CN103140237A - 因子ix多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了施用因子IX的方法；施用包含因子IX的嵌合和杂合多肽的方法；包含因子IX的嵌合和杂合多肽；编码此类嵌合和杂合多肽的多核苷酸；包含此类多核苷酸的细胞；以及使用此类细胞产生此类嵌合和杂合多肽的方法。

Description

因子IX多肽及其使用方法
发明领域
本发明总体上涉及用于止血障碍的治疗剂的领域。
背景领域
B型血友病(也称为克雷司马斯病)是世界上最常见的遗传性出血性障碍之一。其导致降低的体内和体外凝血活性并且需要对患病个体终身进行医疗监控。在干预不存的情况下，患病个体遭受关节的自发性出血，这产生严重的疼痛并且使人虚弱不动；出血至肌内导致血液在此类组织的积累；咽喉和颈内的自发性出血，如果未及时治疗，可引起窒息；肾出血；和；和术后、小的意外损伤后或拔牙后的重度出血也是非常普遍的。
正常体内血液凝固最少需要丝氨酸蛋白酶因子II(凝血酶原)、VII、IX、X和XI(可溶性血浆蛋白质)；辅因子，包括跨膜蛋白组织因子和血浆蛋白因子V和VIII；血纤蛋白原、转谷氨酰胺酶因子XIII、磷脂(包括活化的血小板)和钙。包括激肽释放酶、高分子量激肽原和因子XII在内的另外蛋白质是一些体外凝固测试所需要的，并且可在病理状态下在体内起作用。
在血友病中，凝血因某些血浆凝血因子的不存在而受到妨碍。B型血友病由可由因子IX的缺乏(可因因子IX蛋白的减少的合成或具有降低的活性的缺陷分子而导致)引起。血友病的治疗通过利用高度富集因子IX的外源因子浓缩物替代缺少的凝血因子来进行。然而，从血液产生这样的浓缩物充满技术困难，如在下文描述的。
因子IX从血浆(血浆源性因子IX；pdFIX)的纯化几乎仅产生活性因子IX。然而，从血浆纯化这样的因子IX是非常困难的，因为因子IX仅以低浓度存在于血浆中(5ug/mL)。Andersson,ThrombosisResearch7：451459(1975)。此外，从血液的纯化需要除去或灭活传染原例如HIV和HCV。此外，pdFIX具有短半衰期，从而需要频繁给药。重组因子IX(rFIX)也是可获得的，但遭受相同的短半衰期困扰，需要如pdFIX一样频繁给药(例如，2-3次/周，用于预防)。rFIX还具有与pdFIX相比较更低的增量恢复(incremental recovery)(K值)，这使得必需使用比对于pdFIX所使用的剂量更高的剂量的rFIX。
减少的死亡率、关节损伤的预防以及改善的生活质量是归因于血浆源性因子IX和重组因子IX的发展的重要成就。延长的免受出血的保护作用代表了治疗B型血友病患者的另一个关键成就。然而，迄今为止，未曾开发出允许延长的保护作用的产品。因此，仍然存在对治疗因因子IX缺乏而引起的血友病的改进方法的需要，所述改进方法比目前的疗法更具耐受性和更有效。
发明概要
本发明提供了用于使用包含因子IX的嵌合多肽和此类嵌合多肽的杂合体(hybrid)施用因子IX的方法；包含因子IX的嵌合多肽和此类嵌合多肽的杂合体；编码此类嵌合和杂合多肽的多核苷酸；包含此类多核苷酸的细胞；和使用此类细胞产生此类嵌合和杂合多肽的方法。在一些实施方案中，因子IX嵌合多肽为因子IX FcRn结合伴侣(BP)嵌合多肽，例如因子IX Fc嵌合多肽。在其它实施方案中，因子IX嵌合多肽为因子IX-XTEN多肽。
本发明提供了将因子IX施用给需要其的受试者的方法，包括以约每周一次或更长的给药间隔给受试者施用至少约10、至少约20或至少约25IU/kg的剂量的因子IX FcRn BP嵌合多肽，例如因子IX-Fc嵌合多肽或因子IX-XTEN嵌合多肽。
在一些实施方案中，嵌合多肽的血浆水平在至少约6天后在至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%的患者群体中达到至少约1IU/dl的平均波谷(average trough)或在至少约6天后在受试者中达到至少约1、2、3、4或5IU/dl的波谷。在一些实施方案中，所述嵌合多肽的血浆水平达到约1-5或1-3IU/dl的平均波谷。这样的波谷或平均波谷可在约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40天后达到。
在一些实施方案中，嵌合多肽与血浆源性因子IX相比较具有大幅减少的磷酸化和硫酸化。在一些实施方案中，嵌合多肽少于25%被磷酸化并且少于25%被硫酸化，例如，少于25%被完全磷酸化和硫酸化。在一些实施方案中，嵌合多肽少于约10%被磷酸化并且少于约9%被磷酸化。在一些实施方案中，嵌合多肽具有与实施例5-6中因子IX Fc嵌合多肽相似(即，在10%以内)或相同的γ羧基化模式/分布、γ羧基化含量、唾液酸化模式/分布和/或唾液酸化含量。
在一些实施方案中，嵌合多肽具有大于0.7或大于0.75ug/ml(抗原)的增量恢复(incremental recovery)。在一些实施方案中，嵌合多肽具有至少约0.8、至少约0.9或至少约1IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察值)。
在一些实施方案中，嵌合多肽显示所述患者群体或所述受试者的一个或多个药代动力学参数，其选自：
(a)约3.36±0.93mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；约3.0-3.72、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7或3.72mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；比包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的清除率低约2.5倍的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；约1.84-4.58mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
(b)至少约68.05±11.16小时的所述患者群体的平均平均停留时间(MRT)(活性)；约60-78、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78小时的所述患者群体的平均MRT(活性)；为包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均MRT的约3倍长的所述患者群体的平均MRT(活性)；约53.1-85.8小时的所述受试者的平均停留时间(MRT)(活性)；至少约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90小时的所述受试者的平均停留时间(MRT)(活性)；
(c)约52.5±9.2小时的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；为约47-60小时、约47、约48、约49、约50、约51平均t1/2β(活性)、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60小时的所述患者群体；为包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均t1/2β的约3倍长的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；约40-67.4、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70或约75小时的所述受试者的1/2β(活性)；
(d)约0.93±0.18IU/dL每IU/kg的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；约0.85-1.0、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99、约1.0、约1.05、约1.10或约1.15IU/dL每IU/kg的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；比包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均增量恢复高约24%的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；约0.62-1.17IU/dL每IU/kg的所述受试者的增量恢复(K值)(活性；观察值)；
(e)约226±67.76(校正至69.8)mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；约200-300、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；约145-365mL/kg的所述受试者的Vss(活性)；
(f)约32.44±10.75IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体的平均AUC/剂量(活性)；约26-40、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体的平均AUC/剂量(活性)；约21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg的所述受试者的AUC/剂量。
在一些实施方案中，嵌合多肽的剂量包含比目前市售的因子IX产品例如MONONINETM(pdFIX；CSL Behring))或BENEFIXTM(Wyeth；rFIX)(0.1%)显著更低(低10-100倍)的水平(0.01-0.001%)的激活的FIX(FIXa)。这样的水平可以比目前市售的产品低10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍，或者为目前市售的产品的0.01%、0.05%、0.0033%、0.0025%、0.002%、0.00167%、0.00142%、0.00125%、0.00111%或0.001%。
在一些实施方案中，给药间隔为6-18、6-10、9-18、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18天、每周1次、每月2次或每月1次。给药间隔可以预防性给药间隔、固定的预防性给药间隔或个体化化预防性给药间隔。
对需要控制或预防出血或出血事件、需要间歇治疗、需要预防性治疗或需要按需治疗的受试者实施本发明的方法。
可用于本发明的方法的治疗性剂量为约25-180、约20-180、约20-50、约20-100、约10-180、约10-50、约10-30或约50-100IU/kg。剂量可以是固定剂量或个体化剂量。
在一些实施方案中，静脉内或皮下施用嵌合多肽。
本发明的方法的受试者可以为人受试者或可以为非人哺乳动物。非人哺乳动物包括小鼠、狗、灵长类动物、猴、猫、马、牛、猪和其它家养动物和小动物。
嵌合多肽可以以包含与所述嵌合多肽缔合的第二多肽的杂合体，其中所述第二多肽包含FcRn BP例如Fc或基本上由其组成。嵌合多肽可与表2A(SEQ ID NO:2)和/或2B(SEQ ID NO:4)中的具有或不具有信号序列和前肽的因子IX序列、Fc序列或因子IX和Fc序列两者具有至少90%、至少95%或100%的同一性。
可将嵌合多肽或杂合体作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分施用。
本发明还提供了上述嵌合和杂合多肽本身、编码它们的多核苷酸、包含所述多核苷酸的培养的人胚胎细胞以及产生此类嵌合和杂合多肽的方法以及此此类方法产生的多肽。
附图简述
图1.因子IX嵌合多肽的一种类型，因子IX-Fc杂合体的示意图。
图2.组平均FIXFc浓度对时间的曲线；标称剂量比较。
图3.组平均FIXFc活性对时间的曲线：标称剂量比较。
图4.基线扣除决策数(baseline subtraction decision tree)。
图5.FIX活性的Cmax和AUC的剂量比例增加。
图6.50(A)和100(B)IU/kg的rFIXFc的估计的治疗持续时间。
图7.FIX抗原的Cmax和AUC的剂量比例增加。
图8.50(A)和100(B)IU/kg标称剂量的rFIXFc抗原的药代动力学评估。
图9.rFIXFc活性与抗原水平之间的优良关联性。注意，归因于活性PK的重新计算，如实施例11中论述的，R2=0.946。
图10.rFIX-Fc结构域结构和翻译后修饰。PRO：通过加工酶切割的多肽。GLA：包含12个γ-羧基化谷氨酸(Gla)残基。ACT PEP：经切割以产生活性蛋白酶的激活肽。其它修饰：N-和O-糖基化，Asp(64)β-羟基化，Tyr硫酸化，Ser磷酸化。
图11.纯化中间产物和纯化的FIXFc单体的SDS-PAGE凝胶。通过非还原性SDS-PAGE分析来自FIXFc的纯化的不同步骤的样品。泳道1：SeeBlue+分子量标准参照物(Molecular WeightMarkers)(Invitrogen)。泳道2：空泳道。泳道3：蛋白A加载。泳道4：蛋白A洗脱物。泳道5：Fractogel DEAE洗脱物。泳道6：Q Seph FF洗脱物。泳道7：最终本体FIXFc.泳道8：空泳道。泳道9：最终本体减小的FIXFc。
图12.FIX-缺陷型小鼠的FIXFc的功能活性。在时间=0时，利用219IU/kg FIXFc给FIX-缺陷型小鼠静脉内给药(3或4只/组，6组，n=23)或200IU/kgrFIX(3或4只/组，5组，n=23)。在给药后不同时间点上(0.25小时至96小时)收集血液样品，使用FIX活性测定分析凝血活性。*rFIX活性在晚于给药后48小时的时间点上在所有小鼠中都是不可检测的。
图13.FIX-缺陷型小鼠的FIXFc对重组FIX的全血凝固时间。利用50IU/kgFIXFc或50IU/kgrFIX给FIX-缺陷型小鼠(6只/组)静脉内给药。在给药之前和在给药后不同时间上收集血液样品。将血液样品在37℃下温育，每分钟1次目测其血块的存在。记录血块形成所需的时间，一旦凝血活性回复至基线(即无血块形成)，不再获取另外的样品(对于FIXFc在15分钟至144小时收集样品，或对于rFIX在15分钟至72小时收集样品)。
图14.FIX-缺陷型小鼠的FIXFc的药代动力学。在第0、4和8天给FIX-缺陷型小鼠施用219IU/kg FIXFc(5只/组，6组，n=30)或200IU/kgrFIX(4或5只/组，6组，n=28)。在每一次给药后15分钟和96小时通过心脏穿刺收集血浆样品，并且使用FIX活性测定测量凝血活性。在每一次给药后第8、24、48和72小时通过尾部放血(tailbleed)收集血浆。使用对于FIXFc是特异性的ELISA测量所有样品的FIXFc水平。(A)测量的活性对计算的活性。在3次剂量后15分钟和96小时使用FIX活性测定测量FIXFc的凝血活性。FIXFc的体外凝血活性被测定为43.8±5.4IU/mg。基于该活性(IU/mg)和测量的蛋白质水平，测定每一次给药后15分钟、8、24、48、72和96小时的时间点的计算的血浆凝血活性水平。(B)在利用最多3个剂量的200IU/kg rFIX处理的FIX-缺陷型小鼠中，使用FIX-特异性ELISA测量FIX水平。通过使用测量的FIXFc和rFIX的特异性活性，可能比较利用ELISA分析的所有样品的计算的凝血活性。
图15.FIX缺陷型狗的FIXFc的药代动力学和药效动力学。给两只患有B型血友病的狗静脉内输注140IU/kg FIXFc。在5、15和30分钟和在1、2、4、6、8、12、24、27、30、48、51、54、72、80、96、126、144和168小时收集血液样品。(A)将利用FIX捕获抗体和Fc-HRP检测抗体的夹心ELISA用于测量B型血友病狗的血浆样品的完整FIXFc的浓度。(B)根据利用FIXFc产生的校准曲线测量所有时间点上的FIX凝血活性。(C)立即分析从动物收集的血液的全血凝血时间。将血液样品在28℃温育，每分钟1次目测其血块的存在，记录其中血块形成的时间。
图16.食蟹猴的FIXFc的药代动力学。给猴子施用单次剂量(0.5、2和10mg/kg，相应于约25、100或500IU/kg的)的FIXFc(分别地n=2、3和3)。在给药后0.25、0.5、1、8、24、48、72、96、120、144和168小时收集血液样品，并且制备血浆以用于通过FIXFc-特异性ELISA分析蛋白质浓度。
图17.rFIXF和BENEFIXTM显示来自HemB小鼠的全血的可比较活性和剂量反应。(A)
Figure BDA00002795106000081
参数。将rFIX或BENEFIXTM掺入HemB小鼠血液，并且利用
Figure BDA00002795106000082
测量凝血参数。(B)-(D)剂量反应，测量(B)CT、(C)CFT和(D)α-角。
图18.血友病小鼠的断尾出血模型(tail clip bleeding model)的急性疗效的评估。
图19.(A)利用rFIXFc或BENEFIXTM处理的个体HemB小鼠的断尾后的失血。(B)在HemB小鼠的断尾后中值失血的rFIXFc和BENEFIXTM的剂量反应。
图20.HemB小鼠的尾静脉横断(TVT)出血模型：重度血友病患者的静脉出血特征的模型。
图21.利用全血
Figure BDA00002795106000091
处理的HemB小鼠的rFIXFc相对于BENEFIXTM的延长的活性。(A)CT、(B)CFT、(C)α-角、和(D)
Figure BDA00002795106000092
产生的全血凝血活性(CT)对aPTT产生的血浆活性之间的部分关联性。
图22.HemB小鼠的静脉横断(TVT)出血模型的rFIXFc相对于BENEFIXTM的延长的疗效。(A)存活率：接受BENEFIXTM24小时TVT前体(pre TVT)的小鼠的存活率与接受rFIXFc72小时TVT前体的小鼠的相当，和(B)再出血：接受BENEFIXTM24小时TVT前体的小鼠的出血率与接受rFIXFc72小时TVT前体的小鼠的相当。
图23.接受12.5至100IU/kg的rFIXFc的单次剂量的12个受试者的rFIXFc活性的增量恢复对体重的关联性。
图24.使用rFIXFc活性的结构PK模型构建活性-时间曲线以在每周1次(A)、每10天1次(B)或每2周1次的给药方案(C)后获得高于基线1IU/dL的波谷的蒙特卡罗模拟。中值群体PK参数和相关受试者间和受试者内差异性取自临床1/2a期研究。每给药方案模拟1000个受试者，每一个受试者采用14至16个采样点，并且图解地构建不同给药方案的1000个受试者的活性-时间曲线的平均值±SD。
图25.基于重新计算的药代动力学数据，rFIXFc剂量获得1IU/dL(1%)的波谷的蒙特卡罗模拟。(A)每周1次，(B)每10天1次，和(C)每2周1次。
发明详述
本发明提供了利用因子IX使用比利用目前已知的因子IX产品可能获得的更长的给药间隔和/或改善的药代动力学参数治疗因子IX缺陷例如B型血友病的方法。本发明还提供了改进的因子IX嵌合多肽、因子IX嵌合多核苷酸和产生方法。
如本文中所用，“施用”意指通过药学上可接受的途径给受试者提供本发明的药学上可接受的因子IX多肽。施用的优选途径为静脉内途径，例如静脉内注射和静脉内输注，例如通过中央静脉进入。其它施用途径包括皮下、肌内、口服、经鼻和经肺施用，优选皮下施用。因子IX嵌合多肽和杂合蛋白质可作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分来进行施用。本发明的有利方面包括：改善的方案顺从性；减少的穿透性出血(break through bleed)；增加的保护关节免受出血的作用；关节损伤的预防；减少的发病率；减少的死亡率；延长的保护免受出血的作用；减少的血栓形成事件；和改善的生活质量。
如本文中所用，“嵌合多肽”意指在其内包含至少两个来自不同来源的多肽(或其部分例如子序列或肽)的多肽。嵌合多肽可包括2、3、4、5、6、7或更多个来自不同来源(例如不同基因、不同cDNA或不同动物或其它物种)的多肽或其部分。嵌合多肽可包括一个或多个连接不同多肽或其部分的接头。因此，多肽或其部分可被直接连接，或它们可通过接头间接连接或通过两者连接在单个嵌合多肽内。嵌合多肽可包括帮助蛋白质纯化或检测的另外的肽例如信号序列和序列例如6His和FLAG。此外，嵌合多肽可具有至N和/或C末端的氨基酸或肽添加。本发明的示例性嵌合多肽为因子IX-FcRn BP嵌合多肽，例如因子IX-Fc嵌合多肽，例如图1(SEQ ID NO:2(表2))和实施例1-4中的具有或不具有其信号序列或前肽的FIXFc。本发明的另一个示例性嵌合多肽包括但不限于因子IX-XTEN嵌合多肽。可将因子IX融合至XTEN的N末端或C末端。
嵌合多肽可包含序列，所述序列与因子IX和FcRn BP，例如表2A中显示的不具有信号序列和前肽序列的Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至642)，或可选择地具有前肽序列，或可选择地具有信号序列和前肽序列的Fc氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性。
如本文中所用，“培养”、“为培养”和“培育(culturing)”意指在体外条件下温育细胞，所述体外条件允许细胞生长或分裂或维持细胞的存活状态。如本文所用，“培养的细胞”意指在体外增殖的细胞。
如本文中所用，“因子IX”和“FIX”，除非另外指出，否则意指在凝血中具有其正常作用的功能性因子IX多肽。因此，术语因子IX包括具有功能的变体多肽(variant polypeptide)和编码此类功能性变体多肽的多核苷酸。优选因子IX多肽为人、牛科动物、猪科动物、科动物犬、猫科动物和鼠科动物因子IX多肽。因子IX的全长多肽和多核苷酸序列是已知的，同样地许多功能变体例如片段、突变体和修饰形式的全长序列和多核苷酸序列也是知的。因子IX多肽包括全长因子IX、在N末端除去Met的全长因子IX、除去信号序列的全长因子IX、成熟因子IX(除去信号序列和前肽)和在N末端具有额外Me的成熟因子IX。因子IX优选通过重组方法(“重组因子IX”或“rFIX”)制备，即其不是天然存在的或来源于血浆。
许多功能性因子IX变体是已知的。国际公布号WO02/040544A3(将其通过引用整体并入本文)在第4页第9-30行和第15页第6-31行公开了显示增加的对肝素导致的抑制的抗性的突变体。国际公布号WO03/020764A2(将其通过引用整体并入本文)在表2和3(在第14-24行)和在第12页第1-27行公开了具有减少的T细胞免疫原性的因子IX突变体。国际公布号WO2007/149406A2(将其通过引用整体并入本文)在第4页第1行至第19页第11行公开了显示增加的蛋白质稳定性、增加的体内和体外半衰期以及增加的对蛋白酶的抗性的功能性突变型因子IX分子。WO2007/149406A2还在第19页第12行至第20页第9行公开了嵌合和其它变体因子IX分子。国际公布号WO08/118507A2(将其通过引用整体并入本文)在第5页第14行至第6页第5行公开了显示增加的凝血活性的因子IX突变体。国际公布号WO09/051717A2(将其通过引用整体并入本文)在第9页第11行至第20页第2行公开了具有增加的N联接的和/或O联接的糖基化位点的数目的因子IX突变体，所述增加的糖基化位点导致增加的半衰期和/或回收率。国际公布号WO09/137254A2(将其通过引用整体并入本文)还在第2页段落[006]至第5页段落[011]和第16页段落[044]至第24页段落[057]公开了具有增加的糖基化位点数目的因子IX突变体。国际公布号WO09/130198A2(将其通过引用整体并入本文)在第4页第26行至第12页第6行公开了具有增加的糖基化位点的功能性突变型因子IX分子，所述增加的糖基化位点导致增加的半衰期。国际公布号WO09/140015A2(将其通过引用整体并入本文)在第11页段落[0043]至第13页段落[0053]公开了具有增加的Cys残基的数目的功能性因子IX突变体，所述Cys残基可用于聚合物(例如，PEG)缀合。
此外，已在血友病患者中鉴定了因子IX的数百个非功能性突变，许多所述突变公开于国际公布号WO09/137254A2(将其通过引用并入本文)的第11-14页的表1中。此类非功能性突变不包括在本发明中，但提供了另外的指导，根据所述指导突变或多或少可能导致功能性因子IX多肽。
因子IX(或嵌合多肽的因子IX部分)可与表2A中显示的不具有信号序列和前肽序列的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至415)或可选择地，具有前肽序列或具有前肽和信号序列(全长因子IX)的因子IX氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性。
因子IX促凝剂活性表示为国际单位(IU)。一个IU的因子IX活性大致相应于一毫升正常人血浆中的因子IX的量。用于测量因子IX活性的几个测定是可获得的，包括一期凝血测定(one stage clottingassay)(激活的部分促凝血酶原时间；aPTT)、凝血酶生成时间(TGA)和旋转血栓弹力图(rotational thromboelastometry)
Figure BDA00002795106000131
参见，例如实施例3。
如本文中所用，“FcRn结合伴侣”或“FcRn BP”除非另外明确地指出，否则意指功能性新生儿Fc受体(FcRn)结合伴侣。FcRn结合伴侣是可被FcRn受体特异性结合，随后被FcRn结合伴侣的FcRn受体主动运输的任何分子。因此，术语FcRn BP包括具有功能性的IgG Fc的任何变体。例如，已基于X射线晶体学(Burmeister等人1994,Nature372:379,通过引用整体并入本文)描述了结合FcRn受体的IgG的Fc部分的区域。Fc与FcRn的主要接触区域位于CH2与CH3结构域的接合处附近。Fc-FcRn接触全部在单个Ig重链内。FcRn BP包括完整的IgG、IgG的Fc片段和IgG的包括FcRn的完整结合区域的其它片段。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。参考免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号，其全都基于Kabat等人1991,免疫学目标蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),美国公共卫生部(U.S.Department of Public Health,Bethesda)；MD(将其通过引用整体并入本文)。(已从几种哺乳动物物种包括人分离了FcRn受体。人FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人1994,J.Exp.Med.180：2377),通过引用整体并入本文)。FcRn BP可包括具有或不具有免疫球蛋白的铰链区的免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。示例性FcRn BP变体提供于WO2004/101740和WO2006/074199(将其通过引用整体并入本文)中。
FcRn BP还包括白蛋白及其结合FcRn的片段。优选地，白蛋白为人白蛋白。因子IX可融合至白蛋白的N末端或白蛋白的C末端，只要因子IX-白蛋白融合蛋白的因子IX组分可被具有酶促活性的前蛋白转化酶加工以产生包含加工的因子IX的多肽即可。可用于本发明的白蛋白的实例例如其片段是已知的。例如，美国专利No.7,592,010；美国专利No.6,686,179；和Schulte,Thrombosis Res.124副刊2:S6-S8(2009)，将所述专利和文献的每一个通过引用整体并入本文。
FcRn BP(或嵌合多肽的FcRn BP部分)可包含一个或多个突变以及突变的组合。
FcRn BP(或嵌合多肽的FcRn BP部分)可包含赋予增加的半衰期的突变体，例如M252Y、S254T、T256E及其组合，如Oganesyan等人,Mol.Immunol.46:1750(2009)(将其通过引用整体并入本文)中所公开的；H433K、N434F及其组合，如Vaccaro等人,Nat.Biotechnol.23:1283(2005)(将其通过引用整体并入本文)中所公开的；U.S.2009/0264627A1(将其通过引用整体并入本文)的第1-2页段落[0012]以及实施例9和10中公开的突变体；和U.S.20090163699A1(将其通过引用整体并入本文)的第2页段落[0014]至[0021]中公开的突变体。
FcRn BP(或嵌合多肽的FcRn BP部分)还可包括下列突变：可按照公认的方法例如定向诱变等修饰IgG的Fc区域以产生可被FcRn结合的修饰IgG或其Fc片段或部分。此类修饰包括远离FcRn接触位点的修饰以及在接触位点内的保持或甚至增强对FcRn的结合的修饰。例如，可置换人IgG1Fc(Fcy1)的下列单个氨基酸残基而无Fc对于FcRn的结合亲和力的显著丢失：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A代表在位置编号238上野生型脯氨酸被丙氨酸置换。除了丙氨酸外，其它氨基酸也可置换上述位置上的野生型氨基酸。可将突变单个地引入Fc，从而产生超过100种与天然Fc不同的FcRn结合伴侣。此外，此类单个突变的2、3或更多个的组合可被一起引入，从而产生超过数百种FcRn结合伴侣。此类突变中的某些可赋予FcRn结合伴侣新的功能性。例如，一个实施方案包括N297A，除去了高度保守的N糖基化位点。该突变的作用是减小免疫原性，从而增强FcRn结合伴侣的循环半衰期，并且使得FcRn结合伴侣不能结合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA，但不削弱对于FcRn的亲和力(Routledge等人1995,Transplantation60:847，将其通过引用整体并入本文；Friend等人1999,Transplantation68:1632，将其通过引用整体并入本文；Shields等人1995,J.Biol.Chem.276:6591，将其通过引用整体并入本文)。此外，至少3种人Fcγ受体似乎识别IgG上更低的铰链区(通常氨基酸243-237)内的结合位点。因此，具有新功能性和潜在减小的免疫原性的另一个实例可产生自该区域的突变，如例如通过将人IgG1“″ELLG”的氨基酸233-236替换成来自IgG2“PVA”的相应序列(具有一个氨基酸缺失)。已显示，当引入此类突变时，介导不同效应子功能的FcyRI、FcyRII和FcyRIII将不结合IgG1(Ward和Ghetie1995,Therapeutic Immunology2:77，将其通过引用整体并入本文；和Armour等人1999,Eur.J.Immunol.29:2613，将其通过引用整体并入本文)。作为从上述突变产生的新功能性的另一个实例，对于FcRn的亲和力在一些情况下可被增加至超过野生型的所述亲和力。该增加的亲和力可反映在增加的“结合”率(“on””rate)、减小的“解离”率(“off”rate)或增加的“结合率”和减小的“解离”率。据信赋予增加的对于FcRn的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人2001,J.Biol.Chem.276:6591，将其通过引用整体并入本文)。
FcRn BP(或嵌合多肽的FcRn BP部分)可与表2A或2B中显示的不具有信号序列的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至227)或可选择地，具有信号序列的Fc氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性。
“杂合”多肽和蛋白质，如本文中所用，意指嵌合多肽与第二多肽的组合。杂合体中的嵌合多肽和第二多肽彼此通过非共价蛋白质间相互作用例如电荷-电荷或疏水相互作用缔合。杂合体中的嵌合多肽和第二多肽可通过共价键例如二硫键彼此缔合。嵌合肽与第二肽可通过超过一种类型的键例如非共价键和二硫键彼此缔合。杂合体描述于WO2004/101740、WO2005/001025、美国专利No.7,404,956、美国专利No.7,348,004和WO2006/074199中，将所述申请和专利中的每一个通过引用整体并入本文。第二多肽可以是相同嵌合多肽的第二拷贝，或其可以是非完全相同的嵌合多肽。在优选实施方案中，第二多肽为包含FcRn BP例如Fc的多肽。在优选实施方案中，嵌合多肽为因子IX-FcRn BP，例如因子IX-Fc嵌合多肽，并且第二多肽基本上由Fc组成。参见，例如，图1实施例1-3和表2(SEQ ID NO:2和4)。参见例如，US7404956，将其通过引用整体并入本文。
杂合体中的第二多肽可包含与表2B中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)或可选择地，具有信号序列的氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性的序列或基本上由所述序列组成。
本发明的多肽还包括融合至一个或多个XTEN多肽的因子IX。Schellenburger等人,Nat.Biotech.27:1186-90(2009)，将其通过引用整体并入本文。可将因子IX融合至XTEN多肽的N末端或融合至XTEN多肽的C末端。XTEN多肽包括但不限于WO2009/023270、WO2010/091122、WO2007/103515、US2010/0189682和US2009/0092582中公开的多肽，将所述申请中的每一个通过引用整体并入本文。
如本文中所用，“给药间隔”意指给受试者施用的多个剂量之间经历的时间的量。使用嵌合FIX-FcRn BP例如嵌合FIX-Fc的本发明方法的给药间隔可以为等量的(以IU/kg计)不具有FcRn BP例如Fc部分的所述因子IX(即，由所述FIX组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5至8倍。当施用例如本发明的因子IX-Fc嵌合多肽(或杂合体)时，给药间隔可以为等量的不具有FcRn BP例如Fc部分的所述因子IX(即，由所述FIX组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5倍。给药间隔可以为等量的不具有例如Fc部分的所述因子IX(即，由所述FIX组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5倍至8倍。
在一些实施方案中，给药间隔为6-18、6-10、9-18、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18天。给药间隔可以为至少约每周1次，可以为6-10天，例如约7-10、约7-9、约7-8、约8-10、约9-10、约6-7、约8-9、约6、约7、约8、约9或约10天。
给药间隔可以为9-18天，例如约9-17、约9-16、约9-15、约9-14、约9-13、约9-12、约9-11、约9-10天、约10-18、约11-18、约12-18、约13-18、约14-18、约15-18、约16-18、约17-18天、约10-11、约11-12、约12-13、约13-14、约14-15、约15-16和约16-17天、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17或约18天，给药间隔可以为约10-14天。给药间隔可以为约每2周1次或每月2次。给药间隔可以长于18天，例如，约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40天。给药间隔可以为固定的间隔，例如7天(对于25-50IU/kg)、10-13天(对于50-100IU/kg)或14天(对于100-150IU/kg)。确定固定间隔和剂量以便间隔和剂量的组合可在受试者群体中或在单个受试者中导致至少约1-5或至少约1-3或至少约1、至少约2或至少约3IU/dl FIX的活性的波谷。固定给药间隔也可以为7天(对于20-50IU/kg)、10-14天(对于50-100IU/kg)、14-16天(对于100-150IU/kg)、7天(对于10-50IU/kg)、10-13天(对于15-100IU/kg)或14-15天(对于50-150IU/kg)。固定给药间隔还可以为7天(对于10-30IU/kg)、10天(对于15-50IU/kg)、11天(对于20-70IU/kg)、12天(对于25-85IU/kg)、13天(对于30至100IU/kg)、14天(对于40至125IU/kg)和15天(对于50–150IU/kg)。
在优选实施方案中，给药间隔为每周1次20IU/kg，每10天1次40IU/kg或每2周1次100IU/kg(每月2次)。
给药间隔可以可选择地为基于关于该受试者的药代动力学数据或其它信息针对每一个个体确定的个体化间隔。个体化剂量/给药间隔组合可以与上述段落中的固定间隔方案的所述组合相同或可以不同，如实施例中举例说明的。方案初期可以为固定给药间隔，随后其可改变成个体化给药间隔。
如本文中所用，“按需治疗”意指意欲在短时间过程中发生并且响应目前病况例如出血事件或感觉到的短期需要例如计划的手术的治疗。可需要按需治疗的病况包括出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血、出血至肌内、口腔出血(oral hemorrhage)、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内出血、腹腔内出血、胸内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘(illiopsoassheath)出血。还包括除此类出血事件外的出血事件。受试者可需要手术预防、围手术期管理或手术治疗。此类手术包括小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、其它牙手术/胸面部手术(thoraco-facial surgery)、腹股沟疝切开手术、滑膜切除术、全膝置换术、其它关节置换术、穿颅术、骨接合术、创伤手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术。还可包括除此类手术外的手术。可需要按需治疗的另外的病况包括表26中所列的病况。
可需要按需治疗的另外的病况包括少量出血、关节积血、表浅肌肉出血、软组织出血、中度出血、解剖造成的肌内或软组织出血(intramuscle or soft tissue hemorrhage with dissection)、粘膜出血、血尿、大出血、咽出血、咽后部出血、腹膜后腔出血、中枢神经系统出血、瘀伤(bruises)、切伤、刮擦、关节出血、鼻出血、口出血(mouth bleed)、牙龈出血、颅内出血、腹膜内出血、少量自发性出血、重度创伤后出血、中度皮肤擦伤或至关节、肌肉、内脏器官或脑的自发性出血。按需治疗的其它原因包括对手术的围手术期管理或拔牙、大手术、广泛的口腔手术、泌尿外壳手术、疝气手术、矫形手术例如膝、髋或其它大关节的置换的需要。
缩写：
AUCINF    从0至无穷大的浓度-时间曲线下面积
AUCα     分布期范围内的浓度-曲线下面积
AUCβ     消除期范围内的浓度-时间曲线下面积
ΑHL      分布期半衰期
ΒHL      消除期半衰期；也称为t1/2
C168      在给药后约168小时高于基线的估计的FIXFc活性
Cmax      在Tmax时存在的最大浓度
CV%       变异系数%(Percent coefficient of variation)
Cl        清除率
IVR       体内恢复(%)
K-值       增量恢复
MRT        平均停留时间
N          编号
NC         不可计算的
NR         未报道的
SD         标准误差
SE         标准误差
TBLP1      当FIXFc活性已降至高于基线约1IU/dL时模型预测的给药后时间
TBLP3      当FIXFc活性已降至高于基线约3IU/dL时的模型预测的给药后时间
TBLP5      当FIXFc活性已降至高于基线约5IU/dL时模型预测的给药后时间
VSS        处于稳态的分布体积
V1         中央腔隙的分布体积
药代动力学(PK)参数包括上述术语和下列术语，除非另外指出，否则所述术语具有其在本领域内的通常含义。一些术语在实施例中更详细地解释。PK参数可基于FIX抗原水平(顺便插一句，在本文中通常表示为“抗原”)或FIX活性水平(顺便插一句，在本文中通常表示为“活性”)。在文献中，PK参数通常基于因内源性、无活性的FIX在一些患者的血浆中的存在而产生的FIX活性水平，这干扰了使用抗FIX抗体测量施用的(即，外源性)FIX的能力。然而，当将FIX作为包含异源多肽例如FcRn BP的融合蛋白质的部分施用时，施用的(即，外源性)FIX抗原可使用针对异源多肽的抗体来精确地测量。此外，某些PK参数可基于模型预测的数据(顺便插一句，通常在本文中表示为“模型预测的”)或基于观察到的数据(顺便插一句，通常在本文中表示为“观察到的”)，并且优选基于观察到的数据。
如本文中所用，“基线”在施用剂量之前受试者的最低的测量的血浆因子IX水平。在实施例1中描述的首次应用于人体的研究(first-in-human study)中，在给药前的两个时间点上因子IX的血浆水平：在筛选随访时和即将给药前。为了计算，给药前时间处理为0(基线)，即以产生“扣除基线的”数据。参见，例如，图4。或者，(a)其治疗前FIX活性小于1%，不具有可检测的FIX抗原以及具有无义基因型(nonsense genotype)的患者的基线被确定为0%，(b)治疗前FIX活性小于1%并且具有可检测的FIX抗原的患者的基线设置为0.5%，(c)其治疗前FIX活性为1-2%的患者的基线为Cmin(在整个PK研究中最低的活性)，和(d)其治疗前FIX活性大于等于2%的患者的基线为2%。高于给药前基线的活性被认为是来自先前治疗的残留药物，并且可衰退至基线，在rFIXFc给药后将其从PK数据扣除。参见实施例11。
“血浆浓度对时间曲线下面积”(“AUC”)，如本文中所用，其基于施用后因子IX的消除的速度和程度。基于曲线的斜率使用外推法测定在指定的时期例如12、18、24、36、48或72小时或无穷大的范围内的AUC。除非在本文中另外明确地指出，否则测定无穷大范围的AUC(AUCINF)。还可在每剂的基础上计算AUC。与许多其它PK参数一样，可在单个受试者中或在针对其计算平均值的受试者的群体中进行AUC的测定。在实施例1中，患者群体的平均AUC/剂量为32.44IU*h/dL每IU/kg，并且个体受试者的范围为21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg。(关于基于活性的平均AUC/剂量，参见表13)。因此，患者群体的平均AUC/剂量可为约26-40、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40IU*h/dL每IU/kg。关于AUC/剂量和基于抗原的其它AUC参数，参见表14。
“体内恢复”(“IVR”)表示为增量恢复(K-值)，这为扣除给药前水平的观察到的峰值活性，随后将其除以剂量。还可基于百分比计算IVR，如在实施例中所描述的。为了清楚起见，在本文中使用单位(K值或IU/dl每IU/kg对%)。可测定患者群体的平均IVR或可测定单个受试者的单独的IVR。实施例1中描述的首次应用于人体的研究中使用的FIXFc显示患者群体的约0.93IU/dl每IU/kg的平均IVR；和在0.62至1.17IU/dl每IU/kg(表13)的范围内的每一个受试者的IVR。因此，本发明的嵌合多肽显示0.85-1.15(例如，约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99、约1.0、约1.05、约1.10、约1.15)的患者群体的平均IVR以及至少约0.6、约0.7,0.8、约0.9、约1.0、约1.1或约1.2IU/dl每IU/kg的受试者的IVR。
如本文中所用，“清除率”(“CL”)是身体消除药物的能力的量度，表示为在一段时间内清除了药物的血浆的体积。实施例1中描述的研究中使用的FIXFc显示约3.36mL/hr/kg的平均CL(参见表13)，其比由因子IX(BENEFIXTM)组成的多肽的CL(8.2mL/hr/kg)低约2.5倍；个体受试者的CL值的范围为1.84-4.58ml/h/kg。因此，本发明的嵌合多肽显示3.0-3.72、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7或3.72mL/hr/kg的群体的平均CL。关于基于抗原的CL，参见表14。
如本文中所用，“平均停留时间”(“MRT”)为药物分子在体内的平均寿命的量度。实施例中描述的研究中使用的FIXFc显示约68.05小时的平均MRT(参见表13)；在个体受试者中，MRT值的范围为53.1-85.8小时。因此，本发明的嵌合多肽在群体中显示60-78、约60、约62、约64、约66、约68、约70、约72、约74、约76或约78小时的平均MRT和至少约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90小时的受试者的MRT。关于基于抗原的MRT，参见表14。
如本文中所用，“t1/2β”或“t1/2β”或“βHL”是与消除期相关的半衰期，t1/2β=(ln2)/与终末期相关的消除速率常数。在实施例1中描述的研究中，使用的FIXFc显示为约52.5小时的患者群体的平均t1/2z(参见表13)并且个体受试者的t1/2β值的范围为47-60小时。因此，本发明的嵌合多肽显示大于约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59或约60小时的平均t1/2β。关于基于抗原的t1/2β，参见表14。
如本文中所用，“波谷”，为在施用本发明的嵌合多肽或另一种因子IX分子的剂量后并且在施用下一个剂量(如果有的话)之前达到的最低血浆IX活性水平。波谷在本文中可与“阈值”互换使用。从测量的因子IX水平扣除基线因子IX水平以计算波谷水平。在一些实施方案中，波谷在6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13或约14天后为1-5或1-3IU/dl。在一些实施方案中，嵌合多肽的血浆水平在至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%的患者群体中在至少约6天后达到至少约1IU/dl的平均波谷或在受试者中在至少约6天后达到至少约1、2、3、4或5IU/dl的波谷。在一些实施方案中，所述嵌合多肽的血浆水平达到约1-5或1-3IU/dl的平均波谷。这样的波谷或平均波谷可在约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40天后达到。
如本文中所用，“处于稳态的分布体积(Vss)”是药物已分布至其中的表观空间(apparent space)(体积)。Vss=体内的药物的量除以稳态时的血浆浓度。在实施例1中，群体中发现的平均Vss为约226mL/kg并且受试者的范围为约145-365mL/kg。(参见表13)。因此，患者群体的平均Vss可以为200-300、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300mL/kg。个体受试者的Vss可以为约145、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290、约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360或约370ml/kg。关于基于抗原的Vss，参见表14。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指由共价地联接的氨基酸残基组成的多聚化合物。
“多核苷酸”和“核酸”可互换使用并且是指由共价联接的核苷酸残基组成的多聚化合物。多核苷酸可以为DNA、cDNA、RNA、单链或双链的、载体、质粒、噬菌体或病毒。多核苷酸包括表1中的多核苷酸，其编码表2的多肽(参见表1)。多核苷酸还可包括表1的多核苷酸的片段，例如编码表2的多肽的片段例如因子IX、Fc、信号序列、前肽、6His和表2的多肽的其它片段的多核苷酸的片段。
如本文中所用，"预防性治疗"意指在整个时间过程中以多个剂量给受试者施用因子IX多肽以升高受试者血浆的因子IX活性的水平。优选地，升高的水平足以降低自发性出血的发病率或足以在发生意外损伤的情况下防止出血。预防性治疗减少或预防出血事件，例如在按需治疗下描述的出血事件。预防性治疗可以是固定的或可以是个体化的，如在“给药间隔”下描述的，例如以补偿患者间的差异性。
如本文中所用，“受试者”意指人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括小鼠、狗、灵长类动物、猴子、猫、马、牛、猪和其它家养动物和小动物。受试者还包括小儿人类。小儿人类受试者出生至20岁，优选出生至18岁出生至16岁，出生至15岁，出生至12岁，出生至11岁，出生至6岁，出生至5岁，出生至2岁以及2至11岁。
可对需要控制或预防出血或出血事件的受试者实施本发明的方法。此类受试者包括需要控制或预防少量出血、关节积血、表浅肌肉出血、软组织出血、中度出血、解剖造成的骨内或软组织出血、粘膜出血、血尿、大出血、咽出血、咽后部出血、腹膜后腔出血、中枢神经系统出血、瘀伤、切伤、刮擦、关节出血、鼻出血、口出血、牙龈出血、颅内出血、腹膜内出血、少量自发性出血、重度创伤后出血、中度皮肤擦伤或自发性出血至关节、肌肉、内脏器官或脑的出血的受试者。此类受试者还包括需要围手术期管理例如与手术或拔牙相关的出血的管理的受试者。
如本文中所用，“治疗剂量”意指实现治疗目的剂量，如本文中所描述的。血浆源性因子IX(pdFIX)的需要的剂量的计算基于经验发现：平均起来，1IU pdFIX每kg体重产生约1IU/dL(1%)的血浆因子IX活性。在此基础上，使用下式确定需要的剂量：
需要的单位=体重(kg)x期望的因子IX升高(IU/dL或正常的%)x1(IU/kg每IU/dL)
因为FIXFc(例如如实施例和图1中所描述的)具有与pdFIX相似的增量恢复(与BENEFIXTM的增量恢复不同)，使用上式或将其作略微调整来测定所需剂量。关于各种按需治疗需要的具体推荐剂量，也参见表26。对于使用pdFIX的小儿受试者，剂量指导与对于成年人的相同。然而，小儿患者可具有更低的增量恢复，因此剂量可能需要上调。
可用于本发明的方法的治疗剂量为10-180、20-180或25-180IU/kg，更优选，6-10天的给药间隔的优选剂量如下：约25-110、约30-110、约40-110、约50-110、约60-110、约70-110、约80-110、约90-110和约100-110；约30-100、约30-90、约30-80、约30-70、约30-60、约30-50、约30-40IU/kg；约40-110、约50-100、约60-90和约70-80IU/kg；约40-50、约50-60、约60-70、约70-80、约80-90、约90-100和约100-110IU/kg；约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105和约110IU/kg。6-10天的给药间隔包括每周一次的给药间隔。对于6-10天(例如每周一次)的另外的治疗剂量，给药间隔包括20-50、20-100和20-180IU/kg，更具体地，对于6-10天(例如每周一次)的优选剂量，给药间隔如下：约20-110、约20-100、约20-90、约20-80、约20-70、约20-60、约20-50、约20-40、约20-30、约20-40和约20IU/kg。也参见实施例10和11。如果对于给定的患者有效，剂量可以为低于20IU/kg，例如约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18或约19IU/kg。
9-18天，例如每月2次的给药间隔的优选治疗剂量如下：约50-180、约60-180、约70-180、约80-180、约90-180、约100-180、约110-180、约120-180、约130-180、约140-180、约150-180、约160-180和约170-180IU/kg；约90-170、约90-160、约90-150、约90-140、约90-130、约90-120、约90-110和约90-100IU/kg；约100-170、约110-160、约120-150和约130-140IU/kg；约90-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160和约160-170IU/kg；约60、约70、约80、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175和约180IU/kg。也参见实施例10和11。
优选治疗剂量为10-50、15-100、20-100、20-50、50-100、10、20、40、50和100IU/kg。
治疗剂量可以为约20-50、约20-100、约20-180、25-110、约30-110、约40-110、约50-110、约60-110、约70-110、约80-110、约90-110、约100-110、约30-100、约30-90、约30-80、约30-70、约30-60、约30-50、约30-40IU/kg、约40-110、约50-100、约60-90、约70-80IU/kg、约40-50、约50-60、约60-70、约70-80、约80-90、约90-100、约100-110IU/kg、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105和约110IU/kg。对于约6-10、约7-10、约7-9、约7-8、约8-10、约9-10、约6-7、约8-9、约6、约7、约8、约9天和约10天以及每周1次的给药间隔这些剂量是优选的。
治疗剂量可以为约90-180、约100-180、约110-180、约120-180、约130-180、约140-180、约150-180、约160-180和约170-180IU/kg。剂量可以为约90-170、约90-160、约90-150、约90-140、约90-130、约90-120、约90-110和约90-100IU/kg。剂量可以为约100-170、约110-160、约120-150和约130-140IU/kg。剂量可以为约90-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160和约160-170IU/kg。剂量可以为约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175和约180IU/kg。这些剂量对于约9-18、约9-17、约9-16、约9-15、约9-14、约9-13、约9-12、约9-11、约9-10、约10-18、约11-18、约12-18、约13-18、约14-18、约15-18、约16-18、约17-18、约10-11、约11-12、约12-13、约13-14、约14-15、约15-16和约16-17天、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17和约18天，每月1次或每月2次(每2周1次)的给药间隔是优选的。
优选的治疗剂量和给药间隔如下：每周1次20IU/kg、每10天1次40IU/kg以及每2周1次100IU/kg(每月2次)。剂量和给药间隔的另外的组合包括：至少约50IU/kg的剂量和至少约7天的给药间隔、至少约100IU/kg的剂量和至少约9天的给药间隔、至少约100IU/kg的剂量和至少约12天的给药间隔、至少约150IU/kg的剂量和至少约14天的给药间隔、20-50或20-100IU/kg并且所述给药间隔为每周1次，20-50IU/kg的剂量和7天的给药间隔，50-100IU/kg的剂量和10-14天的给药间隔或100-150IU/kg的剂量和14-16天的给药间隔。给药间隔与剂量的优选组合还包括10-50IU/kg(对于7天)、15-100IU/kg(对于10-13天)、50-150IU/kg(对于14-15天)、10-30IU/kg(对于7天)、15-50IU/kg(对于10天)、20-70IU/kg(对于11天)、25-85IU/kg(对于12天)、30至100IU/kg(对于13天)、40至125IU/kg(对于14天)和50-150IU/kg(对于15天)。
如本文中所用，“变体”是指与原始多核苷酸或多肽不同但保留其基本性质例如因子IX促凝剂活性或Fc(FcRn结合)活性的多核苷酸或多肽。通常地，变体总体上十分相似，并且在许多区域中与原始多核苷酸或多肽相同。变体包括多肽和原始多肽的多核苷酸片段、缺失、插入和修饰形式。
变体多核苷酸可包含这样的核苷酸序列或可选择地由所述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与例如SEQ ID NO:1或3(因子IX部分、Fc部分，单独地或一起地)的核苷酸编码序列或其互补链、已知的突变和重组因子IX或Fc(例如本文中引述的公布和专利中公开的突变和重组因子IX或Fc)的核苷酸编码序列或其互补链、编码SEQ IDNO:2或4的多肽(因子IX部分、Fc部分，单独地或一起地)的核苷酸序列和/或任何此类核酸分子的多核苷酸片段(例如，本文中描述的那些片段)具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在严格杂交条件下或在严格度更低的条件下与此类核酸分子杂交的多核苷酸也被包括为变体，对于由此类多核苷酸编码的多肽亦如此，只要它们是有功能的。
变体多肽可包含这样的氨基酸序列或可选择地由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与例如SEQ ID NO:2或4中显示的多肽序列(因子IX部分、Fc部分，单独地或一起地)和/或此类多肽的任一个的多肽片段(例如，本文中描述的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。
关于具有与参照核苷酸序列具有至少例如95%的“同一性”的核苷酸序列的核酸，该核酸的核苷酸序列旨在与参照核酸完全相同，除核苷酸序列可包括每参照核苷酸序列的100个核苷酸最多5个点突变外。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列具有至少95%的同一性的核苷酸序列的核酸，可缺失或利用另外的核苷酸置换参照序列的最高5%的核苷酸或可将最高5%的参照序列总核苷酸的多个核苷酸插入参照序列中。查询序列可以是例如SEQ ID NO:1或3中显示的完整序列、ORF(开放阅读框架)或如本文中所述指定的任何片段。
实际上，无论任何特定的核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其都可使用已知的计算机程序来常规地测定。用于测定查询序列(参照或原始序列)与主题序列之间的最佳总体配对的优选方法(也称为全局序列比对)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245)(将其通过引用整体并入本文)的算法的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询序列和主题序列都为DNA序列。可通过将U转换成T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以同一性百分比表示。用于DNA序列的FASTDB比对以计算同一性百分比的优选参数为：矩阵=单个，k-元组(tuple)=4，错配罚分=1，连接罚分(Joining Penalty)=30，随机化组长度(Randomization Group Length)=0，截评分(Cutoff Score)=1，空位罚分(Gap Penalty)=5，空位大小罚分(Gap Size Penalty)0.05，窗口大小=500或目标核苷酸的长度，以较短者为准。
如果主题序列由于5’或3’缺失而非因内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行手工校正。这是因为当计算同一性百分比时，FASTDB程序不负责主题序列的5’和3’截断。对于相对于查询序列在5’或3’末端截断的主题序列，通过将未配对/比对的作为主题序列的5’和3’的查询序列的碱基的数目计算为查询序列的总碱基的百分比来校正同一性百分比。核苷酸是否配对/比对通过FASTDB序列比对的结果来确定。随后从使用指定的参数利用上述FASTDB程序计算的同一性百分比扣除该百分比，以获得终同一性百分比评分。该校正的评分是用于本发明的目的评分。为了手工调整同一性百分比评分，仅计算不与查询序列配对/比对的主题序列的5’和3’碱基之外的碱基，如通过FASTDB比对显示的。
例如将90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列比对以测定同一性百分比。缺失存在于主题序列的5’末端，从而FASTDB比对不显示5’末端上的前10个碱基的配对/比对。10个未配对的碱基代表10%的序列(5’和3’末端上未配对的碱基数目/查询序列的碱基的总数)，因此从通过FASTDB程序计算的同一性百分比评分扣除10%。如果剩余的90个碱基完全配对，则终同一性百分比将为90%。在另一个实例中，将90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列比较。这一次缺失为内部缺失，以便在主题序列的5’或3’上不存在不与查询序列配对/比对的碱基。在该情况下，通过FASTDB计算的同一性百分比不通过手工校正。再次地，仅对不与查询序列配对/比对的主题序列的5’和3’碱基进行手工校正。为了本发明的目的，将不进行其它手工校正。
关于具有与本发明的查询氨基酸序列具有至少例如95%的“同一性”的氨基酸序列的多肽，主题多肽(subject polypeptide)的氨基酸序列旨在与查询序列完全相同，除主题多肽序列可包括每查询氨基酸序列的100个氨基酸最多5个氨基酸的改变外。换句话说，为了获得具有与查询氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽，可插入、缺失、(插入缺失(indels))或利用另外的氨基酸置换主题序列的最多5%的氨基酸残基。参照序列的这些改变可在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置上发生，单独地散布在参照序列的残基间或以一个或多个连续的组群散布在参照序列内。
实际上，无论任何特定的核酸分子或多肽是否与SEQ ID NO:2(因子IX部分、Fc部分，单独地或一起地)或4的氨基酸序列或已知的因子IX或Fc多肽序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其都可使用已知的计算机程序来常规地测定。用于测定查询序列(参照或原始序列)与主题序列之间的最佳总体配对的优选方法(也称为全局序列比对)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245)(将其通过引用整体并入本文)的算法的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询序列和主题序列都为核苷酸序列或都为氨基酸序列。所述全局序列比对的结果以同一性百分比表示。用于FASTDB氨基酸比对的优选参数为：矩阵=PAM0，k-元组=2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机化组长度=0，截止评分=1，窗口大小=序列全长，空位罚分(Gap Penalty)=5，空位大小罚分(Gap Size Penalty)0.05，窗口大小=500或目标核苷酸的长度，以较短者为准。
如果主题序列由于N或C末端缺失而非因内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行手工校正。这是因为当计算全局同一性百分比时，FASTDB程序不负责主题序列的N和C末端截断。对于相对于查询序列在N或C末端截断的主题序列，通过将未与相应的主题残基配对/比对的作为主题序列的N和C末端的查询序列的碱基的数目计算为查询序列的总碱基的百分比来校正同一性百分比。残基是否配对/比对通过FASTDB序列比对的结果来确定。随后从使用指定的参数利用上述FASTDB程序计算的同一性百分比扣除该百分比，以获得终同一性百分比评分。该终同一性百分比评分是用于本发明的目的评分。为了手工调整同一性百分比评分，仅考虑不与查询序列配对/比对的主题序列的N和C末端的残基。即，仅在主题序列的N和C末端的最远端残基外侧的查询残基位置。
例如，将90个氨基酸残基的主题序列与100个氨基酸的查询序列比对以测定同一性百分比。缺失在主题序列的N末端发生，从而FASTDB比对不显示N末端上的前10个残基的配对/比对。10个未配对的残基代表序列的10%(N和C末端上未配对的残基数目/查询序列的残基的总数)，因此从通过FASTDB程序计算的同一性百分比评分扣除10%。如果剩余的90个残基完全配对，终同一性百分比为90%。在另一个实例中，将90个残基的主题序列与100个残基的查询序列比较。这时缺失为内部缺失，因此在主题序列的N或C端上不存在不与查询序列配对/比对的残基。在该情况下，不对利用FASTDB计算的同一性百分比进行手工校正。再次地，仅对不与查询序列配对/比对的主题序列的N和C末端外的残基位置(如在FASTDB比对中显示的)进行手工校正。为了本发明的目的，将不进行其它手工校正。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。特别优选的是包含产生沉默置换、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性的改变的多核苷酸变体。通过因遗传密码子的简并性导致的沉默置换产生的核苷酸变体是优选的。此外，其中以任意组合置换、缺失或添加5-10、1-5或1-2个氨基酸的变体也是优选的。可因多个理由(例如最优化用于特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成由细菌宿主例如大肠杆菌(E.coli)优选的密码子))产生多核苷酸变体。
天然存在的变体称为“等位基因变体”，是指占据生物体的染色体上给定的基因座的基因的几个替代形式之一(Genes II,Lewin,B.编著,John Wiley & Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化并且包括在本发明中。或者，非天然产生的变体可通过诱变技术或通过直接合成产生。
通过使用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法，可产生变体来改善或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的N端或C端缺失一个或多个氨基酸而无生物功能的显著丧失。Ron等人,J.Biol.Chem.268：2984-2988(1993)(将其通过引用整体并入本文)的作者报道了即使在缺失3、8或27个氨基-末端氨基酸残基后仍然具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，干扰素γ在从该蛋白质的羧基端缺失8-10个氨基酸残基后显示了最多高10倍的活性。(Dobeli等人,J.Biotechnology7:199-216(1988)，将其通过引用整体并入本文)。
此外，大量证据显示变体通常保持与天然存在的蛋白质的生物活性相似的生物活性。例如，Gayle及同事(J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)，将其通过引用整体并入本文)进行了人细胞因子IL-1a的广泛突变分析。它们使用随机诱变产生超过3,500个个体IL-1a突变体，在分子的整个长度范围内每变体平均改变2.5个氨基酸。在每一个可能的氨基酸位置上检查到多个突变。研究者发现“大部分分子可被改变，而对[结合或生物活性]几乎无影响”(参见摘要)。事实上，所检查的超过3,500个核苷酸的序列中仅23个独特的氨基酸的序列产生了在活性上与野生型显著不不同的蛋白质。
如上所提及的，多核苷酸变体包括修饰多肽。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转运-RNA个导的氨基酸至蛋白质的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化。
术语“约”在本文中用于意指近似地、大致地、左右或在某范围内。当术语“约”与数字范围结合使用时，其通过延伸高于和低于所示数值的边界修饰该范围。一般地，术语“约”在本文中用于修饰高于或低于所述值上或下(更高或更低)10%的差异的数值。
由于现已详细地描述了本发明，因此通过参考下列实施例可更清楚地理解本发明，所述实施例随同本发明包括的，仅用于举例说明目的并且无意限定本发明。本文中提及的所有专利和公布通过引用明确地并入本文。
实施例1.首次应用于人体的(FiH)试验
首次应用于人体的研究是测定FIXFc(重组人凝血因子IX融合蛋白)的安全性、耐受性和药代动力学(PK)参数的开放性、剂量递增的1/2期研究。FIXFc为包含偶联至来自人IgG1的Fc结合域的人凝血因子IX的重组融合蛋白。融合蛋白在人胚肾细胞(HEK293)中表达。参见实施例3。
FIXFc正被开发来用于控制和预防B型血友病(先天性因子IX缺陷或克雷司马斯病)患者的出血事件，包括控制和预防手术背景中的出血。
FIXFc为由凝血因子IX(FIX)和人抗体(IgG1同种型)的Fc结构域组成的重组融合蛋白质。FIXFc分子为具有通过Fc的铰链区中的两个二硫键结合在一起的FIXFc单链(FIXFc-sc)和Fc单链(Fc-sc)的异二聚体。参见图1和表2。
rFIXFc药品为期望用于静脉内(IV)施用的澄清无色溶液。在10mL的一次使用的小瓶中以1000IU/5mL体积提供rFIXFc。将药品包装在具有溴丁基瓶塞和可撕下的平面铝顶封(tear-off plain aluminumoverseal)的USP I型玻璃小瓶中。rFIXFc药品在添加有145mM NaCl和0.1%聚山梨酯20的10mM磷酸钠缓冲液pH7.0中包含200IU/mL。不应当稀释rFIXFc溶液。
研究设计。招募总共14个先前治疗的重度B型血友病患者，在约10分钟的时间内利用FIXFc通过静脉内(IV)输注治疗所述患者。在研究中评估6个剂量水平1、5、12.5、25、50和100IU/kg。在剂量水平1、5、12.5和25IU/kg上每剂量水平招募一个患者，在50和100IU/kg上每剂量水平招募至少3个可评估的患者。
在筛选后(14天的FIXFc剂量内安排的)，开始患者的治疗期。每一个剂量水平的治疗期包括单次剂量的FIXFc(第1天)，(对于剂量水平1和5IU/kg)直至完成72小时安全性观察期(3天)或(在12.5至100IU/kg的剂量水平下)直至获得患者的最后PK样品(约10天)。招募利用1、5、12.5或25IU/kg进行治疗的患者，以始于1IU/kg的顺序方式治疗所述患者。在同一天不治疗接受50IU/kg的患者，并且相隔至少一天给药。在50IU/kg患者的治疗后，开始100IU/kg患者的治疗。
治疗后的时期为始于患者接受FIXFc的剂量的当天的30天的安全性观察期并且与治疗期重叠，因为在该时间过程中，患者一直在经历所需的研究评估例如PK取样。
抽取被赋予剂量水平12.5至100IU/kg的患者的血液样品以评估FIX活性和FIXFc浓度。正好在施用FIXFc之前、在输注结束后15分钟和在输注结束后第1、3、6、9、24、48、72、96、120、168和240小时或直至达到基线FIX水平时抽取血液样品。如果患者在240小时时间点(研究的第11天)上继续具有高于基线的FIX水平，则在第288小时(研究的第13天)采样，如果FIX水平在研究的第13天高于基线则再次在第336小时(研究的第15天)采样。
患者10接受出血的BENEFIXTM治疗，然后在给药后第216小时进行预先安排的FIXFc采样。因此，从分析排除216小时和随后时间点的FIXFc活性和抗原数据。无感觉到已影响该研究的间断分析结果的另外偏差发生。
对于因子IX抗原，在FIXFc的IV输注后，对个体患者观察到的FIXFc浓度对时间数据进行药代动力学分析。使用模型依赖性方法进行初步分析。使用用户确定的初始参数估计，将FIXFc浓度数据与从中央隔室消除的两隔室开放模型进行计算机拟合，以计算初始参数值。产生WinNonlin估计的微观速度常数，并且利用1/(Y-hat *Y-hat)的函数对FIXFc浓度数据进行加权。两隔室模型未充分描述观察到的两个受试者(例如，患者5和6)的数据。因此，使用WinNonlin非隔室分析IV-输注输入模型(AUC计算的线性梯形法则)对这两个患者进行不依赖于模型的分析。对于非隔室分析，使用描述回归的终端对数-线性下降的数据点从β期计算半衰期。使用最少3点来描述消除期。这在大致4至14天之间进行。对于抗原的PK分析，利用“mg/kg”剂量等同物。基于60.2IU/mg的对于FIXFc的特异性活性测定这些值。将实际采样时间、剂量和输注持续时间用于计算。将标称采样时间和剂量用于产生表和浓度-时间图。提供个体和平均PK参数以及描述性统计。不进行正式的统计分析，因为每一个组群的剂量范围和受试者人数太小以至于不能进行有意义的分析。
对于因子IX活性，按照基线扣除决策树(图4)将基线扣除法用于活性对时间的曲线。对于基线衰减(baseline decay)，在1IU/dL下定义为小于1%的活性值。为了进行计算，将给药前时间处理为0。此外，在代表至基线水平的返回的时间点上截断基线校正的活性数据。对在FIXFc的IV输注施用后获得的扣除基线的FIX活性对照时间数据进行药代动力学分析。利用模型依赖性评估进行IV-输注剂量组的分析。使用WinNonlin确定的参数边界值，将扣除基线的数据与从中央隔室消除的两隔室开放模型进行计算机拟合，以计算初始参数值。产生WinNonlin估计的微观速度常数，利用1/(Y-hat *Y-hat)的函数对FIXFc活性数据进行加权。将实际采样时间、剂量和输注持续时间用于计算。将标称采样时间和剂量用于产生表和浓度-时间图。
当不能从实际数据获得时，使用WinNonlin产生的微观速度常数模拟FIXFc活性水平对时间数据来获得给药后168小时(C168)和达到高于rFIXFc的基线(TBLP1)1IU/dL时的时间。在本实施例中提供了个体和平均PK参数以及描述性统计。不进行正式统计分析，因为每一个组群的剂量范围和受试者人数太小以至于不能进行有意义的分析。
FIXFc抗原药代动力学的结果显示FIXFc血浆浓度在短暂的FIXFc的IV输注后急剧增加，对于12.5、25、50和100IU/kg的标称剂量水平分别具有1670(n=1)、2730(n=1)、7510±2480和15400±3960ng/mL的平均(±SD)Cmax值，并且对于所有患者在第一个半小时内达到。所有FIXFc治疗的患者具有剂量相关的全身性FIXFc血浆暴露的增加(如通过Cmax和AUCINF评估的)。虽然在12.5和25IU/kg的标称剂量上限定于单个可评估的患者，但观察到的Cmax和AUCINF的增加合理地在评估的剂量范围内与剂量成比例。(表3显示个体患者和组的平均FIXFc抗原的PK总结数据；通过标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的。表4显示个体患者和组的平均FIXFc抗原的PK总结数据；通过标称剂量、实际剂量、“mg/kg”等同剂量和患者人数分选的，显示个体患者和组的平均FIXFc抗原的PK总结数据；通过标称剂量、实际剂量、“mg/kg”等同剂量和患者人数分选的，并且参见表11)。
FIXFc血浆浓度在短暂的IV输注后以双指数方式下降。分布(α)和消除(β)半衰期值在评估的剂量范围内似乎是不依赖于剂量的，个体患者的α和β半衰期值分别在9.79至21.2小时和71.0至140小时的范围。对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均α半衰期值(±SD)分别为13.1±4.77和12.1±2.33小时。对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均β半衰期值(±SD)分别为110±26.5和95.8±11.1小时。此外，测定Cl、VSS和MRT的主要PK参数值，并且一般地，所述PK参数值在评估的剂量范围内似乎都是不依赖于剂量的。如所指出的，该评估在12.5和25IU/kg的标称剂量水平上受到单个患者数据的限制。(表12和图2、7和8)。
此外，对50和100IU/kg的标称剂量水平，平均Cl值分别为2.28±0.374和2.11±0.464mL/h/kg。对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均VSS值分别为259±78.5和238±52.2mL/kg。此外，对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均MRT值分别为112±21.5和114±17.1小时。
基线校正的FIXFc活性药代动力学的结果显示FIXFc活性在FIXFc的短暂IV输注后急剧增加，对于12.5、25、50和100IU/kg的标称剂量水平分别具有11.9(n=1)、19.9(n=1)、41.6±8.97和98.2±8.21IU/dL的平均(±SD)模型预测的Cmax值，并且对于所有患者在前半小时内达到。(表5显示个体患者和组的平均基线校正的FIXFc活性对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的。表6显示个体患者和组的平均FIXFc活性的PK总结数据；按标称剂量、实际剂量、“mg/kg”等同剂量和患者人数分选的)。
所有FIXFc处理的患者具有剂量相关的FIX活性的增加(相对于给药前基线反应)。虽然限于在12.5和25IU/kg的标称剂量水平上的单个可评估的患者，但观察到的Cmax和AUCINF的增加在评估的剂量范围内合理地与剂量成比例。(表6、9和13以及图3和5)。
在输注结束后，基线校正的FIX活性的下降显示双指数衰减；特征在于快速分布(α)期，然后对数-线性消除(β)期。在α期中，FIXFc活性的下降速度可随个体患者α半衰期变化(从0.140变化至16.6小时)而变化。平均α半衰期值的表面上剂量依赖性增加在12.5和25IU/kg的标称剂量水平上被单个患者所混淆。相反地，消除(β)半衰期的值在剂量范围内似乎是不依赖于剂量的，个体患者的β半衰期值在25至100IU/kg的剂量范围内从42.1变化至67.4小时。虽然已进行了评估和报道，但利用12.5IU/kg的rFIXFc治疗的患者1的消除半衰期因该患者的FIX水平仅在最多96小时内可被检测(从而导致截短的终末期并且促成终末消除半衰期的低估)而不包括在总结评估中。对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均β半衰期值(±SD)分别为52.1±10.4和52.5±10.1小时，对于组合的25、50和100IU/kg的标称剂量，所述平均β半衰期值为52.5±9.2(范围为40-67.4)小时。(表6、8和13)。
此外，测定Cl、V1、VSS和MRT的主要PK参数值，并且一般地，所述PK参数值在评估的剂量范围内全都似乎是不依赖于剂量的。
此外，对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均Cl值分别为3.77±1.12和2.89±0.615mL/h/kg，对于组合的25、50和100IU/kg的标称剂量，所述平均Cl值为3.36±0.928mL/h/kg。(表6、8和13)。
对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均VSS值为分别264±77.6和179±31.1mL/kg，对于组合的25、50和100IU/kg的标称剂量，所述平均VSS值为226±69.8mL/kg。(表6、8和13)。此外，对于50和100IU/kg的标称剂量水平，平均MRT值分别为71.7±13.0和62.8±8.82小时，对于组合的25、50和100IU/kg的标称剂量，所述平均MRT值为68.05±11.16小时。(表6、8和13)。
除了主要PK参数外，测定次要PK参数(例如，C168、K-值、IVR等)以评估FIXFc的作用持续时间。如所预期的，观察到的C168、TBLP1、TBLP3和TBLP5值的剂量依赖性增加。相反地，K值和IVR值在评估的剂量范围内似乎是不依赖于剂量的。在整个剂量范围内，个体患者模型预测的和观察到的K值分别在0.61至1.02IU/dL每IU/kg的范围内和0.62至1.17IU/dL每IU/kg的范围内。对于50和100IU/kg的标称剂量水平的平均模型预测的K值分别为0.76和0.90IU/dL每IU/kg，对于组合的25、50和100IU/kg的标称剂量，所述K值为0.821±0.1387(范围为0.61-1.02)IU/dL每1IU/kg。对于50和100IU/kg的标称剂量水平的平均模型预测的IVR值分别为34.5%和35.1%。对于50和100IU/kg的标称剂量水平的平均观察K值分别为0.86和1.02IU/dL每IU/kg，对于组合的25、50和100IU/kg的标称剂量所述K值为0.926±0.1787(范围为0.97-1.17)IU/dL每1IU/kg。对于50和100IU/kg的标称剂量平均观察IVR值分别为39.2%和39.8%。(表6、7、8和13)。表7A-7B（显示7）显示个体患者和组的平均FIXFc活性次要PK的总结数据；按标称剂量、实际剂量和患者人数分选的。
每一个1IU/kg的输注的rFIXFc使血浆FIX活性平均升高0.93±0.18IU/dl，并且该增量恢复(K值)显示微弱的与体重正相关(R2=0.336,p=0.048)(图23)。
FIXFc活性的药代动力学评估与对于rFIXFc抗原的药代动力学评估一致(例如，比较表13和14)。此外，在rFIXFc活性与抗原水平之间存在优良的相关性，这表明rFIXFc的体内活性的保持。(图9)。此外，相对于BENEFIXTM(Wyeth)的历史数据，rFIXFc显示(表8)下列：
从25至100IU/kg的剂量线性
t1/2β增加至3倍
平均停留时间增加至3倍
24%的提高的增量恢复
减少2.5倍的清除率
FIXFc为由连接至人IgG1的Fc结构域的FIX组成的重组融合蛋白质。FIXFc已被设计为FIX的长效形式。利用FIXFc的临床前研究已显示与BENEFIXTM(商购可得的重组FIX产品)相比较的FIX活性的半衰期的延长。本研究的原理是评估FIXFc在重度B型血友病患者中的安全性和PK。为了进行该研究，可获得12个年龄为18至76岁的可评估的受试者来进行PK评分。在约10分钟的时间每个受试者接受以12.5、25、50或100IU/kg体重的标称剂量静脉内输注FIXFc的单次施用。在输注前以及在给药后最多14天获得用于FIXFc活性和抗原浓度的PK评估的血浆样品。在本研究中使用模型依赖性和不依赖于模型的方法独立地表征FIXFc抗原和活性两者的PK。
在以12.5、25、50和100IU/kg体重的单次IV剂量施用后，FIXFc可被良好地耐受。在本研究中无药物相关严重不利事件的证据。在任何受试者中未检测到rFIXFc的中和或结合抗体。
在施用12.5至100IU/kg的剂量后，对于FIXFc抗原和活性，观察到Cmax和AUCINF的与剂量大致成比例的增加，但在所有剂量上V与Cl相似。这些结果表明FIXFc抗原和活性在评估的剂量范围内显示线性PK。相对小的V参数值可表示FIXFc进入间隙液但不穿过细胞膜进入细胞内液。
在输注结束时在0.5小时内观察到FIXFc抗原和活性的峰值血浆水平，并且在给药后数天仍然是可检测的。对于FIXFc抗原和活性都观察到减少的清除率和延长的半衰期的证据。
对于50和100IU/kg的剂量水平，与FIXFc抗原浓度相关的平均清除率和终末消除半衰期值分别为2.28和2.11mL/h/kg以及110和95.8小时。类似地，在相同的剂量范围内，与FIXFc活性水平相关的平均清除率和终末消除半衰期值分别为3.77和2.89mL/h/kg以及52.1和52.5小时。本研究中观察到的FIXFc活性PK结果与报道的BENEFIXTM活性的PK(BENEFIXTM的产品特征概述；2009年11月18日)的比较显示相对于BENEFIXTM，FIXFc清除率减少约3倍并且FIXFc终末消除半衰期和平均停留时间增加约3倍。
鉴于观察到的PK的改善，FIXFc将提供延长的免受出血的保护作用，从而允许对B型血友病个体进行更低频率的注射。基于该试验的结果，可使用100IU/kg的剂量每两周1次或两月2次和使用更低的剂量至少每周1次施用rFIXFc。这样的方案需要更少次的注射。此外，rFIXFc的使用将具有其它潜在的临床影响例如：中央静脉进入(central venous access)；改善的方案顺从性；减少的穿破性出血；和增强的保护关节免受出血的作用。
实施例2.B-LONG1/2/3期试验
这将是重组长效促凝因子IX Fc融合蛋白(rFIXFc)在预防和治疗先前治疗的患有重度B型血友病的受试者的出血中的安全性、药代动力学和疗效的开放性多中心评估。利用目前在售的FIX产品的治疗使得必需每周给药2-3次。将所需给药间隔延长至每周1次或更长的具有延长的半衰期的产品被医学界认为是对于重度血友病患者的治疗的显著提高。
rFIX产品的剂量水平在临床预防性研究中可广泛地变化：报道的剂量从10至171IU/kg变化(Roth等人,Blood98:3600(2001))或从40至100IU/kg变化(MASAC Recommendation177,National HemophiliaFoundation(2006年10月))。此外，在不具有出血的临床体征的受试者的预防性治疗过程中FIX活性的波谷水平经预测在0.2至3.8IU/dL的范围内变化(Carlsson等人,血友病4:83(1998))。考虑到个体患者间的差异性，基于患者的临床状态的个体化给药方案是普通实践。
评估单次剂量的rFIXFc的冷冻液体制剂的安全性和药代动力学的1/2a期研究(实施例1)的结果已显示药物在从1至100IU/kg变化的剂量上可被良好地耐受，并且PK表征显示优于目前可获得的治疗的几个有利方面，即为先前对于BENEFIXTM所报道的3倍长的半衰期和MRT(61小时对19小时)。本研究的目的是前瞻性测定冻干的rFIXFc在人中的PK参数估计，将这些PK参数估计与BENEFIXTM在人中的PK参数估计相比较，和显示冻干的rFIXFc在预防和治疗先前治疗的患有重度B型血友病的受试者的出血中的疗效和其反复给药对于所述受试者的安全性。
研究必须采用4个方式(arm)：低剂量预防性方案(n=25)、高剂量预防性方案(n=25)、按需方案(n=20)和大手术方案(n=5)。低剂量方案方式可包括利用BENEFIXTM给药，然后交换成rFIXFc给药的PK亚组(n=16)。
本发明的主要目的是：评估rFIXFc在所有治疗方式中的安全性和耐受性；评估rFIXFc在所有治疗方式中的疗效；和评估预防性疗法高于按需疗法的疗效(方式1和2对按需方案方式3之间的出血事件的年度化数量的比较)。
本发明的次要目的是：比较rFIXFc与BENEFIXTM的PK参数估计；评rFIXFc在按需方式和手术方式中的疗效；评估和比较PK亚组中rFIXFc在基线与第26周(±1周)上的PK参数估计；评估受试者对所有方式的治疗的反应；和评估所有方式中rFIXFc的消耗。
主要选择标准(Inclusion Criteria)：
男性且12岁及更大并且体重至少40kg
经诊断患有B型血友病(基线因子IX水平低于或等于2%)
对任何因子IX产品的至少100天暴露的历史
血小板计数≥100,000个细胞/μL
INR(国际标准化比率)≤1.40，如通过测试实验室标准值域确定的
CD4计数≥200个细胞/μL
主要排除标准(Exclusion Criteria)：
因子IX抑制剂的历史
肾或肝功能障碍
经诊断患有除B型血友病外的另一种凝血缺陷
与任何FIX或IV免疫球蛋白施用相关的过敏性反应的先前历史
服用全身性免疫抑制药(例如，全身性糖皮质激素；然而，允许HAART(高效抗逆转录病毒疗法)
实施例3.FIXFc在HEK293细胞中的产生
在含有FIXFc(直接融合至Fc区域的天然FIX)的表达盒和单独的Fc的表达盒的稳定转染的HEK293细胞中产生FIXFc。还用PC5的表达盒转染细胞，所述PC5为允许FIX多肽的完全加工的加工酶。将转染的细胞在含有维生素K的无血清悬浮培养基中生长，并且它们分泌三种蛋白质：FIXFc二聚体、FIXFc单体(一个FIXFc链和一个Fc链)和Fc二聚体。利用柱层析(蛋白A、Fractogel DEAE和具有低离子强度的CaCl2的Q琼脂糖假-亲和力洗脱)纯化FIXFc单体(“FIXFc”)，灭活病毒并且过滤以给人受试者施用。也参见Peters等人,Blood.2010年3月11日；115(10):2057-64(2010年1月7日电子出版)；和美国专利No.7,566,565；将每一个所述文献和专利通过引用整体并入本文。
通过使用MLA Electra1600C(Medical LaboratoryAutomation/Instrument Labs,Pleasantville,NY)定量其恢复FIX-缺陷型血浆的凝血活性的能力来测量FIXFc的促凝剂活性。将结果与使用世界卫生组织FIX标准的系列稀释物产生的标准曲线相比较。
因子IX的丝氨酸磷酸化和酪氨酸硫酸化被认为对于体内恢复是非常重要的。已报道由于MONONINETM的更高的磷酸化/硫酸化水平(>90%/>90%对<10%/5%)，MONONINETM(由CSL Berhing销售的血浆纯化的因子IX(pdFIX))具有比BENEFIXTM(由Wyeth销售的重组(rFIX))更好的体内恢复。然而，HEK293细胞中产生的FIXFc几乎不具有磷酸化/硫酸化(<10%/4%，这与BENEFIXTM非常相似)，并且显示比BENEFIXTM(0.7)更好的IVR(1.0IU/dl每IU/kg)。
此外，如上所述产生的FIXFc具有比MONONINETM(pdFIX)或BENEFIXTM(rFIX)(0.1%)显著更低(低10-100倍)的水平(0.01-0.001%)的激活的FIX(FIXa)(产品相关的杂质)。所得的FIXFc在施用后将具有比MONONINETM或BENEFIXTM更少的不期望的血栓形成事件。
实施例4.小儿研究：成人与小儿群体的发展之间的外推和相互关系
显示与FIX药代动力学的关系的患者特征包括年龄依赖性生理变化(
Figure BDA00002795106000441
和Berntorp,Clin.Pharmacokinetics40:815-32(2001)；和Bjorkman,Hemophilia9(增刊1):101-10(2003))以及身体大小和组成(Shapiro,Hemophilia11:571-82(2005))。因此，总体上已发现FIX的体重调节的清除率(CL)在从婴儿期至成人期的生长过程中随年龄和/或体重增长而减少，而终末半衰期(tl/2)相应增加。对于rFIX产品(BENEFIXTM)，CL和处于稳态的的体积分布(Vss)在儿童中增加，随后在年人期过程中保持恒定；因此在小儿研究中密切监测这些参数。
FIX促凝活性物质的活性(FIX:C)的峰值水平取决于在FIX的单次和/或重复给药后FIX:C的初始分布体积。FIX的初始分布非常快。然而，已显示BENEFIXTM的体内恢复(平均增量恢复)通常比单克隆抗体纯化的血浆源性凝血因子(pdFIX)的体内恢复低30%(Roth等人,Blood98:3600-3606(2001))。此外，利用pdFIX的研究已显示15岁及以下的受试者具有比年龄更大的受试者显著更低的恢复(White等人,Thromb.Haemost.73:779-84(1995))。因此，也将在小儿研究中进行波谷和峰值水平的监测。
由于研究已显示儿童与成人相比较可作出不同的反应，利用缩短的药代动力学采样在儿童中进行利用50IU/kg的rFIXFc的基线药代动力学评估。
最近完成了评估rFIXFc的单次静脉内施用在患有重度B型血友病的年龄18岁及以上的PTP中的安全性和药代动力学曲线的1/2a期研究(SYN-FIXFc-07-001)。来自该在人中的初始探索的初步结果显示rFIXFc的药代动力学参数(平均终末半衰期、MRT和AUC)与文献中对于BENEFIXTM(参见上文)所报道的相比较增加约3倍。此外，rFIXFc可被良好地耐受并且不存在注射部位反应的体征以及不存在抑制剂的产生。综上所述，这些安全性和药代动力学结果支持评估rFIXFc在预防和治疗104个患有重度B型血友病(<2%)的12岁及以上的PTP(对于先前的产品进行至少100个治疗ED)的出血中的安全性、药代动力学和疗效的1/2/3期立项研究(998HB102研究(B-LONG)，参见上文)的启动。一旦可从立项研究获得充足的安全性数据，则可启动小儿计划以进一步研究rFIXFc在儿童中的安全性和疗效。rFIX在人中的延长的半衰期的证明将意味着需要更低频率的注射来预防和治疗患有B型血友病的个体的出血。
在先前治疗的儿童(<12岁)中进行的2/3期小儿PTP研究
一旦从立项研究(998HB102研究)获得26ED的关于10个PTP(≥12岁)的数据，立即启动3期小儿研究。将在约25个临床部位全局性进行该2/3期小儿研究(在于招募前已对FIX产品进行至少50个ED的PTP中进行的)。将按照预定标准筛选并且选择约25个患有重度B型血友病(<2IU/dL[<2%]内源性FIX)的2-11岁的PTP(以确保20个可评估的受试者)。所有可评估的受试者将完成研究的药代动力学部分(关于研究前FIX产品的PK和随后关于rFIXFc的PK)，并且将接受每周1次的rFIXFc给药，进行52周。本研究将记录增量恢复、体内半衰期、AUC和rFIXFc的清除。所有受试者将经历利用研究前FIX和rFIXFc的基线药代动力学评估，并且每一个受试者的研究持续时间将为约69周，包括筛选和随访。
每一个受试者将接受50IU/kg的rFIXFc的基线药代动力学评估，然后接受每周1次利用50-60IU/kg的rFIXFc的重复给药。关于患者的顺从性，可如下将缩短的药代动力学取样用于研究前产品和用于rFIXFc：给药前、注射结束时、注射结束后30+10分钟、3±1小时、24±3小时(第1天)、72±3小时(第3天)、120±3小时(第5天)和168±3小时(第7天)。为了解决免疫原性，将每周1次利用rFIXFc治疗所有受试者，进行最少50ED。将包括用于即时安全性(immediatesafety)和耐受性的评估的安全性参数，例如：(a)rFIXFc注射前和注射后30分钟的生命体征(脉搏、血压、呼吸速率、温度)；(b)血液学和凝固参数；(c)临床化学；(d)使用Nijmegen-改良Bethesda测定进行的频繁的FIX抑制剂测定(即将进行第一次暴露时，ED4[第4周]、ED12、ED24、ED36和ED50)；和(e)不利事件。
通过评估出血事件的数目、出血间隔和治疗次数以及每年和每事件的FIX的消耗来评估疗效。
在先前未治疗的儿童(0–11岁)中进行的2/3期PUP研究
一旦可在先前的研究中获得来自10个先前治疗的儿童(2-11岁)的关于完全动力学参数和50ED的数据，就可启动2/3期小儿PUP研究。将在约60个临床部位全局性地进行该研究。将按照预定的标准筛选并且选择最多30个患有重度B型血友病(<2IU/dL[<2%]内源FIX)的0岁和以上的PUP(以确保20个可评估的受试者)。
由于可按照改进的预防性方案使用rFIXFc开始初始治疗，因此研究的参与可变化。预期每患者研究参与为约4年，包括筛选和随访。在该时间过程中，预期大多数患者对于rFIXFc达到50ED。为了解决免疫原性，利用rFIXFc治疗所有受试者，进行约50ED或达到4年。将包括用于进行即时安全性和耐受性评估的安全性参数：(a)使用Nijmegen-改良Bethesda测定进行的频繁的FIX抑制剂测定；和(b)不利事件。
通过评估出血事件的数目、出血间隔和治疗次数以及每年和每事件的FIX的消耗来评估疗效。
实施例5.非人动物的生物化学表征、活性和PK分析
表征实施例3中产生的rFIXFc的翻译后修饰，获得下列结果(参见表15和图11)。rFIXFc的前肽在产生过程中被正确加工。rFIXFc的γ-羧基化模式与rFIX的γ-羧基化模式相似。此外，rFIXFc的总Gla/分子(11.2±0.7)与rFIX相当。因为某些残基上的γ-羧基化是FIX活性所必需的，因此这些是重要结果。此外，rFIXFc的Ser158磷酸化和Tyr155硫酸化可与rFIX相比较。FIX中的N联接的聚糖未被完全唾液酸化，与rFIX相似。第一EGF结构域中的rFIXFc O联接的糖基化与FIX相同，虽然相对比率不同。rFIXFc的Asp64具有比rFIX或血浆源性FIX(pdFIX)程度更高的β-羟基化。激活的FIX以比在rFIX或pdFIX制剂中低得多的水平存在于rFIXFc制剂，如在实施例3中更详细地论述的。
此外，给不同的动物物种施用rFIXFc以测定其活性和PK参数。结果示于表16和图12-16中。
实施例6.γ-羧基化
本研究的目的是分析和表征临床前批次的FIXFc材料和商购可得的FIX产品中的谷氨酸(Gla)的γ-羧基化，以表征富集的“峰”级分和源于假-亲和力色谱离子交换步骤的高盐洗脱“条带(strip)”级分的Gla含量，以及利用阴离子交换HPLC进一步分离富集的“峰”和高盐洗脱“条带”级分并且进一步表征分离的种类。
为了实现该目的，开发了许多互补分析方法。此类方法包括使用碱水解以测定(总)Gla含量的氨基酸分析(AAA)、使用Lys-C肽以测定Gla分布的肽图谱(LC/MS)、分离同种型的完整分子的分析阴离子-交换HPLC以及测定生物活性的激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。
含有2个Gla(E)的肽为：
–K1K2：YNSGKL7E8EFVQGNL15ER17ECM20E21EK
·[M+H]+6Gla=2953.9
·[M+H]+5Gla=2909.9
–K3：CSF26E27EAR30EVF33ENT36ERTT40EFWK
·[M+H]+6Gla=2959.9
·[M+H]+5Gla=2915.9
·[M+H]+4Gla=2871.9
使30微克的样品(源于富集的峰级分、高盐条带级分和来自分析阴离子-交换HPLC的每一个种类)变性，将其还原、烷基化，利用Lys-C(1:20,E:S)进行降解。利用2%TFA猝灭降解，将其注射至JupiterC18(2.0x250mm)Phenomenex柱上。在Agilent1100系统上进行分离。将柱子维持在25℃，利用多步骤乙腈梯度进行洗脱肽。以“三重”播放模式(“Triple Play”mode)进行质谱法(Thermo-Fisher LCQ)。
互补方法被开发来分析和表征临床前rFIXFc材料的Gla含量和分布。进行临床前批次的rFIXFc(富集的峰级分)的谷氨酸(Gla)含量和分布的γ-羧基化，并将其与商购可得的产品进行比较。分析显示相对于商购可得的产品的相似的Gla含量和分布。分析高盐洗脱“条带”级分，并将其与富集的峰级分相比较。分析显示降低的γ-羧基化水平。
从假-亲和力层析离子-交换步骤分离FIXFc(富集的峰级分)，并且通过分析阴离子交换HPLC将其进一步分成3个同种型。AEX柱负载和分离的种类被高度γ-羧基化。(AEX柱负载为在高盐洗脱步骤过程中从假-亲和力层析离子-交换步骤收集的条带级分)。AEX柱负载和分离的种类具有生物活性。Gla含量和分布与rFIX相似。肽图谱显示4/5/6Gla在K3肽上的分布。肽图谱显示在K1K2肽上存在密集群体的6Gla和痕量水平的5Gla。
从假-亲和力层析离子-交换步骤分离FIXFc(条带峰级分)，并利用分析阴离子交换HPLC将其进一步分成2种同种型。AEX柱负载和分离的种类的γ-羧基化水平下降。相对于FIXFc的富集的峰级分，Gla含量下降。观察到降低的水平的生物活性。肽图谱显示在K1K2中相对于富集的峰级分存在增加的群体的5Gla，并且可暗示对生物活性的影响。
参考资料(将所述每一份参考资料通过引用整体并入本文)：Dumont JA，等人，Monomeric Fc Fusion Molecules in TherapeuticAbs-From Bench to Clinic，第33章第779-795页；Gillis s等人，ProteinScience(1997)6：185；White GC，等人，J．Thrombosis andHaemostasis(1997)78：26l；Hansson K和Stenflo J，Journal Thrombosisand Haemostasis(2005)3：2633；和Peters RT等人，Blood(2010)115：2057。
实施例7．在HemB小鼠出血模型中评估rFIXFc促凝活性物质的活性
在HemB小鼠的体外全血ROTEM中和在HemB小鼠的体内断尾出血模型中显示了rFIXFc与BENEFIXTM的可比较的效力
利用氯化钙作为激活物(NATEM)，通过旋转血小板弹力仪(
Figure BDA00002795106000491
Pentapharm GmbH，Munich，Germany)评估rFIXFc形成坚硬且稳定的血块的能力。将通过大静脉从HemB小鼠收集的混合全血分成7等份，用rFIXFc掺入所述等份至7.4%、0.74%和0.074%的终浓度的正常血浆FIX活性或掺入BENEFIXTM至10%、1%、0.1%的正常活性。作为阴性对照，用FIX配制缓冲液掺入血液样品。产生来自5只HemB小鼠的总共10份血液混合物以完整评估。通过加入CaCl2引发NATEM反应。评估凝血参数，包括凝血时间(CT)、血块形成时间(Clot Formation Time)(CFT)和α角。CT、CFT和α角的平均值和SD概述于表17中。将所述3个参数的剂量反应绘制于图17中。在测试的剂量范围内，所有3个参数在rFIXFc与BENEFIXTM之间是可比较的(p>0.05，利用单因素ANOVA(Kruskal-Wallis)分析)。
还在HemB小鼠断尾出血模型中评估了rFIXFc的急性疗效。(图18)。按照体重和年龄的平等形式将雄性HemB小鼠分层至不同的处理组。在断尾损伤之前，利用50mg/kg氯胺酮和0.5mg/kg右美托咪啶的混合物麻醉小鼠，将其置于加热垫上以帮助维持体温。随后将小鼠尾巴浸没在37℃水中进行10分钟以扩张侧脉。在静脉扩张后，通过尾静脉注射rFIXFc、BENEFIXTM或媒介物，5分钟后，使用#11具有直边的解剖刀切取尾的远端4mm。将流出的血收集至13ml的温盐水中进行30分钟，然后定量失血的重量。测试6个rFIXFc处理组(720、360、240、120、80、40IU/kg,n=15)和3个BENEFIXTM处理组(360、120、40IU/kg,n=15)。个体动物的失血值和每个处理组的中值失血的剂量反应曲线示于图19(A)中，并且每个处理组的中值失血体积概述于表18中。rFIXFc和BENEFIXTM的中值失血体积的剂量反应是可比较的(p=0.9315，利用非配对t检验和Welch's校正)。
为了确定rFIXFc相对于BENEFIXTM的延长3倍的半衰期是否导致rFIXFc的延长的疗效，本发明人在HemB小鼠的离体
Figure BDA00002795106000501
测定和尾静脉横断出血模型(Tail Vein Transection bleeding model)(TVT)中评估了rFIXFc和BENEFIXTM的疗效。图20。
对于离体
Figure BDA00002795106000502
雄性HemB小鼠通过静脉内注射接受50IU/kg的rFIXFc或100IU/kg的BENEFIXTM。在rFIXFc给药后5分钟、24、72、96、120、168和216小时(在每一个时间点上，n=8只小鼠)或在BENEFIXTM给药后5分钟、24、48、72和96小时(n=4只小鼠/时间点)从处理的动物的大静脉收集全血。立即利用NATEM分析血液样品。CT、CFT和α角的平均值和SD示于表19中，CT、CFT和α-角对时间曲线示于图21中。与BENEFIXTM相比较，rFIXFc在第5分钟显示了可比较的CT、CFT和α角，但在72小时后显示了显著增加的CT、CFT和α角，虽然其剂量比BENEFIXTM低2倍。
为了评估rFIXFc和BENEFIXTM的预防性疗效，按照体重和年龄的平等形式将雄性HemB小鼠分层至9个不同的处理组中。在进行尾静脉横断前72小时以4IU/kg、13IU/kg、40IU/kg和120IU/kg的剂量通过iv注射施用rFIXFc，然而在损伤之前24小时施用相同剂量的BENEFIXTM。在尾静脉横断之前，利用50mg/kg氯胺酮/0.125mg/kg右美托咪啶/0.1mg/kg丁丙诺啡的混合物麻醉小鼠。为了在尾静脉横断后允许小鼠维持正常活动，提供1mg/kg阿替美唑溶液以逆转右美托咪啶的作用，随后立即用直边11号手术刀片在其中尾巴的直径为约3mm的区域进行侧尾静脉横断。用温盐水洗掉流出的血液以确保清楚地观察到伤口，随后将小鼠单独地关养在用白纸铺垫的清洁的笼中，进行另外24小时。观察再出血和体力活动，每小时记录一次直至损伤后12小时。在鉴定后立即使垂死的小鼠安乐死，进行损伤后24小时的检定以完成研究。至安乐死的时间的卡普兰-迈耶曲线和TVT后24小时的存活率的图表示于图22中。对数秩检验(Log-ranktest)确定所有具有高于4IU/kg剂量的处理组比媒介物组显著更好(p<0.001)。此外，在损伤前72小时接受相同剂量的rFIXFc的小鼠之间的存活率是可比较的，对于在损伤前24小时接受BENEFIXTM的小鼠，情况亦如此(对于4、13、40和120IU/kg的剂量组，分别地p=0.4886、0.9268、0.7279和0.5209)。将TVT后24小时的存活率作图，从曲线外推每一种分子的ED50值，两个处理的ED50在17.8IU/kg(对于rFIXFc)和15.4IU/kg(对于rFIX)上是相似的。因此，rFIXFc在HemB小鼠中提供了相对于可比较的剂量的BENEFIXTM延长3倍的保持持续时间，如通过尾静脉横断损伤后的存活率和再出血测量的。因此，rFIXFc在HemB小鼠中提供了相对于可比较的剂量的BENEFIXTM延长3倍的保护持续时间，如通过尾静脉横断损伤后的存活率和再出血测量的。
总之，如数据显示的，虽然15.4IU/kg的BENEFIXTM导致50%的HemB小鼠活过在给药后24小时进行的尾静脉横断，但17.8IU/kg的rFIXFc获得50%的在给药后72小时遭受损伤的动物的存活率。因此，rFIXFc显示了相对于BENEFIXTM延长3倍的与其半衰期延长相关的预防性疗效。来自出血模型的结果通过来自利用100IU/kg的BENEFIXTM或50IU/kg的rFIXFc处理的HemB小鼠的全血的离体分析进一步证实。在给药后5分钟，在两个处理组中都观察到血块形成的可比较的促进。然而，主要
Figure BDA00002795106000522
参数例如凝血时间、血块形成时间和α-角在给药后72至216小时在rFIXFc-处理的小鼠中得到显著促进，虽然rFIXFc的剂量比BENEFIXTM低2倍。
简而言之，rFIXFc的急性疗效可与BENEFIXTM的急性疗效相比较，如在HemB小鼠的体外全血
Figure BDA00002795106000523
和断尾出血模型中显示的。rFIXFc的延长的预防性疗效示于来自处理的HemB小鼠的离体全血
Figure BDA00002795106000524
中并且其在HemB小鼠的尾静脉横断出血模型中被测定为BENEFIXTM的约3倍。rFIXFc的延长的疗效与先前在HemB小鼠的药代动力学研究中显示的rFIXFc相对于BENEFIXTM延长3倍的T1/2密切相关。因此，rFIXFc对于按需治疗具有完全活性，同时获得显著延长的预防性保护作用，潜在地减少了给药频率，这正处于3期研究的调查中。
实施例8.在FIX-缺陷型小鼠的单次皮下剂量后rFIXFc和BENEFIXTM的药代动力学和药效动力学分析
在于FIX-缺陷型小鼠中进行200或400IU/kg的单次静脉内或皮下注射后测定重组因子IX-Fc(rFIXFc)和BENEFIXTM(rFIX)的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)曲线。通过大静脉收集全血(n=4只小鼠/时间点/处理)。使用人FIX-特异性ELISA测定血浆的rFIXFc和BENEFIXTM浓度。使用激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定法测定rFIXFc和BENEFIXTM的活性。使用WinNonLin，利用模型依赖性方法进行PK分析。结果示于表22和23中。
对于FIXFc，FIX-缺陷型小鼠中的生物利用度为38%(对于200IU/kg的剂量)和38-46%(对于组合剂量)(抗原ELISA)，以及29%(对于200IU/kg的剂量)和29-39%(对于组合剂量)(aPTT活性测定)，而rFIX分别为23%和19%。rFIXFc具有与BENEFIXTM相比较提高至1.5-1.7倍(200IU/kg的剂量)和1.5-2.5倍(组合剂量)的生物利用度。
对于rFIXFc，终末半衰期(抗原ELISA)为62小时(对于200IU/kg的剂量)和51-62小时(对于组合剂量)，以及终末半衰期(aPTT活性测定)为42小时(对于200IU/kg的剂量)和40-42小时(对于组合剂量)，然而对于BENEFIXTM，终末半衰期为24小时(抗原ELISA)(对于200IU/kg的剂量)和17小时(aPTT活性测定)(对于200IU/kg的剂量)。这显示对于rFIXFc半衰期延长至2.5-2.6倍(200IU/kg的剂量和组合剂量)。
此外，如表22和23显示的，rFIXFc相对于BENEFIXTM具有增加至4.5-5.6倍的AUC/剂量和增加至1.9-3.7倍的Cmax/剂量。
重组因子IX Fc融合(rFIXFc)蛋白是重组FIX(rFIX)的长效形式，其将提供更低频率的rFIX给药来治疗B型血友病。从小鼠至非人灵长类动物以及在B型血友病患者中，rFIXFc具有相对于rFIX(BENEFIXTM)延长约3倍的半衰期。对于预防性治疗，rFIX的静脉内递送仍然是令人烦扰的递送方法，特别地对于儿童和在具有不易进入的静脉的患者中。rFIX的皮下施用呈现为侵袭性较小并且给药频率减少的更吸引人的递送途径。这样，rFIXFc的皮下递送将导致比静脉内递送更少的疼痛和不适，并且因比静脉内途径更容易施用和以更少次数施用而导致改善的顺从性。预防性方案还改善了生活质量并且临床结果将包括减少的出血发病率。
使用人FIX特异性ELISA测量小鼠血浆的rFIXFc浓度，所述ELISA测量分子的FIX部分，将mg/kg标称剂量用于分析。rFIXFc和BENEFIXTM的PK参数的概述示于表20(抗原ELISA)和表21(aPTT活性测定)中，n=4/组。抗原和活性的分析都显示rFIXFc的Cmax和AUC相对于BENEFIXTM都得到显著增加。通过使用抗原ELISA，相对于BENEFIXTM的23%，rFIXFc的生物利用度(F%)为38%。类似地，通过使用aPTT活性测定，相对于BENEFIXTM的19%，rFIXFc的生物利用度为29%。因此，rFIXFc显示生物利用度增加至BENEFIXTM的1.5至1.6倍。消除半衰期的测量显示rFIXFc显著延长半衰期，无论是通过抗原测定(rFIXFc62小时对BENEFIXTM24小时)还是通过活性测定(rFIXFc42小时对BENEFIXTM17小时)测定测量的。这些数据显示rFIXFc具有为BENEFIXTM的2.6至2.5倍的延长的半衰期。
皮下施用至FIX-缺陷型小鼠的rFIXFc显示rFIXFc与BENEFIXTM相比较的Cmax和AUC均增加的PK和PD曲线。总体上，与具有19-23%的生物利用度和17-24%的半衰期的BENEFIXTM相比较，rFIXFc分别具有29%(活性)至38%(抗原)的生物利用度和42小时(活性)至62小时(抗原)的半衰期。因此，FIX-缺陷型小鼠中皮下递送的rFIXFc的半衰期显示增加至静脉内提供的目前销售的rFIX产品的约2.2倍(抗原)至3.3倍(活性)。总体上，这些数据支持皮下递送的rFIXFc对于B型血友病患者的预防性治疗可具有临床益处的概念。
实施例9.在食蟹猴中单次皮下给药后rFIXFc的药代动力学分析
在食蟹猴中50IU/kg、100IU/kg或200IU/kg的单次皮下给药后研究重组因子IX-Fc(rFIXFc)的药代动力学(PK)曲线。使用FIX-特异性ELISA测量血浆的rFIXFc浓度。使用WinNonLin，利用模型依赖性方法进行初步分析。参见表22-25。
血浆浓度对时间数据(通过FIX-特异性ELISA测量的)的药代动力学分析显示生物利用度和终末半衰期在剂量间是相似的。rFIXFc的生物利用度为40%(50IU/kg)、34%(100IU/kg)、36%(200IU/kg)和36-45%(组合剂量)。rFIXFc的终末半衰期为61小时(50IU/kg)、45小时(100IU/kg)、49小时(200IU/kg)和44-58小时(组合剂量)。
使用人FIX特异性ELISA测量猴血浆的rFIXFc浓度，所述ELISA测量分子的FIX部分，将mg/kg标称剂量用于分析。加标回收(Spikeand recovery)分析显示该FIX特异性ELISA测定用于在评估的血浆浓度范围内检测rFIXFc的精确度。rFIXFc的PK参数的概述示于表22(50IU/kg)、表23(100IU/kg)和表24(200IU/kg)中，n=3只/组。对于rFIXFc SC，Cmax的几何平均值和几何平均值的CV%为860+22(50IU/kg)、1630+97(100IU/kg)和3,750+26(200IU/kg)，各自显示剂量依赖性增加。对于AUC看到类似的增加。生物利用度(F%)的几何平均值为40+16(50IU/kg)、30+75(100IU/kg)和36+27(200IU/kg)，显示了生物利用度在剂量间是相似的。终末半衰期的测量显示半衰期在剂量之间(58+39小时(50IU/kg)、45+13小时(100IU/kg)和46+44小时(200IU/kg))是相似的。
皮下施用至食蟹猴的rFIXFc显示具有Cmax和AUC的剂量依赖性增加的PK曲线。总体上，生物利用度为30-40％，半衰期为45-58小时。因此，猴子中皮下递送的rFIXFc的半衰期显示增加至静脉内提供的目前销售的rFIX产品的约2.8倍。总体上，这些数据支持皮下递送的rFIXFc对于B型血友病患者的预防性治疗可具有临床益处的概念。
实施例10.预测的预防性给药方案
与标准推荐的每周2次或3次的25至40IU/kg的FIX的给药方案相比较，来自上述1/2a期研究的中值rFIXFc活性的PK结果显示，以约22.5IU/kg约每周1次或以约45IU/kg约每10天1次或以约120IU/kg约每2周1次的rFIXFc给药足以维持高于基线1%的波谷(图24)。这些模型模拟评估得到可从1/2a期试验获得的数据验证，其完全落在随时间过去的活性的模拟曲线(simulated activity-over-timecurve)的95%置信区间内。这些方案通常在疗法开始时使用。鉴于相对于血浆FIX活性的波谷水平的报道的临床穿破性出血事件的异质性(heterogeneity)，需要个别地调整维持剂量。
在重新计算1/2期研究的PK结果(参见实施例11)后，新型预测的给药方案(例如用于预防)为每周1次20IU/kg、每10天1次40IU/kg或每2周1次(每月2次)100IU/kg。也参见表27和图25。
实施例11.来自首次应用于人体的(FiH)的研究(实施例1)的药代动力学数据的重新计算
具有多种B型血友病基因型例如终止密码子/无义和错义突变的受试者，包括在实施例1中描述的FiH研究中。几个受试者具有与显著减少的FIX活性相关的显著降低的内源性FIX抗原水平，然而具有错义基因型的少数受试者具有比测量的活性更多的抗原，这显示了功能失调的循环蛋白质。2个受试者中的治疗前FIX活性超过2IU/dL，这可能归因于从基于历史测试和疾病表型的他们最后一次FIX浓缩物输注的不完全冲洗。基于该信息，在不扣除基线的情况下重新计算来自实施例1的PK数据，这在下面进行了详细地描述。参见表27。
与实施例1的PK计算(基于活性)相反，如果在不扣除基线的情况下建立rFIXFc活性PK的模型，如最近对于糖基PEG化（glycoPEGylated）的rFIX的PK分析所报道的(Negrier等人,BloodDOI10.1182/blood201102335596(2011)，将其通过引用整体并入本文)，所得的消除半衰期和MRT的评估比实施例1中的评估长得多，分别地为82.2±21.6小时和96.8±22.0小时(平均值±SD)。然而，应理解并非所有重度B型血友病患者都具有0%的内源FIX活性，并且考虑到患者的基因型和内源FIX抗原水平，本发明人在其PK建模中采用基线扣除分析法。具体地，(a)2个患者的基线被确定为0%，因为它们的治疗前FIX活性<1%，它们不具有可检测的FIX抗原并且具有无义基因型，(b)将3个患者的基线设置在0.5%，因为它们的治疗前FIX活性<1%并且它们具有可检测的FIX抗原，(c)对于其治疗前FIX活性在1–2%之间的患者，Cmin(在整个PK研究中最低的活性)被确定为基线，以及(d)对于其治疗前FIX活性≥2%的患者，2%(其为试验招募的上限)为基线。高于给药前基线的活性被认为是来自先前治疗的残留药物，使其衰减至基线，并且在rFIXFc给药后将其从PK数据扣除。
所得的rFIXFc的平均终末半衰期(56.7±10.9小时，范围为42.4–74.5小时)和MRT(71.8±10小时,范围为53.2-85.9小时)约为对于rFIX所报道的3倍。报道的rFIX的终末半衰期为19.3±4.97小时(范围为11.1-36.4小时)以及MRT为26.0±6.07小时(范围为15.8-46.1小时)。Roth等人,Blood98:3600-3606(2001)；和Summary of ProductCharacteristics for BENEFIXTM,Electronic MedicinesCompendium(2010)
(http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20376/SPC/BENEFIXTM/#PHARMACODYNAMIC_PROPS)，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文。因此，rFIXFc的范围不与rFIX的范围重叠。类似地，rFIXFc活性的平均CL(3.18±0.78mL/hr/kg，范围为2.05-4.18mL/hr/kg)比对于rFIX所报道的活性的平均CL(8.40±2.01mL/hr/kg，范围为4.66-13.64mL/hr/kg)低2.6倍，虽然两种蛋白质的Vss在4-5倍血浆体积上是可比较的。
虽然在rFIXFc抗原PK中观察到朝向提高的相同趋势，但rFIXFc抗原的T1/2α和T1/2β都显著比来源于FIX活性测量的更长。针对rFIXFc抗原估计的T1/2α明确地偏离通常与FIX相关的T1/2α(23小时)。此外，在rFIXFc的输注之前可能的从研究前替代疗法的不完全冲洗有时导致更高的基线值，这反过来可导致rFIXFc T1/2β的低估，如通过FIX活性测量的。许多受试者在达到给药后336小时(14天)的更晚的时间点上具有高达3IU/dL的aPTT活性，充分高于aPTT测定的定量检出限(1IU/dL)。然而，从终末半衰期的评估除去这些时间点，因为所述值处于治疗前基线或仅略高于治疗前基线，因此被认为已返回至基线。相反地，rFIXFc的较低但可检测的终末期水平可利用特异性且高灵敏性rFIXFc抗原ELISA来显示，所述ELISA可检测与1.0IU/dl的aPTT下限相比较低至0.1IU/dL。
剩余的PK参数(活性)相对于消除半衰期和MRT发生少量改变。参见表27(B)。基于在输注后立即产生的Cmax和AUCINF(表4)观察到FIX活性的与剂量成比例的线性增加。FIX活性在输注rFIXFc后显示双指数衰减，特征在于快速分布(α)期，随后对数-线性消除(β)期。对于单个受试者平均分布半衰期(T1/2α)是高度可变的(对于两个更高的剂量组平均为3.4和10.3小时)(表27(B))。平均消除半衰期(T1/2β)在测试的治疗性剂量范围内是不依赖于剂量的，即在25IU/kg、50IU/kg和100IU/kg时分别为53.5小时、57.5±8.2小时和56.5±14.1小时。达到高于基线1%(1IU/dL)的时间(rFIXFc活性的评估)显示与剂量成比例的增加。其对于25、50和100IU/kg的剂量分别为7.3、10.1±1.5和12.3±2.5天。在给药后168小时(1周)，对于25、50和100IU/kg的剂量组，血浆FIX活性分别保持在高于基线的1.1IU/dL、2.5±0.9IU/dL和4.6±1.7IU/dL。在25至100IU/kg的剂量范围内MRT、CL和Vss也不是剂量依赖性的。此外，每个1IU/kg的输注的rFIXFc使血浆FIX活性平均升高0.93±0.18IU/dL(表27(B))，并且该增量恢复(K)显示微弱的与体重的正相关性(R2=0.336,p=0.048)。
长期经验性临床经验已显示低至1至2IU/dL的持续血浆因子活性足以防止重度A型和B型血友病患者的自发性出血事件(Nilsson等人,J. Intern.Med.232:25-32(1992)，将该文献通过引用整体并入本文)，增加的出血事件与低于1%的正常FVIII活性的时间量相关。Collins等人,Thromb Haemost7:413-420(2009)，将其通过引用整体并入本文。因此，PK分析提供了利用个体化剂量建模最优化预防性治疗以获得持续的高于基线1%(1IU/dL)的波谷水平，减少峰/谷变化和提高治疗的成本效益。Carlsson等人,Haemophilia4:83-88(1998)；Kisker等人,Haemophilia9:279-284(2003)，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文。
为了构建在不同的给药方案后浓度-时间曲线，使用rFIXFc的群体PK模型进行蒙特卡罗模拟。测试群体的模型参数(CL、分布体积、隔室间清除率和第二隔室的体积)、个体间差异和残留差异性的平均评估被采用于该1/2a期研究。Wang等人,J. Clin.Pharmacol.49:1012-1024(2009)，将其通过引用整体并入本文。每给药方案模拟1000个受试者，每一个受试者使用14至16个采样点。对于每周1次的给药采用14个采样点，对于每10天1次的给药采用15个采样点，对于隔周1次的给药采用16个采样点。按照公开的方法即，基于Z=BW-0.5的乘幂方程产生体重(BW)，Wang等人(2009)。假定1000个受试者的中值BW为75kg。基于模拟的浓度-时间曲线，用图为不同给药方案构建1000个受试者的药物浓度-时间曲线的平均值±标准误差(SD)。图25。
与标准推荐的每周2次的25至40IU/kg的FIX的给药方案相比较，来自本研究的中值rFIXFc活性PK建模结果显示，以20IU/kg每周1次的rFIXFc给药或以40IU/kg每10天1次的rFIXFc给药或以100IU/kg每2周1次的rFIXFc给药足以维持高于基线1%的波谷。图25。这些模型模拟评估得到可从该1/2a期研究获得的数据验证，其完全落在随时间过去的活性的模拟曲线的95%的置信区间内。然而，鉴于相对于血浆FIX活性的波谷水平的报道的临床突破性出血事件的异质性(Bjorkman,Haemophilia9:101-110(2003)；Ahnstrom等人,Haemophilia10:689-697(2004)，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)，需要个别地调整维持剂量。
表
表1：多核苷酸序列：FIx-Fc
A．FTX-Fc链DNA序列(SEQ ID NO：1，其编码SEQ ID NO：2)
pSYN-FIX-030核苷酸序列(nt1至7583)：
FIX外显子1(信号肽，第1个氨基酸前肽)：nt690-777
FIX最小内含子：nt778-1076
FIX前肽序列：nt1077-1126
成熟FIX序列：nt1127-2371
Fc：nt2372-3052
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agctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtc
ggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaa
aataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcca
B.Fc DNA序列(小鼠Igκ信号肽以下划线标示)(SEQ ID NO：3，其编码SEQ ID NO：4)。这是来自pSYN-FIX-030的Fc盒。此外，在pSYN-Fc-015中存在被转化入 细胞系的单独的Fc表达盒，所述表达盒编码相同的氨基酸序列，但包含少数非编 码变化。Fc编码序列的第二拷贝使得能够产生更好的单体：二聚体比率。
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgcgatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
表2：多肽序列
FIX-Fc单体杂合体：通过共表达FIX-Fc和Fc链产生的。
A.FIX-Fc链(SEQ ID NO：2)：
(28个氨基酸的信号序列以下划线标示，18个氨基酸的前肽以双下划线标示，Fc部分以斜体字标示)。C末端赖氨酸不存在于任一亚单位中；通常在于哺乳动物细胞培养物中产生的重组蛋白质中以及对于血浆源性蛋白质观察到该加工。
FIXFC-SC亚单位：
FIX信号肽：-46 MQRVNMIMAE SPGLTTICLLGYLLSAEC
Figure BDA00002795106000621
1YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDDDQ
51CESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCK
101NSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVF
151PDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNG
201KVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNV
251IRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFL
301KFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFC
351AGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTK
401VSRYVNWIKEKTKLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
451TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
501LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAGQPREPPQVYTLPPSR
551DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
601LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
B.Fc链(SEQ ID NO：4)
20个氨基酸的异源小鼠Igκ轻链信号肽(以下划线标示的)：
-20METDTLLLWVLLLWVPGSTG
成熟Fc序列(相应人IgGl的氨基酸221至447，EU编号)
1DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
51PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
101CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
151GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
201NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表3.个体患者的FIXFc抗原浓度对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的
Figure BDA00002795106000641
表3.个体患者的FIXFc抗原浓度对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的(续表)
Figure BDA00002795106000651
表3.个体患者的FIXFc抗原浓度对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的(续表)
Figure BDA00002795106000661
表4.个体患者和组的平均FIXFc抗原的药代动力学总结数据
Figure BDA00002795106000671
*组合12.5-100IU/kg剂量的CL、Vss、MRT、T1/2α和T1/2β分别为2.30±0.46(1.51-2.72)；250±58.2(156-366)；110±18.5(84.5-144)；12.0±4.0(10.1-18.6，不包括其PK参数是利用非隔室模型分析测定的两个患者)；和101±20.9(78-140)。归因于四舍五入或其它误差的校正，(a)应当为207,000，以及(b)应当为0.468,(c)应当为52.1。
表5.个体患者和组的平均FIXFc活性和基线校正的FIXFc活性对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的
Figure BDA00002795106000681
注意：以粗体表示的数据代表至基线的返回并且从分析排除。
表5.个体患者和组的平均FIXFc活性和基线校正的FIXFc活性对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的(续表)
Figure BDA00002795106000691
注意：以粗体表示的数据代表至基线的返回并且从分析排除。
表5.个体患者和组的平均FIXFc活性和基线校正的FIXFc活性对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的(续表)
Figure BDA00002795106000701
注意：以粗体表示的数据代表至基线的返回并且从分析排除。
表5.个体患者和组的平均FIXFc活性和基线校正的FIXFc活性对时间数据；按标称剂量、实际剂量、输注持续时间和患者人数分选的(续表)
注意：以粗体表示的数据代表至基线的返回并且从分析排除。
表6.个体患者和组的平均FIXFc活性的药代动力学总结数据；按标称剂量、实际剂量和患者人数分选的
Figure BDA00002795106000721
归因于四舍五入或其它误差的校正，(a)应当为8.98，(b)应当为8.23，(c)应当892，以及(d)应当为42.2。
表7A-7B.个体患者和组的平均FIXFc活性的次要药代动力学总结数据；按标称剂量、实际剂量和患者人数分选的
Figure BDA00002795106000731
aC168=在给药后约168小时高于基线的估计的FIX活性。从使用单室模型和患者微观速度常数进行的模拟估计以斜体字表示的值。
bTBLP1=当FIX活性已降至高于基线约1IU/dL时的模型预测的给药后时间。从使用单室模型和患者微观速度常数进行的模拟估计以斜体字表示的值。
cTBLP3=当FIX活性已降至高于基线约3IU/dL时的模型预测的给药后时间。
dTBLP5=当FIX活性已降至高于基线约5IU/dL时的模型预测的给药后时间。
eK-值使用从扣除本底的结果产生的模型预测的Cmax值除以剂量来进行计算。
f使用观察到的最大给药后样品结果计算K-值；K-值=(观察到的扣除基线的Cmax)/剂量)。
g体内恢复=100×(来自扣除基线的数据的模型预测的Cmax/剂量)×血浆体积(dL)/以IU计的剂量；其中以mL计的血浆体积=(23.7×以cm计的Ht)+(9.0×以kg计的Wt)-1709.
h体内恢复=100×(扣除基线的观察到的Cmax)×血浆体积(dL)/以IU计的剂量；其中以mL计的血浆体积=(23.7×以cm计的Ht)+(9.0×以kg计的Wt)–1709.
表7B
表8.1/2a期研究：rFIXFc和BENEFIXTM的PK参数的比较
Figure BDA00002795106000761
*来自标称剂量25、50和100IU/kg的FIX活性的双隔室分析的评估(n=11)
BENEFIXTM的产品特征的概述(2009年11月18日)；中值和范围(n=56)
a.因四舍五入或其它误差校正的范围为0.63–1.18。
与BENEFIXTM、rFIX-Fc的历史数据相比较显示：
-半衰期和平均停留时间的延长3x
-24%的增加的相对增量恢复
-减少2.5x的清除率
表9.1/2a期研究：rFIXFc(活性)的Cmax和AUC的与剂量成比例的增加
Figure BDA00002795106000763
也参见图5.
表10A-10B.在50和100IU/kg剂量下的rFIXFc的估计的治疗持续时间
Figure BDA00002795106000764
Figure BDA00002795106000771
也参见图6A-6B.
表11.rFIXFc抗原的Cmax和AUC的与剂量成比例的增加
Figure BDA00002795106000772
也参见图7。
表12.rFIXFc抗原的药代动力学评估
Figure BDA00002795106000773
也参见图8A-8B。
表13.基于活性的平均PK值
Figure BDA00002795106000781
Figure BDA00002795106000791
脚注：
注意:利用双隔室法测定PK参数。
Geo.Mean=几何平均值
[1]C168=给药后168小时高于基线的FIX活性。
[2]TBLP1=当FIX活性已降至高于基线1IU/dL时估计的给药后时间。
[3]TBLP3=当FIX活性已降至高于基线3IU/dL时估计的给药后时间。
[4]TBLP5=当FIX活性已降至高于基线5IU/dL时估计的给药后时间。
[5]使用从扣除本底的结果产生的模型预测的Cmax除以剂量来计算增量恢复。
[6]使用观察到的最大给药后样品结果计算增量恢复；
增量恢复=(观察到的扣除基线的Cmax)/剂量。
[7]体内恢复=100x(来自扣除基线的数据的模型预测的Cmax/剂量)x血浆体积(dL)/以IU计的剂量；
其中以mL计的血浆体积=(23.7x以cm计的Ht)+(9.0x以kg计的Wt)-1709.
[8]体内恢复=100x(观察到的扣除基线的Cmax)x血浆体积(dL)/以IU计的剂量；其中以mL计的血浆体积=(23.7x以cm计的Ht)+(9.0x以Kg计的Wt)-1709。
表14.基于抗原水平的平均PK值
Figure BDA00002795106000801
归因于四舍五入或其它误差的校正，(a)应当为0.46，(b)应当为110，(c)应当12.0，(d)应当为3.95，以及(e)应当为101。
表15：因子IX的生物化学表征
Figure BDA00002795106000811
表16：在施用单次静脉内剂量后FIXFc和BENEFIXTM的终末半衰期的概述.
Figure BDA00002795106000821
*Brinkhous等人,Blood,1996；88：2603-2610
Figure BDA00002795106000822
McCarthy等人,2002,Thromb Haemost,2002；87：824-830
表17.掺入混合的HemB小鼠全血的rFIXFc和BENEFIXTM的体外参数的概述
Figure BDA00002795106000832
表18.在用rFIXFc或BENEFIXTM处理的HemB小鼠的断尾后中值失血
Figure BDA00002795106000833
表19.用rFIXFc和BENEFIXTM处理的HemB小鼠的离体
Figure BDA00002795106000834
参数
Figure BDA00002795106000835
表20A.在FIX-缺陷型小鼠中皮下注射单次剂量后rFIXFc和BENEFIXTM(200IU/kg)的PK参数(抗原ELISAl
表20B.在FIX-缺陷型小鼠中皮下注射单次剂量后rFIXFc和BENEFIXTM(200 IU/kg)的PK参数(aPTT活性测定)
Figure BDA00002795106000841
表21.在FIX-缺陷型小鼠中皮下单次剂量后rFIXFc和BENEFIXTM的PK和PD分析.
Figure BDA00002795106000851
表22.在食蟹猴中皮下注射单次剂量后rFIXFc(50IU/kg)的PK参数
表23.在食蟹猴中皮下注射单次剂量后rFIXFc(100IU/kg)的PK参数
Figure BDA00002795106000862
表24.在于食蟹猴中皮下注射单次剂量后rFIXFc(200IU/kg)的PK参数
表25.在食蟹猴的单次皮下剂量后rFIXFc的PK分析
Figure BDA00002795106000871
对于rFIXFc，范围为35.5至44.5%的生物利用度
对于rFIXFc，范围为43.8至57.9小时的消除半衰期
表26.用于B型血友病的rFIXFc疗法的给药指导
患者应当咨询他们的医生，但应当在初始剂量后24-48小时以后仅采用1个随访剂量。
表27A和27B.使用(A)实施例1和(B)实施例11中的计算的数据的比较
A
B
显示的结果为平均值±SD，范围列于括号中
Cmax表示最大浓度；AUCINF，曲线下面积(时间0外推至无限时间)；CL，清除率；Vss，处于稳态时的分布的体积；MRT，平均停留时间；T1/2α，分布半衰期；T1/2β，消除半衰期；NA，不适用的
*使用观察到的扣除治疗前基线值的Cmax除以剂量来计算增量恢复
Figure BDA00002795106000902
给药后168小时(7天)时高于基线的血浆FIX活性
Figure BDA00002795106000903
当FIX活性降至高于受试者的基线1IU/dL时的模型预测的给药后时间
§数据是不适用的，因为参数是剂量依赖性的，因此不能跨不同剂量组计算平均值和SD值

Claims (121)

1.一种将因子IX施用给需要其的人受试者的方法，其包括以约每周1次或更长的给药间隔给所述受试者施用剂量为至少约25IU/kg的包含因子IX和FcRn结合伴侣(FcRn BP)的嵌合多肽。
2.一种将因子IX施用给需要其的人受试者的方法，其包括以约每周1次或更长的给药间隔给所述受试者施用剂量为至少约10或至少约20IU/kg的包含因子IX和FcRn结合伴侣(FcRn BP)的嵌合多肽。
3.一种将因子IX施用给需要其的人受试者的方法，其包括给以约每周1次或更长的给药间隔给所述受试者施用剂量为至少约10IU/kg的包含因子IX和XTEN的嵌合多肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的血浆水平在至少约6天后在至少约80%的患者群体中达到至少约1IU/dl的波谷或在至少约6天后在所述受试者中达到至少约1IU/dl的波谷。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的血浆水平达到
在患者群体中约1-5IU/dl的平均波谷；或
在所述受试者中约1-5IU/dl的波谷。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述剂量中少于25%的所述因子IX嵌合多肽被完全磷酸化并且所述剂量中少于25%的所述因子IX嵌合多肽被完全硫酸化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述剂量中少于约10%的所述嵌合多肽被磷酸化并且所述剂量中少于约9%的所述嵌合多肽被硫酸化。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述剂量具有大于0.75IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察值)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂量具有至少约0.8、至少约0.9或至少约1IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察值)。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽显示所述患者群体或所述受试者的一个或多个药代动力学参数，所述参数选自：
约3.36±0.93mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
约3.0-3.72、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7或3.72mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
比包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的清除率低约2.5倍的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
约1.84-4.58mL/hr/kg的所述受试者的清除率(CL)(活性)
至少约68.05±11.16小时的所述患者群体的平均平均停留时间(MRT)(活性)；
约60-78、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78小时的所述患者群体的平均MRT(活性)；
为包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均MRT的约3倍长的所述患者群体的平均MRT(活性)；
约53.1-85.8小时的所述受试者的平均停留时间(MRT)(活性)；
至少约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90小时的所述受试者的平均停留时间(MRT)(活性)；
约52.5±9.2小时的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；
为约47-60小时、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60小时的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；为包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均t1/2β的约3倍长的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；
约40-67.4、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70或约75小时的所述受试者的t1/2β(活性)；
约0.93±0.18IU/dL每IU/kg的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；
约0.85-1.15、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99、约1.0、约1.05、约1.10或约1.15IU/dL每IU/kg的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；
比包含所述因子IX但无所述FcRN BP的多肽的平均增量恢复高约24%的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；
约0.62-1.17IU/dL每IU/kg的所述受试者的增量恢复(K值)(活性；观察值)；
约226±67.76mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；
约200-300、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；
约145-365mL/kg的所述受试者的Vss(活性)；
约32.44±10.75IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体的平均AUC/剂量(活性)；
约26-40、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体的平均AUC/剂量(活性)；
约21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg的所述受试者的AUC/剂量。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述给药间隔为6-10天。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量选自约25-110、约30-110、约40-110、约50-110、约60-110、约70-110、约80-110、约90-110和约100-110IU/kg。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量选自约30-100、约30-90、约30-80、约30-70、约30-60、约30-50和约30-40IU/kg。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量选自约40-110、约50-100、约60-90和约70-80IU/kg。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量选自约40-50、约50-60、约60-70、约70-80、约80-90、约90-100和约100-110IU/kg。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量选自约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105和约110IU/kg。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约7-10、约7-9和约7-8天。
18.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约8-10和约9-10天。
19.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约6-7和约8-9天。
20.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约6、约7、约8、约9和约10天。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量为约30-50IU/kg并且所述给药间隔为约7天。
22.根据权利要求4-21中任一项所述的方法，其中在至少约90%的所述患者群体中达到所述波谷。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在约100%的所述患者群体中达到所述波谷。
24.根据权利要求1-11、22和23中任一项所述的方法，其中所述剂量为约50IU/kg，并且所述给药间隔为约7天。
25.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中所述剂量为约50IU/kg，所述给药间隔为约7天，并且在约100%的所述患者群体中达到所述波谷。
26.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述给药间隔为9-18天。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量选自约90-180、约100-180、约110-180、约120-180、约130-180、约140-180、约150-180、约160-180和约170-180IU/kg。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量选自约90-170、约90-160、约90-150、约90-140、约90-130、约90-120、约90-110和约90-100IU/kg。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量选自约100-170、约110-160、约120-150和约130-140IU/kg。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量选自约90-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160和约160-170IU/kg。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量选自约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175和约180IU/kg。
32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约9-17、约9-16、约9-15、约9-14、约9-13、约9-12、约9-11和约9-10天。
33.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约10-18、约11-18、约12-18、约13-18、约14-18、约15-18、约16-18和约17-18天。
34.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约10-11、约11-12、约12-13、约13-14、约14-15、约15-16和约16-17天。
35.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述给药间隔选自约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17和约18天。
36.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量为约100IU/kg并且所述给药间隔为至少约12天。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述波谷在至少约70%、约80%或约90%的所述患者群体中为至少约1IU/dl。
38.根据权利要求26所述的方法，其中所述给药间隔为约12-13天。
39.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量为约100IU/kg并且所述给药间隔为至少约9天。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述波谷在约100%的所述患者群体中为至少约1IU/dl。
41.根据权利要求26或39所述的方法，其中所述给药间隔为约9-15天。
42.根据权利要求26所述的方法，其中所述剂量为约150IU/kg并且所述给药间隔为至少约14天。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述波谷在约100%的所述患者群体中为至少约1IU/dl。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述受试者需要控制或预防出血或出血事件。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述受试者需要控制或预防少量出血、关节积血、表浅肌肉出血、软组织出血、中度出血、解剖造成的骨内或软组织出血、粘膜出血、血尿、大出血、咽出血、咽后部出血、腹膜后腔出血、中枢神经系统出血、瘀伤、切伤、刮擦、关节出血、鼻出血、口出血、牙龈出血、颅内出血、腹膜内出血、少量自发性出血、重度创伤后出血、中度皮肤擦伤或至关节、肌肉、内脏器官或脑中的自发性出血。
46.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述受试者需要围手术期管理。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者需要与手术或拔牙相关的出血的管理。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者将经历，正在经历或已经历大手术。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述大手术为矫形手术、广泛的口腔手术、泌尿外科手术或疝气手术。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述矫形手术是膝关节、髋关节或其它主要关节的置换。
51.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。
52.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述受试者需要按需治疗。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述受试者需要治疗出血事件。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者需要治疗出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血、出血至肌内、口腔出血、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内出血、腹腔内出血、胸内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试者需要手术预防、围手术期管理或手术治疗。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、全膝置换、穿颅术、骨接合术、创伤手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽中的因子IX为人因子IX。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述因子IX为突变型因子IX。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述FcRn BP为人Fc。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中嵌合多肽中的所述FcRn BP为突变型Fc。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述因子IX与表2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至415)具有至少90%或95%的同一性。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述因子IX与表2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至415)完全相同。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述Fc与表2B中显示的不具有信号序列的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)具有至少90%或95%的同一性。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述Fc与表2B中显示的不具有信号序列的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)完全相同。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽以包含与所述嵌合多肽缔合的第二多肽的杂合体的形式存在，其中所述第二多肽包含FcRn BP。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX和Fc氨基酸序列(SEQID NO:2的氨基酸1至642)具有至少90%或95%的同一性的序列。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX和Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至642)完全相同的序列。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中所述第二多肽包含与表2B中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)具有至少90%或95%的同一性的序列。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述第二多肽包含与表2B中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)完全相同的序列。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述患者需要以每周1次或更长的给药间隔进行的长期治疗。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中将所述嵌合多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分施用。
73.一种多肽，其包含与表2A中显示的不包含信号序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至415)具有至少90%或95%的同一性的因子IX，和FcRn BP。
74.根据权利要求73所述的多肽，其中所述因子IX与表2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至415)完全相同。
75.一种多肽，其包含与表2A中显示的具有信号序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-46至415)具有至少90%或95%的同一性的因子IX，和FcRn BP。
76.根据权利要求75所述的多肽，其中所述因子IX与表2A中显示的具有信号序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-46至415)完全相同。
77.根据权利要求73-65中任一项所述的多肽，其中所述FcRn BP与表2B中显示的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)具有至少90%或95%的同一性。
78.根据权利要求77所述的多肽，其中所述Fc与表2B中显示的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)完全相同。
79.根据权利要求73或75所述的多肽，其包含与表2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至642)具有至少90%或95%的同一性的序列。
80.根据权利要求79所述的多肽，其包含与表2A中显示的不具有信号序列和前肽的因子IX和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至642)完全相同的序列。
81.根据权利要求73-80中任一项所述的多肽，其以包含第二多肽的杂合体的形式存在，其中所述第二多肽包含FcRn BP。
82.根据权利要求81所述的多肽，其中所述第二多肽包含与表2B中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)具有至少90%或95%的同一性或与表2B中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20至227)具有至少90%或95%的同一性的序列。
83.根据权利要求81所述的多肽，其中所述第二多肽包含与表2B中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至227)完全相同或与表2B中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQID NO:4的氨基酸-20至227)具有至少90%或95%的同一性的序列。
84.根据权利要求73-83中任一项所述的多肽，其与血浆源性因子IX相比较具有大幅减少的磷酸化和硫酸化。
85.根据权利要求84所述的多肽，其少于约10%被磷酸化并且少于约9%被硫酸化。
86.根据权利要求73-85中任一项所述的多肽，其具有大于0.7或0.75的K值。
87.根据权利要求86所述的多肽，其具有至少约0.8、至少约0.9或至少约1的K值。
88.根据权利要求73-87中任一项所述的多肽，其显示所述患者群体或所述受试者的一个或多个药代动力学参数，所述参数选自：
约3.36±0.93mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
约3.0-3.72、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7或3.72mL/hr/kg的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
比包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的清除率低约2.5倍的所述患者群体的平均清除率(CL)(活性)；
约1.84-4.58mL/hr/kg的所述受试者的清除率(CL)(活性)
至少约68.05±11.16小时的所述患者群体的平均平均停留时间(MRT)(活性)；
约60-78、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78小时的所述患者群体的平均MRT(活性)；
为包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均MRT的约3倍长的所述患者群体的平均MRT(活性)；
约53.1-85.8小时的所述受试者的平均停留时间(MRT)(活性)；
至少约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90小时的所述受试者的平均停留时间(MRT)(活性)；
约52.5±9.2小时的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；
为约47-60小时、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60小时的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；为包含所述因子IX但无所述FcRn BP的多肽的平均t1/2β的约3倍长的所述患者群体的平均t1/2β(活性)；
约40-67.4、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70或约75小时的所述受试者的t1/2β(活性)；
约0.93±0.18IU/dL每IU/kg的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；
约0.85-1.15、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99、约1.0、约1.05、约1.10或约1.15IU/dL每IU/kg的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；
比包含所述因子IX但无所述FcRN BP的多肽的平均增量恢复高约24%的所述患者群体的平均增量恢复(K值)(活性；观察值)；
约0.62-1.17IU/dL每IU/kg的所述受试者的增量恢复(K值)(活性；观察值)；
约226±67.76mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；
约200-300、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；
约145-365mL/kg的所述受试者的Vss(活性)；
约32.44±10.75IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体的平均AUC/剂量(活性)；
约26-40、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体的平均AUC/剂量(活性)；
约21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg的所述受试者的AUC/剂量。
89.一种多核苷酸，其编码根据权利要求73-80中任一项所述的多肽。
90.一种多核苷酸，其编码因子IX-FcRn BP多肽和根据权利要求81-88中任一项所述的第二多肽。
91.根据权利要求89或90所述的多核苷酸，其为载体、质粒、噬菌体或病毒。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的多核苷酸，其为DNA或RNA。
93.一种培养的人胚胎细胞，其包含根据权利要求89-92中任一项所述的多核苷酸。
94.根据权利要求93所述的细胞，其为HEK293细胞。
95.一种产生因子IX-FcRn BP杂合蛋白的方法，其包括：
在允许所述编码的因子IX-FcRn BP嵌合多肽和基本上由FcRnBP组成的编码的多肽表达的条件下培养根据权利要求93或94所述的细胞；和
回收所述编码的因子IX-FcRn BP杂合蛋白。
96.一种杂合蛋白，其通过根据权利要求95所述的方法产生。
97.根据权利要求96所述的杂合蛋白，其与血浆源性因子IX相比较具有大幅减少的磷酸化和硫酸化。
98.根据权利要求97所述的杂合蛋白，其少于约10%被磷酸化并且少于约9%被硫酸化。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的杂合蛋白，其具有大于0.7或0.75的K值。
100.根据权利要求99所述的杂合蛋白，其具有为至少约8、约9或约1的K值。
101.根据权利要求66-72中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽以杂合体的形式存在，其中所述杂合体基本上由所述嵌合多肽的单链和所述第二多肽的单链组成，并且其中所述链通过(a)非共价相互作用、(b)两个二硫键或(c)(a)和(b)两者缔合。
102.根据权利要求81-88和96-100中任一项所述的多肽，其中所述嵌合多肽以杂合体的形式存在，其中所述杂合体基本上由所述嵌合多肽的单链和所述第二多肽的单链组成，并且其中所述链通过(a)非共价相互作用、(b)两个二硫键或(c)(a)和(b)两者缔合。
103.一种重组因子IX(rFIX)制剂，其在人中具有大于0.75IU/dL每IU/kg的增量恢复(K-值)并且其中所述制剂中少于25%的rFIX被完全磷酸化和硫酸化。
104.根据权利要求103所述的rFIX制剂，其具有至少约0.8、至少约0.9或至少约1IU/dL每IU/kg的增量恢复(K-值)。
105.根据权利要求103所述的rFIX制剂，其中所述rFIX包含FcRn BP。
106.根据权利要求105所述的rFIX制剂，其包含Fc的FcRn结合区域。
107.根据权利要求105所述的rFIX制剂，其包含白蛋白的FcRn结合区域。
108.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述剂量为10-50、10-30、20-50、20-100、10或20IU/kg并且所述给药间隔为每周1次。
109.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述剂量为15-50或40IU/kg并且所述给药间隔为每10天1次。
110.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述剂量为100IU/kg并且所述给药间隔为每2周1次或每月2次。
111.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述给药间隔为每周1次。
112.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述剂量为15-100IU/kg并且所述给药间隔为10-13天。
113.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述剂量为50-100IU/kg并且所述给药间隔为10-14天，所述剂量为50-150IU/kg并且所述给药间隔为14-15天或所述剂量为100-150IU/kg并且所述给药间隔为14-16天。
114.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述剂量为15-50IU/kg并且所述给药间隔为10天，所述剂量为20-70IU/kg并且所述给药间隔为11天，所述剂量为25-85IU/kg并且所述给药间隔为12天，所述剂量为30-100IU/kg并且所述给药间隔13天，所述剂量为40-125IU/kg并且所述给药间隔为14天或所述剂量为50–150IU/g并且所述给药间隔为15天。
115.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其由每周1次的预防性给药间隔组成。
116.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其由10-14天的预防性给药间隔组成。
117.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其由15-18或16-18天的预防性给药间隔组成。
118.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其由每月2次的预防性给药间隔组成。
119.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其由每月1次的预防性给药间隔组成。
120.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其为固定的或个体化预防性剂量和/或给药间隔。
121.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中静脉内或皮下施用所述剂量。
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