RU2004110239A - Модифицированный фактор ix - Google Patents

Claims (16)

1. Модифицированная молекула, обладающая биологической активностью фактора IX человека и являющаяся существенно неиммуногенной или менее иммуногенной, чем любая немодифицированная молекула, которая имеет такую же биологическую активность при использовании in vivo, в которой потеря иммуногенности достигается заменой 1-9 аминокислотных остатков в любом из исходно присутствующих эпитопов Т-клеток, как это показано в таблице 2 так, чтобы осуществлялось удаление одного или нескольких эпитопов Т-клеток, происходящих от исходной немодифицированной молекулы.

2. Молекула по п.1, в которой указанные изначально присутствующие эпитопы Т-клеток являются лигандами класса II МНС или пептидными последовательностями, которые демонстрируют способность стимулировать или связывать Т-клетки через презентацию на классе II.

3. Молекула по п.2, в которой указанные пептидные последовательности выбраны из группы, как представлено в таблице 1.

4. Молекула по п.1 или 2, в которой один аминокислотный остаток изменен.

5. Молекула по п.1 или 2, в которой дополнительно одна или более аминокислотных замен выполнены так, как показано в таблице 3, для уменьшения числа аллотипов МНС, способных к связыванию пептидов, имеющих происхождение от указанной молекулы.

6. Модифицированная молекула по п.1 или 2, в которой изменение аминокислоты осуществляют в соответствии со способами моделирования in silico.

7. Модифицированная молекула по п.1 или 2, которая содержит меньше 100% аминокислот, идентичных к соответствующей последовательности белка дикого типа, и обнаруживает индекс стимуляции меньше 2,0, при тестировании с помощью анализа на Т-клетках.

8. Модифицированная молекула по п.1 или 2, которая при тестировании в анализе на Т-клетках обнаруживает уменьшенный индекс стимуляции по сравнению с немодифицированной белковой молекулой.

9. Последовательность ДНК, кодирующая модифицированную молекулу фактора IX человека по п.1 или 2.

10. Фармацевтическая композиция, включающая модифицированную молекулу, обладающую биологической активностью фактора IX человека, как определено в п.1 или 2, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

11. Способ получения модифицированной молекулы, обладающей биологической активностью фактора IX человека, как определено в п.1 или 2, который включает следующие этапы:

(i) определение аминокислотной последовательности полипептида или его части;

(ii) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности белка с помощью любого метода, предполагающего определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов;

(iii) конструирование вариантов с новыми последовательностями с одной или более аминокислотами в пределах идентифицированных потенциальных эпитопов Т-клеток, модифицированных путем замещения, добавления или делеции 1-9 аминокислотных остатков в любом из первоначально имеющихся эпитопов Т-клеток, как определено связыванием пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологическими анализами, или путем связывания комплексов пептид-МНС с Т-клетками;

(iv) конструирование таких вариантов последовательности с помощью способов рекомбинантной ДНК и тестирование таких вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желательными свойствами; и

(v) необязательное повторение этапов (ii)-(iv).

12. Способ по п.11, в котором этап (ii) выполняют с помощью следующих этапов: (а) отбора участка пептида, имеющего известную последовательность аминокислотных остатков; (b) последовательного отбора аминокислотных сегментов перекрывающихся участков с предварительно определенным одинаковым размером и состоящих по крайней мере из трех аминокислотных остатков выбранного участка; (с) подсчет значения связывания молекулы класса II МНС для каждого выборочного сегмента путем суммирования определенных значений для каждой гидрофобной аминокислотной боковой цепи, которая присутствует в каждом дискретном сегменте аминокислотных остатков; и (d) идентификацию по крайней мере одного из указанных сегментов, подходящего для модификации, основываясь на подсчитанной величине связывания молекулы класса II МНС для этого сегмента для изменения общего значения связывания МНС класса II для пептида, без существенного уменьшения терапевтической полезности пептида.

13. Способ по п.12, в котором этап (с) выполняют при использовании счетной функции Bohm, модифицированной для включения 12-6 лиганд-протеиновой энергии отталкивания Ван дер Ваальса и лиганд-конформационной энергии путем (1) обеспечения первой базы данных моделей молекулы класса II МНС; (2) обеспечения второй базы данных возможных пептидных скелетов для моделей молекул указанного класса II МНС; (3) отбора модели из указанной первой базы данных; (4) отбора возможного пептидного скелета из указанной второй базы данных; (5) идентификации боковых цепей аминокислотных остатков, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; (6) определения значения связывающего сродства для всех боковых цепей, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; и повторение этапов от (1) до (5) для каждой указанной модели и каждого указанного скелета.

14. Тринадцатимерный пептид эпитопа Т-клеток с пептидной последовательностью, состоящей по крайней мере из 9 соприкасающихся аминокислотных остатков, имеющий потенциальную связывающую активность класса II МНС и созданный из немодифицированного фактора IX человека, выбранный из группы, как показано в таблице 1.

15. Пептидная последовательность по п.14, которая проявляет индекс стимуляции больше 2,0, при исследовании путем анализа на Т-клетках.

16. Применение пептидной последовательности по п.15 для приготовления модифицированной молекулы фактора IX человека, которая существенно не имеет иммуногенности или имеет меньшую иммуногенность, чем любая немодифицированная молекула дикого типа с той же биологической активностью, при использовании in vivo.