CN102791285A - 因子VIII-Fc嵌合多肽和杂交多肽及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了施用因子VIII的方法；施用包含因子VIII的嵌合和杂交多肽的方法；包含因子VIII的嵌合和杂交多肽；编码这类嵌合和杂交多肽的多核苷酸；包含这类多核苷酸的细胞；和使用这类细胞产生这类嵌合和杂交多肽的方法。

Description

因子VIII-Fc嵌合多肽和杂交多肽及其使用方法

发明背景

发明领域

本发明一般涉及凝血障碍的治疗领域。

背景领域

血友病A是由因子VIII(FVIII)基因的突变和/或缺失(导致FVIII活性的缺乏)引起的X连锁出血障碍(Peyvandi等人2006)。该疾病的特征在于创伤后自发性出血和过量流血。随着时间的过去，通常始于幼童时期的至肌肉和关节内的反复出血产生血友病性关节病和不可逆的关节损伤。该损伤是渐进的并且可导致严重受限的关节活动性、肌肉萎缩和慢性疼痛(Rodriguez-Merchan，E.G.，Semin.Thromb.Hemost.29:87-96(2003)(将其通过引用整体并入本文)。

A2结构域是因子VIII分子的促凝活性所必需的。研究显示猪因子VIII具有为人因子VIII 6倍的促凝活性(Lollar，P.和E.T.Parker，J.Biol.Chem.266:12481-12486(1991))以及人与猪因子VIII之间的促凝剂活性的差异似乎基于人与猪A2结构域的一个或多个残基之间的氨基酸序列的差异(Lollar，P.等人，J.Biol.Chem.267:23652-23657(1992))(将其通过引用整体并入本文)。

血友病A的治疗是通过靶向使FVIII活性恢复至1至5%的正常水平以防止自发性出血的替代疗法(Mannucci，P.M.等人，N.Engl.J.Med.344:1773-1779(2001)，将其通过引用整体并入本文)。存在可用于按需治疗出血事件或通过预防性治疗预防出血事件发生的血浆源性FVIII和重组FVIII产物。基于这类制品的半衰期，治疗方案需要频繁的静脉内施用。这样的频繁施用非常痛苦并且不方便。

由于血浆源性FVIII和重组FVIII的开发，死亡率的降低、关节损伤的预防以及生活质量的改善已取得重要成就。延长的出血保护作用代表血友病A患者的治疗中的另一个至关重要的成就。然而，迄今为止，还未开发出允许长期保护的产物。因此，仍然需要比目前疗法更可耐受且更有效的治疗因因子VIII缺乏而引起的血友病的改进的方法。

发明概述

本发明提供了施用因子VIII的方法；施用包含因子VIII的嵌合多肽和这类嵌合多肽的杂交体的方法；包含因子VIII的嵌合多肽和这类嵌合多肽的杂交体；编码这类嵌合多肽和杂交多肽的多核苷酸；包含这类多核苷酸的细胞；和使用这类细胞产生这类嵌合和杂交多肽的方法。

本发明提供了给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括以等量的不具有非-因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的部分)所需的给药间隔的至少约1.5倍的给药间隔给受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽。

给药间隔可以为等量的不具有非-因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。给药间隔可以为等量的不具有非-因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。给药间隔可以为每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次。

给药间隔可以为至少约1.5至5、1.5、2、3、4或5天或更长时间。

本发明还提供了给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括给受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽例如嵌合因子VIII-Fc多肽，以获得为通过等量的不具有非-因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)获得的AUC的至少约1.25倍的血浆浓度-时间曲线下面积(area under the plasma concentration versus time curve)(AUC)。

本发明还提供了给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括以约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次的给药间隔给受试者施用治疗剂量的包含因子VIII和Fc的多肽。

可对需要预防性治疗或按需治疗的受试者实施本发明的方法。

按需治疗包括出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血、至肌肉内的出血、口腔出血、创伤、头创伤(trauma capitis)(头创伤)、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、,胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘(illiopsoas sheath)出血的治疗。受试者可能需要手术预防、围手术期处理(perioperative management)或手术治疗。此类手术包括例如小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、全膝置换、穿颅术、骨接合术、创伤性手术(trauma surgery)、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换术。

为了进行按需治疗，所述嵌合多肽的给药间隔为约每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或更长时间一次。

可用于本发明的方法的治疗剂量为约10至约100IU/kg，更具体地，约10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg，更具体地约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。

可用于本发明的方法的治疗剂量为约10至约150IU/kg，更具体地约100-110、110-120、120-130、130-140、140-150IU/kg，更具体地，约110、115、120、125、130、135、140、145或150IU/kg。

本发明的方法的受试者可以是人受试者或可以是非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如小鼠、狗、灵长类动物、猴、猫、马、牛、猪和其它家养动物和小动物。给药间隔和AUC的确定可在单个受试者或受试者群体中进行。

因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可以是人因子VIII或非-人因子VIII，例如猪、小鼠或犬因子VIII。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可具有B结构域的完全或部分缺失。

因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可以与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。

因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的具有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIM(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ IDNO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。

Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一性。Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ IDNO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。

嵌合多肽可包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。嵌合多肽可包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有同一性的序列。

嵌合多肽可以以包含与所述嵌合多肽结合的第二多肽的杂交体的形式存在，其中所述第二多肽包含Fc或基本上由其组成。

第二多肽可包含与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列或基本上由所述序列组成。第二多肽可包含与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列或基本上由所述序列组成。

可将嵌合多肽或杂交体作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分施用。

本发明还提供了上述嵌合多肽和杂交多肽本身、编码它们的多核苷酸、包含所述多核苷酸的培养的人胚胎细胞以及产生这类嵌合和杂交多肽的方法和利用这类方法产生的多肽。

附图简述

图1.rFVIIIFc单体的示意图。

图2.在50IU/kg的静脉内剂量后，血友病A小鼠中与

相比较的rFVIIIFc的WBCT(n=6只小鼠/组)。

图3.在50IU/kg的rFVIIIFc、

和

的单次IV剂量后血友病A小鼠的血浆中的生色活性。

图4.血友病A狗中rFVIIIFc和的WBCT。(A)rFVIIIFc。(B)在交叉研究中，施用

然后施用rFVIIIFc。

图5.血友病A狗中静脉内rFVIIIIFc和

的药代动力学(通过ELISA测量的)。

图6.血友病A狗中单次静脉内剂量后rFVIII和的活性(通过FVIII-特异性生色活性测定测量的)。

图7.在食蟹猴中，在单次静脉内剂量(125IU/kg)后随时间过去后rFVIIIFc和Xyntha的组平均血浆浓度(n=6，平均值±SD)。通过ELISA测量血浆浓度。

图8.在食蟹猴中，单次静脉内剂量(125IU/kg)后rFVIIIFc和Xyntha的个体血浆浓度对时间曲线(n=6，平均值±SD)。通过ELISA测量血浆浓度。(A)通过ELISA测量的rFVIIIFc。(B)通过ELISA测量的Xyntha。

图9.在食蟹猴中，单次静脉内剂量(125IU/kg)后rFVIIIFc和Xyntha的组平均血浆生色活性(n=6，平均值±SD)。使用FVIII-特异性生色活性测定法测量的IVIII活性活性。

图10.在食蟹猴中，单次静脉内剂量(125IU/kg)后rFVIIIFc和Xyntha的个体血浆生色活性对时间曲线(n=6，平均值±SD)。使用FVIII特异性生色活性测定法测量FVIII活性。(A)rFVIIIFc生色活性。(B)Xyntha生色活性。

图11.rFVIII-Fc的生物化学表征：作为因子X浓度的函数的因子X的激活。

图12.rFVIII-Fc的生物化学表征：作为因子IXa浓度的函数的因子X的激活。

图13.观察到的平均FVIII活性(±SE)(一步测定法，25IU/kg(A)或65IU/kg(B)；和生色测定法，25IU/kg(C)或65IU/kg(D))对时间。

图14.观察到的组平均FVIII活性(±SE)(一步测定法(A)或生色测定法(B))对时间。

发明详述

本发明提供了使用更长的给药间隔和/或更大的AUC(与利用目前已知的因子VIII产品可能获得的给药间隔和/或AUC相比较的)利用因子VIII治疗血友病A的方法。本发明还提供了改进的因子VIII嵌合多肽、因子VIII嵌合多核苷酸以及产生方法。

血友病A的治疗是靶向使FVIII活性恢复至1至5%的正常水平以防止自发性出血的替代疗法(Mannucci，P.M.等人，N.Engl.J.Med.344:1773-9(2001)，通过引用整体并入本文)。存在可用于按需治疗出血事件或通过预防性治疗防止出血事件发生的血浆源性FVIII产物和重组FVIII产物。基于这类产物的半衰期(10-12小时)(White G.C.等人，Thromb.Haemost.77:660-7(1997)；Morfini，M.，Haemophilia 9(增刊):94-99；论述100(2003))，治疗方案需要通常每周2至3次(对于预防)和每天1至3次(对于按需治疗)的频繁静脉内施用(Manco-Johnson，M.J.等人，N.Engl.J.Med.357:535-544(2007))，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文。这样的频繁的施用是痛苦且不便的。

本发明提供了给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括以等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5倍的给药间隔给受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽或这类多肽的杂交体。

给药间隔可以为等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。给药间隔可为等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍。给药间隔可以为约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次。

给药间隔可以为至少约1.5至5天、1.5天、2天、3天、4天或5天或更长时间。

本发明还提供了给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括给受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽或这类多肽的杂交体，以获得为通过等量的不具有非-因子VIII部分例如不具有Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)获得的AUC的至少约1.25倍的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。

本发明还提供了给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括以约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次的给药间隔给受试者施用治疗剂量的包含因子VIII和Fc的多肽或这类多肽的杂交体。

可对需要预防性治疗或按需治疗的需要的受试者实施本发明的方法。

如本文中所用，“施用”意指通过药学上可接受的途径给受试者提供本发明的药学上可接受的VIII多肽。优选施用途径是静脉内途径例如静脉注射和静脉内输注。施用的其它途径包括例如皮下、肌内、口服、经鼻和经肺施用。可将嵌合多肽和杂交蛋白作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分来施用。

如本文中所用的“血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)”与药理学领域的术语的含义相同，并且基于施用后因子VIII的吸收的速率和程度。使用基于曲线的斜率，使用外推法测定在指定的时间段例如12、18、24、36、48或72小时、或无穷时间内的AUC。除非本文中另外指定，否则测定无穷时间的AUC。可在单个受试者中或在计算其平均值的受试者群体中进行AUC的测定。

如本文中所用，因子VIII的“B结构域”与本领域已知的B结构域相同，其由内部氨基酸序列同一性和被凝血酶切割的蛋白酶水解切割位点界定，例如全长人因子VIII的残基Ser741-Argl648。其它人因子VIII结构域由下列氨基酸残基界定：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；A3，残基Ser1690-Ile2032；C1，残基Arg2033-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Ser1690-Tyr2332。其余序列残基Glul 649-Arg1689通常被称为因子VIII轻链激活肽。猪、小鼠和犬因子VIII的所有结构域(包括B细胞域的边界)的定位在本领域也是已知的。优选地，因子VIII的B结构域缺失(“B结构域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的实例为REFACTO(重组BDD FVIII)，其具有与表2A(i)中的序列的因子VIII部分(SEQID NO:2的氨基酸-19-1438或1-1438)相同的序列。

“B结构域缺失的因子VIII”可具有美国专利No.6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563中公开的完全或部分缺失，将所述每一个专利通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本发明的B结构域缺失的因子VIII序列包含在美国专利No.6,316,226(也在US 6,346,513中)的第4栏第4行至第5栏第28行和实施例1-5中公开的任一缺失。在一些实施方案中，本发明的B结构域缺失的因子VIII具有美国专利No.5,789,203(也在US 6,060,447、US 5,595,886和US 6,228,620中)的第2栏第26-51行和实施例5-8中公开的缺失。在一些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII具有美国专利No.5,972,885的第1栏第25行至第2栏第40行；美国专利No.6,048,720的第6栏，第1-22行和实施例；美国专利No.5,543,502的第2栏第17-46行；美国专利No.5,171,844的第4栏第22行至第5栏第36行；美国专利No.5,112,950的第2栏第55-68行、图2和实施例1；美国专利No.4,868,112的第2栏第2行至第19栏，第21行和表2；美国专利No.7,041,635的第2栏第1行至第3栏第19行、第3栏第40行至第4栏第67行、第7栏第43行至第8栏第26行以及第11栏第5行至第13栏第39行；美国专利No.6,458,563的第4栏第25至53行中描述的缺失。在一些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII具有大部分B结构域的缺失，但仍然包含为初级翻译产物至两条多肽链的体内蛋白酶加工所必需的B结构域的氨基末端序列，如WO91/09122(其通过引用整体并入本文)中公开。在一些实施方案中，利用氨基酸747-1638的缺失即实际上B结构域的完全缺失构建B结构域缺失的因子VIII。Hoeben R.C.等人，J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)，通过引用整体并入本文。B结构域缺失的因子VIII还可包含因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。Meulien P.等人Protein Eng.2(4):301-6(1988)，通过引用整体并入本文。为本发明的部分的其它B结构域缺失包括例如氨基酸982-1562或760-1639(Toole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83，5939-5942))、797-1562(Eaton等人Biochemistry(1986)25:8343-8347))、741-1646(Kaufman(PCT公布申请No.WO 87/04187))、747-1560(Sarver等人，DNA(1987)6:553-564))，741-1648(Pasek(PCT申请No.88/00831))、816-1598或741-1689(Tagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82:16-25，EP 295597))(将所述每一篇文献或申请通过引用整体并入本文)的缺失。可以以任何因子VIII序列制备上述缺失的每一个。

如本文中所用，"嵌合多肽"意指在其中包括至少2种来自不同来源的多肽(或子序列或肽)。嵌合多肽可包含例如2、3、4、5、6、7或更多种来自不同来源例如不同基因、不同cDNA或不同动物或其它物种的多肽。嵌合多肽可包括例如一个或多个连接不同子序列的接头。因此，可直接连接子序列或在单个嵌合多肽内直接、通过接头或通过这两种方式连接它们。嵌合多肽可包括例如额外的肽例如信号序列和序列例如6His和FLAG(其可帮助蛋白质纯化或缺失)。此外，嵌合多肽还可具有至N-和/或C-端的氨基酸或肽的添加。

在一些实施方案中，嵌合多肽包含因子VIII部分和非-因子VIII部分。示例性非-因子VIII部分包括例如Fc、XTEN和白蛋白。本发明的示例性嵌合多肽包括例如嵌合因子VIII-Fc多肽、嵌合因子VIII-XTEN多肽和嵌合因子VIII-白蛋白多肽。

示例性嵌合因子VIII-Fc多肽包括例如SEQ ID NO:2、6、8、10和12(表2)(具有或不具有它们的信号序列)和SEQ ID NO:4的嵌合Fc多肽(表2)。

嵌合多肽可包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或与2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。嵌合多肽可包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列VIII和Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有同一性的序列。

如上所述，示例性嵌合多肽包括融合至一个或多个XTEN多肽的因子VIII。Schellenburger等人，Nat.Biotech.27:1186-90(2009)(将其通过引用整体并入本文)。可将因子VIII融合至XTEN多肽的N末端或XTEN多肽的C末端，只要因子VIII-XTEN融合蛋白的VIII组分可被蛋白酶加工以产生含有经加工的因子VIII的多肽。可将蛋白酶位点包含在NTEN部分与因子VIII部分之间以允许这样的加工。XTEN多肽包括例如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682和US 2009/0092582(将所述每一个申请通过引用整体并入本文)中公开的多肽。

如上所论述的，示例性嵌合多肽还包括融合至一个或多个白蛋白多肽的因子。优选地白蛋白是人白蛋白。还可将因子VIII融合至白蛋白的N末端或白蛋白的C末端，只要因子VIII-白蛋白融合蛋白的因子VIII组分可被酶促活性前蛋白转化酶(proprotein convertase)加工以产生含有经加工的因子VIII的多肽即可。可用于本发明的白蛋白例如其片段的实例在例如美国专利No.7,592,010；美国专利No.6,686,179；和Schulte，Thrombosis Res.124增刊.2:S6-S8(2009)(将每一篇所述专利和文献通过引用整体并入本文)中是已知的。

在一些实施方案中，含有因子VIII部分的嵌合多肽具有与由相同因子VIII部分组成但无非因子VIII部分的多肽相比增加的半衰期(t1/2)。具有增加的t1/2的嵌合因子VIII多肽在本文中可称为长效因子VIII。长效嵌合因子VIII多肽包括例如融合至Fc的因子VIII(包括例如以杂交体FVIIIFc单体二聚体杂交体形式存在的嵌合因子VIII多肽；参见实施例1，图1和表2A；和美国专利No.7,404,956和7,348,004)、融合至XTEN的因子VIII和融合至白蛋白的因子VIII。

如本文中所用，“培养”、“进行培养”和“正在培养”意指在允许细胞生长或分裂或将细胞维持在活的状态中的体外条件下温育细胞。如本文中所用，“培养的细胞”意指在体外增殖的细胞。

如本文中所用，“因子VIII”，除非另外指出，否则意指在凝结中以其正常作用发挥功能的因子VIII多肽。因此，术语因子VIII包括具有功能的变异多肽。优选因子VIII蛋白是人、猪科动物、犬科动物和鼠因子VIII蛋白。如背景领域部分中所述，全长多肽和多核苷酸的序列是已知的，同样地许多功能性片段、突变体和经修饰的形式的序列也是已知的。人因子VIII的序列的实例显示为SEQ ID NO:2、6、8、10和12(表2)中的子序列。因子VIII多肽包括例如全长因子VII、除去N末端上的Met的全长因子VIII、成熟因子VIII(除去信号序列)、在N末端上具有额外Met的成熟因子VIII和/或具有B结构域的全长或部分缺失的因子VIII。优选因子VIII变体包括B结构域缺失，无论是部分还是完全缺失。

许多功能性因子VIII变体是已知的，如在上文和下文中论述的。此外，已在血友病患者中鉴定了因子VIII的数百个非功能性突变，并且已确定这类突变对因子VIII功能的作用更主要地归因于它们在,因子VIII的三维结构存在的位置而非置换的性质(Cutler等人，Hum.Mutat.19:274-8(2002))(通过引用整体并入本文)。此外，人与其它物种的因子VIII之间的比较已鉴定了可能是功能所需的保守性残基(Cameron等人，Thromb.Haemost.79:317-22(1998)；US6,251,632)(通过引用整体并入本文)。

人因子VIII基因已被分离并且将其在哺乳动物细胞中表达(Toole，J.J.等人，Nature 312:342-347(1984)；Gitschier，J.等人，Nature 312:326-330(1984)；Wood，W.I.等人，Nature 312:330-337(1984)；Vehar，G.A.等人，Nature312:337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美国专利No.4,757,006)(将所述每一篇文献、申请、专利通过引用整体并入本文)，并且从cDNA推断出所述氨基酸序列。Capon等人，美国专利No.4,965,199(通过引用整体并入本文)公开了用于在哺乳动物宿主细胞中产生因子VIII和纯化人因子VIII的重组DNA方法。已报导了人因子VIII在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHKC(幼仓鼠肾细胞)中的表达。已对人因子VIII进行了修饰以缺失部分或全部B结构域(美国专利No.4,994,371和4,868,112，将所述每一个专利通过引用整体并入本文)，并且已进行了人因子V B结构域对人因子VIII B结构域的替换(美国专利No.5,004,803，通过引用整体并入本文)。编码人因子VIII的cDAN序列和预测的氨基酸序列分别示于美国申请公布第2005/0100990号(通过引用整体并入本文)的SEQ ID NO:l和2中。

美国专利No.5,859,204，Lollar.J.S.(通过引用整体并入本文)报导了具有减小的抗原性和减小的免疫反应性的因子VIII的功能性突变体。美国专利No.6,376,463，Lollar，J.S.(通过引用整体并入本文)也报导了具有减小的免疫反应性的因子VIII的突变体。美国申请公布第2005/0100990号，Saenko等人(通过引用整体并入本文)报导了因子VIII的A2结构域中的功能性突变。

许多功能性因子VIII分子(包含B结构域缺失)公开于下列专利US6,316,226和US 6,346,513(两个专利都属于Baxter)；属于In2Gen的US7,041,635；属于Chiron的US 5,789,203、US 6,060,447、US 5,595,886和US6,228,620；属于Biovitrum的US 5,972,885和US 6,048,720、属于Novo Nordisk的US 5,543,502和US 5,610,278；属于Immuno Ag的US 5,171,844；属于Transgene S.A的US 5,112,950；属于Genetics Institute的US 4,868,112，将所述每一个专利通过引用整体并入本文。

猪因子VIII序列已被公布(Toole，J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5939-5942(1986))(所述文献通过引用整体并入本文)，并且已报导了获自猪脾cDNA文库的因子VIII序列的PGR扩增的完全猪cDNA序列(Healey，J.F.等人，Blood 88:4209-4214(1996)(通过引用整体并入本文)。所有结构域、所有亚单位以及特定的氨基酸序列被置换的杂交体人/猪因子VIII公开于Lollar和Runge的美国专利No.5,364,771和在WO 93/20093(通过引用整体并入本文)中。更近以来，在WO 94/11503(通过引用整体并入本文)中报导了用猪Al和/或A2结构域置换了相应的人结构域的猪因子VIII和嵌合因子VIII的核苷酸和相应的氨基酸序列。美国专利No.5,859,204，Lollar，J.S.还公开了猪cDNA和推断的氨基酸序列。属于Emory的6,458,563(通过引用整体并入本文)公开了了B-结构域缺失的猪因子VIII。

因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ IDNO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。

因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有至少90%或95%的同一性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ IDNO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。

如本文中所用，“等量的”意指以国际单位表示的相同量的因子VIII活性，其不依赖于所述多肽的分子量。因子VIII活性的一个国际单位(IU)大致对应于1毫升正常人血浆中的因子VIII的量。几个测定法可用于测量因子VIII活性，包括欧洲药典生色底物测定法(European Pharmacopoeia chromogenic substrateassay)和一步凝集测定法。

如本文中所用，“Fc”，除非另外指出，否则意指功能性新生儿Fc受体(FcRn)结合伴侣。FcRn结合伴侣是可被FcRn受体特异性结合，随后通过FcRn结合伴侣的FcRn受体主动运输的任何分子。因此，术语Fc包括具有功能的IgG Fc的任何变体。已基于X-射线晶体学描述了结合FcRn受体的IgG的Fc部分的区域(Burmeister等人1994，Nature 372:379，通过引用整体并入本文)。Fc与FcRn的主要接触区域靠近CH2与CH3结构域的接合处。Fc-FcRn接触全部在单Ig重链内。FcRn结合伴侣包括例如完整的IgG、IgG的Fc片段、包括FcRn的完整结合区域的IgG的其它片段。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号全部基于Kabat等人1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，美国公共生部，Bethesda；MD，通过引用整体并入本文。(已从几种哺乳动物物种(包括人)分离了FcRn受体。人FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人1994，J.Exp.Med.180:2377)，通过引用整体并入文)。Fc可包含具有或不具有免疫球蛋白的铰链区的免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。示例性Fc变体提供于WO 2004/101740和WO2006/074199(通过引用整体并入本文)中。

Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可包含一个或多个突变以及突变的组合。

Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可包含赋予增加的半衰期的突变例如M252Y、S254T、T256E及其组合，如Oganesyan等人，Mol.Immunol.46:1750(2009)(将其通过引用整体并入本文)中公开的；H433K、N434F及其组合，如Vaccaro等人，Nat.Biotechnol.23:1283(2005)(通过引用整体并入本文)中公开的；US2009/0264627Al(将其通过引用整体并入本文)的第1-2页的段落[0012]以及实施例9和10中公开的突变；和US 20090163699A1(将其通过引用整体并入本文)的第2页段落[0014]至[0021]中公开的突变体。

Fc(或嵌合多肽的Fc部分)还可包括下列突变：IgG的Fc区域可按照公认的方法例如定向诱变等来进行修饰以产生可被FcRn结合的经修饰IgG或其Fc片段或部分。此类修饰包括例如远离FcRn接触位点的修饰以及接触位点内的修饰，所述修饰保持或甚至增强对FcRn的结合。例如，人IgG1Fc中的下列单个氨基酸残基(Fcyl)可被置换而无对FcRn的Fc结合亲和力的显著丢失：P238A、S239A、K246A、248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375AD376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D41 A.414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A.E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A代表在位置编号238上被置换的野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它氨基酸可在上文中指定的位点上置换野生型氨基酸。可将突变单个地引入Fc，从而产生超过100多种与天然Fc不同的FcRn结合伴侣。此外，可将2、3或更多个这类单个突变的组合一起引入，从而产生超过数百种FcRn结合伴侣。这类突变的某些突变可赋予FcRn结合功能新的功能性。例如，一个实施方案整合N297A，从而除去高度保守的N-糖基化位点。该突变的效应是减小免疫原性，从而增加FcRn结合伴侣的循环半衰期和使得FcRn结合伴侣不能结合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA，但不损害对于FcRn的亲和力(Routledge等人1995，Transplantation60:847，将其通过引用整体并入本文；Friend等人1999，Transplantation 68:1632，将其通过引用度整体并入本文；Shields等人1995，J.Biol.Chem.276:6591，将其通过引用整体并入本文)。此外，至少3种人Fcγ受体似乎识别IgG上的更下方的铰链区内的结合位点(通常氨基酸234-237)。因此，新功能性和潜在减小的免疫原性的另一个实例可因该区域的突变而产生，如例如通过来自IgG2“PVA”的相应序列(具有一个氨基酸缺失)替代人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236来产生。已显示当这类突变已被引入时，介导各种效应子功能的FcyRI、FcyRII和FcyRIII将不结合IgG1(Ward和Ghetie 1995，TherapeuticImmunology 2:77，将其通过引用整体并入本文；和Armour等人1999，Eur.J.Immunol.29:2613，将其通过引用整体并入本文)。作为由上述突变产生的新功能性的其它实例，对FcRn的亲和力在一些情况下可被增加超过野生型的亲和力。该增加的亲和力可反映增加的“结合”率(on rate)、减小的“离解”率(off rate)或增加的“结合率(on rate)”和减小的“离解率(off rate)”。据认为赋予增加的对FcRn的亲和力的突变包括例如T256A，T307A，E380A和N434A(Shields等人2001，J.Biol.Chem.276:6591，将其通过引用整体并入本文)。

Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一性。Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。

如本文中所用，“杂交体”多肽和蛋白质意指嵌合多肽与第二多肽的组合。杂交体中的嵌合多肽和第二多肽可通过蛋白质间相互作用例如电荷-电荷或疏水相互作用彼此结合。杂交体中的嵌合多肽和第二多肽可通过二硫键或其它共价键彼此缔合。杂交体描述于WO 2004/101740和WO 2006/074199(将所述每一个申请通过引用整体并入本文)。也参见美国专利No.7,404,956和7,348,004，将所述每一个专利通过引用整体并入本文。第二多肽可以是相同嵌合多肽的第二拷贝或其可以是非-同一嵌合多肽。参见，例如，图1、实施例1和表2。在优选实施方案中，所述第二多肽是包含Fc的多肽。在优选实施方案中，嵌合多肽为嵌合因子VIII-Fc多肽并且第二多肽基本上由Fc组成，例如实施例1的杂交多肽(其为rFVIIIFc重组融合蛋白，由融合至人IgiG1的二聚Fc结构域的重组B结构域缺失的人FVIII(BDD-rFVIII)的单个分子组成，无间插接头序列)。该杂交多肽在本文中称为FVIIIFc单体Fc融合蛋白、FVIIIFc单体杂交体、单体FVIIIIFc杂交体和FVIIIFc单体-二聚体。参见实施例1、图1和表2。实施例提供了该杂交多肽的临床前和临床数据。

杂交体的第二多肽可包含与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列或基本上由所述序列组成。第二多肽可包含与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列或基本上由所述序列组成。

图1为显示B结合域缺失的因子VIII-Fc嵌合多肽的结构以及其与作为Fc多肽的第二多肽的结合的示意图。为了获得该杂交体，使用FVIII特异性引物通过逆转录聚合酶链多反应(RT-PCR)从人肝poly A RNA(Clontech)获得人重组B结构域缺失的FVIII的编码序列。FVIII序列包括FVIII的天然信号序列。B结构域缺失从丝氨酸743(S743；2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；4969bp)，总共2682bp的缺失。然后，使用Fc特异性引物通过RT-PCR从人白细胞cDNA文库(Clontech)获得人重组Fc的编码序列。设计引物以便将B结构域缺失的FVIII序列直接融合至Fc序列的N端而不用间插接头。在CMV启动子的控制之下将FVIIIFc DNA序列克隆入哺乳动物双表达载体pBUDCE4.1(Invitrogen)。通过RT-PCR获得包含小鼠Igk信号序列的第二相同的Fc序列，然后将其克隆在表达载体pBUDCE4.1中的第二启动子EF1α的下游。

使用Lipofectamine 2000转染剂(Invitrogen)将rFVIIIFc表达载体转染入人胚胎肾293细胞(HEK293H；Invitrogen)。通过用Zeocin(Invitrogen)选择产生稳定克隆细胞系。将一个克隆细胞系3C4-22用于产生FVIIIFc以进行体内表征。在Biogen Idec(Cambridge，MA)产生和纯化重组FVIIIFc(McCue等人2009)。预期上述转录策略产生3种产物，即单体rFVIIIFc杂交体、二聚rFVIIIFc杂交体和二聚Fc。然而，在来自这类细胞的条件化培养基中基本上不存在可检测的二聚rFVIIIFc。相反，条件化培养基包含Fc和单体rFVIIIFc。二聚rFVIIIFc的尺寸可能太大，从而被阻止从细胞高效分泌。该结果是有益的，因为其使得单体的纯化比在所有3种蛋白质都存在的情况下简单。这类研究中使用的材料具有约9000IU/mg的比活性。

如本文中所用，“给药间隔”，意指给受试者施用的多个剂量之间逝去的时间的量。可在单个受试者或在受试者群体中进行给药间隔的比较，然后可计算群体中获得的平均值。

当施用本发明的嵌合因子VIII多肽例如嵌合因子VIII-Fc多肽(包含因子VIII的多肽或杂交体)时，给药间隔可以为等量的不具有非-因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5倍。给药间隔可以为等量的不具有非因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。给药间隔可以为等量的不具有非-因子VIII部分例如无Fc部分的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需的给药间隔的至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。给药间隔可以为约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次。给药间隔可以为至少约1.5至5、1.5、2、3、4或5天或更长时间。对于按需治疗，所述嵌合多肽或杂交体的给药间隔为约每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或更长时间一次。

优选地，有效剂量为25-65IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64或65IU/kg)并且给药间隔为每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8天或更多天一次，或每周3次，或每周不超过3次。优选地，有效剂量为65IU/kg并且给药间隔为每周一次或每6-7天一次。

“长效因子VIII”为与参照因子VIII相比较具有增加的半衰期(在本文中也称为t1/2、1/2β、消除半衰期和HL)的因子VIII。长效因子VIII的增加的半衰期可归因于至一个或多个非-因子VIII多肽例如Fc、XTEN或白蛋白的融合。增加的半衰期可归因于一种或多种修饰例如PEG化。示例性长效因子VIII多肽包括例如包含Fc的嵌合因子VIII多肽、包含XTEN的嵌合因子VIII和包含白蛋白的嵌合因子VIII多肽。其它示例性长效因子VIII多肽包括例如PEG化的因子VIII。

“参照”多肽，在长效嵌合因子VIII多肽的情况下，为基本上由嵌合多肽的因子VIII部分组成的多肽，例如无Fc部分、无XTEN部分或无白蛋白部分的相同因子VIII部分。同样地，在修饰因子VIII的情况下，参照多肽为不具有修饰的相同因子VIII，例如不具有PEG化的因子VIII。

在一些实施方案中，当给受试者施用时，长效因子VIII具有下列性质的一个或多个性质：

约14-41.3小时的所述受试者中的平均停留时间(MRT)(活性)；

约1.22-5.19mL/小时/kg或更少的所述受试者中的清除率(CL)(活性)；

约11-26.4小时的所述受试者中的t1/2β(活性)；

约1.38-2.88IU/dL每IU/g的所述受试者中的增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

约37.7-79.4mL/kg的所述受试者中的Vss(活性)；和

约19.2-81.7IU*h/dL每IU/kg的所述受试者中的AUC/剂量。

在一些实施方案中，当给患者群体施用时，长效因子VIII具有下列性质的一个或多个性质：

大于1.38IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察到的)；

至少约1.5、至少约1.85或至少约2.46IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察到的)。

约2.33±1.08mL/小时/kg或更小的所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)；

约1.8-2.69mL/小时/kg的所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)；

为包含不具有修饰的所述因子VIII的多肽的清除率的约65%的所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)；

至少约26.3±8.33小时的所述患者中的平均停留时间(MRT)(活性)；

约25.9-26.5小时的所述患者群体中的平均MRT(活性)；

为包含不具有修饰的所述因子VIII的多肽的平均MRT的约1.5倍的所述患者群体中的平均MRT(活性)；

约18.3±5.79小时的所述患者群体中的平均t1/2β(活性)；

为约18-18.4小时的所述患者群体中的平均t1/2β(活性)；

为包含不具有修饰的所述因子VIII的多肽的平均t1/2β的约1.5倍的所述患者群体中的平均t1/2β(活性)；

约2.01±0.44IU/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

约1.85-2.46IU/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

为包含不具有修饰的所述因子VIII的多肽的平均增量恢复的约90%的所述患者群体中的平均增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

约55.1±12.3mL/kg的所述患者群体中的平均Vss(活性)；

约45.3-56.1mL/kg的所述患者群体的平均Vss(活性)；

约49.9±18.2IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)；

约44.8-57.6IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)

如本文中所用，“按需治疗”意指有意在短时程内发生和响应现有病况例如出血事件的治疗或感觉性需要(perceived need)例如计划的手术(plannedsurgery)。可需要按需治疗的病况包括例如出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血、至肌肉内的出血、口腔出血、创伤、头创伤、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、,胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。受试者可能需要手术预防、围手术期处理(perioperative management)或手术治疗。此类手术包括例如小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、全膝置换、穿颅术、骨接合术、创伤性手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换术。

优选地，按需治疗以单次剂量解决超过80%(超过80%、超过81%、超过82%、超过83%、超过84%、超过85%、超过86%、超过87%、超过88%、超过89%、超过90%、超过91%、超过92%、超过93%、超过94%、超过95%、超过96%、超过97%、超过98%、超过99%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血(例如，自发性出血)。优选地，超过80%(超过81%、超过82%、超过83%、超过84%、超过85%、超过86%、超过87%、超过88%、超过89%、超过90%、超过91%、超过92%、超过93%、超过94%、超过95%、超过96%、超过97%、超过98%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血事件在按需治疗后被医生评定为优良或良好。优选地，超过5%、(超过6%、超过7%、超过8%、超过9%、超过10%、超过11%、超过12%、超过13%、超过14%、超过15%、超过16%、超过17%、超过18%、超过19%、超过20%)或5-20%、5-15%、5-10%、10-20%或10-15%的出血事件在按需治疗后被医生评定为相当好(fair)。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指由共价连接的氨基酸残基组成的多聚化合物。

“多核苷酸”和“核酸”可互换使用且是指由共价连接的核苷酸残基组成的多聚化合物。多核苷酸可以是DNA、cDNA、RNA(单链的或双链的)、载体、质粒、噬菌体或病毒。多核苷酸包括例如表1中的多核苷酸，其编码表2的多肽(参见表1)。多核苷酸还包括例如表1的多核苷酸的片段，例如编码表2的多肽的片段例如表2的多肽的因子VIII、Fc、信号序列、6His和其它片段的那些多核苷酸。

如本文中所用，“预防性治疗”意指在一段时间内以多个剂量给受试者施用因子VIII多肽以升高受试者的血浆中的因子VIII的活性水平。优选地，升高的水平足以降低自发性出血的发病率或防止出血，例如在意外损伤的事件中。优选地，在预防性治疗过程中，受试者的血浆蛋白质水平不低于受试者的基线水平，或不低于表征严重血友病的因子VIII的水平(<1IU/dl[1%])。

优选地，给个体患者“定制”预防性方案，优选通过测定每一个患者的PK数据和以维持1-3%FVIII活性的波谷水平的给药间隔施用本发明的因子VIII来进行。当受试者经历不可接受的流血事件(定义为在滚动的2个月的时期内≥2次自发性出血事件)时可进行调整。在该情况下，调整将靶向3-5%的低谷水平。优选地，预防性治疗导致出血的预防和控制、出血的持久控制、持久的出血保护作用和/或持久的益处。预防，例如持久的保护作用可通过增加的至最终测量时间点的AUC(AUC-LAST)和减少的清除率(从而导致与短效FVIII相比较增加的终t1/2)来证明。优选地，预防通过更好的Cmax、更好的Tmax和/或更大的平均停留时间对短效FVIII来证明。优选地，预防导致在注射(例如，最后一次注射)后约24、36、48、72或96小时(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96小时，优选72小时内)内无自发性出血事件。优选，对于每周给药一次(例如，以65IU/kg)，预防导致大于30%(例如，大于31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89或90%，优选大于50%)的年出血事件的平均减少。

如本文中所用，“受试者”意指人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如小鼠、狗、灵长类动物、猴、猫、马、牛、猪和其它驯养动物和小动物。

如本文中所用，“治疗剂量”意指实现治疗目的的剂量，如本文中所描述的。因子VIII的必需剂量的计算基于这样的经验发现：平均地，1IU因子VIII/kg体重升高血浆因子VIII活性约2IU/dL。使用下列公式测定必需剂量：

必需单位=体重(kg)x期望的因子VIII升高(IU/dL或正常的%)x0.5(IU/kg/IU/dL)

可用于本发明的方法的治疗剂量为约10-100IU/kg，更具体地10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg，更具体地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。

可用于本发明的方法的其它治疗剂量为约10至约150IU/kg，更具体地，约100-110、110-120、120-130、130-140、140-150IU/kg，更具体地，约110、115、120、125、130、135、140、145或150IU/kg。

如本文中所用，“变体”是指与原始多核苷酸或多肽不同但保留其基本性质例如因子VIII促凝活性或Fc(FcRn结合)活性的多核苷酸或多肽。通常，变体总体上十分相似，并且在许多区域与原始多核苷酸或多肽相同。变体包括例如原始多肽的多肽和多核苷酸片段、缺失、插入和修饰形式。

变体多核苷酸可包含与例如编码这样的核苷酸序列或替代地由所述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的核苷酸编码序列(因子VIII部分、Fc部分，单独地或一起地)或与其互补的链、已知的突变和重组因子VIII或Fc(例如本文中引用的出版物和专利中公开的那些突变和重组因子VIII或Fc)的核苷酸编码序列或与其互补的链、编码SEQ IDNO:2、4、6、8、10或12的多肽(因子VIII部分、Fc部分，单独地或一起地)的核苷酸序列和/或这类核酸分子的任一个的多核苷酸片段(例如，本文中描述的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。与这类核酸分子在严格杂交条件或更低严格条件下杂交的多核苷酸也包括为变体，对于由这类多核苷酸编码的多肽亦如此，只要它们具有功能。

变体多肽可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中显示的多肽序列(因子VIII部分、Fc部分，单独地或一起地)和/或这类多肽的任一个的多肽片段(例如，本文中描述的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的氨基酸序列或替代地由所述氨基酸序列组成。

对于具有与参照核苷酸序列具有至少例如95%的“同一性”的核苷酸序列的核酸，其意指除核苷酸序列可包含最多5个点突变每100个参照核苷酸序列的核苷酸外，所述核酸的核苷酸序列与参照序列具有同一性。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列具有至少95%的同一性的核苷酸序列的核酸，参照序列中的最多5%核苷酸可缺失或用另一种核苷酸进行置换，或可将参照序列中的最多5%总核苷酸的许多核苷酸插入参照序列。查询序列可以是例如SEQID NO:1或3中显示的完整序列、ORF(开放阅读框架)或本文中描述的指定的任何片段。

作为一个实际问题，任何特定核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性可使用已知的计算机程序来进行常规测定。用于测定查询序列(参照序列或原始序列)与受试序列之间的最佳总体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245)(将其通过引用整体并入本文)的算法的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询序列与受试序列都为DNA序列。可通过将U转变换成T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以同一性%表示。用于DNA序列的FASTDB算法以计算同一性%的优选参数为：矩阵=Unitary，k-元组=4，错配罚分(Mismatch Penalty)=1，连接罚分(Joining Penalty)=30，随机化组长度(Randomization Group Length)=0，截止评分(Cutoff Score)=1，空位罚分=5，空位大小评分(Gap Size Penalty)0.05，窗口大小(Window Size)=500或受试核苷酸序列的长度，择其中较短的。

如果受试序列因5'或3'缺失而非因内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行手工校正。这是因为当计算同一性%时，FASTDB程序不负责受试者的5'和3'截短。对于在5'或3'末端截短的受试序列，相对于查询序列，通过将作为受试序列的5'和3'但不匹配/对齐的查询序列的碱基的数目计算为查询序列的总碱基的百分比来校正同一性%。利用FASTDB序列比对的结果来确定核苷酸是否匹配/对齐。然后从使用指定的参数通过上述FASTDB程序计算的同一性%减去该百分比，以获得最终的同一性%评分。该校正的评分就是用于本发明的目的评分。为了手工调整同一性%评分，仅计算受试序列的5'和3'碱基外的碱基(如通过FASTDB比对显示的)，所述碱基与查询序列不匹配/对齐。

例如，将90个碱基受试序列与100个碱基的查询序列比对以测定同一性%。缺失在受试序列的5'末端上发生，从而FASTDB比对未显示5'末端上前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基代表10%的序列(5'和3'末端上未配对的碱基数/查询序列中碱基的总数)，因此从利用FASTDB程序计算的同一性%评分减去10%。如果剩余90个碱基完全匹配，则最终同一性%可为90%。在另一个实例中，将90个碱基的受试序列与100个碱基的查询序列相比较。这次，缺失是内部缺失，这样在受试序列的5'或3'上不存在不与查询序列匹配/对齐的碱基。在该情况下，通过FASTDB计算的同一性%未进行手工校正。再次地，仅手工校正与查询序列不匹配/对齐的受试序列的碱基5'和3'。无需为了本发明而进行其它手工校正。

对于具有与本发明的查询氨基酸序列具有至少例如95%的“同一性”的氨基酸序列的多肽，其意指除受试多肽序列可包含最多5个点突变每100个查询核苷酸序列的核苷酸外，受试多肽的氨基酸序列与参照序列具有同一性。换句话说，为了获得具有与查询核苷酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽，或可将受试序列中的最多5%氨基酸可用另一种氨基酸插入、缺失、(插入缺失(indel))或置换。参照序列的这些改变可在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上或这些末端位置之间的任何位置上发生，单个地散布在参照序列的残基之间或以一个或多个连续组散布在参照序列内。

作为一个实际问题，任何特定多肽是否与例如SEQ ID NO:2(因子VIII部分、Fc部分，单独地或一起)或4的氨基酸序列或已知的因子VIII或Fc多肽序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，可常规地使用已知的计算机程序来确定。用于确定查询序列(参照或原始序列)与受试序列之间的最佳总体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)可使用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)(通过引用整体并入本文)的算法的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询序列与受试序列都为核苷酸序列或都为氨基酸序列。所述全局序列比对的结果以同一性%表示。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：矩阵=PAM 0，k-元组=2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机化组长度=0，截止评分=1，窗口大小=序列长度。空位罚分=5，空位大小罚分=0.05，窗口大小=500或受试氨基酸序列的长度，择其中较短的。

如果受试序列因N-或C-末端缺失而非因为内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行手工校正。这是因为当计算全局同一性%时FASTDB程序不负责受试序列的N-和C-末端截短。对于在N-和C-末端上截短的受试序列，相对于查询序列，通过将作为受试序列的N-和C-末端的查询序列的残基的数目(所述残基与相应的受试残基不配对/对齐)计算为查询序列的总碱基的百分比来校正同一性%。利用FASTDB序列比对的结果来确定残基是否错配/对齐。随后从使用指定的参数通过上述FASTDB程序计算的同一性%减去该百分比，以获得最终的同一性%评分。该最终的同一性%评分就是用于本发明的目的的评分。为了手工调整同一性%评分仅考虑将至受试序列的N-和C-末端的残基(所述残基与查询序列不匹配/对齐)。即，仅受试序列的最远N-和C-末端残基外的查询残基位置。

例如，将90个氨基酸残基的受试序列与100个残基的查询序列比对以测定同一性%。缺失在受试者序列的N-末端上发生，从而FASTDB比对未显示N-末端上的前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基代表10%的序列(N-和C-末端上不匹配的残基的数目/查询序列中的残基的总数)，因此从利用FASTDB程序计算的同一性%评分减去10%。如果剩余的90个残基完全匹配，则最终同一性%为90%。在另一个实例中，将90个残基的受试序列与100个残基的查询序列相比较。这次缺失是内部缺失，这样在受试序列的N-或C-端上不存在不与所述查询序列匹配/对齐的残基。在该情况下，未对利用FASTDB计算的同一性%进行手工校正。再次地，仅手工校正受试序列的N-和C-末端外的残基位点(如FASTDB比对中显示的)，所述残基位点不与查询序列匹配/对齐。无需为本发明进行其它手工校正。

多核苷酸变体可包含编码区、非编码区或两者中的改变。特别优选的是包含产生沉默置换、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性的改变的多核苷酸变体。通过沉默置换(归因于遗传密码子的简并性)产生的核苷酸变体是优选的。此外，其中以任何组合置换、缺失或添加5-10、1-5或1-2个氨基酸的变体也是优选的。可因为许多原因例如最优化用于特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主例如大肠杆菌(E.coli)偏爱的密码子)来产生多核苷酸变体。

天然存在的变体称为“等位基因变体”，是指占据生物体的染色体上给定的基因座的基因的几个备选形式之一(Genes II，Lewin，B.编，John Wiley&Sons，New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化并且包括在本发明中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或通过直接合成来产生。

通过使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可产生变体来改进或改变多肽的特征。例如，可从分泌型蛋白质的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸而基本上不丢失生物功能。Ron等人.J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(通过引用整体并入本文)的作者报导了即使在缺失3、8或27个氨基末端氨基酸残基后仍具有肝素结合活性的变异KGF蛋白。类似地，干扰素γ在从该蛋白质的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基后展示高达10倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，通过引用整体并入本文)。

此外，充足的证据表明变体通常保留与天然存在的蛋白质的生物活性相似的生物活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，通过引用整体并入本文)进行人细胞因子IL-1a的广泛的突变分析。它们使用随机诱变来产生3,500个以上单独的IL-1a突变体，在分子的整个长度上每变体平均具有2.5个氨基酸改变。在第一个可能的氨基酸位置上检查多个突变。研究者发现“大多数分子可被改变而对[结合或生物活性]几乎无影响”。(参见Abstract)。事实上，在检查的3,500多个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生在活性上与野生型显著不同的蛋白质。

如上文中提及的，多肽变体包括例如修饰多肽。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化(Mei等人Blood 116:270-79(2010)，将其通过引用整体并入本文)、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转运-RNA介导的氨基酸至蛋白质的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化。在一些实施方案中，在任何方便的位置修饰例如PEG化因子VIII。在一些实施方案中，在因子VIII的表面暴露氨基酸优选表面暴露半胱氨酸上PEG化因子VIII，所述半胱氨酸可以是工程化半胱氨酸。Mei等人(2010)。在一些实施方案中，修饰因子VIII例如PEG化的因子VIII是长效因子VIII。

如本文中所用，“稳态分布容积(Vss)”具有与药理学中使用的术语相同的含义，其为药物分布在其中的表观空间(apparent space)(容积)。Vss=身体中药物的量除以稳态血浆浓度(plasma concentration at steady state)。

如本文中关于范围所用的“约”修饰范围的两端。因此，“约10-20”意指“约10至约20”。

在现已详细地描述了本发明后，通过参考下列实施例可更清楚地理解本发明，随同包括的所述实施例仅为了举例说明而无意限定本发明。本文中提及的全部专利和申请明确地通过引用并入本文。

实施例1

摘要

产生重组B结构域缺失的因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合蛋白以延长FVIII的半衰期。在严重血友病A的小鼠和狗模型中研究FVIIIFc，将其与相比较。与

相比较，对于rFVIIIFc，血友病A小鼠的全血凝固时间(WBCT)被校正约2至3倍并且血浆的消除半衰期几乎为2倍。在血友病A狗中，rFVIIIFc(125IU/kg)的静脉内剂量将WBCT校正至正常。WBCT保持少于20分钟，与FVIII:C>1%一致的时间，与利用

处理的狗的48小时相比较，持续约96小时。当使用ELISA或生色活性测定测量时，rFVIIIFc在狗血浆中的消除半衰期分别为15.7±1.7小时和15.4±0.3小时。

校正的WBCT约为rFVIIIFc的一半长，并且血浆半衰期为7.0小时。因此，FVIII至Fc的融合产生了具有增加的血浆半衰期和提供延长的出血保护作用的能力的分子。

引言

由于血浆衍生以及重组FVIII的开发，死亡率的降低、关节损伤的预防以及生活质量的改善已取得重要成就。延长的出血保护作用代表血友病A患者的治疗中的另一个至关重要的成就。本发明人已产生重组因子VIII-Fc(rFVIIIFc)嵌合蛋白和杂交体作为延长FVIII的半衰期的方法。

rFVIIIFc为异二聚体杂交蛋白质，其由重组地融合至人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc结构域的B结构域缺失的FVIII组成(图1，SEQ ID NO:2；表2A)(该蛋白在本文中也称为FVIIIFc单体Fc融合蛋白、FVIIIFc单体杂交体、单体FVIIIIFc杂交体和FVIIIFc单体-二聚体)。Fc使得能够结合新生儿Fc受体(FcRn)，其负责保护IgG免受降解并且赋予IgG 3周的半衰期(在人中观察到的)(Ghetie V和Ward ES.，Annu.Rev.Immunol.2000；18:739-766；Roopenian DC.和Akilesh S.，Nature Rev.Immunol.2007；7:715-725，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。

已将IgG1的Fc结构域整合至生长因子、细胞因子、酶和受体的配体结合区(Ashkanazi A等人，Int.Rev.Immunol.1993:10:219-27；Chamow SM和Ashkanazi A，Trends Biotechnol.1996:14:52-60；Fisher等人，N.Engl.J.Med.1996:334(26):1697-702，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。这类分子中的几种分子已成为重要的治疗性分子(例如，依那西普、阿来法塞、阿巴他塞)。在这类融合蛋白中，可将两个效应分子与两个Fc分子连接。在该实施例中，rFVIII Fc已被构建为单体Fc融合蛋白(一个拷贝的由表2A(i)(SEQ IDNO:2)的具有或不具有信号序列的序列组成的多肽和一个拷贝的由表2A(ii)(SEQ ID NO:4)的具有或不具有信号序列的序列组成的多肽)，即，仅具有一个拷贝的效应分子(参见图1)，并且本文中所示的研究在血友病A的小鼠和狗模型中比较该新型蛋白与rFVIII的药效学和药代动力学。信号序列在分泌过程中被切割。该蛋白质构建体在本文中称为FVIIIFc单体Fc融合蛋白、FVIIIFc单体杂交体、单体FVIIIFc杂交体和FVIIIFc单体-二聚体。关于该蛋白质的结构和产生，参见实施例1、图1、表2A；和美国专利No.7,404,956和7,348,004，将所述每一个专利通过引用整体并入本文。

方法和材料

FVIII制剂

重组FVIIIFc

使用FVIII特异性引物通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人肝poly ARNA(Clontech)获得人重组B结构域缺失的FVIII的编码序列。所述FVIII序列包括FVIII的天然信号序列。B结构域缺失为从丝氨酸743(S743；2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；4969bp)，总共2682bp的缺失。关于该蛋白质的结构和产生，参见实施例1、图1、表2A；和美国专利No.7,404,956和7,348,004，将所述每一个专利通过引用整体并入本文。

使用Fc特异性引物通过RT-PCR从人白细胞cDNA文库(Clontech)获得人重组Fc的编码序列。设计使B结构域缺失的FVIII序列直接融合至Fc序列的N-末端而不用间插接头的引物。将FVIIIFc DNA序列在CMV启动子的控制之下克隆入哺乳动物双表达载体pBUDCE4.1(Invitrogen)。通过T-PCR获得包含小鼠Igk信号序列的第二相同的Fc序列，然后将其克隆在所述表达载体pBUDCE4.1的第二启动子EF1α的下游。

使用Lipofectamine 2000转染剂(Invitrogen)将rFVIII Fc表达载体转染入人胚胎肾293细胞(HEK293H；Invitrogen)。通过利用Zeocin(Invitrogen)选择产生稳定的克隆细胞系。将一个克隆细胞系3C4-22用于产生FVIIIFc以进行体内表征。在Biogen Idec(Cambridge，MA)产生和纯化重组FVIIIFc(McCueJT等人，J.Chromatogr.A 2009；7824-7830，通过引用整体并入本文)。预期上述转录策略产生3种产物，即单体rFVIIIFc杂交体、二聚rFVIIIFc杂交体和二聚Fc。然而，在来自这类细胞的条件化培养基中基本上不存在可检测的二聚rFVIIIFc。相反，条件化培养基包含Fc和单体rFVIIIFc。二聚rFVIIIFc的尺寸可能太大以至于被阻止从细胞高效分泌。该结果是有益的，因为其使得单体的纯化比在所有3种蛋白质都存在的情况下简单。这类研究中使用的材料具有约9000IU/mg的比活性。此外，这类人细胞产生比在本实验中尝试的其它细胞更高的蛋白质水平。

重组FVIII

重组B结构域缺失的

购自Novis Pharmaceuticals并且按照制造商的说明书进行制备。

(重组B结构域缺失的FVIII)具有与SEQID NO:2的氨基酸1-1438相同的氨基酸序列。

血友病A动物

血友病A小鼠为129xB6背景上的FVIII外显子16敲除，所述129xB6背景获自University of Pennsylvania的Dr.Kazazian(Bi L等人，Nat.Genet.1995；10(1):119-121，通过引用整体并入本文)并且饲养于Syntonix。这些小鼠展示延长的全血凝固时间(>60分钟)，从而是严重血友病A的良好模型。

血友病A狗来自在University of North Carolina，Chapel Hill的弗兰西斯欧文血液研究实验室(Francis Owen Blood Research Laboratory)维持的近交群(Graham，JB等人，J.Exp.Med.1949；90:97-111，通过引用整体并入本文)。这些狗具有可与人疾病的严重形式相比较的严重血友病表型(Graham，JB等人，J.Exp.Med.1949；90:97-111；Lozier，JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2002；99:12991-12996，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。

研究设计

血友病A小鼠的研究

在FVIII缺陷小鼠中研究rFVIIIFc和对全血凝固时间(WBCT)的影响。以50IU/kg静脉内施用每一种蛋白质，在给药前和给药后不同的时间点上从每一只小鼠的尾静脉收集血。将血液样品在37℃下于微量管中进行温育，每分钟目测检查凝固的存在一次。记录凝固形成的时间。如果到了60分钟无凝固形成，则将凝固时间记录为>60分钟。在WBCT测定中正常小鼠的血液在约4分钟(范围2-7分钟，n=10只小鼠)内凝固。

在第二组研究中，给血友病A小鼠静脉内施用单剂50IU/kg rFVIIIFc、

或

(4只小鼠/时间点)。在给药后0.25、8、24，48和72小时通过心脏穿刺激将血液收集在1/10体积的3.2%柠檬酸钠中。制备血浆，将其于-80℃下贮存直至使用FVIII特异性生色活性测定法对FVIII活性进行分析。

血友病A狗的研究

在rFVIIIFc的单剂量PK/PD研究中，给来自Chapel Hill繁殖群的两条血友病A狗静脉内施用单剂125IU/kg，在给药前和给药后指定的时间点上收集血液样品以用于WBCT、激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partialthromboplastin time)(aPTT)、FVIIIFc血浆浓度、血液学和血清化学。用于WBCT的时间点包括给药前、给药后5和30分钟以及1、2、4、8、24、32、48、72、96、144和168小时。用于凝固活性(aPTT)和FVIIIFc血浆浓度的血液收集包括上文对于WBCT所列的时间点以及给药后15分钟和3、6、12小时。

进行第二研究，其中静脉内施用

(114IU/g(针对狗M12)和120IU/kg(针对狗M38))。测量WBCT直至凝固时间超过20分钟(与FVIII:C>1%一致)，随后将125IU/kg rFVIIIFc静脉内施用至相同的狗，收集血液样品以进行WBCT、aPTT、FVIIIFc血浆浓度、血液学和血清化学。用于WBCT的时间点包括给药前、给药后5和30分钟以及1、2、4、8、24、32、48、72小时。还在利用FVIIIFc给药后96、120、144和168小时收集血液。用于凝固活性和FVIIIFc血浆浓度的血液收集包括上文所列用于WBCT的时间点以及给药后15分钟和3、6、12小时。

血友病A狗的WBCT过程与血友病A小鼠中的略微不同。在用rFVIIIFc或

给药后，在不同的时间点收集1mL的血液，将0.5mL稀释入两个硅化玻璃管中，随后将所述玻璃管置于28℃水浴中。始于第1分钟，将一个管每30秒倾斜一次，第二个管保持不动。当凝块在倾斜的管中形成时，随后使第二个管每30秒倾斜一次直至凝块形成。将第二个管中完全胶化凝块形成所需的时间记录为WBCT。

血浆中的FVIII活性

利用FVIII特异性生色测定法测量血浆中的FVIII活性

使用Sysmex CA1500仪通过自动生色法测试血浆样品的FVIII活性，试剂来自Siemans Healthcare Diagnostics(Dallas，TX，试剂盒#B4238-40)。使用利用浓度范围为1.5-0.016IU/mL的掺入人FVIII-耗尽的血浆(Stago USA)的第7国际标准因子FVIII浓缩物(NIBSC代码99/678)产生的标准曲线测定rFVIIIFc的活性。

利用ELISA测量rFVIIIFc或FVIII

利用ELISA测量狗血浆中的FVIIIFc

将特异于A1结构域的FVIII抗体(Green Mountain Antibodies:GMA-8002)涂覆在96孔板上并且在37℃下温育1小时。在室温下用含有Tween 20、CaCl₂和牛血清白蛋白的Tris-缓冲盐溶液封闭涂覆的板1小时，随后将标准、对照和在正常狗血浆中制备的样品以1:10稀释，然后添加至板中并且在37℃下温育1小时。洗涤板，随后添加驴(F(ab)'₂)抗-人Fc-HRP(Jackson:709-036-098)，将其在37℃下温育1小时。洗涤后，将TMB(BioFx超敏底物:TMBS-0100-01)添加至板中，用酸淬灭底物反应，在Spectra Max Plus板读数器(MolecularDevices)上于450nm处测量吸光度。

利用ELISA测量狗血浆中的

将特异于重链上的A1结构域的FVIII抗体(Green Mountain Antibodies:GMA-8002)涂覆在96孔板上并且在室温下温育2小时。在37℃下封闭涂覆的板1小时，洗涤后，将1:10稀释的标准、对照和在正常狗水浆中制备的样品添加至板中并且在室温下温育2小时。洗涤板，随后用检测抗体预稀释的抗-FVIII辣根过氧化物酶缀合物(Affinity Biologicals:F8C-EIA-D)处理板，在室温下温育1小时。洗涤后，将TMB(BioFx超敏底物:TMBS-0100-01)添加至板中进行10分钟。用酸淬灭底物反应，在Spectra Max Plus板读数器(MolecularDevices)上于450nm的波长处测量信号。

血纤蛋白原的测量

按照制造商的说明书，使用包括HemoslL^TM PT-Fibrinogen-HS试剂(Instrumentation Laboratory，Lexington，MA，Catalog#0008468210)和ACL 7000Coagulation分析仪(Beckman Coulter)的试剂盒在Esoterix(Research TrianglePark，NC)上测量血浆中血纤蛋白原的浓度。

血小板的测量

使用利用物种特异性智能卡编程的Vet-ABC-Diff Hematology分析仪(SCILAnimal Care Co.，Gurnee，IL)通过自动化方法在EDTA抗凝全血中对血小板进行计数。

药代动力学分析

使用来自Pharsight的WinNonlin软件5.2版(Mountain View，Ca)通过非房室模型分析(Noncompartmental Analysis)计算药代动力学参数。PK参数包括最大血浆浓度(Cmax)、血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)、消除半衰期(t1/2)、分布容积(volume of distribution)(Vss)和清除率(Cl)。

结果

重组FVIII-Fc

rFVIIIFc为人B结构域缺失的FVIII与来自人IgG1的Fc的具有无间插接头序列的重组融合物(rFVIIIFc；图1)。

纯化的rFVIIIFc具有约9000IU/mg的比活性，如使用生色活性测定法测定的。重组B结构域缺失的

具有报导的9110-13700IU/mg的比活性。考虑了FVIIIFc与

(分别地216kDa和170kDa)之间的大小差异的比活性至IU/nmol的转化表明两种蛋白质具有几乎相等的比活性(1970IU/nmol(针对rFVIIIFc)和1521-2287IU/nmol(针对

))。因此，rFVIIIFc的FVIII活性不受人FVIII的C末端至人Fc的N末端的融合影响。

至血友病A小鼠的施用

将单次50IU/kg剂量的rFVIIIFc或

静脉内施用给FVIII缺陷小鼠(n=6/组)。给药前和在给药后120小时的过程中收集血液样品，如材料和方法中所述测定WBCT。基线WBCT大于60分钟。来自代表性实验的数据示于图2和表3中。WBCT在利用rFVIIIFc或

给药后即刻被校正至2-17分钟。来自用

处理的小鼠的血液丧失了在42小时凝固的能力，然而来自所有用rFVIIIFc处理的小鼠的血液仍然在96小时凝固，6只小鼠中有1只的血液在第113小时凝固，但全部丧失在120小时凝固的能力。这些数据表明rFVIIIFc的作用持续时间约为

的2至3倍。

在单次50IU/kg的静脉内注射后在FVIII缺陷小鼠中研究rFVIIIFc、

或

(全长重组FVIII)的生色活性。在给药前和给药后第8、24、48和72小时收集血液。使用FVIII特异性生色活性测定法测量活性，所述活性示于图3中。药代动力学参数报告于表4中。rFVIIIFc的循环半衰期为

(7小时)和

(5小时)的约1.6至2倍(11.1小时)。与针对

的0.47±0.30IU/mL和针对的0.67±0.44IU/mL相比较，针对rFVIIIFc的Cmax为1.6±0.36IU/mL。在血友病A小时中，与

(6.94小时IU/mL)和

(3.90小时IU/mL)相比较，对于rFVIIIFc(22.6小时IU/mL)，rFVIIIFc的全身性暴露显著更大，并且与

(7.2mL/小时/kg)和

(12.8小时/mL/kg)相比较，rFIIIFc的清除率显著更低(2.09mL/小时/kg)。

至血友病A狗的施用

在血友病A狗的Chapel Hill繁殖群中研究rFVIIIFc的药效学(PD)和药代动力学(PK)。给4只血友病A狗的每一只施用125IU/kg rFVIIIFc的单次静脉内剂量，WBCT立即被校正至正常(图4)。正常狗中的WBCT的范围为8-12分钟。WBCT保持少于20分钟，与FVIII:C>1%一致的时间，持续约96小时(除一只具有少于20分钟的WBCT且持续72小时的狗外)。此外，aPTT也立即被校正至正常(表6)。使用被设计用以检测分子的FVIII和Fc部分的特异性ELISA测量rFVIIIFc的血浆浓度。血浆浓度-时间曲线示于图5中。数据的PK分析显示t_1/2为15.7±1.7小时(表5)。当使用FVIII特异性生色活性测定法测量时，获得相似的结果(t_1/2=15.4±0.3小时，表5)，使用两种方法(图5和6)产生的血浆浓度-时间曲线相似。当使用rFVIIIFc的比活性将活性数据从IU/mL转换成ng/mL时，存在与ELISA数据的良好相关性，从而证明通过ELISA测量的蛋白质具有完全活性。

在利用rFVIIIFc给药前72小时，两条用rFVIIIFc处理的狗还接受单次剂量的114IU/kg(针对狗M12)和120IU/kg(针对狗M38)。在用给药后，WBCT和aPTT立即被校正至正常。然而，在单次剂量的rFVIIIFc后WBCT的正常化持续时间约为

的2倍(图4)。此外，当利用ELISA测量蛋白质的血浆浓度时(表5)，对于rFVIIIFc，rFVIIIFc的血浆半衰期(15.7±1.7小时)约为

(7.0和6.7小时)的2倍。当利用FVIII特异性生色活性测量两种分子时，获得相似的结果。

为了评估凝血活性(thrombogenicity)的潜在风险，测量血小板和血纤蛋白原。在利用rFVIIIFc或

给药后，血小板数目和血浆血纤蛋白原浓度与给前值(数未显示)相比较未改变。

讨论

在来自稳定转染的细胞系的人胚胎肾293(HEK 293)细胞中产生重组FVIIIFc，将其从细胞培养物中纯化。人细胞系中的产生与目前市售的在中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞中产生的rFVIII产物相比较显示了制造上的显著变化。该变化的基础理论是预期最佳地配备人细胞以进行该分子的FVIII部分的必需翻译后修饰。

考虑到rFVIIIFc与重组B结构域缺失的

的分子量的差异的比活性至IU/nmol的转换表明两种蛋白质的比活性(1970IU/nmol(针对rFVIIIFc)和1521-2287IU/nmol(针对

))是相似的。有点令人惊讶的是rFVIIIFc的比活性不受FVIII的C末端与Fc的N末端的融合影响，因为FVIII的C1和C2结构域参与完全FVIII活性所必需的磷脂结合(Fay，PJ，J.Hematology 83:103-8(2006)和Raut，S等人，Br.J.Haematol.107:323(1999)，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。

在出血事件发生时按需治疗血友病A，或利用预防法治疗血病A以预防出血。虽然仍然频繁使用按需治疗，但存在朝向关节损伤的预防和防止的趋势(Blanchette P等人，Haemophilia 2004:10；679-683，Manco-Johnson，MJ等人，N.Engl.J.Med.2007；357:535-544，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。为了进行预防，现有FVIII产品因10-12小时的相对短的半衰期而要每2或3天施用一次以在患者中维持高于1%的FVIII:C(Morfini，M，Haemophilia2003；9(增刊1):94-99；discussion 100，White GC等人，Thromb.Haemost.1997:77:660-7，Blanchette，P等人，J.Thromb.Haemost.2008Aug；6(8):1319-26，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。提供延长的出血保护作用的长效FVIII疗法可代表血友病A患者的生活质量的显著提高。延长凝血因子的半衰期的策略包括已成功地用于其它分子的策略，包括PEG化(Rostin J等人，Bioconj.Chem.2000；11:387-96，通过引用整体并入本文)、糖聚乙二醇化(glycopegylation)(Stennicke HR等人，Thromb.Haemost.2008；100:920-8，通过引用整体并入本文)、利用PEG化的脂质体的配制(Spira J等人，Blood 2006；108:3668-3673，Pan J等人，Blood 2009；114:2802-2811，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)和与白蛋白的缀合(Schulte S.，Thromb.Res.2008；122增刊4:S14-9，通过引用整体并入本文)。PEG化代表降低清除率的方法，然而，修饰的体内作用目前尚不清楚。在体内FVIII的直接PEG化的结果目前尚不清楚，然而已临床研究了利用PEG化脂质配制的RVIII，所述RVIII显示了对出血事件的中等作用至无作用(Spira J等人，Blood 2006；108:3668-3673，SpiraJ等人，Thromb.Haemost.2008Sep；100(3):429-34，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。

延长FVIII的半衰期的本方法是将FVIII重组地融合至IgG1的Fc结构域。Fc结合天然存在的受体FcRn，其正常功能是保护IgG免受降解。本文中描述的结果代表血友病A小鼠和血友病A狗中rFVIIIFc与rFVIII产物相比较的初始药代动力学和效率的表征。在两个物种中，rFVIIIFc的半衰期都为当通过FVIII活性或ELISA(仅用于狗)测量时的rFVIII的半衰期的约2倍。这些数据也与来自两个动物模型的WBCT结果良好相关，即rFVIIIFc对WBCT的作用的持续时间约为的2倍。在狗中，rFVIIIFc与的Cmax和清除率相似，rFVIIIFc的AUC和稳态分布容积分别为

的约1.5倍和2倍。在该动物模型中

的PK参数与文献(Brinkhous K等人，Sem.Thromb.Haemost.2002；28:269-272，通过引用整体并入本文)中报导的值一致。

如果这些发现翻译成人中半衰期的相同延长，则这可代表血友病A患者的治疗中的重大进步。

其它参考资料(将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)

Berkner K.，Methods Enzymol.1993；222:450-477.

Bitonti AJ和Dumont JA.，Adv.Drug Del.Rev.2006；58:1106-1118.

Dumont J A等人，J.Aerosol Med.2005；18:294-303.

Dumont JA等人，BioDrugs 2006:20:151-160.

Ellis CN和Krueger GG.，N.Engl.J.Med.2001；345:248-55.

Low SC等人，Hum Reprod.2005:7:1805-1813.

Manco-Johnson，M.，Haemophilia 2007；13增刊；2:4-9.

Mannucci，PM.和Tuddenham，EGD.，N.Engl.J.Med.2001；344:1773-1779.

Peyvandi F等人Haemophilia 2006；12(增刊3):82-89.

Rodriguez-Merchan，EC，Semin.Thromb.Hemost.2003；29:87-96.

Srour MA等人，Ann.Hematol.2008；87:107-12.

实施例2

本研究的目的是测定在单次静脉内剂量后rFVIIIFc和

在食蟹猴中的药代动力学和药效学。

材料和方法

rFVIIIFc(Biogen Idec)，以1.2mg/mL和9882IU/mL的浓度作为冷冻液体提供。比活性为8235IU/mg。于-70℃下贮存。注射前将其稀释。

名称：Xyntha(Novis Pharmaceuticals)，作为冻干的粉剂(按照制造商的说明书将其重建以产生具有525IU/mL的标称浓度的溶液)。按照制造商的推荐进行贮存。

动物

使用来自新伊比利亚研究中心(New Iberia Research Center)(NIRC)繁殖群的食蟹猴，本研究在(NIRC研究#8733-0903)在批准的NIRC IACUC方案(APS2008-8733-058)下于New Iberia，LA的NIRC进行。

在研究中使用6只经确定处于良好健康状况的首次用于实验的食蟹猴(3只雄性，3只雌性)。

按照方案和UL Lafayette-NIRC标准操作步骤进行研究。

研究设计

以125IU/kg给6只猴(3只雄性，3只雌性)的每一只静脉内施用rFVIIIFc。在交叉设计中以125IU/kg给相同的动物静脉内施用Xyntha(BDD-rFVIII)。组1动物(n=3)在第0天接受Xyntha，在第3天接受rFVIIIFc，然而组2动物(n=3)在第0天接受rFVIIIFc，然后在第4天接受Xyntha。用于组2的剂量之间多出的一天是为了确保rFVIIIFc具有足够的时间来下降至低于设计的基线水平。在给药前和给药后第0.25、4、12、24、36、48和72小时将每一只动物的血液收集在1/10体积的3.2%柠檬酸钠中(以获得血浆)，以用于通过ELISA和FVIII特异性生色活性测定法测量rFVIIIFc或Xyntha。

测量血浆中的rFVIIIFc和FVIII的ELISA

测量猴血浆中的rFVIIIFc的方法

设计该酶联免疫吸附测定法(ELISA)以定量猴血浆中的rFVIIIFc。在该ELISA法中，将来自Bethyl Laboratories(Cat#A80-319A)的山羊抗-人IgG-(H+L)抗体(猴吸收的)稀释于涂覆缓冲液中，将其固定在96孔微量滴定样品板上。抽吸该板，通过添加封闭缓冲液(3%BSA/1xTris)在37℃下进行约2小时来封闭该所有未吸附的位置。用高钙样品稀释缓冲液(3%的含有30mM CaC1₂的脱脂干乳/TBST)以1:20稀释血浆样品，将其分配至样品板中。将板在37℃下温育约2小时。随后洗涤板，将来自Green Mountain Antibodies的小鼠抗-B结构域缺失的(a.BDDA1)因子VIII(A1结构域)抗体(Cat#GMA-8002)添加至板中，在37℃下温育约1小时。洗涤板后，将来自Southern Biotech的缀合有HRP的山羊抗-小鼠IgG2a抗体(Cat#1080-05)添加至板中，在室温下温育约30分钟。再次洗涤板，加入四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物溶液，在室温下温育约30分钟。通过添加非酸性终止溶液终止反应。颜色显现与样品中的rFVIIIFc的量成正比。使用单检测波长650nm在吸收板读数器上读取板。在通过使用4参数逻辑曲线拟合程序(four-parameter logistic curve-fitting program)将光密度(OD)对浓度作图获得的标准曲线上测定rFVIIIFc的浓度。该方法的标准曲线范围是5%猴血浆中的0.400ng/mL-51.2ng/mL(100%的猴血浆中的8.00ng/mL-1024ng/mL)。可包括在测定的定量范围外的一个校准点(5%猴血浆中的0.200ng/mL)来用作有助于曲线拟合的锚点(anchor point)。可基于曲线的最佳拟合(即，在确定的精确度内读取最高数量的标准，%RE)除去或保留锚点。

测量猴血浆中的FVIII的方法

设计该酶联免疫吸附测定法(ELISA)以定量猴血浆中的FVIII。在该ELISA法中，将来自Green Mountain Antibodies(Cat#GMA-8002)的小鼠αBDDA1FVIII抗体稀释于涂覆缓冲液中，并且将其固定在96孔微量滴定样品板上。抽吸该板，通过添加封闭缓冲液(3%BSA/1xTris)在37℃下进行约1小时来封闭所有未吸附的位置。用高钙样品稀释缓冲液(含有100mM CaC1₂的封闭缓冲液)以1:20稀释血浆样品，将其分配至样品板上。将板在37℃下温育约2小时。洗涤板后，将来自Affinity Biologicals试剂盒的检测抗体HRP标记的多克隆抗体(Cat#F8C-EIA-D)进一步稀释于TBS/0.05%Tween 20中，然后添加至板并且在室温下温育约1小时。再次洗涤板，加入四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物溶液，在室温下温育约30分钟。通过添加酸性终止溶液终止反应。颜色显现与样品中的FVIIIF的量成正比。使用单检测波长450nm在吸收板读数器上读取板。在通过使用4参数逻辑曲线拟合程序将光密度(OD)对浓度作图获得的标准曲线上测定FVIIIF的浓度。该方法的标准曲线范围是5%猴血浆中的0.625ng/mL-20ng/mL(100%的猴血浆中的12.5ng/mL-400ng/mL)。可包括在测定的定量范围外的2个校准点(5%猴血浆中的0.313和0.156ng/mL)来用作有助于曲线拟合的锚点。可基于曲线的最佳拟合(即，在确定的精确度内读取最高数量的标准，%RE)除去或保留锚点。

FVHI-特异性生色测定

基于施用的剂量估计食蟹猴血浆样品中的FVIII活性，然后将其在人FVIII-缺失的血浆(Diagnostica Stago)中稀释至约0.25-1IU/ml。使用FVIIIchromogenic试剂盒(Siemens)在Sysmex CA1500(Siemens Diagnostic Healthcare)上分析样品。在该生色测定中，血浆中的rFVIIIFc被凝血酶激活。激活的因子VIII(FVIIIa)随后在激活的因子IX(FIXa)、磷脂(PL)和钙离子存在的情况下加速因子X(FX)至因子Xa(FXa)的转化。通过特异于FXa的对硝基苯胺底物的水解来评估FXa活性。在405nm测量的对硝基苯胺(pNA)的初始释放速率与FXa活性成正比，从而与样品中的FVIII活性成正比。在本测定中因rFVIIIFc而产生的FVIII活性的定量限为约0.3IU/ml。所述测定法可测量下限降至约0.06IU/ml的总FVIII活性，精确度为±20%。从每一个时间点上的值减去个体动物的给药前样品的计算活性以产生PD曲线(FVIII活性对时间)。

从在人FVIII缺陷血浆中稀释至1IU/ml的NIBSC第7国际标准FVIII浓缩物产生标准曲线。将标准曲线在Sysmex仪中进行系列稀释以产生0.15、0.1、0.05、0.025、0.0053和0.0026IU/ml的浓度。由于仪器在内部以1:10稀释所有样品，因此FVIII标准浓度相应于1.5-0.026IU/ml的血浆浓度，这在可测量的FVIII活性的范围内。

PK分析

使用WinNonlin软件系统(5.2版，Pharsight Corporation.Mountain View，CA)中的非房室模型分析模块评估浓度时间谱。

结果

使用测量分子的FVIII和Fc部分的夹心ELISA形式测量rFVIIIFc的猴血浆浓度，在表7中报告数据。所有给药前样品低于定量限。图7举例说明随时间过去组平均rFVIIIFc和Xyntha血浆浓度，个体血浆浓度-时间曲线示于图8中。rFVIIIFc和Xyntha的PK参数的概述分别示于表9和10中。rFVIIIFc的平均t1/2为11.9±1.7小时(从9.3小时变化至14.1小时)，对于Xyntha，平均清除率t1/2为12.7±4.4小时(从9.2小时变化至19.9小时)。

使用FVIII特异性生色活性测定法测量FVIII活性，将数据报告于表8中。从所有样品减去因内源FVIII而产生的给药前活性。平均组数据的图表示于图9中，个体血浆浓度-时间曲线示于图10中。rFVIIIFc和Xyntha的PK参数的概述分别报告于表9和10中。平均清除率t1/2为16.1±6.9小时(从11.6小时变化至29.4小时)(针对rFVIIIFc)和12.5±1.7小时(从10.4小时变化至14.3小时)(针对Xyntha)。

讨论和结论

在125IU/kg的单次静脉内剂量后，无论利用ELISA还是利用生色活性测定法来测定检品，rFVIIIFc与Xyntha的消除半衰期都相似。

实施例3

这将是设计用以评估单次剂量的rFVIIIFc在患有严重(定义为<1IU/dL[1%]内源因子VIII[FVIII])血友病A的受试者中的安全性、耐受性和药代动学的I/IIa期、开放标记、交叉、剂量递增、多中心和首次在人中的研究。招募总共约12个先前治疗的患者，以25或65IU/kg施用rFVIIIFc。在筛查(在

[rFVIII](对照比较试剂)的首次剂量之前28天内安排的)和在首次注射之前在无FVIII处理的情况下经历最少4天(96小时)后，大约6个受试者将接受单次25IU/kg剂量的

然后进行3天(72小时)的药代动力学(PK)表征，随后进行交叉，然后接受25IU/kg的单次开放标记剂量的rFVIIIFc以进行7天(168小时)的PK表征。顺次地给前3个受试者给药。对于前三个(3)利用25IU/kg rFVIIIFc给药的受试者，每一个受试者将在rFVIIIFc注射后第14天(336小时)经历抑制剂评估。一旦完成抑制剂测试，将对接下来的受试者(仅对于前3个受试者)给药。在第3个受试者完成14天的抑制剂评估后，开始将将其余3个受试者(以25IU/kg)和6个受试者(以65IU/kg)至少相隔1天顺次招募入每一个剂量组。

在最后一个受试者接受25IU/kg剂量的rFVIIIFc后1周，大约6个独特的受试者被招募来用作65IU/kg的组群。65IU/kg组群中的每一个受试者将接受单次65IU/kg剂量的

然后进行4天(96小时)PK表征，然后进行交叉表征，接受65IU/kg的单次开放标记剂量的rFVIIIFc，进行10天(240小时)的表征。如果在任何组群中，出血事件在rFVIIIFc的首次注射之前发生，则应当将受试者的研究前FVIII产物用于治疗，随后必须经历至少4天的间隔，然后才开始接受rFVIIIFc的首次注射来进行PK表征。

为安全起见，在施用rFVIIIFc 25IU/kg或65IU/kg后使所有受试者经历14天(336个小时)和28天的安全评估期。所有受试者在将经历给药前和给药后药代动力学取样以及在指定的时间点将血液样品用于FVIII活性分析。

实施例4

Xase复合物内的活性

为了研究FVIII蛋白(rBDD FVIII和rFVIIIFc)与FIXa的结合和测量这类蛋白激活FX的能力，进行动力学研究以在Xase复合物的背景中检查这些相互作用。该测定包括在钙存在的情况下利用激活的FIX和激活的rBDD FVIII或rFVIIIFc蛋白在磷脂表面上形成Xase复合物，监控FX至FXa的转化，如通过生色或发荧光底物的切割测量的。

简而言之，首先用α-凝血酶激活FVIII，进行5分钟，然后在Ca²⁺和合成磷脂囊泡(25%磷脂酰丝氨酸(PS)/75%磷脂酰胆碱(PC))或血小板存在的情况下将其与FIXa混合。在下述条件下，FVIIIa与FIXa在磷脂表面和钙离子存在的情况下相互作用以形成活性Xase复合物，该复合物通过蛋白酶解加工介导FX至FXa的转化。依次地，FXa切割FXa特异性生色或发荧光底物。切割的底物产生颜色，从而溶液中切割的底物的量表示产生的FXa的量。这可通过测量405nm处的溶液的吸光度来定量。

A.因子X的激活

如上所述在Xase复合物的背景中研究rBDD FVIII和rFVIIIFc激活FX的能力。在钙存在的情况下将凝血酶激活的FVIII蛋白与FIXa和磷脂一起温育，随后在FX特异性底物存在的情况下添加至不同浓度的FX中，测定FXa产生的速率(图11)。

基于这些数据，在Xase复合物的背景中计算不同FVIII蛋白的Km和Vmax(Chang 1997)(表11)。数据表示为6个分析(3个包括一式两份运行的实验)的平均值±相应的标准差。基于这些数据，发现在测定的变型内这类蛋白(rBDDFVIII和rFVIIIFc)具有相当的Km和Vmax值。因此，利用rFVIIIFc形成的Xase复合物与利用获得许可的产品rBDD FVIII(ReFacto)形成的Xase复合物在与磷脂相互作用和激活FX的能力方面表现出相似的行为。注意，这些可比较的数据还显示rFVIIIFc在用凝血酶短暂温育后被激活至可与rBDD FVIII相比较的程度。

B.与FIXa的相互作用

也在Xase复合物的背景中检查rBDD FVIII和rFVIIIFc与FIXa之间的相互作用。如上使用固定量的FX和变化的FIXa水平装配Xase复合物，测定FXa的产生速率(图12)。从这些数据测定利用两种FVIII蛋白形成的Xase复合物对FIXa的Kd值(Chang 1997)。数据表示为6个分析(3个包含一式两份运行的实验)的平均值±相应的标准差(表12)。发现两种蛋白质具有相似的Kd和Vmax值，表明rFVIIIFc具有可与被许可的rBDD FVIII产品相比较的与FIXa的相互作用。

实施例5

实施例3中论述的I/IIa期临床试验的临时药代动力学数据(Interimpharmacokinetic data)显示下列FVIIIFc的结果。FVIIIFc与ADVATE(全长rFVIII)相比较具有约50%的全身性暴露量(systemic exposure)(AUC_INF)的增加、约50%的清除率(CI)的减少以及约50-70%的消除半衰期和MRT的增加。此外，FVIIIFc与ADVATE相比较显示增加的C168、TBLP1、TBLP3和TBLP5值。

AUC_INF  从0至无穷大的浓度-时间曲线下面积

βHL  消除期半衰期；也称为t_1/2β

C168  在给药后约168小时高于基线的估计的FVIIIFc活性

Cl    清除率

MRT平均停留时间

TBLP1  给药后当FVIIIFc活性下降至约高于基线1IU/dL时模型预测的时间

TBLP3  给药后当FVIIIFc活性下降至高于基线约3IU/dL时模型预测的时间

TBLP5  给药后当FVIIIFc活性下降至高于基线约5IU/dL时模型预测的时间

实施例6

重组B结构域缺失的因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合蛋白已被产生用作延长FVIII的半衰期的方法。在血友病A小鼠中进行将rFVIIIFc与rFVIII的药代动力学(PK)比较。我们发现rFVIIIFc的终半衰期为rFVIII的2倍。为了验证半衰期延长的背后机制归归于FcRn对rFVIIIFc的保护作用，在FcRn敲除和人FcRn转基因小鼠中评估PK。施用单次静脉内剂量(125IU/kg)，使用生色活性测定法测量血浆浓度。在两个小鼠品系中rFVIIIFc与

的Cmax相似。然而，虽然在FcRn敲除小鼠中，rFVIIIFc的半衰期可与rFVIII的相比较，但在hFcRn转基因小鼠中，rFVIIIFc的半衰期被延长至rFVIII的约2倍。这些结果确认了FcRn介导与rFVIII相比较rFVIIIFc的延长的半衰期或是该延长的半衰期的形成原因。由于已显示在血友病小鼠的出血模型以及临床应用中通过旋转血栓弹性测定法(rotation fhromboelastometry)(ROTEM)测量的全血的动态平衡与凝血因子的效率相关，因此我们寻求使用ROTEM来在血友病A小鼠评估rFVIIIFc的离体效率。给血友病A小鼠施用单次静脉内剂量的50IU/kg rFVIIIFc、

或在给药后5分钟，凝块形成在凝固时间(CT)、凝块形成时间(CFT)和α-角上相似。然而，rFVIIIFc在给药后72和96小时显示显著改善的CT，在96小时后与

和

相比较CFT和α-角也得到改善，这与rFVIIIFc的延长的PK一致。因此FVIII的Fc融合的构建产生了具有确定的作用机制的分子，所述分子具有增加的半衰期和提供延长的出血保护作用的潜能。

实施例7

本实施例提供来自16个用25和65IU/kg FVIII产品治疗的患者的FVIII活性的最终分析结果。参见实施例3和5。

在本实施例中，rFVIIIFc为重组融合蛋白，其由融合至人IgG1的嵌合Fc结构域的重组B结构域缺失的人FVIII的单个分子(BDD-rFVIII)组成，该分子无间插接头序列。该蛋白质结构在本文中也称为rFVIIIFc异二聚杂交蛋白、FVIIIFc单聚Fc融合蛋白、FVIIIFc单体杂交体、单体FVIIIIFc要交体以及FVIIIFc单体-二聚体。参见实施例1、图1和表2A。

利用rFVIIIFc的临床前研究已显示与商购可得的rFVIII产品相比较rFVIII活性的约2倍的半衰期延长。本研究的原理是在严重血友病A受试者中评估单次剂量的以冷冻液体制剂形式存在的rFVIIIFc的安全性和耐受性以及提供关于PK的数据。为了进行本研究，16个可评价的受试者可用于PK评估。两个剂量(以25(n=6)和65IU/kg的体重(n=10)的标称剂量)的rFVIIIFc和Advate的单次施用是在约10分钟的时期内进行静脉内输注。在输注之前以及在给药后达到10天，获得用于血浆PK评估的血液样品。在本研究中使用模型依赖性方法表征Advate和rFVIIIFc的FVIII活性的PK。

目的

本研究的主要目的是在先前治疗的年龄12岁以上的严重血友病A患者(PTP)中评估两个剂量(25和65IU/kg)的rFVIIIFc的单次施用的安全性和耐受性。

第二目的是在一步凝集测定和生色测定中测定25或65IU/kg的rFVIIIFc的单次施用后随时间过去FVIII相对于Advate的药代动力学(PK)参数(通过FVIII的药效(PD)活性测定的)。

研究设计(参见实施例3)

在筛查随访时(在施用Advate之前28天内)、在注射当天(Advate的注射)和在注射后第10分钟和30分钟以及第1、3、6和9小时、在Advate的注射后第1天(第24小时)、在Advate注射后第2天(第48小时)、在Advate的注射后第3天(第72小时)以及在高剂量的Advate注射(仅组群B)后第4天(在第96小时)收集Advate血液样品以进行FVIII活性的PK评估。

在即将施用rFVIIIFc之前在rFVIIIFc注射当天、在rFVIIIFc注射后第10分钟和30分钟以及第1、3、6和9小时；在rFVIIIFc注射后第1天(第24小时)；在rFVIIIFc注射后第2天至第5天(第48、72、96和120小时)、在rFVIIIFc注射后第7天(第168小时)、在高剂量的rFVIIIFc注射(仅组群B)后第8、9和第10天(第192、216和240小时)收集血液样品以进行FVIII活性的PK评估。也在最终的研究随访(rFVIIIFc注射后28天)时，在rFVIIIFc注射后第672小时测量FVIII活性。

药代动力学建模和计算

缩写

TBLP1=在给药后当FVIII活性下降至高于基线1IU/dL时模型预测的时间

TBLP3=在给药后当FVIII活性下降至高于基线3IU/dL时模型预测的时间

KV_M=Cmax_M/实际剂量(IU/kg)

KV_OB=Cmax_OB/实际剂量(IU/kg)

IVR_M=100xCmax_Mx血浆体积(dL)/以IU表示的总剂量；其中以ml表示的血浆体积=(23.7Ht(以cm表示))+(9.0Wt(以kg表示))-1709。

IVR_OB=100Cmax_OBx血浆体积(dL)/以IU表示的总剂量；其中以ml表示的血浆体积=(23.7xHt(以cm表示))+(9.0Wt(以kg表示))-1709。

结果

图13.观察到的组平均值(+SE)FVIII活性-时间曲线，通过剂量水平分选的，通过化合物分组的(一步测定法，25IU/kg(A)和65IU/g(B))和(生色测定法，25IU/kg(C)和65IU/kg(D))。

图14.观察到的组平均值(+SE)FVIII活性-时间曲线，通过剂量水平和化合物分组的(一步测定法；A)(生色测定法；B)。

单次剂量药代动力学(一步测定法)

在Advate或rFVIIIFc的短暂IV输注后观察到的FVIII活性急剧升高，25和65IU/kg剂量组的平均(±SD)模型预测的Cmax值分别为56.6±4.74和121±28.2IU/dL(针对Advate)以及55.6±8.18和108±16.9IU/dL(针对rFVIIIFc)。所有Advate-和rFVIIIFc-处理的患者具有FVIII活性的剂量相关增加。观察到的Cmax和AUCINF的增加的程度在评估的剂量范围内略低于剂量的增加。

输注结束后，观察到的FVIII活性的下降显示单指数衰减(monoexponentialdecay)特征直至达到基线水平。rFVIIIFc的FVIII活性的下降速率比Advate慢，对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型-预测的消除半衰期值分别为11.9±2.98和10.4±3.03小时(针对Advate)以及18.0±3.88和18.4±6.99小时(针对rFVIIIFc)。消除半衰期在对两种FVIII产品进行评估的剂量范围内表现出不依赖于剂量。

在以25和65IU/kg剂量水平施用rFVIIIFc后，总的全身性FVIII暴露(通过AUCINF评估的)分别比Advate大~48%和61%。对于25和65IU/kg的剂量组，平均(±SD)模型预测的AUCINF值分别为974±259和1810±606小时*IU/dL(针对Advate)以及1440±316和2910±1320小时*IU/dL(针对rFVIIIFc)。

与消除半衰期类似，相对于Advater，FVIIIFc的MRT获得延长。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的MRT值分别为17.1±4.29和14.9±4.38小时(针对Advate)以及25.9±5.60和26.5±10.1小时(针对rFVIIIFc)。MRT值在对两种FVIII产物进行评估的剂量范围内表现出不依赖于剂量。

此外，测定CL和V的一级PK参数值。rFVIIIFc的CL值仅约占对于等剂量的Advate观察到的CL值的66%。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的CL值分别为2.70±0.729和4.08±1.69mL/小时/kg(针对Advate)以及1.80±0.409和2.69±1.25mL/小时/kg(针对rFVIIIFc)。Advate与rFVIIIFc的V值相当，对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的V值分别为43.9±4.27和56.1±13.4mL/kg(针对Advate)以及45.3±7.23和61.6±10.6mL/kg(针对rFVIIIFc)。随Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，注意到平均CL和V值的略微增加；然而，与有限的剂量水平偶联的65IU/kg剂量上的标准差的增加使得这些参数的剂量依赖性的评估含糊不清。例如，rFVIIIFc处理组的CV%几何平均CL值从23.0%(25IU/kg)增加至48.6%(65IU/kg)。

除了一级PK参数外，还测定二级PK参数(例如K-值、IVR等)以评估效应的FVIII持续时间。对于rFVIIIFc也观察到PK差异的证据，证明了与等剂量的Advate相比较TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相当。随着Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，观察到LBLP1和LBLP3值的略微增加。相反地，随着Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，注意到平均IVR和K-值的略微减小。如先前所指出的，这些参数的剂量依赖性的评估因有限的剂量水平而含糊不清。

对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的TBLP1分别为2.88±0.733和2.93±0.848IU/dL每IU/kg(针对Advate)以及4.28±0.873和5.16±2.02IU/dL每IU/kg(针对rFVIIIFc)。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的TBLP3分别为2.06±0.527和2.26±0.666IU/dL每IU/kg(针对Advate)以及3.09±0.623和3.93±1.59IU/dL每IU/kg(针对rFVIIIFc)。

使用观察到的Cmax值计算的平均IVR和K-值(扣除基线和模型中的残留药物)通常大于使用模型预测的Cmax值测定的值；与使用单室模型(one-compartment model)产生的观察到的峰值活性的略微低估相一致。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的K-值分别为2.57±0.198和2.13±0.598IU/dL每IU/kg(针对Advate)以及2.46±0.330和1.85±0.332IU/dL每IU/g(针对rFVIIIFc)。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的IVR值分别为94.1±15.6和85.8±16.5%(针对Advate)以及89.5±11.9和74.8±6.72%(针对rFVIIIFc)。

单次剂量药代动力学(生色测定法)

在Advate或rFVIIIFc的短暂IV输注后观察到的FVIII活性急剧升高，对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的Cmax值分别为70.2±9.60和157±38.6IU/dL(针对Advate)以及70.3±10.0和158±34.7IU/dL(针对rFVIIIFc)。

所有Advate-和rFVIIIFc-处理的患者具有FVIII活性的剂量相关增加。观察到的Cmax和AUCINF的增加的程度在评估的剂量范围内比剂量的增加略低。

输注结束后，观察到的FVIII活性的下降显示单指数衰减直至达到基线水平。rFVIIIFc的FVIII活性的下降速率比Advate慢，对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型-预测的消除半衰期值分别为10.7±1.98和10.3±3.27小时(针对Advate)以及16.2±2.92和19.0±7.94小时(针对rFVIIIFc)。消除半衰期在对两种FVIII产品进行评估的剂量范围内表现出不依赖于剂量。

在以25和65IU/kg剂量水平施用rFVIIIFc后，总的全身性FVIII暴露(通过AUCINF评估的)分别比Advate大~53%和84%。对于25和65IU/kg的剂量组，平均(±SD)模型预测的AUCINF值分别为1080±236和2320±784小时*IU/dL(针对Advate)以及1650±408和4280±1860小时*IU/dL(针对rFVIIIFc)。

与消除半衰期类似，相对于Advater，FVIIIFc的MRT获得延长。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的MRT值分别为15.3±2.86和14.8±4.72小时(针对Advate)以及23.4±4.22和27.3±11.4小时(针对rFVIIIFc)。MRT值在对两种FVIII产物进行评估的剂量范围内表现出不依赖于剂量。

此外，测定CL和V的一级PK参数值。rFVIIIFc的CL值仅占对于等剂量的Advate观察到的CL值的~58-66%。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的CL值分别为2.39±0.527和3.21±1.40mL/小时/kg(针对Advate)以及1.57±0.349和1.86±0.970mL/小时/kg(针对rFVIIIFc)。Advate与rFVIIIFc的V值相当，对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测的V值分别为5.8±5.52和43.6±11.2mL/kg(针对Advate)以及35.9±6.65和42.7±8.91mL/kg(针对rFVIIIFc)。随Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，注意到平均CL和V值的增加；然而，与有限的剂量水平偶联的65IU/kg剂量上的标准差的增加使得这些参数的剂量依赖性的评估含糊不清。

除了一级PK参数外，还测定二级PK参数(例如K-值、IVR等)以评估效应的FVIII持续时间。对于rFVIIIFc也观察到PK差异的证据，证明了与等剂量的Advate相比较TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相当。

随着Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，观察到LBLP1和LBLP3值的略微增加。相反地，随着Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，注意到平均IVR和K-值的略微减小。如先前所指出的，这些参数的剂量依赖性的评估因有限的剂量水平而含糊不清。

对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的TBLP1分别为2.70±0.511和3.09±0.978IU/dL每IU/kg(针对Advate)以及4.06±0.798和5.66±2.38IU/dL每IU/kg(针对rFVIIIFc)。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的TBLP3分别为1.98±0.377和2.39±0.718IU/dL每IU/kg(针对Advate)以及3.04±0.598和4.44±1.84IU/dL每IU/kg(针对rFVIIIFc)。

使用观察到的Cmax值计算的平均IVR和K-值(扣除基线和模型中的残留药物)通常大于使用模型预测的Cmax值测定的值；与使用单室模型产生的观察到的峰值活性的略微低估相一致。对于25和65IU/kg剂量组，平均(±SD)观察到的K-值分别为3.08±0.429和2.85±0.721IU/dL每IU/kg(针对Advate)以及3.12±0.451和2.92±0.985IU/dL每IU/kg(针对rFVIIIFc)。对于25和65IU/g剂量组，平均(±SD)观察到的IVR值分别为112±14.5和116±26.9%(针对Advate)以及113±16.3和117±33.6%(针对rFVIIIFc)。

结论

所有Advate-处理和rFVIIIFc-处理的患者在评估的剂量范围内具有Cmax和AUCINF的剂量相关增加。通常在输注结束后第1小时内观察到Advate和rFVIIIFc的峰值血浆水平，其在给药后数天中仍可被检测到。在输注结束后，基线校正的FVIII活性的下降显示单指数衰减直至达到两种产品的基线。在对两种FVIII产品进行评估的剂量范围内消除半衰期和MRT的参数值表现出不依赖于剂量。随着Advate和rFVIIIFc的剂量逐渐增加，注意到平均CL和V值的略微增加；然而，与有限的剂量水平偶联的65IU/kg剂量上的受试者间差异性的增加使得这些参数的剂量依赖性的评估含糊不清。

rFVIIIFc与Advate活性的PK的比较显示对于相当剂量的Advate，rFVIIIFc的全身性暴露增加约48-61%(一步测定法)或53-84%(生色测定法)、清除率减少约30-40%以及清除半衰期和MRT增加约50-80%。对于rFVIIIFc也观察到PK差异的证据，证明了与等剂量的Advate相比较TBLP1和LBLP3增加。Advate和rFVIIIFc的IVR和K-值似乎相当。

除生色测定产生更高的暴露参数评估(例如Cmax、AUCINF等)外，获自生色测定结果的PK参数通常与来自一步测定法的PK参数一致。

由于观察到的PK的提高，rFVIIIFc可提供延长的出血保护作用，从而允许对患有血友病A的个体进行更低频率的注射。

实施例8

基于来自rFVIII:Fc的首次在人中的研究(实施例3)的临时PK分析，设计A-LONG研究。A-LONG是重组因子VIII Fc融合物(FVIII:Fc)在先前治疗的患有严重血友病A(定义为<1IU/dL[<1%]内源FVIII)的受试者的出血的预防和治疗中的安全性、药代动力学和效率的开放标记、多中心评估。

约106个受试者被招募入3个方案之一：定制的预防性方案(arm 1)、每周一次的给药方案(arm 2)和按需治疗方案(arm 3)。

Arm 1:定制的预防性方案

Arm 1可包括总体组和PK亚组。招募了大约66个受试者。初始方案为每周2次，第1天以25IU/kg施用，然后在该周的第4天以50IU/g施用。受试者将在该周预防法中施用rFVIIIFc直至rFVIIIFc的PK结果可获得。基于这些结果，将建立每一个个体的定制的预防性方案，其中确定剂量和间隔以维持1-3%的波谷水平的FVIII活性。随后在整个研究过程中，每一个受试者施用他的单独定制的预防性方案。

在整个研究过程中监控受试者，进行剂量和间隔调整。仅当受试者经历不可接受的出血事件(定义为在滚动的2个月时期内超过2次自发性出血)时进行调整。在该情况下，调整将靶向3-5%的波谷水平。

Arm 2:每周一次给药的方案

大约20个受试者被招募/随机化，并且如下经历简短的rFVIIIFc PK表征：至少96小时的清洗(Washout)；单次剂量的rFVIIIFc 65IU/kg；始于rFVIIIFc当天，包括注射前和从注射开始10(±2)分钟、3小时(±15分钟)、72(±2)小时[第3天]和96(±2)小时[第4天]的简短取样。在简短的PK表征后，受试者可随后每7天施用一次固定剂量的65IU/kg rFVIIIFc。

Arm 3：按需方案

在本研究中将评估至少5个受试者的最少10个大手术。大手术定义为包括全身麻醉(general anesthesia)和/或呼吸援助的任何手术过程(选择的或应急的(emergent))，其中大体腔被穿透并且暴露，或因为该手术产生了身体或生理功能的重大损伤(例如，剖腹手术、开胸术、开颅术、关节置换术和截肢术)。

为在手术期间进行预防，每12至24小时利35至50IU/kg rFVIIIFc处理受试者。在手术之前，医生将仔细研究受试者的rFVIIIFc PK特征并且估量受试者的计划手术的类型和临床状态通常所需的因子VIII替代的剂量方案。在手术治疗期(包括任何康复时间)中对rFVIIIFc的适当给药的推荐将考虑这些因素。

本研究的主要目的是(a)评估作为预防性治疗方案、按需治疗方案和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的安全性和耐受性；和(b)评估作为预防性治疗方案、按需治疗方案和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的效率。本研究的第二目的是(a)表征rFVIIIFc的PK特征和比较FVIIIFc与目前市售的产品ADVATE的PK；(b)评估个体对FVIIIFc的反应；和(c)评估FVIIIFc的消耗。

主要目的

·评估作为预防性治疗方案、每周一次的治疗方案、按需治疗方案和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的安全性和耐受性

·评估作为定制的预防性治疗方案、按需治疗方案和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的效率

次要目的

·表征rFVIIIFc的PK特征和比较FVIIIFc与目前市售的产品

的PK

·评估个体对rFVIIIFc的反应

·表征足以在预防性方案中预防出血所需的剂量范围和时间安排；维持外科设置的动态平衡；或以按需、每周一次的治疗或预防性设置治疗出血事件

·评估rFVIIIFc的消耗(例如，总的年rFVIIIFc消耗/受试者)

实施例9

临床ROTEM评估

在实施例8中的研究中，除通过一步活化部分凝血活酶时间(one-stageactivated partial thromboplastin time)(aPTT)测定法对血浆FVIII活性的测量外，还已开发了全血旋转血栓弹力测定法(whole blood rotationalthromboelastometry)(ROTEM)来评估2个受试者中(具体地，1个在低剂量组群中，1个在高剂量组群中)由rFVIIIFc和Advate产生的全局止血(globalhemostasis)的提高。

当在rFVIIIFc治疗之前掺入受试者的血液时，rFVIIIFc和Advate在血块形成中表现出相当的活性。凝血时间(CT)在约1%至100%的正常的范围内与rFVIIIFc和Advate的剂量线性相关，并且在相同的受试者中rFVIIIFc与Advate的剂量反应是相当的。

在用Advate，随后用rFVIIIFc给药后，在不同时间点上对柠檬酸化全血采样，然后利用ROTEM监控复钙(recalcification)后血块形成。尽管可变基线CT归因于Advate和rFVIIIFc给药前残留的FVIII水平，但两种产品都在注射后30分钟将CT有效地校正至可比较水平。此外，CT的改善在25IU/kg的rFVIIIFc注射时和注射后3小时相对于Advate在以该低剂量给药的受试者中持续更久。然而，在65IU/kg剂量上rFVIIIFc对Advate的差异改善几乎看不出来。

表

表1:多核苷酸序列

A.B结构域缺失的FVIIIFc

(i)B结构域缺失的FVIIIFc链DNA序列(FVIII信号肽用下划线标示， Fc区用粗体标示)(SEQ ID NO:1，其编码SEQ ID NO:2)

(ii)Fc DNA序列(小鼠Igκ信号肽用下划线标示)(SEQ ID NO:3，其编码 SEQ ID NO:4)

B.F全长FVIIIFc

(i)全长FVIIIFc DNA序列(FVIII信号肽用下划线标示，Fc区用粗体标 示)(SEQ ID NO:5，其编码SEQ ID NO:6)

(ii)Fc(与A(ii)(SEQ ID NO:3)相同的序列)]

C.

(i)重链(HC)-Fc DNA序列(HC与Fc之间无接头)(信号肽用下划线标示， Fc区用粗体标示)(SEQ ID NO:7，其编码SEQ ID NO:8)

C.

(ii)重链(HC)-Fc DNA序列(HC与Fc之间的5个氨基酸的接头)(信号肽 用下划线标示，Fc区以粗体标示,5个氨基酸的接头用双下划线标示)(SEQ ID  NO:9，其编码SEQ ID NO:10)

C.

(iii)轻链(LC)-Fc DNA序列(信号肽用下划线标示，Fc区用粗体标示) (SEQ ID NO:11，其编码SEQ ID NO:12)

表2:多肽序列

A.B结构域缺失的FVIII-Fc单体杂交体(BDD FVIIIFc单体二聚体):通过表达BDD FVIIIFc和Fc链产生的。

构建体=HC-LC-Fc融合物。将Fc表达盒与BDDFVIII-Fc一起共转染以产生BDD FVIIIFc单体-。对于BDD FVIIIFc链，Fc序列以粗体显示；HC序列用双下划线显示；剩下的B结构域序列以斜体字显示。信号肽用下划线标示。

i)B结构域缺失的FVIII-Fc链(19个氨基酸序列用下划线标示)(SEQ ID  NO:2)

ii)Fc链(来自小鼠Igκ链20个氨基酸的异源信号肽用下划线标示)(SEQ ID  NO:4)

B.全长FVIIIFc单体杂交体(全长FVIIIFc单体二聚体):通过表达FVIIIFc和Fc链产生的。

构建体=HC-B-LC-Fc融合物。将Fc表达盒与全长FVIII-Fc一起共转染以产生全长FVIIIFc单体。对于FVIIIFc链，Fc序列以粗体显示；HC序列用双下划线显示；B结构域序列以斜体字显示。信号肽以下划线标示。

i)全长FVIIIFc链(FVIII信号肽用下划线标示(SEQ ID NO:6)

ii)Fc链(来自小鼠Igκ链的20个氨基酸的异源信号肽用下划线标示) (SEQ ID NO:4)

C.FVIII-Fc异二聚体杂交体

这可通过共转染HC-Fc和LC-Fc构建体来产生。已制备了两个HC-Fc构建体。一个在HC与Fc之间不具有接头(HC-Fc)，而另一个在HC与Fc之间具有5个氨基酸的接头(HC+5-Fc)。将FVIII信号肽用于HC-Fc构建体，然而将小鼠Igκ信号序列用于LC-Fc构建体。

(i)HC-Fc (Fc以粗体显示，信号肽用下划线标示)(SEQ ID NO:8)

(ii)HC+5-Fc (Fc序列以粗体显示，5个氨基酸的接头序列(来自FVIII 的B结构域)以斜体字显示，信号肽用下划线标示)(SEQ ID NO:10)

(iii)LC-Fc6His(Fc序列以粗体显示，信号肽用下划线标示)(SEQ IDNO:12)

表3.在单次50IU/kg rFVIIIFc或

的静脉内剂量后血友病A小鼠中的全血凝固时间(WBCT)测定.

A.

ND=由于先前时间点超过60分钟而未被测定的

B.

ND=由于先前时间点超过60分钟而未被测定的

表4.单次静脉内剂量(50IU/kg)后血友病A小鼠中的PK参数

表5.单次静脉内剂量(125IU/kg rFVIIIFc,114和120IU/kg

)后血友病A狗中的PK参数

A.从生色活性数据测定的PK

B.从ELISA数据测定的PK

平均值±sd,n=4(针对rFVIIIFc),

*由于只有两只狗，款报告

的sd

表6.用rFVIIIFc或

单次静脉内给药后通过aPTT测量的血友病A狗中的凝血活性。

表7.通过ELISA测量的以125IU/kg的单次静脉内剂量施用的猴中rFVIIIFc或Xyntha的血浆浓度

A.血浆中的rFVIIIFc浓度(μg/mL)

B.血浆中的Xyntha浓度(μg/mL)

表8.施用了125IU/kg的单次静脉内剂量的猴的rFVIIIFc或Xyntha的血浆浓度，通过FVIII-特异性生色活性测定测量的(以IU/mL报告)。

A.Xyntha

B.rFVIIIFc

BLQ=低于定量限

表9.单次125IU/kg剂量后rFVIIIFc的PK参数

表10.单次IV剂量(125IU/kg)后Xyntha的PK参数

表11.因子X的激活

	Km(nM)	Vmax(nM/分钟)
			rFVIIIFc	55.0±5.9	65.6±8.6
BDD FVIII	51.0±8.7	73.5±10.1

表12.与因子IXa的相互作用

	Kd(nM)	Vmax(nM/分钟)
			rFVIIIFc	2.8±0.4	4.5±0.3
BDD FVIII	2.5±0.3	4.0±1.0

Claims (110)

1.一种给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括：

以等量的由所述因子VIII部分组成的多肽所需的给药间隔的至少约1.5倍的给药间隔给所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII部分和第二部分的嵌合多肽。

2.权利要求1所述的方法，其中所述嵌合多肽包含Fc部分。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述给药间隔为等量的由所述因子VIII部分组成的多肽所需的给药间隔的至少约1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。

4.权利要求3所述的方法，其中所述给药间隔为等量的由所述因子VIII部分组成的多肽所需的给药间隔的至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6倍。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述给药间隔为约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。

7.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述受试者需要按需治疗。

8.权利要求7所述的方法，其中所述受试者需要治疗出血事件。

9.权利要求8所述的方法，其中所述受试者需要治疗关节积血、肌肉出血、口腔流血、出血、至肌肉内的出血、口腔出血、创伤、头创伤、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。

10.权利要求7所述的方法，其中所述受试者需要手术预防、围手术期处理或手术治疗。

11.权利要求10所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、全膝置换、穿颅术、骨接合术、创伤性手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换术。

12.权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述给药间隔为约每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或更长时间一次。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为10-100IU/kg。

14.权利要求12所述的方法，其中所述治疗剂量为10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg。

15.权利要求13所述的方法，其中所述治疗剂量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。

16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述因子VIII为人因子VIII。

18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述因子VIII具有B结构域的完全或部分缺失。

19.权利要求17所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。

20.权利要求19所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。

21.权利要求17所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。

22.权利要求21所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。

23.权利要求17或18所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ IDNO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一性。

24.权利要求23所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。

25.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽以包含与所述嵌合多肽结合的第二多肽的杂交体的形式存在，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。

26.权利要求25所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

27.权利要求26所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有同一性的序列。

28.权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

29.权利要求28所述的方法，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有同一性的序列组成。

30.权利要求1-29中任一项所述的方法，其中将所述嵌合多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分施用。

31.一种给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括

给所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII部分和第二部分的嵌合多肽，以获得为通过等量的由所述因子VIII部分组成的多肽获得的AUC的至少约1.25倍的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。

32.权利要求31所述的方法，其中以约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次的给药间隔施用所述嵌合多肽。

33.权利要求31-32中任一项所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。

34.权利要求31所述的方法，其中所述受试者需要按需治疗。

35.权利要求32所述的方法，其中所述受试者需要治疗出血事件。

36.权利要求33所述的方法，其中所述受试者需要治疗关节积血、肌肉出血、口腔流血、出血、至肌肉内的出血、口腔出血、创伤、头创伤、胃肠道出血、颅内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。

37.权利要求34所述的方法，其中所述受试者需要手术预防、围手术期处理或手术治疗。

38.权利要求37所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、全膝置换、穿颅术、骨接合术、创伤性手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换术。

39.权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述给药间隔为约每24-36、24-48、24-72、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或更长时间一次。

40.权利要求31-39中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为10-100IU/kg。

41.权利要求40所述的方法，其中所述治疗剂量为10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg。

42.权利要求41所述的方法，其中所述治疗剂量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。

43.权利要求31-42中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

44.权利要求31-43中任一项所述的方法，其中所述因子VIII为人因子VIII。

45.权利要求31-44中任一项所述的方法，其中所述因子VIII具有B结构域的完全或部分缺失。

46.权利要求44所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。

47.权利要求46所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。

48.权利要求44所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。

49.权利要求48所述的方法，其中所述嵌合多肽的因子VIII部分与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。

50.权利要求43或44所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ IDNO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一性。

51.权利要求50所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。

52.权利要求31-51中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽以包含与所述嵌合多肽结合的第二多肽的杂交体的形式存在，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。

53.权利要求52所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

54.权利要求53所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

55.权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

56.权利要求55所述的方法，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

57.权利要求31-56中任一项所述的方法，其中将所述嵌合多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分施用。

58.一种给有此需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括

以约每5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间一次的给药间隔给所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII和Fc的多肽。

59.权利要求58中任一项所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。

60.权利要求58-59中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为10-100IU/kg。

61.权利要求60所述的方法，其中所述治疗剂量为10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg。

62.权利要求61所述的方法，其中所述治疗剂量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。

63.权利要求58-62中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

64.权利要求58-63中任一项所述的方法，其中所述因子VIII为人因子VIII。

65.权利要求58-64中任一项所述的方法，其中所述因子VIII具有B结构域的完全或部分缺失。

66.权利要求64所述的方法，其中所述因子VIII与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ IDNO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有至少90%或95%的同一性。

67.权利要求66所述的方法，其中所述因子VIII与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ IDNO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。

68.权利要求64所述的方法，其中所述因子VIII与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQID NO:6的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ IDNO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。

69.权利要求68所述的方法，其中所述因子VIII与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ IDNO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。

70.权利要求64或65所述的方法，其中所述第二部分与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一性。

71.权利要求70所述的方法，其中所述第二部分与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有同一性。

72.权利要求58-71中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽为以包含与所述嵌合多肽结合的第二多肽的杂交体的形式存在的因子VIII-Fc嵌合多肽，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。

73.权利要求72所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

74.权利要求73所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

75.权利要求72-74中任一项所述的方法，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

76.权利要求75所述的方法，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

77.权利要求58-76中任一项所述的方法，其中将所述多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的部分施用。

78.一种包含因子VIII和Fc的多肽，所述因子VIII与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基1-1438；SEQ IDNO:6的氨基1-2332；SEQ ID NO:8的氨基1-740；SEQ ID NO:10的氨基1-745；或SEQ ID NO:12的氨基1-684)具有至少90%或95%的同一性。

79.权利要求78所述的多肽，其中所述因子VIII与表2中显示的不具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1438；SEQ IDNO:6的氨基酸1-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸1-740；SEQ ID NO:10的氨基酸1-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸1-684)具有同一性。

80.一种包含因子VIII和Fc的多肽，所述因子VIII与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸序列-19-1438；SEQ ID NO:6的氨基酸序列-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸序列-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸序列-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸序列-20-684)具有至少90%或95%的同一性。

81.权利要求80所述的多肽，其中所述因子VIII与表2中显示的具有信号序列的因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1438；SEQ IDNO:6的氨基酸-19-2332；SEQ ID NO:8的氨基酸-19-740；SEQ ID NO:10的氨基酸-19-745；或SEQ ID NO:12的氨基酸-20-684)具有同一性。

82.权利要求78至81中任一项所述的多肽，其中所述Fc与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ ID NO:12的氨基酸685-924)具有至少90%或95%的同一性。

83.权利要求82所述的多肽，其中所述Fc与表2中显示的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1439-1665；SEQ ID NO:6的氨基酸2333-2559；SEQ ID NO:8的氨基酸741-967；SEQ ID NO:10的氨基酸746-972；SEQ IDNO:12的氨基酸685-924)具有同一性。

84.权利要求78所述的多肽，其包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

85.权利要求84所述的多肽，其包含与表2A(i)中显示的不具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1-1665)具有同一性或与表2A(i)中显示的具有信号序列的因子VIII和Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-19-1665)具有至少90%或95%的同一性的序列。

86.权利要求78-85中任一项所述的多肽，其以包含第二多肽的杂交体的形式存在，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。

87.权利要求85所述的多肽，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有至少90%或95%的同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

88.权利要求86所述的多肽，其中所述第二多肽基本上由与表2A(ii)中显示的不具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-227)具有同一性或与表2A(ii)中显示的具有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20-227)具有至少90%或95%的同一性的序列组成。

89.权利要求78-88中任一项所述的多肽，其具有为由所述因子VIII组成的多肽的至少约1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍的半衰期。

90.一种多核苷酸，其编码权利要求78-85中任一项所述的多肽。

91.权利要求90所述的多核苷酸，其包含表1的因子VIII-Fc核苷酸序列(SEQ ID NO:1、5、7、9或11)。

92.一种多核苷酸，其编码权利要求86-89中任一项所述的因子VIII-Fc多肽和所述的第二肽。

93.权利要求90-92中任一项所述的多核苷酸，其为载体、质粒、噬菌体或病毒。

94.权利要求90-93中任一项所述的多核苷酸，其为DNA或RNA。

95.一种培养的人胚胎细胞，其包含权利要求89-94中任一项所述的多核苷酸。

96.权利要求95所述的细胞，其为HEK293细胞。

97.一种产生因子VIII-Fc杂交蛋白的方法，其包括：

在允许编码的因子VIII-Fc嵌合多肽和编码的基本上由Fc组成的多肽表达的条件下培养权利要求95或96所述的细胞；和

回收编码的因子VIII-Fc杂交蛋白。

98.一种蛋白质，其由权利要求97所述的方法产生。

99.权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽具有一个或多个选自下列特征的特征：

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的与磷脂囊泡相互作用的能力；

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的形成激活因子X的Xase复合物的能力；

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的在5分钟内被α-凝血酶激活的能力；和

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的与因子IXa相互作用的能力。

100.权利要求99所述的方法，其中所述嵌合多肽具有一个或多个选自下列特征的特征：

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Km的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Km形成激活因子X的Xase复合物，其中将Km测量为因子X浓度的函数；

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Vmax形成激活因子X的Xase复合物，其中将Vmax测量为因子X浓度的函数；

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Kd的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Kd形成激活因子X的Xase复合物，其中将Kd测量为因子IXa浓度的函数；和

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Vmax形成激活因子X的Xase复合物，其中将Vmax测量为因子IXa浓度的函数。

101.权利要求58-77中任一项所述的方法，其中所述多肽具有一个或多个选自下列特征的特征：

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的与磷脂囊泡相互作用的能力；

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的形成激活因子X的Xase复合物的能力；

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的在5分钟内被α-凝血酶激活的能力；和

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的与因子IXa相互作用的能力。

102.权利要求101所述的方法，其中所述多肽具有一个或多个选自下列特征的特征：

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Km的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Km形成激活因子X的Xase复合物，其中将Km测量为因子X浓度的函数；

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Vmax形成激活因子X的Xase复合物，其中将Vmax测量为因子X浓度的函数；

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Kd的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Kd形成激活因子X的Xase复合物，其中将Kd其中测量为因子IXa浓度的函数；和

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Vmax形成激活因子X的Xase复合物，其中将Vmax测量为因子IXa浓度的函数。

103.权利要求78-89和98中任一项所述的多肽，其具有1个、约1.5个或约2个或更多个选自下列特征的特征：

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的与磷脂囊泡相互作用的能力；

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的形成激活因子X的Xase复合物的能力；

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的在5分钟内被α-凝血酶激活的能力；和

可与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相比较的与因子IXa相互作用的能力。

104.权利要求101所述的方法，其中所述多肽具有一个或多个选自下列特征的特征：

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Km的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Km形成激活因子X的Xase复合物，其中将Km测量为因子X浓度的函数；

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Vmax形成激活因子X的Xase复合物，其中将Vmax测量为因子X浓度的函数；

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Kd的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Kd形成激活因子X的Xase复合物，其中将Kd测量为因子IXa浓度的函数；和

以在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约1个、约1.5个或约2个标准差内的Vmax形成激活因子X的Xase复合物，其中将Vmax测量为因子IXa浓度的函数。

105.权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述剂量具有大于1.38IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察到的)。

106.权利要求1-77和104中任一项所述的方法，其中所述剂量具有至少约1.5、至少约1.85或至少约2.46IU/dL每IU/kg的平均增量恢复(K-值)(活性；观察到的)。

107.权利要求1-75和104-106中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽在所述患者群体中或所述受试者中展示一个或多个药代动力学参数，其选自：

约2.33±1.08mL/小时/kg或更少的所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)；

约1.8-2.69mL/小时/kg的所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)；

为由所述因子VIII部分组成的多肽的清除率的约65%的所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)；

约1.22-5.19mL/小时/kg的所述受试者中的清除率(CL)(活性)

至少约26.3±8.33小时的所述患者群体中的平均停留时间(MRT)(活性)；

约25.9-26.5小时的所述患者群体中的平均MRT(活性)；

为由所述因子VIII部分组成的多肽的平均MRT的约1.5倍的所述患者群体中的平均MRT(活性)；

约14-41.3小时的所述受试者中的平均停留时间(MRT)(活性)；

约18.3±5.79小时的所述患者群体中的平均t1/2β(活性)；

为约18-18.4小时的所述患者群体中的平均t1/2β(活性)；

为由所述因子VIII部分组成的多肽的平均t1/2β的约1.5倍的所述患者群体中的平均t1/2β(活性)；

约11-26.4小时的所述受试者中的t1/2β(活性)；

约2.01±0.44IU/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

约1.85-2.46IU/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

为由所述因子VIII部分组成的多肽的平均增量恢复的约90%的所述患者群体中的平均增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

约1.38-2.88IU/dL每IU/kg的所述受试者中的增量恢复(K值)(活性；观察到的)；

约55.1±12.3mL/kg的所述患者群体中的平均Vss(活性)；

约45.3-56.1mL/kg的所述患者群体中的平均Vss(活性)；

约37.7-79.4mL/kg的所述受试者中的Vss(活性)；

约49.9±18.2IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)；

约44.8-57.6IU*h/dL每IU/kg的所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)；和

约19.2-81.7IU*h/dL每IU/kg的所述受试者中的AUC/剂量。

108.权利要求1-77和104-106中任一项所述的方法，其中所述第二部分为XTEN或白蛋白。

109.权利要求1-77和104-106中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为约10至约150、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、110、115、120、125、130、135、140、145或150IU/kg。

110.权利要求1-77和104-106中任一项所述的方法，其中所述给药间隔为1.5至5、1.5、2、3、4或5天或更长时间。

Images