BR112019015569A2

BR112019015569A2 - Proteínas de fusão do fator ix e métodos para a sua produção e uso

Info

Publication number: BR112019015569A2
Application number: BR112019015569-4A
Authority: BR
Inventors: Van Der Flier Arjan; Liu Zhiqian; R. Light David; Seth Chhabra Ekta; Liu Tongyao; T. Peters Robert; Kulman John; ISMAIL Ayman
Original assignee: Bioverativ Therapeutics Inc.
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2020-03-17
Also published as: IL268234A; MA47416A; PH12019501765A1; AU2018215092A1; EP3576762A1; CL2019002155A1; WO2018144623A1; AR110871A1; TW201831521A; EA201991768A1; CN110831613A; MX2019009063A; US20210238259A1; CA3051862A1; KR20190112763A; SG11201906788XA; JP2020505424A; CR20190389A

Abstract

a presente invenção fornece proteínas de fusão do fator ix (fix) compreendendo pelo menos um componente heterólogo, tal como um xten. a presente invenção ainda divulga métodos de produção e uso das proteínas de fusão do fix.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA POR MEIO ELETRÔNICO [001] O conteúdo da listagem de sequências apresentado por meio eletrônico em arquivo de texto ASCII (Nome: SA9_456_Sequence Listing.txt; Tamanho: 712.364 bytes; e Data da Criação: 15 de Julho de 2019) depositado com o pedido é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES [002] A hemofilia B (também conhecida como doença de Christmas) é um dos distúrbios hemorrágicos hereditários mais comuns em todo o mundo. Isso resulta em diminuição da atividade de coagulação do sangue in vivo e in vitro e requer monitoramento médico extensivo durante toda a vida do indivíduo afetado. Na ausência de intervenção, o indivíduo afligido irá sofrer de hemorragia espontânea nas articulações, o que produz dor grave e debilitação da imobilidade; sangramento nos músculos resulta no acúmulo de sangue nesses tecidos; hemorragia espontânea na garganta e no pescoço podem provocar asfixia se não for tratada imediatamente; hemorragia renal; e hemorragia grave após cirurgia, lesões acidentais secundárias, ou extrações dentárias também são predominantes.

[003] A coagulação do sangue normal in vivo no mínimo requer Fatores II (protrombina), VII, IX, X e XI de serina proteases (proteínas do plasma solúvel); cofatores incluindo o fator de tecido de proteína da transmembrana e as proteínas do plasma Fatores V e VIII; fibrinogênio, o Fator XIII da transglutaminase, fosfolipídeo (incluindo plaquetas ativadas), e cálcio. As proteínas adicionais incluindo calicreína, cininogênio de elevado peso molecular e Fator XII são necessárias para al

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2/203 guns testes de coagulação in vitro, e podem desempenhar um papel in vivo sob condições patológicas.

[004] Na hemofilia, a coagulação do sangue é perturbada por uma falta de certos fatores de coagulação do sangue do plasma. A hemofilia B é provocada por uma deficiência no Fator IX (FIX), que pode resultar da síntese diminuída ou da ausência da proteína do FIX ou uma molécula de defeituosa com atividade reduzida. O tratamento da hemofilia ocorre através da substituição do fator de coagulação ausente por concentrados de fator exógeno altamente enriquecidos com FIX. No entanto, a geração de um tal concentrado de sangue é carregado de dificuldades técnicas, como é descrito abaixo.

[005] A purificação do FIX a partir do plasma (FIX derivado do plasma; pdFIX) quase exclusivamente produz FIX completamente γcarboxilado. No entanto, essa purificação de FIX do plasma é muito difícil porque o FIX só está presente em baixa concentração no plasma (5 pg/ml). Andersson, Thrombosis Research 7: 451 459 (1975). Além disso, a purificação do sangue requer a remoção ou inativação de agentes infecciosos tais como HIV e HCV. Além disso, o pdFIX possui uma meia-vida curta e, portanto, requer uma dosagem frequente. O Fator IX recombinante (rFIX) também está disponível, mas sofre da mesma meia-vida curta e necessita de dosagem frequente (por exemplo, 2 a 3 vezes por semana para profilaxia) como o pdFIX.

[006] Mortalidade reduzida, prevenção de lesões nas articulações e melhora da qualidade de vida têm sido realizações importantes devido ao desenvolvimento do FIX derivado do plasma e recombinante. A proteção prolongada de sangramento representa outro avanço fundamental no tratamento de indivíduos com hemofilia B. Portanto, permanece uma necessidade de FIX recombinante melhorado, que possua uma meia-vida mais longa, enquanto mantém uma atividade eficaz. BREVE SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

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3/203 [007] São divulgados métodos de administração de uma proteína de fusão do Fator IX (FIX) a um indivíduo com sua necessidade, compreendendo a administração subcutânea a um indivíduo de uma proteína de fusão do FIX, em que (a) a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX e pelo menos um XTEN, que é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO:

2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ IDNO:

2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ IDNO:

2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ IDNO:

2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ IDNO:

2, e qualquer combinação dos mesmos, e (b) em que após a administração, a proteína de fusão do FIX apresenta uma atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 30% no indivíduo.

[008] Outros aspectos da presente invenção são direcionados aos métodos de administração de uma proteína de fusão de Fator IX (FIX) a um indivíduo com sua necessidade, que compreende a administração subcutânea a um indivíduo de uma proteína de fusão do FIX que compreende um polipeptídeo do FIX e um domínio Fc, em que a proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 229, em que após a administração, a proteína de fusão do FIX apresenta uma atividade no plasma de cerca de 1% a cerca de 30% no indivíduo.

[009] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose de cerca de 50 lU/kg a cerca de 400 lU/kg,

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e.g., em uma dose de cerca de 50 IU/kg, cerca de 100 IU/kg, cerca de 200 IU/kg ou cerca de 400 IU/kg.

[0010] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor máximo de atividade no plasma de cerca de 10% a cerca de 30%. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma de cerca de 1% a cerca de 10%.

[0011] Em outras modalidades, as proteínas de fusão de Fator IX incluem pelo menos um XTEN. Em um aspecto, a proteína de fusão de Fator IX (FIX) compreende um polipeptídeo do FIX e pelo menos um XTEN que é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 224da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 228da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos, e em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante. Em certas modalidades, o sítio de inserção corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2 e qualquer combinação dos mesmos.

[0012] Em algumas modalidades, o XTEN compreende pelo menos cerca de 6 aminoácidos, pelo menos cerca de 12 aminoácidos, pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos, ou pelo menos cerca de 288 aminoácidos. Em certas modalidades, o XTEN compreende uma sequência de aminoácido

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5/203 pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 230, e qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o XTEN compreende AE72. Em uma modalidade particular, o XTEN compreende a SEQ ID NO: 230.

[0013] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX ainda compreende um segundo XTEN, em que o XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, e em que o segundo XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX.

[0014] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX ainda compreende um domínio Fc. Em certas modalidades, o domínio Fc é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX ainda compreende um segundo domínio Fc. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX ainda compreende duas cadeias de polipeptídeo, em que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende o polipeptídeo do FIX fundido com o domínio Fc, e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende o segundo domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc são associados por uma ligação covalente.

[0015] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do FIX é uma variante de FIX R338L (“Padua”).

[0016] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende uma primeira cadeia e uma segunda cadeia, em que: (a) a primeira cadeia compreende: (i) um polipeptídeo do FIX tendo uma

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6/203 mutação 338L; (ii) opcionalmente um XTEN, em que o XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, e em que o XTEN compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos cerca de 72 aminoácidos; e (iii) um primeiro domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc é fundido com o polipeptídeo do FIX; e (b) a segunda cadeia compreende um segundo domínio Fc; em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc são associados por uma ligação covalente. [0017] O método para a presente invenção também fornece para uma proteína de fusão do FIX que compreende um polipeptídeo do FIX e um componente heterólogo que compreende um XTEN, em que o XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX e compreende uma sequência de aminoácido de mais do que 42 aminoácidos e menos do que 144 aminoácidos de comprimento.

[0018] As proteínas de fusão FIX dos presentes métodos possuem várias utilizações, incluindo o fornecimento de um método de prevenção, tratamento, melhora ou controle de uma doença ou condição de coagulação em um paciente com sua necessidade.

[0019] A presente invenção também fornece um método de prolongar uma meia-vida de um polipeptídeo do FIX que compreende a inserção de um XTEN dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 224 da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 228 da

SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos, construindo assim uma proteína de fusão do FIX, em que a proteína de FIX apresenta atividade pró-coagulante.

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7/203 [0020] As modalidades adicionais da presente invenção serão evidentes a partir da descrição e figuras que se seguem.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [0021] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui divulgados são incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0022] A Figura 1 é um gráfico que representa a atividade de proteínas de fusão de FIX que compreende um XTEN de 42 aminoácidos (por exemplo, AE42) inserido em vários sítios de inserção (por exemplo, no aminoácido 52, aminoácido 59, aminoácido 66, aminoácido 80, aminoácido 85, aminoácido 89, aminoácido 103, aminoácido 105, aminoácido 113, aminoácido 129, aminoácido 142, aminoácido 149, aminoácido 162, aminoácido 166, aminoácido 174, aminoácido 188, aminoácido 202, aminoácido 224, aminoácido 226, aminoácido 228, aminoácido 230, aminoácido 240, aminoácido 257, aminoácido 265, aminoácido 277, aminoácido 283, aminoácido 292, aminoácido 316, aminoácido 341, aminoácido 354, aminoácido 392, aminoácido 403 e aminoácido 413, que correspondem aos aminoácidos da SEQ ID NO: 2) ou fundido com o C-terminal (C-term) do polipeptídeo do FIX. As sequências de XTEN fundidas C-terminais contêm um sítio de divagem de trombina entre o FIX e a fusão C-terminal. O eixo Y mostra a atividade de FIX como uma porcentagem da atividade da construção de base (FIX-R338L) em meios condicionados através de um ensaio cromogênico. O eixo X mostra os sítios de inserção específicos como o número de aminoácido (que corresponde à SEQ ID NO: 2) e a abreviação de aminoácido de uma única letra. Os domínios correspondentes (por exemplo, GLA, EGF1, EGF2, ligante, AP e o domínio catalítico),

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8/203 as regiões de ligante e o C-terminal (C-term) do FIX são indicados abaixo no eixo X.

[0023] A Figura 2 é um gráfico que representa a atividade das proteínas de fusão de FIX que compreende um XTEN de 42 aminoácidos (AE42), 72 aminoácidos (AE72), 144 aminoácidos (AE144), 288 aminoácidos (AE288), e 864 aminoácidos (AE864) inserido em vários sítios de inserção (por exemplo, no aminoácido 103, aminoácido 105, aminoácido 142, aminoácido 149, aminoácido 162, aminoácido 166, aminoácido 174, aminoácido 224, e aminoácido 413, que corresponde ao aminoácidos da SEQ ID NO:2) ou fundido com o C-terminal (Cterm, aminoácido 415) do polipeptídeo do FIX. O eixo Y mostra a atividade de FIX como uma porcentagem da atividade da construção de base (FIX-R338L) em meios condicionados por um ensaio cromogênico. O eixo X mostra o domínio (por exemplo, EGF2, AP e domínios catalíticos) ou região (por exemplo, ligante e C-terminal) de cada sítio de inserção e os sítios de inserção específicos como o número de aminoácido (que corresponde à SEQ ID NO: 2). As setas indicam os sítios de inserção selecionados para experimentação adicional (vide FIGs. 3A-3B).

[0024] A FIG. 3A é uma representação esquemática das regiões e domínios da variante do FIX R338L. Os resíduos de aminoácido específicos (por exemplo, N105, D166, E224 e) e o C-terminal são destacados como componente heterólogo potencial, por exemplo, XTEN, sítios de inserção. A FIG. 3B mostra ilustrações da estrutura tridimensional do FIX de suíno (PDB:1 PFX) a partir de três ângulos diferentes. Os sítios de inserção N105, D166 e E224, o C-terminal, e a localização da mutação R338L (por exemplo, na variante do FIX R338L) são marcados.

[0025] A Figura 4 resume as atividades relativas de proteínas de fusão de FIX compreendendo um ou dois XTENs (por exemplo, XTEN

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9/203 de 42, 72, 144 e 288 aminoácidos), ou compreendendo um XTEN e um domínio Fc, ou FIXFc. O eixo Y mostra a atividade de FIX como uma porcentagem da atividade da construção de base (FIX-R338L) em meios condicionados através de um ensaio cromogênico. O eixo X mostra o número de construção, e a tabela abaixo do eixo X mostra a composição de XTEN e Fc para cada construção testada. EGF2 105, AP 166, alça calibrada 60 224 e XTEN C-term ou Fc indicam a posição onde o XTEN ou Fc é inserido ou fundido. Os números (por exemplo, 42, 72, 144, e 288, que indicam o tamanho da XTEN) e Fc em cada caixa na tabela abaixo do eixo-X indicam que o componente é inserido dentro ou fundido ao C-terminal do polipeptídeo do FIX.

[0026] A FIG. 5A fornece um gráfico que representa o percentil de plasma das atividades de coagulação de FIX administradas em doses contra o tempo de várias proteínas de fusão de FIX com fusões de XTEN C-terminais cliváveis por trombina de vários comprimentos (por exemplo, FIX-CT.288 (XTEN de 288 aminoácidos, por exemplo, AE288) e FIX-CT.864 (XTEN de 864 aminoácidos, por exemplo, AE864)), em comparação com rFIX e rFIXFc conforme medido após dosagem única em bolus por via intravenosa em camundongos com hemofilia-B. FIG. A FIG. 5B fornece um gráfico que representa o percentil de plasma das atividades de coagulação de FIX administradas em doses contra o tempo de várias proteínas de fusão de FIX com fusões XTEN de vários comprimentos inseridos no domínio de peptídeo de ativação (AP) (por exemplo, FIX-AP.144, FIX-AP.72 e FIX-AP.42) em comparação com rFIX e rFIXFc, conforme medido após a dosagem única em bolus por via intravenosa em camundongos com hemofilia-B. A FIG. 5C fornece uma compilação gráfica dos parâmetros farmacocinéticos calculados de uma proteína de fusão do FIX administrada em doses em bolus por via intravenosa única mostrada nas FIGs. 5A e 5B. Indicado no eixo Y está o percentil de recuperação da atividade no

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10/203 plasma para cada uma das moléculas indicadas. O eixo X mostra o tempo de permanência médio calculado (MRT, em horas), e a área dos pontos representa a área calculada relativa sob a curva por dose (AUC/D, em h/kg/ml).

[0027] A FIG. 6A fornece um gráfico que representa o percentil de plasma das atividades de coagulação de FIX administradas em doses contra o tempo de várias proteínas de fusão de FIX com fusões de XTEN de vários comprimentos inseridos no domínio de peptídeo de ativação (AP) (por exemplo, FIXFc-AP.72 e FIXFc-AP.42) ou no domínio EGF2 (por exemplo, FIXFc-EGF.42) em comparação com rFIX e rFIXFc, como medido após a dosagem única por via intravenosa em bolus em camundongos com hemofilia-B. A FIG. 6B fornece uma compilação gráfica dos parâmetros farmacocinéticos calculados de proteínas de fusão de FIX administradas em doses em bolus por via intravenosa isoladas mostrados na FIG. 6A. Indicado no eixo Y está o percentil de recuperação da atividade no plasma para cada uma das moléculas indicadas. O eixo X mostra o tempo de permanência médio calculado (MRT, em horas). A área dos pontos representa a área calculada relativa sob a curva por dose (AUC/D, em h/kg/ml).

[0028] A FIG. 7A fornece um gráfico que representa o percentil de plasma das atividades de coagulação de FIX administradas em doses contra o tempo de uma proteína de fusão do FIX compreendendo um XTEN clivável por trombina de 288 aminoácidos fundido com o Cterminal de um polipeptídeo do FIX (rFIX-CT.288), uma proteína de fusão do FIX compreendendo uma XTEN de 72 aminoácidos inserido dentro do domínio de AP de um polipeptídeo do FIX (rFIXFc-ΑΡ.72), e uma proteína de fusão do FIX compreendendo XTEN de 42 aminoácidos inseridos dentro do domínio EGF2 de um polipeptídeo do FIX (rFIXFc-EGF2.42) em comparação com rFIX e rFIXFc, como medido após a dosagem por via subcutânea em bolus única em camundongos

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11/203 com hemofilia-B. A FIG. 7B fornece uma compilação gráfica dos parâmetros farmacocinéticos calculados de proteínas de fusão de FIX administradas em doses em bolus por via subcutânea isoladas mostradas na FIG. 7A. Indicado no eixo Y está o percentil de biodisponibilidade para cada uma das moléculas indicadas. O eixo X mostra o tempo de permanência médio calculado (MRT, em horas). A área dos pontos representa a área calculada relativa sob a curva por dose (AUC/D, em h/kg/ml).

[0029] A FIG. 8A fornece uma representação gráfica do tempo de coagulação em segundos medido por tromboelastometria rotacional (ROTEM) do rFIXFc e uma proteína de fusão do FIX compreendendo um XTEN de 72 aminoácidos inserido dentro do domínio de AP do FIX (por exemplo, rFIXFc-AP-XTEN.72) no sangue humano de hemofilia B. A FIG. 8B fornece uma representação gráfica do ângulo alfa em graus de rFIXFc e uma proteína de fusão do FIX (por exemplo, rFIXFc-APXTEN.72) em sangue humana de hemofilia B. A FIG. 8C fornece uma representação gráfica da firmeza máxima do coágulo (MCF) em mm do rFIXFc e uma proteína de fusão do FIX (por exemplo, rFIXFc-APXTEN.72) no sangue humana de hemofilia B.

[0030] A FIG. 9 é um gráfico que mostra a eficácia aguda de rFIXFc-AP.72 em comparação com rFIXFc no modelo de sangramento de corte na cauda. Os resultados apresentados são a perda de sangue individual e média (μΙ) em 5 minutos após a dosagem, ao longo de um período de 30 minutos para os tratamentos e dosagem conforme indicados. Os asteriscos indicam os valores significativos de p para veículos versus todos os outros tratamentos. Os dados indicam uma eficácia semelhante ou melhorada em camundongos doseados com rFIXFc-AP.72 em comparação com rFIXFc.

[0031] A FIG. 10 é um gráfico que mostra a porcentagem de camundongos HemB sobreviventes traçada em gráfico (eixo Y) contra o

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12/203 tempo em horas após a transecção da veia da cauda (eixo X). Todos os camundongos foram pré-dosados 72 horas antes da transecção da veia da cauda por via intravenosa com FIXFc (linhas pontilhadas) ou por via subcutânea com FIXFc-AP.72 na lU/kg indicada (FIXFc-AP.72: 100 lU/kg (círculo preto sólido), 50 lU/kg (triângulo sólido cinzento) e 15 lU/kg (triângulo cinzento invertido sólido); rFIXFc: 100 lU/kg (círculo aberto), 50 lU/kg (triângulo aberto) e 15 lU/kg (triângulo invertido aberto); e o veículo (círculo cinzento fechado). Os gráficos de sobrevivência para os camundongos administrados em doses com rFIXFc ou FlXFc-AP.72 são todos significativamente diferente quando comparados com os camundongos tratados com veículo (p < 0,0001, teste de Logrank (Mantel-Cox).

[0032] A FIG. 11A é um gráfico que mostra os níveis no plasma da atividade de FX conforme medida por um ensaio de plasma de uma etapa representado graficamente em função do tempo para camundongos com hemofilia B que foram doseados por injeção intravenosa (linhas tracejadas) ou subcutânea (linhas contínuas), com um único bolus (200 IU/kg) de rFIX (cinzento) ou a proteína de fusão de rFIXFcAP.72 (preto). A FIG. 11B mostra os parâmetros farmacocinéticos como determinados utilizando a análise não compartimental (NCA) utilizando o software Phoenix WinNonLin 6.2.1 (Pharsight, Certara).

[0033] A FIG. 12A é um desenho esquemático que ilustra a estrutura de domínio de cadeia única de rFIXFc-AP.72 Fc. A FIG. 12B é um desenho esquemático que mostra a estrutura do domínio de cadeia dupla de rFIXFc-AP.72 Fc. FIX HC refere-se à cadeia pesada de FIX; FIX LC refere-se à cadeia leve de FIX, que inclui os domínios EGF e GLA de FIX; e AP refere-se ao peptídeo de ativação de FIX.

[0034] A FIG. 13 é uma tabela que resume as construções de FIXXTEN como utilizadas nos exemplos com a combinação do número, descrição e código de plasmídeo de identificação de sequência.

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13/203 [0035] As FIGs. 14A e14B mostram as representações gráficas da atividade plasmática de FIX após a administração de rFIXFc-AP.72 de cadeia única em camundongos HemB. As curvas farmacocinéticos subcutâneas após administração de 50 lU/kg (círculos cinzentos claros), 100 lU/kg (círculos cinzentos medianos), 200 lU/kg (círculos cinzentos escuros) e 400 lU/kg (círculos pretos) de rFIXFc-AP.72 são mostradas como atividade plasmática de FIX em lU/dL (Fig. 14A) e como um percentil recuperado da dose injetada (FIG. 14B). A FIG. 14C mostra uma tabela de comparação que lista os parâmetros farmacológicos calculados mostrados na FIG. 14 A, utilizando o software Phoenix WinNonLin.

[0036] A FIG. 15A é uma representação gráfica da atividade no plasma (linhas sólidas) e antígeno (linhas tracejadas) de rFIXFc-AP.72 cadeia única (pJH84; SEQ ID NO: 151) administrado em 100 lU/kg por injeção intravenosa (linhas cinzentas) ou subcutânea (linhas pretas) (média ± SD, n = 3) em macacos cinomolgos. A FIG. 15B é uma tabela de comparação que lista os parâmetros farmacológicos calculados da FIG. 15 A, utilizando o software Phoenix WinNonLin.

[0037] A FIG. 16 é uma representação gráfica dos níveis de atividade no plasma (lU/dL) em camundongos HemB após a administração subcutânea (SQ) de 100 lU/kg (carga cinza escuro) ou 200 lU/kg (carga cinza claro) de rFIXFc-AP.72 (pJH84; SEQ ID NO: 151) e em camundongos HemB após a administração intravenosa (IV) de 50 lU/kg de (linha contínua), 100 lU/kg (linha tracejada grande) ou 200 lU/kg (linha tracejada pequena) de rFIXFc. Os dados são apresentados a partir do dia 1 após a administração até o dia 7. Linhas horizontais sobrepostas indicam o valor máximo de 30% e o nível mínimo de 5%, conforme mostrado.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0038] Esta invenção fornece uma proteína de fusão do FIX com

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14/203 preendendo um polipeptideo do FIX e pelo menos um componente heterólogo e métodos para a sua produção e utilização. Em certos aspectos, a proteína de fusão do FIX compreende pelo menos um componente heterólogo inserido dentro do polipeptideo do FIX, fundido com o C-terminal do polipeptideo do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante. Em um aspecto particular, o componente heterólogo é XTEN.

L DEFINIÇÕES [0039] Ao longo desta invenção, o termo um ou uma entidade refere-se a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, um polinucleptídeo é entendido de representar um ou mais polinucleotídeos. Como tais, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um podem ser aqui utilizados de modo trocável.

[0040] Além disso, e/ou onde aqui utilizado, deve ser tomado como divulgação específica de cada uma das duas características especificadas ou componentes com ou sem o outro. Assim, o termo e/ou como utilizado em uma frase como A e/ou B destina-se aqui a incluir A e B, A ou B, A (isoladamente) e B (isoladamente). Da mesma forma, o termo e/ou como utilizado em uma frase como A, B e/ou C pretende abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (isoladamente); B (isoladamente) e C (isoladamente).

[0041] Fica entendido que aonde quer que os aspectos sejam aqui descritos com a linguagem compreendendo, de outro modo os aspectos análogos descritos em termos de consistindo em e/ou que consiste essencialmente em, também são fornecidos.

[0042] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como geralmente compreendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica à qual esta invenção está relacionada. Por exemplo, o Concise

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Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, suprem uma pessoa com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta divulgação.

[0043] Unidades, prefixos e símbolos são indicados em sua forma aceita pelo Système International de Unites (SI). As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A não ser que de outra maneira indicada, as sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi. Os cabeçalhos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos da invenção, que podem obtidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo na sua totalidade.

[0044] O termo cerca de é aqui utilizado para significar aproximadamente, em termos gerais, cerca de, ou nas regiões de. Quando o termo cerca de é utilizado em conjunto com uma faixa numérica, ele modifica essa faixa através do prolongamento dos limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo cerca de pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor mencionado por uma variação de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor).

[0045] O termo polinucleotídeo ou nucleotídeo destina-se a abranger um ácido nucleico singular assim como ácidos nucleicos plurais, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolado ou construção, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou de DNA plasmídeo (pDNA). Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma ligação convencional de fosfodiéster ou uma ligação não convencional

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16/203 (por exemplo, uma ligação de amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo ácido nucleico refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo isolado entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removido do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo do FIX contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado que incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou purificadas (parcial ou substancialmente) a partir de outros polinucleotídeos em uma solução. As moléculas de RNA isoladas incluem os transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção ainda incluem tais moléculas sinteticamente produzidas. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode incluir elementos reguladores tais como promotores, intensificadores, sítios de ligação ao ribossoma ou sinais de terminação da transcrição.

[0046] Como aqui utilizado, uma região de codificação ou sequência de codificação é uma parte do polinucleotídeo, o qual consiste em códons transladáveis em aminoácidos. Embora um códon de interrupção (TAG, TGA ou TAA) tipicamente não seja transladado em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossoma, terminadores de transcrição, introns, e outros mais, não são parte de uma região de codificação. Os limites de uma região de codificação são tipicamente determinados por um códon de início no terminal 5', que codifica o terminal de amino do polipeptídeo resultante, e um códon de parada da translação

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17/203 no terminal 3', que codifica o terminal de carboxila do polipeptídeo resultante. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construções de polinucleotídeo separadas, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Segue-se, então, que um único vetor pode conter apenas uma única região de codificação, ou compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um único vetor pode codificar separadamente um domínio de ligação A e um domínio de ligação B como descrito abaixo. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da presente invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica um domínio de ligação da presente invenção. As regiões de codificação heterólogas incluem sem limitação elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo de sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo. [0047] Certas proteínas secretadas por células de mamífero estão associados com um peptídeo sinal de secreção, que é clivado da proteína madura assim que a exportação da cadeia de proteína em desenvolvimento através do retículo endoplasmático rugoso tenha sido iniciada. Aqueles de habilidade prática na técnica estão cientes de que os peptídeos de sinal são geralmente fundidos ao terminal N do polipeptídeo, e são clivados do polipeptídeo completa ou de comprimento total para produzir uma forma secretada ou madura do polipeptídeo. Em certas modalidades, um peptídeo de sinal nativo ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que está associado de maneira operável com ela. Alternativamente, um peptídeo de sinal heterólogo de mamífero, por exemplo, um ativador do plasminogênio de tecido humano (TPA) ou peptídeo de sinal de B-glucuronidase de camundongo, ou um derivado funcional deste, pode ser utilizado.

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18/203 [0048] O termo a jusante refere-se a uma sequência de nucleotídeo que está localizada 3' para uma sequência de nucleotídeo de referência. Em certas modalidades, as sequências de nucleotídeo a jusante referem-se às sequências que seguem o ponto de partida da transcrição. Por exemplo, o códon de início da translação de um gene está localizado a jusante do sítio de partida da transcrição. Jusante pode também referir-se a uma sequência de peptídeo que está localizada Cterminal a uma sequência de peptídeo de referência.

[0049] O termo a montante refere-se a uma sequência de nucleotídeo que está localizada a 5' para uma sequência de nucleotídeo de referência. Em certas modalidades, as sequências de nucleotídeo a montante referem-se às sequências que estão localizadas no lado 5' de uma região de codificação ou ponto de partida da transcrição. Por exemplo, a maior parte dos promotores está localizada a montante do sítio de partida da transcrição. A montante pode também referir-se a uma sequência de peptídeo que está localizada N-terminal de uma sequência de peptídeo de referência.

[0050] Conforme aqui utilizado, o termo região reguladora referese às sequências de nucleotídeo localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro, ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma região de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA, estabilidade ou translação da região de codificação associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de translação, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento do RNA, sítios de ligação efetoras e estruturas de alça peduncular. Se uma região de codificação for destinada para a expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição geralmente estarão localizados a 3' da sequência de codificação.

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19/203 [0051] Um polinucleotídeo, o qual codifica um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou translação associado de maneira operável com uma ou mais regiões de codificação. Em uma associação operável uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associada com uma ou mais regiões reguladoras de uma tal maneira como para colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle das regiões reguladoras. Por exemplo, uma região de codificação e um promotor estão associados de maneira operável se a indução da função do promotor resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto de gene codificado pela região de codificação, e se a natureza da ligação entre o promotor e a região de codificação não interferir com a capacidade do promotor de direcionar a expressão do produto de gene ou interferir com a capacidade do modelo de DNA a ser transcrito. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores, e sinais de término da transcrição, também pode estar associados de maneira operável com uma região de codificação para a expressão direta do produto de gene.

[0052] Uma variedade de regiões de controle da transcrição é conhecida daqueles versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, as regiões de controle da transcrição, que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitados aos segmentos promotores e intensificadores de citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovirus (tais como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aqueles derivados de genes de vertebrados tais como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e B-globina de coelho, assim como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes nas células eucarióti

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20/203 cas. As regiões de controle da transcrição adequadas adicionais incluem promotores e intensificadores específicos do tecido, assim como promotores induzíveis por linfocinas (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).

[0053] Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle da translação é conhecida daqueles de habilidade prática na técnica. Estes incluem, mas não são limitados a sítios de ligação ao ribossoma, de códons de início e término da translação, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de entrada de ribossoma interno, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).

[0054] O termo expressão como aqui utilizado refere-se a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto de gene, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo. Ele inclui sem limitação a transcrição do polinucleotídeo no RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA grampo de cabelo pequeno (shRNA), RNA interferente pequeno (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a translação de um mRNA em um polipeptídeo. A expressão produz um produto de gene. Como aqui utilizado, um produto de gene pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é trasladado a partir de um transcrito. Os produtos de gene descritos nesta invenção ainda incluem ácidos nucleicos com modificação pós-transcricional, por exemplo, poliadenilação ou recomposição, ou polipeptídeos com modificações pós-translacionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídeos, associação com outras subunidades de proteína ou divagem proteolítica.

[0055] Um vetor refere-se a qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de um ácido nucleico em uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon ao qual outro segmento de ácido nucleico pode estar ligado de modo a efetuar a replicação do segmento

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21/203 ligado. Um replicon refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação in vivo, isto é, capaz de replicação sob o seu próprio controle. O termo vetor inclui veículos tanto virais quanto não virais para introduzir o ácido nucleico em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Um grande número de vetores é conhecido e utilizado na técnica, incluindo, por exemplo, plasmídeos, vírus eucarióticos modificado ou vírus bacterianos modificados. A inserção de um polinucleotídeo em um vetor adequado pode ser executada através da ligação dos fragmentos de polinucleotídeo apropriados em um vetor selecionado que possui terminais coesivos complementares.

[0056] Os vetores podem ser planejados para codificar marcadores ou repórteres selecionáveis que fornecem a seleção ou identificação de células que incorporaram o vetor. A expressão de marcadores ou repórteres selecionáveis permite a identificação e/ou seleção de células hospedeiras que incorporam e expressam outras regiões de codificação contidas no vetor. Exemplos de genes marcadores selecionáveis conhecidos e utilizados na técnica incluem: genes que fornecem resistência à ampicilina, estreptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, neomicina, puromicina, herbicida bialafos, sulfonamida, e semelhantes; e genes que são utilizados como marcadores fenotípicos, isto é, genes reguladores de antocianina, gene de isopentanil transferase, e semelhantes. Exemplos de repórteres conhecidos e utilizados na técnica incluem: luciferase (Luc), proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), -galactosidase (LacZ), -glucuronidase (GUS), e similares. Os marcadores selecionáveis também podem ser considerados repórteres.

[0057] O termo plasmídeo refere-se a um elemento extracromossômico que frequentemente transporta um gene que não é parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de molécu

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22/203 las de DNA de fita dupla circulares. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração do genoma, sequências em fagos ou de nucleotídeo, lineares, circulares, ou super-enrolados, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivado de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeo foram unidas ou recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento do promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado, juntamente com a sequência não trasladada apropriada 3' em uma célula.

[0058] Os vetores virais eucarióticos que podem ser utilizados incluem, mas não são limitados a estes, vetores de adenovirus, vetores de retrovirus, vetores de vírus adeno-associados e poxvirus, por exemplo, vetores de vírus da vacínia, vetores de baculovírus ou vetores de herpesvirus. Os vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídeos eletricamente carregados (citofectinas), complexos de DNA-proteína e biopolímeros.

[0059] Um vetor de clonagem refere-se a um replicon, que é um comprimento da unidade de um ácido nucleico que se replica de forma sequencial e que compreende uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de ácido nucleico pode ser ligado de modo a efetuar a replicação do segmento ligado. Certos vetores de clonagem são capazes de replicação em um tipo de célula, por exemplo, bactérias, e expressão em outro, por exemplo, células eucarióticas. Os vetores de clonagem tipicamente compreendem uma ou mais sequências que podem ser utilizadas para seleção de células compreendendo o vetor e/ou um ou mais sítios de múltiplas clonagens para a inserção de sequências de ácido nucleico de interesse.

[0060] O termo vetor de expressão refere-se a um veículo designado a permitir a expressão de uma sequência de ácido nucleico inse

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23/203 rida após a inserção em uma célula hospedeira. A sequência de ácido nucleico inserida é colocada em associação operável com regiões reguladoras como descrito acima.

[0061] Os vetores são introduzidos nas células hospedeiras através de métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjecção, transdução, fusão celular, DEAE dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção (fusão de lisosoma), uso de uma pistola genética ou um transportador de vetor de DNA.

[0062] Cultura, para cultivar e cultivo, como aqui utilizados, significam incubar células sob condições in vitro que levam em conta o crescimento ou divisão celular ou manter as células em um estado vivo. Células cultivadas como aqui utilizadas, significam células que são propagadas in vitro.

[0063] Como aqui utilizado, o termo polipeptídeo destina-se a abranger um polipeptídeo singular, assim como polipeptídeos plurais, e refere-se a uma molécula de composto de monômeros (aminoácidos) linearmente conectados por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo polipeptídeo refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, os peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, proteína, cadeia de aminoácido ou qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos dentro da definição de polipeptídeo, e o termo polipeptídeo pode ser utilizado em lugar ou de modo trocável com qualquer um destes termos. O termo polipeptídeo também pretende se referir aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, divagem proteolítica ou modificação através de aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo

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24/203 pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou tecnologia recombinante produzida, mas não é necessariamente trasladado a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer modo, incluindo pela síntese química.

[0064] Um polipeptídeo isolado ou um fragmento, variante ou derivado deste refere-se a um polipeptídeo que não está em seu ambiente natural. Nenhum nível de purificação particular é requerido. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode simplesmente ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas produzidas de forma recombinante expressas em células hospedeiras são consideradas isoladas para o propósito da presente invenção, como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separadas, fracionados ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[0065] Como aqui utilizado, o termo célula hospedeira refere-se a uma célula ou uma população de células que abrigam ou são capazes de abrigar um ácido nucleico recombinante. As células hospedeiras podem ser células procarióticas (por exemplo, E. coli), ou alternativamente, as células hospedeiras podem ser eucarióticas, por exemplo, células fúngicas (por exemplo, células de levedura tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Schizosaccharomyces pombe), e várias células de animais, tais como células de inseto (por exemplo, Sf-9) ou células de mamífero (por exemplo, HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3).

[0066] Também incluídos na presente invenção são os fragmentos ou as variantes de polipeptídeos, e qualquer combinação dos mesmos. O termo fragmento ou variante quando se refere a domínios de ligação de polipeptídeo ou moléculas ligação da presente invenção incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades (por exemplo, afinidade de ligação FcRn para um domí

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25/203 nio de ligação FcRn ou variante Fc, ou atividade de coagulação de uma variante do FIX) do polipeptídeo de referência. Fragmentos de polipeptídeos incluem fragmentos proteolíticos, assim como fragmentos de supressão, além de fragmentos de anticorpos específicos tratados aqui em outro lugar, mas não incluem o polipeptídeo de ocorrência natural de comprimento total (ou polipeptídeo maduro). As variantes de domínios de ligação ou moléculas de ligação de polipeptídeo da presente invenção incluem fragmentos, como descritos acima, e também os polipeptídeos com sequências de aminoácido alteradas devido às substituições, supressões ou inserções de aminoácido. As variantes podem ser de ocorrência natural ou não natural. As variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas utilizando técnicas de mutagênese conhecidas na especialidade. Os polipeptídeos variantes podem compreender substituições, supressões ou adições de aminoácido conservatives ou não conservatives. Uma variante do FIX particular aqui descrito é a variante do FIX R338L (Padua) (SEQ ID NO: 2). Ver, por exemplo, Simioni, P., et a!., X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua), NEJM 36/:1671-75 (October 2009), o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0067] Uma substituição de aminoácidos conservative é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo as cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e

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26/203 cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, se um aminoácido em um polipeptídeo for substituído com outro aminoácido da mesma família de cadeia lateral, a substituição é considerada conservativa. Em outra modalidade, uma cadeia de aminoácidos pode ser conservativamente substituída por uma cadeia estruturalmente semelhante que difere na ordem e/ou composição dos membros da família de cadeia lateral.

[0068] O termo identidade de sequência percentual entre duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se ao número de posições correspondentes idênticas compartilhadas pelas sequências além de uma janela de comparação, levando em conta as adições ou supressões (isto é, lacunas) que devem ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequências. Uma posição correspondente é qualquer posição onde um nucleotídeo ou aminoácido idêntico é apresentado na sequência tanto alvo quanto de referência. As lacunas apresentadas na sequência alvo não são contadas uma vez que as lacunas não são nucleotídeos ou aminoácidos. Do mesmo modo, as lacunas apresentadas na sequência de referência não são contabilizadas uma vez que os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência alvo são contados e não os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência de referência.

[0069] A porcentagem de identidade de sequência é calculada através da determinação do número de posições em que o resíduo de aminoácido idêntico ou base de ácido nucleico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, divisão do número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicação do resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. A comparação das sequências e a determinação da identidade de sequência percentual entre duas sequências podem ser executadas utilizando o software

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27/203 facilmente disponível tanto para uso online quanto para download. Os programas de software adequados estão disponíveis de várias fontes, e para o alinhamento das sequências tanto de proteína quanto de nucleotídeo. Um programa adequado para determinar a identidade de sequência percentual é bl2seq, parte do software integrado BLAST de programas disponíveis do U.S. government's National Center for Biotechnology Information BLAST web site (blast.ncbi.nlm.nih.gov). O b12seq executa uma comparação entre duas sequências utilizando o algoritmo BLASTN ou BLASTP. BLASTN é utilizado para comparar as sequências de ácido nucleico, enquanto que o BLASTP é utilizado para comparar as sequências de aminoácido. Outros programas adequados são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water ou Matcher, parte do software integrado EMBOSS de programas de bioinformática e também disponíveis do European Bioinformatics Institute (EBI) em www.ebi.ac.uk/Tools/Dsa.

[0070] Diferentes regiões dentro de uma única sequência alvo de polinucleotídeo ou polipeptideo que se alinha com uma sequência de referência de polinucleotídeo ou polipeptideo pode cada uma ter a sua própria identidade de sequência percentual. Observa-se que o valor de identidade de sequência percentual é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13 e 80,14 são arredondados para baixo em 80,1, enquanto que 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, 80,19 e são arredondados para 80,2. Também se observa que o valor de comprimento sempre será um número inteiro.

[0071] Uma pessoa versada na técnica irá observar que a geração de um alinhamento de sequência para o cálculo de uma identidade de sequência percentual não se limita às comparações de sequência binária-sequência exclusivamente conduzidas por dados de sequências primárias. Os alinhamentos de sequências podem ser derivados de múltiplos alinhamentos de sequência. Um programa adequado para

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28/203 gerar múltiplos alinhamentos de sequência é ClustalW2, disponível da www.clustal.org. Outro programa adequado é MUSCLE, disponível da www.drive5.com/muscle/· ClustalW2 e MUSCLE estão alternativamente disponível, por exemplo, do EBI.

[0072] Será também observado que os alinhamentos de sequência podem ser gerados através de dados de sequência de integração com dados de fontes heterogêneas tais como dados estruturais (por exemplo, estruturas cristalográficas de proteína), dados funcionais (por exemplo, localização de mutações) ou dados filogenéticos. Um programa apropriado que integra os dados heterogêneos para gerar múltiplos alinhamentos de sequências é T-Coffee, disponível em www.tcoffee.org, e alternativamente disponível, por exemplo, do EBI. Também será observado que o alinhamento final utilizado para calcular a identidade de sequência percentual pode ser curado automática ou manualmente.

[0073] Como aqui utilizado, um aminoácido que corresponde a, sítio que corresponde a ou aminoácido equivalente de uma sequência de proteína do Fator IX é identificado por alinhamento para maximizar a identidade ou semelhança entre uma primeira sequência de FIX e uma segunda sequência de FIX. O número utilizado para identificar um aminoácido equivalente em uma segunda sequência de FIX baseia-se no número utilizado para identificar o aminoácido correspondente na primeira sequência de FIX.

[0074] Como aqui utilizado, o termo sítio de inserção refere-se a um número de resíduo de aminoácido no polipeptídeo do aFIX (tipicamente um polipeptídeo do FIX maduro), ou seu fragmento, variante ou derivado, que é imediatamente a montante da posição em que um componente heterólogo pode ser inserido. Um sítio de inserção é especificado como um número, o número sendo o número do aminoácido na variante do FIX R338L (Padua) (SEQ ID NO: 2), ao qual o sítio

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29/203 de inserção corresponde, que é imediatamente N-terminal à posição da inserção. Por exemplo, a frase o domínio EGF2 compreende um XTEN em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2 indica que o componente heterólogo está localizado entre dois aminoácidos que correspondem ao aminoácido 105 e ao aminoácido 106 da SEQ ID NO: 2. No entanto, uma pessoa de habilidade na técnica seria facilmente capaz de identificar uma posição correspondente em qualquer variante do FIX, e a presente invenção não se limita às inserções feitas unicamente na variante do FIX R338L (Padua). De preferência, as inserções aqui divulgadas podem ser efetuadas em qualquer variante do FIX ou seus fragmentos tendo atividade pró-coagulante em uma posição que corresponde a uma posição da variante do FIX R338L.

[0075] A frase imediatamente a jusante de um aminoácido como aqui utilizada refere-se à posição correta próxima ao grupo de carboxila terminal do aminoácido. Da mesma forma, a frase imediatamente a montante de um aminoácido refere-se à posição correta próxima ao grupo de amina terminal do aminoácido. Portanto, a frase entre dois aminoácidos de um sítio de inserção como aqui utilizada refere-se a uma posição em que um XTEN ou qualquer outro polipeptídeo é inserido entre dois aminoácidos adjacentes.

[0076] Os termos inserido, é inserido, inserido no ou termos gramaticalmente relacionados, como aqui utilizados, referem-se à posição de um XTEN em um polipeptídeo de fusão em relação à posição análoga na variante do FIX R338L (Padua) (SEQ ID NO: 2). Aqueles de habilidade no campo irão compreender como identificar as posições de inserção correspondentes no que diz respeito a outras sequências de polipeptídeo do FIX tais como aquelas mostradas como SEQ ID NO: 1. Como aqui utilizado os termos referem-se às características do polipeptídeo do FIX recombinante em relação à variante do FIX R338L

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30/203 (Padua), e não indicam, implicam ou inferem quaisquer métodos ou processo pelos quais o polipeptídeo de fusão foi produzido. Por exemplo, em referência a um polipeptídeo de fusão aqui fornecido, a frase um XTEN é inserido no domínio EGF2 imediatamente a jusante de um resíduo 105 do polipeptídeo do FIX” significa que o polipeptídeo de fusão compreende um XTEN imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 105 na variante do FIX R338L (SEQ ID NO: 2), por exemplo, ligado por aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 105 e 106 da variante do FIX R338L.

[0077] Uma proteína de fusão ou quimérica compreende uma primeira sequência de aminoácido ligada a uma segunda sequência de aminoácido com a qual não está naturalmente conectada na natureza. As sequências de aminoácido que normalmente existem em proteínas separadas podem ser reunidas no polipeptídeo de fusão, ou as sequências de aminoácido que existem normalmente na mesma proteína podem ser colocadas em uma nova disposição no polipeptídeo de fusão, por exemplo, a fusão de um domínio FIX da presente invenção com um domínio Fc de Ig. Uma proteína de fusão é criada, por exemplo, através da síntese química, ou através da criação e translação de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeo são codificadas na conexão desejada. Uma proteína de fusão pode ainda compreender uma segunda sequência de aminoácido associada com a primeira sequência de aminoácido através de uma ligação covalente não peptídica ou uma ligação não covalente.

[0078] Os termos heterólogo e componente heterólogo significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo, ou outro componente é derivado de uma entidade distinta daquela da entidade na qual está sendo comparada. Por exemplo, um polipeptídeo heterólogo pode ser sintético ou derivado de uma espécie diferente, tipo de célula diferente de um indivíduo, ou o mesmo ou diferente tipo de célula de indivíduos dis

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31/203 tintos. Em um aspecto, um componente heterólogo é um polipeptídeo fundido com outro polipeptídeo para produzir um polipeptídeo ou proteína de fusão. Em outro aspecto, um componente heterólogo é um não polipeptídeo tal como PEG conjugado com um polipeptídeo ou proteína.

[0079] Como aqui utilizado, o termo meia-vida refere-se a uma meia-vida biológica de um polipeptídeo particular in vivo. A meia-vida pode ser representada pelo tempo necessário para metade da quantidade administrada a um indivíduo a ser liberada da circulação e/ou outros tecidos no animal. Quando uma curva de liberação de um determinado polipeptídeo é construída como uma função do tempo, a curva é geralmente bifásica com uma fase α rápida e fase β mais longa. A fase α tipicamente representa um equilíbrio do polipeptídeo administrado entre o espaço intra- e extra-vascular e é, em parte, determinada pelo tamanho do polipeptídeo. A fase β tipicamente representa o catabolismo do polipeptídeo no espaço intravascular. Em algumas modalidades, as proteínas do FIX e de fusão compreendendo FIX são monofásicas, e assim não possuem uma fase alfa, mas apenas a fase beta isolada. Portanto, em certas modalidades, o termo meia-vida como aqui utilizado refere-se à meia-vida do polipeptídeo na fase β. A meia-vida de fase β típica de um anticorpo humano em seres humanos é de 21 dias.

[0080] Os termos conectado e fundido como aqui utilizados referem-se a uma primeira sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo de forma covalente ou não covalente unida a uma segunda sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo, respectivamente. A primeira sequência de aminoácido ou nucleotídeo pode ser diretamente unida ou justaposta à segunda sequência de aminoácido ou nucleotídeo ou, alternativamente, uma sequência interveniente pode juntar-se covalentemente a primeira sequência com a segunda se

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32/203 quência. O termo conectado significa não apenas uma fusão de uma primeira sequência de aminoácido com uma segunda sequência de aminoácido no C-terminal ou N-terminal, mas também inclui a inserção da primeira sequência de aminoácido inteira (ou a segunda sequência de aminoácido) em todos os dois aminoácidos na segunda sequência de aminoácido (ou a primeira sequência de aminoácido, respectivamente). Em uma modalidade, a primeira sequência de aminoácido está ligada a uma segunda sequência de aminoácido através de uma ligação peptídica ou um ligante. A primeira sequência de nucleotídeos pode ser ligada a uma segunda sequência de nucleotídeo através de uma ligação de fosfodiéster ou um ligante. O ligante pode ser um peptídeo ou um polipeptídeo (com relação às cadeias de polipeptídeo) ou um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeo (com relação às cadeias de nucleotídeo) ou qualquer componente químico (com relação às cadeias tanto de polipeptídeo quanto de polinucleotídeo). O termo conectado também é indicado por um hífen (-).

[0081] Como aqui utilizado, o termo associado com refere-se a uma ligação covalente ou não covalente formada entre uma primeira cadeia de aminoácido e uma segunda cadeia de aminoácido. Em uma modalidade, o termo associado com significa uma ligação covalente, ligação não peptídica ou uma ligação não covalente. Esta associação pode ser indicada por dois pontos, isto é, (:). Em outra modalidade, significa uma ligação covalente exceto uma ligação peptídica. Por exemplo, o aminoácido cisteína compreende um grupo de tiol que pode formar uma ligação de dissulfeto ou uma ligação com ponte com um grupo de tiol de um segundo resíduo de cisteína. Na maior parte das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CL estão associadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão associados por duas ligações de dissulfeto nas posições que correspondem a 239 e 242 utilizando o sistema de numeração

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Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da EU). Exemplos de ligações covalentes incluem, mas não são limitados a estes, uma ligação pi, uma ligação delta, uma ligação glicosídica, uma ligação agnóstica, uma ligação inclinada, uma ligação dipolar, uma formação Pi, uma ligação dupla, uma ligação tripla, uma ligação quádrupla, uma ligação quintuple, uma ligação sêxtupla, conjugação, hiperconjugação, aromaticidade, hapticidade ou antiligação. Exemplos não limitativos de ligação não covalente incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação pi de cátion ou ligação de sal), uma ligação de metal, uma ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de diidrogênio, complexo de diidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa barreira ou ligação de hidrogênio simétrica), força de van der Walls, força de dispersão de London, uma ligação mecânica, uma ligação de halogêneo, aurofilicidade, intercalação, empilhamento, força entrópica ou polaridade química.

[0082] Conforme aqui utilizado, o termo sítio de divagem ou sítio de divagem enzimática refere-se a um sítio reconhecido por uma enzima. Certos sítios de divagem enzimática compreendem um sítio de processamento intracelular. Em uma modalidade, um polipeptídeo possui um sítio de divagem enzimática clivada por uma enzima que é ativada durante a cascata de coagulação, de tal modo que a divagem de tais sítios ocorre no sítio da formação do coágulo. Exemplares de tais sítios incluem, por exemplo, aqueles reconhecidos pela trombina, Fator Xla ou Fator Xa. Os sítios de divagem do FXIa exemplares incluem, por exemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 166) e SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 167). Os sítios de divagem de trombina exemplares incluem, por exemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 168), TTKIKPR (SEQ ID NO: 169), LVPRG (SEQ ID NO: 170) e ALRPR (SEQ ID NO: 171). Outros sítios de divagem enzimática são conhecidos na técnica.

[0083] Como aqui utilizado, o termo sítio de processamento ou sítio de processamento intracelular refere-se a um tipo de sítio de

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34/203 divagem enzimática em um polipeptídeo que é um alvo para as enzimas que funcionam após a translação do polipeptídeo. Em uma modalidade, tais enzimas funcionam durante o transporte do lúmen de Golgi para o compartimento de trans-Golgi. As enzimas de processamento intracelular clivam os polipeptídeos antes da secreção da proteína da célula. Exemplos de tais sítios de processamento incluem, por exemplo, aqueles direcionados pela família PACE/furina (onde PAGE é um acrônimo para Enzima de Clivagem de Aminoácido Básico Correlacionado) de endopeptidases. Estas enzimas são localizadas na membrana de Golgi e clivam as proteínas no lado carboxiterminal do motivo de sequência Arg-[qualquer resíduo]-(Lys ou Arg)-Arg. Como aqui utilizado, a família furina de enzimas inclui, por exemplo, PCSK1 (também conhecido como PC1/Pc3), PCSK2 (também conhecido como PC2), PCSK3 (também conhecido como furina ou PACE), PCSK4 (também conhecido como PC4), PCSK5 (também conhecido como PC5 ou PC6), PCSK6 (também conhecido como PACE4) ou PCSK7 (também conhecido como PC7/LPC, PC8 ou SPC7). Outros sítios de processamento são conhecidos na técnica. O termo ligante processável aqui referido significa um ligante que compreende um sítio de processamento intracelular.

[0084] Em construções que incluem mais do que um sítio de processamento ou clivagem, ficará entendido que tais sítios podem ser os mesmos ou diferentes.

[0085] Um ligante processável como aqui utilizado refere-se a um ligante que compreende pelo menos um sítio de processamento intracelular, o qual é descrito em outro local nesta invenção.

[0086] Linha de base, como aqui utilizada, é o menor nível de FIX no plasma medido em um indivíduo antes da administração de uma dose. Os níveis de FIX no plasma podem ser medidos em dois momentos antes da dosagem: em uma visita de triagem e imediata

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35/203 mente antes da dosagem. Alternativamente, (a) a linha de base em indivíduos cuja atividade de FIX de pré-tratamento é <1%, a qual não possui o antígeno de FIX detectável, e possui genótipos de não sentido, pode ser definida como 0%, (b) a linha de base para os indivíduos com atividade de FIX de pré-tratamento <1% e que possui antígeno de FIX detectável pode ser fixada em 0,5%, (c) a linha de base para os indivíduos cuja atividade de FIX de pré-tratamento está entre 1 a 2% é Cmin (a menor atividade em todo o estudo de PK), e (d) a linha de base para os indivíduos cuja atividade de FIX de pré-tratamento é >2% pode ser fixada em 2%.

[0087] Indivíduo, como aqui utilizado, significa um ser humano. Indivíduo como aqui utilizado inclui um indivíduo que é conhecido de ter, pelo menos, uma incidência de episódios de hemorragia descontrolados, que foi diagnosticado com uma doença ou distúrbio associado com episódios descontroladas de hemorragia, por exemplo, uma doença ou distúrbio hemorrágico, por exemplo, hemofilia B, os quais são suscetíveis de episódios hemorrágicos descontrolados, por exemplo, hemofilia, ou quaisquer combinações destes. Os indivíduos também podem incluir um indivíduo que está em perigo de uma ou mais episódios de hemorragia descontroláveis antes de uma certa atividade, por exemplo, uma cirurgia, uma atividade esportiva ou quaisquer atividades extenuantes. O indivíduo pode ter uma atividade do FIX de linha de base menor do que 1%, menor do que 0,5%, menor do que 2%, menor do que 2,5%, menor do que 3% ou menor do que 4%. Os indivíduos também incluem seres humanos pediátricos. Indivíduos humanos pediátricos são do nascimento até 20 anos, preferivelmente do nascimento até 18 anos, do nascimento até 16 anos, do nascimento até 15 anos, do nascimento até 12 anos, do nascimento até 11 anos, do nascimento até 6 anos, do nascimento até 5 anos, do nascimento até 2 anos, e de 20 a 11 anos de idade.

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36/203 [0088] Tratar, tratamento, tratando como utilizado nesta invenção refere-se, por exemplo, à redução da gravidade de uma doença ou condição; a redução na duração de um curso da doença; a melhora de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição; o fornecimento de efeitos benéficos a um indivíduo com uma doença ou condição, sem necessariamente a cura da doença ou condição, ou a profilaxia de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição. Em uma modalidade, o termo tratar ou tratamento significa a manutenção de um nível mínio de FIX pelo menos cerca de 1 lU/dL, 2 lU/dL, 3 lU/dL, 4 lU/dL, 5 lU/dL, 6 lU/dL, 7 lU/dL, 8 lU/dL, 9 lU/dL, 10 lU/dL, 11 lU/dL, 12 lU/dL, 13 lU/dL, 14 lU/dL, 15 lU/dL, 16 lU/dL, 17 lU/dL, 18 lU/dL, 19 lU/dL ou 20 lU/dL em um indivíduo através da administração de uma proteína de fusão da divulgação. Em outra modalidade, tratar ou tratamento significa a manutenção de um nível mínimo de FIX entre cerca de 1 e cerca de 20 ILJ/dL, cerca de 2 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 3 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 4 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 5 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 6 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 7 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 8 e cerca de 20 lU/dL, cerca de 9 e cerca de 20 lU/dL ou cerca de 10 e cerca de 20 lU/dL. O tratamento ou tratando uma doença ou condição pode também incluir a manutenção da atividade do FIX em um indivíduo em um nível comparável a pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% da atividade do FIX em um indivíduo não hemofílico. O nível mínimo requerido para o tratamento pode ser medido por um ou mais métodos conhecidos e pode ser ajustado (aumentado ou diminuído) para cada pessoa.

[0089] O distúrbio hemostático, como aqui utilizado, significa uma condição geneticamente herdada ou adquirida caracterizada por uma tendência à hemorragia, espontaneamente ou como resultado de um

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37/203 trauma, devido a uma capacidade deteriorada ou incapacidade para formar um coágulo de fibrina. Exemplos de tais distúrbios incluem as hemofilias. As três formas principais são hemofilia A (deficiência do Fator VIII), hemofilia B (deficiência do Fator IX ou doença de Christmas ) e hemofilia C (deficiência do Fator XI, tendência de hemorragias leve). Outros distúrbios hemostáticos incluem, por exemplo, a doença de Von Willebrand, deficiência do Fator XI (deficiência de PTA), deficiência do Fator XII, deficiências ou anomalias estruturais em fibrinogênio, protrombina, Fator V, Fator VII, Fator X ou Fator XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que é um defeito ou deficiência em GPIb. GPIb, o receptor para VWF, pode estar com defeito e conduzir a falta de formação de coágulo primário (hemostase primária) e aumento da tendência para hemorragia), e trombastenia de Glanzman e Naegeli (trombastenia de Glanzmann). Na insuficiência hepática (formas aguda e crônica), existe produção insuficiente de fatores de coagulação pelo fígado; isto pode aumentar o risco de hemorragia.

[0090] Como aqui utilizado, o termo hemorragia aguda refere-se a um episódio de hemorragia independente da causa subjacente. Por exemplo, um indivíduo pode ter trauma, uremia, um distúrbio hemorrágico hereditário (por exemplo, deficiência do Fator VII), um distúrbio de plaquetas, ou resistência devido ao desenvolvimento de anticorpos para fatores de coagulação.

IL PROTEÍNAS DE FUSÃO DO FIX [0091] A presente invenção é direcionada à administração subcutânea de uma proteína de fusão do FIX que compreende um polipeptídeo do FIX e pelo menos um componente heterólogo inserido dentro do polipeptídeo do FIX, fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX, ou ambos. Certos aspectos da presente invenção são direcionados à administração subcutânea de uma proteína de fusão do FIX que compreende um polipeptídeo do FIX e um componente heterólogo, por

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38/203 exemplo, uma região Fc, em que o polipeptídeo do FIX compreende uma mutação R338L (mutação Padua). A proteína de fusão do FIX, após a inserção da fusão ao componente heterólogo, pode reter uma ou mais atividades do FIX. Em uma modalidade, a atividade do FIX é uma atividade pró-coagulante. O termo atividade pró-coagulante significa a capacidade da proteína do FIX da presente invenção em participar da cascata de coagulação no sangue, substituindo o FIX nativo. Por exemplo, uma proteína do FIX recombinante da presente invenção possui atividade pró-coagulante quando ela pode converter o Fator X (FX) em Fator X ativado (FXa) na presença do Fator VIII (FVIII), conforme testado, por exemplo, em um ensaio cromogênico. Em outra modalidade, a atividade do FIX é uma capacidade de gerar um complexo tenase. Em outras modalidades, a atividade do FIX é a capacidade de gerar trombina (ou coágulo).

[0092] Uma proteína do FIX recombinante da presente invenção não necessita expor 100% da atividade de pró-coagulante do FIX humano maduro nativo. De fato, em certos aspectos um componente heterólogo inserido em um polipeptídeo do FIX da presente invenção pode aumentar a meia-vida ou a estabilidade da proteína de forma significativa, de tal modo que a atividade mais baixa é perfeitamente aceitável. Assim, em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção possui, pelo menos, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 100% da atividade prócoagulante do FIX nativo. No entanto, em algumas modalidades da presente invenção, a proteína do FIX recombinante da presente invenção pode ter mais do que 100% de atividade do FIX nativo para proteínas contendo a variante de elevada atividade de FIX Pádua R338L, por exemplo, pelo menos cerca de 105%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ou 200% ou mais desta atividade.

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39/203 [0093] A atividade pró-coagulante pode ser medida por qualquer ensaio in vitro ou in vivo adequado. A atividade do FIX pode ser medida a jusante da cascata de coagulação através do monitoramento da geração de um coágulo (ensaios de coagulação), ou a montante através da medição direta da atividade enzimática de FX após a ativação pelo complexo de FVIII-FIX (ensaios cromogênicos) (ver, por exemplo, Barrowcliffe et al., Semin. Thromb. Haemost. 28: 247-56 (2002); Lee et ai., Thromb. Haemost. 82: 1644-47 (1999); Lippi et al., Clin. Chem. Lab. Med. 45: 2-12 (2007); Matsumoto et al., J. Thromb. Haemost. 4: 377-84 (2006)). Assim, a atividade pró-coagulante pode ser medida utilizando um ensaio de substrato cromogênico, um ensaio de coagulação (por exemplo, um ensaio de coagulação de um estágio ou um ensaio de coagulação de dois estágios), ou ambos. O mecanismo de ensaio cromogênico baseia-se nos princípios da cascata de coagulação do sangue, onde o FIX ativado converte FX em FX_a na presença de FVIII, fosfolipídeos e íons de cálcio. A atividade de FX_a é avaliada por meio de hidrólise de um substrato de p-nitroanilida (pNA) específico do FX_a. A taxa inicial de liberação de p-nitroanilina medida em 405 nm é diretamente proporcional à atividade do FX_a e assim à atividade do de FIX na amostra. O ensaio cromogênico é recomendado pelo Factor VIII and Factor IX Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee (SSC) of the International Society on Thrombosis and Hemostasis (ISTH).

[0094] Outros ensaios adequados úteis para determinar a atividade pró-coagulante incluem aqueles divulgados, por exemplo, na Publicação do Pedido U.S. No. 2010/0022445 de Scheiflinger and Dockal, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0095] Em certos aspectos a atividade pró-coagulante de uma proteína do FIX recombinante da divulgação é comparada com o FIX maduro nativo, em certos aspectos é comparada a um padrão internacioPetição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 57/727

40/203 nal.

[0096] O pelo menos um componente heterólogo como descrito com maiores detalhes abaixo, pode compreender qualquer componente heterólogo ou pode ser um componente que possa fornecer uma propriedade melhorada à proteína recombinante. Por exemplo, em um aspecto, um componente heterólogo útil para a presente invenção pode ser um componente que seja capaz de prolongar a meia-vida da proteína do FIX ou um componente que é capaz de melhorar a estabilidade da proteína do FIX. A proteína de fusão do FIX da presente invenção pode ter mais do que um componente heterólogo inserido ou fundido ao polipeptídeo do FIX. Em uma modalidade, os mais do que um componentes heterólogos são idênticos. Em outros modalidades, os mais do que um componentes heterólogos são diferentes. Em outras modalidades, o componente heterólogo é selecionado do grupo que consiste em um XTEN, uma albumina, um peptídeo de ligação a albumina, uma molécula pequena de ligação a albumina, um domínio Fc, um par de ligação FcRn, um PAS, um CTP, um PEG, um HES, um PSA ou qualquer combinação dos mesmos.

[0097] Em algumas modalidades, pelo menos um componente heterólogo é inserido dentro de um domínio do polipeptídeo do FIX, mas não entre os domínios. Um polipeptídeo do FIX compreende vários domínios, por exemplo, um domínio de ácido γ-carboxiglutâmico (GLA), um domínio semelhante ao fator de crescimento epidérmico 1 (EGF1), um domínio semelhante ao fator de crescimento epidérmico 2 (EGF2), um domínio de peptídeo de ativação (AP), uma ligante entre o domínio EGF2 e o domínio AP, e um domínio catalítico (por exemplo, um domínio de serina protease). Um zimogênio de FIX compreende 461 aminoácidos: os aminoácidos de 1 a 28 (que correspondem a SEQ ID NO: 3) são um peptídeo de sinal; aminoácidos de 29 a 46 (que correspondem à SEQ ID NO: 3) são um pró-peptídeo; seguido pela

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41/203 sequência de proteína do FIX de aminoácido 415. Este FIX processado por 415 compreende aminoácidos de 1 a 145 (que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) é uma cadeia leve do FIX; os aminoácidos de 146 a 180 são um peptídeo de ativação; e os aminoácidos de 181 a 415 (que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) são a cadeia pesada do FIX catalítico. Dentro das cadeias leves e pesadas, o domínio GLA corresponde aos aminoácidos de 1 a 46 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; o domínio EGF1 corresponde aos aminoácidos de 47 a 84 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; o domínio EGF2 corresponde aos aminoácidos de 85 a 127 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; o ligante entre o domínio EGF2 e o domínio AP corresponde aos aminoácidos de 128 a 145 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; o domínio AP corresponde aos aminoácidos de 146 a 180 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; e o domínio catalítico corresponde aos aminoácidos de 181 a 415 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0098] Em certas modalidades, pelo menos um componente heterólogo é inserido dentro de um ou mais domínios de um polipeptídeo do FIX. Por exemplo, pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, pode ser inserido dentro de um domínio selecionado do grupo que consiste do domínio GLA, do domínio EGF1, do domínio EGF2, do domínio AP, do ligante entre o domínio EGF2 e o domínio AP, do domínio catalítico, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade particular, o pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do domínio GLA, por exemplo, aminoácidos de 1 a 46 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particular, o pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do domínio EGF1, por exemplo, aminoácidos de 47 a 83 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particular, o pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do domínio EGF2, por exemplo,

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42/203 aminoácidos de 84 a 125 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do ligante entre o domínio EGF2 e o domínio AP, por exemplo, aminoácidos de 132 a 145 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particular, o pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do domínio AP, por exemplo, aminoácidos de 146 a 180 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do domínio catalítico, por exemplo, aminoácidos de 181 a 415 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0099] Em algumas modalidades, um ou mais componentes heterólogos podem ser inseridos dentro de vários sítios de inserção. Em certas modalidades, as inserções de pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, um XTEN, em um ou mais destes sítios não resultam em uma perda de atividade do FIX e/ou induzem uma propriedade melhodada da proteína do FIX. Por exemplo, pelo menos um componente heterólogo pode ser inserido dentro do polipeptideo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 166 da SEQ ID NO:

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43/203 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2), aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2 (isto é, imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2) e qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade prócoagulante.

[00100] Em uma modalidade, o componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, o componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado

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44/203 do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, e ambos. Em outra modalidade, o componente heterólogo, por exemplo, XTEN, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 142 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[00101] Como debatido com maiores detalhes abaixo, o componente heterólogo pode ser um XTEN, que pode ser de comprimentos variáveis. Por exemplo, o XTEN pode compreender pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos, pelo menos cerca de 288 aminoácidos ou pelo menos cerca de 864 aminoácidos. Em algumas modalidades, o XTEN é selecionado do grupo que consiste em AE42, AG42, AE72, AG72, AE144, AG144, AE288, AG288, AE864 e AG864. Exemplos não limitativos dos XTENs que pode ser inseridos ou fundidos a um polipeptídeo do FIX são incluídos em outro lugar nesta invenção.

[00102] Em algumas modalidades, um XTEN que compreende 42 aminoácidos, por exemplo, AE42 ou AG42, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

[00103] Em algumas modalidades, um XTEN que compreende 72 aminoácidos, por exemplo, AE72 ou AG72, é inserido dentro do poli

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45/203 peptideo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e qualquer combinação dos mesmos, ou o XTEN é fundido com o C-terminal, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

[00104] Em algumas modalidades, um XTEN que compreende 144 aminoácidos, por exemplo, AE144 ou AG 144, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2,aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

[00105] Em algumas modalidades, um XTEN que compreende 288 aminoácidos, por exemplo, AE288 ou AG288, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

[00106] Em mais outras modalidades, um XTEN que compreende

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864 aminoácidos, por exemplo, AE864 ou AG8648, é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

[00107] A proteína de fusão do FIX da presente invenção pode ainda compreender um segundo componente heterólogo, por exemplo, um segundo XTEN, inserido dentro do FIX, fundido com o C-terminal do FIX, ou ambos. O segundo componente heterólogo pode ser inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2, e qualquer combinação dos mesmos ou em que o segundo XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX. Em algumas modalidades, o primeiro XTEN e o segundo XTEN são inseridos dentro do polipeptídeo do FIX em sítios de inserção que corresponde a um aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2 e/ou fundido com o Cterminal do polipeptídeo do FIX selecionado do grupo que consiste em aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2; aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e aminoácido 224

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47/203 da SEQ ID NO: 1 ou 2; aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e fundido com o C-terminal; aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2; aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e fundido com o C-terminal; e aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2 e fundido com o C-terminal, respectivamente. Em uma modalidade, o primeiro XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, e o segundo XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX.

[00108] O segundo XTEN pode compreender pelo menos cerca de 6 aminoácidos, pelo menos cerca de 12 aminoácidos, pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos ou pelo menos cerca de 288 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo XTEN compreende 6 aminoácidos, 12 aminoácidos, 36 aminoácidos, 42 aminoácidos, 72 aminoácidos, 144 aminoácidos ou 288 aminoácidos. O segundo XTEN pode ser selecionado do grupo que consiste em AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade particular, o segundo XTEN é AE72 ou AE144.

[00109] Em uma modalidade particular, o segundo XTEN compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, e qualquer combinação dos mesmos.

[00110] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX ainda compreende um terceiro, um quarto, um quinto e/ou um sexto XTEN. [00111] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX com

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48/203 preende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 153 sem o peptídeo de sinal e a sequência de propeptídeo. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 153 sem o peptídeo de sinal e a sequência de propeptídeo. Em uma modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 119, 120, 121 e 123 sem o peptídeo de sinal e a sequência de propeptídeo. Em outra modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 119, 120, 123, 121 e 226 ou 122 sem o peptídeo de sinal e a sequência de propeptídeo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX é selecionada do grupo que consiste em FIX-AP.72, FIX-AP.144, FIX-CT.72, FIX-CT.144, FIXAP.288 e FIX-CT.288 sem o peptídeo de sinal e a sequência de propeptídeo.

[00112] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende dois tipos diferentes de componentes heterólogos. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX, um XTEN e um domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) ou um fragmento destes. Em algumas modalidades, o XTEN é inserido dentro do FIX, e o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn)

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49/203 ou um fragmento destes é fundido com o C-terminal do FIX. Em algumas modalidades, o XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um ou mais sítios de inserção selecionados dos sítios de inserção listados na tabela 3. Em uma modalidade, o XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 1 ou 2, e aminoácido 413 da SEQ ID NO: 1 ou 2; e o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) ou um fragmento destes é fundido com o C-terminal do FIX. Em certas modalidades, o XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 105 da SEQ ID NO: 1 ou 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 1 ou 2, e aminoácido 224 da SEQ ID NO: 1 ou 2; e o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) ou um fragmento destes é fundido com o C-terminal do FIX. Em algumas modalidades, o XTEN é selecionado de AE42, AE72, e AE144.

[00113] Em certos aspectos da presente invenção, a proteína de fusão do FIX compreende uma ou duas cadeias de polipeptídeo. Em uma modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende duas cadeias de polipeptídeo, em que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende polipeptídeo do FIX fundido a um domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn), e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende um segundo domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) e o segundo domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) estão associados por uma ligação covalente.

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50/203 [00114] Em outra modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende uma cadeia única de polipeptídeo que compreende um polipeptídeo do FIX e um domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn). Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX ainda compreende um ligante, que liga o polipeptídeo do FIX e o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn). Em outra modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX, um domínio Fc e um segundo domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn). Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX ainda compreende um ligante, que liga o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) e o segundo domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn). Em outra modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX, um domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn), e um segundo domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn), em que o polipeptídeo do FIX é conectado com o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) por um ligante. Em outra modalidade, a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX, um domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn), e um segundo domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn), em que o polipeptídeo do FIX é conectado com o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) por um primeiro ligante, e em que o domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) é conectado com o segundo domínio Fc (ou um par de ligação a FcRn) através de um ligante. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende uma fórmula selecionada do grupo que consiste em:

(i) FIX(X)-F1;

(ii) FIX(X)-L1-F1;

(iii) FIX(X)-F1-F2;

(iv) FIX(X)-L1-F1-F2;

(v) FIX(X)-L1-F1-L2-F2;

(vi) FIX(X)-F1-L1-F2;

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51/203 (vii) FIX(X)-F1 :F2;

(viii) FIX(X)-L1-F1:F2; e (ix) qualquer combinação das mesmas, em que FIX(X) é um polipeptídeo do FIX tendo um XTEN inserido em um ou mais sítios de inserção aqui descritos; cada um de L1 e L2 é um ligante; F1 é um domínio Fc ou um par de ligação a FcRn; F2 é um segundo domínio Fc ou um segundo par de ligação a FcRn, (-) é uma ligação de peptídeo ou um ou mais aminoácidos; e (:) é uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação de dissulfeto.

[00115] Os ligantes (L1 e L2) podem ser os mesmos ou diferentes. O ligante pode ser clivável ou não clivável, e o ligante pode compreender um ou mais sítios de processamento intracelular. Exemplos não limitativos dos ligantes são aqui descritos em outro lugar. Qualquer um dos ligantes pode ser utilizado para combinar FIX com um componente heterólogo (por exemplo, XTEN ou Fc) ou um primeiro componente heterólogo (por exemplo, primeiro Fc) com um segundo componente heterólogo (por exemplo, segundo Fc).

[00116] Em certas modalidades, o ligante compreende um sítio de divagem de trombina. Em uma modalidade particular, o sítio de divagem de trombina compreende XVPR, em que X é qualquer aminoácido alifático (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, ou isoleucina). Em uma modalidade particular, o sítio de divagem de trombina compreende LVPR. Em algumas modalidades, o ligante compreende um motivo de interação exossítio PAR1, que compreende SFLLRN (SEQ ID NO: 190). Em algumas modalidades, o motivo de interação exossítio PAR1 ainda compreende uma sequência de aminoácido selecionada de P, PN, PND, PNDK (SEQ ID NO: 191), PNDKY (SEQ ID NO: 192), PNDKYE (SEQ ID NO: 193), PNDKYEP (SEQ ID NO: 194), PNDKYEPF (SEQ ID NO: 195), PNDKYEPFW (SEQ ID NO: 196), PNDKYEPFWE (SEQ ID NO: 197), PNDKYEPFWED (SEQ ID NO:

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198), PNDKYEPFWEDE (SEQ ID NO: 199), PNDKYEPFWEDEE (SEQ ID NO: 200), PNDKYEPFWEDEES (SEQ ID NO: 201), ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades o ligante compreende o sítio de divagem do FXIa LDPR.

[00117] Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX e um componente heterólogo, que compreende um XTEN, em que o XTEN é fundido com ou sem um ligante, em que o ligante pode ou não ser clivável, ao C-terminal do polipeptídeo do FIX e compreende uma sequência de aminoácido de mais do que 42 aminoácidos e menos do que 864 aminoácidos de comprimento, preferivelmente menos do que 144 aminoácidos de comprimento. O XTEN pode compreender uma sequência de aminoácido de mais do que 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 71 aminoácidos e menos do que 140, 139, 138, 137, 136, 135, 134, 133, 132, 131, 130, 129, 128, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 76, 75, 74 ou 73 etc., aminoácidos ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o XTEN é de 72 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade particular, o XTEN é AE72. Em outra modalidade, o XTEN compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 35.

[00118] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX que contém pelo menos uma sequência de XTEN inserida sequence e um componente heterólogo que

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53/203 compreende um XTEN, em que o XTEN é fundido com ou sem um ligante, que ligante pode ou não ser clivável, ao C-terminal do polipeptídeo do FIX. Em algumas modalidades, o XTEN é menos do que 864 aminoácidos de comprimento, preferivelmente menos do que 144 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o XTEN compreende uma sequência de aminoácido de menos do que 244, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, ou 75 aminoácidos de comprimento.

[00119] Em outras modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende uma fórmula selecionada do grupo que consiste em:

(i) FIX-X (ii) FIX-L1-X (iii) FIX(X)-X (iv) FIX(X)-L1-X (v) FIX(X)-L1 :X (vi) qualquer combinação das mesmas, em que o FIX é um polipeptídeo do FIX; FIX(X) é um polipeptídeo do FIX tendo pelo menos um XTEN inserido em um ou mais sítios de inserção aqui descritos; (X) é um XTEN que é mais longo do que 42 aminoácidos e menos do que 144 aminoácidos; X é um XTEN que é mais longo do que 42 aminoácidos e menos do que 864 aminoácidos tal como 288 aminoácidos, preferivelmente menos do que 144 aminoácidos (por exemplo, um XTEN com 72 aminoácidos); L1 é um ligante; (-) é uma ligação de peptídeo ou um ou mais aminoácidos; e (:) é uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação de dissulfeto.

[00120] O ligante (L1) pode ser o mesmo ou diferente. O ligante pode ser clivável ou não clivável conforme necessário e o ligante pode compreender um ou mais sítios de processamento intracelular. Exemplos não limitativos dos ligantes são aqui descritos em outro lugar. Qualquer um dos ligantes pode ser utilizado para combinar o FIX com um componente heterólogo (por exemplo, XTEN ou Fc). O que se se

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54/203 gue são exemplos não limitativos de ligantes que são adequados para muitas modalidades da invenção:

a) GPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHHH (SEQ ID NO: 219, Trombina);

b) GAGSPGAETALVPRGAGSPGAETAG (SEQ ID NO: 220, TrombinaPAR1);

c) GAGSPGAETALVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEESGAGSPGAETA (SEQ ID NO: 221);

d) GPEGPSKLTRAETGAGSPGAETA (SEQ ID NO: 222)

e) GGGGALRPRVVGGAGSPGAETA (SEQ ID NO: 223)

f) GGGGTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEKGGAGSPGAETA (SEQ ID NO: 224)

g) GGAGSPGAETA (SEQ ID NO: 225) [00121] Em certas outras modalidades, o ligante compreende um sítio de divagem de trombina. Em uma modalidade particular, o sítio de divagem de trombina compreende XVPR, em que X é qualquer aminoácido alifático (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, ou isoleucina). Em uma modalidade particular, o sítio de divagem de trombina compreende LVPR. Em algumas modalidades, o ligante compreende um motivo de interação exossítio PAR1, que compreende SFLLRN (SEQ ID NO: 190). Em algumas modalidades, o motivo de interação exossítio PAR1 ainda compreende uma sequência de aminoácido selecionada de P, PN, PND, PNDK (SEQ ID NO: 191), PNDKY (SEQ ID NO: 192), PNDKYE (SEQ ID NO: 193), PNDKYEP (SEQ ID NO: 194), PNDKYEPF (SEQ ID NO: 195), PNDKYEPFW (SEQ ID NO: 196), PNDKYEPFWE (SEQ ID NO: 197), PNDKYEPFWED (SEQ ID NO: 198), PNDKYEPFWEDE (SEQ ID NO: 199), PNDKYEPFWEDEE (SEQ ID NO: 200), PNDKYEPFWEDEES (SEQ ID NO: 201), ou qualquer combinação dos mesmos. Em certa outra modalidade o ligante compreende um sítio de divagem do FXIa que compreende LDPR (SEQ ID NO: 232), que pode ser combinado com o motivo de

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55/203 interação exossítio PAR1.

[00122] Em certas modalidades, o polipeptídeo do FIX fundido a um XTEN no C-terminal pode ainda compreender um segundo XTEN. O segundo XTEN pode ser fundido ou inserido em qualquer parte da proteína de fusão do FIX, incluindo, mas não limitado aos sítios de inserção aqui divulgados. A proteína de fusão do FIX pode ainda compreender um terceiro XTEN, um quarto XTEN, um quinto XTEN, ou um sexto XTEN.

[00123] A proteína de fusão do FIX da presente invenção mantém um nível de atividade comparado com o FIX nativo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX possui pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou 100% da atividade pró-coagulante do FIX nativo. A atividade pró-coagulante pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a um ensaio de substrato cromogênico, um ensaio de coagulação de um estágio, ou ambos.

II.A. Fator IX [00124] O Fator IX Humano (FIX) é uma serina protease que é um importante componente da via intrínseca da cascata de coagulação do sangue. Fator IX ou FIX, como aqui utilizado, refere-se a uma proteína do fator de coagulação e suas espécies e variantes de sequência, e inclui, mas não é limitada à sequência de aminoácido de cadeia única 461 do polipeptídeo precursor do FIX humano (prepro), à sequência de aminoácido de cadeia única 415 do FIX humano maduro (SEQ ID NO: 1) e à variante do FIX R338L (Padua) (SEQ ID NO: 2). Ο FIX inclui qualquer forma de molécula de FIX com as características típicas do FIX de coagulação sanguínea. Como aqui utilizado Fator

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IX e FIX destinam-se a abranger polipeptídeos que compreendem os domínios Gia (região contendo resíduos de ácido γcarboxiglutâmico), EGF1 e EGF2 (regiões que contêm sequências homólogas ao fator de crescimento epidérmico humano), peptídeo de ativação (AP, formado por resíduos R136-R180 do FIX maduro), e o domínio C-terminal de protease (Pro), ou sinônimos estes domínios conhecidos na técnica, ou pode ser um fragmento truncado ou uma variante de sequência que retém pelo menos uma parte da atividade biológica da proteína nativa. O FIX ou variantes de sequência foram clonados, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.770.999 e 7.700.734, e o cDNA que codifica o Fator IX humano foi isolado, caracterizado e clonado em vetores de expressão (ver, por exemplo, Choo etal., Nature 299:178-180 (1982); Fair et al., Blood 64:194-204 (1984); and Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982)). Uma variante particular do FIX, a variante do FIX R338L (Padua) (SEQ ID NO: 2), caracterizada por Simioni etal, 2009, compreende uma mutação de ganho de função, que se correlaciona com um aumento de quase 8 vezes na atividade da variante Padua em relação ao FIX nativo (Tabela 1). As variantes do FIX também podem incluir qualquer polipeptídeo do FIX tendo uma ou mais substituições conservatives de aminoácido, que não afetam a atividade do FIX do polipeptídeo do FIX.

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Tabela 1: Exemplo de Sequências do FIX

SEQ IP NO: 1 (polipeptídeo do FIX maduro) :YNSGKLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ CESNPCLNGG 61 :SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK NSADNKVVCS CTEGYRLAEN

121 :QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF PDVDYVNSTE AETILDNITQ STQSFNDFTR

181 :VVGGEDAKPG QFPWQVVLNG KVDAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT VVAGEHNIEE

241 :TEHTEQKRNV IRIIPHHNYN AAINKYNHDI ALLELDEPLV LNSYVTPICI ADKEYTNIFL

301 :KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VDRATCLRST KFTIYNNMFC AGFHEGGRDS 361 :CQGDSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK VSRYVNWIKE KTKLT SEQ ID NO: 2 (Polipeptideo do FIX maduro Padua(R338L)) :YNSGKLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVPGPQ CESNPCLNGG 61 :SCKPPINSYE CWCPFGFEGK NCELPVTCNI KNGRCEQFCK NSAPNKVVCS CTEGYRLAEN

121 :QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF PPVPYVNSTE AETILPNITQ STQSFNPFTR

181 :VVGGEPAKPG QFPWQVVLNG KVPAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT VVAGEHNIEE

241 :TEHTEQKRNV IRIIPHHNYN AAINKYNHPI ALLELPEPLV LNSYVTPICI APKEYTNIFL

301 :KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VPRATCLLST KFTIYNNMFC AGFHEGGRPS

361 :CQGPSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK VSRYVNWIKE KTKLT

SEQ IP NO: 3 (Polioeotídeo de Sinal do FIX e Prooeotídeo}

1: MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAEC7V FLDHENANKILNRPKR [00125] O polipeptideo do FIX é de 55 kDa, sintetizado como uma cadeia de prepropolipeptídeo (SEQ ID NO: 1) composto de três regiões: um peptídeo de sinal de 28 aminoácidos (aminoácidos 1 a 28 da SEQ ID NO: 3), um pró-peptídeo de 18 aminoácidos (aminoácidos 29 a 46), o qual é requerido para gama-carboxilação dos resíduos de ácido glutâmico, e um Fator IX maduro de 415 aminoácidos (SEQ ID NO: 1 ou 2). O pró-peptídeo é uma sequência de 18 resíduos de aminoácido N-terminal para o domínio de gama-carboxiglutamato. O própeptídeo se liga à gama carboxilase dependente da vitamina K e depois é clivado a partir do polipeptideo precursor do FIX por uma protease endógena, mais provável PACE (enzima de divagem de aminoácido básica emparelhada), também conhecida como furina ou PCSK3. Sem a gama carboxilação, o domínio Gla é incapaz de se ligar ao cálcio para assumir a conformação correta necessária para ancorar a proteína às superfícies de fosfolipídeo negativamente carregadas, tornando assim o Fator IX não funcional. Mesmo que seja carboxilado, o domínio Gla também depende da divagem do pró-peptídeo

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58/203 para a função apropriada, visto que o pró-peptídeo retido interfere com as alterações conformacionais do domínio Gla necessárias para a ligação ideal ao cálcio e fosfolipídeo. Nos seres humanos, o Fator IX maduro resultante é secretado pelas células do fígado para dentro da corrente sanguínea como um zimogênio inativo, uma proteína de cadeia única de resíduos de aminoácido 415 que contém aproximadamente 17% de hidratos de carbono em peso (Schmidt, A. E., et al. (2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39).

[00126] O FIX maduro é composto de vários domínios que em uma configuração N- para C-terminal são: um domínio GLA, um domínio EGF1, um domínio EGF2, um domínio de peptídeo de ativação (AP), e um domínio de protease (ou catalítico). Um ligante curto se conecta ao domínio EGF2 com o domínio de AP. O FIX contém dois peptídeos de ativação formados por R145-R180 e A146-V181, respectivamente. Após a ativação, o FIX de cadeia única torna-se uma molécula de 2 cadeias, em que as duas cadeias estão ligadas por uma ligação de dissulfeto. Os fatores de coagulação podem ser planejados através da substituição de seus peptídeos de ativação, resultando na especificidade de ativação alterada. Nos mamíferos, o FIX maduro deve ser ativada pelo Fator XI ativado para produzir o Fator IXa. O domínio de protease fornece, depois da ativação de FIX em FIXa, a atividade catalítica do FIX. O Fator VIII ativado (FVIIIa) é o cofator para a expressão completa da atividade de FIXa.

[00127] Em outras modalidades, um polipeptídeo do FIX compreende uma forma alélica Thr148 do Fator IX derivado de plasma e possui características estruturais e funcionais semelhantes ao Fator IX endógeno.

[00128] Grande quantidade de variantes do FIX funcionais é conhecida. A publicação internacional número WO 02/040544 A3 divulga mutantes que apresentam aumento da resistência à inibição por hepa

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59/203 rina na página 4, linhas 9 a 30 e página 15, linhas 6 a 31. A publicação internacional número WO 03/020764 A2 divulga mutantes de FIX com imunogenicidade reduzida de células T nas Tabelas 2 e 3 (nas páginas 14 a 24), e na página 12, linhas 1 a 27. A publicação internacional número WO 2007/149406 A2 divulga moléculas de FIX mutantes funcionais que apresentam estabilidade de proteína aumentada, meia-vida in vivo e in vitro aumentada, e aumento da resistência a proteases na página 4, linha 1 até a página 19, linha 11. A WO 2007/149406 A2 também divulga moléculas de FIX quiméricas e outras variantes na página 19, linha 12, até a página 20, linha 9. A publicação internacional número WO 08/118507 A2 divulga mutantes de FIX que apresentam atividade de coagulação aumentada na página 5, linha 4 até a página 6, linha 5. A publicação internacional número WO 09/051717 A2 divulga mutantes de FIX tendo um número aumentado de sítios de glicosilação N-conectados e/ou O-conectados, que resulta em uma meiavida e/ou recuperação aumentada na página 9, linha 11 até página 20, linha 2. A publicação internacional número WO 09/137254 A2 também divulga mutantes de Fator IX com aumento dos números de sítios de glicosilação na página 2, parágrafo [006] a página 5, parágrafo [011] e página 16, parágrafo [044] a página 24, parágrafo [057]. A publicação internacional número WO 09/130198 A2 divulga moléculas de FIX mutantes funcionais que possuem um número aumentado de sítios de glicosilação, que resultam em uma meia-vida aumentada, na página 4, linha 26 até a página 12, linha 6. A publicação internacional número WO 09/140015 A2 divulga mutantes de FIX funcionais em que um aumento do número de resíduos Cys, que podem ser utilizados para a conjugação de polímeros (por exemplo, PEG), na página 11, parágrafo [0043] até a página 13, parágrafo [0053]. Os polipeptídeos do FIX descritos no Pedido Internacional No. PCT/US2011/043569 depositado em 11 de Julho de 2011 e publicado como WO 2012/006624 em 12 de

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Janeiro de 2012 também são incorporados nesta invenção por referência na sua totalidade.

[00129] Além disso, centenas de mutações não funcionais no FIX foram identificadas em indivíduos hemofílicos, muitas das quais são descritas na Tabela 5, nas páginas 11 a 14 da publicação internacional número WO 09/137254 A2. Tais mutações não funcionais não são incluídas na divulgação, mas fornecem orientação adicional para que as mutações sejam mais ou menos prováveis de resultar em um polipeptídeo do FIX funcional.

[00130] Em uma modalidade, o polipeptídeo do FIX (ou parte do Fator IX de um polipeptídeo de fusão) compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 2 (aminoácidos 1 a 415 da SEQ ID NO: 1 ou 2), ou alternativamente, com uma sequência de pró-peptídeo, ou com uma sequência de pró-peptídeo e sinal (FIX de comprimento total). Em outra modalidade, o polipeptídeo do FIX compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 2.

[00131] A atividade coagulante do Fator IX é expressa como Unidades Internacionais (IU). Uma IU da atividade do FIX corresponde aproximadamente à quantidade de FIX em um mililitro de plasma humano normal. Vários ensaios estão disponíveis para a medição da atividade do Fator IX, incluindo o ensaio de coagulação de um estágio (tempo de tromboplastina parcial ativada; aPTT), tempo de geração de trombina (TGA) e tromboelastometria rotacional (ROTEM®). A divulgação contempla sequências que possuem homologia com as sequências de

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FIX, os fragmentos de sequência que são naturais, tais como de seres humanos, primatas não humanos, mamíferos (incluindo animais domésticos), e variantes de sequência não naturais que retêm pelo menos uma parte da atividade biológica ou função biológica do FIX e/ou que são úteis para a prevenção, tratamento, mediação ou melhora de uma doença, deficiência, distúrbio ou condição relacionada com o fator de coagulação (por exemplo, episódios hemorrágicos relacionados com trauma, cirurgia, deficiência de um fator de coagulação). Sequências com homologia ao FIX humano podem ser encontradas através de técnicas de pesquisa de homologia padrão, tais como NCBI BLAST.

II.B. Componentes Heteróloqos [00132] Uma proteína de fusão do FIX da presente invenção pode compreender pelo menos um componente heterólogo inserido em um ou mais sítios dentro do polipeptídeo do FIX, fundido com o C-terminal, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade prócoagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Um componente heterólogo pode compreender um polypeptídeo heterólogo, ou um componente não polipeptídeo, ou ambos. Em certos aspectos, o componente heterólogo é um XTEN. Em alguns aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um XTEN inserido em um ou mais sítios dentro do polipeptídeo do FIX. Em alguns aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos uma região Fc fundida com o C-terminal do polipeptídeo do FIX. Em outros aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende pelo menos um componente heterólogo inserido em um ou mais sítios dentro do polipeptídeo do FIX, em que o componente heterólogo é um componente de prolongamento da meia-vida (por exemplo, um componente de prolongamento da meia-vida in vivo).

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62/203 [00133] Acredita-se que o descobrimento dos sítios de inserção em que o FIX retém pelo menos um pouco da sua atividade prócoagulante também deve permitira a inserção de outros peptídeos e polipeptídeos com características não estruturadas ou estruturadas que são associadas com o prolongamento da meia-vida quando fundidos a uma proteína do FIX em um ou mais destes mesmos sítios. Exemplos não limitativos de componentes heterólogos (por exemplo, um componente de prolongamento da meia-vida) incluem albumina, fragmentos de albumina, fragmentos Fc de imunoglobulinas, pares de ligação a FcRn, o peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade β de gonadotropina coriônica humana, uma sequência HAP, uma transferrina, os polipeptídeos PAS do Pedido de Pat U.S. No. 20100292130, ligantes de poliglicina, ligantes de polisserina, peptídeos e polipeptídeos curtos de 6 a 40 aminoácidos de dois tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (a), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) com graus variáveis de estrutura secundária de menos do que 50% a mais do que 50%, entre outros, devem ser adequados para inserção nos sítios de inserção ativos identificados do FIX.

[00134] Em certos aspectos um componente heterólogo aumenta a meia-vida in vivo ou in vitro da proteína de fusão do FIX. Em outros aspectos um componente heterólogo facilita a visualização ou localização da proteína de fusão do FIX. A visualização e/ou localização da proteína de fusão do FIX pode ser in vivo, in vitro, ex vivo, ou suas combinações. Em outros aspectos um componente heterólogo aumenta a estabilidade da proteína de fusão do FIX. Como utilizado nesta invenção, o termo estabilidade refere-se a uma medida reconhecida na técnica da manutenção de uma ou mais propriedades físicas da proteína de fusão do FIX em resposta a uma condição ambiental (por exemplo, uma temperatura elevada ou diminuída). Em certos aspectos, a propriedade física é a manutenção da estrutura covalente da

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63/203 proteína de fusão do FIX (por exemplo, a ausência de clivagem proteolítica, oxidação não desejada ou desamidação). Em outros aspectos, a propriedade física também pode ser a presenção da proteína de fusão do FIX em um estado apropriadamente dobrado (por exemplo, a ausência de agregados ou precipitados solúveis ou insolúveis). Em um aspecto, a estabilidade da proteína de fusão do FIX é medida através da demonstração de uma propriedade biofísica da proteína de fusão do FIX, por exemplo, estabilidade térmica, perfil de desdobramento do pH, remoção estável de glicanos, solubilidade, função bioquímica (por exemplo, capacidade de se ligar a outra proteína), etc., e/ou suas combinações. Em outro aspecto, a função bioquímica é demonstrada pela afinidade de ligação da interação. Em um aspecto, uma medida da estabilidade de proteína é a estabilidade térmica, isto é, a resistência ao estímulo térmico. A estabilidade pode ser medida utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como, HPLC (cromatografia em fase líquida de alta eficiência), SEC (cromatografia de exclusão por tamanho), DLS (dispersão de luz dinâmica), etc. Os métodos para medir a estabilidade térmica incluem, mas não são limitados a estes, calorimetria diferencial de varredura (DSC), fluorometria diferencial de varredura (DSF), dicroísmo circular (CD) e ensaio de estímulo térmico.

[00135] Em um aspecto específico, um componente heterólogo inserido em um ou mais sítios de inserção em uma proteína de fusão do FIX retém a atividade bioquímica da proteína de fusão do FIX. Em certas modalidades, o componente heterólogo é um XTEN. Em uma modalidade, a atividade bioquímica é a atividade do FIX, que pode ser medida através do ensaio cromogênico.

[00136] Em algumas modalidades, pelo menos um componente heterólogo é inserido indiretamente em um sítio de inserção por meio de ligantes localizados no N-terminal, no C-terminal, ou tanto no Nterminal quanto no C-terminal do componente heterólogo. Os ligantes

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64/203 no N-terminal e no C-terminal do componente heterólogo podem ser os mesmos ou diferentes. Em algumas modalidades, vários ligantes podem flanquear um ou ambos os terminais do componente heterólogo em tandem. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de peptídeo Gly-Ser. O termo ligante de peptídeo Gly-Ser refere-se a um peptídeo que compreende resíduos de glicina e serina.

[00137] Um ligante de pepetídeo Gly/Ser exemplar inclui, mas não é limitado a estes, a sequência de aminoácido (Gly4Ser)_n (SEQ ID NO:161), em que n é um número inteiro que é o mesmo ou mais elevado do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 46, 50, 55, 60, 70, 80, 90 ou 100. Em uma modalidade, n = 1, isto é, o ligante é (Gly4Ser) (SEQ ID NO: 161). Em uma modalidade, n = 2, isto é, o ligante é (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 162). Em outra modalidade, n = 3, isto é, o ligante é (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 172). Em outra modalidade, n = 4, isto é, o ligante é (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 173). Em outra modalidade, n = 5, isto é, o ligante é (Gly4Ser)s (SEQ ID NO: 174). Em mais outra modalidade, n = 6, isto é, o ligante é (Gly4Ser)e (SEQ ID NO: 175). Em outra modalidade, n = 7, isto é, o ligante é (Gly4Ser)? (SEQ ID NO: 176). Em mais outra modalidade, n = 8, isto é, o ligante é (Gly4Ser)s (SEQ ID NO: 177). Em outra modalidade, n = 9, isto é, o ligante é (Gly4Ser)g (SEQ ID NO: 178). Em mais outra modalidade, n = 10, isto é, o ligante é (Gly4Ser)io(SEQ ID NO: 179).

[00138] Outro ligante de pepetídeo Gly/Ser exemplar compreende a sequência de aminoácido Ser(Gly4Ser)_n (SEQ ID NO: 180), em que n é um número inteiro que é o mesmo ou mais elevado do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 46, 50, 55, 60, 70, 80, 90 ou 100. Em uma modalidade, n = 1, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser) (SEQ ID NO: 180). Em uma modalidade, n = 2, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 181). Em outra modalidade, n = 3, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 182). Em outra modalidade, n = 4,

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65/203 isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 183). Em outra modalidade, n = 5, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)s (SEQ ID NO: 184). Em mais outra modalidade, n = 6, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)6 (SEQ ID NO: 185). Em mais outra modalidade, n = 7, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)? (SEQ ID NO: 186). Em mais outra modalidade, n = 8, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)s(SEQ ID NO: 187). Em mais outra modalidade, n = 9, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)g (SEQ ID NO: 188). Em mais outra modalidade, n = 10, isto é, o ligante é Ser(Gly4Ser)io(SEQ ID NO: 189).

[00139] Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende um componente heterólogo inserido em um sítio de inserção listado na TABELA 7. Em outros aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende dois componentes heterólogos inseridos em dois sítios de inserção listados na TABELA 7. Em uma modalidade particular, os dois componentes heterólogos são inseridos em dois sítios de inserção listados na TABELA 8. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende três componentes heterólogos inseridos em três sítios de inserção listados na TABELA 7. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende quatro componentes heterólogos inseridos em quatro sítios de inserção listados na TABELA 7. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende cinco componentes heterólogos inseridos em cinco sítios de inserção listados na TABELA 7. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende seis componentes heterólogos inseridos em seis sítios de inserção listados na TABELA 7. Em alguns aspectos, todos os componentes heterólogos inseridos são idênticos. Em outros aspectos, pelo menos um dos componentes heterólogos inseridos é diferente do resto dos componentes heterólogos inseridos.

[00140] A fusão do polipeptídeo do FIX ao pelo menos um componente heterólogo, por exemplo, XTEN, pode afetar as propriedades físicas ou químicas, por exemplo, a farmacocinética da proteína de fu

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66/203 são da presente invenção. Em uma modalidade específica, o componente heterólogo ligado a uma proteína de FIX aumenta pelo menos uma propriedade farmacocinética, por exemplo, meia-vida terminal aumentada ou aumento da área sob a curva (AUC), de modo que a proteína de fusão aqui descrita permaneça in vivo durante um período de tempo aumentado em comparação com o FIX tipo silvestre ou um FIX correspondente que carece do componente heterólogo. Em outras modalidades, a sequência de XTEN utilizada nesta divulgação aumenta pelo menos uma propriedade farmacocinética, por exemplo, aumento da meia-vida terminal, aumento da recuperação e/ou biodisponibilidade aumentada com relação à dosagem por via subcutânea, a área sob a curva (AUC) aumentada, de modo que a proteína do FIX permaneça in vivo durante um período de tempo aumentado em comparação com o FIX do tipo silvestre ou um FIX correspondente que carece do componente heterólogo.

[00141] Em certos aspectos, um componente heterólogo que aumenta a meia-vida da proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende, sem limitação, um polipeptídeo heterólogo, tal como a albumina, uma região Fc de imunoglobulina, uma sequência de XTEN, o peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade β da gonadotrofina coriônica humana, uma sequência de PAS, uma sequência de HAP, uma transferrina, componentes de ligação a albumina, ou quaisquer fragmentos, derivados, variantes ou combinações destes polipeptídeos. Em certos aspectos, a proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende um polipeptídeo heterólogo que aumenta a meia-vida, em que o polipeptídeo heterólogo é uma sequência de XTEN. Em outros aspectos relacionados, um componente heterólogo pode incluir um sítio de ligação para um componente não polipeptídico tal como polietileno glicol (PEG), amido de hidroxietila (HES), ácido polissiálico, ou quaisquer derivados, variantes ou combinações destes componentes.

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67/203 [00142] Em outras modalidades, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção é conjugada com um ou mais polímeros. O polímero pode ser solúvel em água ou não solúvel em água. O polímero pode ser covalente ou não covalentemente ligado ao FIX ou a outros componentes conjugados com o FIX. Exemplos não limitativos do polímero podem ser poli(óxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), poli(álcool vinílico), polioxazolina ou poli(acriloilmorfolina).

[00143] Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende um, dois, três ou mais componentes heterólogos, os quais podem ser cada um as mesmas ou diferentes moléculas. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende um ou mais XTENs. Em outras modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende um ou mais XTENs e um ou mais domínios Fc. Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX pode compreender um XTEN inserido dentro do FIX e um Fc fundido com o Cterminal do FIX.

[00144] As proteínas de fusão do FIX da presente invenção podem ter um aumento na meia vida in vivo em comparação com FIX nativo, rFIXFc, ou FIX R338L. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX pode ter pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes ou pelo menos cerca de 4 vezes maior de meia-vida in vivo em comparação com FIX nativo que carece do componente heterólogo ou, em comparação com FIX R338L que carece do componente heterólogo. Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX possui uma meia-vida in vivo de mais do que 2 vezes maior do que o polipeptídeo do FIX sem o componente heterólogo.

[00145] Em outras modalidades, a proteína de fusão do FIX pode ter uma meia-vida in vivo que é de pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos

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68/203 cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menose cerca de 11 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 13 horas, pelo menos cerca de 14 horas, pelo menos cerca de 15 horas, pelo menos cerca de 16 horas, pelo menos cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, pelo menos cerca de 22 horas, pelo menos cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 25 horas, pelo menos cerca de 26 horas, pelo menos cerca de 27 horas, pelo menos cerca de 28 horas, pelo menos cerca de 29 horas, pelo menos cerca de 30 horas, pelo menos cerca de 31 horas, pelo menos cerca de 32 horas, pelo menos cerca de 33 horas ou pelo menos cerca de 34 horas mais longa do que a meia-vida in vivo de um polipeptídeo do FIX que carece de um componente heterólogo.

ΙΙ·Β·1· XTENs [00146] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é um XTEN. Conforme aqui utilizado sequência de XTEN refere-se aos polipeptídeos de comprimento prolongado com sequências de ocorrência não natural substancialmente não repetitivas que são compostas principalmente de aminoácidos hidrófilos pequenos, com a sequência tendo um baixo grau ou nenhuma estrutura secundária ou terciária sob condições fisiológicas. Como par de proteína de fusão, os XTENs podem servir como um veículo, que confere certas propriedades farmacocinéticas, físicoquímicas e farmacêuticas desejável, quando ligados a uma sequência do FIX da presente invenção para criar uma proteína de fusão. Tais propriedades desejáveis incluem, mas não são limitadas aos parâmetros farmacocinéticos e características de solubilidade melhorados. Como aqui utilizado, XTEN especificamente exclui anticorpos e fragmentos de anticorpos tais como anticorpos de cadeia única ou fragmentos Fc de uma cadeia leve ou uma

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69/203 cadeia pesada.

[00147] Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um XTEN ou fragmento, variante, ou seu derivado inserido no FIX, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expresso in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Em certos aspectos, dois dos componentes heterólogos são sequências de XTEN. Em alguns aspectos, três dos componentes heterólogos são sequências de XTEN. Em alguns aspectos, quatro dos componentes heterólogos são sequências de XTEN. Em alguns aspectos, cinco dos componentes heterólogos são sequências de XTEN. Em alguns aspectos, seis ou mais dos componentes heterólogos são sequências de XTEN.

[00148] Em algumas modalidades, a sequência de XTEN útil para a presente invenção é um peptídeo ou um polipeptídeo que possui mais do que cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ou 2000 resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, o XTEN é um peptídeo ou um polipeptídeo que possui mais do que cerca de 20 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, mais do que 30 a cerca de 2500 resíduos, mais do que 40 a cerca de 2000 resíduos, mais do que 50 a cerca de 1500 resíduos, mais do que 60 a cerca de 1000 resíduos, mais do que 70 até cerca de 900 resíduos, mais do que 80 até cerca de 800 resíduos, mais do que 90 até cerca de 700 resíduos, mais do que 100 a cerca de 600 resíduos, mais do que 110 a cerca de 500 resíduos ou mais do que 120 a cerca de 400 resíduos. Em uma modalidade particular o XTEN compreende uma sequência de aminoácido de mais do que 42 aminoácidos e mais curta do que 144 aminoácidos de comprimento.

[00149] A sequência de XTEN da presente invenção pode compreender um ou mais motivos de sequência de 5 a 14 (por exemplo, de 9

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70/203 a 14) resíduos de aminoácidos ou uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao motivo de sequência, em que o motivo compreende, consiste essencialmente ou consiste em 4 a 6 tipos de aminoácidos (por exemplo, 5 aminoácidos) selecionados do grupo que consiste em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P). Ver a US 2010-0239554 A1.

[00150] Em algumas modalidades, o XTEN compreende motivos de sequência não sobrepostos em que cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% ou cerca de 100% da sequência consiste em múltiplas unidades de sequências não sobrepostas selecionadas de uma família única de motivos selecionada da Tabela 2A, o que resulta em uma sequência de família. Como aqui utilizado, família significa que o XTEN possui motivos selecionados apenas de uma única categoria de motivo da Tabela 2A; isto é, XTEN AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ou BD, e que quaisquer outros aminoácidos no XTEN que não são de um motivo de família são selecionados para se conseguir uma propriedade necessária, tal como para permitir a incorporação de um sítio de restrição pelos nucleotídeos de codificação, a incorporação de uma sequência de divagem, ou para conseguir uma melhor ligação ao FIX. Em algumas modalidades das famílias de XTEN, uma sequência de XTEN compreende múltiplas unidades de motivos de sequência não sobrepostos da família de motivo AD, ou da família de motivo AE, ou da família de motivo AF, ou da família de motivo AG, ou da família de motivo AM, ou da família de motivo AQ, ou da família de motivo BC, ou da família de motivo BD, com o XTEN resultante apresentando a faixa de homologia descrita acima. Em outras modalidades, o XTEN compreende múlti

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71/203 pias unidades de sequências de motivo de duas ou mais das famílias de motivo da Tabela 2A. Essas sequências podem ser selecionadas para se conseguir as características físicas/químicas desejadas, incluindo tais propriedades como carga líquida, hidrofobicidade, falta de estrutura secundária ou falta de repetição que são conferidas pela composição de aminoácidos dos motivos, descrito mais completamente abaixo. Nas modalidades mais acima descritas neste parágrafo, os motivos incorporados no XTEN podem ser selecionados e agrupados utilizando os métodos aqui descritos para obter um XTEN de cerca de 36 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido.

Tabela 2A· Motivos de Sequência de XTEN de 12 aminoácidos e Famílias de Motivo

Família de Motivo*	SEQUÊNCIA DE MOTIVO	SEQ ID NO:
AD	GESPGGSSGSES	4
AD	GSEGSSGPGESS	5
AD	GSSESGSSEGGP	6
AD	GSGGEPSESGSS	7
AE, AM	GSPAGSPTSTEE	8
AE, AM, AQ	GSEPATSGSETP	9
AE, AM, AQ	GTSESATPESGP	10
AE, AM, AQ	GTSTEPSEGSAP	11
AF, AM	GSTSESPSGTAP	12
AF, AM	GTSTPESGSASP	13
AF, AM	GTSPSGESSTAP	14
AF, AM	GSTSSTAESPGP	15
AG, AM	GTPGSGTASSSP	16
AG, AM	GSSTPSGATGSP	17
AG, AM	GSSPSASTGTGP	18
AG, AM	GASPGTSSTGSP	19
AQ	GEPAGSPTSTSE	20
AQ	GTGEPSSTPASE	21
AQ	GSGPSTESAPTE	22

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Família de Motivo*	SEQUÊNCIA DE MOTIVO	SEQ ID NO:
AQ	GSETPSGPSETA	23
AQ	GPSETSTSEPGA	24
AQ	GSPSEPTEGTSA	25
BC	GSGASEPTSTEP	26
BC	GSEPATSGTEPS	27
BC	GTSEPSTSEPGA	28
BC	GTSTEPSEPGSA	29
BD	GSTAGSETSTEA	30
BD	GSETATSGSETA	31
BD	GTSESATSESGA	32
BD	GTSTEASEGSAS	33

* Significa sequências de motivo individuais que, quando utilizadas em conjunto em várias permutações, resulta em uma sequência de família [00151] O XTEN pode ter diferentes comprimentos para inserção ou ligação ao FIX. Em uma modalidade, o comprimento das sequências do XTEN é selecionado com base na propriedade ou na função a ser conseguida na proteína de fusão. Dependendo da propriedade ou função pretendida, o XTEN pode ser uma sequência de comprimento curto ou intermediário ou sequência mais longa que pode servir como veículos. Em certas modalidades, o XTEN inclui segmentos curtos de cerca de 6 a cerca de 99 resíduos de aminoácido, comprimentos intermediários de cerca de 100 a cerca de 399 resíduos de aminoácido, e comprimentos mais longos de cerca de 400 a cerca de 1000 e até cerca de 3000 resíduos de aminoácido. Assim, o XTEN inserido ou ligado ao FIX pode ter comprimentos cerca de 6, cerca de 12, cerca de 36, cerca de 40, cerca de 42, cerca de 72, cerca de 96, cerca de 144, cerca de 288, cerca de 400, cerca de 500, cerca de 576, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800, cerca de 864, cerca de 900, cerca de 1000, cerca de 1500, cerca de 2000, cerca de 2500 ou cerca de 3000 resíduos de aminoácido de comprimento. Em outras modalidades, as

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73/203 sequências de XTEN é de cerca de 6 a cerca de 50, de cerca de 50 a cerca de 100, cerca de 100 a 150, cerca de 150 a 250, cerca de 250 a 400, de cerca de 400 a cerca de 500, de cerca de 500 a cerca de 900, cerca de 900 a 1500, cerca de 1500 a 2000 ou de cerca de 2000 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido de comprimento. O comprimento exato de um XTEN inserido ou ligado ao FIX pode variar sem afetar adversamente a atividade de FIX. Em uma modalidade, um ou mais dos XTENs aqui utilizados possuem 42 aminoácidos, 72 aminoácidos, 144 aminoácidos, 288 aminoácidos, 576 aminoácidos ou 864 aminoácidos de comprimento e podem ser selecionados de uma ou mais das sequências da família de XTEN; isto é, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ou BD.

[00152] Em algumas modalidades, a sequência de XTEN utilizada na divulgação é de pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288,

AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432,

AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540,

AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648,

AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792,

AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912,

AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG 1044, AG 1140, AG 1236, AG 1332, AG 1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004, e qualquer combinação dos mesmos. Ver a US 2010-0239554 A1. Em uma modalidade particular, o XTEN compreende AE42, AE72, AE144, AE288, AE576, AE864, AG 42, AG72, AG 144, AG288, AG576, AG864, ou

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74/203 qualquer combinação dos mesmos.

[00153] Em uma modalidade, a sequência de XTEN é pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em AE36 (SEQ ID NO: 217), AE42 (SEQ ID NO: 34), AE72 (SEQ ID NO: 35), AE78 (SEQ ID NO: 218), AE144 (SEQ ID NO: 36), AE144_2A (SEQ ID NO: 37), AE144_3B (SEQ ID NO: 38), AE144_4A (SEQ ID NO: 39), AE144_5A (SEQ ID NO: 40), AE144_6B (SEQ ID NO: 41), AG144 (SEQ ID NO: 42), AG144_A (SEQ ID NO: 43), AG144_B (SEQ ID NO: 44), AG144_C (SEQ ID NO: 45), AG144_F (SEQ ID NO: 46), AE288 (SEQ ID NO: 47), AE288_2 (SEQ ID NO: 48), AG288 (SEQ ID NO: 49), AE576 (SEQ ID NO: 50), AG576 (SEQ ID NO: 51), AE864 (SEQ ID NO: 52), AG864 (SEQ ID NO: 53), XTEN_AE72_2A_1 (SEQ ID NQ:202), XTEN_AE72_2A_2 (SEQ ID NQ:203), XTEN_AE72_3B_1 (SEQ ID NQ:204), XTEN_AE72_3B_2 (SEQ ID NQ:205), XTEN_AE72_4A_2 (SEQ ID NO: 206), XTEN_AE72_5A_2 (SEQ ID NQ:207), XTEN_AE72_6B_1 (SEQ ID NO: 208), XTEN_AE72_6B_2 (SEQ ID NQ:209), XTEN_AE72_1 A_1 (SEQ ID NO: 210), XTEN_AE72_1 A_2 (SEQ ID NO:211), XTEN_AE72_1 A_3 (SEQ ID NO: 230), XTEN_AE144_1 A (SEQ ID NO:212), AE150 (SEQ ID NO:213), AG150 (SEQ ID NO:214), AE294 (SEQ ID NO:215), AG294 (SEQ ID NO:216), e qualquer combinação dos mesmos.

[00154] Em algumas modalidades, menos do que 100% de aminoácidos de um XTEN são selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), ou menos do que 100% da sequência consiste dos motivos de sequência da Tabela 2A ou as sequências de XTEN da Tabela 2B. Em tais modalidades, os resíduos de aminoácido remanescentes do XTEN são selecionados a partir de qualquer dos outros 14 L-aminoácidos naturais, mas podem ser preferencialmente selecionados de aminoácidos hidrófilos de tal modo que

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75/203 a sequência de XTEN contém, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos cerca de 99% de aminoácidos hidrófilos. O teor de aminoácidos hidrofóbicos no XTEN utilizados nas construções de conjugação pode ser menor do que 5%, ou menor do que 2%, ou menor do que 1% de teor de aminoácido hidrofóbico. Os resíduos hidrofóbicos que são menos favorecidos na construção de XTEN incluem triptofano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina e metionina. Adicionalmente, as sequências de XTEN podem conter menos do que 5% ou menos do que a 4% ou menos do que 3% ou menos do que 2% ou menos do que 1% ou nenhum dos seguintes aminoácidos: metionina (por exemplo, para evitar a oxidação) ou asparagina e glutamina (para evitar a desamidação).

[00155] Em outra modalidade, a sequência de XTEN é selecionada do grupo que consiste em AE36 (SEQ ID NO: 217), AE42 (SEQ ID NO: 34), AE72 (SEQ ID NO: 35), AE78 (SEQ ID NO: 218), AE144 (SEQ ID NO: 36), AE144_2A (SEQ ID NO: 37), AE144_3B (SEQ ID NO: 38), AE144_4A (SEQ ID NO: 39), AE144_5A (SEQ ID NO: 40), AE144_6B (SEQ ID NO: 41), AG144 (SEQ ID NO: 42), AG144_A (SEQ ID NO: 43), AG144_B (SEQ ID NO: 44), AG144_C (SEQ ID NO: 45), AG144_F (SEQ ID NO: 46), AE288 (SEQ ID NO: 47), AE288_2 (SEQ ID NO: 48), AG288 (SEQ ID NO: 49), AE576 (SEQ ID NO: 50), AG576 (SEQ ID NO: 51), AE864 (SEQ ID NO: 52), AG864 (SEQ ID NO: 53), XTEN_AE72_2A_1 (SEQ ID NQ:202), XTEN_AE72_2A_2 (SEQ ID NQ:203), XTEN_AE72_3B_1 (SEQ ID NQ:204), XTEN_AE72_3B_2 (SEQ ID NQ:205), XTEN_AE72_4A_2 (SEQ ID NQ:206), XTEN_AE72_5A_2 (SEQ ID NQ:207), XTEN_AE72_6B_1 (SEQ ID NO: 208), XTEN_AE72_6B_2 (SEQ ID NO: 209), XTEN_AE72_1 A_1 (SEQ ID NO: 210), XTEN_AE72_1 A_2 (SEQ ID NO: 211), XTEN_AE72_1 A_3 (SEQ ID NO: 230), XTEN_AE144_1 A (SEQ ID NO: 212), AE150 (SEQ ID NO: 213), AG150 (SEQ ID NO:

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214), AE294 (SEQ ID NO: 215), AG294 (SEQ ID NO:216), e quaisquer combinações destes. Em uma modalidade específica, a sequência de XTEN é selecionada do grupo que consiste em AE72, AE144 e AE288. As sequências de aminoácido para certas sequências de XTEN da presente invenção são mostradas na Tabela 2B.

Tabela 2B· Seqüências de XTEN

XTEN	Sequência de Aminoácido
AE36 SEQ ID NO: 217	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETP
AE42 SEQ ID NO: 34	GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPASS
AE72 SEQ ID NO: 35	GAPTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGASS
AE78 SEQ ID NO: 218	GAPTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGASS
AE144 SEQ ID NO: 36	GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGS EPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSESAPESGPGSEPA TSGSETPGTSTEPSEGSAP
AE144_2A SEQ ID NO: 37	TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGTSESATPESGPG
AE144_3B SEQ ID NO: 38	SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPG
AE144_4A SEQ ID NO: 39	TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTST

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XTEN	Sequence de Aminoácido
	EEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPG
AE144_5A SEQ ID NO: 40	TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG
AE144_6B SEQ ID NO: 41	TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATP ESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSE PATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPG
AG 144 SEQ ID NO:42	GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSA STGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSP GASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSA STGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGP GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP
AG144_A SEQ ID NO: 43	GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSA STGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP GSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSG TASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPG ASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSP
AG144_B SEQ ID NO: 44	GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP GSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPS GATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP GASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSP
AG144_C SEQ ID NO: 45	GTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGT SSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGP GTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGT SSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSP GSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP
AG144_F SEQ ID NO: 46	GSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGT SSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSP GSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSA STGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP

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XTEN	Sequence de Aminoácido
	GSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP
AE288 SEQ ID NO: 47	GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAP
AE288_2 SEQ ID NO: 48	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPA GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPT STEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAP
AG288 SEQ ID NO: 49	PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGS GTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSP GSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPS GATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGP GSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSG TASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPG SSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSS TGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTG PGA SPGTSSTGSPGSSPSASTGTG PGTPGSGTA SSSPGSSTPSGATGS
AE576 SEQ ID NO: 50	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA

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XTEN	Sequence de Aminoácido
	PGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAP
AG576 SEQ ID NO: 51	PGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPS ASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGATGS PGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPG TSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSP GASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGT SSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSP GASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGT SSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSP GASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPS GATGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSP GSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSP GASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSG TASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPG SSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSS TGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGS SPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GS
AE864 SEQ ID NO: 52	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

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XTEN	Sequência de Aminoácido
	STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSP AGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG864 SEQ ID NO: 53	GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSA STGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP GSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSG TASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPG ASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGT ASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGT PGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSAST GTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGATGSPGS STPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGAS

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XTEN	Sequence de Aminoácido
	PGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGAS PGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGAS PGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGAT GSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSS PSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGAS PGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTP GSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTAS SSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSS PSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSS PSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSS PSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGT GPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSST PSGATGSPGASPGTSSTGSP
XTEN_AE72_2A_1 SEQ ID NO: 202	TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_2A_2 SEQ ID NO: 203	TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPG
XTEN_AE72_3B_1 SEQ ID NQ:204	SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_3B_2 SEQ ID NO: 205	TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_4A_2 SEQ ID NO: 206	TSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPT STEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_5A_2 SEQ ID NO: 207	SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSP

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XTEN	Sequence de Aminoácido
	AGSPTSTEEG
XTEN_AE72_6B_1 (SEQ ID NO: 208)	TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATP ESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSE PATSGSETPG
XTEN_AE72_6B_2 SEQ ID NO: 209	SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_1 A_1 SEQ ID NO: 210	SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_1 A_2 SEQ ID NO: 211	TSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSG SETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE72_1 A_3 SEQ ID NO: 230	PSPGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPG
XTEN_AE144_1 A SEQ ID NO: 212	SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPG
AE150 SEQ ID NO: 213	GAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPAT SGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPASS
G150 SEQ ID NO: 214	GAPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSS PSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSS PSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGT GPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPASS
AE294 SEQ ID NO: 215	GAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG

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XTEN	Sequence de Aminoácido
	SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPASS
AG294 SEQ ID NO: 216	GAPPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGT PGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTA SSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGS STPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTG TGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTP GSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGT GPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASP GTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGT GPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPG SGTASSSPGSSTPSGATGSASS

[00156] Em outras modalidades, a sequência de XTEN utilizada na divulgação afeta a propriedade física ou química, por exemplo, a farmacocinética da proteína de fusão da presente invenção. A sequência de XTEN utilizada na presente invenção pode apresentar uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solubilidade aquosa intensificada, grau elevado de resistência à protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação aos receptores de mamífero ou raios hidrodinâmicos aumentados (ou Stokes). Em uma modalidade específica, a sequência de XTEN ligada a uma proteína do FIX nesta invenção aumenta as propriedades farmacocinéticas tais como meia-vida terminal mais longa, aumento da biodisponibilidade ou aumento da área sob a curva (AUC), de modo que a proteína aqui descrita permanece in vivo durante um período de tempo aumentado em comparação com o FIX do tipo silvestre. Em outras modalidades, a sequência de XTEN utilizada nesta divulgação aumenta as proprieda

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84/203 des farmacocinéticas tais como meia-vida terminal mais longa ou aumento da área sob a curva (AUC), de modo que a proteína do FIX permaneça in vivo durante um período de tempo aumentado em comparação com o FIX do tipo silvestre.

[00157] Em algumas modalidades, a proteína do FIX apresenta uma meia-vida in vivo de pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes ou pelo menos cerca de 4 vezes maior do que o FIX nativo, rFIXFc, FIX R338L, ou uma proteína do FIX correspondente a que carece do XTEN. Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX pode ter uma meia-vida in vivo de mais do que 2 vezes maior do que um polipeptídeo do FIX sem o componente heterólogo.

[00158] Em outras modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta uma meia-vida in vivo que é pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 13 horas, pelo menos cerca de 14 horas, pelo menos cerca de 15 horas, pelo menos cerca de 16 horas, pelo menos cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, pelo menos cerca de 22 horas, pelo menos cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 25 horas, pelo menos cerca de 26 horas, pelo menos cerca de 27 horas, pelo menos cerca de 28 horas, pelo menos cerca de 29 horas, pelo menos cerca de 30 horas, pelo menos cerca de 31 horas, pelo menos cerca de 32 horas, pelo menos cerca de 33 horas ou pelo menos cerca de 34 horas mais longa do que a meia-vida in vivo de um polipeptídeo do FIX que carece do componente heterólogo.

[00159] Uma variedade de métodos e ensaios pode ser empregada

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85/203 para determinar as propriedades físicas/químicas das proteínas que compreendem a sequência de XTEN. Tais métodos incluem, mas não são limitados a estes, centrifugação analítica, EPR, HPLC-troca iônica, HPLC-exclusão tamanho, HPLC-fase reversa, dispersão de luz, eletroforese capilar, dicroísmo circular, calorimetria diferencial de varredura, fluorescência, HPLC-troca iônica, HPLC-exclusão de tamanho, IR, NMR, espectroscopia de Raman, refractometria e espectroscopia UV/visível. Métodos adicionais são descritos em Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).

[00160] Exemplos adicionais de sequências de XTEN que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção e são divulgados na Publicações de Patente US Nos. 2010/0239554 A1,2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 ou 2011/0172146 A1, ou Publicações de Patente Internacional Nos. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, WO 2014/011819 A2 ou WO 2015/023891.

[00161] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende uma ou mais sequências de XTEN inseridas dentro do FIX, fundidas com o C-terminal de FIX, ou ambas. Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de XTEN são inseridas dentro do domínio GLA. Em outra modalidade, a uma ou mais sequências de XTEN são inseridas dentro de domínio EGF1. Em outras modalidades, a uma ou mais sequências de XTEN são inseridas dentro de EGF2. Em mais outras modalidades, a uma ou mais sequências de XTEN são inseridas dentro de AP. Em mais outras modalidades, a uma ou mais sequências de XTEN são inseridas dentro do domínio catalítico. Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de XTEN são fundidas com o C-terminal do FIX.

[00162] Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX com

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86/203 preende uma sequência de XTEN inserida em um sítio de inserção listado na Tabela 7. Em outros aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende duas sequências de XTEN inseridas em dois sítios de inserção listados na Tabela 7. Em uma modalidade particular, as duas sequências de XTEN são inseridas em dois sítios de inserção listados na Tabela 8. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende três sequências de XTEN inseridas em três sítios de inserção listados na Tabela 7. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende quatro sequências de XTEN inseridas em quatro sítios de inserção listados na Tabela 7. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende cinco sequências de XTEN inseridas em cinco sítios de inserção listados na Tabela 7. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende seis sequências de XTEN inseridas em seis sítios de inserção listados na Tabela 7. Em alguns aspectos, todas as sequências inseridas de XTEN são idênticas. Em outros aspectos, pelo menos uma das sequências inseridas de XTEN é diferente do resto das sequências inseridas de XTEN.

[00163] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de XTEN inserida dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO:2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO:2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO:2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO:2, e qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante. Em alguns aspectos, uma proteína de fusão do FIX compreende uma segunda sequência de XTEN dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corPetição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 104/727

87/203 responde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO:2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO:2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO:2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO:2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO:2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos ou em que o segundo XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante. Em um aspecto particular, uma proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de XTEN fundida com o Cterminal do FIX, em que o XTEN compreende uma sequência de aminoácido de mais do que 42 aminoácidos e menos do que 144 aminoácidos de comprimento.

ΙΙ·Β·2· Regiões Fc ou pares de ligação a FcRn [00164] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é uma região Fc (por exemplo, um par de ligação ao FcRn) ou um fragmento destes. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos uma região Fc (por exemplo, um par de ligação ao FcRn) inserida dentro do FIX, fundida com o C-terminal do FIX, ou ambas, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende uma região Fc fundida com o Cterminal do polipeptídeo do FIX. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX (por exemplo, proteína de fusão do FIX-Fc) não compreende uma sequência de XTEN. Fc ou região Fc como aqui utilizado, pode ser um par de ligação do receptor Fc neonatal funcional (FcRn) que compreende um domínio Fc, variante, ou fragmento destes, a não ser que de outra maneira especificada. Um par de ligação

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88/203 ao FcRn é qualquer molécula que pode ser especificamente ligada pelo receptor FcRn com consequente transporte ativo pelo receptor FcRn do par de ligação ao FcRn, incluindo, mas não limitado a albumina. Assim, o termo Fc inclui quaisquer variantes de IgG Fc que são funcionais. A região da parte Fc de IgG que se liga ao receptor FcRn foi descrita com base na cristalografia de raio X (Burmeister et al., Nature 372.379 (1994), aqui incorporado por referência na sua totalidade). A principal área de contato do Fc com o FcRn é próxima à junção dos domínios de CH2 e CH3. Os contatos Fc-FcRn estão todos dentro de uma única cadeia pesada de Ig. Os pares de ligação ao FcRn incluem, mas não são limitados a estes, todo o IgG, o fragmento Fc do IgG, e outros fragmentos de IgG que incluem a região de ligação completa de FcRn. Um Fc pode compreender os domínios de CH2 e CH3 de uma imunoglobulina com ou sem a região de dobradiça da imunoglobulina. Também estão incluídos os fragmentos, variantes ou derivados Fc que mantêm as propriedades desejáveis de uma região Fc em uma proteína de fusão, por exemplo, um aumento na meia-vida, por exemplo, na meia vida in vivo. Um grande número de mutantes, fragmentos, variantes e derivados é descrito, por exemplo, nas Publicações PCT Nos. WO 2011/069164 A2, WO 2012/006623 A2, WO 2012/006635 A2 ou WO 2012/006633 A2, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00165] O um ou mais domínios Fc podem ser inseridos dentro do polipeptídeo do FIX, fundidos ao C-terminal do polipeptídeo, ou ambos. Em algumas modalidades, o domínio Fc é fundido ao polipeptídeo do FIX. Em certas modalidades, o polipeptídeo do FIX compreende uma proteína de fusão do FIXFc tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cer

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89/203 ca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 229. Em algumas modalidades, o domínio Fc está fundido a outro componente heterólogo, tal como um XTEN, o qual é inserido dentro do FIX ou fundido ao C-terminal do XTEN. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX compreende um segundo domínio Fc. O seguindo domínio Fc pode estar associado com o primeiro domínio Fc, por exemplo, através de uma ou mais ligações covalentes.

ΙΙ·Β·3· Albuminas [00166] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é uma albumina, um domínio de ligação a albumina, ou uma molécula pequena de ligação a albumina, ou sua variante, derivado ou fragmento. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um polipeptídeo de albumina ou fragmento, variante ou derivado deste inserido ao FIX, fundido ao C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. A albumina de soro humano (HSA ou HA), uma proteína de 609 aminoácidos na sua forma de comprimento total, é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica do soro e funciona também como um veículo de ligantes endógenos e exógenos. O termo albumina, como aqui utilizado, inclui albumina de comprimento total ou um fragmento, variante, derivado ou análogo funcional desta. Exemplos de albumina ou dos seus fragmentos ou variantes são divulgados nas Publ. de Pat. US Nos. 2008/0194481A1,2008/0004206 A1,2008/0161243 A1,2008/0261877 A1, ou 2008/0153751 A1 ou Publ. do Ped PCT Nos. 2008/033413 A2, 2009/058322 A1 ou 2007/021494 A2, as quais são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.

[00167] Os polipeptídeos de ligação a albumina (ABPs) podem

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90/203 compreender, sem limitação, domínios de ligação a albumina de bactérias, peptídeos de ligação a albumina ou fragmentos de anticorpos de ligação a albumina, que podem ligar-se à albumina. Domínio 3 da proteína estreptocócica G, como divulgado por Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) e Linhult et al., Protein Sei. 11:206-213 (2002), é um exemplo de um domínio de ligação a albumina bacteriana. Exemplos de peptídeos de ligação a albumina incluem uma série de peptídeos tendo a sequência de núcleo DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 163). Ver, por exemplo, Dennis et aí., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Exemplos de fragmentos de anticorpos de ligação a albumina são divulgados em Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers et aí., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), e Holt et al., Prot. Eng. Design Sei., 21:283288 (2008), que são aqui incorporados por referência nas suas totalidades.

[00168] Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um sítio de ligação para uma molécula pequena não polipeptídeo, variante, ou seu derivado que pode se ligar à albumina (por exemplo, uma molécula pequena de ligação a albumina) inserida no FIX, fundida ao C-terminal do FIX, ou ambas, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade prócoagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Por exemplo, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção pode incluir um ou mais componentes de ligação a albumina orgânicos ligados em um ou mais sítios de inserção dentro do FIX, ou fundido ao C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Um exemplo de tais componentes de ligação a albumina é 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4iodofenil)butanamido)hexanoato (marca Albu) conforme divulgado

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91/203 porTrussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).

[00169] Em algumas modalidades, a sequência de polipeptídeo de ligação a albumina é flanqueada no C-terminal, no N-terminal, ou ambos os terminais, por uma sequência de ligante de peptídeo Gly-Ser. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo Gly-Ser é Gly4Ser (SEQ ID NO: 161). Em outras modalidades, o ligante de peptídeo GlySer é (Gly₄Ser)₂ (SEQ ID NO: 162).

II.B.4. CTP [00170] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade β da gonadotropina coriônica humana ou seu fragmento, variante ou derivado. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos uma CTP ou fragmento, variante ou derivado deste inserido no FIX, fundido ao C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Um ou mais peptídeos de CTP inseridos em uma proteína recombinante é conhecido de aumentar a meia-vida desta proteína. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.712.122, aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os peptídeos de CTP exemplares incluem DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 164) ou SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 165). Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2009/0087411 A1, incorporada por referência. Em algumas modalidades, a sequência de CTP é flanqueada no C-terminal, no N-terminal, ou ambos os terminais, através de uma sequência de ligante de peptídeo Gly-Ser. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo Gly-Ser é Gly₄Ser (SEQ ID NO: 161). Em outras modalidades, o ligante de peptídeo Gly-Ser é (Gly₄Ser)₂ (SEQ ID NO: 162).

II.B.5. PAS

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92/203 [00171] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é um peptídeo PAS. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um peptídeo PAS ou seu fragmento, variante ou derivado inserido no FIX, fundido ao C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Um peptídeo PAS ou sequência PAS, como aqui utilizado, significa uma sequência de aminoácido que compreende principalmente resíduos de alanina e serina ou que compreende principalmente resíduos de alanina, serina e prolina, a sequência de aminoácido que formando uma conformação helicoidal aleatória sob condições fisiológicas. Consequentemente, a sequência PAS é um bloco de reforço, um polímero de aminoácido, ou um cassete de sequência que compreende, que consiste essencialmente, ou que consiste em alanina, serina e prolina que pode ser utilizado como um componente heterólogo na proteína de fusão. Um polímero de aminoácido também pode formar uma conformação helicoidal aleatória quando os resíduos diferentes de alanina, serina e prolina são adicionados como um constituinte secundário na sequência PAS. Por constituinte secundário entende-se que os aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser adicionados na sequência PAS a um certo grau, por exemplo, até cerca de 12%, isto é, cerca de 12 de 100 aminoácidos da sequência PAS, até cerca de 10%, até cerca de 9%, até cerca de 8%, cerca de 6%, cerca de 5%, cerca de 4%, ao redLor de 3%, isto é, cerca de 2%, ou cerca de 1%, dos aminoácidos. Os aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser selecionados do grupo que consiste em Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr e ValSob condições fisiológicas,um peptídeo PAS forma uma conformação helicoidal aleatória e,desse modo,pode mediar um aumento de estabilidade in vivo e/ou

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93/203 in vitro a uma proteína recombinante da divulgação,e tem atividade pró-coagulante.

[00172] Exemplos não limitativos dos peptídeos PAS incluem ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 154), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 155), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 156), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 157), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 158), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 159), ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 160) ou quaisquer variantes, derivados, fragmentos ou combinações destes. Exemplos adicionais de sequências PAS são conhecidos da, por exemplo, Publ. de Pat. US No. 2010/0292130 A1 e Publ. de Pat. PCT No. WO 2008/155134 A1. Patente emitida européia EP2173890.

[00173] Em algumas modalidades, a sequência PAS é flanqueada no C-terminal, no N-terminal, ou ambos os terminais, através de uma sequência de ligante de peptídeo Gly-Ser. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo Gly-Ser é Gly4Ser (SEQ ID NO: 161). Em outras modalidades, o ligante de pepetídeo Gly/Ser é (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 162).

II.B.6. HAP [00174] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é um peptídeo de homo-aminoácido polimérico (HAP) ou seu fragmento, variante ou derivado. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um peptídeo homo-aminoácido polimérico (HAP) ou seu fragmento, variante ou derivado inserido dentro do FIX, fundido com o C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Um peptídeo HAP pode compreender uma sequência repetitiva de glicina, que possui pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos

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100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos ou 500 aminoácidos de comprimento. Uma sequência de HAP é capaz de prolongar a meia-vida de um componente fundido ou conectado com a sequência de HAP. Exemplos não limitativos da sequência de HAP incluem, mas não são limitados a (Gly)_n (SEQ ID NO: 233), (Gly4Ser)_n(SEQ ID NO: 234) ou S(Gly₄Ser)_n (SEQ ID NO: 235), em que n é 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em uma modalidade, n é 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em outra modalidade, n é 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200. Ver, por exemplo, Schlapschy M et a!., Protein Eng. Design Selection, 20: 273284 (2007).

ΙΙ·Β·7· Polímeros Orgânicos [00175] Em algumas modalidades, o pelo menos um componente heterólogo é um polímero orgânico, por exemplo, um polietileno glicol, um ácido polissiálico ou amido de hidroxietila. Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da invenção compreende pelo menos um sítio de ligação para um componente heterólogo de não polipeptídeo ou seu fragmento, variante ou derivado inserido no FIX, fundido ao C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Por exemplo, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção pode incluir uma ou mais componentes de polietileno glicol (PEG) ligado dentro da sequência do FIX, ligado ao Cterminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira.

[00176] O FIX PEGuilado pode referir-se a um conjugado formado

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95/203 entre o FIX e pelo menos uma molécula de polietileno glicol (PEG). O PEG é comercialmente disponível em uma grande variedade de pesos moleculares e faixas de peso molecular médio. Exemplos típicos de faixas de peso molecular médio do PEG incluem, mas não são limitados a estes, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 600, cerca de 1000, cerca de 1300 a 1600, cerca de 1450, cerca de 2000, cerca de 3000, cerca de 3000 a 3750, cerca de 3350, cerca de 3000 a 7000, cerca de 3500 a 4500, cerca de 5000 a 7000, cerca de 7000 a 9000, cerca de 8000, cerca de 10000, cerca de 8500 a 11500, cerca de 16000 a 24000, cerca de 35000, cerca de 40000, cerca de 60000 e cerca de 80000 daltons. Estes pesos moleculares médios são fornecidos meramente como exemplos e não se destinam a serem limitativos de qualquer forma.

[00177] Uma proteína de fusão do FIX da presente invenção pode ser PEGuilada para incluir os componentes de PEG mono- ou poli-(por exemplo, 2-4). A PEGuilação pode ser realizada por qualquer uma das reações de PEGuilação conhecidas na técnica. Os métodos para a preparação de um produto protéico PEGuilado geralmente incluem (i) reagir um polipeptídeo com polietileno glicol (tal como um éster reativo ou um derivado aldeído de PEG) sob condições pelas quais o peptídeo da divulgação torna-se ligado a um ou mais grupos de PEG; e (ii) obter os produtos de reação. Em geral, as condições de reação ideais para as reações irão ser determinadas caso a caso com base nos parâmetros conhecidos e no resultado desejado.

[00178] Existem vários métodos de ligação de PEG disponíveis para aqueles versados na técnica, por exemplo, Malik F et al., Exp. Hematol. 20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); Pub. de Pat. Européia Nos. EP0401384, EP0154316 e EP0401384; e Pub. do Ped. de Pat. Internacional Nos. WO92/16221 e WO95/34326. Como um exemplo não limitative, as variantes de FIX

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96/203 podem conter substituições de cisteína em ou próximo de um ou mais sítios de inserção como aqui descritos, e as cisteínas pode ser ainda conjugadas com polímero de PEG. Ver Mei et al., Blood 116:270-279 (2010) e Patente U.S. No. 7.632.921, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[00179] Em outras modalidades, o polímero orgânico é um ácido polissiálico (PSA). Os PSAs são polímeros não ramificados de ocorrência natural de ácido siálico produzido por certas cepas bacterianas e em mamíferos em certas células. Ver, por exemplo, Roth J. et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (BirkhãuserVerlag, Basel, Switzerland), pp. 335-348. Os PSAs podem ser produzidos em vários graus de polimerização a partir de resíduos de n = cerca de 80 ou mais de resíduos ácido siálico até n = 2 mediante a hidrólise ácida limitada ou através da digestão com neuraminidases, ou por fracionamento das formas naturais bacterianamente derivadas do polímero. Existem vários métodos de fixação de PSA disponíveis para aqueles versados na técnica, por exemplo, os mesmos métodos de ligação de PEG descritos acima. Em certos aspectos, um PSA ativado também pode ser ligado a um resíduo de aminoácido cisteína no FIX. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.846.951.

[00180] Em outras modalidades, o polímero orgânico é um polímero de amido de hidroxietila (HES). Em certos aspectos, uma proteína de fusão do FIX da presente invenção compreende pelo menos um polímero de HES conjugado em um ou mais sítio dentro do FIX, fundido com o C-terminal do FIX, ou ambos, em que a proteína de fusão do FIX possui atividade pró-coagulante e pode ser expressa in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira.

Ill· Polinucleotídeos, Vetores, Células Hospedeiras e Métodos de Produção

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97/203 [00181] A presente invenção ainda fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão do FIX aqui descrita, um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo, uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo ou o vetor, ou métodos de produção da proteína de fusão do FIX.

[00182] O polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão do FIX pode ser uma sequência de nucleotídeo única, duas sequências de nucleotídeo, três sequências de nucleotídeo, ou mais. Em uma modalidade, um sequência de nucleotídeo única codifica uma proteína de fusão do FIX que compreende um polipeptídeo do FIX e um componente heterólogo (por exemplo, XTEN), por exemplo, uma proteína de fusão do FIX que compreende um polipeptídeo do FIX e um XTEN inserido dentro do polipeptídeo do FIX, um domínio Fc fundido com o C terminal do polipeptídeo do FIX, e um segundo domínio Fc fundido com o polipeptídeo do FIX através de um ligante opcional. Em outra modalidade, o polinucleotídeo compreende duas sequências de nucleotídeo, a primeira sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo do FIX e um XTEN inserido dentro do polipeptídeo do FIX e a segunda sequência de nucleotídeo que codifica um componente heterólogo, por exemplo, Fc. Em outras modalidades, o polinucleotídeo compreende duas sequências de nucleotídeo, a primeira sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo do FIX, um XTEN inserido dentro do polipeptídeo do FIX, e um domínio Fc fundido com o polipeptídeo do FIX, e a segunda sequência de nucleotídeo que codifica um segundo domínio Fc. Os domínios Fc codificados podem formar uma ligação covalente após a expressão.

[00183] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão do FIX é otimizado pelo códon.

[00184] Como aqui utilizado, um vetor de expressão refere-se a qualquer construção de ácido nucleico que contém os elementos ne

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98/203 cessários para a transcrição e translação de uma sequência de codificação inserida, ou no caso de um vetor viral de RNA, os elementos necessários para a replicação e translação, quando introduzidos em uma célula hospedeira apropriada. Os vetores de expressão podem incluir plasmídeos, fagemídeos, vírus e seus derivados.

[00185] Uma sequência de controle da expressão do gene como aqui utilizada é qualquer sequência de nucleotídeo reguladora, tal como uma sequência promotora ou combinação de promotorintensificador, que facilita a transcrição e a translação eficientes do ácido nucleico de codificação ao qual ele está operacionalmente ligado. A sequência de controle de expressão do gene pode, por exemplo, ser um promotor de mamífero ou viral, tal como um promotor constitutivo ou induzível. Os promotores de mamífero constitutivos incluem, mas não são limitados a estes, os promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT), adenosina desaminase, piruvato cinase, promotor da beta-actina, e outros promotores constitutivos. Promotores virais exemplares que funcionam de modo constitutivo nas células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do citomegalovírus (CMV), vírus símio (por exemplo, SV40), vírus do papiloma, adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, as repetições terminais longas (LTR) do vírus da leucemia de Moloney e outros retrovirus, e o promotor de timidina cinase do vírus do herpes simples. Outros promotores constitutivos são conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica. Os promotores úteis como sequências de expressão do gene da presente invenção também incluem promotores induzíveis. Os promotores induzíveis são expressos na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor da metalotioneína é induzido para promover a transcrição e a translação na presença de certos íons metálicos. Outros promotores induzíveis são conhecidos daqueles de habilidade prá

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99/203 tica na técnica.

[00186] Para os propósitos desta invenção, numerosos sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Estes vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomos ou como uma parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro. Os vetores de expressão podem incluir sequências de controle de expressão, incluindo, mas não limitado a estes, promotores (por exemplo, promotores naturalmente associados ou heterólogos), intensificadores, sequências de sinal, sinais de união, elementos intensificadores e sequências de término da transcrição. De preferência, as sequências de controle da expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Os vetores de expressão também podem utilizar elementos de DNA que derivam de vírus de animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus de polioma, adenovirus, vírus da varíola, baculovírus, retrovirus (RSV, MMTV ou MOMLV), citomegalovírus (CMV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios internos de ligação ao ribossoma.

[00187] Geralmente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à higromicina, resistência à tetraciclina ou resistência à neomicina) para permitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (ver, por exemplo, Itakura et al., Patente U.S. No. 4.704.362). As células que integraram o DNA nos seus cromossomas podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode fornecer prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência à biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tais como o cobre. O gene marcador selecionável pode ser diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas, ou introdu

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100/203 zido na mesma célula por cotransformação.

[00188] Um exemplo de um vetor útil para a expressão de uma sequência do FIX otimizada é NEOSPLA (Patente U.S. No. 6.159.730). Este vetor contem o promotor/intensificador do citomegalovírus, o promotor principal de beta-globina de camundongo, a origem de replicação de SV40, a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, neomicina fosfotransferase éxon 1 e éxon 2, o gene de diidrofolato redutase e a sequência líder. Este vetor foi observado de resultar na expressão de nível muito elevado de anticorpos após a incorporação de genes da região variável e constante, transfecção em células, seguido por seleção em meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. Os sistemas de vetor também são ensinados nas Patentes US Nos. 5.736.137 e 5.658.570, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Este sistema fornece níveis elevados de expressão, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetor exemplares são divulgados, por exemplo, na Patente US No. 6.413.777.

[00189] Em outras modalidades os polipeptídeos da presente invenção são expressos utilizando construções policistrônicas. Nestes sistemas de expressão, vários produtos de gene de interesse, tais como múltiplos polipeptídeos de proteína de ligação de multímero, podem ser produzidos a partir de uma única construção policistrônica. Estes sistemas vantajosamente utilizam um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) para fornecer níveis relativamente elevados de polipeptídeos em células hospedeiras eucarióticas. As sequências do IRES compatíveis são divulgadas na Patente US No. 6.193.980, que também é aqui incorporada.

[00190] De modo mais geral, logo que a sequência de vetor ou DNA que codifica um polipeptideo foi preparada, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Isto é, as célu

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Ias hospedeiras podem ser transformadas. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser executada por várias técnicas bem conhecidas daqueles versados na técnica, como tratado acima. As células transformadas são cultivadas em condições apropriadas para a produção do polipeptídeo do FIX, e analisadas com relação à síntese de polipeptídeo do FIX. As técnicas de ensaio exemplares incluem o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) ou análise de separador celular ativado por fluorescência (FACS), imunoistoquímica, e semelhantes.

[00191] Nas descrições de processos para o isolamento de polipeptídeos de hospedeiros recombinantes, os termos célula e cultura celular são utilizados de modo trocável para indicar a fonte de polipeptídeo a menos que seja claramente especificado de outro modo. Em outras palavras, a recuperação de polipeptídeos das células pode significar de células inteiras centrifugadas, ou da cultura celular contendo tanto o meio quanto as células em suspensão.

[00192] A linhagem celular hospedeira utilizada para a expressão da proteína é de preferência de origem de mamíferos; mais preferivelmente de origem humana ou de camundongo. As linhagens celulares hospedeiras exemplares foram descritas acima. Em uma modalidade do método para produzir um polipeptídeo com atividade do FIX, a célula hospedeira é uma célula HEK293. Em outra modalidade do método para produzir um polipeptídeo com atividade do FIX, a célula hospedeira é uma célula de CHO.

[00193] Os genes que codificam os polipeptídeos da presente invenção também podem ser expressos em células não mamíferas, tais como bactérias ou células de levedura ou vegetais. A este respeito será observado que vários microorganismos de não mamífero unicelulares tais como bactérias também podem ser transformados; isto é, aqueles capazes de serem cultivados em culturas ou fermentação. As

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102/203 bactérias, que são susceptíveis à transformação, incluem membros das família Enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coliou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Será ainda observado que, quando se expressa em bactérias, os polipeptídeos tipicamente se tornam parte dos corpos de inclusão. Os polipeptídeos deve ser isolados, purificados e depois agrupados em moléculas funcionais.

[00194] Alternativamente, as sequências de polinucleotídeo da presente invenção podem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgênico e subsequente expressão no leite do animal transgênico (ver, por exemplo, Deboer et al., US 5.741.957, Rosen, US 5.304.489 e Meade et al., US 5.849.992). Os transgenes adequados incluem sequências de codificação para polipeptídeos em ligação operável com um promotor e intensificador de um gene específico da glândula mamaria, tal como a caseína ou beta lactoglobulina.

[00195] A produção in vitro permite ampliar para dar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Técnicas para o cultivo de células de mamífero sob condições de cultura de tecido são conhecidas na técnica e incluem cultura em suspensão homogênea, por exemplo, em um reator de elevação do ar ou em um reator de agitação contínua ou cultura celular imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatografia por (imuno-)afinidade, por exemplo, depois da biossíntese preferencial de um polipeptídeo sintético da região de dobradiça ou antes ou subsequente a etapa de cromatografia HIC aqui descrita. Uma sequência de marca por afinidade

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103/203 (por exemplo, uma marca His(6) (SEQ ID NO: 236)) pode opcionalmente ser ligada ou incluída dentro da sequência de polipeptídeo para facilitar a purificação a jusante.

[00196] Assim que expressa, a proteína recombinante pode ser purificada de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em coluna por afinidade, purificação por HPLC, eletroforese em gel e semelhantes (ver de uma forma geral Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). As proteínas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90% a 95% de homogeneidade são preferidas, e 98% a 99% ou mais de homogeneidade as mais preferidas, para utilizações farmacêuticas.

[00197] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Como aqui utilizado, uma célula eucariótica refere-se a qualquer célula animal ou vegetal tendo um núcleo definitivo. As células eucarióticas incluem células de animais de vertebrados, por exemplo, mamíferos, e células de invertebrados, por exemplo, insetos. As células eucarióticas de plantas especificamente podem incluir, sem limitação, células de levedura. Uma célula eucariótica é distinta de uma célula procariótica, por exemplo, bactérias.

[00198] Em certas modalidades, a célula eucariótica é uma célula de mamífero. Uma célula de mamífero é qualquer célula derivada a partir de um mamífero. As células de mamífero especificamente incluem, mas não são limitadas às linhagens celulares de mamífero. Em uma modalidade, a célula de mamífero é uma célula humana. Em outra modalidade, a célula de mamífero é uma célula HEK 293, que é uma linhagem celular de rim embrionário humano. As células HEK 293 estão disponíveis como CRL-1533 da American Type Culture Collection, Manassas, VA, e como células 293-H, No. de Catálogo Hesiod ou células 293-F, No. de Catálogo 11625-019 de Invitrogen (Car

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Isbad, Calif.). Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula PER.C6®, que é uma linhagem celular humana derivada da retina. As células PER.C6® estão disponíveis da Crucell (Leiden, The Netherlands). Em outras modalidades, a célula de mamífero é uma célula do ovário de hamster Chinês (CHO). As células do CHO são disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas, VA. (por exemplo, CHO-K1; CCL-61). Em ainda outras modalidades, a célula de mamífero é uma célula de rim de hamster bebê (BHK). As células de BHK são disponíveis da from American Type Culture Collection, Manassas, Va. (por exemplo, CRL-1632). Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula HKB11, que é uma linhagem celular híbrida de uma célula HEK293 e uma linhagem celular B humana. Mei etal., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).

[00199] Em mais outras modalidades, as células transfectadas são transfectadas de forma estável. Estas células podem ser selecionadas e mantidas como uma linhagem celular estável, utilizando técnicas convencionais conhecidas daqueles de habilidade na técnica.

[00200] As células hospedeiras que contêm construções de DNA da proteína são cultivadas em um meio de crescimento apropriado. Como aqui utilizado, o termo meio de crescimento apropriado significa um meio contendo nutrientes necessários para o crescimento das células. Os nutrientes necessários para o crescimento das células podem incluir uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, vitaminas, minerais e fatores de crescimento. Opcionalmente, os meios podem conter um ou mais fatores de seleção. Opcionalmente, os meios podem conter soro de bezerro ou soro fetal de bezerro (FCS). Em uma modalidade, os meios não contêm substancialmente nenhum IgG. O meio de crescimento geralmente irá selecionar as células contendo a construção de DNA, por exemplo, por meio de seleção de fármacos ou deficiência em um nutriente essencial que é comPetição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 122/727

105/203 plementado pelo marcador selecionável na construção de DNA ou cotransfectado com a construção de DNA. As células de mamífero cultivadas são geralmente cultivadas em meio contendo soro ou livre de soro comercialmente disponível (por exemplo, MEM, DMEM, meio DMEM/F12). Em uma modalidade, o meio é CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em outra modalidade, a forma é de CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A seleção de um meio apropriado para a linhagem celular particular utilizada está dentro do nível daqueles de habilidade prática na técnica.

[00201] Em algumas modalidades, o ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira compreende ainda um nucleotídeo adicional que codifica uma proteína convertase. A proteína convertase pode ser selecionada do grupo que consiste em pró-proteína convertase subtilisina/kexin tipo 5 (PCSK5 ou PC5), pró-proteína convertase subtilisina/kexin tipo 7 (PCSK7 ou PC5), uma levedura Kex 2, pró-proteína convertase subtilisina/kexin tipo 3 (PACE ou PCSK3), e duas ou mais combinações destas. Em algumas modalidades, a proteína convertase é PACE, PC5 ou PC7. Em uma modalidade específica, a proteína convertase é PC5 ou PC7. Ver a Publ. do Ped. Internacional No. WO 2012/006623, a qual é aqui incorporada por referência. Em outra modalidade, a proteína convertase é PACE/Furina.

[00202] Em certos aspectos, a presente invenção refere-se à proteína de fusão do FIX produzida pelos métodos aqui descritos.

[00203] Em certos aspectos, as células hospedeiras da presente invenção podem expressar a proteína de fusão do FIX in vivo ou in vitro. A produção in vitro permite a ampliação para conceder grandes quantidades dos polipeptídeos alterados desejados da presente invenção. Uma proteína de fusão do FIX pode ser produzida através do cultivo das células hospedeiras aqui descritas, sob condições em que a proteína de fusão do FIX é expressa. Técnicas para o cultivo de célu

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106/203 las de mamífero sob condições de cultura de tecido são conhecidas na especialidade e incluem o cultivo homogêneo em suspensão, por exemplo, em um reator de elevação do ar ou em um reator de agitação contínua ou cultura celular imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatografia por afinidade. Em outros aspectos, as células hospedeiras expressam a proteína de fusão do FIX in vivo. [00204] Em uma modalidade, a presente invenção inclui um método de preparação de uma proteína de fusão do FIX que compreende a inserção de um componente heterólogo em um sítio de inserção, a fusão de um componente heterólogo ao C-terminal do FIX, ou ambas, conforme aqui descrito, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

[00205] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um método de aumentar a meia-vida de uma proteína do FIX sem eliminar ou reduzir a atividade pró-coagulante da proteína do FIX, compreendendo a inserção de um componente heterólogo em um sítio de inserção, a fusão de um componente heterólogo ao C-terminal do FIX, ou ambas, como aqui descrito, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante e meia-vida aumentada em comparação com a proteína do FIX sem o componente heterólogo.

[00206] Em outras modalidades, a invenção fornece um método de construção de uma proteína de fusão do FIX que compreende a concepção de uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína de fusão do FIX compreendendo pelo menos um componente heterólogo em um sítio de inserção, a fusão ao C-terminal do FIX, ou ambas, con

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107/203 forme aqui descrito.

[00207] Em certas modalidades, a presente invenção inclui um método de aumentar a expressão de uma proteína de fusão do FIX que compreende a inserção de um componente heterólogo em um sítio de inserção, a fusão ao C-terminal do FIX, ou ambas, conforme aqui descrito, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade prócoagulante.

[00208] Em mais outras modalidades, a invenção fornece um método de reter a atividade pró-coagulante de uma proteína de fusão do FIX, compreendendo a inserção de um componente heterólogo em um sítio de inserção, a fusão de um componente heterólogo ao C-terminal do FIX, ou ambas, conforme descrito nesta invenção, em que a proteína de fusão do FIX apresenta atividade pró-coagulante.

IV· COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE TRATAMENTO [00209] A presente invenção fornece ainda um método para prevenção, tratamento, melhora ou controle de uma doença ou condição de coagulação ou uma condição de hemorragia em um indivíduo humano com sua necessidade utilizando uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão do FIX da presente invenção. Um método exemplar compreende a administração ao indivíduo com sua necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição/formulação farmacêutica que compreende uma proteína de fusão do FIX da presente invenção. Em outros aspectos, uma composição que compreende um DNA que codifica a proteína de fusão da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo com sua necessidade. Em certos aspectos da presente invenção, uma célula que expressa uma proteína de fusão do FIX da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo com sua necessidade. Em certos aspectos da presente invenção, a composição farmacêutica compreende (i)

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108/203 uma proteína de fusão do FIX, (ii) um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína de fusão do FIX, (iii) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão do FIX, (iv) uma célula que compreende um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína de fusão do FIX e/ou um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão do FIX, ou (v) uma combinação dos mesmos, e as composições farmacêuticas ainda compreendem um excipiente ou veículo aceitável.

[00210] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de administração de uma proteína de fusão do Fator IX (FIX), que compreende administração a um indivíduo de uma proteína de fusão do FIX, em que (a) a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX e pelo menos um XTEN, que é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos, (b) em que a proteína de fusão do FIX é administrada por via subcutânea; e (c) em que após a administração, a proteína de fusão do FIX apresenta uma atividade no plasma de cerca de 1% a cerca de 30%, por exemplo, de cerca de 5% a cerca de 30%.

[00211] Em algumas modalidades, após a administração da proteína de fusão do FIX aqui divulgada, a atividade no plasma de uma proteína de fusão do FIX é de cerca de 1% a cerca de 30%, por exemplo, 5% a 30%, por exemplo, 1% a 20%, por exemplo, 5% a 20%, por exemplo, 1% a 10%, por exemplo, 5% a 10%, por exemplo, de cerca

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109/203 de 10% a cerca de 30%, de cerca de 10% a cerca de 20% durante o tratamento (por exemplo, a partir da primeira administração até a segunda administração). Por exemplo, a atividade no plasma após administração de uma proteína de fusão do FIX aqui divulgada pode ser mais elevada do que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% e mais baixa do que 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12% ou 11% durante o prazo de duração do tratamento (por exemplo, a partir da primeira administração até a segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona ou décima (ou mais elevada) administração).

[00212] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose eficaz. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose de cerca de 1 IU/kg a cerca de 500 lU/kg. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose de cerca de 50 IU/kg a cerca de 300 lU/kg, de cerca de 50 IU/kg a cerca de 250 lU/kg, de cerca de 50 lU/kg a cerca de 200 lU/kg, de cerca de 50 IU/kg a cerca de 150 lU/kg, de cerca de 50 IU/kg a cerca de 100 lU/kg, de cerca de 100 IU/kg a cerca de 300 lU/kg, de cerca de 150 IU/kg a cerca de 300 lU/kg, de cerca de 200 IU/kg a cerca de 300 lU/kg, de cerca de 250 IU/kg a cerca de 300 lU/kg, de cerca de 100 IU/kg a cerca de 250 lU/kg, de cerca de 100 IU/kg a cerca de 200 lU/kg, de cerca de 100 IU/kg a cerca de 150 lU/kg, de cerca de 150 IU/kg a cerca de 250 lU/kg ou de cerca de 150 IU/kg a cerca de 200 lU/kg. Em uma modalidade, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose de cerca de 50 IU/kg a cerca de 300 lU/kg.

[00213] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose cerca de 25 lU/kg, cerca de 50 lU/kg, cerca de 75 lU/kg, cerca de 100 lU/kg, cerca de 125 lU/kg, cerca de 150 lU/kg, cerca de 175 lU/kg, cerca de 200 lU/kg, cerca de 225 lU/kg,

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110/203 cerca de 250 IU/kg, cerca de 275 lU/kg, cerca de 300 lU/kg, cerca de 325 IU/kg, cerca de 350 IU/kg, cerca de 375 IU/kg ou cerca de 400 IU/kg. Em uma modalidade, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose cerca de 100 IU/kg. Em outra modalidade, a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose cerca de 200 IU/kg.

[00214] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma de cerca de 1% a cerca de 50%. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 50%, de cerca de 10% a cerca de 50%, de cerca de 15% a cerca de 50%, de cerca de 20% a cerca de 50%, de cerca de 25% a cerca de 50%, de cerca de 30% a cerca de 50%, de cerca de 35% a cerca de 50%, de cerca de 40% a cerca de 50%, de cerca de 10% a cerca de 45%, de cerca de 15% a cerca de 40%, de cerca de 20% a cerca de 40%, de cerca de 20% a cerca de 35%, de cerca de 25% a cerca de 40%, ou de cerca de 25% a cerca de 35%. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma de cerca de 10% a cerca de 30%.

[00215] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma cerca de 10%, cerca de 11 %, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29% ou cerca de 30%. Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma cerca de 30%. Em outra modalidade, proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma cerca de 15%.

[00216] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta um valor mínino de atividade no plasma de cerca de 1% a cerca

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111/203 de 20%. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma de cerca de 5% a cercade

20%, de cerca de 10% a cerca de 20%, de cerca de 15% a cercade

20%, de cerca de 1% a cerca de 15%, de cerca de 1% a cercade

10%, de cerca de 1% a cerca de 5% ou de cerca de 5% a cercade

15%. Em uma modalidade, a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 10%. [00217] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11 %, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14% ou cerca de 15%. Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma cerca de 5%.

[00218] A proteína de fusão do FIX da presente invenção pode ser administrada a um paciente por via intravenosa, por via subcutânea ou por via oral. Em certas modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada a um indivíduo através de injeção intravenosa. Em outras modalidades, a proteína de fusão do FIX é administrada a um indivíduo através de injeção subcutânea. As injeções podem compreender um único bolus. Os indivíduos podem receber mais do que uma injeção.

[00219] As proteínas de fusão da presente invenção podem ser utilizadas profilaticamente. Como utilizado nesta invenção, o termo tratamento profilático refere-se à administração de uma molécula antes de um episódio de hemorragia. Em uma modalidade, o indivíduo com necessidade de um agente hemostático geral está passando, ou está a ponto de passar, por cirurgia. A proteína de fusão da presente invenção pode ser administrada antes ou após a cirurgia como uma prevenção. A proteína de fusão da presente invenção pode ser administrada

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112/203 durante ou após a cirurgia para controlar um episódio de hemorragia agudo. A cirurgia pode incluir, mas não é limitada a isto, transplante de fígado, ressecção hepática, procedimentos dentários ou transplante de células tronco.

[00220] A proteína de fusão da presente invenção também é utilizada para tratamento sob demanda. O termo tratamento sob demanda refere-se à administração de uma proteína de fusão em resposta aos sintomas de um episódio de hemorragia ou antes de uma atividade que pode provocar hemorragia. Em um aspecto, o tratamento sob demanda é dado a um indivíduo quando a hemorragia começa, tal como após uma lesão, ou quando a hemorragia é esperada, tal como antes da cirurgia. Em outro aspecto, o tratamento sob demanda é dado antes das atividades que aumentam o risco de hemorragia, tais como os esportes de contato.

[00221] Em outras modalidades, a proteína de fusão é utilizada para controlar, melhorar ou tratar um episódio de hemorragia agudo. Em outras modalidades, a proteína de fusão do FIX apresenta um ou mais parâmetros farmacocinéticos em comparação com uma proteína do FIX correspondente sem o componente heterólogo. Os parâmetros PK podem se basear no nível de antígeno do FIX (muitas vezes aqui indicado entre parênteses como antígeno) ou no nível de atividade do FIX (muitas vezes aqui indicado entre parênteses como atividade). Na literatura, os parâmetros PK são frequentemente baseados no nível de atividade do FIX devido à presença no plasma de alguns indivíduos de FIX endógeno inativo, que interfere com a capacidade de medir o FIX administrado (isto é, exógeno) utilizando o anticorpo contra o FIX. No entanto, quando o FIX é administrado como parte de uma proteína de fusão Fc como aqui fornecida, o antígeno do FIX administrado (isto é, exógeno) pode ser exatamente medido utilizando o anticorpo para o polypeptídeo heterólogo. Além disso, certos parâmetros PK podem ser

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113/203 baseados nos dados preditos do modelo (muitas vezes aqui indicado entre parênteses como predito do modelo) ou nos dados observados (muitas vezes aqui indicado entre parênteses como observado), e de preferência se baseiam nos dados observados.

[00222] A proteína de fusão do FIX pode ser administrada a um indivíduo através de qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, a proteína de fusão do FIX pode ser administrada através da administração tópica (por exemplo, transdérmica ou ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, retal ou parenteral (por exemplo, subcutânea, intradérmica, intravascular/intravenosa, intramuscular, espinal, intracraniana, intratecal, intraocular, periocular, intraorbital, intrassinovial e intraperitoneal). Em uma modalidade particular, a proteína de fusão do FIX é administrada através de uma injeção subcutânea. A injeção subcutânea pode incluir um ou mais bolus, incluindo, por exemplo, um único bolus de uma dose da proteína de fusão do FIX. Alternativamente, a proteína de fusão do FIX pode ser administrada por meio de injeção intravenosa.

[00223] A dose de proteína de fusão do FIX pode variar dependendo da natureza da proteína de fusão particular e da natureza da condição do indivíduo. Em algumas modalidades, a dose da proteína de fusão do FIX pode compreender entre 1 e 1000 lU/kg de proteína de fusão do FIX.

[00224] A condição hemorrágica pode ser provocada por um distúrbio de coagulação do sangue. Um distúrbio da coagulação do sangue também pode ser referido como uma coagulopatia. Em um exemplo, o distúrbio da coagulação do sangue, que pode ser tratado com uma composição farmacêutica da presente invenção, é a hemofilia. Em outro exemplo, o distúrbio da coagulação do sangue, que pode ser tratado com uma composição farmacêutica da presente divulgação é a hemofilia B.

[00225] Em algumas modalidades, o tipo de hemorragia associado

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114/203 com a condição de hemorragia é selecionado de hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma da cabeça, hemorragia gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, hemorragia do sistema nervoso central, hemorragia no espaço retrofaríngeo, hemorragia no espaço retroperitoneal e hemorragia na bainha de iliopsoas.

[00226] Em outras modalidades, o indivíduo que sofre da condição de hemorragia está com necessidade de tratamento para cirurgia, incluindo, por exemplo, profilaxia cirúrgica ou gestão peri-operatória. Em um exemplo, a cirurgia é selecionada de uma pequena cirurgia e grande cirurgia. Os procedimentos cirúrgicos exemplares incluem a extração do dente, cirurgia para retirada das amígdalas, herniotomia inguinal, sinovectomia, craniotomia, osteossíntese, cirurgia do trauma, cirurgia intracraniana, cirurgia intra-abdominal, cirurgia intratorácica, cirurgia de substituição da articulação (por exemplo, a substituição total do joelho, substituição do quadril, e similares), cirurgia cardíaca e cesariana.

[00227] Em outro exemplo, o indivíduo é tratado concomitantemente com o Fator VIII. Visto que os compostos da presente invenção são capazes de ativar o FIXa, eles podem ser utilizados para pré-ativar o polipeptídeo do FIXa antes da administração do FIXa ao indivíduo.

[00228] Os métodos da presente invenção podem ser praticados em um indivíduo com necessidade de tratamento profilático ou tratamento sob demanda.

[00229] As composições farmacêuticas que compreendem uma proteína de fusão do FIX da presente invenção podem ser formuladas para qualquer forma apropriada de administração, incluindo, por exemplo, a administração tópica (por exemplo, transdérmica ou ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, retal ou parenteral.

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115/203 [00230] O termo parentera como aqui utilizado inclui a injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraniana, intratecal, intraocular, periocular, intraorbital, intrassinovial e intraperitoneal, assim como qualquer técnica de injeção ou infusão semelhante. Em particular, as composições farmacêuticas que compreendem uma proteína de fusão do FIX da presente invenção podem ser formuladas para a administração subcutânea. A composição pode ser também, por exemplo, uma suspensão, emulsão, formulação de liberação sustentada, creme, gel ou pó. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais tais como triglicerídeos.

[00231] Em um exemplo, a formulação farmacêutica é uma formulação líquida, por exemplo, uma solução aquosa isotônica tamponada. Em outro exemplo, a composição farmacêutica possui um pH que é fisiológico, ou perto do fisiológico. Em outros exemplos, a formulação aquosa possui uma osmolaridade e salinidade fisiológica ou próxima da fisiológica. Ela pode conter cloreto de sódio e/ou acetato de sódio. Em alguns exemplos, a composição da presente invenção é liofilizada. [00232] Uma proteína de fusão da presente invenção pode ser produzida in vivo em um mamífero, por exemplo, um paciente humano, utilizando uma abordagem de terapia genética para o tratamento de uma doença ou distúrbio hemorrágico selecionado dentre o grupo que consiste em um distúrbio de coagulação de sangramento, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma da cabeça, hemorragia gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, hemorragia do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaríngeo, sangramento no espaço retroperitoneal e hemorragia na bainha de iliopsoas seria terapeuticamente benéfica. Em uma modalidade, a doença ou distúrbio

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116/203 hemorrágico é a hemofilia. Em outra modalidade, a doença ou distúrbio hemorrágico é a hemofilia B. Isto envolve a administração de um ácido nucléico adequado de codificação da proteína de fusão de maneira operável ligado às sequências de controle da expressão adequadas. Em certa modalidade, estas sequências são incorporadas em um vetor viral. Os vetores virais adequados para tal terapia de gene incluem vetores adenovirais, vetores lentivirais, vetores de baculovírus, vetores virais de Epstein Barr, vetores, vetores papovavirais, vetores do vírus da varíola, vetores virais do herpes simples, e vetores virais adeno associados (AAV). O vetor viral pode ser um vetor viral de replicao defeituosa. Em outras modalidades, um vetor adenoviral possui uma deleção no seu gene E1 ou gene E3. Quando um vetor adenoviral é utilizado, o mamífero não pode ser exposto a um ácido nucleico que codifica um gene marcador selecionável. Em outras modalidades, as sequências são incorporadas em um vetor não viral conhecido daqueles versados na técnica.

[00233] A prática da presente divulgação irá empregar, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells

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And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes l-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

[00234] Trabalhos de referência padrão que apresentam os princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology, 6^th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); e Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988).

[00235] Tendo agora descrito a presente divulgação com detalhes, ela será mais claramente compreendida por referência aos seguintes exemplos, que são incluídos por meio desta para propósitos de ilustração unicamente e não são destinados a serem limitativos da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Identificação das Variantes Ativas de FIX-XTEN [00236] As proteínas de fusão do FIX compreendendo um polipeptídeo do FIX com uma ou mais inserções de XTEN para melhorar as

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118/203 propriedades da proteína do FIX foram construídas. No entanto, a localização, o comprimento, a composição e o número de modificações de XTEN podem ser facilmente variados, e o impacto destas modificações sobre a atividade e a depuração do FIX pode ser avaliado.

[00237] O presente exemplo visa identificar sítios no FIX que pode acomodar a introdução de XTENs sem anular a atividade do FIX e aplicar esta abordagem à proteína de fusão tanto para o FIX de outra maneira não modificado quanto para FIX-Fc recombinante.

Métodos [00238] A sequência de codificação de polipeptídeo do FIX foi ligada no vetor de expressão pcDNA4/myc-His C (INVITROGEN™, Carlsbad, CA) entre os sítios BsiWI e Pmel após a introdução de uma sequência de iniciação da translação Kozak (GCCGCCACC) imediatamente 5' do códon ATG que codifica o resíduo Met de início.

[00239] As células HEK293F (INVITROGEN™, Carlsbad, CA) foram transfectadas com o plasmídeo utilizando polietilenoimina (PEI, Polysciences Inc., Warrington, PA). As células transitoriamente transfectadas foram cultivadas em meio FREESTYLE™ 293 ou uma mistura de meios FREESTYLE™ 293 e CD OPTICHO™ (INVITROGEN™, Carlsbad, CA). O meio de cultura celular foi colhido 5 dias após a transfecção e analisado com relação à atividade do FIX através do ensaio cromogênico ou de atividade do aPTT FIX.

[00240] A atividade do FIX cromogênica foi medida utilizando o kit BIOPHEN Factor IX da Aniara e todas as incubações foram executadas em um aquecedor de placa a 37 O com agitação. Colheitas de cultura celular do meio de transfecção transitória de variantes de FIXXTEN das placas de 6 reservatórios foram diluídas para a faixa desejada de atividade do FIX utilizando tampão de diluição Tris-BSA (R4). Padrões de FIX também foram preparados em tampão de diluição Tris-BSA. Os padrões, amostras de cultura celular diluídas e um con

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119/203 trole de ensaio de plasma humano normal reunido (50 μΙ/reservatório) foram adicionados nas placas de 96 reservatórios IMMULON®2HB em duplicatas. O Fator X Humano, FVIILC e inibidor de polimerização de fibrina (50 μΙ), 50 μΙ de mistura de Fator Xia, com trombina, fosfolipideos e cálcio, e 50 μΙ de substrato cromogênico específico do Fator Xa (SXa-11) foram adicionados sequencialmente a cada reservatório, com 2 minutos de incubação entre cada adição. Após a incubação com o substrato, 50 μΙ de ácido acético a 20% foram adicionados para terminar a reação de coloração, e a absorbância em 405 nm foi medida com um instrumento SPECTRAMAX® plus (MOLECULAR DEVICES®). A análise dos dados foi executada utilizando SOFTMAX® Pro Software (versão 5.2).

[00241] Um ensaio de coagulação no tempo de tromboplastina parcial ativada de um estágio (aPTT) foi empregado para avaliar a atividade do FIX. A atividade do FIX-XTEN aPTT foi medida utilizando o instrumento SYSMEX® CA-1500 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY). Para criar uma curva padrão para o ensaio, o WHO OMS Factor IX padrão foi diluído com meio de transfecção simulada com concentração de meio de cultura correspondente como a amostra de teste. As colheitas de cultura celular do meio de transfecção transitória de variantes de FIX-XTEN de placas de 6 reservatórios foram diluídas na faixa desejada de atividade do FIX utilizando meio de transfecção simulada. Após a diluição, o ensaio de aPTT foi executado utilizando o instrumento Sysmex como se segue: 50 μΙ de padrões diluídos e as amostras foram misturadas com 50 μΙ Siemens human FIX depleted Plasma e depois 50 μΙ ativador Siemens Actin FSL (ácido elágico). A mistura foi incubada durante 1 min. Subsequentemente, 50 μΙ de CaCL Siemens foram adicionados à mistura e a mistura foi incubada durante 240 segundos. O tempo de coagulação foi medido imediatamente após esta incubação. Para determinar a atividade do FIX

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120/203 das amostras de teste, os tempos de coagulação dos padrões foram representados graficamente utilizando escalas log para extrapolar a equação entre o tempo de coagulação e atividade do FIX, e a atividade do FIX-XTEN foi então calculada contra a curva padrão.

Seleção dos Sítios de Inserção [00242] As estruturas do FIX do Protein Data Bank, 1PFX, 11XA, 1CFI, 1CFH,1EDM, 3LC3, 3LC5, 1RFN, 1X7A e 3KCG, foram analisadas para selecionar os sítios em FIX para a inserção de XTEN. A inserção XTEN dentro do domínio GLA foi evitada devido ao papel essencial do domínio GLA na ancoragem do FIX nas superfícies de fosfolipídeo e de colágeno subendotelial tipo IV. Os sítios de inserção de XTEN foram selecionados através da análise de estruturas do FIX disponíveis no Protein Data Bank, em conjunto com os seguintes critérios: 1) área de superfície acessível calculada pelo software de algoritmo ASA View (http://www.abren.net/asaview/) e Get Area (http://curie.utmb.edu/getarea.html), 2) acessibilidade do solvente avaliada por espectrometria de massa de troca hidrogênio/deutério (H/DXMS), 3) exclusão dos sítios dentro de elementos estruturais secundários definidos, 4) preferência para posições com variabilidade de sequência de proteína inter-espécies significativa.

[00243] Quatro sítios no domínio EGF1, 5 sítios no domínio EGF2, 2 sítios na região de ligante entre o domínio de AP e o domínio EGF2, 4 sítios no domínio AP (peptídeo de ativação) e 18 sítios do domínio catalítico foram selecionados para inserção de XTEN (Tabela 6).

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121/203

Tabela 6: Sítios potenciais para a inserção de XTEN no FIX (inserção no C-terminal do resíduo indicou)

Domínio de FIX	Sítios Selecionados
EGF1	E52, G59, I66, K80
EGF2	D85, N89, A103, N105, E113
Ligante	P129, K142
AP	V149, E162, D166, S174
Catalítico	K188, V202, E224, G226, K228, T230, E240, H257, K265, E277, S283, D292, K316, K341, H354, K392, R403, K413

Exame da Atividade de Inserções de XTEN do Aminoácido 42 e Fusão C-Terminal [00244] A variante do FIX Padua (R338L) altamente ativa foi utilizada como uma matriz para contar a perda de atividade do FIX potencial devido à atividade reduzida provocada pela introdução de XTENs. Um elemento XTEN do resíduo 42 (AE42) foi inserido nos sítios selecionados através do uso dos critérios acima ou fundido no C-terminal de FIX. As atividades do FIX destas variantes foram avaliadas em meio condicionado de células HEK293 transfectadas conforme descrito acima. As atividades do FIX de FIX-AE42s são apresentadas como porcentagem da construção de base sem XTEN, FIX-R338L (Figura 1).

[00245] A inserção de XTEN foi tolerada em sítios limitados, conforme determinado pelo ensaio cromogênico de FIX (Figura 1 e Tabela 7). Um total de 33 sítios no FIX foram selecionados e avaliados pela inserção de AE-42. Destes, dois no domínio EGF2, um na região conectora entre o domínio EGF2 e o domínio AP, quatro no domínio AP, e quatro no domínio catalítico, incluindo o C-terminal, foram identificados como sítios permissivos através do ensaio de atividade do FIX (Figura 1 e Tabela 7).

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122/203

Tabela 7: Exemplo de Sítios de Inserção do FIX

Sítio de inserção	Domínio	Atividade AE42	Atividade AE72	Atividade AE144	Atividade AE288	Atividade AE4864
52	EGF1	ND
59	EGF1	ND
66	EGF1	ND
80	EGF1	ND
85	EGF2	ND
89	EGF2	ND
103	EGF2	+	ND	ND	ND	ND
105	EGF2	+	ND	ND	ND	ND
113	EGF2	ND
129	Ligante EGF2-AP	ND
142	Ligante EGF2-AP	++	ND	ND	ND	ND
149	AP	+++	+	+	+	ND
162	AP	++	+	+	+	ND
166	AP	+++	+	+	+	ND
174	AP	+++	+	+	+	ND
188	Domínio catalítico	ND
202	Domínio catalítico	+
224	Domínio catalítico	+	+	ND	ND	ND
226	Domínio catalítico	+
228	Domínio catalítico	+
230	Domínio catalítico	ND
240	Domínio catalítico	ND
257	Domínio catalítico	+
265	Domínio catalítico	ND
277	Domínio catalítico	ND
283	Domínio catalítico	ND
292	Domínio catalítico	ND
316	Domínio catalítico	ND
341	Domínio catalítico	ND

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123/203

Sítio de inserção	Domínio	Atividade ililll	Atividade AE72	Atividade AE144	Atividade AE288	Atividade AE4864
354	Domínio catalítico	ND
392	Domínio catalítico	ND
403	Domínio catalítico	ND
413	Domínio catalítico	++	+	+	+	ND
415	C-Terminal	+++	+++	++	++	+

Nota: ND = Nenhuma atividade detectada; (+) = menos do que 30% de atividade detectada; (++) = entre 30% e 70% de atividade detectada; e (+++) = mais do que 70% de atividade detectada como uma porcentagem da construção de base, através do ensaio cromogênico (ver as Figuras 5A-5C e 6A-6B).

Atividade de Inserções mais Longas e Fusão C-Terminal [00246] XTENs mais longos (AE-72, -144 e -288) foram então similarmente testados em sítios mostrados de serem permissivos para a inserção de AE42. As atividades do FIX foram determinadas como anteriormente descrito e são apresentadas como porcentagem da construção de base sem XTEN, FIX-R338L (Figura 2).

[00247] Apenas os sítios em AP e os sítios no ou próximos do Cterminal de FIX permitiram mais XTENs (AE144, AE288 ou AE864) (Figura 2). A atividade do FIX detectada no meio condicionado inversamente correlacionado com o comprimento de XTEN introduzido (Figura 2, Tabela 7). Quatro sítios permissivos de inserção em diferentes domínios de FIX foram selecionados para gerar uma biblioteca combinatória.

Múltiplas Inserções de XTEN [00248] Com base nos resultados obtidos com as variantes de XTEN individuais, as variantes de FIX com múltiplas inserções de XTEN de vários comprimentos e em quatro locais diferentes (ver a Figura 4 e a Tabela 8) foram avaliadas quanto a atividade do FIX no meio condicionado de células HEK293 transfectadas, através do en

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124/203 saio aPTT (Tabelas 8 a 10). As atividades do FIX são apresentadas como porcentagem da construção de base sem XTEN, FIX-R338L (Figura 4).

Tabela 8: Exemplo de Inserções Duplas de FIX

Sítio de inserção 1	XTEN 1 (ou IIIIIIMIIIIIIIII	Sítio de inserção 2	XTEN 2 (OU llllllliiilllllll	Atividade
105	AE42			++
166	AE42			++
166	AE72			+
166	AE144			+
224	AE42			+
C-Term	AE72			++
C-Term	AE144			+
C-Term	AE288			+
C-Term	Fc			++
166	AE42	C-Term	AE72	++
166	AE42	C-Term	AE144	+
166	AE42	C-Term	AE288	+
166	AE72	C-Term	AE72	+
166	AE72	C-Term	AE144	+
166	AE72	C-Term	AE288	+
166	AE144	C-Term	AE72	+
166	AE144	C-Term	AE144	+
166	AE144	C-Term	AE288	+
105	AE42	166	AE42	+
105	AE42	166	AE72	+
105	AE42	166	AE144	ND
105	AE42	C-Term	AE72	+
105	AE42	C-Term	AE144	+
105	AE42	C-Term	AE288	+
105	AE42	224	AE42	+
166	AE42	224	AE42	+
166	AE72	224	AE42	+

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125/203

Sítio de in- serção 1	XTEN 1 (ou llllllWlillllllll	Sítio de in- IIIBIII·	XTEN 2 (ou	Atividade
166	AE144	224	AE42	ND
224	AE42	C-Term	AE72	+
224	AE42	C-Term	AE144	+
224	AE42	C-Term	AE288	+
105	AE42	C-Term	Fc	+
224	AE42	C-Term	Fc	+
166	AE42	C-Term	Fc	+
166	AE72	C-Term	Fc	+
166	AE144	C-Term	Fc	+
Nota: ND = Nenhuma atividade detectada;	(+) = menos d	o que 30% de

atividade detectada; (++) = entre 30% e 70% de atividade detectada; e (+++) = mais do que 70% de atividade detectada como porcentagem de construção de base, através do ensaio cromogênico (ver as Figuras 8A-8C).

Tabela 9: Elementos de XTEN Inseridos em Cada Domínio

Localização	Elemento
EGF2	AE42
APROPRIADAMENTE	AE42, AE72, AE144
Catalítica 60-loop	AE42
C-Term	AE72, AE144, AE288, Fc

Tabela 10: Número Total de Construções Inseridas como Combinações isoladas, duplas, triplas e quádruplas

Combinação	# Construções
Isolada	9
Dupla	27
Tripla	31
Quádrupla	12
	Total 79

[00249] Três grupos, FIX com um único XTEN, FIX com inserções

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126/203 duplas de XTEN e FIX-Fc com uma única inserção de XTEN, apresentaram atividade detectável, enquanto que a combinação de inserção/fusão em três ou mais sítios aboliu a atividade do FIX (Figura 4). [00250] Em conclusão, vários sítios permissivos para a inserção XTEN estão presentes no FIX e a seleção de combinações de variantes de inserções de XTEN retém a atividade de FIX. As variantes de FIX-XTEN ativas aqui identificadas são candidatas para caracterização de farmacocinética em camundongos com hemofilia B.

Exemplo 2: Proteínas de fusão do FIX e Sua Recuperação do Plasma e AUC/D [00251] Camundongos deficientes do Fator IX (HemB, B6.129P2F9tm1Dws/J, MGI:1932297) (Lin. et aí., 1997) foram originalmente adquiridos do Dr. Darrel Stafford (University of North Carolina, Chapel Hill). Camundongos HemB macho/fêmea foram cada um injetados por via intravenosa com uma única injeção em bolus intravenosa de 50 ou 200 lU/kg de proteínas de fusão do FIX (por exemplo, FIX-CT.288 (AE288 XTEN fundido ao C-terminal de um polipeptídeo do FIX), FIXCT.864 (AE864 XTEN fundido com o C-terminal de um polipeptídeo do FIX), FIX-AP.144 (AE144 XTEN inserido após D166 dentro do domínio de AP de um polipeptídeo do FIX), FIX-AP.72 (AE72 XTEN inserido após D166 dentro do domínio de AP de um polipeptídeo do FIX), FIXAP.42 (AE42 XTEN inserido após D166 dentro do domínio de AP de um polipeptídeo do FIX), FIXFc, e FIX)) em um volume de dosagem de 10 ml/kg em t = 0 hora. O sangue foi coletado em 5 minutos após a dosagem até 168 horas (7 dias) após a dosagem. Para cada momento indicado ~ 100 μΙ de sangue em citrato foram coletados através do sangramento da veia cava retro-orbital ou terminal de 3 a 4 camundongos por momento. Até 3 momentos por camundongo foram gerados. O plasma foi isolado por centrifugação em 5000 rpm durante 8 minutos e as amostras de plasma foram congeladas rapidamente em

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127/203 um banho de etanol em gelo seco e armazenadas a -80 O até que fossem analisadas com o ensaio de tempo de tromboplastina ativada de um estágio (aPTT) em um analisador de coagulação SysmexCA1500, utilizando reagentes Dade Behring e actina FSL como ativador e material de dosagem como padrões de atividade. Nas Figuras 5A-5B, as atividades plasmáticas são traçadas em gráfico como % de dose injetada. O Tempo Médio de Permanência (MRT) e outros parâmetros farmacocinéticos (PK) foram calculados utilizando a modelação não compartimental com Phoenix WinNonlin 6.2.1 (Pharsight, Certera by NCA analysis). A Figura 5C ilustra as recuperações de plasma relativas (eixo Y) versus o MRT (eixo X). A área dos pontos representa a área sob a curva por dose (AUC/D, em h/kg/ml) e mostra que a recuperação da atividade do FIX no plasma e a AUC/D aumentam com o aumento do comprimento de XTEN (Figura 5C). As figuras mostram que as proteínas de fusão do FIX com comprimento de XTEN aumentado (288 e 864 no C-terminal ou 144, 72 e 42 no domínio de AP) apresentam um aumento dependente do tamanho na recuperação de plasma até 60% e AUC/D aumentada após a administração em bolus intravenosa.

Exemplo 3: Proteínas de Fuso do FIX e sua Meia-Vida [00252] Camundongos deficientes do FIX foram dosados por via intravenosa com 50 ou 200 lU/kg das proteínas de fusão do FIX: FIX fundido a um XTEN com 288 aminoácidos (por exemplo, AE288); FIXFc em que um XTEN com 72 aminoácidos (por exemplo, AE72) é inserido no domínio AP após D166; FIX-Fc em que um XTEN com 42 aminoácidos (por exemplo, AE42) é inserido no domínio AP após D166; e controles (por exemplo, FIXFc e FIX). O plasma foi coletado e a atividade do FIX e análise PK foram executadas de forma idêntica com os métodos descritos no Exemplo 5. A Figura 6A traça em gráfico as atividades no plasma como % de dose injetada. Os parâmetros farmaco

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128/203 cinéticos (PK) foram calculados utilizando WinNonlin 6.2.1 (Pharsight, Certera) através da análise de NCA e a FIGURA 6B representa as recuperações relativas de plasma (eixo Y) versus MRT (eixo X). A área dos pontos representa a Área sob a Curva por Dose (AUC/D, em h/kg/mL) e mostra que a inserção de sequências de XTEN no domínio de peptídeo de ativação (AP) de FIXFc prolonga o tempo médio de permanência por mais tempo do que aquele do rFIXFc isoladamente em comparação com o FIX (Figura 6B). Além disso, a recuperação de atividade no plasma e a AUC/D são melhoradas com o aumento do comprimento de XTEN (Figuras 6A-6B). A AUC/D para rFIX-CT.288 (SEQ ID NO: 226) e rFIXFc-AP.72 (SEQ ID NO: 151) foi 3,4 e 4,5 vezes melhorada em comparação com o rFIXFc, respectivamente (Figuras 6A-6B). Isto é equivalente a uma melhora de 8,5 e 14,5 vezes da AUC/D quando comparado com o rFIX administrado por via intravenosa, respectivamente (Figuras 6A-6B). Portanto, as combinações das inserções de XTEN no domínio AP com a extensão da meia-vida mediada por Fc em rFIXFc-R338L prolongam tanto a meia-vida e aumentam na recuperação de plasma quanto a AUC/Dose em comparação com aquela de rFIX e rFIXFc.

Exemplo 4: Farmacocinética Melhorada das Proteínas de Fusão do FIX através da Liberação Subcutânea [00253] Camundongos deficientes de FIX foram administrados em doses por via subcutânea em t=0 com 50 ou 200 lU/kg das proteínas de fusão do FIX: FIX fundido a um XTEN de 288 aminoácidos (por exemplo, AE288) no C-terminal (FIX-CT.288); FIXFc tendo um XTEN de 72 aminoácidos (por exemplo, AE72) no domínio AP (FIXFcAP.72); FIXFc tendo um XTEN de 42 aminoácidos (por exemplo, AE42) no domínio EGF2 (por exemplo, FIXFc-EGF.42); e controless (FIXFc e FIX). O plasma foi coletado e a atividade do FIX e análise PK foram executadas de forma idêntica com os métodos descritos no

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Exemplo 5. A Figura 7A traça em gráfico as atividades no plasma como % de dose injetada. Os parâmetros farmacocinéticos (PK) foram calculados utilizando WinNonlin 6.2.1 (Pharsight, Certera) através da análise de NCA e a FIGURA 6B representa a biodisponibilidade relativa (eixo Y) versus MRT (eixo X). A área dos pontos representa a Área sob a Curva por Dose (AUC/D, em h/kg/mL) e mostra que a fusão de sequências de polipeptideo de XTEN no terminal carbóxi de rFIX ou inserção de sequências de XTEN no domínio de peptídeo de ativação (AP) ou domínio EGF2 de FIXFc melhora grandemente o perfil de dosagem subcutânea das proteínas de fusão do FIX (Figura 7B). rFIXFcAP.72 e rFIX-CT.288 possuem uma AUC/D 6 a 9 vezes melhorada, biodisponibilidade 1,5 a 2 vezes melhorada e Cmax/D 3 a 10 vezes melhorada, em comparação com rFIXFc em camundongos HemB com relação à administração em doses por via subcutânea. Quando comparado com o rFIX a melhora nos parâmetros farmacocinéticos é AUC/D 28 a 40 vezes melhorada, biodisponibilidade 3 vezes melhorada e Cmax/D 15 a 30 vezes melhorada em comparação como o rFIX para FIXFc-AP.72 e rFIX-CT.288, respectivamente (Figuras 7A-7B).

[00254] Tomadas em conjunto, as proteínas de fusão do FIX (por exemplo, rFIX-CT.288 e rFIXFc-AP.72) apresentaram uma AUC/D 2,6 e 1,9 vezes melhorada para a administração em doses por via subcutânea quando comparada com a administração em doses intravenosa de rFIXFc, esta sustentando a dosagem intravenosa uma vez por semana ou menos frequente em seres humanos para profilaxia.

Exemplo 5: Eficácia In vitro de Proteínas de Fusão do FIX [00255] Sangue de hemofilia-B humana foi misturado com as doses indicadas de 3 a 10 e 30 lU/dL de rFIXFc (círculos abertos, linha tracejada) ou uma proteína de fusão do FIX (por exemplo, rFIXFc-AP.72) (pontos cheios, linha cheis) ou veículo (triângulo aberto) (Figuras 8A8C). As características de coagulação do sangue total foram determi

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130/203 nadas utilizando tromboelastometria rotacional (ROTEM) e a coagulação foi iniciada através da recalcificação do sangue (NATEM). rFIXFcAP.72 apresentou atividade semelhante em comparação com rFIXFc no sangue de hemofilia-B, no que diz respeito ao tempo de coagulação (CT em segundos), ângulo alfa (em graus) e firmeza máxima do coágulo (MCF em mm) (Figuras 8A-8C). Os dados de cada ponto de tempo é a média +/- desvio padrão de 4 a 5 amostras replicadas (Figuras 8A-8C).

[00256] rFIXFc-AP.72 e rFIX-CT.288 apresentam farmacocinética subcutânea muito melhorada em camundongos HemB em comparação tanto ao rFIX quanto ao rFIXFc. Outros estudos estão em curso para abordar a eficácia e expansão alométrica em modelos animais pré-clínicos.

Exemplo 6: Eficácia In Vivo de rFIXFc-AP.72 em um Modelo de Sanqramento Agudo de Corte na Cauda de Murino [00257] A eficácia aguda foi estudada em um modelo de sangramento de corte na cauda cego, no qual uma perda de sangue total em camundongos administrados em doses é medida após a amputação da ponta da cauda, conforme descrito anteriormente (Dumont et ai., Blood, 119(13):3024-3030, 2012). Sumariamente, camundongos com Hemofilia B machos de 8 a 15 semanas de idade (Lin et al., Blood (1997) 90: 3962-3966) foram anestesiados com um coquetel de 50 mg/kg de cetamina e 0,5 mg/kg de dexmedetomidina. As caudas foram imersas em solução salina a 37 Ό durante 10 minutos para dilatar a veia lateral seguido por injeção intravenosa na veia da cauda de veículo (3,88 g/L de L-histidina, 23,8 g/L de manitol, 11,9 g/L de sacarose, 3,25 g/L de cloreto de sódio, Polissorbato 20 0,01% (p/v) (pH 7,1), albumina de soro humano 3%), rFIXFc-AP.72 ou rFIXFc em 50, 100 e 200 lU/kg. Cinco minutos após a dosagem, a ponta distai de 5 mm da cauda foi cortada e submersa dentro de um tubo pré-pesado contendo

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131/203 ml de soro fisiológico durante o período de 30 minutos. A perda de sangue foi quantificada em peso. A significância estatística foi calculada utilizando teste t de duas caudas não pareado em GraphPad Prism

6. Estes testes t de duas caudas mostraram que as doses de 50, 100, e 200 ILJ/kg de rFIXFc-AP.72 eram significativamente diferentes do veículo valor p < 0,0001). Além disso, os dados mostram que uma dose baixa, por exemplo, 50 lU/kg, de rFIXFc-AP.72 resulta em perda de sangue significativamente mais baixa em comparação com a mesma dose baixa, isto é, 50 lU/kg, de rFIXFc. Estes resultados demonstram uma eficácia aguda igual ou melhorada para rFIXFc-AP.72 em comparação com rFIXFc neste modelo de hemorragia.

Exemplo 7: Eficácia In Vivo de FIXFc-AP.72 em um Modelo de Sanqramento de Transeccão da Veia da Cauda Profilática de Murino [00258] A eficácia prolongada foi estudada em um modelo de hemorragia de transecção da veia da cauda cego de murino (TVT), em que o tempo de sobrevivência de camundongos com hemofilia-B administrados em doses é medido após a transecção de uma veia lateral da cauda, conforme descrito anteriormente (Toby et al., PLOS One, DOI:10.1371/journal.pone.0148255, 2016; Pan et al., Blood 114:28022822 (2009)). Sumariamente, camundongos machos de 8 a 15 semanas de idade com hemofilia B (Lin et a!., Blood 90: 3962-3966 (1997)) foram pré-dosados por via intravenosa com 15, 50, 100 lU/kg de atividade do FIX de rFIXFc ou doses subcutâneas combinadas de FIXFcAP.72 e comparados com os camundongos que receberam uma dose em bolus de veículo. Em 72 horas após a dosagem, todos os camundongos foram anestesiados todos e uma veia lateral da cauda foi seccionada em um diâmetro de cauda de 2,7 milímetros. Durante as 9 a 11 horas imediatamente após a TVT e depois em um ponto de tempo durante a noite em 24 horas, os pontos finais qualitativos foram monitorados e registrados de hora em hora, incluindo novo sangramento e

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132/203 tempo até à morte (conforme definido como o tempo para a eutanásia, como determinado quando o animal estava moribundo). Todos os camundongos foram sacrificados no final do estudo de 24 horas, enquanto que os animais não mortos ou moribundos foram determinados de terem sobrevivido em 24 horas.

[00259] Os dados foram representados graficamente como porcentagem de sobrevivência após a TVT utilizando GraphPad Prism 6. Os camundongos dosados com veículo por via subcutânea (linha tracejada), por via subcutânea com FIXFc-AP.72 (linhas cheias, símbolos fechados) ou por via intravenosa dosados com FIXFc (linhas tracejadas, símbolos abertos) (15 lU/kg, 50 lU/kg, 100 lU/kg n = 20/dose, exceto para a dose de veículo; n = 30) (FIG. 10). As curvas de sobrevivência para camundongos tratados com doses em lU/kg combinadas por via subcutânea administrados em doses de FIXFc-AP.72 versus rFIXFc administrados em doses por via intravenosa mostraram aumento da sobrevivência de camundongos HemB administrados em doses por via subcutânea de FIXFc-AP.72 em comparação com o rFIXFc administrado em doses por via intravenosa equivalente em todas as doses testadas (FIG. 10).

Exemplo 8: Parâmetros Farmacocinéticos Intravenosos e Subcutâneos Melhorados para FIXFc-AP.72 (FIX-216, cadeia dupla Fc) em comparação com rFIX em camundongos HemB [00260] Camundongos com Hemofilia-B foram administrados em doses com 200 lU/kg de FIXFc-AP.72 (FIX-216, cadeia dupla Fc) ou rFIX. O sangue foi coletado por sangramento retro-orbital nos momentos indicados. Os níveis plasmáticos de FIX foram determinados por atividade de ensaio de coagulação de um estágio utilizando o material de dosagem como padrões de atividade. Na FIG. 11A a atividade plasmática é representada graficamente como % de dose injetada. A Fig. 11B mostra uma tabela dos parâmetros farmacocinéticos calcula

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133/203 dos utilizando Phoenix WinNonLin 6.2.1 (Pharsight, Certara) por análise NCA (não compartimental). Os parâmetros farmacocinéticos melhorados mostrados para FIX-216 contra rFIX incluem o Tempo Médio de Permanência (MRT), a AUC/dose e outros parâmetros.

[00261] A dosagem subcutânea de FIXFc-AP.72 mostra um tmax cerca de 20 horas após a administração em camundongos, e níveis melhorados de atividade no plasma em comparação com rFIX ou rFIXFc administrado em doses por via intravenosa semelhante (lU/kg). Utilizando o modelo de sangramento TVT em camundongos HemB mostramos que em 72 horas após a dosagem, FIXFc-AP.72 administrado em doses por via subcutânea melhorou a eficácia in vivo em comparação com rFIXFc administrado em doses por via intravenosa em todas as doses testadas. Do mesmo modo, testes de eficácia aguda no modelo de hemorragia de corte da cauda de camundongo HemB mostraram eficácia melhorada do FIXFc-AP.72 administrado em doses por via intravenosa comparação com rFIXFc. Estes dados sustentam o potencial de dosagem profilática subcutânea uma vez por semana ou menos frequente de FIXFc-AP.72 em seres humanos.

Exemplo 9: Linearidade de Dose PK de SQ rFIXFc-XTEN [00262] A linearidade da dose PK de rFIXFc-AP.72 administrado em doses por via subcutânea (pJH84; SEQ ID NO: 151) foi avaliada em camundongos HemB. Três grupos de quatro camundongos cada um foram dosados com 50, 100, 200 ou 400 lU/kg de rFIXFc-AP.72. O sangue foi coletado de cada camundongo em três momentos sequenciais por coleta de sangue retro-orbital em 10% p/v de citrato (isto é, 1, 6, 24, 48, 72, 96, 144, 168 e 192 horas após a administração). A atividade do FIX foi medida pelo ensaio de atividade de um estágio autopadronizado. As soluções de dosagem foram confirmadas contra FIX WHO padrão. A análise farmacocinética foi feita utilizando o programa Phoenix (Pharsight Corp, Mountainview, CA). As atividades do FIX no

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134/203 plasma e as recuperações calculadas são apresentadas na FIG. 14A e FIG. 14B, respectivamente. As curvas de atividade do FIX correm em paralelo para as doses crescentes (Fig. 14A) e se sobrepõem quando traçadas em gráfico como recuperação percentil da dose injetada (%) (Fig. 14B), indicando a linearidade de dose na faixa de dose de 50 a 400 ILJ/kg em camundongos HemB. A linearidade de dose foi confirmada pelos parâmetros farmacocinéticos para cada dose testada, conforme calculado pelo software Phoenix WinNonLin utilizando análise não compartimental da dose medida real e dados de nível de atividade no plasma combinados (Fig. 14C).

Exemplo 10: Farmacocinética de rFIXFc-XTEN em Macacos Cinomolqos [00263] Três macacos cinomolgos machos passíveis por coorte foram para cada um administrados 100 lU/kg de rFIXFc-XTEN (pJH84; SEQ ID NO: 151) por qualquer via de dosagem intravenosa ou subcutânea. O sangue foi coletado nos momentos indicados, pré e pós dosagem (Fig. 15A). Os níveis plasmáticos de FIX foram determinados por ELISA específico de rFIXFc-XTEN (captura de XTEN e detecção de FIX humano), assim como por um ensaio de atividade cromogênica do FIX modificado (captura de XTEN) que mediu a atividade no plasma específica de rFIXFc-XTEN. A dosagem foi confirmada contra FIX WHO padrão e níveis plasmáticos de rFIXFc-XTEN foram determinados utilizando rFIXFc-XTEN como padrão. Na FIG. 15A, a média ± desvio padrão dos níveis de antígeno no plasma (linhas pontilhadas) e a atividade no plasma (linhas sólidas n = 3) é representada graficamente como percentil recuperado da dose injetada. A Fig. 15B mostra uma tabela dos parâmetros PK calculados utilizando Phoenix WinNonLin 6.2.1 (Pharsight, Certara) através da análise de NCA incluindo o Yempo Médio de Permanência (MRT), AUC/dose e outros parâmetros. Exemplo 11: Comparação da Administração Intravenosa e Subcutânea

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135/203 [00264] Os camundongos HemB foram administrados em doses por via intravenosa com 50 lU/kg de (linha cheia), 100 (linha tracejada grande) ou 200 lU/kg (linha tracejada pequena) de rFIXFc, e os níveis de atividade no plasma de FIX foram medidos em vários momentos após a administração até 7 dias (FIG. 16). As áreas sombreadas representam os níveis de atividade no plasma de FIX modelados para 100 e 200 lU/kg de rFIXFc-AP.72 administrado em doses por via subcutânea (pJH84; SEQ ID NO: 151), que foram calculadas utilizando um modelo de PK de um compartimento de que ajusta todos os dados de atividade no plasma medidos descritos nas FIGs. 14A a 14C. O rFIXFc-AP.72 administrado em doses por via subcutânea atingiu o seu pico no plasma previsto em aproximadamente 1m dia após a dosagem. Os valores máximos de aproximadamente 15 lU/dL e 30 lU/dL para rFIXFc-AP.72 administrado em doses por via subcutânea de 100 lU/kg e 200 lU/kg, respectivamente, ilustram o potencial reduzido para a super-dosagem pela via subcutânea de dosagem. Risco potencial de trombose é esperado para mais de 150 lU/kg de valores máximos, que são facilmente alcançados para as doses intravenosas de rFIX de mais de 150 lU/kg. Digno de nota é a descoberta de que rFIXFc-AP.72 administrado em doses por via subcutânea fornece níveis plasmáticos mais elevados no primeiro dia após a dosagem e através de níveis em intervalos de dosagem semanais do que o rFIXFc administrado por via intravenosa em doses equivalentes. Isto sugere que a administração subcutânea de rFIXFc-AP.72 pode fornecer uma melhor proteção contra sangramentos em seis dos sete dias após a administração, em comparação com uma quantidade equivalente de rFIXFc administrado por via intravenosa no dia 1 de um ciclo de sete dias.

[00265] A descrição anterior das modalidades específicas irá revelar completamente a natureza geral da presente invenção que outros podem, através da aplicação do conhecimento dentro da habilidade da

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136/203 técnica, modificar e/ou adaptar facilmente as várias aplicações de tais modalidades específicas, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Portanto, estas adaptações e modificações se destinam a estar dentro do significado e faixa de equivalentes das modalidades divulgadas, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados. Deve ficar compreendido que a fraseologia ou terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrição e não de limitação, de tal modo que a terminologia ou fraseologia do presente relatório descritivo deve ser interpretada pelo especialista versado à luz dos ensinamentos e orientação.

[00266] Outras modalidades da presente invenção irão ser evidentes para aqueles versados na técnica a partir da consideração do relatório descritivo e prática da presente invenção aqui divulgada. Pretende-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas como exemplares, com um verdadeiro escopo e espírito da divulgação sendo indicado pelas seguintes reivindicações.

[00267] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 62/452.826 depositado em 31 de janeiro de 2017, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

MODALIDADES [00268] E1. Um método de administração de uma proteína de fusão dO Fator IX (FIX) em um indivíduo com sua necessidade, que compreende a administração subcutânea a um indivíduo de uma proteína de fusão do FIX, em que [00269] a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptídeo do FIX e pelo menos um XTEN, que é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2,

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137/203 aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO:2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO:2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO:2, e qualquer combinação dos mesmos, e [00270] em que após a administração, a proteína de fusão do FIX apresenta uma atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 30% no indivíduo.

[00271] E2. O método de E1, em que a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose de cerca de 50 IU/kg a cerca de 400 IU/kg.

[00272] E3. O método de E1 ou E2, em que a proteína de fusão do

FIX é administrada em uma dose de cerca de 50 IU/kg, de cerca de 100 IU/kg, de cerca de 200 IU/kg ou de cerca de 400 IU/kg.

[00273] E4. O método de qualquer um de E1 a E3, em que a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor máximo de atividade no plasma de cerca de 10% a cerca de 30%.

[00274] E5. O método de qualquer um de E1 a E4, em que a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor máximo de atividade no plasma de cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29% ou cerca de 30%.

[00275] E6. O método de qualquer um de E1 a E5, em que a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor máximo de atividade no plasma de cerca de 30%.

[00276] E7. O método de qualquer um de E1 a E6, em que a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 10%.

[00277] E8. O método de qualquer um de E1 a E7, em que a proteína de fusão do FIX apresenta urn valor mínino de atividade no plasma

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138/203 cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, ou cerca de 10%.

[00278] E9. O método de qualquer um de E1 a E8, em que a proteína de fusão do FIX apresenta um valor mínino de atividade no plasma de cerca de 5%.

[00279] E10. O método de qualquer um de E1 a E9, em que a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma de cerca de 30% e a proteína do FIX apresenta um valor mínino de atividade no plasma de cerca de 5%.

[00280] E11. O método de qualquer um de E1 a E10, em que o sítio de inserção corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2 e qualquer combinação dos mesmos.

[00281 ] E12. O método de qualquer um de E1 a E11, em que o sítio de inserção corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2; aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos.

[00282] E13. O método de qualquer um de E1 a E12, em que o sítio de inserção corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, e ambos.

[00283] E14. O método de qualquer um de E1 a E13, em que o sítio de inserção corresponde ao aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2.

[00284] E15. O método de qualquer um de E1 a E14, em que o

XTEN compreende pelo menos cerca de 6 aminoácidos, pelo menos cerca de 12 aminoácidos, pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos ou pelo menos cerca de

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288 aminoácidos.

[00285] E16. O método de qualquer um de E1 a E15, em que o

XTEN compreende A42, A72, A864, A576, A288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00286] E17. O método de qualquer um de E1 a E16, em que o

XTEN compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, e qualquer combinação dos mesmos.

[00287] E18. O método de E16 ou E17, em que o XTEN compreende AE72ou AE144.

[00288] E19. O método de qualquer um de E16 a E18, em que o

XTEN compreende AE72.

[00289] E20. O método de qualquer um de E1 a E19, que ainda compreende um segundo XTEN.

[00290] E21. O método de E20, em que o segundo XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ ID NO: 2, e qualquer combinação dos mesmos, ou em que o segundo XTEN é fundido ao C-terminal do polipeptídeo do FIX ou um ligante fundido com o C-terminal do polipeptídeo

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140/203 do FIX.

[00291] E22. O método de E20 ou E21, em que o XTEN e o segundo XTEN são inseridos dentro do polipeptideo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido e/ou fundido com o Cterminal do polipeptideo do FIX selecionado do grupo que consiste em:

i. aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2 e aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2;

ii. aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2 e aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2;

iii. aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2 e fundido com o Cterminal;

iv. aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2 e aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2;

v. aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2 e fundido com o Cterminal; e vi. aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2 e fundido com o Cterminal, respectivamente.

[00292] E23. O método de E20 ou E21, em que o XTEN é inserido dentro do polipeptideo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, e em que o segundo XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptideo do FIX.

[00293] E24. O método de qualquer um de E20 a E23, em que o segundo XTEN compreende pelo menos cerca de 6 aminoácidos, pelo menos cerca de 12 aminoácidos, pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos, ou pelo menos cerca de 288 aminoácidos.

[00294] E25. O método de qualquer um de E20 a E24, em que o segundo XTEN é selecionado do grupo que consiste em A42, A72, A864, A576, A288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, e qual

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141/203 quer combinação dos mesmos.

[00295] E26. O método de E25, em que o segundo XTEN é A72 ou

AE144.

[00296] E27. O método de qualquer um de E20 a E26, em que o segundo XTEN compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, e qualquer combinação dos mesmos.

[00297] E28. O método de qualquer um de E20 a E27, que ainda compreende um terceiro, um quarto, um quinto, ou um sexto XTEN.

[00298] E29. Um método que compreende um polipeptideo do FIX e um componente heterólogo que compreende um XTEN, em que o XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptideo do FIX e compreende uma sequência de aminoácido de mais do que 42 aminoácidos e menos do que 144 aminoácidos de comprimento.

[00299] E30. O método de E29, em que o XTEN compreende uma sequência de aminoácido de mais do que 50, 55, 60, 65 ou 70 aminoácidos e menos do que 140, 130, 120, 110, 100, 90 ou 80 aminoácidos ou qualquer combinação dos mesmos.

[00300] E31. O método de E30, em que o XTEN é de 72 aminoácidos de comprimento.

[00301] E32. O método de E31, em que o XTEN é A72.

[00302] E33. O método de E29, em que o XTEN compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de

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98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 35. [00303] E34. O método de qualquer um de E1 a E33, que ainda compreende um domínio Fc.

[00304] E35. O método de E34, em que o domínio Fc é fundido com o polipeptídeo do FIX ou do XTEN.

[00305] E36. O método de E34 ou E35, que compreende um segundo domínio Fc.

[00306] E37. O método de E36, em que o segundo domínio Fc está associado com o primeiro domínio Fc.

[00307] E38. O método de E36 ou E37, que compreende duas cadeias de polipeptídeo, em que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende polipeptídeo do FIX fundido com o domínio Fc, e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende o segundo domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc estão associados por uma ligação covalente.

[00308] E39. O método de E36 ou E37, que é uma cadeia única de polipeptídeo que compreende polipeptídeo do FIX, o domínio Fc, o segundo domínio Fc, e um ligante que liga o domínio Fc e o segundo domínio Fc.

[00309] E40. O método de E39, em que o ligante ainda compreende um ou mais sítios de processamento intracelular.

[00310] E41. O método de E39 ou E40, em que o ligante compreende (Gly4Ser)n, em que n é um número inteiro selecionado de 1 a 100.

[00311] E42. O método de qualquer um de E1 a E41, que compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ

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ID NO: 54 a SEQ ID NO: 153 sem o peptídeo de sinal e a sequência de pró-peptídeo.

[00312] E43. O método de qualquer um de E1 a E42, que possui pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou 100% da atividade pró-coagulante do FIX nativo.

[00313] E44. O método de E43, em que a atividade pró-coagulante é medida por um ensaio de substrato cromogênico, um ensaio de coagulação de um estágio, ou ambos.

[00314] E45. O método de qualquer um de E1 a E44, em que o polipeptídeo do FIX é uma variante de FIX R338L.

[00315] E46. O método de E45, em que a variante de FIX R338L compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 2.

[00316] E47. O método de qualquer um de E1 a E10, em que a proteína de fusão do FIX compreende uma primeira cadeia e uma segunda cadeia, em que:

(a) a primeira cadeia compreende:

(i) um polipeptídeo do FIX;

(ii) pelo menos um XTEN, em que o pelo menos um XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, e em que o pelo menos um XTEN compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos cerca de 72 aminoácidos; e (iii) um primeiro domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc

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144/203 é fundido com o polipeptídeo do FIX do pelo menos um XTEN; e (b) a segunda cadeia compreende um segundo domínio Fc; em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc estão associados por uma ligação covalente.

[00317] E48. O método de E47, em que o pelo menos um XTEN compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 35.

[00318] E49. O método de E47 ou E48, em que a primeira cadeia da proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 227; e em que a segunda cadeia da proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 228.

[00319] E50. A proteína de fusão do FIX de qualquer um de E47 a

E49, em que a primeira cadeia da proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 227; e em que a segunda cadeia da proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 228.

[00320] As seguintes sequências de vetor são referenciadas nos exemplos precedentes e em outros lugares no presente pedido. A seguinte chave irá ajudar na compreensão da informação:

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145/203

Chave:

Peptídeo de sinal (pré-peptídeo)

Pró-peptídeo

Ligante com ou sem marca de proteína

Sítio de Clivagem

Inserção ou fusão de XTEN e/ou Fc

SEQ ID NO: 54 E0113_AE42; PNL118 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR

CEQFCKNSADNKVVCSCTEGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPASSGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLT RAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhh

SEQ ID NO: 55 N0089_AE42 pNL116

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNGAPG

SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSIKNGRCEQ

FCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 163/727

146/203

ISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhh

SEQ ID NO: 56 A0103_AE42 pNL117

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR

CEQFCKNSAGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE

TPASSDNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLT RAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhh

SEQ ID NO: 57 P0129_AE42 pNL119

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPGAPGSPAGSP

TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.hh

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 164/727

147/203

SEQ ID NO: 58 K0142_AE42 pNL120

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT

SKGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSLT

RAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG AGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.HH

SEQ ID NO: 59 V0149_AE42 pNL121

SKLTRAETVGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPASSFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.hh

SEQ ID NO: 60 E0162_AE42 pNL122

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 165/727

148/203

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPASSTILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQF PWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A gspgaetaeqkliseeplspatghhhhhh.hh

SEQ ID NO: 61 D0166_AE42 pNL123

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG AGSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 62 S0174_AE42 pNL124

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 166/727

149/203

DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSGAPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSFNDFTRVVGGEDAKPGQF PWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A gspgaetaeqkliseedlspatghhhhhhhh

SEQ ID NO: 63 K0188_AE42 pNL125

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK

GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSPGQF PWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 64 V0202_AE42 pNL126

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 167/727

150/203

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK

PGQFPWQVVLNGKVGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEP

ATSGSETPASSDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.^

SEQ ID NO: 65 E0224_AE42 pNL127

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSP

TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIE

ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.^

SEQ ID NO: 66 E0240_AE42 pNL128

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 168/727

151/203

HNIEEGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPAS

STEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A gspgaetaeqkliseedlspatghhhhhhhh

SEQ ID NO: 67 H0257_AE42 pNL129

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE

HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGSEPATSGSETPASSNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 68 K0265_AE42 pNL130

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKGAPGSPAGSPTSTEEGTS

ESATPESGPGSEPATSGSETPASSYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 169/727

152/203

ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.HH

SEQ ID NO: 69 E0277_AE42 pNL131

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEGAPGSPA

GSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.HH

SEQ ID NO: 70 D0292_AE42 pNL132

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV

TPICIADGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPA

SSKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL

LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 170/727

153/203

WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A

GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.^

SEQ ID NO: 71 K0316_AE42 pNL133

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGAPGSPAGSPTSTEEG

TSESATPESGPGSEPATSGSETPASSGRSALVLQYLRVPLVDRATCL

LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.^

SEQ ID NO: 72 K0341_AE42 pNL134

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR

ATCLLSTKGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSET

PASSFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A gspgaetaeqkliseedlspatghhhhh

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 171/727

154/203

SEQ ID NO: 73 H0354_AE42 pNL135

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR

ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGSEPATSGSETPASSEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHH.H

SEQ ID NO: 74 K0392_AE42 pNL136

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL

TGIISWGEECAMKGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPASSGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGA gspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.h

SEQ ID NO: 75 R0403_AE42 pNL137

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 172/727

155/203

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV

TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL

TGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPASSYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGA gspgaetaeqkliseedlspatghhhhhhhh

SEQ ID NO: 76 K0413_AE42 pNL138

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKGAPGSPAGSPTST

EEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSLTGPEGPSKLTRAETGA

GSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 77 CT_AE42 pNL140

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 173/727

156/203

DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG AGSPG AETAL .K^SFL.LfíNPNpKYEPF^EDEESGAGSPGA.ETAGAPGSPAGSPTS TEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSGAETAEQKUSEEDLSP ATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 78 E0052_AE42 pNL141

DQCEGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS SNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQF CKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLT RAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.hh

SEQ ID NO: 79 G0059_AE42 pNL142

DQCESNPCLNGGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 174/727

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GSETPASSGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQ FCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhh

SEQ ID NO: 80 IOO66_AE42 pNL143

DQCESNPCLNGGSCKDDIGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG SEPATSGSETPASSNSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQF CKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLT RAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhh

SEQ ID NO: 81 K0080_AE42 pNL144

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKGAPGSPAGSPTST

EEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSNCELDVTCNIKNGRCEQ

FCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 175/727

158/203

TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.hh

SEQ ID NO: 82 D0085_AE42 pNL145

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDGAPGSPAG

SPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSVTCNIKNGRCEQF

CKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLT RAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.hh

SEQ ID NO: 83 CT_AE144 pNL164

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 176/727

159/203

TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG AGSPG AETAL .K^SFL.LPNP/ypKYEPFVVEpEESGAGSPGAETAGAPTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPS

EGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGASSG

AETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 84 CT_AE288 pNL165

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TG I ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG AGSPG AETAL

VPPSFLLPA/PA/DKYEPFW/EDEESG.AGSPGAETAGAPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APASSGAETAEQKUSEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 85 CT_AE864 pNL166

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 177/727

160/203

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG AGSPG AETAL VPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEESGAGSPGAETAGkPGSPkGSPJS TEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPS

EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPA TSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPE SGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG TSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSET PGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSGAETAEQKLISEEDLSP

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 178/727

161/203 atghhhhhhhh

SEQ ID NO: 86 K0142_AE72 pNL167

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT

SKGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGASSLTRAETVFPDVD

YVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGK VDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRN VIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLK FGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNM FCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGK YGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQK LJSEEDLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 87 K0142_AE144 pNL168

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SKGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGT

STEPSEGSAPGASSLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFN DFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHC VETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIAL LELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSA LVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 179/727

162/203

GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL

TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHH

H.

SEQ ID NO: 88 K0142_AE288 pNL169

SKGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT

PESGPGTSTEPSEGSAPASSLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQ STQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWI VTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINK YNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVF HKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSC QGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHH h.hhhhh

SEQ ID NO: 89 V0149_AE72 pNL170

SKLTRAETVGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSET

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 180/727

163/203

PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGASSFPDVD

YVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGK VDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRN VIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLK FGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNM FCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGK YGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQK LISEEDLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 90 V0149_AE144 pNL171

SKLTRAETVGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP

TSTEEGTSTEPSEGSAPGASSFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFN DFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHC VETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIAL LELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSA LVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG

GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL

TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHH

H.

SEQ ID NO: 91 V0149_AE288 pNL172

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 181/727

164/203

CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT

SKLTRAETVGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETP

GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSFPDVDYVNSTEAETILDNIT

QSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEK WIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAI NKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGR VFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRD SCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVN WIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATG hhhhhhhh

SEQ ID NO: 92 E0162_AE72 pNL173

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESG

PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG

SAPGASSTILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGK VDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRN VIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLK FGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNM FCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGK YGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQK LISEEDLSPATGHHHHHHHH

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 182/727

165/203

SEQ ID NO: 93 E0162_AE144 pNL174

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESG

PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSTILDNITQSTQSFN

DFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHC VETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIAL LELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSA LVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHH H.

SEQ ID NO: 94 E0162_AE288 pNL175

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGAPGTSESATPESGPGSEPATSGS

ETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSTILDNIT

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 183/727

166/203

QSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEK WIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAI NKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGR VFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRD SCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVN WIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATG hhhhhhh

SEQ ID NO: 95 D0166_AE72 pNL176

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESAT

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNN MFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMK

GKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAE QKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 96 D0166_AE144 pNL177

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 184/727

167/203

PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSNITQSTQSF

NDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAH CVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA LLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS ALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHH H.

SEQ ID NO: 97 D0166_AE288 pNL178

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGTSESATPESGPGSEPAT

SGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP ASSNIT

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 185/727

168/203

SEQ ID NO: 98 S0174_AE72 pNL179

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSGAPSPAGSPTSTEE

GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGASSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGK VDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRN VIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLK FGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNM FCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGK YGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQK

LISEEDLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 99 S0174_AE144 pNL180

GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSFN

DFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHC VETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIAL LELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSA LVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHH

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 186/727

169/203

Η.

SEQ ID NO: 100 S0174_AE288 pNL181

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSGAPGTSESATPESG

PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA

PASSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWI VTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINK YNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVF HKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSC QGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHH h.hhhhh

SEQ ID NO: 101 E0224_AE72 pNL182

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPSPAGSPT

STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 187/727

170/203

SEGSAPGTSTEPSEGSAPGASSTGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRN

VIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLK FGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNM FCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGK YGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQK

LJSEEDLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 102 E0224_AE144 pNL183

CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK

PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPSPAGSPT

STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP

SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGA

SSTGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIAL LELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSA LVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL

TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHH H.

SEQ ID NO: 103 E0224_AE288 pNL184

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 188/727

171/203

PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGTSESAT

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS

EGSAPASSTGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINK YNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVF HKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSC QGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHH h.hhhhh

SEQ ID NO: 104 K0413_AE72 pNL185

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKGAPSPAGSPTSTE

EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGASSLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQ. KLJSEEDLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 105 K0413_AE144 pNL186

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 189/727

172/203

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKGAPSPAGSPTSTE

EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSL

TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHH H.

SEQ ID NO: 106 K0413_AE288 pNL187

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKGAPGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTST

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 190/727

173/203

EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APASSLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHH h.hhhhh

SEQ ID NO: 107 A0103_AE72 pNL188

CEQFCKNSAGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGASSDNKVV CSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVD

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 191/727

174/203

SEQ ID NO: 108 A0103_AE144 pNL189

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR

CEQFCKNSAGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP

TSTEEGTSTEPSEGSAPGASSDNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAV PFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFN DFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHC VETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIAL LELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSA LVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHH H.

SEQ ID NO: 109 A0103_AE288 pNL190

CEQFCKNSAGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSDNKVVCSCTEGYRLAENQK SCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQ

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 192/727

175/203

STQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWI VTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINK YNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVF HKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSC QGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWI KEKTKLTGPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHH h.hhhhh

SEQ ID NO: 110 G0226_AE42 pNL195

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGGAPGSPA

GSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSVKITVVAGEHNI

EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG PEG PSKLTRAETG agspgaetaeqkliseedlspatghhhhhh.hh

SEQ ID NO: 111 K0228_AE42 pNL196

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKGAPGSP

AGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSITVVAGEHNIE

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 193/727

176/203

ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 112 T0230_AE42 pNL197

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITGAPG

SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 113 N0105_AE42 pNL198

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 194/727

177/203

CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG AGSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 114 S0283_AE42 pNL199

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSGA

PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRAETG A GSPGAETAEQKLISEEPLSPATGHHHHHHHH

SEQ ID NO: 115 CT_AE72 pNL202

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETAL

VPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEESGAGSPGAEY AGAPSPAGSPTSTE

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 195/727

178/203

EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGASSGAETAEQKLJSEEDLSPATGHHHHHHH H.

SEQ ID NO: 116 C-term-AE864 FIX-092

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG PEG PSKLTRA

E7G.SPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 196/727

179/203

TSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSSS

SEQ ID NO: 117 C-Term-AE144 pJH0131

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETAL .K^SFL.LfíNP/ypKYEPF^EDEESGAGSPGAETAGAPSPAGSPTSTE

EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 118 N105-AE42 pJH44

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 197/727

180/203

CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT

CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI

ISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 119 D166-AE72 pJH46

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNN MFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMK GKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 120 D166-AE144 pJH47

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESAT

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

NDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAH CVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 198/727

181/203

LLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS ALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL T

SEQ ID NO: 121 C-Term-AE144 pJH50

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG AGSPGAETAL .K^SFL.LfíNPNpKYEPF^EDEESGAGSPGA.ETAGAPTSTEPSEGSA

PGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 122 C-Term-AE288 pJH51

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 199/727

182/203

ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETAL .K^SFL.LPNPNpKYEPF^EpEESGAGSPGAETAGAPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APASS

SEQ ID NO: 123 C-Term-AE72 pJH52

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TG I ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETAL .K^SFL.LFNPNpKYEPF^EpEESGAGSPGAETAGAPTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 124 E224-AE42 pJH54

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 200/727

183/203

CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 125 D166-AE42 pJH55

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT

CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL

SEQ ID NO: 126 D166-AE42, C-Term-AE72 pJH59

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 201/727

184/203

EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG AGSPG AETALVP/? .SFLLP/yP/VpKYEPFV^^^

SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGAS

SEQ ID NO: 127 D166-AE42, C-Term-AE144 pJH60 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG AGSPG AETALVP/?

.SFLLP/yP/VpKYEPFI^^^ SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 128 D166-AE42, C-Term-AE288 pJH61 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 202/727

185/203

SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTG AGSPG AETALVP/? SFLLP/yP/ypKYEPFI^EpEESGAGSPGAETAGAPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP ASS

SEQ ID NO: 129 D166-AE72, C-Term-AE72 pJH62

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNN MFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMK GKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGAGSPGAETALyPPSFLLPA/P/ypK YEPFWEDEESGAGSPGAETAGAPTSESATPESGPGSEPATSGSETP

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 203/727

186/203

GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS

APGASS

SEQ ID NO: 130 D166-AE72, C-Term-AE144 pJH63 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNN MFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMK GKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGAGSPGAETALyPPSFLLPA/P/ypK

Y^PFlVEpEESGAGSPGAETAGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 131 D166-AE72, C-Term-AE288 pJH64 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 204/727

187/203

NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNN MFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMK GKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGAGSPGAETALyPfíSFLLfíA/P/ypK /^PFlVEpEESGAGSPGAETAGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGS EPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASS

SEQ ID NO: 132 D166-AE144, C-Term-AE72 pJH65 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESAT

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSNITQSTQSF NDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAH

CVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA LLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS ALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGAGSPGAETALVP/?SFLLP/yPNpKYEP/^Ep££SfâAGSPGAETA

GAPTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGASS

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 205/727

188/203

SEQ ID NO: 133 D166-AE144, C-Term-AE144 pJH66 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESAT

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSNITQSTQSF

NDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAH CVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA LLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS

ALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGAGSPGAETALYP/?SFLLP/yPNpKyEP/^Ep££SfâAGSPGAETA

GAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 134 D166-AE144, C-Term-AE288 pJH67 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESAT

NDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAH

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 206/727

189/203

CVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA

LLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS

ALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TGAGSPGAETALyPPSFLLP/yPNpKYEPFW/EpEE^AGSPGAETA

GAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPASS

SEQ ID NO: 135 N105-AE42, D166-AE42 pJH68

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS

GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL

TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPE

SGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPW QVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETE HTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIAD KEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLS TKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWG EECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 136 N105-AE42, D166-AE72 pJH69

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 207/727

190/203

DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS

GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL

TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE

GSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVD AFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVI RIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKF GSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMF CAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKY GIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 137 N105-AE42, D166-AE144 pJH70

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS

GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL

TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSNITQSTQSFNDF

TRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVE TGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLE LDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALV LQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGP HVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 138 N105-AE42, C-Term-AE72 pJH71

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 208/727

191/203

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETALVP/? SFLLP/yP/ypKYEPFW<EpEESGAGSPGAETAGAPTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 139 N105-AE42, C-Term-AE144 pJH72 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETALVP/? .SFLLR/yPNpKYEPFW^^

SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASS

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 209/727

192/203

SEQ ID NO: 140 N105-AE42, C-Term-AE288 pJH73 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG AGSPG AETALVP/?

.SFLLP/yP/VDKYE^^ GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP ASS

SEQ ID NO: 141 N105-AE42, E224-AE42 pJH74

CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSPTS

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 210/727

193/203

TEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIEET

EHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIA DKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLL STKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISW GEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 142 D166-AE42, E224-AE42 pJH75

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSPTST

EEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIEETE

HTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIAD KEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLS TKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWG EECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 143 D166-AE72, E224-AE42 pJH76

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE

PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG

KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATP

ESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRII

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 211/727

194/203

PHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGS GYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCA GFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGI YTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 144 D166-AE144, E224-AE42 pJH77

MEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCK DDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVC SCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDY

VNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGS

PTSTEEGTSTEPSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG

QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSPTS TEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIEET EHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIA DKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLL

STKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISW GEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

SEQ ID NO: 145 E224-AE42, C-Term-AE72 pJH78

TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIE

ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 212/727

195/203

LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETALVPFS

FLLP/yP/ypKYEPFV/EpEE^AGSPGAETAGAPTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 146 E224-AE42, C-Term-AE144 pJH79 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSP

TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW I KEKTKLTG AGSPGAETALVPFS

FLLmPNpKyFPFVKHpEE^AGSPGAETAGAPSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGASS

SEQ ID NO: 147 E224-AE42, C-Term-AE288 pJH80 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVEGAPGSPAGSP

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 213/727

196/203

TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIE

ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WG E ECAM KG KYG I YTKVSRYVNW IKEKTKLTG AGSPG AETALVPRS fLLmPNpKyEPFVK^Pfi^AGSPGAETAGAPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPA SS

SEQ ID NO: 148 N105-AE42, C-Term-Fc pJH81

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNGAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPASSKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKL TRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHN IEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPAPEL

LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 214/727

197/203

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGG.GGSGGGGSGGGGS GGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK

SEQ ID NO: 149 E224-AE42, C-Term-Fc pJH82

TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASSTGVKITVVAGEHNIE

ETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICI ADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCL LSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPAPELL

GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 215/727

198/203

PGK

SEQ ID NO: 150 D166-AE42, C-Term-Fc pJH83

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQ FPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNI EETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPI CIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRAT CLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGI ISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPAPEL

LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGG.GGSGGGGSGGGGS GGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK

SEQ ID NO: 151 D166-AE72, C-Term-Fc pJH84

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 216/727

199/203

CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGAPSPAGSPTSTEEGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNN MFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMK GKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP

PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 152 D166-AE144, C-Term-Fc pJH85

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 217/727

200/203

CVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA LLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS ALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSG GPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL

TDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQ

SEQ ID NO: 153 C-Term-Fc pJH56

MORVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPA

PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 218/727

201/203

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGG.GGSGGGGSGG ggsggggsdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpe VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO: 226 C-Term-AE288 pSYN-FIX-102

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLPHENANKILNRPKRYN SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAK PGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGE HNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV TPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDR ATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFL TGIISWG E ECAM KG KYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTGi PEG P SKL TRA .ETGAGSPGAETAGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHH HHH*

SEQ ID NO: 227 cadeia dupla D166-AE72, C-Term-Fc pSYN-FIX-216

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYN

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 219/727

202/203

SGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDG DQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR CEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQT SKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDGPSPGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGASSNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVD AFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVI RIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKF GSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMF CAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKY

GIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 228 cadeia dupla D166-AE72, C-Term-Fc pSYN-FIX-216Fc parte da cadeia

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 229 rFIXFc-R338L, C-Term Fc

YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYV DGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKN GRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSV

Petição 870190072467, de 29/07/2019, pág. 220/727

203/203

SQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE DAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVV AGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLN SYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPL VDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGT SFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de administração de uma proteína de fusão do Fator IX (FIX) a um indivíduo com sua necessidade, que compreende a administração por via subcutânea a um indivíduo de uma proteína de fusão do FIX, caracterizado pelo fato de que (a) a proteína de fusão do FIX compreende um polipeptideo do FIX e pelo menos um XTEN, que é inserido dentro do polipeptideo do FIX em um sítio de inserção que corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 103 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 142 da SEQ ID NO:
2, aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ IDNO:

2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ IDNO:

2, aminoácido 224 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 226 da SEQ IDNO:

2, aminoácido 228 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 413 da SEQ IDNO:

2, e qualquer combinação dos mesmos, e (b) em que após a administração, a proteína de fusão do FIX apresenta uma atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 30% no indivíduo.

2. Método de administração de uma proteína de fusão do Fator IX (FIX) a um indivíduo com sua necessidade, que compreende a administração por via subcutânea a um indivíduo de uma proteína de fusão do FIX compreendendo um polipeptideo do FIX e um domínio Fc, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 229, em que após a administração, a proteína de fusão do FIX apresenta uma atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 30% no indivíduo.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX é administrada em uma dose de cerca de 50 lU/kg a cerca de 400 lU/kg.

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4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX apresenta um valor máximo de atividade no plasma de cerca de 10% a cerca de 30%.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX apresenta um valor mínino de atividade no plasma de cerca de 5% a cerca de 10%.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 e 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o sítio de inserção corresponde a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácido 149 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 162 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, aminoácido 174 da SEQ ID NO: 2 e qualquer combinação dos mesmos.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 e 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o XTEN compreende pelo menos cerca de 6 aminoácidos, pelo menos cerca de 12 aminoácidos, pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos ou pelo menos cerca de 288 aminoácidos.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 e 3 a 7, caracterizado pelo fato de que o XTEN compreende uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 230, e qualquer combinação dos mesmos.

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9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 8, caracterizado pelo fato de que o XTEN compreende AE72.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX ainda compreende um segundo XTEN, em que o XTEN é inserido dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, e em que o segundo XTEN é fundido com o C-terminal do polipeptídeo do FIX.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 10, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX ainda compreende um domínio Fc.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX ainda compreende um segundo domínio Fc.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX ainda compreende duas cadeias de polipeptídeo, em que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende polipeptídeo do FIX fundido com o domínio Fc, e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende o segundo domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc estão associados por uma ligação covalente.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do FIX é uma variante de FIX R338L.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do FIX compreende uma primeira cadeia e uma segunda cadeia, em que:

(a) a primeira cadeia compreende:

(i) um polipeptídeo do FIX tendo uma mutação 338L;

(ii) opcionalmente um XTEN, em que o XTEN é inserido

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4/4 dentro do polipeptídeo do FIX em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 166 da SEQ ID NO: 2, e em que o XTEN compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos cerca de 72 aminoácidos; e (iii) um primeiro domínio Fc, em que o primeiro domínio Fc é fundido com o polipeptídeo do FIX; e (b) a segunda cadeia compreende um segundo domínio Fc; em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc estão associados por uma ligação covalente.