는 기능에 따라, XTEN은 담체로서 역할을 할 수 있는 짧은 또는 중간 길이 서열 또는 더 긴 서열일 수 있다. 일정 구현예에서, XTEN은 약 6 내지 약 99 개 아미노산 잔기의 짧은 절편, 약 100 내지 약 399 개 아미노산 잔기의 중간 길이, 및 약 400 내지 약 1000 개 및 약 3000 개까지의 아미노산 잔기의 더 긴 길이를 포함한다. 따라서, 치료적 단백질 내로 삽입되거나 이에 연결된 XTEN은 약 6, 약 12, 약 36, 약 40, 약 42, 약 72, 약 96, 약 144, 약 288, 약 400, 약 500, 약 576, 약 600, 약 700, 약 800, 약 864, 약 900, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500 개, 또는 약 3000 개까지의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, XTEN 서열은 약 6 내지 약 50 개, 약 50 내지 약 100 개, 약 100 내지 150 개, 약 150 내지 250 개, 약 250 내지 400 개, 약 400 내지 약 500 개, 약 500 내지 약 900 개, 약 900 내지 약 1500 개, 약 1500 내지 2000 개, 또는 약 2000 내지 약 3000 개 아미노산 잔기 길이이다. 치료적 단백질 내로 삽입되거나 이에 연결된 XTEN의 정확한 길이는 치료적 단백질의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않고 다양할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 사용된 XTEN 중 하나 이상은 42 개 아미노산, 72 개 아미노산, 144 개 아미노산, 288 개 아미노산, 576 개 아미노산, 또는 864 개 아미노산 길이를 가지며 XTEN 패밀리 서열; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC 또는 BD 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 288 개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 치료적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 288 개의 아미노산을 포함하고, XTEN은 FVIII 폴리펩타이드의 B 도메인 내에 삽입된다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 SEQ ID NO:109를 포함하는 FVIII 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, XTEN은 FVIII 폴리펩타이드의 B 도메인 내에 삽입된다. 일 구체적 구현예에서, 치료적 단백질은 SEQ ID NO:109를 포함하는 FVIII 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, XTEN은 성숙 FVIII의 아미노산 745의 바로 다운스트림으로 FVIII 폴리펩타이드 내에 삽입된다.
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 72 개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 치료적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 72 개의 아미노산을 포함하고, XTEN은 성숙 FIX의 아미노산 166의 바로 다운스트림으로 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 사용된 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. US 2010-0239554 A1 참고. 일 구체적 구현예에서, XTEN은 AE42, AE72, AE144, AE288, AE576, AE864, AG42, AG72, AG144, AG288, AG576, AG864, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 치료적 단백질에서 이종 모이어티로서 사용될 수 있는 예시적인 XTEN 서열은 XTEN AE42-4(SEQ ID NO: 47에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 46), XTEN AE144-2A(SEQ ID NO: 49에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 48), XTEN AE144-3B(SEQ ID NO: 51에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 50), XTEN AE144-4A(SEQ ID NO: 53에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 52), XTEN AE144-5A(SEQ ID NO: 55에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 54), XTEN AE144-6B(SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57에 의해 인코딩), XTEN AG144-1(SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59에 의해 인코딩), XTEN AG144-A(SEQ ID NO: 61에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 60), XTEN AG144-B(SEQ ID NO: 63에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 62), XTEN AG144-C(SEQ ID NO: 65에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 64), 및 XTEN AG144-F(SEQ ID NO: 67에 의해 인코딩된 SEQ ID NO: 66)를 포함한다. 일 구체적 구현예에서, XTEN은 SEQ ID NO: 18에 의해 인코딩된다.
또 다른 구현예에서, XTEN 서열은 AE36(SEQ ID NO: 130), AE42(SEQ ID NO: 131), AE72(SEQ ID NO: 132), AE78(SEQ ID NO: 133), AE144(SEQ ID NO: 134), AE144_2A(SEQ ID NO: 48), AE144_3B(SEQ ID NO: 50), AE144_4A(SEQ ID NO: 52), AE144_5A(SEQ ID NO: 54), AE144_6B(SEQ ID NO: 135), AG144(SEQ ID NO: 136), AG144_A(SEQ ID NO: 137), AG144_B(SEQ ID NO: 62), AG144_C(SEQ ID NO: 64), AG144_F(SEQ ID NO: 66), AE288(SEQ ID NO: 138), AE288_2(SEQ ID NO: 139), AG288(SEQ ID NO: 140), AE576(SEQ ID NO: 141), AG576(SEQ ID NO: 142), AE864(SEQ ID NO: 143), AG864(SEQ ID NO: 144), XTEN_AE72_2A_1(SEQ ID NO:145), XTEN_AE72_2A_2(SEQ ID NO: 146), XTEN_AE72_3B_1(SEQ ID NO: 147), XTEN_AE72_3B_2(SEQ ID NO: 148), XTEN_AE72_4A_2(SEQ ID NO: 149), XTEN_AE72_5A_2(SEQ ID NO: 150), XTEN_AE72_6B_1(SEQ ID NO: 151), XTEN_AE72_6B_2(SEQ ID NO: 152), XTEN_AE72_1A_1(SEQ ID NO: 153), XTEN_AE72_1A_2(SEQ ID NO: 154), XTEN_AE144_1A(SEQ ID NO: 155), AE150(SEQ ID NO: 156), AG150(SEQ ID NO: 157), AE294(SEQ ID NO: 158), AG294(SEQ ID NO: 159), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, XTEN 서열은 AE72, AE144, 및 AE288로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일정 XTEN 서열에 대한 아미노산 서열은 표 8에 나타나있다.
[표 8]
XTEN 서열
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
일부 구현예에서, XTEN의 아미노산의 100% 미만은 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택되거나, 서열의 100% 미만은 표 7의 서열 모티프, 또는 본원에 제공된 XTEN 서열로 구성된다. 이러한 구현예에서, XTEN의 나머지 아미노산 잔기는 다른 14 개의 천연 L-아미노산 중 임의의 것으로부터 선택되나, 친수성 아미노산으로부터 우선적으로 선택되어 XTEN 서열은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유할 수 있다. 접합 작제물에 이용되는 XTEN에서 소수성 아미노산의 함량은 5% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만의 소수성 아미노산 함량일 수 있다. XTEN의 구성에서 덜 선호되는 소수성 잔기로는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 류신, 이소류신, 발린, 및 메티오닌이 포함된다. 추가적으로, XTEN 서열은 다음 아미노산을 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만 함유 또는 함유하지 않을 수 있다: 메티오닌(예를 들어, 산화를 피하기 위해), 또는 아스파라긴 및 글루타민(데스아미데이션(desamidation)을 피하기 위해).
하나 이상의 XTEN 서열은 치료적 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 삽입되거나 치료적 단백질의 아미노산 서열에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 치료적 단백질이 FVIII 폴리펩타이드를 포함하는 경우, XTEN은 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 치료적 단백질이 FIX 폴리펩타이드를 포함하는 경우, XTEN은 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 XTEN 서열의 추가의 예는 미국 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, WO 2014/011819 A2, 또는 WO 2015/023891에 개시되어 있다.
5. 알부민 또는 단편, 유도체, 또는 이의 변이체
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 알부민 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 전장 형태에서 609 개의 아미노산으로 구성된 단백질로서, 혈청의 삼투압의 상당 부분의 원인이고 또한 내인성 및 외인성 리간드의 담체로서도 기능한다. 본원에서 사용된 용어 "알부민"은 전장 알부민 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체, 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체의 예는 미국 특허 공개 번호 2008/0194481 A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, 또는 2008/0153751 A1 또는 PCT 출원 공개 번호 2008/033413 A2, 2009/058322 A1, 또는 2007/021494 A2에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 치료적 단백질은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 영역), PAS 서열, HES, PEG 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 제2 이종 모이어티에 추가로 연결된 알부민, 이의 단편, 또는 변이체를 포함한다.
6. 알부민-결합 모이어티
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 알부민-결합 펩타이드, 박테리아 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 항체 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 알부민-결합 모이어티이다.
예를 들어, 알부민-결합 단백질은 박테리아 알부민-결합 단백질, 항체, 또는 도메인 항체를 포함하는 항체 단편일 수 있다(미국 특허 번호 6,696,245 참조). 예를 들어, 알부민-결합 단백질은 박테리아 알부민-결합 도메인, 예컨대, 스트렙토코커스 단백질 G 중 하나일 수 있다(문헌[Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83]). 접합 파트너로서 사용될 수 있는 알부민-결합 펩타이드의 다른 예는, 예를 들어, 미국 특허 출원 2003/0069395 또는 Dennis 등의 문헌[Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043]에 기재된 바와 같은 Cys-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Cys 공통 서열을 갖는 것들이고, 여기서 Xaa 1은 Asp, Asn, Ser, Thr, 또는 Trp이고; Xaa 2는 Asn, Gln, H is, Ile, Leu, 또는 Lys이고; Xaa 3은 Ala, Asp, Phe, Trp, 또는 Tyr이고; Xaa 4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 또는 Thr이다.
문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) 및 Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 스트렙토코커스 단백질 G 유래 도메인 3은 박테리아 알부민-결합 도메인의 예이다. 알부민-결합 펩타이드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW(SEQ ID NO: 35)를 갖는 일련의 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)] 참고. 알부민-결합 항체 단편의 예는, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된, 문헌[Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), 및 Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)]에 개시되어 있다. 그러한 알부민-결합 모이어티의 예는 문헌[Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 의해 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-아이오도페닐)부탄아미도) 헥사노에이트("Albu" 태그)이다.
지방산, 특히, 장쇄 지방산(long chain fatty acid: LCFA) 및 장쇄 지방산-유사 알부민 결합 화합물은 본 개시내용의 응고 인자 단백질의 생체내 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있다. LCFA-유사 알부민-결합 화합물의 예는 16-(l-(3-(9-(((2,5-디옥소피롤리딘-l-일옥시) 카보닐옥시)-메틸)-7-설포-9H-플루오렌-2-일아미노)-3-옥소프로필)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일티오) 헥산데칸산이다(예를 들어, WO 2010/140148 참조).
7. PAS 서열
다른 구현예에서, 이종 모이어티는 PAS 서열이다. 본원에서 사용된 "PAS 서열"은 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나 주로 알라닌, 세린, 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 의미하며, 아미노산 서열은 생리학적 조건 하에서 랜덤 코일 구조를 형성한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 단백질에서 이종 모이어티의 일부로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린, 및 프롤린을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 기초 단위, 아미노산 중합체, 또는 서열 카세트이다. 그러나 당업자는 아미노산 중합체는 또한 알라닌, 세린, 및 프롤린 외의 잔기가 PAS 서열 내 소수 구성 성분으로서 첨가될 때 랜덤 코일 구조를 형성할 수 있음을 알고 있다. 본원에 사용된 용어 "소수 성분"은 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 아미노산이 특정 정도, 예를 들어, 약 12%까지, 즉, PAS 서열의 100 개의 아미노산 중 약 12 개, 약 10%까지, 즉, PAS 서열의 100 개의 아미노산 중 약 10 개, 약 9%까지, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 9 개, 약 8%까지, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 8 개, 약 6%, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 6 개, 약 5%, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 5 개, 약 4%, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 4 개, 약 3%, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 3 개, 약 2%, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 2 개, 약 1%, 즉, 100 개의 아미노산 중 약 1 개로 PAS 서열에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
생리학적 조건 하에서, PAS 서열 연장은 랜덤 코일 구조를 형성하고, 이에 의해 응고 인자 단백질에 생체내 및/또는 시험관내 안정성의 증가를 매개할 수 있다. 랜덤 코일 도메인은 그 자체로 안정한 구조 또는 기능을 채택하지 않기 때문에, 응고 인자 단백질에 의해 매개된 생물학적 활성은 본질적으로 보존된다. 다른 구현예에서, 랜덤 코일 도메인을 형성하는 PAS 서열은 특히 혈장에서 단백질 분해, 면역원성, 등전점/정전 거동, 세포 표면 수용체에 대한 결합 또는 내재화와 관련하여 생물학적으로 불활성이지만, 여전히 생분해 가능하며, 이는 PEG와 같은 합성 중합체에 비해 분명한 이점을 제공한다.
랜덤 코일 구조를 형성하는 PAS 서열의 비-제한적 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO: 36), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO: 37), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO: 38), APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO: 39), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO: 40), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO: 41), ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO: 42) 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. PAS 서열의 추가의 예는, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2010/0292130 A1 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2008/155134 A1로부터 알려져 있다.
8. HAP 서열
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 글리신-풍부 호모-아미노산 중합체(glycine-rich homo-amino-acid polymer: HAP)이다. HAP 서열은 적어도 50 개의 아미노산, 적어도 100 개의 아미노산, 120 개의 아미노산, 140 개의 아미노산, 160 개의 아미노산, 180 개의 아미노산, 200 개의 아미노산, 250 개의 아미노산, 300 개의 아미노산, 350 개의 아미노산, 400 개의 아미노산, 450 개의 아미노산, 또는 500 개의 아미노산 길이를 갖는, 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 일 구현예에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40이다. 또 다른 구현예에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200이다.
9. 트랜스페린 또는 이의 단편
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 트랜스페린 또는 이의 단편이다. 임의의 트랜스페린이 본 개시내용의 응고 인자 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 야생형 인간 TF(TF)는 유전자 중복으로부터 생긴 것으로 보이는 2 개의 주요 도메인 N(약 330 개의 아미노산) 및 C(약 340 개의 아미노산)를 갖는 대략 75 KDa(글리코실화는 고려하지 않음)의 679 개의 아미노산 단백질이다. 그 전체가 모두 참조로서 본원에 포함되는 Genbank 수탁 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/) 참조. 트랜스페린은 2 개의 도메인, 즉, N 도메인 및 C 도메인을 포함한다. N 도메인은 2 개의 서브도메인, 즉, N1 도메인 및 N2 도메인을 포함하고, C 도메인은 2 개의 서브도메인, 즉, C1 도메인 및 C2 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 트랜스페린 이종 모이어티는 트랜스페린 스플라이스 변이체를 포함한다. 일례에서, 트랜스페린 스플라이스 변이체는 인간 트랜스페린의 스플라이스 변이체, 예를 들어, Genbank 수탁 AAA61140일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키메라 단백질의 트랜스페린 부분은 트랜스페린 서열의 하나 이상의 도메인, 예를 들어, N 도메인, C 도메인, N1 도메인, N2 도메인, C1 도메인, C2 도메인 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
10. 간극 수용체
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 간극 수용체, 이의 단편, 변이체, 또는 유도체이다. LRP1은 다양한 단백질, 예컨대, 인자 X의 수용체-매개 간극에 연루되는 600 kDa 막관통 단백질이다(예를 들어, 문헌[Narita et al., Blood 91:555-560 (1998)] 참조).
11. 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 단편
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 폰 빌레브란트 인자(VWF) 또는 이의 하나 이상의 단편이다.
VWF(F8VWF로도 알려짐)는, 혈장에 존재하고, 내피(바이벨-펠라드 소체(Weibel-Palade body)에서), 거핵세포(혈소판의 α-과립), 및 내피하 결합 조직에서 구성적으로 생산되는 큰 다합체 당단백질이다. 기본 VWF 단량체는 2813 개의 아미노산 단백질이다. 모든 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, 즉, D' 및 D3 도메인(인자 VIII에 함께 결합), A1 도메인(혈소판 GPIb-수용체, 헤파린, 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합), A3 도메인(콜라겐에 결합), C1 도메인(여기서, RGD 도메인은 활성화될 때 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결합), 및 단백질의 C-말단에서 "시스테인 노트" 도메인(VWF는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 및 β-인간 융모성 고나도트로핀(βHCG)과 공유)을 함유한다.
인간 VWF에 대한 2813 개의 단량체 아미노산 서열은 Genbank에 수탁 번호 NP000543.2로 보고되어 있다. 인간 VWF를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 Genbank에 수탁 번호 NM000552.3으로 보고되어 있다. SEQ ID NO: 129는 SEQ ID NO: 128에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. D' 도메인은 SEQ ID NO: 129의 아미노산 764 내지 866을 포함한다. D3 도메인은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 867 내지 1240을 포함한다.
혈장에서, FVIII의 95% 내지 98%가 전장 VWF와 치밀한 비-공유 복합체로 순환한다. 이러한 복합체의 형성은 생체내에서 FVIIII의 적절한 혈장 수준의 유지를 위해 중요하다. 문헌[Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007)]. FVIII가 중쇄에서의 위치 372 및 740에서, 그리고 경쇄에서의 위치 1689에서 단백질 분해로 인해 활성화되는 경우, FVIII에 결합된 VWF는 활성화된 FVIII로부터 제거된다.
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 전장 폰 빌레브란트 인자이다. 다른 구현예에서, 이종 모이어티는 폰 빌레브란트 인자 단편이다. 본원에 사용된 용어 "VWF 단편" 또는 본원에 사용된 "VWF 단편들"은, FVIII와 상호작용하고, 전장 VWF에 의해 FVIII에 일반적으로 제공되는 적어도 하나 이상의 특성들, 예를 들어, FVIIIa로의 조기 활성화를 예방하고/하거나, 조기 단백질 분해를 예방하고/하거나, 조기 간극을 초래할 수 있는 인지질 막과의 회합을 예방하고/하거나, 네이키드 FVIII를 결합할 수 있지만 VWF-결합된 FVIII를 결합하지 않는 FVIII 간극 수용체에 대한 결합을 예방하고/하거나, FVIII 중쇄 및 경쇄 상호작용을 안정화시키는 특성을 보유하는 임의의 VWF 단편을 의미한다. 특정 구현예에서, 이종 모이어티는 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 (VWF) 단편이다. D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D1 도메인, D2 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들 중 하나 이상의 단편, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 VWF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. VWF 단편에 융합된 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 추가 예는, 둘 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 2012년 7월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/667,901 및 미국 공개 번호 2015/0023959 A1에 개시되어 있다.
12. 링커 모이어티
일정 구현예에서, 이종 모이어티는 펩타이드 링커이다.
본원에 사용된 용어 "펩타이드 링커" 또는 "링커 모이어티"는 폴리펩타이드 쇄의 선형 아미노산 서열에서 2 개의 도메인을 연결하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열)을 지칭한다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 알부민과 같은, 상술된 이종 모이어티와 본 개시내용의 치료적 단백질 사이에 삽입될 수 있다. 펩타이드 링커는 키메라 폴리펩타이드 분자에 융통성을 제공할 수 있다. 링커는 전형적으로 절단되지만, 이러한 절단이 요망될 수 있다. 일 구현예에서, 이들 링커는 가공 동안 제거되지 않는다.
본 개시내용의 키메라 단백질에 존재할 수 있는 링커의 유형은 절단 부위(즉, 프로테아제 절단 부위 기질, 예를 들어, 인자 XIa, Xa, 또는 트롬빈 절단 부위)를 포함하고, 절단 부위의 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 모두 상에 추가 링커를 포함할 수 있는, 프로테아제 절단 가능한 링커이다. 이들 절단 가능한 링커는 본 개시내용의 작제물에 편입될 때 이종 절단 부위를 갖는 키메라 분자를 생성시킨다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 치료적 단백질은 cscFc 링커를 통해 연결되어 단일 폴리펩타이드 쇄에 포함되는 Fc 영역을 형성시키는 둘 이상의 Fc 도메인 또는 모이어티를 포함한다. cscFc 링커는 적어도 하나의 세포내 가공 부위, 즉, 세포내 효소에 의해 절단된 부위가 측접된다. 적어도 하나의 세포내 가공 부위에서 폴리펩타이드의 절단은 적어도 2 개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 생성시킨다.
다른 펩타이드 링커가, 예를 들어, 응고 인자 단백질을 Fc 영역에 연결시키기 위해 본 개시내용의 작제물에서 선택적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용과 연관하여 사용될 수 있는 일부 예시적인 링커는, 예를 들어, 하기에서 보다 상세하게 기재되는 GlySer 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 펩타이드 링커는 합성, 즉, 비-천연 발생이다. 일 구현예에서, 펩타이드 링커는 아미노산의 제1 선형 서열을 자연에서 천연적으로 연결되거나 유전적으로 융합되지 않는 아미노산의 제2 선형 서열에 연결하거나 유전적으로 융합하는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(또는 폴리펩타이드)(천연 발생일 수 있거나 천연 발생이지 않을 수 있음)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 펩타이드 링커는 천연 발생 폴리펩타이드의 변형 형태(예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함함)인 비-천연 발생 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 비-천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 천연적으로 발생하지 않는 선형 서열에서 발생하는 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 천연 발생 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일정 구현예에서, 펩타이드 링커는 동일한 Fc 모이어티를 융합함으로써 동종이합체 scFc 영역을 형성시키는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 상이한 Fc 모이어티(예를 들어, 야생형 Fc 모이어티 및 Fc 모이어티 변이체)를 융합함으로써 이종이합체 scFc 영역을 형성시키는 데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나 이로 구성된다. 일 구현예에서, scFc 또는 cscFc 링커는 gly-ser 링커 및 면역글로불린 힌지의 적어도 일부를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성되는 펩타이드를 지칭한다. 일정 구현예에서, 상기 gly-ser 링커는 펩타이드 링커의 2 개의 다른 서열 사이에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, gly-ser 링커는 펩타이드 링커의 또 다른 서열의 하나의 말단 또는 두 말단 모두에 부착된다. 추가의 다른 구현예에서, 둘 이상의 gly-ser 링커는 펩타이드 링커에서 일련적으로 편입된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 상부 힌지 영역의 적어도 일부(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유래됨), 중간 힌지 영역의 적어도 일부(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유래됨) 및 일련의 gly/ser 아미노산 잔기를 포함한다.
본 개시내용의 펩타이드 링커는 적어도 하나의 아미노산 길이이고, 다양한 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 약 1 개 내지 약 50 개 아미노산 길이이다. 이러한 문맥에서 사용된 용어 "약"은 +/- 2 개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 링커 길이는 양의 정수여야 하므로, 약 1 개 내지 약 50 개 아미노산 길이의 길이는 1 개 내지 3 개에서부터 48 개 내지 52 개까지의 아미노산 길이의 길이를 의미한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 약 10 개 내지 약 20 개 아미노산 길이이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 약 15 개 내지 약 50 개 아미노산 길이이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 약 20 개 내지 약 45 개 아미노산 길이이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 약 15 개 내지 약 35 개 또는 약 20 개 내지 약 30 개 아미노산 길이이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 약 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 26 개, 27 개, 28 개, 29 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 500 개, 1000 개, 또는 2000 개 아미노산 길이이다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 펩타이드 링커는 20 개 내지 30 개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 10 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 또는 적어도 100 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 200 개, 적어도 300 개, 적어도 400 개, 적어도 500 개, 적어도 600 개, 적어도 700 개, 적어도 800 개, 적어도 900 개, 또는 적어도 1,000 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 300 개, 400 개, 500 개, 600 개, 700 개, 800 개, 900 개, 1000 개, 1100 개, 1200 개, 1300 개, 1400 개, 1500 개, 1600 개, 1700 개, 1800 개, 1900 개, 또는 2000 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 1 개 내지 5 개의 아미노산, 1 개 내지 10 개의 아미노산, 1 개 내지 20 개의 아미노산, 10 개 내지 50 개의 아미노산, 50 개 내지 100 개의 아미노산, 100 개 내지 200 개의 아미노산, 200 개 내지 300 개의 아미노산, 300 개 내지 400 개의 아미노산, 400 개 내지 500 개의 아미노산, 500 개 내지 600 개의 아미노산, 600 개 내지 700 개의 아미노산, 700 개 내지 800 개의 아미노산, 800 개 내지 900 개의 아미노산, 또는 900 개 내지 1000 개의 아미노산을 포함할 수 있다.
펩타이드 링커는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 폴리펩타이드 서열에 도입될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 플라스미드 DNA는 생산되는 폴리펩타이드의 안정한 생산을 위해 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
13. 단량체-이합체 하이브리드
일부 구현예에서, 본 개시내용의 치료적 단백질은 응고 인자를 포함하는 단량체-이합체 하이브리드 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단량체-이합체 하이브리드"는 디설파이드 결합에 의해 서로 회합되는 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄을 포함하는 키메라 단백질로서, 제1 쇄는 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 및 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 쇄는 응고 인자가 없는 제2 Fc 영역을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 키메라 단백질을 지칭한다. 따라서, 단량체-이합체 하이브리드 작제물은 하나의 응고 인자만을 갖는 단량체 양태, 및 2 개의 Fc 영역을 갖는 이합체 양태를 포함하는 하이브리드이다.
14. 발현 제어 서열
일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 적어도 하나의 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 본원에서 사용된 발현 제어 서열은 그것이 작동 가능하게 연결된 코딩 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 용이하게 하는, 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합과 같은, 임의의 조절 뉴클레오타이드 서열이다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 분자는 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 발현 제어 서열은, 예를 들어, 구성성 또는 유도성 프로모터와 같은, 포유류 또는 바이러스 프로모터일 수 있다.
구성성 포유류 프로모터로는 다음 유전자에 대한 프로모터가 포함되나, 이에 한정되지 않는다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스페라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 및 기타 구성성 프로모터. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터로는, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스(예를 들어, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복(LTR), 및 기타 레트로바이러스 유래 프로모터, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터가 포함된다. 다른 구성성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 본 개시내용의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 일정 금속 이온의 존재 하에 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 조직 특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에 전이유전자의 발현을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 간 세포에서 전이유전자의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일정 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 간세포, 동모양 세포, 및/또는 내피 세포에서 전이유전자의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일 구체적 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 내피 세포에서 전이유전자의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일정 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 근세포, 중추신경계, 눈, 간, 심장, 또는 이들의 임의의 조합에서 전이유전자의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 간 특이적 프로모터의 예는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 및 마우스 알부민 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 구체적 구현예에서, 프로모터는 mTTR 프로모터를 포함한다. mTTR 프로모터는 문헌[R. H. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697]에 기재되어 있다. F8 프로모터는 문헌[Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 특이적 프로모터(예를 들어, α1-항트립신(AAT)), 근육 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 및 데스민(DES)), 합성 프로모터(예를 들어, SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, 및 tMCK), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 프로모터는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, TTPp, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-항트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, 및 tMCK, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
발현 수준은 하나 이상의 인핸서를 사용하여 치료 효능을 달성하기 위해 추가로 향상될 수 있다. 하나 이상의 인핸서는 단독으로 또는 하나 이상의 프로모터 요소와 함께 제공될 수 있다. 전형적으로, 발현 제어 서열은 복수의 인핸서 요소 및 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일 구현예에서, 인핸서는 α-1-마이크로글로불린/바이쿠닌 인핸서의 하나 이상의 카피를 포함한다(문헌[Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouet et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet et al., 1998, Biochem. J. 334:577-584; Ill et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30]). 또 다른 구현예에서, 인핸서는 HNF1, (센스)-HNF3, (센스)-HNF4, (안티센스)-HNF1, (안티센스)-HNF6, (센스)-EBP, (안티센스)-HNF4 (안티센스)를 포함하여, Enh1과 EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6과 같은 간 특이적 전사 인자 결합 부위로부터 유래된다.
구체적 예에서, 본 개시내용에 유용한 프로모터는 Genbank 번호 AY661265로도 공지된 SEQ ID NO: 69(즉, ET 프로모터)를 포함한다. 또한, 문헌[Vigna et al., Molecular Therapy 11(5):763 (2005)] 참조. 다른 적합한 벡터 및 유전자 조절 요소의 예는 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 WO 02/092134, EP1395293, 또는 미국 특허 번호 6,808,905, 7,745,179, 또는 7,179,903에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 인트론 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 천연 발생 인트론 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 합성 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 천연 발생 인트론 서열로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 인트론 서열은 SV40 작은 T 인트론을 포함한다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 115를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 전사 후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 돌연변이된 마멋 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 일 구체적 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 SEQ ID NO: 120을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 마이크로RNA(MiRNA) 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, miRNA 결합 부위는 miR-142-3p에 대한 miRNA 결합 부위이다. 다른 구현예에서, miRNA 결합 부위는 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Rennie et al., RNA Biol. 13(6):554-560 (2016)], 및 http://sfold.wadsworth.org/starmirDB.php에서 입수 가능한 STarMirDB에 개시된 miRNA 결합 부위로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 DNA 핵 표적화 서열(DTS)을 포함한다. DTS는 이러한 서열을 함유하는 DNA 분자의 핵으로의 전좌를 촉진한다. 일정 구현예에서, DTS는 SV40 인핸서 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, DTS는 c-Myc 인핸서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DTS는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 있다. 일부 구현예에서, DTS는 제1 ITR에 대해 3'에 있고, 치료적 단백질에 대해 5'에 있다. 다른 구현예에서, DTS는 치료적 단백질에 대해 3'에 있고, 제2 ITR에 대해 5'에 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다. 일 구현예에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리는 액틴 폴리(A) 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리는 헤모글로빈 폴리(A) 부위를 포함한다.
일 구체적 구현예에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 SEQ ID NO: 122를 포함한다.
III. 조직 특이적 발현
일정 구현예에서, 이는, 예를 들어, 응고 인자 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 벡터 내에 포함하는 데 유용할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 또한 응고 인자 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결되거나, 달리 벡터 내에 삽입된 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 제공한다. 벡터에 포함된 miRNA 표적 서열의 하나 초과의 카피는 시스템의 효과를 증가시킬 수 있다. 또한, 상이한 miRNA 표적 서열이 포함된다. 예를 들어, 하나 초과의 전이유전자를 발현하는 벡터는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 보다 많은 miRNA 표적 서열의 제어 하에 전이유전자를 가질 수 있다. miRNA 표적 서열은 종열로 있을 수 있지만, 다른 배열이 또한 포함된다. miRNA 표적 서열을 함유하는 전이유전자 발현 카세트는 또한 안티센스 배향으로 벡터 내에 삽입될 수 있다. 안티센스 배향은 달리 생산자 세포에 독성일 수 있는 유전자 산물의 발현을 방지하기 위해 바이러스 입자의 생산에서 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 동일하거나 상이한 miRNA 표적 서열의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개의 카피를 포함한다. 그러나, 일정의 다른 구현예에서, 벡터는 임의의 miRNA 표적 서열을 포함하지 않을 것이다. miRNA 표적 서열을 포함하는지의 여부(및 개수)의 선택은 의도된 조직 표적, 필요한 발현 수준 등과 같은 공지된 매개변수에 의해 지시될 수 있다.
일 구현예에서, 표적 서열은 골수성 수임 전구세포(myeloid committed progenitor)에서, 그리고 적어도 부분적으로 보다 원시적인 HSPC에서, 가장 효과적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수성 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수성 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프구 또는 적혈구 계통에서 강력한 전이유전자 발현에 의존하는 유전자 요법 적용에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 표적 서열은 miR142 표적(tccataaagt aggaaacact aca (SEQ ID NO: 43))이다. 일 구현예에서, 벡터는 miR-142 표적 서열의 4 개의 카피를 포함한다. 일정 구현예에서, 조혈-특이적 마이크로RNA, 예컨대, miR-142 (142T)의 상보적 서열은 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터(LV)의 3' 비번역 영역에 편입되어, 전이유전자-인코딩 전사체를 miRNA-매개 하향-조절에 민감하게 만든다. 이러한 방법에 의해, 전이유전자 발현은 비-조혈 세포에서 유지되면서 조혈-계통 항원 제시 세포(APC)에서 방지될 수 있다(문헌[Brown et al., Nat Med 2006]). 이러한 전략은 전이유전자 발현에 대한 엄격한 전사 후 제어를 부과할 수 있고, 그에 따라 전이유전자의 장기간 발현 및 안정한 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, miR-142 조절은 형질도입된 세포의 면역-매개 청소를 방지하고/하거나 항원 특이적 조절 T 세포(T regs)를 유도하고 전이유전자-인코딩된 항원에 대한 강력한 면역학적 내성을 매개한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165]에는 마우스 골수 내 B 세포에서 특이적으로 발현된 miRNA인 miR-181가 개시되어 있다(Chen 및 Lodish, 2005). 여기에는 또한 일부 인간 miRNA가 백혈병과 연관된다는 것이 개시되어 있다.
표적 서열은 miRNA에 완전히 또는 부분적으로 상보적일 수 있다. 용어 "완전 상보적"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 용어 "부분 상보적"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 일부만 상보적이라서 부분적으로 상보적인 서열이 miRNA에 의해 여전히 인식된다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 본 개시내용의 문맥에서 부분 상보적 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고, 그러한 miRNA를 발현하는 세포에서 전이유전자 발현의 방지 또는 감소를 야기하는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413, 또는 WO2010/125471에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 간에 표적화된다. 일정 구현예에서, 전이유전자 발현은 간세포에 표적화된다. 다른 구현예에서, 전이유전자 발현은 내피 세포에 표적화된다. 일 구체적 구현예에서, 전이유전자 발현은 내인성 FVIII를 천연적으로 발현시킨 임의의 조직에 표적화된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 중추신경계에 표적화된다. 일정 구현예에서, 전이유전자 발현은 뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 구심성 뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 원심성 뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 개재뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 아교 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 성상세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 희돌기교세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 미세아교세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 뇌실막 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 슈반 세포(Schwann cell)에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 위성 세포에 표적화된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 근육 조직에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 평활근에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 심근에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 골격근에 표적화된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 눈에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 광수용체 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 망막 절세포에 표적화된다.
IV. 숙주 세포
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원에 사용된용어 "형질전환"은 유전자형을 변화시키고 결과적으로 수용 세포에서 변화를 야기하는 수용 숙주 세포로의 DNA의 도입을 지칭하기 위해 넓은 의미로 사용될 것이다.
"숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하고 적어도 하나의 이종 유전자를 인코딩하여 구성된 벡터로 형질전환된 세포를 지칭한다. 본 개시내용의 숙주 세포는 바람직하게는 포유류 기원; 가장 바람직하게는 인간 또는 마우스 기원이다. 당업자는 이들의 목적에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력이 있는 것으로 여겨진다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO, DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21, 및 HEK 293(인간 신장)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 구체적 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6® 세포, NS0 세포, CAP 세포 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 곤충 기원이다. 일 구체적 구현예에서, 숙주 세포는 SF9 세포이다. 숙주 세포는 전형적으로, 상업적 서비스, 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(American Tissue Culture Collection)으로부터, 또는 공개된 문헌으로부터 입수 가능하다.
숙주 세포로의 본 개시내용의 핵산 분자 또는 벡터의 도입은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 이들은 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 외막형 DNA와의 세포 융합, 마이크로주입, 및 온전한 바이러스에 의한 감염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)] 참조. 가장 바람직하게는, 숙주로의 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 이루어진다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생산에 적절한 조건 하에 성장되고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성을 위해 분석된다. 예시적인 분석 기술로는 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), 또는 형광-활성화 세포 분류기 분석(FACS), 면역조직화학법 등이 포함된다.
본 개시내용의 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장된다. 본원에서 사용된 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장에 요구되는 영양소를 함유하는 배지를 의미한다. 세포의 성장에 요구되는 영양소에는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄, 및 성장 인자가 포함될 수 있다. 선택적으로, 배지는 하나 이상의 선택 인자를 함유할 수 있다. 선택적으로 배지는 소의 송아지 혈청 또는 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배지는 실질적으로 IgG를 함유하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들어 약물 선택 또는 DNA 작제물 상에 있거나 DNA 작제물과 동시-형질감염되는 선택 마커에 의해 보완되는 필수 영양소의 결핍에 의해, DNA 작제물을 함유하는 세포를 선택할 것이다. 배양된 포유류 세포는 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 혈청-함유 또는 무-혈청 배지(예를 들어, MEM, DMEM, DMEM/F12)에서 성장된다. 일 구현예에서, 배지는 CDoptiCHO(Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 또 다른 구현예에서, 배지는 CD17(Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 사용된 구체적인 세포주에 적절한 배지의 선택은 당업자의 수준 이내이다.
V. 폴리펩타이드의 제조
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 본 개시내용의 핵 분자를 포함하는 벡터에 의해 인코딩된다. 추가의 다른 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 본 개시내용의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 의해 생산된다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은 또한 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드가 생산되게 하는 조건 하에 본 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현은 동일한 조건이지만 기준 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 모 FVIII 유전자 서열)을 포함하는 조건 하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가된다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법으로서, 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드가 핵산 분자에 의해 발현되게 하는 조건 하에 본 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현은 기준 핵산 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 모 FVIII 유전자 서열)를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가되는, 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 수율을 향상시키는 방법으로서, 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드가 본원에 개시된 핵산 분자에 의해 생산되게 하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 수율은 기준 핵산 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 모 FVIII 유전자 서열)을 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가되는, 방법을 제공한다.
본 개시내용의 치료적 단백질, 예를 들어, 응고 인자는 설치류, 염소, 양, 돼지, 또는 소와 같은 유전자이식 동물에서 합성될 수 있다. 용어 "유전자이식 동물"은 이들의 게놈에 외래 유전자를 편입한 비-인간 동물을 지칭한다. 이러한 유전자는 생식계열 조직에 존재하기 때문에, 이는 모체로부터 자식으로 보내진다. 외인성 유전자는 단일-세포 배아에 도입된다(문헌[Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438]). 유전자이식 동물을 생산하는 방법은 면역글로불린 분자를 생산하는 유전자이식을 포함하여 당업계에 공지되어 있다(문헌[Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34 : 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59 : 831 ; Robl et al. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267]).
VII. 약제학적 조성물
핵산 분자, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드, 벡터, 또는 본 개시내용의 숙주 세포를 함유하는 조성물은 약제학적으로 허용되는 적합한 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이들은 작용 부위로의 전달을 위해 고안된 제제로 활성 화합물을 용이하게 가공하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 (a) 핵산 분자, 벡터, 폴리펩타이드, 또는 본원에 개시된 숙주 세포; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 전달제를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 전달제는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 리포좀, 기타 중합체 분자, 및 엑소좀을 추가로 포함한다.
약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의한 비경구 투여(즉, 정맥내, 피하, 또는 근육내)를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은, 예를 들어, 보존제가 첨가된 앰플 또는 다용량 용기에서 단위 투여형으로 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유한다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어, 발열성 자유수와의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 또한 수용성 형태의 활성 화합물, 예를 들어, 수용성 염의 수성 용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함하여, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 리포좀은 또한 세포 또는 사이질 공간으로의 전달을 위해 본 개시내용의 분자를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 생리학적으로 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 및 에탄올 등이다. 일부 구현예에서, 조성물은 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 물질, 예컨대, 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 에멀젼화제, 활성 성분의 저장 수명 또는 효과를 향상시키는 보존제 또는 완충제를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은, 예를 들어, 액체(예를 들어, 주사용 및 불용 용액), 분산액, 현탁액, 반고체 및 고체 투여형을 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 적용의 방식에 의해 좌우된다.
조성물은 용액, 마이크로 에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 상기 나열한 성분의 하나 이상의 조합으로 적절한 용매에 필요량의 활성 성분을 혼입한 후, 필요한 경우, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질, 및 상기 나열한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조에 의해, 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분과 함께 활성 성분의 분말을 수득하는 것이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
활성 성분은 제어-방출형 제형 또는 디바이스와 제형화될 수 있다. 이러한 제형 및 디바이스의 예는 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생분해 가능한 생체적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형 및 디바이스를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
주사용 디포트 제형은 생분해 가능한 중합체, 예컨대, 폴리락티드-폴리글리콜리드에서 약물의 마이크로캡슐화된 매트리스(matrice)를 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 중합체에 대한 약물의 비율, 및 사용되는 중합체의 성질에 따라, 약물 방출의 속도가 제어될 수 있다. 다른 예시적인 생분해 가능한 중합체는 폴리오르토에스테르 및 폴리안하이드라이드이다. 디포트 주사용 제형은 또한 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획함으로써(entrap) 제조될 수 있다.
보충용 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 응고 인자, 또는 이의 변이체, 단편, 유사체, 또는 유도체와 제형화된다. 예를 들어, 응고 인자는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자(rsTF), 또는 임의의 상기 인자들의 활성화된 형태를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 지혈제의 응고 인자는 또한 항-피브린용해성 약물, 예를 들어, 엡실론-아미노-카프로산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
투여 계획은 최적의 요망되는 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 단회 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 개의 분할된 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 위급에 의한 지시에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)] 참조.
활성 화합물 외에, 액체 투여형은 불활성 성분, 예컨대, 물, 에틸 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다.
적합한 약제학적 담체의 비제한적인 예는 또한 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 부형제의 일부 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한 pH 완충 시약, 및 습윤제 또는 에멀젼화제를 함유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 약제학적 조성물은 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한 액체, 예를 들어, 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방), 에멀젼화제(레시틴 또는 아카시아), 비-수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분별화된 식물성 오일), 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)을 포함할 수 있다. 제제는 또한 향미제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클과의 구성을 위한 건성 제품에 존재할 수 있다.
구강 투여의 경우, 조성물은 통상적인 프로토콜에 따라 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 화합물은 부형제와 함께 또는 부형제 없이 분무 에어로졸의 형태로, 또는 선택적으로 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스와 함께 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 혼합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토스 또는 전분을 함유하여 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 통상적인 좌약 베이스, 예컨대, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성된 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
VIII. 치료 방법
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 유전자 카세트를 포함하고, 여기서 유전자 카세트는 응고 인자를 포함하고, 핵산 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용된다. 출혈 질병 또는 질환은 출혈 응고 장애, 출혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈(oral bleed), 출혈, 근육 내로의 출혈, 구강 출혈(oral hemorrhage), 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강-내 출혈, 흉강내 출혈, 골절, 중추신경계 출혈, 인두뒤 공간 내 출혈, 복막뒤 공간 내 출혈, 장요근 수초 내 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 다른 구현예에서, 대상체는 수술을 받기로 예정되어 있다. 추가의 다른 구현예에서, 치료는 예방적이거나 온-디맨드(on-demand)이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 출혈 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 응고 인자, 예를 들어, FVIII의 결핍을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병이다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병 A이다. 출혈 장애를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 응고 인자, 예를 들어, FVIII의 혈장 활성은, 투여 후 24 시간째에, 기준 핵산 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 16, 모 FVIII 유전자 서열), 기준 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 기준 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드가 투여된 대상체에 비해 증가된다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 지혈 장애를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 치료적 유효량의 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 또는 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 단리된 핵산 분자 또는 인코딩된 폴리펩타이드에 의한 치료, 개선, 및 예방은 우회 요법일 수 있다. 우회 요법을 받는 대상체는 응고 인자, 예를 들어, FVIII에 대한 저해제를 이미 생성시켰을 수 있거나, 응고 인자 저해제를 생성시키는 대상체이다.
본 개시내용의 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 피브린 혈전의 형성을 촉진함으로써 지혈 장애를 치료하거나 예방한다. 본 개시내용의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 응고 인자, 예를 들어, FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드는 응고 캐스케이드의 일원을 활성화시킬 수 있다. 응고 인자는 외재적 경로, 내재적 경로 또는 둘 모두에 관여할 수 있다.
본 개시내용의 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 응고 인자로 치료 가능한 것으로 알려진 지혈 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 지혈 장애는 혈우병 A, 혈우병 B, 폰 빌레브란트병, 인자 XI 결핍(PTA 결핍), 인자 XII 결핍, 뿐만 아니라 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X, 또는 인자 XIII의 결핍 또는 구조적 이상, 출혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈(oral bleed), 출혈, 근육 내로의 출혈, 구강 출혈(oral hemorrhage), 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강-내 출혈, 흉강내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두뒤 공간 내 출혈, 복막뒤 공간 내 출혈, 및 장요근 수초 내 출혈을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 지혈 장애는 유전성 장애이다. 일 구현예에서, 대상체는 혈우병 A를 갖는다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 응고 인자 결핍의 결과이다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 FVIII 결핍의 결과이다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 FVIII 응고 인자 결손의 결과일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 지혈 장애는 후천성 장애일 수 있다. 후천성 장애는 기저성 이차 질병 또는 질환으로부터 초래될 수 있다. 관련이 없는 질환은, 예로서, 비제한적으로 암, 자가면역 질병, 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 노환으로부터 또는 기저성 이차 장애를 치료하기 위한 의약(예를 들어, 암 화학요법)으로부터 초래될 수 있다.
본 개시내용은 또한 지혈 장애 또는 지혈 장애의 발병으로 초래된 이차 질병 또는 질환을 갖지 않는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용은 일반적인 지혈제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 일반적인 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나, 수술을 받기 직전에 있다. 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 수술 전 또는 후에 예방적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 중 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 또는 줄기 세포 이식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 지혈 장애를 갖지 않는 급성 출혈 에피소드를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 급성 출혈 에피소드는 중증 외상, 예를 들어, 수술, 자동차 사고, 상처, 열상 총상, 또는 조절되지 않는 출혈을 초래하는 임의의 다른 외상 사건으로부터 초래될 수 있다.
단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 단백질은 지혈 장애가 있는 대상체를 예방적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 단백질은 지혈 장애가 있는 대상체에서 급성 출혈 에피소드를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자 또는 벡터의 투여에 의한 응고 인자 단백질의 발현은 대상체에서 면역 반응을 유발하지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 응고 인자에 대항하는 항체의 생성을 포함한다. 일 구현예에서, 면역 반응은 FVIII에 대항하는 항체의 생성을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 사이토카인 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 B 세포, T 세포, 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 저해성 면역 반응이고, 여기서 대상체의 면역 반응은 면역 반응을 생성시키지 않은 대상체에서의 응고 인자의 활성에 비해 응고 인자 단백질의 활성을 감소시킨다. 일정 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자 또는 벡터의 투여에 의한 응고 인자 단백질의 발현은 응고 인자 단백질, 또는 단리된 핵산 분자 또는 벡터로부터 발현된 응고 인자 단백질에 대항하는 저해성 면역 반응을 예방한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 단백질 조성물은 지혈을 촉진하는 적어도 하나의 다른 작용제와 조합되어 투여된다. 상기 다른 작용제는 응고 활성이 입증된 치료에서 지혈을 촉진한다. 예로서, 비제한적으로 지혈제는 FV, FVII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, 프로트롬빈, 또는 피브리노겐 또는 임의의 전술된 것들의 활성화된 형태를 포함할 수 있다. 응고 인자 또는 지혈제는 또한 항-피브린용해성 약물, 예를 들어, 엡실론-아미노-카프로산, 트락넥삼산을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 조성물(예를 들어, 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드)은 응고 인자가 대상체에게 투여될 때 활성화 가능한 형태로 존재하는 조성물이다. 이러한 활성화 가능한 분자는 대상체에게 투여한 후 응고 부위에서 생체내로 활성화될 수 있다.
단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 정맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어, 경구로, 설하로, 구강으로, 설하로, 비내로, 직장으로, 질로 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 응고 인자 단백질은 요망되는 부위로의 키메라 단백질의 서방형 방출을 가능하게 하는 바이오중합체 고형 지지체 내에 이식되거나 이에 연결될 수 있다.
경구 투여의 경우, 약제학적 조성물은 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한 액체, 예를 들어, 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방), 에멀젼화제(레시틴 또는 아카시아), 비-수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분별화된 식물성 오일), 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)을 포함할 수 있다. 제제는 또한 향미제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클과의 구성을 위한 건성 제품에 존재할 수 있다.
구강 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 통상적인 프로토콜에 따라 정제, 로젠지, 또는 속용 필름의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 응고 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스와 함께 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이(예를 들어, PBS에서)의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 혼합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토스 또는 전분을 함유하여 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드의 투여 경로는 비경구이다. 본원에 사용된 용어 비경구는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내 형태가 바람직하다. 이러한 형태의 투여 모두가 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 분명하게 고려되지만, 투여를 위한 형태는 주사용, 특히, 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적용 용액일 것이다. 대개, 주사에 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시와 양립 가능한 다른 방법에서, 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 유해한 세포 집단의 부위에 바로 전달되어, 질병이 있는 조직의 치료제에 대한 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 조제물에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트이다. 수성 담체에는 물, 알코올계/수성 용액, 식염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 본 개시내용에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 0.01 M 내지 0.1 M 및 바람직하게는 0.05 M 인산 완충액 또는 0.8%의 식염수를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 일반적인 비경구 비히클에는 소듐 포스페이트 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링거, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것들 등이 포함될 수 있다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
보다 구체적으로, 주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉각적인 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 멸균이어야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도의 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하며, 바람직하게는 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 유해 작용에 대해 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 통상적인 좌약 베이스, 예컨대, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다.
질환의 치료를 위한 본 개시내용의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함하는 다수의 상이한 인자들에 따라 다르다. 대개, 환자는 인간이지만, 유전자이식 포유류를 포함한 비-인간 포유류가 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화시키기 위해 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 이용하여 적정될 수 있다.
본 개시내용의 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 선택적으로 치료(예를 들어, 예방적 또는 치료적)를 필요로 하는 장애 또는 질환을 치료하는 데 효과적인 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 보조 요법과 함께 또는 조합하여 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드를 투여하는 것은, 요법 및 개시된 폴리펩타이드의 순차적, 동시적, 동연적, 공동적, 동반적 또는 동시발생적 투여 또는 적용을 의미한다. 당업자는 조합 치료 계획의 다양한 성분의 투여 또는 적용이 치료의 전체 효과를 향상시키도록 시간 조절될 수 있다는 점을 인지할 것이다. 당업자(예를 들어, 의사)는 선택된 보조 요법 및 본 명세서의 교시에 기반하여 과도한 실험 없이, 효과적인 병행 치료 계획을 용이하게 알 수 있을 것이다.
추가로, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 폴리펩타이드는 (예를 들어, 조합 치료 계획을 제공하기 위해) 작용제 또는 작용제들과 함께 또는 조합하여 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 조합될 수 있는 예시적인 작용제는 치료되는 특정 장애를 위한 현재 표준 치료를 나타내는 작용제들을 포함한다. 이러한 작용제는 성질이 화학적이거나 생물학적일 수 있다. 용어 "생물학적" 또는 "생물학적 작용제"는 치료로서 사용하고자 하는 살아 있는 유기체 및/또는 이들의 산물로부터 제조된 임의의 약제학적 활성제를 지칭한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 조합하여 사용될 작용제의 양은 대상체마다 다를 수 있거나, 당업계에 공지된 것에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)] 참조. 또 다른 구현예에서, 치료 표준과 일치하는 양의 그러한 작용제가 투여된다.
일 구현예에서, 또한, 본원에 개시된 핵산 분자, 및 이를 필요로 하는 대상체에게 핵산 분자를 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 개시된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 분자의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템이 본원에 개시된다. 핵산 분자는 곤충 세포에서 생산된다. 또 다른 구현예에서, 발현 작제물을 위한 나노입자 전달 시스템이 제공된다. 발현 작제물은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함한다.
IX. 유전자 요법
본 개시내용의 일정 양태는 대상체에서 유전자 작제물을 발현시키는 방법으로서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법으로서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 폴리펩타이드의 발현을 이를 필요로 하는 대상체에서 조정하는 방법으로서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 예를 들어, miRNA를 포함하는 핵산 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 발현을 이를 필요로 하는 대상체에서 하향 조절하는 방법으로서, 본 개시내용의 단리된 핵산 분자, 예를 들어, miRNA를 포함하는 핵산 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
체세포 유전자 요법은 혈우병 A를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 질환에 대한 치료로서 연구되고 있다. 유전자 요법은 벡터의 단일 투여 후 응고 인자, 예를 들어, FVIII의 연속적인 내인성 생산을 통해 질병을 치료하는 이의 잠재력 때문에 특히 매력적인 혈우병 치료이다. 혈우병 A는 이의 임상 증후가 혈장에서 미세한 양(200 ng/ml)으로 순환하는 단일 유전자 산물(예를 들어, FVIII)의 결여에 전적으로 기인하기 때문에 유전자 대체 접근법에 매우 적합하다.
본 개시내용의 응고 인자 단백질은, 치료적으로 유익할, 출혈 응고 장애, 출혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈(oral bleed), 출혈, 근육 내로의 출혈, 구강 출혈(oral hemorrhage), 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강-내 출혈, 흉강내 출혈, 골절, 중추신경계 출혈, 인두뒤 공간 내 출혈, 복막뒤 공간 내 출혈, 및 장요근 수초 내 출혈로 구성된 군으로부터 선택되는 출혈 질병 또는 장애의 치료에 대한 유전자 요법 접근 방식을 사용하여 포유류, 예를 들어 인간 환자에서 생체내 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 출혈 질병 또는 장애는 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 출혈 질병 또는 장애는 혈우병 A이다.
다른 질환이 또한 본원에 개시된 핵산 분자를 사용하는 치료에 적합하다. 일정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 근육, 중추신경계(CNS), 안구, 간, 심장, 신장, 췌장, 폐, 피부, 방광, 요로, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 표적 기관에 영향을 미치는 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용된다. 일정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 DMD(뒤쉔 근육 영양장애, Duchenne muscular dystrophy), XLMTM(X-연관 근세관성 근증, X-linked myotubular myopathy), 파킨슨(Parkinson), SMA(척수성 근위축(spinal muscular atrophy)), 프레드릭 실조증(Friedreich's Ataxia), GUCY2D-LCA(리베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis)), XLRS(X-연관 망막층간분리증, X-Linked Retinoschisis), AMD(노인성 황반 변성(Age-related Macular Degeneration)), ACHM(완전색맹(Achromatopsia)), RPF65 매개 IRD(표 9)로부터 선택된 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용된다.
[표 9]
본원에 개시된 방법에 의해 치료 가능한 질병 및 장애.
Figure pct00030
Figure pct00031
1: SOD1 유전자의 돌연변이는 유전성 ALS 사례의 20%를 차지했다. 야생형 SOD1은 신경 배양에서 항세포자멸 특성을 나타낸 반면, 돌연변이 SOD1은, 둘 모두에서 동일하게 발현되기는 하지만, 간 미토콘드리아에서가 아니라 척수 미토콘드리아에서 세포자멸을 촉진한 것으로 관찰되었다. 돌연변이된 SOD1 발현을 하향 조절하는 것은 ALS에서 운동 뉴런 퇴행을 저해할 수 있었다. 2: HD는 정상 범위를 초과하는 유전자의 반복된 섹션의 길이에 의해 초래되는 여러 트리뉴클레오타이드 반복 장애들 중 하나이다. HTT는 트리뉴클레오타이드 반복부로 알려진 여러 번 반복되는 세 개의 DNA 염기 사이토신-아데닌-구아닌(CAG)(즉, ... CAGCAGCAG ...)의 서열을 함유한다. CAG는 아미노산 글루타민에 대한 3-문자 유전자 코드(코돈)인데, 일련의 이들이 폴리글루타민 트랙트(또는 폴리Q 트랙트), 및 유전자의 반복되는 부분, 폴리Q 영역으로 알려진 글루타민 쇄의 생산을 야기한다.일반적으로, 사람들은 폴리Q 영역에서 36 개 미만의 반복된 글루타민을 갖는데, 이는 세포질 단백질 헌팅틴(Huntingtin)의 생산을 야기한다. 그러나, 36 개 이상의 글루타민의 서열은 상이한 특징을 갖는 단백질의 생산을 야기한다. 돌연변이 헌팅틴(mHTT)으로도 불리는 이러한 변경된 형태는 특정 유형의 뉴런의 붕괴 속도를 증가시킨다. 일반적으로, CAG 반복 횟수는 이러한 과정이 어느 정도 영향을 받는지와 관련이 있으며, 증상 발병 연령의 변이의 약 60%를 설명한다. 나머지 변이는 HD의 메카니즘을 변형시키는 환경 및 다른 유전자에 기인한다. 36 회 내지 39 회의 반복은, 증상이 훨씬 더 나중에 발병하고 더 느리게 진행되는, 질병의 감소된-침투 형태를 야기한다. 일부 경우에, 발병이 너무 늦어서 증상을 전혀 알아차리지 못할 수도 있다. 매우 많은 반복 횟수로, HD는 완전 침투를 갖고, 이후 청소년 HD, 무동성-경직, 또는 베스트팔 변종(Westphal variant) HD로 지칭될 경우에는, 20 세 미만의 연령에서 발생할 수 있다. 이는 HD 보균자의 약 7%를 차지한다. 3: 색소망막염의 원인이 되는 RHO 유전자 돌연변이의 대부분은 로돕신 단백질의 폴딩 또는 수송을 변경시킨다. 약간의 돌연변이는 로돕신이 광에 반응하여 활성화되는 대신에 구성적으로 활성화되게 한다. 연구는 로돕신의 변경된 버전이 필수 세포 기능을 방해하여 간상체의 자가-파괴(세포자멸을 거침)를 초래한다는 것을 시사한다. 간상체는 저-광 조건 하에서 시력에 필수적이므로, 이러한 세포의 손실은 색소망막염이 있는 사람들의 진행성 야맹증으로 이어진다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 리소좀 축적 장애를 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 리소좀 축적 장애는 MLD(이염성 백질이영양증), MPS(뮤코다당증), PKU(페닐케톤뇨증), II형 폼페 글리코겐 축적병, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 마이크로RNA(miRNA) 요법에서 사용된다. 일부 구현예에서, miRNA는 유전자 또는 단백질의 과발현에 의해 초래된 질환을 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 단백질의 축적에 의해 초래된 질환을 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 유전자 또는 단백질의 오발현에 의해 초래된 질환을 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 돌연변이 유전자의 발현에 의해 초래된 질환을 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 이종 유전자의 발현에 의해 초래된 질환을 치료한다. 일정 구현예에서, miRNA 요법은 ALS(아미트로픽 측삭 경화증), 헌팅턴병, AdRP(상염색체 우성 색소망막염), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 질환을 치료한다. 일정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 투여함으로써 ALS를 표적 치료하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, miRNA는 SOD1의 발현을 표적화한다. 일정 구현예에서, miRNA는 문헌[Dirren et al., Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2):167-84 (February 2015)]에 개시된 miR SOD1 인공 miRNA를 포함한다. SOD1 유전자의 돌연변이는 유전성 ALS 사례의 20%를 차지한다. 야생형 SOD1은 신경 배양에서 항세포자멸 특성을 나타낸 반면, 돌연변이 SOD1은, 둘 모두에서 동일하게 발현되기는 하지만, 간 미토콘드리아에서가 아니라 척수 미토콘드리아에서 세포자멸을 촉진한 것으로 관찰되었다. 돌연변이된 SOD1 발현의 하향 조절은 ALS에서 운동 뉴런 퇴행을 저해할 수 있었다.
일정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 투여함으로써 헌팅턴병을 표적 치료하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, miRNA는 HTT의 발현을 표적화한다. 일정 구현예에서, miRNA는 문헌[Evers et al., Molecular Therapy 26(9):1-15 (epub ahead of print June 2018)]에 개시된 miHTT 조작된 miRNA를 포함한다. 헌팅턴병은 정상 범위를 초과하는 유전자의 반복된 섹션의 길이에 의해 초래되는 여러 트리뉴클레오타이드 반복 장애들 중 하나이다. HTT는 트리뉴클레오타이드 반복부로 알려진 여러 번 반복되는 세 개의 DNA 염기 사이토신-아데닌-구아닌(CAG)(즉, ... CAGCAGCAG ...)의 서열을 함유한다. CAG는 아미노산 글루타민에 대한 3-문자 유전자 코드(코돈)인데, 이러한 일련의 반복이 폴리글루타민 트랙트(또는 폴리Q 트랙트), 및 유전자의 반복되는 부분, 폴리Q 영역으로 알려진 글루타민 쇄의 생산을 야기한다. 일반적으로, 사람들은 폴리Q 영역에서 36 개 미만의 반복된 글루타민을 갖는데, 이는 세포질 단백질 헌팅틴의 생산을 야기한다. 그러나, 36 개 이상의 글루타민의 서열은 상이한 특징을 갖는 단백질의 생산을 야기한다. 돌연변이 헌팅틴(mHTT)으로도 불리는 이러한 변경된 형태는 특정 유형의 뉴런의 붕괴 속도를 증가시킨다. 일반적으로, CAG 반복 횟수는 이러한 과정이 어느 정도 영향을 받는지와 관련이 있으며, 증상 발병 연령의 변이의 약 60%를 설명한다. 나머지 변이는 헌팅턴병의 메카니즘을 변경시키는 환경 및 다른 유전자에 기인한다. 36 회 내지 39 회의 반복은, 증상이 훨씬 더 나중에 발병하고 더 느리게 진행되는, 질병의 감소된-침투 형태를 야기한다. 일부 경우에, 발병이 너무 늦어서 증상을 전혀 알아차리지 못할 수도 있다. 매우 많은 반복 횟수로, 헌팅턴병은 완전 침투를 갖고, 이후 청소년 헌팅턴병, 무동성-경직, 또는 베스트팔 변종 헌팅턴병로 지칭될 경우에는, 20 세 미만의 연령에서 발생할 수 있다. 이는 헌팅턴병 보균자의 약 7%를 차지한다.
일정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 투여함으로써 상염색체 우성 색소망막염(AdRP)을 표적 치료하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 miRNA를 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하고, miRNA는 RHO(로돕신)의 발현을 표적화한다. 일정 구현예에서, miRNA는 miR-708을 포함한다(문헌[Behrman et al., JCB 192(6):919-27 (2011)] 참조). 색소망막염의 원인이 되는 RHO 유전자 돌연변이의 대부분은 로돕신 단백질의 폴딩 또는 수송을 변경시킨다. 약간의 돌연변이는 로돕신이 광에 반응하여 활성화되는 대신에 구성적으로 활성화되게 한다. 연구는 로돕신의 변경된 버전이 필수 세포 기능을 방해하여 간상체의 자가-파괴(세포자멸을 거침)를 초래한다는 것을 시사한다. 간상체는 저-광 조건 하에서 시력에 필수적이므로, 이러한 세포의 손실은 색소망막염이 있는 사람들의 진행성 야맹증으로 이어진다.
본원에 기재된 모든 다양한 양태, 구현예, 및 선택은 임의의 및 모든 변화로 조합될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참조로 포함되는 것처럼 동등한 정도로 참조로 포함된다.
본 개시내용이 전반적으로 기술되었지만, 본원에 제공된 실시예를 참조함으로써 추가적인 이해를 얻을 수 있다. 이들 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 제한하는 것을 의도하지 않는다.
실시예
실시예 1. AAV 및 비-AAV 파르보바이러스 ITR을 지니는 FVIII 발현 작제물의 생성.
실시예 1a. 유전자 카세트로, 코돈-최적화된 FVIII 유전자, 및 AAV로부터의 역 말단 반복부(ITR) 영역 클로닝.
FVIII 유전자 카세트를 AAV 혈청형 2의 게놈에 기초하여 생성시켰다. 그러나, 임의의 혈청형(합성 포함)으로부터 유래된 ITR 영역이 이러한 접근법에 사용될 수 있다(도 1a).
도 1b에 나타나 있는 바와 같이, AAV(AAV-FVIII)로부터 역 말단 반복부(ITR) 영역이 측접된 간-특이적 프로모터(TTPp, 도 1a 및 도 1b)의 조절 하에 코돈-최적화된 FVIII 코딩 서열을 인코딩하는 발현 플라스미드 AAV2-FVIIIco6XTEN을 시험관내 및 생체내 발현을 위해 설계하였다. 유전자 카세트는 또한 전이유전자의 최적 발현을 위해 WPRE 및 bGHpA 요소를 함유하였다(도 1a 및 도 1b). ITR-측접 코돈-최적화된 FVIII 서열을 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제를 위한 발현 카세트 및 ColE1 복제 기점을 포함하는 플라스미드 골격으로 클로닝하였다(도 1b). 발현 카세트에 측접한 제한 엔도뉴클레아제 PvuII에 대한 인식 부위를 PvuII 분해 시 AAV-FVIII 작제물의 정확한 삭제를 가능하게 하도록 조작하였다(도 1b).
실시예 1b. 유전자 카세트로, 코돈-최적화된 FVIII 유전자, 및 비-AAV 파르보바이러스로부터의 역 말단 반복부(ITR) 영역 클로닝.
AAV가 속하는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원들 간의 계통발생 관계를 기초로 할 때(도 2a), 데펜도바이러스속의 다른 비-AAV 일원, 및 에리스로바이러스속의 일원(및 가능하게는 바이러스 패밀리의 모든/다수 다른 일원)은 바이러스 생활사의 유지, 및 가장 중요하게는 지속적인 잠복 감염의 확립에 대하여 유사한 세포 메카니즘을 이용한다는 가설을 세웠다. 따라서, 이러한 바이러스의 게놈으로부터 유래된 ITR 영역은 AAV-유사(AAV-기반 아님) 유전자 발현 카세트를 생성시키기 위해 이용할 수 있다. 유전자 요법 적용을 위한 유전자 작제물의 생성에 대한 이들 ITR 영역의 적합성에 대해 다음 파르보바이러스를 시험하였다: 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주 B 및 에리스로바이러스 B19 파르보바이러스(도 2a).
세균 세포에서 플라스미드 벡터가 증식하는 동안 파르보바이러스 ITR 영역의 불안정성은 유전자 작제물의 생성 및 조작에 있어서 잘 알려져 있는 장애요인이다. 전장 AAV2 ITR(145 nt)을 함유하는 유전자 작제물은 우리를 포함하여 여러 그룹에 의해 성공적으로 생성되었지만, 이러한 작제물은 매우 불안정하고, 대부분의 AAV2 ITR-기반 플라스미드는 절단된 130 nt 버전의 ITR 영역을 함유한다(표 1에서 예시됨). 유사하게, 생성된 B19와 GPV ITR 둘 모두의 전장 서열을 지니는 플라스미드 작제물은 세균 숙주에서 높은 정도의 불안정성을 나타냈는데(데이터 미도시), 이는 유전자 요법 적용을 위한 유전자 벡터의 개발에 있어서 이들 ITR의 유용성을 상당히 제한한다.
이전에, 절단된 버전의 ITR을 지니는 재조합 B19 바이러스 구조용 역 유전학 시스템이 개발되었다(문헌[Manaresi et al., 2017, Virology, doi: 10.1016/j.virol.2017.05.006](표 2B, ITR ID: B19d135)). 따라서, 본 발명자들은 유전적으로 안정한 FVIII 발현 플라스미드 B19-FVIIIco6XTEN을 생성시키기 위해 B19d135 ITR을 사용하였다(도 1c). GPV ITR-기반 작제물을 합성하기 위한 이러한 접근법을 추가로 이용하기 위해, 본 발명자들은 B19, GPV, 및 AAV2 ITR의 전장 야생형 서열을 비교하였다(도 3a). ITR 기능에 없어도 되는 각각 B19 및 AVV2 ITR의 처음 135 개 및 15 개 뉴클레오타이드에 대한 상동성에 기초하여, 본 발명자들은 GPV ITR의 처음 162 개의 뉴클레오타이드가 완전히 기능적인 ITR을 갖는 안정한 유전자 작제물을 합성하기 위해 제거될 수 있다는 가설을 세웠다(도 3a, 회색 음영 서열). 따라서, 이들의 상응하는 ITR의 절단된 버전을 지니는 작제물 AAV2-FVIIIco6XTEN 및 B19-FVIIIco6XTEN과 유사하게, 본 발명자들은 안정한 FVIII 발현 플라스미드 작제물 GPV-FVIIIco6XTEN을 생성시키기 위해 GPVd162(표 2c)를 사용하였다(도 1d). 특히, 전장 B19와 GPV ITR 둘 모두는 전장 AAV2 ITR보다 훨씬 더 길고(표 1), AAV ITR의 특징적인 T 자형 헤어핀 구조를 형성시키지 않았다(도 2b).
비-AAV 파르보바이러스 ITR이 측접된 FVIII-발현 카세트(B19d135-FVIII 및 GPVd162-FVIII)를 함유하는 플라스미드 B19-FVIIIco6XTEN(도 1c; 표 2B) 및 GPV-FVIIIco6XTEN(도 1d; 표 2C)을 실시예 1a에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 제한 엔도뉴클레아제 LguI에 대한 인식 부위를 FVIII 발현 카세트 둘 모두를 측접시키는 데 사용하였다(도 1c 및 도 1d).
실시예 1c. AAV 및 비-AAV 파르보바이러스 ITR이 측접된 FVIII 발현 카세트를 함유하는 단일-가닥 DNA 단편의 제조.
FVIII 발현 카세트를 측접하는 ITR 영역 내 헤어핀 구조의 형성은 표적 세포의 지속적인 형질도입을 유도할 것이라는 가설을 세웠다. 개념 증명 연구를 위해, AAV ITR-기반 플라스미드 AAV2-FVIIIco6XTEN 및 비-AAV ITR-기반 플라스미드 B19-FVIIIco6XTEN 및 GPV-FVIIIco6XTEN을 각각 PvuII 및 LguI로 분해하였다. 95℃에서 PvuII 또는 LguI 분해의 이중-가닥 DNA 단편 산물(FVIII 발현 카세트 및 플라스미드 골격)을 변성시킨 후, 4℃에서 냉각시켜 회문 ITR 서열이 폴딩되게 함으로써 헤어핀 ITR 구조가 형성된 단일-가닥(ss) AAV-FVIII, B19-FVIII, 또는 GPV-FVIII 단편을 생성시켰다(도 1a). 생성된 ssAAV-FVIII, ssB19-FVIII, 또는 ssGPV-FVIII를 간세포의 지속적인 형질도입을 확립하는 능력에 대하여 HemA(혈우병 A) 마우스 모델에서 시험하였다.
실시예 1d. FVIII 발현 작제물을 생성하기 위한 바큘로바이러스 발현 시스템의 사용
곤충 세포에서 폐쇄형-말단 DNA(ceDNA) 분자 형태의 AAV-FVIII, B19-FVIII, 및 GPV-FVIII 작제물의 생성을 위하여 문헌[Li et al., PLoS ONE 8(8): e69879 (2013)]에 기재된 바큘로바이러스 발현 시스템이 사용될 것이다. ceDNA 발현 카세트의 전신 전달은 간세포에서 지속적인 형질도입을 확립하고, 간에서 안정한 장기간 전이유전자 발현을 유도하는 것으로 입증되었다.
실시예 2. AAV 및 비-AAV 파르보바이러스 ITR이 측접된 FVIII 발현 카세트를 포함하는 유전자 작제물의 전신 주사로 HemA 마우스에서 장기간 FVIII 발현 야기.
실시예 2a. ssAAV-FVIII-매개된 FVIII 발현의 생체내 평가.
지속적인 생체내 전이유전자 발현을 매개하는 AAV ITR 영역을 지니는 ssAAV-FVIII의 능력을 입증하기 위해, 유전자 발현 카세트를 5 μg, 10 μg, 또는 20 μg의 ssDNA 유전자 발현 카세트(ssAAV-FVIII)로 5 주령 내지 12 주령된 Hem A 마우스(4 마리의 동물/그룹)에게 수력학 주사(HDI)를 통해 전신으로 전달하였다(도 4a). HDI는 실험 동물의 간으로 주사된 물질의 일차 전달을 야기하였다. 5 ug/마우스의 모체 발현 플라스미드가 주사된 대조 동물은 투여 직후에 높은 수준의 FVIII 혈장 활성을 나타냈다. 그러나, 순환 FVIII의 수준은 급격히 감소하였고, 주사 후(p.i.) 15 일째에는 검출 불가능하게 되었다. ssAAV-FVIII의 단일 수력학 주사 후 18 시간, 3 일, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월 및 4 개월째에 실험 동물로부터 혈장 샘플을 수집하였다. 혈액 내 FVIII 혈장 활성을 발색 FVIII 활성 분석에 의해 분석하였다. 5, 10, 및 20 ug/마우스의 ssAAV-FVIII가 주사된 실험 동물들은 정상 FVIII 수준의 각각 약 8%, 16%, 및 32%의 안정한 수준의 순환 FVIII를 갖는 전이유전자의 장기간 발현을 생성시켰다(도 4a). 본 발명자들이 주사된 용량과 치료 결과 간의 높은 정도의 상관관계를 시사하는 강력한 용량 반응을 관찰하였다는 점이 강조되어야 한다.
실시예 2b. ssB19-FVIII- 및 ssGPV-FVIII-매개 FVIII 발현의 생체내 평가.
각각 비-AAV 파르보바이러스 ITR 영역 B19d135 및 GPVd162를 지니는 ssB19-FVIII 및 ssGPV-FVIII로부터의 FVIII의 생체내 발현을 평가하기 위해, 10 또는 20 μg/마우스의 ssB19-FVIII, 및 10 또는 50 μg/마우스의 ssGPV-FVIII 유전자 발현 카세트를 5 주령 내지 12 주령의 혈우병 A(HemA) 마우스에게 HDI를 통해 전신으로 전달하였다. 혈액 샘플을 주사 후 1, 3, 7, 14, 21, 및 28 일째에 수집하고, 혈액 내 FVIII 활성을 발색 FVIII 활성 분석에 의해 분석하였다. AAV-FVIII 작제물로의 실험에서 앞서 관찰된 바와 같이, 5 μg/마우스의 모 FVIII 발현 플라스미드가 주사된 대조 동물들은 주사 후 24 시간째에 높은 수준의 FVIII 혈장 활성을 나타냈고, 이는 급격히 감소하여 주사 후 14 일째에는 검출 불가능하게 되었다. ssB19-FVIII가 주사된 실험 동물들은 주사 후 24 시간째에 최고 FVIII 혈장 활성을 나타냈는데, 이는 이후 21 일의 기간에 걸쳐 점진적으로 감소되고, 주사 후 대략 28 일째에는 안정화되었다. (도 4b) 다른 한 편으로, ssGPV-FVIII가 주사된 HemA 마우스는 대략 7 일째에 안정한 수준의 FVIII 혈장 활성을 빠르게 나타냈는데, 이는 28 일의 전체 관찰 기간 동안 유지되었다(도 4c). 특히, 10 μg/마우스의 ssAAV-FVIII(도 4a) 또는 ssGPV-FVIII(도 4c)가 주사된 동물들은 매우 유사한 안정한 수준의 FVIII 혈장 활성을 나타냈는데, 이는 AAV2와 GPV ITR 영역 둘 모두가 표적 세포의 지속적인 형질도입을 효율적으로 확립하기 위해 필요한 유전적 요인을 포함한다는 것을 시사한다.
실시예 3. B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 FVIII 발현 작제물의 생성 및 생체내 평가.
실시예 3a. B19 및 GPV ITR의 최소 필수 서열의 결정.
데펜도바이러스 AAV2 및 GPV, 및 에리스로바이러스 B19(각각, 유전자 은행 수탁 번호 NC_001401.2, U25749.1, 및 KY940273.1)의 ITR 서열 간의 비교에 기초하여, 본 발명자들은 이러한 ITR을 지니는 유전자 작제물로 진핵 세포의 지속적인 형질도입을 위해 추가 서열(스페이서, 삽입, 역위, 첨가, 및/또는 다른 파르보바이러스 ITR의 야생형 서열과의 재조합)과 함께 또는 그것 없이, 필요로 할 GPV 및 B19 파르보바이러스 ITR의 최소 서열을 설계하였다(도 3a 및 도 3b). 따라서, AAV2, GPV, 및 B19 ITR의 서열 정렬은 가변 서열의 스페이서 영역이 없는 연속 서열로서 표 2A 내지 표 2C에 제시된 세 개의 모든 바이러스종 사이에 보존된 영역 B19v1 및 GPVv1을 나타냈다. 마찬가지로, 최소 필수 서열 변이체 B19v3 및 GPVv3을 B19와 GPV ITR 간의 서열 비교에 기초하여 설계하였다. GPVd162 ITR을 지니는 FVIII 발현 작제물은 B19d135 ITR을 지니는 유전자 작제물보다 생체내 실험에서 보다 우수하게 수행되었기 때문에, 본 발명자들은 GPV ITR 서열에는 지속적인 형질도입에 필요한 유전적 요인 모두가 존재하지만; B19 ITR 서열에는 이러한 유전적 요인 중 일부가 결여된다고 추정하였다. 따라서, B19v3 서열은 B19와 GPV ITR 서열 사이에 보존된 최소 B19 ITR 서열 영역을 포함하고, GPVv3 서열은 GPV ITR 서열에는 존재하지만 B19 ITR 서열에는 결여된 최소 GPV ITR 서열 영역을 포함한다(표 2B 및 표 2C). 서열 B19v2 및 GPVv2는 처음 135 개 및 162 개의 뉴클레오타이드, 및 각각 B19 및 GPV ITR 서열의 ITR 회문 영역에서 상응하는 상보적 135 개 및 162 개의 뉴클레오타이드를 배제함으로써 생성하였다(표 2B 및 표 2C).
실시예 3b. 기능적 유전자 작제물에 대한 B19 및 GPV ITR 및 이들의 유도체의 회문 영역의 배향.
파르보바이러스 ITR의 일부는 자가-상보적 회문 영역으로 구성된다. 회문 영역을 지니는 바이러스를 정배향 및 역배향으로 구조한 재조합 감염성 B19 파르보바이러스는 유사한 성장 특성을 나타낸다는 것이 이전에 입증되었다(문헌[Manaresi et al., 2017, Virology, doi: 10.1016/j.virol.2017.05.006]). 따라서 본 발명자들은, B19 및 GPV ITR 및 이들의 유도체를 지니는 유전자 발현 작제물은 이러한 ITR의 회문 영역이 정방향, 역방향, 또는 유전자 발현 카세트에 대한 5' 및 3' ITR 조합의 임의의 가능한 조합인지의 여부에 상관없이 계속 기능적으로 유지될 것이라는 점을 제안한다.
실시예 3c. HemA 마우스에서 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 유전자 작제물의 전신 주사.
B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 ssDNA 작제물로부터의 FVIII 생체내 발현을 평가하기 위해, 5, 10, 20, 또는 50 μg/마우스의 각 ssDNA 유전자 발현 카세트가 5 주령 내지 12 주령의 HemA 마우스에게 HDI를 통해 전신으로 전달될 것이다. 혈액 샘플을 주사 후 1, 3, 7, 14, 21, 및 28 일째, 그리고 이후 4 개월의 기간 동안 월 1 회 수집될 것이다. 혈액 내 FVIII 활성은 발색 FVIII 활성 분석에 의해 분석될 것이다.
실시예 4. 곤충 세포에서 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 ceDNA 발현 작제물의 생성 및 생체내 평가
실시예 4a. B19d135 및 GPVd162 ITR의 유도체를 지니는 ceDNA 발현 작제물을 생성하기 위한 바큘로바이러스 발현 시스템의 사용
실시예 1d에 기재된 AAV-FVIII, B19-FVIII, 및 GPV-FVIII 작제물과 유사하게, 본 발명자들이 곤충 세포에서 ceDNA 형태로 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 유전자 작제물에 대한 FVIII 발현을 생성하기 위해 바큘로바이러스 발현 시스템이 사용될 것이다.
실시예 4b. HemA 마우스에서 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 ceDNA 발현 작제물의 전신 주사.
B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 지니는 ceDNA 작제물로부터의 FVIII 생체내 발현을 평가하기 위해, 5, 10, 20, 또는 50 μg/마우스의 각 ceDNA 유전자 발현 카세트가 5 주령 내지 12 주령의 HemA 마우스에게 HDI를 통해 전신으로 전달될 것이다. 혈액 샘플은 주사 후 1, 3, 7, 14, 21, 및 28 일째, 그리고 이후 4 개월의 기간 동안 월 1 회 수집될 것이다. 혈액 내 FVIII 활성은 발색 FVIII 활성 분석에 의해 분석될 것이다.
실시예 5. ssDNA 및 ceDNA FVIII 발현 작제물의 지질 나노입자 제형의 생성
실시예 1 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 각각의 ssDNA 또는 ceDNA가 생산된 후, 각각의 유전자 작제물이 미세유체 혼합(LNP-ssDNA 및 LNP-ceDNA)에 의해 적절한 지질 조성을 이용하여 지질 나노입자(LNP)로 제형화될 것이다. LNP로 제형화된 AAV 또는 비-AAV 파르보바이러스 ITR이 측접된 FVIII 발현 카세트를 인코딩하는 모 플라스미드는 형질도입 효율에 관한 대조로서 사용될 것이다.
실시예 6. LNP-ssDNA 및 LNP-ceDNA의 시험관내 및 생체내 평가
실시예 6a. 배양된 간세포에서 ssDNA- 및 ceDNA-매개 FVIII 발현의 시험관내 평가.
ssDNA 또는 ceDNA FVIII 발현 유전자 작제물 및 상응하는 모 대조 플라스미드는 표적 유전자 전달을 위해 실시예 5에 기재된 바와 같이 LNP로 제형화될 것이다. Huh7 또는 HEK293T(비-간세포 대조) 세포는 7 × 104 개 세포/웰로 24-웰 조직 배양 플레이트에 시딩되고, 밤새 인큐베이션될 것이다. 다음날, LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA 제형은 1000, 500, 250, 125 및 62.5 ng/웰로 세포 상에 첨가될 것이다. 배양 배지 및 세포는 형질도입 후 24 시간째 및 48 시간째에 채취될 것이다. 배양 배지에서 FVIII 활성은 발색 FVIII 활성 분석에 의해 측정될 것이다. 세포 내 FVIII의 발현은 또한 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 분석될 것이다.
또한, 세포 히스톤은 rAAV 에피솜을 따라 규칙적으로 위치되어 세포 염색체 DNA 뉴클레오솜 패턴과 유사한 크로마틴-유사 구조를 형성시키는 것으로 문헌에 나타나 있다. 따라서, 표적 세포의 지속적인 형질도입에 필요한 크로마틴-유사 뉴클레오솜 구조를 확립하는 이러한 작제물의 능력이 또한 서던 블롯(Southern blot)에 의해 평가될 것이다.
실시예 6b. 정맥내 투여 후 HemA 마우스에서 LNP-제형화된 ssDNA- 및 ceDNA-매개 장기간 FVIII 발현의 평가.
5 주령 내지 12 주령의 HemA 마우스에 IV 주사를 통해 5, 10, 20, 40, 100 ug/마우스(N= 4 마리/그룹)로 LNP-ssDNA, LNP-ceDNA, 또는 LNP-pDNA(플라스미드 대조)가 투여될 것이다. 혈액 샘플은 최대 6 개월 동안 주사 후 48 시간째에 시작하여 선택된 시점에 수집될 것이고, 혈액 내 FVIII 활성은 발색 FVIII 활성 분석에 의해 분석될 것이다. LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA로 처리된 마우스에서 FVIII 발현 프로파일은 실시예 1 내지 실시예 4에 기재된 각 유전자 작제물에 대하여 LNP-pDNA로 처리된 마우스의 프로파일과 비교될 것이다.
실시예 6c. 보강 주사 후 ssDNA- 또는 ceDNA-매개 FVIII 발현의 생체내 평가.
실시예 6b에서 LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA로 처리된 마우스의 서브세트는 초기 주사 후 2 개월째에 동일한 용량으로, 상응하는 LNP의 추가 IV 주사 보강을 받을 것이다. 혈액 샘플은 보강 주사 후 48 시간째에 출발하여 6 개월까지, 선택된 시점에 수집될 것이다. 혈액 내 FVIII 활성은 발색 FVIII 활성 분석에 의해 분석될 것이다. LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA로 처리된 마우스에서 FVIII 발현 프로파일은 상응하는 LNP-pDNA로 처리된 마우스의 프로파일과 비교될 것이다.
실시예 7. 유전자 요법에서 일반적인 사용을 위한 B19 또는 GPV 기점의 ITR을 지니는 유전자 발현 작제물의 효용.
실시예 7a. B19 또는 GPV 기점의 ITR을 지니는 리포터 유전자 작제물의 생성.
유전자 요법 적용에서 일반적으로 사용하기 위한 플랫폼으로서의 비-AAV ITR-기반 유전자 발현 시스템의 효용을 입증하기 위해, 발현 카세트를 포함하는 리포터 작제물은 실시예 1b에 기재된 작제물에 기반한 B19d135 또는 GPVd162 ITR이 측접된 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 루시페라제(luc)에 대해 생성될 것이다. 따라서, B19-FVIIIco6XTEN(도 1c) 및 GPV-FVIIIco6XTEN(도 1d)에서 FVIII의 개방형 해독틀(ORF)은 통상적인 분자 클로닝 기술에 의해 GFP 또는 luc의 ORF로 대체될 것이다.
B19d135 또는 GPVd162 ITR이 측접된 발현 카세트는 또한 관련 마우스 모델에서 PAH 발현을 평가하는 데 사용될 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)에 대해 생성될 것이다.
실시예 7b. B19 또는 GPV 기점의 ITR을 지니는 ssDNA 리포터 유전자 작제물의 제조.
ssDNA 리포터/PAH 작제물은 실시예 1c에 기재된 바와 같이 제조될 것이다. 간략하게 말하면, 플라스미드는 LguI로 분해될 것이다. 95℃에서 LguI 분해의 이중-가닥 DNA 단편 산물(리포터 발현 카세트 및 플라스미드 골격)을 변성시킨 후, 4℃에서 냉각시켜 회문 ITR 서열이 폴딩되게 함으로써 헤어핀 ITR 구조가 형성된 ssDNA 단편이 생성될 것이다(도 1a). 생성된 ssDNA 작제물은 간, 근육 조직, 눈의 광수용체, 및 중추신경계(CNS)의 지속적인 형질도입을 형성시키는 능력에 대하여 마우스에서 시험될 것이다.
실시예 7c. ssDNA-매개 리포터 발현의 생체내 평가.
지속적인 전이유전자 생체내 발현을 매개하는 실시예 7b에 기재된 ssDNA 리포터 작제물의 능력을 입증하기 위해, 5 주령 내지 12 주령의 마우스(4 마리 동물/그룹)에게 5, 10, 또는 20 μg/마우스의 리포터 ssDNA가 전신으로 주사되고/되거나, 표적 근육 조직 및 CNS 세포에 국소적으로 주사되고/되거나, 표적 광 수용체 세포에 대해 망막하로 주사될 것이다.
B19 및 GPV ITR-기반 발현 작제물로부터 PAH의 발현을 평가하기 위해, 관련 질병 마우스 모델이 사용될 것이다. 이러한 유전자 작제물은 간을 표적화하기 위해 HDI에 의해 전신으로 전달될 것이다.
구현예
E1. 제1 역 말단 반복부(ITR), 제2 ITR, 및 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자로서; 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스(비-AAV)의 ITR이고, 유전자 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치하고, 치료적 단백질은 응고 인자를 포함하는, 핵산 분자.
E2. E1에 있어서, 비-AAV는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E3. E1 또는 E2에 있어서, 제1 ITR은 비-AAV의 ITR이고, 제2 ITR은 아데노-관련 바이러스(AAV)의 ITR이거나, 제1 ITR은 AAV의 ITR이고, 제2 ITR은 비-AAV의 ITR인, 핵산 분자.
E4. E1 또는 E2에 있어서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 비-AAV의 ITR인, 핵산 분자.
E5. E1, E2, 및 E4 중 어느 하나에 있어서, 제1 ITR과 제2 ITR은 동일한, 핵산 분자.
E6. E1 내지 E5 중 어느 하나에 있어서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 연속적인 회문 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E7. E1 내지 E5 중 어느 하나에 있어서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비연속적인 회문 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, 비-AAV는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원인, 핵산 분자.
E9. E8에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리스로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 및 펜스틸덴소바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E10. E8에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)인, 핵산 분자.
E11. E8에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 머스코비 오리 파르보바이러스(MDPV) 균주인, 핵산 분자.
E12. E11에 있어서, MDPV 균주는 약독화 FZ91-30인, 핵산 분자.
E13. E11에 있어서, MDPV 균주는 병원성 YY인, 핵산 분자.
E14. E8에 있어서, 데펜도파르보바이러스는 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주인, 핵산 분자.
E15. E14에 있어서, GPV 균주는 약독화 82-0321V인, 핵산 분자.
E16. E14에 있어서, GPV 균주는 병원성 B인, 핵산 분자.
E17. E8에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 돼지 파르보바이러스(U44978), 미세 생쥐 바이러스(U34256), 개 파르보바이러스(M19296), 및 밍크 장염 바이러스(D00765)로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E18. E1 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는 핵산 분자.
E19. E18에 있어서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터인, 핵산 분자.
E20. E18 또는 E19에 있어서, 프로모터는 간세포, 내피 세포, 근세포, 동모양 세포, 또는 이들의 임의의 조합에서 치료적 단백질의 발현을 유도하는, 핵산 분자.
E21. E18 또는 E19에 있어서, 프로모터는 간세포에서 치료적 단백질의 발현을 유도하는, 핵산 분자.
E22. E18 내지 E21 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는, 핵산 분자.
E23. E18 내지 E22 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-항트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK, 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E24. E18 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 TTP 프로모터를 포함하는, 핵산 분자.
E25. E1 내지 E24 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 인트론 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
E26. E25에 있어서, 인트론 서열은 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는, 핵산 분자.
E27. E25 또는 E26에 있어서, 인트론 서열은 프로모터에 대해 3'에 위치하는, 핵산 분자.
E28. E25 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 인트론 서열은 합성 인트론 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E29. E25 내지 E28 중 어느 하나에 있어서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 115를 포함하는, 핵산 분자.
E30. E1 내지 E29 중 어느 하나에 있어서, 유전자 카세트는 전사 후 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
E31. E30에 있어서, 전사 후 조절 요소는 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치하는, 핵산 분자.
E32. E30 또는 E31에 있어서, 전사 후 조절 요소는 돌연변이된 마멋 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), 마이크로RNA 결합 부위, DNA 핵 표적화 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 핵산 분자.
E33. E32에 있어서, 마이크로RNA 결합 부위는 miR142-3p에 대한 결합 부위를 포함하는, 핵산 분자.
E34. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, 유전자 카세트는 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
E35. E34에 있어서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E36. E34 또는 E35에 있어서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함하는, 핵산 분자.
E37. E1 내지 E36 중 어느 하나에 있어서, 유전자 카세트는 인핸서 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
E38. E37에 있어서, 인핸서 서열은 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치하는, 핵산 분자.
E39. E1 내지 E38 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자는 제1 ITR, 유전자 카세트, 및 제2 ITR의 순서로 이들을 포함하고; 유전자 카세트는 조직-특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열, 전사 후 조절 요소, 및 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E40. E39에 있어서, 유전자 카세트는 조직-특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, FVIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 전사 후 조절 요소, 및 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열의 순서로 이들을 포함하는, 핵산 분자.
E41. E38 또는 E39에 있어서,
(a) 제1 ITR은 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR이고;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열은 TTP 프로모터를 포함하고;
(c) 인트론은 합성 인트론이고;
(d) 뉴클레오타이드 서열은 응고 인자를 인코딩하고;
(e) 전사 후 조절 요소는 WPRE를 포함하고;
(f) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGHpA를 포함하고;
(g) 제2 ITR은 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 핵산.
E42. E1 내지 E41 중 어느 하나에 있어서, 유전자 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함하는, 핵산 분자.
E43. E1 내지 E41 중 어느 하나에 있어서, 유전자 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함하는, 핵산 분자.
E44. E1 내지 E43 중 어느 하나에 있어서, 응고 인자는 간세포, 내피 세포, 근세포, 동모양 세포, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 발현되는, 핵산 분자.
E45. E1 내지 E44 중 어느 하나에 있어서, 응고 인자는 인자 I(FI), 인자 II(FII), 인자 V(FV), 인자 VII(FVII), 인자 VIII(FVIII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 인자 XIII(FVIII), 폰 빌레브란트 인자(VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노젠, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성화제 저해제-2(PAI2), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 핵산 분자.
E46. E1 내지 E45 중 어느 하나에 있어서, 응고 인자는 FVIII를 포함하는, 핵산 분자.
E47. E46에 있어서, FVIII는 전장 성숙 FVIII를 포함하는, 핵산 분자.
E48. E47에 있어서, FVIII는 SEQ ID NO: 106을 갖는 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E49. E46에 있어서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, C1 도메인, C2 도메인을 포함하고, B 도메인을 일부만 포함하거나 포함하지 않는, 핵산 분자.
E50. E49에 있어서, FVIII는 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E51. E1 내지 E50 중 어느 하나에 있어서, 응고 인자는 이종 모이어티를 포함하는, 핵산 분자.
E52. E51에 있어서, 이종 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 영역, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩타이드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 알부민-결합 모이어티, 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E53. E51 또는 E52에 있어서, 이종 모이어티는 FVIII의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나 FVIII에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입되는, 핵산 분자.
E54. E53에 있어서, 이종 모이어티는 표 5에 열거된 삽입 부위로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2 개의 아미노산 사이에 삽입되는, 핵산 분자.
E55. E45 내지 E54 중 어느 하나에 있어서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 선택적인 B 도메인, 및 이종 모이어티를 추가로 포함하고, 이종 모이어티는 성숙 FVIII(SEQ ID NO: 106)에 상응하는 아미노산 745의 바로 다운스트림에 삽입되는, 핵산 분자.
E56. E53 내지 E55 중 어느 하나에 있어서, FVIII는 FcRn 결합 파트너를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
E57. E56에 있어서, FcRn 결합 파트너는 면역글로불린 불변 도메인의 Fc 영역을 포함하는, 핵산 분자.
E58. E45 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 코돈 최적화되는, 핵산 분자.
E59. E45 내지 E58 중 어느 하나에 있어서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 핵산 분자.
E60. E59에 있어서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 107의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E61. E59에 있어서, FVIII를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
E62. E1 내지 E61 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자는 전달제와 제형화되는, 핵산 분자.
E63. E62에 있어서, 전달제는 지질 나노입자를 포함하는, 핵산 분자.
E64. E63에 있어서, 전달제는 리포좀, 비-지질 중합체 분자, 엔도좀 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
E65. E1 내지 E64 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자는 정맥내, 경피, 피내, 피하, 폐, 또는 경구 전달, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 제형화되는, 핵산 분자.
E66. E65에 있어서, 핵산 분자는 정맥내 전달을 위해 제형화되는, 핵산 분자.
E67. E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
E68. E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드.
E69. E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
E70. (a) E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산, E67의 벡터, E68의 폴리펩타이드, 또는 E69의 숙주 세포; (b) LNP; 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
E71. E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자, 및 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
E72. E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템.
E73. E72에 있어서, E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자는 곤충 세포에서 생산되는, 바큘로바이러스 시스템.
E74. 발현 작제물을 위한 나노입자 전달 시스템으로서, 발현 작제물은 E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는, 나노입자 전달 시스템.
E75. 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 적합한 조건 하에서 E69의 숙주 세포를 배양하고, 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 회수하는 것을 포함하는 방법.
E76. 응고 인자를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법으로서, E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자, E67의 벡터, E68의 폴리펩타이드, 또는 E70의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
E77. 응고 인자 결핍을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, E1 내지 E66 중 어느 하나의 핵산 분자, E67의 벡터, E68의 폴리펩타이드, 또는 E70의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
E78. E76 또는 E77에 있어서, 핵산 분자는 정맥내로, 경피로, 피내로, 피하로, 경구로, 폐로, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여되는 방법.
E79. E78에 있어서, 핵산 분자는 정맥내로 투여되는 방법.
E80. E76 내지 E79 중 어느 하나에 있어서, 제2 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
E81. E76 내지 E80 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 포유류인 방법.
E82. E76 내지 E81 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
E83. E76 내지 E82 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 핵산 분자를 투여하는 것은 투여 전 대상체의 FVIII 활성에 비해서 증가된 FVIII 활성을 야기하며, FVIII 활성은 적어도 약 2 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 8 배, 적어도 약 9 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 11 배, 적어도 약 12 배, 적어도 약 13 배, 적어도 약 14 배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25 배, 적어도 약 30 배, 적어도 약 35 배, 적어도 약 40 배, 적어도 약 50 배, 적어도 약 60 배, 적어도 약 70 배, 적어도 약 80 배, 적어도 약 90 배, 적어도 약 100 배만큼 증가되는, 방법.
E84. E76 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 출혈 장애를 갖는, 방법.
E85. E84에 있어서, 출혈 장애는 혈우병인, 방법.
E86. E84 또는 E85에 있어서, 출혈 장애는 혈우병 A인, 방법.
E83. E76 내지 E82, E85, 및 E86 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 대한 핵산 분자의 투여는 투여 전 대상체의 FVIII 활성에 비해 증가된 FVIII 활성을 야기하고, FVIII 활성은 정상 FVIII 활성에 비해 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150% 증가되는 방법.
본 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 2017년 8월 9일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/543,297의 우선권을 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC. Seregin, Alexey Liu, Tongyao Patarroyo-White, Susannah Drager, Douglas Peters, Robert T. Liu, Jiayun <120> Nucleic Acid Molecules and Uses Thereof <130> 4159.493PC01/C-K/BMD <150> US 62/543,297 <151> 2017-08-09 <160> 184 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFVIII-5 <400> 1 atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60 acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120 ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc caaagtcgtt tccgttcaac 180 acctccgtgg tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240 gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300 gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360 ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420 gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480 aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540 gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 600 ggctcactgg cgaaagaaaa gactcagacc ttgcacaagt tcattctgct gttcgctgtg 660 ttcgacgagg ggaagtcgtg gcacagcgag actaagaact ccctgatgca agatagagat 720 gccgcctccg cccgggcctg gcctaagatg cacaccgtga acggttacgt gaaccgctcc 780 ctccctggcc tgattggatg ccaccggaag tccgtgtact ggcacgtgat cgggatgggg 840 accacccccg aggtgcacag catcttcctg gaaggtcaca catttctcgt gcgcaaccac 900 cggcaggcct ccctggaaat cagccccatt accttcctca ctgcccagac tctgctgatg 960 gacctgggac agttcctgct gttctgccat atctcctccc accaacatga cggaatggag 1020 gcatacgtga aggtcgattc ctgccctgag gaaccccagc tccgcatgaa gaacaatgag 1080 gaagccgagg actacgacga cgacctgacg gatagcgaga tggatgtggt ccggttcgat 1140 gacgataaca gcccttcctt catccaaatt cgctcggtgg caaagaagca ccccaagacc 1200 tgggtgcatt acattgcggc ggaagaagag gactgggatt atgccccgct tgtcctcgct 1260 cctgacgacc ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gtccacagag gatcggtaga 1320 aagtacaaga aggtccgctt catggcctat accgacgaaa ccttcaaaac tagagaggcc 1380 atccaacacg aatccggcat cctgggcccg ctcttgtacg gagaagtcgg cgacaccctt 1440 ctcattatct tcaagaacca ggcttcccgg ccgtacaaca tctatccgca tgggatcact 1500 gacgtgcgcc cactgtactc gcggcgcctg cccaagggtg tcaaacacct gaaggatttt 1560 ccgatccttc cgggagaaat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga agatggccca 1620 actaagtctg accctagatg cctcacccgc tactactcat ccttcgtcaa catggagcgc 1680 gacctggcca gcggactgat cggcccgctg ctgatttgct acaaggaatc agtggaccaa 1740 cggggaaacc agatcatgtc ggataagagg aacgtcatcc tcttctccgt gtttgacgaa 1800 aaccggtcgt ggtacctgac tgaaaacatc cagcggttcc tccccaaccc cgcgggcgtg 1860 cagctggaag atcctgagtt tcaggcatca aacatcatgc actccattaa cggctacgtg 1920 ttcgattcgc tgcagctgag cgtgtgtctg cacgaagtgg cctactggta catcctgtcc 1980 attggtgccc agactgactt cctgtccgtg tttttctccg gctacacgtt caagcacaag 2040 atggtgtacg aggacaccct gaccctcttc cctttttccg gcgaaactgt gtttatgagc 2100 atggagaatc ccggcctgtg gatcttgggc tgccacaaca gcgacttccg taacagagga 2160 atgactgcgc tgctcaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggagacta ttatgaggac 2220 tcatacgagg acatctccgc ctacctcctg tccaagaata acgccattga acctcggagc 2280 ttcagccaga acccacccgt gcttaagaga catcaacggg agatcactag gaccaccctg 2340 cagtcagacc aggaggaaat cgactacgat gacaccatct cggtcgagat gaagaaggag 2400 gactttgaca tctacgacga agatgaaaac cagagcccga ggtcgttcca aaagaaaacc 2460 cgccactact ttattgctgc tgtcgagcgg ctgtgggact acggaatgtc gtcctcgccg 2520 cacgtgctcc gcaaccgagc ccagagcggc tcggtgccgc aattcaagaa ggtcgtgttc 2580 caggagttca ctgacgggag cttcactcag cctttgtacc ggggagaact caatgaacat 2640 ctcggcctcc tcggacctta catcagagca gaagtggaag ataacatcat ggtcactttc 2700 cgtaaccaag ccagccgccc gtactcgttc tactcctccc tcatttctta cgaagaggac 2760 cagcggcagg gcgcagaacc gcgcaagaac ttcgtgaagc ccaacgaaac caagacctac 2820 ttctggaaag tgcagcatca tatggccccg actaaggacg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcctacttct ccgatgtgga cttggagaag gacgtccact ccggcctcat cggtcccctg 2940 ctcgtgtgcc ataccaatac cctgaacccc gcacacggtc gccaggtcac cgtgcaggag 3000 ttcgctctgt tcttcactat cttcgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaacatg 3060 gagaggaact gcagagcccc ctgtaacatc cagatggagg acccgacgtt caaggaaaac 3120 taccggttcc acgccattaa cggatacatc atggatacgc tgccgggtct tgtgatggcc 3180 caggatcaac ggatcagatg gtacttattg tcgatgggca gcaacgagaa catccactct 3240 attcacttct ccggtcatgt gttcactgtg cggaagaagg aagagtacaa gatggccctg 3300 tacaaccttt atcccggagt gttcgaaact gtggaaatgc tgccgtcgaa ggccggcatt 3360 tggcgcgtgg agtgtttgat tggagaacat ctccatgcgg ggatgtcaac cctgttcctg 3420 gtgtatagca acaagtgcca gactccgctt gggatggcgt caggacacat tagggatttc 3480 cagatcactg cgtccggcca gtacggccaa tgggccccta agctggcccg cctgcattac 3540 tccggatcca ttaacgcctg gtcaaccaag gagccattct cctggatcaa ggtggacctt 3600 ctggccccca tgattatcca cggaattaag acccaggggg cccggcagaa gttctcctca 3660 ctgtacatca gccagttcat aatcatgtac tccctggacg gaaagaagtg gcaaacctac 3720 agggggaaca gcaccggcac actgatggtc tttttcggaa atgtggactc ctccgggatt 3780 aagcataaca tcttcaaccc tccgattatc gctcggtaca ttagacttca ccctacccac 3840 tacagcattc gctccaccct gcggatggaa ctgatgggct gcgatctgaa ctcgtgcagc 3900 atgccgttgg gaatggagtc caaagcaatt tccgacgcgc agatcaccgc ctcgtcctac 3960 tttaccaaca tgttcgccac gtggtcaccg tccaaggccc ggctgcacct ccagggaaga 4020 tccaacgcat ggcggccaca ggtcaacaac cctaaggagt ggctccaggt ggacttccag 4080 aaaaccatga aggtcaccgg agtcacaacc cagggagtga agtcgctgct gacttctatg 4140 tacgtcaagg agttcctgat ctccagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200 caaaatggaa aggtcaaggt gtttcagggc aatcaggatt cattcacccc ggtggtgaac 4260 tcccttgatc cacccctcct gacccgctac cttcgcatcc acccacagtc ctgggtgcac 4320 cagatcgcgc tgaggatgga ggtcctggga tgcgaagccc aggacctgta ctga 4374 <210> 2 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFVIII-4 <400> 2 atgcagatcg agctgagcac gtgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttcagcgcc 60 accaggaggt actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gagcgacctg 120 ggcgagctgc ccgtggacgc caggttcccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaac 180 acgagcgtgg tgtacaagaa gaccctgttc gtggagttca ccgaccatct gttcaatatc 240 gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggccca cgatccaggc cgaggtgtac 300 gacaccgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360 ggcgtgagct actggaaggc cagcgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagagg 420 gagaaggagg acgacaaggt gttccccggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaatg ggcccatggc cagcgacccc ctgtgcctga cctactctta cctgagccac 540 gtggatctgg tgaaggacct gaacagcggc ctgatcggcg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660 ttcgacgagg gcaagagctg gcacagcgag accaagaaca gcctgatgca ggatagggac 720 gccgccagcg ccagggcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacaggtct 780 ctgcccggcc tgatcggctg ccacaggaag agcgtgtact ggcacgtgat cggcatgggg 840 accacccccg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca cgttcctggt gaggaatcac 900 aggcaggcca gcctggagat cagcccgatc accttcctga ccgcccagac cctgctgatg 960 gacctggggc agttcctgct gttctgccat atcagctctc accagcacga cggcatggag 1020 gcctacgtga aggtggatag ctgccccgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080 gaggccgagg actacgacga cgacctgacc gacagcgaga tggacgtggt gaggttcgac 1140 gacgacaata gcccgagctt catccagatc aggagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200 tgggtgcatt acatcgccgc cgaggaggag gattgggact acgcccccct ggtgctggcc 1260 cccgacgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaacaacg ggccccagag gatcggcagg 1320 aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac accgacgaga ccttcaagac cagggaggcg 1380 atccagcacg agagcgggat cctggggccc ctgctgtacg gcgaggtggg cgacacgctg 1440 ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccgtacaata tctaccccca cgggatcacc 1500 gacgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cccaagggcg tgaagcacct gaaggacttc 1560 cccatcctgc ccggcgagat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga ggacgggccc 1620 acgaagagcg accccaggtg cctgaccagg tactacagct ctttcgtgaa catggagagg 1680 gacctggcca gcggcctgat cgggcccctg ctgatctgct acaaggagag cgtggatcag 1740 aggggcaacc agatcatgag cgacaagagg aacgtgatcc tgttcagcgt gttcgacgag 1800 aataggtctt ggtacctgac cgagaatatc cagaggttcc tgcccaaccc cgccggcgtg 1860 cagctggagg atcccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa cggctacgtg 1920 ttcgacagcc tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttcagcg gctacacctt caagcacaag 2040 atggtgtacg aggataccct gaccctgttc cccttcagcg gcgagaccgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgccataact ccgacttcag gaataggggc 2160 atgaccgccc tgctgaaggt gagctcttgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggat 2220 agctacgagg atatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca acgccatcga gcccaggtct 2280 ttcagccaga acccccccgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gacgaccctg 2340 cagagcgacc aggaggagat cgactacgac gacacgatca gcgtggagat gaagaaggag 2400 gatttcgaca tctacgacga ggacgagaat cagagcccca ggtctttcca gaagaagacc 2460 aggcattact tcatcgccgc cgtggagagg ctgtgggact acggcatgag cagctctccc 2520 cacgtgctga ggaatagggc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580 caggagttca ccgacggcag cttcacccag cccctgtaca ggggcgagct gaacgagcac 2640 ctgggcctgc tggggcccta catcagggcc gaggtggagg ataacatcat ggtgaccttc 2700 aggaatcagg ccagcaggcc ctatagcttc tatagctctc tgatcagcta cgaggaggat 2760 cagaggcagg gcgccgagcc caggaagaac ttcgtgaagc ccaacgagac caagacctac 2820 ttctggaagg tgcagcacca catggccccc acgaaggacg agttcgactg caaggcctgg 2880 gcctacttca gcgacgtgga tctggagaag gacgtgcaca gcggcctgat cgggcccctg 2940 ctggtgtgcc acaccaacac cctgaacccc gcccacggca ggcaggtgac cgtgcaggag 3000 ttcgccctgt tcttcaccat cttcgacgag accaagagct ggtacttcac cgagaatatg 3060 gagaggaatt gcagggcccc ctgcaatatc cagatggagg acccgacctt caaggagaat 3120 tacaggttcc acgccatcaa cggctacatc atggacacgc tgcccggcct ggtcatggcc 3180 caggatcaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggga gcaacgagaa tatccacagc 3240 atccacttca gcggccacgt gttcaccgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300 tacaatctgt accccggcgt gttcgagacc gtggagatgc tgcccagcaa ggccgggatc 3360 tggagggtgg agtgcctgat cggcgagcac ctgcacgccg gcatgagcac gctgttcctg 3420 gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg gggatggcca gcggccacat cagggacttc 3480 cagatcaccg ccagcggcca gtacggccag tgggccccca agctggccag gctgcactat 3540 tccggaagca tcaacgcctg gagcacgaag gagcccttca gctggatcaa ggtggatctg 3600 ctggccccca tgatcatcca cgggatcaag acccagggcg ccaggcagaa gttcagctct 3660 ctgtatatca gccagttcat catcatgtac tctctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720 aggggcaaca gcaccggcac gctgatggtg ttcttcggca acgtggactc tagcgggatc 3780 aagcacaata 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tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240 gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300 gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360 ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420 gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480 aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540 gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 600 ggctcactgg cgaaagaaaa gactcagacc ttgcacaagt tcattctgct gttcgctgtg 660 ttcgacgagg ggaagtcgtg gcacagcgag actaagaact ccctgatgca agatagagat 720 gccgcctccg cccgggcctg gcctaagatg cacaccgtga acggttacgt gaaccgctcc 780 ctccctggcc tgattggatg ccaccggaag tccgtgtact ggcacgtgat cgggatgggg 840 accacccccg aggtgcacag catcttcctg gaaggtcaca catttctcgt gcgcaaccac 900 cggcaggcct ccctggaaat cagccccatt accttcctca ctgcccagac tctgctgatg 960 gacctgggac agttcctgct gttctgccat atctcctccc accaacatga cggaatggag 1020 gcatacgtga aggtcgattc 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Sequence <220> <223> XTEN AE42-4, protein sequence <400> 46 Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala 20 25 30 Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser 35 40 <210> 47 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XTEN AE42-4, DNA sequence <400> 47 ggcgcgccag gttctcctgc tggctccccc acctcaacag aagaggggac aagcgaaagc 60 gctacgcctg agagtggccc tggctctgag ccagccacct ccggctctga aacccctgcc 120 tcgagc 126 <210> 48 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XTEN AE144-2A, protein sequence <400> 48 Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly 1 5 10 15 Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly 20 25 30 Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly 35 40 45 Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu 50 55 60 Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Gly Pro Gly 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gatgggactg ctggggccaa caatccaggc cgaggtgtac 300 gacaccgtgg tcattacact taagaacatg gcctcacacc ccgtgagcct gcatgctgtg 360 ggcgtcagct actggaaggc ttccgaagga gcagagtatg acgatcagac ttcccagaga 420 gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc ggatctcata cctacgtgtg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gccctatggc ctccgaccct ctgtgcctga cctactctta tctgagtcac 540 gtggacctgg tcaaggatct gaacagcggc ctgatcggag ccctgctggt gtgcagggaa 600 ggaagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagt tcattctgct gttcgccgtg 660 tttgacgaag ggaaatcatg gcacagcgag acaaagaata gtctgatgca ggacagggat 720 gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtga acggctacgt caatcgctca 780 ctgcctgggc tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtatt ggcatgtcat cgggatgggc 840 accacacctg aagtgcactc cattttcctg gagggacata cctttctggt ccgcaaccac 900 cgacaggctt ccctggagat ctctccaatt accttcctga cagcacagac tctgctgatg 960 gacctggggc agttcctgct gttttgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020 gcttacgtga aagtggactc ttgtcccgag gaacctcagc tgcggatgaa gaacaatgag 1080 gaagcagaag actatgacga tgacctgacc 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPV-FVIII construct <400> 182 cggtgacgtg tttccggctg ttaggttgac cacgcgcatg ccgcgcggtc agcccaatag 60 ttaagccgga aacacgtcac cggaagtcac atgaccggaa gtcacgtgac cggaaacacg 120 tgacaggaag cacgtgaccg gaactacgtc accggatgtg cgtcaccgga agcatgtgac 180 cggaacttgc gtcacttccc cctcccctga ttggctggtt cgaacgaacg aaccctccaa 240 tgagactcaa ggacaagagg atattttgcg cgccaggaag tggcggcaat tcagtcgata 300 actataacgg tcctaaggta gcgatttaaa tacgcgctct cttaaggtag ccccgggacg 360 cgtcaattga gatctggatc cggtaccgaa ttcgcggccg cctcgacgac tagcgtttaa 420 ttaaacgcgt gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct 480 aggcaaggtt catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc 540 agaatcagca ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg 600 gtataaaagc cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctgaggtaag 660 tgccgtgtgt ggttcccgcg ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg 720 aattactgac actgacatcc actttttctt tttctccaca gctagcgcca ccatgcagat 780 tgagctgtcc 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tccatcttcc tggaagggca caccttcctc gtgcgcaacc accgccaggc 1680 ctctctggaa atctccccga ttacctttct gaccgcccag actctgctca tggacctggg 1740 gcagttcctt ctcttctgcc acatctccag ccatcagcac gacggaatgg aggcctacgt 1800 gaaggtggac tcatgcccgg aagaacctca gttgcggatg aagaacaacg aggaggccga 1860 ggactatgac gacgatttga ctgactccga gatggacgtc gtgcggttcg atgacgacaa 1920 cagccccagc ttcatccaga ttcgcagcgt ggccaagaag caccccaaaa cctgggtgca 1980 ctacatcgcg gccgaggaag aagattggga ctacgccccg ttggtgctgg cacccgatga 2040 ccggtcgtac aagtcccagt atctgaacaa tggtccgcag cggattggca gaaagtacaa 2100 gaaagtgcgg ttcatggcgt acactgacga aacgtttaag acccgggagg ccattcaaca 2160 tgagagcggc attctgggac cactgctgta cggagaggtc ggcgataccc tgctcatcat 2220 cttcaaaaac caggcctccc ggccttacaa catctaccct cacggaatca ccgacgtgcg 2280 gccactctac tcgcggcgcc tgccgaaggg cgtcaagcac ctgaaagact tccctatcct 2340 gccgggcgaa atcttcaagt ataagtggac cgtcaccgtg gaggacgggc ccaccaagag 2400 cgatcctagg tgtctgactc ggtactactc cagcttcgtg aacatggaac gggacctggc 2460 atcgggactc attggaccgc tgctgatctg ctacaaagag tcggtggatc aacgcggcaa 2520 ccagatcatg tccgacaagc gcaacgtgat cctgttctcc gtgtttgatg aaaacagatc 2580 ctggtacctc actgaaaaca tccagaggtt cctcccaaac cccgcaggag tgcaactgga 2640 ggaccctgag tttcaggcct cgaatatcat gcactcgatt aacggttacg tgttcgactc 2700 gctgcaactg agcgtgtgcc tccatgaagt cgcttactgg tacattctgt ccatcggcgc 2760 ccagactgac ttcctgagcg tgttcttttc cggttacacc tttaagcaca agatggtgta 2820 cgaagatacc ctgaccctgt tccctttctc cggcgaaacg gtgttcatgt cgatggagaa 2880 cccgggtctg tggattctgg gatgccacaa cagcgacttt cggaaccgcg gaatgactgc 2940 cctgctgaag gtgtcctcat gcgacaagaa caccggagac tactacgagg actcctacga 3000 ggatatctca gcctacctcc tgtccaagaa caacgcgatc gagccgcgca gcttcagcca 3060 gaacggcgcg ccaacatcag agagcgccac ccctgaaagt ggtcccggga gcgagccagc 3120 cacatctggg tcggaaacgc caggcacaag tgagtctgca actcccgagt ccggacctgg 3180 ctccgagcct gccactagcg gctccgagac tccgggaact tccgagagcg ctacaccaga 3240 aagcggaccc ggaaccagta ccgaacctag cgagggctct gctccgggca gcccagccgg 3300 ctctcctaca tccacggagg agggcacttc cgaatccgcc accccggagt cagggccagg 3360 atctgaaccc gctacctcag gcagtgagac gccaggaacg agcgagtccg ctacaccgga 3420 gagtgggcca gggagccctg ctggatctcc tacgtccact gaggaagggt caccagcggg 3480 ctcgcccacc agcactgaag aaggtgcctc gagcccgcct gtgctgaaga ggcaccagcg 3540 agaaattacc cggaccaccc tccaatcgga tcaggaggaa atcgactacg acgacaccat 3600 ctcggtggaa atgaagaagg aagatttcga tatctacgac gaggacgaaa atcagtcccc 3660 tcgctcattc caaaagaaaa ctagacacta ctttatcgcc gcggtggaaa gactgtggga 3720 ctatggaatg tcatccagcc ctcacgtcct tcggaaccgg gcccagagcg gatcggtgcc 3780 tcagttcaag aaagtggtgt tccaggagtt caccgacggc agcttcaccc agccgctgta 3840 ccggggagaa ctgaacgaac acctgggcct gctcggtccc tacatccgcg cggaagtgga 3900 ggataacatc atggtgacct tccgtaacca agcatccaga ccttactcct tctattcctc 3960 cctgatctca tacgaggagg accagcgcca aggcgccgag ccccgcaaga acttcgtcaa 4020 gcccaacgag actaagacct acttctggaa ggtccaacac catatggccc cgaccaagga 4080 tgagtttgac tgcaaggcct gggcctactt ctccgacgtg gaccttgaga aggatgtcca 4140 ttccggcctg atcgggccgc tgctcgtgtg tcacaccaac accctgaacc cagcgcatgg 4200 acgccaggtc accgtccagg agtttgctct gttcttcacc atttttgacg aaactaagtc 4260 ctggtacttc accgagaata tggagcgaaa ctgtagagcg ccctgcaata tccagatgga 4320 agatccgact ttcaaggaga actatagatt ccacgccatc aacgggtaca tcatggatac 4380 tctgccgggg ctggtcatgg cccaggatca gaggattcgg tggtacttgc tgtcaatggg 4440 atcgaacgaa aacattcact ccattcactt ctccggtcac gtgttcactg tgcgcaagaa 4500 ggaggagtac aagatggcgc tgtacaatct gtaccccggg gtgttcgaaa ctgtggagat 4560 gctgccgtcc aaggccggca tctggagagt ggagtgcctg atcggagagc acctccacgc 4620 ggggatgtcc accctcttcc tggtgtactc gaataagtgc cagaccccgc tgggcatggc 4680 ctcgggccac atcagagact tccagatcac agcaagcgga caatacggcc aatgggcgcc 4740 gaagctggcc cgcttgcact actccggatc gatcaacgca tggtccacca aggaaccgtt 4800 ctcgtggatt aaggtggacc tcctggcccc tatgattatc cacggaatta agacccaggg 4860 cgccaggcag aagttctcct ccctgtacat ctcgcaattc atcatcatgt acagcctgga 4920 cgggaagaag tggcagactt acaggggaaa ctccaccggc accctgatgg tctttttcgg 4980 caacgtggat tcctccggca ttaagcacaa catcttcaac ccaccgatca tagccagata 5040 tattaggctc caccccactc actactcaat ccgctcaact cttcggatgg aactcatggg 5100 gtgcgacctg aactcctgct ccatgccgtt ggggatggaa tcaaaggcta ttagcgacgc 5160 ccagatcacc gcgagctcct acttcactaa catgttcgcc acctggagcc cctccaaggc 5220 caggctgcac ttgcagggac ggtcaaatgc ctggcggccg caagtgaaca atccgaagga 5280 atggcttcaa gtggatttcc aaaagaccat gaaagtgacc ggagtcacca cccagggagt 5340 gaagtccctt ctgacctcga tgtatgtgaa ggagttcctg attagcagca gccaggacgg 5400 gcaccagtgg accctgttct tccaaaacgg aaaggtcaag gtgttccagg ggaaccagga 5460 ctcgttcaca cccgtggtga actccctgga ccccccactg ctgacgcggt acttgaggat 5520 tcatcctcag tcctgggtcc atcagattgc attgcgaatg gaagtcctgg gctgcgaggc 5580 ccaggacctg tactgaatca gcctgagctc gctgatcata atcaacctct ggattacaaa 5640 atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 5700 gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 5760 ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 5820 ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 5880 tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 5940 gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 6000 gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 6060 ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 6120 cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 6180 cggatctccc tttgggccgc ctccccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 6240 gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 6300 tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 6360 tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 6420 tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaacgggct cgagaagctt 6480 ctagatatcc tctcttaagg tagcatcgag atttaaatta gggataacag ggtaatggcg 6540 cgggccgcca cttcctggcg cgcaaaatat cctcttgtcc ttgagtctca ttggagggtt 6600 cgttcgttcg aaccagccaa tcaggggagg gggaagtgac gcaagttccg gtcacatgct 6660 tccggtgacg cacatccggt gacgtagttc cggtcacgtg cttcctgtca cgtgtttccg 6720 gtcacgtgac ttccggtcat gtgacttccg gtgacgtgtt tccggcttaa ctattgggct 6780 gaccgcgcgg catgcgcgtg gtcaacctaa cagccggaaa cacgtcaccg 6830 <210> 183 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' ITR <400> 183 cggtgacgtg tttccggctg ttaggttgac cacgcgcatg ccgcgcggtc agcccaatag 60 ttaagccgga aacacgtcac cggaagtcac atgaccggaa gtcacgtgac cggaaacacg 120 tgacaggaag cacgtgaccg gaactacgtc accggatgtg cgtcaccgga agcatgtgac 180 cggaacttgc gtcacttccc cctcccctga ttggctggtt cgaacgaacg aaccctccaa 240 tgagactcaa ggacaagagg atattttgcg cgccaggaag tg 282 <210> 184 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' ITR inverted terminal repeat <400> 184 cggtgacgtg tttccggctg ttaggttgac cacgcgcatg ccgcgcggtc agcccaatag 60 ttaagccgga aacacgtcac cggaagtcac atgaccggaa gtcacgtgac cggaaacacg 120 tgacaggaag cacgtgaccg gaactacgtc accggatgtg cgtcaccgga agcatgtgac 180 cggaacttgc gtcacttccc cctcccctga ttggctggtt cgaacgaacg aaccctccaa 240 tgagactcaa ggacaagagg atattttgcg cgccaggaag tg 282

Claims (21)

  1. 제1 역 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR), 제2 ITR, 및 유전자 카세트를 포함하는 핵산 분자로서,
    제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-관련 바이러스(비-AAV)의 ITR이고, 유전자 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치하고, 유전자 카세트는 치료적 단백질, miRNA, 또는 치료적 단백질과 miRNA 둘 모두를 인코딩하는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 치료적 단백질은 응고 인자를 포함하는, 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비-AAV는 바이러스 패밀리 파르보바이러스과(Parvoviridae)의 일원으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 비-AAV의 ITR인, 핵산 분자.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 보카바이러스(Bocavirus), 데펜도바이러스(Dependovirus), 에리스로바이러스(Erythrovirus), 암도바이러스(Amdovirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus), 콘트라바이러스(Contravirus), 아베파르보바이러스(Aveparvovirus), 코피파르보바이러스(Copiparvovirus), 프로토파르보바이러스(Protoparvovirus), 테트라파르보바이러스(Tetraparvovirus), 암비덴소바이러스(Ambidensovirus), 브레비덴소바이러스(Brevidensovirus), 헤판덴소바이러스(Hepandensovirus), 펜스틸덴소바이러스 머스코비 오리 파르보바이러스(Penstyldensovirus Muscovy duck parvovirus: MDPV) 균주, 돼지 파르보바이러스(U44978), 미세 생쥐 바이러스(U34256), 개 파르보바이러스(M19296), 및 밍크 장염 바이러스(D00765)로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과의 일원은 에리스로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)인, 핵산 분자.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 패밀리 파르보바이러스과는 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주인, 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조직-특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 프로모터는 간세포, 내피 세포, 근세포, 동모양 세포, 또는 이들의 임의의 조합에서 치료적 단백질의 발현을 유도하는, 핵산 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 프로모터는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-항트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK, 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은
    (a) 인트론 서열,
    (b) 전사 후 조절 요소,
    (c) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열,
    (d) 인핸서 서열, 또는
    (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) 인트론 서열은 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하거나;
    (b) 전사 후 조절 요소는 돌연변이된 마멋 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), 마이크로RNA 결합 부위, DNA 핵 표적화 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나;
    (c) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    (d) (a) 내지 (c)의 임의의 조합인, 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    (a) 인트론 서열은 SEQ ID NO: 115를 포함하거나;
    (b) 마이크로RNA 결합 부위는 miR142-3p에 대한 결합 부위를 포함하거나;
    (c) 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함하거나;
    (d) (a) 내지 (c)의 임의의 조합인, 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제1 ITR;
    (b) TTP 프로모터를 포함하는, 조직 특이적 프로모터 서열;
    (c) 합성 인트론인, 인트론;
    (d) 응고 인자를 인코딩하는, 뉴클레오타이드 서열;
    (e) WPRE를 포함하는, 전사 후 조절 요소;
    (f) bGHpA를 포함하는, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열; 및
    (g) 파르보바이러스과의 비-AAV 패밀리 일원의 ITR인, 제2 ITR
    의 순서로 이들을 포함하는, 핵산 분자.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 I(FI), 인자 II(FII), 인자 V(FV), 인자 VII(FVII), 인자 VIII(FVIII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 인자 XIII(FVIII), 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand factor: VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노젠, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성화제 저해제-2(PAI2), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, FVIII는 SEQ ID NO: 71, 106, 107, 및 109로부터 선택된 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 영역, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩타이드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 알부민-결합 모이어티, 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 이종 모이어티를 포함하는, 핵산 분자.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII는 FcRn 결합 파트너를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 지질 나노입자를 포함하는 전달제와 제형화되는, 핵산 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 응고 인자를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법으로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제20항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
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