WO2017222337A1 - Fviii 및 vwf 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도 - Google Patents

Fviii 및 vwf 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도 Download PDF

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WO2017222337A1
WO2017222337A1 PCT/KR2017/006655 KR2017006655W WO2017222337A1 WO 2017222337 A1 WO2017222337 A1 WO 2017222337A1 KR 2017006655 W KR2017006655 W KR 2017006655W WO 2017222337 A1 WO2017222337 A1 WO 2017222337A1
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fviii
domain
seq
chimeric protein
vwf
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PCT/KR2017/006655
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오인재
이승훈
조의철
오미숙
류재환
김용재
김소라
박진현
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재단법인 목암생명과학연구소
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)

Definitions

  • the present application is a technique related to recombinant Factor VIII used in the treatment of hemophilia.
  • Hemophilia is a disease in which bleeding continues due to lack of coagulation factors.
  • Blood clotting factors consist of I to XIII, of which the factors associated with hemophilia are VIII, IX and XI. Hemophilia is caused by a genetic defect of each of the above factors, and is classified into hemophilia A lacking Factor VIII, hemophilia B lacking Factor IX, and hemophilia C lacking Factor XI, depending on the type of coagulation factor lacking. Occupies%
  • Hemophilia differs depending on the type of drug being administered, and even in the same type, dosage and method are different depending on the site of administration.
  • the purpose of hemophilia treatment is hemostasis and treatment is carried out in two aspects, prophylaxis and on demand using Enzyme Replacement Therapy (ERT). The trend is moving.
  • ERT Enzyme Replacement Therapy
  • FVIII-Fc FVIII-Fc fusion protein
  • FVIII-Fc FVIII-Fc fusion protein
  • PEG polyethylene glycol
  • LRP low density lipoprotein receptor related protein
  • FVIII-Fc and PEGylated FVIII does not increase significantly because FVIII circulates in the blood while intensifying non-covalent interaction with vWF in the blood.
  • FVIII-Fc and pegylated FVIII there is a limit of non-covalent coupling with vWF present in the blood and eventually converged to the half-life (12 hours, human) of vWF due to the half-life of vWF (Tiede) A. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13 (Suppl. 1): S176-S179).
  • Therapeutics developed to date are still pointed out as a problem of frequent bleeding due to a short period of administration (intravenous injection) in terms of function and a loss of efficacy in the body due to a half-life that is not long enough. Therefore, the development of long-acting FVIII with a three-fold increase in half-life to reduce the number of administrations to at least once a week is necessary.
  • the present invention seeks to provide FVIII that can be administered up to once a week with improved body retention time.
  • the present disclosure provides human hemagglutinin factor 8 (Factor VIII, FVIII), including the light and heavy chains, wherein the full length or part of the B domain is deleted; And a chimeric protein comprising at least one vWF D′ D3 domain.
  • the protein according to the present invention has at least a two-fold half-life extension compared to wild type FVIII protein.
  • the light and heavy chains can be expressed as one polypeptide or as two polypeptides.
  • the FVIII and the vWF D'D3 domains are linked, comprising a linkage having an enzyme cleavage site located between, the vWF D'D3 domains are linked
  • the N-terminus of the FVIII in the N-terminus or C-terminus of the FVIII, or the vWF D'D3 domain and the FVIII are respectively in its N-terminus or C-terminus, relative to the linker Located.
  • it may be arranged in the order of FVIII-linker-D'D3 or D'D3-linker-FVIII in the N to C direction, for example.
  • the vWF D′ D3 domain When expressed as two polypeptides according to the present application, the vWF D′ D3 domain may be linked to the C-terminus of the B domain whose N-terminus is included in the heavy chain.
  • the B domain which is partly deleted from the chimeric protein according to the present invention, comprises the residues based on the 1648 and 1649 residue positions in the sequence of SEQ ID NO: 1 in the N-terminal and / or C-terminal directions. At least five amino acids are each deleted; Or part deleted so that the B domain contains at least four, or four to six glycosylation sites.
  • the B domain which may be part of a chimeric protein according to the present disclosure, comprises a sequence of amino acid residues 741 to 902 and 1654 to 1689, or an amino acid based on the sequence of SEQ ID NO: 01, based on the sequence of SEQ ID NO: 01 Represented by the sequence of residues 741 to 936.
  • the chimeric protein according to the present disclosure further comprises one or more Fc, wherein the Fc may be linked to the vWF D′ D3 domain and / or the FVIII.
  • the chimeric protein according to the present disclosure may further comprise two or more vWF D′ D3 domains and / or two or more Fc.
  • the plurality of vWF D'D3 domains, and between the plurality of Fc are linked to each other by a linkage containing or not including an enzyme cleavage site and / or a covalent bond between each other, for example comprising two If dimers can be formed.
  • Enzyme cleavage sites and linkers used herein may be referred to those described herein.
  • the amino acid sequence which can be cleaved by the thrombin at the enzyme cleavage site included in the linkage in the chimeric protein according to the invention is DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 36), TTKIKPR (SEQ ID NO: 37), or LVPRGS (SEQ ID NO: 38),
  • the amino acid sequence which may be cleaved by FVIIa is ASKPQGRIVGG (SEQ ID NO: 39)
  • the amino acid sequence which may be cleaved by FXa is IDGR (SEQ ID NO: 40) or IEGR (SEQ ID NO: 41)
  • the FXIa The sequence that can be cleaved by may be represented by SKLTRAETVF (SEQ ID NO: 42).
  • the chimeric protein according to the invention is expressed in the form of first and second polypeptides, wherein the first polypeptide comprises all or part of the heavy chain and B domain of the FVIII, and the second polypeptide is the FVIII And a portion of the light chain or B domain of wherein the vWF D'D3 domain is located in the N-terminus or C-terminus direction of the first polypeptide, or at the N-terminus or C-terminus of the second polypeptide.
  • vWF D'D3 domain When the vWF D'D3 domain is linked to the C-terminus of the first polypeptide N-terminus or the second polypeptide, it has a structure similar to that linked to the N-terminus or C-terminus of scFVIII, in which case FVIII is short-chained. The difference is whether or not it is double-printed.
  • the vWF D′ D3 domain when expressed in the form of the first and second polypeptides, is located in the C-terminal direction of the first polypeptide.
  • the chimeric protein according to the invention may comprise one or more, in particular two vWF D'D3 domains, and may form a complex (dimer) between vWF D'D3 domains.
  • the chimeric protein according to the invention further comprises one or more Fc, in particular two Fc, which Fc may be linked to the vWF D′ D3 domain and / or the second polypeptide.
  • Complexes (dimer) can be formed between Fc.
  • the Fc or the vWF D′ D3 domain in the chimeric protein according to the present disclosure is linked to a linker with or without an enzyme cleavage site.
  • the chimeric protein according to the invention is SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 or when expressed in one polypeptide
  • An amino acid sequence represented by 25 or an amino acid sequence having an equivalent biological function or more than 90% homology thereto may also be included herein.
  • the chimeric protein according to the invention is SEQ ID NOs: 4 and 5 (heavy and light chains), SEQ ID NOs: 23 and 24 (heavy and light chains), SEQ ID NOs. 26 and 27 (heavy chains, respectively) when expressed in two polypeptides And light chains), SEQ ID NOs: 28 and 29 (heavy chains and light chains respectively), SEQ ID NOs: 30 and 31 (heavy chains and light chains respectively), SEQ ID NOs: 32 and 33 (heavy chains and light chains respectively), or SEQ ID NOs: 34 and 35 (heavy chains and Light chain) or an amino acid sequence having an equal or more than 90% homology with the same or with a biological function thereof.
  • the chimeric protein according to the present disclosure may be conjugated with a hydrophilic polymer at some amino acid residues of the A domain and / or B domain fragment of FVIII, wherein the conjugated position is based on the sequence of SEQ ID NO: 01 in the B domain
  • the conjugated position is based on the sequence of SEQ ID NO: 01 in the B domain
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol, polyethylene oxide, dextran.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol and PEG with an average molecular weight of at least 20 kDa or more, in particular 40 kDa or 60 kDa, is used.
  • the chimeric protein according to the invention is modified at the B domain fragment of FVIII, in particular at residue 782.
  • the application provides a nucleic acid encoding a chimeric protein as described above, a vector comprising the nucleic acid, a cell comprising the vector.
  • the present application provides the use of a chimeric protein, a nucleic acid encoding the same, a vector comprising the nucleic acid, a cell comprising the vector.
  • Uses of the invention according to the invention include a composition for treating hemophilia, a method for treating hemophilia, a composition for coagulation of blood, a method of blood coagulation, or a method for producing a protein according to the present application.
  • Chimeric protein in the form of modified chimeric protein or PEG conjugated FVIII and vWF domain according to the present invention increases the half-life in the body significantly when administered, reducing the number of administration 2 ⁇ 4 times a week or less, hemophilia A As a type of therapeutic agent, not only the convenience of the patient is increased, but also the treatment cost can be reduced.
  • the first strategy is to mask the LRP binding sites known to have the greatest effect on the in vivo removal of FVIII with D'D3, a domain of PEG and vWF.
  • the second strategy is to covalently bind D'D3, a domain of vWF, to the chimeric protein according to the present invention to prevent endogenous vWF from binding to the chimeric protein in the blood.
  • FIGS. 2A and 2B diagrammatically show various molecular structures of chimeric proteins expressed in single chain (single polypeptide) and bichain (double polypeptide), respectively, according to the present application.
  • Figure 3 schematically shows a vector encoding a chimeric protein expressed as a single polypeptide according to one embodiment of the present application.
  • Figure 4 is a result of analysis by SDS-PAGE after chimeric protein expression and purification, including a connector of various lengths according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 5 is a result of Western blot analysis of chimeric proteins comprising various lengths of linkages according to an embodiment of the present invention with antibodies to a heavy chain, a light chain and a D'D3, respectively.
  • Each antibody used is as follows. Green mountain, GMA-012; Light chain: Abcam, 41188 and D'D3: Abcam, 96340.
  • FIG. 7 is a comparison group of vWF binding results of chimeric FVIII (scFVIII / D'D3-120-TH1) and pegylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1) according to an embodiment of the present disclosure.
  • Advate® was used.
  • RNA 8 is a comparative group as a result of LRP binding analysis of chimeric FVIII (scFVIII / D'D3-120-TH1) and pegylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1) according to an embodiment of the present disclosure.
  • Advate® was used.
  • FIG. 9 was used as a comparative group as a result of PK analysis in HA mice of pegylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D′ D3-120) prepared according to one embodiment of the present application.
  • FIG. 10 shows the results of PK analysis in HA mice of pegylated chimera FVIII (40 kDa PEG-scFVIII / D'D3-120, 60 kDa PEG-scFVIII / D'D3-120) prepared according to an embodiment of the present application.
  • Advate® was used as a comparative group.
  • FIG. 11 compares PK results in HA mice of PEGylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D'D3-60, PEG-scFVIII / D'D3 / Fc-120, Fc) prepared according to one embodiment of the present disclosure Advate® was used as a group.
  • FIG. 12 compares PK results in HA mice of PEGylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D'D3-300, PEG-scFVIII / D'D3 / D'D3-120) prepared according to one embodiment of the present disclosure.
  • Advate® was used as a group.
  • FIG. 13 HA mice of PEGylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D'D3-60, PEG-scFVIII / D'D3-120, PEG-scFVIII / D'D3-300) prepared according to one embodiment of the present application Advate® was used as a comparative group as a result of PK in.
  • Advate® was used as a comparative group as a result of PK in HA mice of PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1).
  • FIG. 16 shows the results of thrombin generation analysis of PEGylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D′ D3-120-TH1) prepared according to one embodiment of the present application.
  • FIG. 17 shows PEGylated chimeric FVIII (PEG-scFVIII / D'D3-120, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH2 prepared according to one embodiment of the present application) Advate® was used as a comparison in the acute efficacy study in the tail clip model.
  • RNA 18 is a PEGylated chimeric FVIII (20 kDa linear PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, 40 kDa linear PEG-scFVIII / D'D3-120- prepared by expression in CHO cells according to one embodiment of the present disclosure.
  • Advate® was used as a control group as a result of PK in HA mice of TH1).
  • the present application relates to a technique for preventing or inhibiting FVIII from complexing with an endogenous vWF protein, while preventing FVIII from binding to a low density lipoprotein receptor related protein (LRP), thereby extending the half-life of the FVIII protein.
  • LRP low density lipoprotein receptor related protein
  • the present disclosure is directed to chimeric proteins fused to human hemagglutinin factor 8 (Factor VIII or FVIII) and one or more vWF D′ D3 domains.
  • the chimeric protein according to the present invention is a single chain (sc, single chain) in which the light and heavy chains of FVIII composed of light and heavy chains in its natural form are expressed as a single polypeptide, or the light and heavy chains are expressed as separate polypeptides, respectively. It may take the form of a dual chain (dc, dual chain).
  • the chimeric protein according to the invention is embodied in a single chain (single polypeptide), in which case the vWF D'D3 domain is located in the N- or C-terminal direction of FVIII and comprises an cleavage site by an enzyme Connected by a linker (or linker).
  • the chimeric protein according to the invention is also implemented as a double chain (double polypeptide), in which case the vWF D′ D3 domain may be linked to the N- or C-terminal direction of the heavy or light chain of FVIII. In one embodiment in particular is linked to the C-terminal direction of the B domain.
  • the FVIII protein which may be included in the chimeric protein according to the present invention may be used of various lengths or derivatives as long as the object according to the present invention is achieved through binding to vWF.
  • FVIII consists of the A1-A2-B-A3-C1-C2 domain and is synthesized as a short chain protein in hepatocytes. After synthesis, they are processed to form a heterodimer of 280 kDa consisting of heavy and light chains.
  • the light chain is 80kDa and is composed of A3-C1-C2 domain
  • the heavy chain is composed of A1-A2-B domain
  • the molecular weight is 90-200kDa, which has a large difference in molecular weight depending on the length of B-domain.
  • heterodimers remain inactivated by binding to vWF in the blood and, after exposure to stimuli such as vascular damage, residues 372, 740 and 1689, based on the sequence of SEQ ID NO: 01, after an arginine residue by thrombin. Cut from behind The result is separation from vWF and activation to form trimers of A1, A2 and A3-C1-C2. The trimer then catalyzes the activation of FX by FIXa and degrades rapidly.
  • FVIII proteins that may be included in the chimeric protein according to the present disclosure include full length, functional fragments, variants, analogs or derivatives thereof that retain the function of the full length wild type FVIII factor in the coagulation pathway.
  • FVIII protein is used interchangeably with FVIII polypeptide or FVIII.
  • FVIII function include the ability to activate blood coagulation, to act as a cofactor for factor IX, or to form a tenase complex with factor IX in the presence of Ca 2+ and phospholipids (hereafter factor X). Converting to activating form Xa) ability, but not limited to these.
  • FVIII proteins can be used, for example human, porcine, feline, rat or murine FVIII proteins.
  • FVIII amino acid and nucleic acid sequences include, for example, GenBank NOs: NM_000132, NP_000123, 1012296A AAA52420.1, CAA25619.1, AAA52484.1, 1012298A, EAW72647.1, EAW72646.1, XP_001498954.1, ACK44290.1, ACO95359.1, NP_001138980.1, ABZ10503.1, NP_032003.2.
  • human-derived FVIII is used, for example, human FVIII may be represented by the sequence of SEQ ID NO: 01 (not including the signal peptide), the heavy chain in the wild type sequence is SEQ ID NO: 01 Based on 1-740 residues, the B domain is 741-1689 residues, including the a3 domain, the light chain is up to 1690-2332 residues.
  • variants of FVIII are also known in the art and are included in the present invention.
  • a variant of FVIII as disclosed in US Pat. No. 5,668,108 discloses a variant of FVIII in which aspartic acid at position 1241 is replaced by glutamic acid and has an attached nucleic acid change;
  • US Pat. No. 5,149,637 describes FVIII variants comprising glycosylated or unglycosylated C-terminal fragments;
  • US Pat. No. 5,661,008 also discloses FVIII variants comprising amino acids 1-740 linked to amino acids 1649 to 2332 by at least three amino acid residues.
  • FVIII that may be included in the chimeric protein according to the present disclosure includes FVIII lacking a B domain, such FVIII is described, for example, in US Pat. Nos. 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, and 6,458,563.
  • FVIII which may be included in the chimeric protein according to the present invention, is a FVIII in which a part of the B domain is deleted, including heavy and light chains, but some residues are deleted so as not to include a cleavage site by a protease such as furin.
  • the B domain partially deleted comprises at least 5 amino acids deleted in the N-terminal and C-terminal directions, including this, based on the 1648 and 1649 residue positions in SEQ ID NO: 01; and And / or a B domain fragment partially deleted to contain 4 to 6 glycosylation sites.
  • the B domain fragment comprises amino acid residues 741 to 902 and 1654 to 1689 based on the sequence of SEQ ID NO: 01.
  • such B domain fragments comprise amino acid sequences of amino acid residues 741 to 902 and 1654 to 1689 based on the sequence of SEQ ID NO: 01, wherein some of these residues, particularly isoleucine residues 782, are modified to hydrophilic polymers It is to be substituted for cysteine for.
  • FVIII which has been deleted from part of the B domain, which may be included in a chimeric protein according to the present application, has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 03 or an amino acid sequence that is at least 90% homologous thereto.
  • the B domain included in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 03 includes residues 741 to 902 based on SEQ ID NO: 01.
  • FVIII which may be included in the chimeric protein according to the present disclosure, may be modified by conjugation with a hydrophilic polymer at some amino acid residues of the A domain and / or B domain fragments.
  • the present invention is intended to interfere with the LRP binding of the chimeric protein according to the modification through site-specific progress, it can be modified at various positions to achieve this.
  • the position conjugated in the chimeric protein according to the present application may comprise at least one position selected from the group consisting of amino acid residues 491, 495, 498 and 1806 based on the sequence of SEQ ID NO: 01 in the A domain; And at least one position selected from the group consisting of amino acid residues 754, 781, 782, 788, 789, 825, 897 based on the sequence of SEQ ID NO: 01 in the B domain.
  • the residue may be substituted with cysteine or a cysteine group may be inserted as described below.
  • Hydrophilic polymers that can be used in the modification of FVIII according to the present application can be used a variety of polymers known in the art as long as it achieves the purpose according to the present application, for example, polyethylene glycol, polyethylene oxide, dextran It is not limited to one.
  • PEG is used, in particular PEG of at least 20 kDa.
  • PEG binds to the LRP binding region and inhibits FVIII binding to LRP by PEG hindrance, so if PEG is too short, it may not be sufficient to provide such hindrance. It is important that the length is 20 kDa or more. In one embodiment in particular 40 kDa, 60 kDa or more PEG is used.
  • PEG used for PEGylation in the modifications according to the invention can be linked to the residues using a variety of known functional groups.
  • PEG is linked site-specifically via free-SH groups present at residues such as cysteine, in this case for example via thiol, orthopyridyl disulfide, acryloyl, sulfone or maleimide groups, in particular maleimide groups It is possible, but not limited to.
  • a residue linked to a hydrophilic polymer for modification to a hydrophilic polymer may be substituted or inserted into another residue, and the residue to be substituted or inserted varies depending on the material used for modification, and those skilled in the art select appropriate ones. You can do it.
  • PEGylation is used as the modification, in which case the residue to be modified may be substituted with cysteine or the cysteine residue may be inserted at an appropriate position.
  • residue 782 isoleucine of the B domain, in particular PEGylated, and the residue is substituted with cysteine for PEGylation.
  • the PEGylation reaction can be carried out using a known method, for example, cysteine or glutathione used for masking free cysteine must be removed before the PEGylation reaction to restore the free thiol of cysteine introduced. , DTT, beta-mercaptoethanol, cysteine, glutathione (reduction type) and the like, and the process of the reduction can be carried out including the oxidation process for restoring the reductive cleavage of the original disulfide bond FVIII.
  • Expression of cysteine-substituted proteins for modification can be performed using methods known in the art, for example for PEGylated proteins, the free cysteine introduced is free of the culture during expression or after draining out of cells. Since it forms a disulfide bond with cysteine or glutathione, a low-molecular substance containing thiol, it is necessary to mask free cysteine and stabilize it before pegylation to increase PEGylation efficiency.
  • Chimeric proteins according to the present disclosure comprise the vWF D'D3 domain.
  • vWF (or F8vWF) is a large multimeric glycoprotein that is produced in endothelial tissues, megakaryocytes ( ⁇ -granules of platelets) and subendothelian connective tissue in the Weibel-Palade body and is present in plasma. to be.
  • the basic vWF monomer consists of 2813 amino acids (when the signal peptide is included), and every monomer has a number of specific domains with specific functions, namely the D '/ D3 domain (which binds to FVIII factor), (platelet GPIb)
  • the A1 domain (which binds to collagen), the A3 domain (which binds to collagen), the C1 domain (which binds to platelet integrin ⁇ IIb ⁇ 3 when RGD domain is activated) and the C-terminus of the protein It includes a “cysteine knot” domain, which is also found in platelet derived growth factor (PDGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF ⁇ ) and ⁇ -human chorionic gonadotropin ( ⁇ HCG).
  • PDGF platelet derived growth factor
  • TGF ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • ⁇ HCG ⁇ -human chorionic gonadotropin
  • Non-limiting examples of vWF amino acid sequences and nucleic acid sequences encoding vWF or portions thereof include, for example, GenBank NO: NP_000543, NM_000552, AAE20723, AAB59512, P04275, EAW88815, ACP57027, EAW88816, and AAD04919; US Patent No. 5,260,274; Titani et al., Biochemistry, 25: 3171-84 (1986); And Sadler et al., PNAS, 82: 6391-6398 (1985).
  • amino acid sequence of full length human vWF is shown by SEQ ID NO: 02 (not including signal peptide).
  • the "propeptide” portion of vWF (D1-D2) is from amino acid residues 1 to Arg-741 and the "mature” vWF protein is from amino acid residues 742 to 2791.
  • D1: 12-218 by EXPASY protein database nomenclature (worldwideweb.uniprot.org/uniprot/P04275); D2: 365-576; D ': 754-805; D3: 844-1052; A1: 1255-1431; A2: 1476-1643; A3: 1669-1849; D4: 1927-2131; B: 2233-2306 (named C1 in EXPASY); C1: 2407-2473 (named C2 in EXPASY); C2: 2558-2623 (named C3 in EXPASY); And CK: 2701-2790.
  • vWF D'D3 domain included in the chimeric protein according to the invention is fused with FVIII to inhibit the binding of recombinant FVIII according to the invention to endogenous vWF (full length vWF).
  • vWF D'D3 domains included in the chimeric protein according to the present application may be of various lengths or derivatives as long as they retain this activity, and include variants, derivatives, variants, mutants, complexes or analogs thereof.
  • the D'D3 domain of vWF included in the chimeric protein according to the invention is amino acids 742-1248 or at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95 based on SEQ ID NO: 02 %, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% homology and prevents binding of endogenous vWF to recombinant FVIII according to the present application.
  • the chimeric protein according to the present application may be embodied as a single polypeptide expressing the light and heavy chains of FVIII as one polypeptide or a double polypeptide expressing each of the light and heavy chains as a separate polypeptide.
  • the vWF D'D3 domain may be located in the N- or C-terminal direction of FVIII, and prevents separation of D'D3 in the body. And may be linked to an amino acid linker (or linker) comprising an enzymatic cleavage site.
  • the FVIII and D'D3 domains included in the chimeric protein according to the present invention are represented by the amino acid sequence of [G 4 S] n as a linkage (wherein G is glycine and S is serine and n is 1 to 1). Integer between 100) and the linkage may include an enzyme cleavage site.
  • the linker connects D'D3 and FVIII and has the ability to give D'D3 the flexibility to precisely bind to the vWF binding site of FVIII.
  • the position where the D'D3 can be fused to FVIII is the N-terminus, C-terminus, or N-terminus or C-terminus of the FVIII light chain, and corresponds to the N-terminus in the D'D3 domain.
  • the D'domain binds to the A3 domain of FVIII and the D3 domain binds to the C2 domain of FVIII
  • the distance between the D'domain and the A3 domain of FVIII is when the D'D3 is fused to the C-terminus of the FVIII light chain.
  • a flexible linker was chosen to allow D'D3 to bind FVIII well when fused to D'D3 with FVIII.
  • n is at least 6. In another embodiment n can be 6, 8, 10, 12, 18, 24, or 60 in the above formula.
  • linkage includes an enzyme cleavage site, when the FVIII is activated, vWF D'D3, or vWF D'D3 and the linkage, can be cut out from FVIII.
  • the enzyme cleavage site included in the linkage according to the present application may be linked to the N- or C-terminal direction of the linkage.
  • enzyme site is a site that can be cleaved by thrombin, such site may be represented by DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 36), TTKIKPR (SEQ ID NO: 37), or LVPRGS (SEQ ID NO: 38) .
  • the chimeric protein according to the present invention is cleaved by thrombin in the body upon administration to be activated to FVIIIa and to activate activated factor X along with activated IX factor (FIXa) to convert to activated X factor (FXa).
  • the enzyme cleavage site which may be included in the linkage according to the present application may include a site that can be cut by FVIIa, FXa, or FXIa in a coagulant cascade in addition to thrombin, and such sites are ASKPQGRIVGG (SEQ ID NO: 39), IDGR ( SEQ ID NO: 40), IEGR (SEQ ID NO: 41), SKLTRAETVF (SEQ ID NO: 42).
  • the enzyme cleavage site is included on the N-terminal side of the linker, and when the site is cut by an enzyme such as thrombin, the linker and the D'D3 domain are separated from FVIII.
  • the enzyme cleavage site is included in the C-terminal direction of the linker, whereby thrombin cleaves the Zalier linker and D′ D3 domain from FVIII.
  • the chimeric protein according to the present invention is embodied in the form of a double or first and second two polypeptides in which each of the heavy and light chains is expressed as a separate polypeptide.
  • the light and heavy chains can be associated by metal ion mediated noncovalent bonds.
  • the first polypeptide comprises all or part of the heavy chains A1, A2 and B domains of FVIII and the second polypeptide comprises the light chains A3, C1, C2 and / or of FVIII Include part of the B domain.
  • the B domain included in the first polypeptide may be referred to the above and the following.
  • the second polypeptide may not include a B domain or a part of the B domain may be used.
  • the B domain C-terminal residues comprise 86 residues in the N-terminal direction. A portion of the B domain expressed with the second polypeptide falls off when secreted extracellularly.
  • the vWF D′ D3 domain is linked to the C terminal direction of the first polypeptide.
  • the B domain may act as a kind of linker.
  • the same or longer length B domain may be used as compared to the case in which it is expressed in a single chain.
  • a B domain of residues 741-902 and 1654-1689 is used for the short chain based on the sequence of SEQ ID NO: 1, and for the double chain 196 residues of 741-936 based on SEQ ID NO: 01 B domain is used.
  • the D 'domain can be linked to the B domain, but is not limited to the present theory, but the linkage between the proteins to be fused is structurally more natural.
  • the C-terminal amino acid residue sequence of the 196 B domains employed herein is-SGGPLSLS.
  • the N-terminal amino acid sequence of the D 'domain starts with SLSCR PPMVKLVCPA-.
  • 196 B domains were used to overlap the three amino acid residues of the SLS.
  • the 196 B domains were calculated to include only up to SGGPL residues in -SGGPLSLS.
  • Chimeric proteins according to the present disclosure may comprise one or more vWF D′ D3.
  • D'D3 is two domains located at the N-terminus of vWF, and the D3 domain actually forms a dimer through the vWF and D3 domains of another molecule.
  • D′ D3 can be fused to FVIII in monomeric or dimeric form.
  • the first D'D3 is connected to FVIII, and the second D'D3 is connected to the first D'D3.
  • FVIII the first D'D3 is connected to FVIII
  • the second D'D3 is connected to the first D'D3.
  • the first and second D'D3 can be linked through a linkage, or the second D'D3 is expressed separately, so as to form a complex with the chimeric protein can do.
  • the linker when linked using a linker as in scFVIII / D'D3 / D'D3-120 chimeric protein, the linker may refer to the aforementioned but does not include an enzyme cleavage site.
  • D'D3 when D'D3 is used in the form of dimer, D'D3 may form a dimer through an S-S bond in the D3 domain.
  • D'D3s When plural D'D3s are expressed in separate vectors, for example, in the case of a double strand, the DNAs of FVIII-D'D3 and D'D3 DNA are simultaneously expressed in one cell, and the D'D3s are intracellularly Dimers are made and allowed to secrete out of the cells, which can then be isolated and purified.
  • the chimeric protein according to the present application may further comprise one or more Fc proteins.
  • Fc When Fc is further fused to FVIII together with D'D3, it can be expected to increase the half-life through FcRn recycling by Fc, as well as the effect of binding vWF to blood by D'D3.
  • Fc on the order of about 50 kDa, is fused and may make it more difficult for blood vWF to bind to this material by steric hindrance by the Fc.
  • Fc of various lengths and origins can be included as long as the above functions achieve the purpose according to the present application.
  • Fc represented by SEQ ID NO: 22, Fc derived from IgG of human origin is used.
  • Fc may be linked to vWF D 'D3.
  • the linker may be linked using a linker.
  • the linker may refer to the aforementioned, but does not include an enzyme cleavage site.
  • the Fc may be linked to vWF D′ D3 expressed as part of the heavy chain and / or to the C terminal direction of the light chain.
  • the linker may be linked using a linker, and the linker may refer to the above-mentioned bar.
  • the linker may include an enzyme cleavage site when connected to the light chain, and an enzyme cleavage site when connected to the D'D3. do not include.
  • Two or more Fc may be included in the chimeric protein according to the invention.
  • the first Fc is linked to the chimeric FVIII, and the second Fc may be implemented in such a way as to be connected to the first Fc.
  • the first Fc can be linked to the heavy chain of chimeric FVIII expressed in a double chain, and the second Fc can be linked to the light chain (and vice versa), in which case a dimer between the plurality of Fc The same complex can be formed.
  • the first and second Fc may be linked through a linker, or the second Fc is expressed as a separate vector in one cell, and a dimer is made between the Fc in the cell, and then The secreted extracellularly can be used after purification.
  • the chimeric protein according to the present application may be implemented in a single chain or a double chain.
  • the chimeric protein of the single chain according to the present application may be represented by SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 or 25.
  • the protein may form a complex with separate D'D3 and / or Fc
  • the chimeric protein of SEQ ID NO: 19 may form a complex with one or more D'D3 represented by SEQ ID NO: 20
  • the chimeric protein of SEQ ID NO: 21 may form a complex with one or more Fc represented by SEQ ID NO: 22.
  • the chimeric protein of the double chain according to the present application comprises SEQ ID NOs: 4 and 5 (heavy and light chains respectively), SEQ ID NOs: 23 and 24 (heavy and light chains respectively), SEQ ID NOs: 26 and 27 (heavy and light chains respectively), SEQ ID NO: 28 and 29 (heavy and light chains), SEQ ID NOs: 30 and 31 (heavy and light chains respectively), SEQ ID NOs: 32 and 33 (heavy and light chains respectively), or SEQ ID NOs: 34 and 35 (heavy and light chains respectively) have.
  • the protein may be complexed with separate D'D3 and / or Fc, and in one embodiment the chimeric protein of SEQ ID NOs: 28 and 29 (heavy and light chains respectively) or SEQ ID NOs: 32 and 33 (heavy and light chains, respectively) May form a complex with one or more Fc represented by SEQ ID NO: 22.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 04 to 35 as described above as well as proteins having a sequence of at least 90% homology or substantially identical thereto.
  • Such substantial identity or homology can be determined using sequence comparison methods known in the art. At least 80% homology, especially at least 85%, more when aligning the sequences disclosed herein to any other sequence as closely as possible and analyzing the aligned sequences using algorithms commonly used in the art. In particular 90%, even more particularly 95% or more. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. For example, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio . (1970) 48: 443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol .
  • NCBI National Metal-Bassham
  • NCBI National Metal-Bassham
  • BLSAT is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ and a method for comparing sequence homology using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the chimeric protein according to the present invention has an improved half-life of at least 1.5 times, at least 2 times, and at least 3 times compared to wild-type FVIII in terms of half-life.
  • Methods for measuring half-life have been disclosed, and those skilled in the art, in view of the description herein, in the art, and references, select appropriate methods to determine the half-life and activity, and are based on the chimeric proteins included in the scope herein. You will be able to decide.
  • the invention also relates to a nucleic acid molecule or polynucleotide encoding a chimeric protein disclosed herein, a vector comprising said polynucleotide or a cell strain transformed with said vector.
  • the nucleic acid molecule according to the present application is one that includes codon optimized according to the type of cells in which the chimeric protein according to the present invention is expressed.
  • codon optimized according to the type of cells in which the chimeric protein according to the present invention is expressed in one embodiment according to the invention is optimized for CHO codons, such a nucleic acid sequence may be represented by the sequence of SEQ ID NO: 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, or 66.
  • Nucleic acid molecules encoding chimeric proteins according to the invention also include those encoding FVIII corresponding to substantially the same biological equivalents as described above.
  • nucleic acid molecules encoding chimeric proteins according to the present application can be cloned into various expression vectors for various purposes.
  • the specific configuration of the expression vector may vary depending on the host cell intended to express the chimeric protein according to the present application, but sequences that control the expression of the nucleic acid molecule into mRNA or the expression of mRNA into protein, eg, promoters and / or the like. Or a control sequence such as an enhancer.
  • Various vectors and control sequences are known that can be used for these or various other purposes, and those skilled in the art will be able to select appropriate ones in view of the specific purposes and effects herein, including, for example, those described in the Examples and Drawings herein. You can, but are not limited to this.
  • a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a chimeric protein according to the present invention may be prepared by methods known in the art, for example, a nucleic acid molecule encoding a chimeric protein according to the present invention may be added to a promoter and / or enhancer of the vector. Connect it operatively.
  • a nucleic acid molecule encoding a chimeric protein according to the present invention may be added to a promoter and / or enhancer of the vector. Connect it operatively.
  • a recombinant expression vector capable of expressing a foreign gene in the cell examples of such vectors include, but are not limited to, general protein expression vectors such as pMSGneo, pcDNA3.1 (+).
  • MAR matrix attachment region
  • the MAR factor induces position-independent expression when used in an expression vector. It plays a role in increasing gene expression. Therefore, when using the pMSGneo vector, a stable and high expression amount can be obtained.
  • pcDNA3.1 (+) vector contains a strong CMV promoter, widely used for protein expression.
  • the one described in FIG. 3 is used.
  • the chimeric protein according to the invention can be expressed as a single polypeptide or as two polypeptides as described above.
  • the recombinant expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding a chimeric protein according to the present invention can be transformed into a suitable host cell for a variety of purposes.
  • the host cell includes both prokaryotic and eukaryotic cells, in which amplification of the vector according to the present invention and / or nucleic acid molecules contained in the vector can be expressed.
  • Various cells that can be used for this purpose are known, and those skilled in the art will be able to select appropriate ones in view of the specific purposes and effects herein, and may include, for example, those described in the Examples and the drawings herein, but not limited thereto. It is not. Examples include E. coli, Mammalian cells, Yeast, Plant cells, Insect cells.
  • eukaryotic cells in particular mammalian cell lines, are used for expression of recombinant FVIII.
  • mammalian cell lines include CHO, BHK, COS7 known in the art.
  • HEK cell lines and the like can be used, and preferably, but not limited to, CHO cell line, in particular CHO-S cell line or CHO-K1 cell line or CHO-DG44 cell line, or HEK cell line especially HEK293 cell line.
  • the vector according to the present invention is delivered to such a host cell for expression.
  • Methods of delivering vectors to such host cells are known in the art, for example, calcium phosphate precipitation method, shotgun method, liposome method, nanoneedle or electroporation method, etc. May be, but is not limited to such.
  • the present invention also provides a method of translating a vector according to the present application into a eukaryotic cell; Culturing the cells in culture; Collecting the culture solution to purify cysteine introduced chimeric protein; And treating the purified cysteine introduced protein with PEGylation buffer. Restoring the introduced free thiol group of cysteine through a reduction process; Oxidizing to restore disulfide bonds within the isolated chimeric protein during the reduction process;
  • the present invention relates to a method for producing a chimeric protein, the method comprising specifically PEGylating a chimeric protein cysteine restored to a reduced thiol group and separating the PEGylated chimeric protein.
  • the chimeric protein according to the present invention can be usefully used for the treatment of hemophilia A, hemophilia, in particular hemophilia A, hemophilia A or hemophilia A.
  • the present application also relates to a chimeric protein according to the present disclosure, a nucleic acid molecule encoding the same, a vector comprising the same, or a cell comprising the nucleic acid molecule or the vector, or a carrier in the above-described composition and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention relates to a method for treating or coagulating hemophilia, in particular, hemophilia A, comprising administering a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount to a hemophilia patient, in particular, a type A patient or a patient in need of coagulation of blood.
  • the chimeric protein or nucleic acid molecule encoding the vector or the vector encoding the same may be provided in the form of a pharmaceutical composition for the treatment of hemophilia, in particular hemophilia A, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions herein can also be used alone or in combination with other drug therapies and methods using biological response modifiers.
  • composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically or physiologically acceptable carriers in addition to the above-mentioned active ingredients.
  • carrier means a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer that is nontoxic to a cell or mammal that is exposed to the dosages and concentrations employed.
  • examples of such carriers include saline, Ringer's solution, buffered saline, buffers such as phosphate, citrate and other organic acids, antioxidants including ascorbic acid, low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin Or immunoglobulins; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins, for example EDTA, sugars Alcohols such as mannitol or sorbitol, salt forming counter ions such as sodium, and / or non-ionic surfactants such as tween, polyethylene glycol (
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition, Mack Publishing Company, Easton PA). have.
  • compositions herein are particularly preferred parenteral administration (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal) according to the desired method.
  • the dosage depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the time of day, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • composition according to the invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, with an effective dose level being the type of disease, severity, activity of the drug, drug Sensitivity to, time of administration, route of administration and rate of administration, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions herein may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • treatment means any action in which symptoms caused by a disease are improved or beneficially altered by administration of a composition of the present invention.
  • Subjects in which the methods according to the invention are used are primates including but not limited to humans.
  • the recombinant chimeric protein according to the present application may be administered in a therapeutically effective amount to a subject in need of hemophilia or coagulation in the form of a composition as described above or as provided above, and may be provided in the form of a blood coagulation method or a method of treating hemophilia. This may be referred to the above description.
  • FVIII expressed in the short chain form
  • FVIII was constructed in which part of the B domain including the furin cleavage position 1648 residue (based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 01 representing the full length FVIII amino acid sequence) was deleted.
  • Each constructed scFVIII contains a B domain of a specific length from the N-terminus of the B domain (the 741th amino acid residue of SEQ ID NO: 01), and the included B domain is constructed so that it contains the sugar chains it originally possesses, and is site specific.
  • the 782 isoleucine residue located in the B domain was modified with cysteine for site-specific PEGylation.
  • the manufacturing method is as follows.
  • Each scFVIII of which the B domain of Table 1 was deleted was synthesized based on the human FVIII nucleic acid sequence (NM000132).
  • the CSL form (Leader-heavy chain-B domain (741-764, 1653-1689) -light chain) based on the human FVIII nucleic acid sequence (NM000132) was 5 'with NotI-AsisI and 3'.
  • the entire gene was synthesized through GeneArt to include the PacI-XhoI enzyme cleavage site.
  • the synthesized gene was cloned into the NotI / XhoI site of the pcDSW vector to construct a pcDSW-CSL expression vector, and the accuracy of expression vector construction was confirmed by comparison of the cut band size after cleavage using an AsisI / PacI enzyme.
  • Each scFVIII having the B domain deleted thereafter is synthesized by GeneArt to include the PacI enzyme cleavage site at the BamHI site (GGATCC) in the A2 domain of the FVIII heavy chain and the light chain 3 ′, and then the previously completed pcDSW-CSL
  • the expression vector was removed using the enzyme BamHI / PacI
  • the corresponding region of FVIII was removed, and the synthesized gene was cut into the BamHI / PacI site and cloned into the BamHI / PacI site of the pcDSW-CSL expression vector to construct a pcDSW-scFVIII expression vector.
  • the accuracy of expression vector construction was confirmed by size comparison after cleavage using BamHI / PacI enzyme.
  • the cysteine-introduced scFVIII G4 (B3, SEQ ID NO: 3) synthesized genes through GeneArt to include the PacI enzyme cleavage site at the light chain terminal 3 'from the BamHI site (GGATCC) present in the cysteine substitution site and the FVIII heavy chain A2 domain.
  • the heavy and light chains including D′ D3 were expressed in one cell using different vectors.
  • the heavy chain including D′ D3 includes a B domain corresponding to B3 used in Example 1-1, and the light chain was made with reference to a vector expressing the light chain described in Korean Patent No. 251286.
  • the chimeric FVIII was fused with one or two D'D3s based on the short-chain FVIII and dimer FVIII made in Examples 1-1 and 1-2, so that the fused D'D3 could bind to FVIII properly.
  • Linkers were used. The linker used part of the B domain of FVIII or [G 4 S] n . Some also included Fc in the configurations specified above (FIGS. 2, 3, and 2).
  • Cloning of the chimeric FVIII was performed using the scFVIII G4 (B3) described in Patent Example 1-1.
  • the FVIII heavy chain of SEQ ID NO: 04 synthesizes a gene through GeneArt to include a PacI enzyme cleavage site at the terminal 3 'from the KpnI enzyme cleavage site present in the A2 domain of FVIII, and then scFVIII G4 prepared in Example 1-1 (B3)
  • the expression vector pcDSW-scFVIII G4 (B3) was removed by using the enzyme KpnI / PacI to remove the corresponding region of the existing FVIII, and the synthesized gene was cloned into KpnI / PacI to construct an expression vector corresponding to the heavy chain of SEQ ID NO: 04.
  • the accuracy of expression vector construction was confirmed by length analysis through enzyme digestion.
  • the light chain of SEQ ID NO: 05 was synthesized through GeneArt to include the AsisI-Leader sequence and the BspEI enzyme cleavage site present in the FVIII light chain C1 domain at 5 ', and then expressed the scFVIII G4 (B3) prepared in Example 1-1.
  • the vector pcDSW-scFVIII G4 (B3) was removed by using the enzyme AsiSI / BspEI to remove the corresponding region of the existing FVIII and cloned the synthesized gene into the AsiSI / BspEI site to construct an expression vector corresponding to the light chain of SEQ ID NO: 05, and expression
  • the accuracy of vector construction was confirmed by length analysis via enzyme digestion.
  • SEQ ID Nos. 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, and 16 represent the PacI enzyme cleavage site at the terminal 3 'from the BspEI enzyme site sequence present in the C1 domain of the FVIII light chain.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 15 differs from the position of the thrombin cleavage site in the linker
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 16 differs from the position of the thrombin cleavage site and the linker sequence itself. TH1 and TH2.
  • SEQ ID NOs: 17, 18, and 21 are CHO codon optimization and genes synthesized through Cosmojintech to include the PacI enzyme cleavage site at the terminal 3 ′ from the BspEI enzyme site sequence present in the FVIII light chain C1 domain, and Example 1-1.
  • ScFVIII G4 (B3) expression vector pcDSW-scFVIII G4 (B3) prepared by using the enzyme BspEI / PacI removed the region of the existing FVIII and cloned the synthesized gene to the BspEI / Paci site SEQ ID NO: 17, 18, A chimeric FVIII expression vector corresponding to 21 was constructed, and the accuracy of expression vector construction was confirmed by length analysis through enzyme digestion.
  • SEQ ID NO: 19 adds a NotI-AsiSI enzyme cleavage site to 5 ′ and synthesizes CHO codon optimization and genes through Cosmogenetech to include the AflII enzyme cleavage site present in the FVIII heavy chain A1 domain
  • Example 1-1 ScFVIII G4 (B3) expression vector pcDSW-scFVIII G4 (B3) was removed using the enzyme AsiSI / AflII, and the cloned gene was cloned into the AsiSI / AflII site, corresponding to SEQ ID NO: 19.
  • Chimeric FVIII expression vectors were constructed and the accuracy of expression vector construction was confirmed by length analysis via enzyme digestion.
  • SEQ ID NO: 20 removes the existing gene of interest from the gene represented by SEQ ID NO: 64 synthesized by Cosmojintech using the enzyme MfeI / XbaI, and processes the enzyme MfeI / XbaI from the gene represented by the synthesized SEQ ID NO: 63 and inserts.
  • scFVIII G4 (B3) expression vector pcDSW-scFVIII G4 (B3) was removed using the enzyme NotI / PacI to remove the corresponding region of the existing FVIII, and the primary cloned gene was enzyme NotI.
  • the insert was cut with / PacI and cloned into the NotI / PacI site of the expression vector to construct an expression vector corresponding to SEQ ID NO: 20, and the accuracy of the expression vector construction was confirmed by length analysis through enzyme cleavage.
  • SEQ ID NO: 22 was synthesized through GeneArt so that 5 'AsisI and 3' PacI enzyme cleavage site, respectively, and the scFVIII G4 (B3) expression vector pcDSW-scFVIII G4 prepared in Example 1-1 In (B3), the enzyme AsisI / PacI was used to remove the corresponding region of the existing FVIII, and the synthesized gene was cloned into the AsisI / PacI site to construct an expression vector corresponding to SEQ ID NO: 22. It was confirmed through the length analysis through.
  • SEQ ID NO: 15 additionally prepared a CHO expression vector to produce a CHO transformed cell line.
  • the gene was synthesized to include AatII-AscI in SEQ ID NO: 15 ', and BsiWI-PacI enzyme cleavage site in 3', respectively, or optimized for CHO expression through Biobasics, GeneArt, and Genscript.
  • CHO expression vector CHO expression vector corresponding to SEQ ID NO: 15 was constructed by cloning the gene synthesized at the AscI / PacI site of pMSID2. The accuracy of expression vector construction was confirmed by length analysis via enzyme digestion.
  • Chimeric FVIII constructed in Example 1 was expressed in cells, and the expressed cells were cultured in cell culture medium.
  • the expression vector constructed in Example 1 for expression was transferred to Expi293F TM cells using an Expi293F TM Expression System Kit (Thermofisher, Catalog Number A14635). Transformation method and culture was performed as follows on a 30mL scale, the actual culture volume was adjusted according to the protein requirements. 24 hours before the transformation, Expi293F TM cells were passaged at 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL using the Expi293 culture medium to the expected requirements. On the day of transformation, the cell number and viability were measured, and when the cell viability was 95% or more, transformation was performed.
  • Example 2 Into a 125mL flask was adjusted to 25.5mL by adding Expi293 culture medium to 7.5 X 10 7 cells. 30 ⁇ g of the expression vector constructed in Example 1 was mixed using Opti-MEM so that the total volume was 1.5 mL. The 80 ⁇ L transfection reagent was mixed with Opti-MEM so that the total volume was 1.5 mL and incubated at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, the Opti-MEM containing the transfection reagent was added to the Opti-MEM containing the DNA and mixed gently. And reacted at room temperature for 20 to 30 minutes.
  • a CHO transformed cell line was constructed and expressed chimeric FVIII.
  • CHO DG44 cells were passaged to the required amount in CDM4CHO medium (Hyclone, Catalog Number, SH30557.02) in an amount of 5-6 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • CDM4CHO medium Hyclone, Catalog Number, SH30557.02
  • 1 x 10 7 cells / mL was dispensed at 3 mL using OptiPro medium (Thermo fisher, Catalog Number 12309-019).
  • the 30 ⁇ g CHO expression vector constructed in Example 1 was mixed using OptiPro so that the total volume was 1.5 mL.
  • PEI MAX 1 ⁇ g / ⁇ L
  • OptiPro OptiPro containing DNA
  • 3 mL of the DNA: PEI complex was dropped dropwise onto the prepared CHO DG44 cells. Incubated for 4 hours at 140 rpm in 37 °C, 5% CO 2 shaking incubator. 24 mL of CDM4CHO medium was added to incubate at 140 rpm and cell selection was performed 48 hours later.
  • Transformed CHO DG44 cells were suspended in a T-175 flask at 50 ⁇ 5 ⁇ 10 6 cells / mL using CDM4CHO culture medium containing 20 nM MTX and allowed to stand for 7 days in 37 ° C., 5% CO 2 incubator. If the cell count was insufficient, the total volume was reduced. After 7 days of screening, the number of cells was measured and passaged using a culture medium containing 20 nM MTX at 5 x 10 5 cells / mL in a 125 mL flask and incubated at 37 rpm and 140 rpm in a 5% CO 2 shaking incubator. Subcultures were carried out in 125mL flasks at 3-4 day intervals and screening was determined to be complete when the cell concentration was 1 x 10 6 cells / mL and the survival rate was greater than 90%.
  • CHO transformed cell lines were inoculated at 3 x 10 5 cells / mL for chimeric FVIII expression and cultured at 140 rpm in a 37 ° C, 5% CO 2 shaking incubator. On day 4 of the culture, all the cells were centrifuged to completely remove the existing culture medium. After releasing all the cells in a new culture medium of the same volume, the cells were incubated at 140 rpm in 31 ° C., 5% CO 2 shaking incubator for 1 day. The medium exchange and incubation were repeated until the 8th day of culture and the 6, 7 and 8 days of culture were recovered to analyze and purify the activity of chimeric FVIII.
  • FVIII activity assay methods There are two commonly used FVIII activity assay methods, one-stage clotting method and chromogenic method. Among them, chimeric FVIII expression was measured using the chromogenic method.
  • the chromogenic method mixes FIXa, FX, thrombin, calcium, phospholipids and FVIII samples, and then inserts a chromogenic substrate that is cut and developed by FXa to measure the amount of FXa activated by the FVIII sample and develops the chromogenic substrate. It is a method of measuring the activity of FVIII according to the degree.
  • the chromogenic method was used as an endpoint method for the chromogenic assay kit sold by CHROMOGENIX.
  • the test method provided by the manufacturer was modified to suit this test. Dilute the sample into the standard range (0.25-1 IU / mL) using a 1 ⁇ dilution buffer. Calibration plasma was prepared using a 1 ⁇ dilution buffer to a concentration of 0, 0.25, 0.5, 1 IU / mL. 10 ⁇ L of the prepared sample and 10 ⁇ L of the standard product were diluted with 790 ⁇ L of 1 ⁇ dilution buffer, and then 50 ⁇ L was dispensed into a 96 well plate and allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes.
  • 50 ⁇ L of the reagent reagent was dispensed into each well by using an automatic dispenser pipette, followed by reaction at 37 ° C. for 2 minutes.
  • 50 ⁇ L substrates were dispensed into each well and allowed to develop for 2 minutes at 37 ° C. for 2 minutes.
  • 50 ⁇ L 2% citric acid was added to the developed sample to stop the reaction. After measuring the absorbance at 405nm wavelength to draw a linear calibration curve, the absorbance of the sample was substituted into the calibration curve to measure the activity of the sample.
  • the expression level of scFVIII-B3 before fusion of D′ D3 was measured between 1.6 and 8.0 IU / mL.
  • the expression level was confirmed to be similar to scFVIII-B3 before fusion of D'D3.
  • the expression level was confirmed to be 10 times lower than the existing scFVIII-B3 at 0.1 IU / mL, and the measured results are described in Table 3.
  • the mixture and the LDS sample buffer were mixed at a ratio of 3: 1, respectively, and loaded with 30 ⁇ L of the mixed sample on a 4-12% bis-tris (BT) gel, and then run at 150 volt for about 1 hour. After running the gel was transferred to nitrocellulose (NC) membrane, it was allowed to stand for one hour in blocking buffer (Thermo Scientific). Primary membranes that recognize the heavy chain (GMA-012, Green Mountain Antibodies), light chain (ab41188, Abcam) and D'D3 (96340, Abcam) of Factor 8 were prepared by diluting them in TBST buffer and blocking NC membranes. It was reacted with for 1 hour. Washing is performed 3 times at 5 minute intervals using TBST buffer.
  • the chimera FVIII production process is largely composed of five steps, and purification was performed using the culture medium cultured in Example 2.
  • the VIIISelect resin developed by GE for the purification of FVIII was used to isolate and purify chimeric FVIII from the culture.
  • the column was washed with 2% citric acid.
  • Equilibrate equilibration by flowing equilibration buffer (20 mM Histidine, 5 mM CaCl 2 , 1 M NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0). 5 M NaCl buffer was added to the culture solution to the final 1 M NaCl concentration, the pH was adjusted to 7.0, and the column was loaded. After incubation, the equilibration buffer was equilibrated by flowing until UV dropped to the baseline.
  • the chimeric FVIII was eluted by flowing an elution buffer (20 mM Histidine, 5 mM CaCl 2 , 0.9 M Arginine, 45% propylene glycol, 0.02% Tween® 80, pH 6.5).
  • GE's Q fast flow resin was used to remove propylene glycol mixed in the eluate of the first step and remove some of the mixed impurities.
  • the column was washed by flowing washing buffer (0.5 M NaOH, 1 M NaCl).
  • Equilibration buffer (20 mM Histidine, 5 mM CaCl 2 , 0.02% Tween® 80, pH 7.0) was run out to equilibrate.
  • the eluate of the VIIISelect process was diluted 10-fold with equilibration buffer, then the pH was titrated to 7.0 and loaded onto the column. After loading, the equilibration buffer was equilibrated by flowing until UV dropped to the baseline.
  • the chimeric FVIII was eluted by flowing an elution buffer (20 mM Histidine, 5 mM CaCl 2 , 500 mM NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0).
  • PEG is conjugated to purified chimeric FVIII.
  • TCEP was added to the purified chimeric FVIII solution so that the final concentration was 0.1 mM, and then the inserted cysteine was reduced by standing at 4 ° C for 1 hour. Residual TCEP was removed using a PD-10 column (GE healthcare) equilibrated with PEGylation buffer (20 mM Histidine, 5 mM CaCl 2 , 200 mM NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0). In order to oxidize the disulfide bond of the reduced chimeric FVIII itself, it was left standing at 4 ° C. for 2 hours.
  • the PEG solution 50 mg / mL
  • DMSO was added at a PEG ratio of 1:20 per protein, and then allowed to stand at 4 ° C. for 12-16 hours.
  • GE's Superdex 200 resin was used to remove the chimeric FVIII without PEG and the chimeric FVIII with two or more PEGs.
  • Equilibration was performed by pouring equilibration buffer (20 mM Histidine, 5 mM CaCl 2 , 200 mM NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0) onto a pre-packed superdex 200 column. PEGylation process samples were loaded onto the column using a sample loop. After loading, the peaks were collected by flowing the equilibration buffer, and analyzed by SDS-PAGE to pool appropriate fractions.
  • the PEGylated chimera FVIII pooled in the fourth step is concentrated.
  • Millipore's amicon 30kDa was concentrated to 25 IU / mL concentration.
  • Binding affinity of chimeric FVIII with LRP or vWF was measured using an ELISA method. Coat 100 ⁇ L per well on a 96 well plate using vWF (HCVWF-0191, Haemtech, 200 ⁇ g / mL) or LRP (# 04-03, Biomac, 260 ⁇ g / mL) and allow to stand at room temperature for 2 hours. . After incubation for 2 hours, washing is performed with washing buffer added 0.1% Tween® 20 to PBS. Insert blocking buffer added 1% BSA to PBS 200 ⁇ L per well, incubation at room temperature for 1 hour to perform blocking. After 1 hour incubation, washing is performed with washing buffer added 0.1% Tween® 20 to PBS.
  • Washing is performed with washing buffer to which 0.1% Tween® 20 is added to PBS.
  • TMB substrate (52-00-03, KPL) was treated with 100 ⁇ L per well and incubated for 10 minutes. After stopping the reaction by adding 100 ⁇ L of a stop solution (1 N sulfuric acid) per well, measure the absorbance of 490 nm.
  • the control material Advate® and pegylated chimeric FVIII (in this example, PEG-scFVIII / D'D3-120) were administered intravenously at a dose of 125 IU / kg.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • PK analysis As a result of PK analysis (FIG. 9), the half-life of Advate® was measured to be about 7.86 hours, and the half-life of PEG-scFVIII / D'D3-120 was measured to be about 26.12 hours, 3.3 times longer than Advate®.
  • the mean retention time (MRT) of PEG-scFVIII / D'D3-120 also increased 3.6-fold over Advate®.
  • the disappearance rate (CL) of PEG-scFVIII / D'D3-120 was reduced by about 2 times compared to Advate®, and the area under the concentration curve (AUC) was increased by about 2 times.
  • the FVIII concentration in the blood is maintained at 1% or 3% or more, so when using long-lived FVIII with a long half-life, the concentration of blood FVIII falls below 1% or 3%. This can lead to a decrease in the number of doses.
  • the half-life increase in HA mice was less than twice that of the control group.
  • FVIII did not last longer than the half-life of vWF because FVIII roams in a state with strong non-covalent binding to vWF in the blood.
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 7.88 hours, the half-life of 40kDa PEG-scFVIII / D'D3-120 was about 20.93 hours, and the half-life of 60kDa PEG-scFVIII / D'D3-120 was about 28.09. Measured by time. Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIGS. 10 and 6.
  • the PEG-scFVIII / D'D3-60 and Fc were subjected to a PK test using a material in which PEG was conjugated to scFVIII / D'D3-120.
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 7.08 hours, the half-life of PEG-scFVIII / D'D3-60 was about 16.53 hours, and the half-life of PEG-scFVIII / D'D3 / Fc-120, Fc. It was measured about 18.89 hours.
  • Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIGS. 11 and 7.
  • Example 10 Animal PK Test: PEG Conjugation to scFVIII / D'D3-120, in which PEG-scFVIII / D'D3-300 and D'D3 were dimerized to the c-terminus of FVIII
  • the PEG-scFVIII / D'D3-300 and the D'D3 in the dimer form were subjected to PK test using a substance conjugated with PEG to scFVIII / D'D3-120 fused to the c-terminus of FVIII. It was.
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 9.02 hours, the half-life of PEG-scFVIII / D'D3-300 was about 15.76 hours, and the half-life of PEG-scFVIII / D'D3 / D'D3-120. It was measured at about 18.00 hours.
  • Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIGS. 12 and 8.
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 6.99 hours, and the half-lives of PEG-scFVIII / D'D3-60, PEG-scFVIII / D'D3-120, and PEG-scFVIII / D'D3-300 were approximately 20.07, respectively. , 24.48, 17.13 hours.
  • Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIGS. 13 and 9.
  • Example 12 Animal PK Test: PEG-scFVIII / D'D3-120, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH2
  • the PK test was performed using PEG-scFVIII / D'D3-120, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, and PEG-scFVIII / D'D3-120-TH2.
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 6.26 hours and the half-life of PEG-scFVIII / D'D3-120, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, PEG-scFVIII / D'D3-120-TH2. Were measured at approximately 21.28, 24.19, and 25.28 hours, respectively. Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIG. 14 and Table 10.
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 7.66 hours, and 20kDa linear PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, 20kDa branch PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1, 40kDa branch PEG-scFVIII / D
  • the half-life of 'D3-120-TH1 was measured to be about 22.98, 16.10 and 27.33 hours, respectively.
  • Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIG. 15 and Table 11.
  • a thrombin generation assay was performed to confirm the thrombin generation profile of PEGylated chimeric FVIII.
  • the Fluoroskan Ascent TM FL microplate fluorometer and luminometer (5210460, Thermofisher) instrument was warmed to 37 ° C in advance and the machine line was washed with 37 ° C pre-warmed D.W. FVIII deficient plasma (OTXW17, Siemens), Calibrator (TS20.00, Thrombinoscope) and PPP-low-reagent (TS31.00, Thrombinoscope) were left at room temperature for at least 15 minutes and warmed to 37 °C pre-warmed DW 1mL. reconstitution.
  • Thrombin generation assay showed that the thrombin generation profile was significantly lower in FVIII deficient plasma, whereas the thrombin generation profile was gradually increased in the chimeric FVIII.
  • the thrombin generation profile of chimeric FVIII 1 IU / mL was confirmed to be similar to the thrombin generation profile of normal plasma (FIG. 16).
  • HA mice hemophilia type A mice
  • Wild type mice (WT) used 19-25 g-weight male C57BL / 6 mice from Orient Bio. HA mice were bred from green cross and 19-25 g-weight male mice. It was.
  • the saline was filled up to 14 mL in a 15 mL conical tube (1 / horse), soaked in a heated water bath to maintain the saline temperature at 37 ° C., and the weight of the mouse was measured before administration.
  • the negative control was 0.9% physiological saline
  • the positive controls Advate® and pegylated chimera FVIII were 5 mL with jugular vein at 100 IU / kg dose. Single dose at a volume of / kg.
  • a 4 mm point was cut from the end of the HA mice tail, and the tail was placed in saline buffer to collect blood for 30 minutes.
  • the third distilled water up to 10mL in a conical tube using a 10mL pipet to hemolyzed blood completely using a vortex.
  • Hemoglobin assay kit MAK115-1KT, Sigma-Aldrich
  • Advate® and PEGylated chimera FVIII were found to have a hemoglobin concentration of about 140-450 nM, which is about 55% lower than the negative control. It was found that there was no statistical difference between Advate® and PEGylated chimeric FVIII (FIG. 17).
  • Blood samples from the control group, Advate® were administered at 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr after administration, and blood samples from the test group were administered at 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 200 ⁇ L sampling was performed at 40, 48, 64, 72 and 96 hr.
  • anticoagulant sodium citrate 3.2% buffer
  • Titers of Advate® and PEGylated chimeric FVIII were measured using the Chromogenic method, and pharmacokinetic parameters were calculated using the non-compartmental (NCA) model of the WinNonLin software (version 6.4).
  • PK analysis showed that the half-life of Advate® was about 8.22 hours.
  • the half-lives of 20kDa linear PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1 and 40kDa linear PEG-scFVIII / D'D3-120-TH1 were about 25.01 and 26.88, respectively. Measured by time. Pharmacokinetic profiles and pharmacokinetic parameters are shown in FIGS. 18 and 12.

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Abstract

본원에 따른 키메라 단백질은 FVIII에 결합된 vWF 도메인으로 인해, 투여시 체내 반감기가 월등히 증가하여, 혈우병 A형의 치료제로서 환자의 편리성이 증대되는 것은 물론, 치료비의 절감을 가져올 수 있다.

Description

FVIII 및 VWF 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도
본원은 혈우병의 치료에 사용되는 재조합 Factor VIII과 관련된 기술이다.
혈우병은 응고인자의 부족으로 지혈이 되지 않아 출혈이 지속적으로 생기는 질환이다. 혈액 내 응고인자는 I~XIII으로 구성되어 있으며, 이중 혈우병과 관련 있는 인자는 VIII, IX 및 XI이다. 혈우병은 상기 각 인자의 유전자 결함으로 발생되며, 부족한 응고인자의 종류에 따라 Factor VIII이 부족한 혈우병 A, Factor IX이 부족한 혈우병 B 및 Factor XI이 부족한 혈우병 C로 구분되며, 혈우병 A가 약 80-85%를 차지한다.
혈우병은 유형에 따라 투여약제가 상이하며, 동일한 유형의 경우에도 투여부위에 따라 투여량과 방법이 다르다. 하지만 혈우병 치료의 목적은 지혈이며 치료는 효소대체요법(ERT, Enzyme Replacement Therapy)을 이용하여 예방적(prophylaxis)과 대증적(on demand)의 두 가지 측면에서 수행되는데, 현재 치료법은 예방적 측면으로 옮겨가는 추세이다.
ERT를 위해 사용되는 효소로 과거에는 전혈과 혈장에서 추출하여 농축한 FVIII (혈우병 A), FIX 인자 (혈우병 B)가 사용되었다. 하지만 전혈과 혈장에서 혈우인자를 추출할 때, AIDS나 HBV와 같은 바이러스에 감염된 사람의 혈액이 일부 사용되었고, 이러한 바이러스가 혈우인자(coagulant factor) 추출과정에서 적절히 제거되지 못함으로 인한 바이러스 감염과 같은 부작용과 합병증의 문제가 발생하였다. 따라서 최근에는 유전자 재조합 기술로 생산된 다양한 인자가 개발되어 사용되고 있으며, 예를 들면 온전한 형태의 FVIII, 또는 B 도메인이 결실된 형태, 특정 잔기에서의 변형을 통해 반감기가 증가된 다양한 FVIII 등이 개발되고 있다.
FVIII을 예방적 요법으로 사용할 때, FVIII의 혈중 반감기가 12시간(human)으로 짧아 2~3일에 한 번 투여해야 하는 불편함이 있다. 또한, I.V 투여이기 때문에 투여 횟수 감소가 환자 편의성 측면에서 봤을 때, 중요하다. 이에 FVIII의 혈중 반감기를 늘려준 long-acting FVIII이 최근 개발되었다.
그 중 한 가지는 FVIII의 C-말단에 항체의 Fc 도메인을 융합한 FVIII-Fc 융합 단백질(FVIII-Fc)이 개시되어 있고, 이 물질은 FcRn recycling을 이용하여 반감기를 증가시키는 전략을 사용하였다. 또한 FVIII에 PEG(polyethylene glycol)를 FVIII의 생체 내 제거(clearance)를 담당하는 것으로 알려진 LRP(Low density lipoprotein receptor related protein)과의 결합부위 근처에 접합시킨 페길화 FVIII이 몇 건 개시되어 있다. 하지만, 이들 long-acting FVIII들의 임상결과 반감기가 기존 12시간에서 평균 18시간 정도로 약 1.5배 밖에 증가하지 못 했으며, 이는 기존 주 3~4회의 투여 횟수가 주 2~3회 투여 횟수로 줄어든 것을 의미한다. 이렇게 FVIII-Fc와 페길화 FVIII의 반감기가 크게 증가하지 못 하는 이유는 FVIII이 혈중에서 vWF와 비공유 결합(non-covalent interaction)을 강하게 하고 있는 상태로 혈중에서 순환(circulation)하고 있기 때문이다. FVIII-Fc와 페길화 FVIII의 경우에도 혈중에서 혈중에 존재하는 vWF와 비공유 결합을 하게 되고, 결국 vWF의 반감기에 영향을 받아 vWF의 반감기(12시간, human)에 수렴하게 되는 한계가 있다 (Tiede A. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13 (Suppl. 1): S176-S179).
현재까지 개발된 치료제는 여전히 기능적 측면에서 투여 주기(정맥 주사)가 짧고, 또한 충분히 길지 못한 반감기로 인한 체내 효력 소실에 따라 잦은 출혈 빈도가 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 투여 횟수를 최소 주 1회까지 줄여 주기 위한 반감기가 3배 이상 증가한 long-acting FVIII의 개발이 필요하다.
본원은 체내 체류 시간이 향상되어 주 1회 이하로 투여 가능한 FVIII을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 경쇄 및 중쇄를 포함하며 B 도메인의 전장 또는 그 일부가 결실된 인간 혈액응고 8인자(Factor VIII, FVIII); 및 하나 이상의 vWF D’D3 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 제공한다. 본원에 따른 단백질은 야생형 FVIII 단백질과 비교하여 최소 2배 반감기가 연장된다.
본원에 따른 키메라 단백질에서, 상기 경쇄 및 중쇄는 한 개 폴리펩타이드로 또는 두 개의 폴리펩타이드로 발현될 수 있다.
본원에 따라 상기 한 개의 폴리펩타이드로 발현되는 경우, 상기 FVIII 및 상기 vWF D’D3 도메인을 연결하며, 그 사이에 위치하는 효소절단부위 갖는 연결체를 포함하며, 상기 vWF D’D3 도메인은 상기 연결체를 기준으로 그 N-말단이 상기 FVIII의 N-말단 또는 C-말단 방향, 또는 상기 vWF D’D3 도메인 및 상기 FVIII는 각각 상기 연결체를 기준으로 그 N-말단 방향 또는 C- 말단 방향에 위치한다. 일 구현예에서 예를 들면 N 부터 C 방향으로 FVIII-연결체-D’D3 또는 D’D3-연결체-FVIII의 순서로 배열될 수 있다.
본원에 따라 두 개의 폴리펩타이드로 발현되는 경우, 상기 vWF D’D3 도메인은 그 N-말단이 상기 중쇄에 포함된 상기 B 도메인의 C-말단에 연결될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 일부가 결실된 B 도메인은 서열번호 1의 서열에서, 1648 및 1649 잔기 위치를 기준으로 상기 잔기를 포함하여 N-말단 및/또는 C-말단 방향으로 각각 최소 5개의 아미노산이 결실된 것; 또는 상기 B 도메인이 최소 4개, 또는 4개 내지 6개의 당화부위를 포함하도록 일부가 결실된 것을 포함한다.
다른 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 일부가 결실된 B 도메인은 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 741 내지 902 및 1654 내지 1689의 서열, 또는 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 741 내지 936의 서열로 표시된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질은 하나 이상의 Fc를 추가로 포함하며, 상기 Fc는 상기 vWF D’D3 도메인 및/또는 상기 FVIII에 연결될 수 있다.
본원에 따른 다른 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질은 두 개 이상의 vWF D’D3 도메인 및/또는 두 개 이상의 Fc를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 복수 개의 vWF D’D3 도메인간, 그리고 복수 개의 Fc 간에는 서로 효소절단부위를 포함하거나 포함하지 않는 연결체로 연결되거나 및/또는 서로간에 공유결합을 통한 복합체, 예를 들면 두 개를 포함하는 경우 이량체를 형성할 수 있다. 여기에 사용된 효소절단부위 및 연결체는 본 명세서에 기재된 것을 참조 할 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에서 효소절단 부위를 포함하는 연결체가 사용되는 경우, 상기 효소절단부위는 트롬빈, FVIIa, FXa 또는 FXIa에 의해 절단될 수 있는 서열이고, 그 외의 서열은 [G4S]n 의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 식에서 n= 0, 또는 1 내지 100 사이 정수, 특히 n은 6, 8, 10, 12, 18, 24 또는 60이다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에서 연결체에 포함된 효소절단 부위에서 상기 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 DFLAEGGGVR (서열번호 36), TTKIKPR (서열번호 37), 또는 LVPRGS (서열번호 38)이고, 상기 FVIIa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 ASKPQGRIVGG (서열번호 39), 상기 FXa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 IDGR (서열번호 40) 또는 IEGR (서열번호 41)이고, 상기 FXIa에 의해 절단될 수 있는 서열은 SKLTRAETVF (서열번호 42)로 표시될 수 있다.
다른 양태에서 본원에 따른 키메라 단백질은 제 1 및 제 2 폴리펩타이드의 형태로 발현되며, 제 1 폴리펩타이드는 상기 FVIII의 중쇄 및 B 도메인의 전부 또는 일부를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드는 상기 FVIII의 경쇄 또는 B 도메인의 일부를 포함하고, 상기 vWF D’D3 도메인은 상기 제 1 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 방향, 또는 제 2 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치한다. vWF D’D3 도메인이 제1 폴리펩타이드 N-말단 또는 제 2 폴리펩타이드의 C-말단에 연결되는 경우 scFVIII의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는 것과 유사한 구조를 갖으며, 이 경우 FVIII가 단쇄 또는 이쇄인지가 차이나는 부분이다.
일 구현예에서 제 1 및 제 2 폴레펩타이드의 형태로 발현되는 경우, 상기 vWF D’D3 도메인은 제 1 폴리펩타이드의 C-말단 방향에 위치한다.
본원에 따른 키메라 단백질은 하나 이상, 특히 두 개의 vWF D’D3 도메인을 포함할 수 있으며, vWF D’D3 도메인 간에 복합체(이량체)를 형성할 수 있다.
선택적으로 본원에 따른 키메라 단백질은 하나 이상의 Fc, 특히 두개의 Fc를 추가로 포함하며, 상기 Fc는 상기 vWF D’D3 도메인 및/또는 상기 제 2 폴리펩타이드에 연결될 수 있다. Fc 간에 복합체(이량체)를 형성할 수 있다.
일구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에서 Fc 또는 상기 vWF D’D3 도메인은 효소절단부위를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연결체로 연결된다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질은 한 개의 폴리펩타이드로 발현되는 경우 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 또는 25로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 생물학적 기능이 균등하거나 또는 이와 90% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열도 본원에 포함될 수 있다.
다른 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질은 두 개의 폴리펩타이드로 발현되는 경우 서열번호 4 및 5 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 23 및 24 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 26 및 27 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 28 및 29 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 30 및 31 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 32 및 33 (각각 중쇄 및 경쇄), 또는 서열번호 34 및 35 (각각 중쇄 및 경쇄)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 생물학적 기능이 균등하거나 또는 이와 90% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열도 본원에 포함될 수 있다.
본원에 따른 키메라 단백질은 FVIII의 A 도메인 및/또는 B 도메인 단편의 일부 아미노산 잔기에서 친수성 폴리머와 컨쥬게이션될 수 있고, 상기 컨쥬게이션되는 위치는 상기 B 도메인에서 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 754, 781, 782, 788, 789, 825, 및 897로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치이고; 상기 A 도메인에서 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 491, 495, 498 및 1806으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치이고, 상기 컨쥬게이션되는 위치의 잔기, 특히 컨쥬게이션 되는 모든 위치의 잔기는 친수성 폴리머와의 접합을 위해 시스테인으로 치환된다.
일 구현예에서 친수성 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드, 덱스트란이다.
다른 구현예에서, 친수성 폴리머는 폴리에틸렌글리콜이고, 평균 분자량이 최소 20kDa이상, 특히 40kDa 또는 60kDa의 PEG가 사용된다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질은 FVIII의 B 도메인 단편, 특히 782번 잔기에서 개질된다.
다른 양태에서 본원은 상술한 키메라 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 키메라 단백질, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포의 용도를 제공한다.
본원에 따른 발명의 용도는 혈우병 치료용 조성물, 혈우병 치료 방법, 혈액 응고용 조성물, 혈액 응고 방법, 또는 본원에 따른 단백질의 생산 방법을 포함한다.
본원에 따른 FVIII와 vWF 도메인이 결합된 키메라 단백질 또는 PEG로 개질된 형태의 키메라 단백질은 투여 시 체내 반감기가 월등히 증가하여, 기존 주 2~4회의 투여 횟수를 주 1회 이하로 줄여주어, 혈우병 A형의 치료제로서 환자의 편리성이 증대되는 것은 물론, 치료비의 절감을 가져올 수 있다.
도 1은 본원에 따른 반감기가 증가된 재조합 FVIII의 반감기 증가 기전을 도식적으로 나타낸 것이다. FVIII의 생체 내 제거에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 알려진 LRP 결합부위를 PEG와 vWF의 일부 도메인인 D’D3로 가려(masking)주는 것이 첫 번째 전략이다. 이와 동시에 본원에 따른 키메라 단백질에 vWF의 일부 도메인인 D’D3를 공유적으로 결합시켜 주어 혈중에 있는 내인성 vWF가 키메라 단백질에 결합하는 것을 막아주는 것이 두 번째 전략이다.
도 2a 및 2b는 각각 본원에 따른 단쇄(단일 폴리펩타이드) 및 이쇄(이중 폴리펩타이드)로 발현되는 키메라 단백질의 다양한 분자구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따른 단일 폴리펩타이드로 발현되는 키메라 단백질을 코딩하는 벡터를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따른 다양한 길이의 연결체를 포함하는 키메라 단백질 발현 및 정제 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 다양한 길이의 연결체를 포함하는 키메라 단백질을 각각 중쇄, 경쇄 및 D’D3에 대한 항체로 분석한 웨스턴블랏 결과이며, 사용된 각 항체는 다음과 같다: 중쇄: Green mountain, GMA-012; 경쇄: Abcam, 41188 및 D’D3: Abcam, 96340.
도 6은 본원의 일 구현예에 따른 scFVIII/D’D3-60, -120 및 -300을 PEG로 개질한 페길화 키메라 단백질을 정제 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 7은 본원의 일 구현예에 따른 키메라 FVIII (scFVIII/D’D3-120-TH1), 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1)의 vWF 결합 분석 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 8은 본원의 일 구현예에 따른 키메라 FVIII (scFVIII/D’D3-120-TH1), 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1)의 LRP 결합 분석 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 9는 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-120)의 HA mice에서의 PK 분석 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 10은 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (40 kDa PEG-scFVIII/D’D3-120, 60 kDa PEG-scFVIII/D’D3-120)의 HA mice에서의 PK 분석 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 11은 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-60, PEG-scFVIII/D’D3/Fc-120, Fc)의 HA mice에서의 PK 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 12는 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-300, PEG-scFVIII/D’D3/D’D3-120)의 HA mice에서의 PK 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 13은 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-60, PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-300)의 HA mice에서의 PK 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 14는 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH2)의 HA mice에서의 PK 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 15는 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (20 kDa linear PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, 20 kDa branch PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, 40 kDa branch PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1)의 HA mice에서의 PK 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 16은 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1)의 트롬빈 생성 분석 결과이다.
도 17은 본원의 일 구현예에 따라 제조한 페길화 키메라 FVIII (PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH2)의 꼬리클립모델(tail clip model)에서의 급성효능연구결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
도 18은 본원의 일 구현예에 따라 CHO 세포에서 발현하여 제조한 페길화 키메라 FVIII (20 kDa linear PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, 40 kDa linear PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1)의 HA 마우스에서의 PK 결과로 비교군으로 Advate®를 사용하였다.
본원은 FVIII이 내인성 vWF 단백질과 복합체를 형성하는 것을 방지 또는 억제하는 것과 동시에 FVIII이 LRP(Low density lipoprotein receptor related protein)에 결합하는 것을 막아주어 FVIII 단백질의 반감기를 연장하는 기술에 관한 것이다. 이로 인해 LRP 및 프로테아제 의존적 FVIII 제거를 지연시키는 것은 물론 vWF 의존적 제거를 동시에 감소시켜 반감기가 증가된다.
따라서 한 양태에서 본원은 인간 혈액응고 8인자(Factor VIII 또는 FVIII) 및 하나 이상의 vWF D’D3 도메인이 융합된 키메라 단백질에 관한 것이다.
본원에 따른 키메라 단백질은 천연형태에서 경쇄와 중쇄로 구성되는 FVIII의 경쇄 및 중쇄를 하나의 폴리펩타이드로 발현되는 단쇄(sc, single chain)로, 또는 경쇄 및 중쇄가 각각 별개의 폴리펩타이드로 발현되는 이쇄(dc, dual chain)의 형태를 취할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질이 단쇄(단일 폴리펩타이드)로 구현되며, 이 경우 vWF D’D3 도메인은 FVIII의 N- 또는 C- 말단 방향에 위치하며, 효소에 의한 절단 부위를 포함하는 아미노산 링커(또는 연결체)로 연결된다.
본원에 따른 키메라 단백질은 또한 이쇄(이중 폴리펩타이드)로 구현되며, 이 경우 vWF D’D3 도메인은 FVIII의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C- 말단 방향에 연결될 수 있다. 일 구현예에서는 특히 B 도메인의 C- 말단 방향에 연결된다.
본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 FVIII 단백질은 vWF와의 결합을 통해 본원에 따른 목적을 달성하는 한, 다양한 길이 또는 유래의 것이 사용될 수 있다.
FVIII는 A1-A2-B-A3-C1-C2 도메인으로 구성되며, 간세포에서 단쇄의 단백질로 합성된다. 합성 후 프로세싱을 거쳐 성숙되어 중쇄와 경쇄로 구성된 280 kDa의 헤테로이량체를 형성한다. 이 중 경쇄는 80kDa이며 A3-C1-C2 도메인으로 구성되고, 중쇄는 A1-A2-B 도메인으로 구성되고 분자량은 90-200kDa으로 B-도메인의 길이에 따라 분자량의 차이가 크다. 이러한 헤테로이량체는 혈액 내에서 vWF와 결합하여 비활성화 상태로 존재하다가, 혈관 손상과 같은 자극에 노출 시, 트롬빈에 의해 알지닌 잔기 뒤, 즉 서열번호 01의 서열을 기준으로 372, 740 및 1689번 잔기 뒤에서 절단된다. 그 결과 vWF로부터 분리되고, 활성화되어 A1, A2 및 A3-C1-C2의 삼량체가 형성된다. 이어 삼량체는 FIXa에 의한 FX의 활성화를 촉매하고, 빠르게 분해된다.
본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 FVIII 단백질은 응고 경로에서 전장 야생형 FVIII 인자의 기능을 보유하는 전장, 이의 기능적 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함한다. FVIII 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 또는 FVIII과 상호 교환적으로 사용된다. FVIII 기능의 예는 혈액 응고를 활성화시키는 능력, IX 인자에 대한 보조인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에 IX 인자와 테나세 복합체(tenase complex)를 형성하는(이후 X 인자를 활성화 형태 Xa로 전환시킴) 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
또한 다양한 유래의 FVIII 단백질이 사용될 수 있으며, 예를 들면 인간, 돼지과, 고양이과, 래트 또는 쥣과 FVIII 단백질일 수 있다. FVIII 아미노산 및 핵산 서열의 비제한적인 예는 예컨대 GenBank NOs: NM_000132, NP_000123, 1012296A AAA52420.1, CAA25619.1, AAA52484.1, 1012298A, EAW72647.1, EAW72646.1, XP_001498954.1, ACK44290.1, ACO95359.1, NP_001138980.1, ABZ10503.1, NP_032003.2로 개시되어 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 인간 유래의 FVIII이 사용되며, 예를 들면 인간 FVIII은 서열번호 01의 서열(신호펩타이드는 포함하지 않음)로 표시될 수 있으며, 야생형 서열에서 중쇄는 서열번호 01의 서열을 기준으로 1-740 잔기, B 도메인은 a3 도메인을 포함하여 741-1689 잔기, 경쇄는 1690-2332 잔기까지이다.
또한 FVIII의 변이체, 유도체, 변형체, 돌연변이체, 복합체 또는 유사체 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 또 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 미국 특허번호 제5,668,108호에 개시된 바와 같은 FVIII의 변이체는 위치 1241에 있는 아스파라긴산이 글루탐산에 의해 치환되고 첨부된 핵산 변화를 갖는 FVIII의 변이체를 개시하고; 미국 특허번호 제5,149,637호는 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않은 C-말단 단편을 포함하는 FVIII 변이체를 기재하며; 또 미국 특허번호 제5,661,008호는 적어도 3개 아미노산 잔기에 의해 아미노산 1649 내지 2332에 연결된 아미노산 1-740을 포함하는 FVIII 변이체를 개시한다.
본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 FVIII은 B 도메인이 결실된 FVIII을 포함하며, 이러한 FVIII은 예를 들면 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 제6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호 및 제6,458,563호에 개시된 것을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
또한 본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 FVIII은 B 도메인의 일부가 결실된 FVIII으로 중쇄 및 경쇄를 포함하나 퓨린(furin)과 같은 단백질분해효소에 의한 절단부위를 포함하지 않도록 일부 잔기가 결실된다.
일 구현예에서 일부가 결실된 B 도메인은 서열번호 01의 서열의 1648 및 1649 잔기 위치를 기준으로, 이를 포함하여 N-말단 및 C-말단 방향으로 각각 최소 5개의 아미노산이 결실된 것을 포함하거나 및/또는 4개 내지 6개의 당화부위를 포함하도록 일부가 결실된 B 도메인 단편을 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 B 도메인의 일부가 결실된 FVIII에서, 상기 B 도메인 단편은 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 741 내지 902 및 1654 내지 1689를 포함하는 것이다.
다른 구현예에서는 이러한 B 도메인 단편은 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 741 내지 902 및 1654 내지 1689의 아미노산 서열을 포함하고 상기 잔기 중 일부, 특히 782번 아이소루이신 잔기가 친수성 폴리머로의 개질을 위해 시스테인으로 치환된 것을 포함하는 것이다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 키메라단백질에 포함될 수 있는, B 도메인의 일부가 결실된 FVIII는 서열번호 03으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 서열번호 03의 아미노산 서열에 포함된 B 도메인은 서열번호 01을 기준으로 741 - 902번 잔기를 포함한다.
본원에 따른 키메라 단백질에 포함될 수 있는 FVIII은 A 도메인 및/또는 B 도메인 단편의 일부 아미노산 잔기에서 친수성 폴리머와 컨쥬게이션되어 개질될 수 있다.
특히 본원에서는 개질을 통해 본원에 따른 키메라 단백질의 LRP 결합을 방해하기 위한 것으로, 부위 특이적으로 진행되며, 이를 달성할 수 있는 다양한 위치에서 개질될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에서 컨쥬게이션되는 위치는 상기 A 도메인에서 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 491, 495, 498 및 1806으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치; 그리고 상기 B 도메인에서 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 754, 781, 782, 788, 789, 825, 897로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치이다.
본원에 따른 다른 구현예에서 특히 B 도메인, 특히 상술한 위치에서 페길화된다.
본원에 따른 다른 구현예에서는 B 도메인의 782번 아이소루이신 잔기에서 개질되며, 특히 페길화되고, 페길화를 위해, 후술하는 바와 같이 상기 잔기가 시스테인으로 치환되거나 또는 시스테인기가 삽입될 수 있다.
본원에 따른 FVIII의 개질에 사용될 수 있는 친수성 폴리머는 본원에 따른 목적을 달성하는 한 당업계에 공지된 다양한 폴리머가 사용될 수 있으며, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드, 덱스트란을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서는 PEG가 사용되며, 특히 20kDa 이상의 PEG가 사용된다. 본원에 따르면, PEG는 LRP 결합영역 근처에 결합되어 PEG hindrance에 의해 FVIII이 LRP에 결합하는 것을 저해 시키는 기능을 하며, 따라서 PEG의 길이가 너무 짧으면 이러한 hindrance를 충분히 주지 못 할 가능성이 있기 때문에 PEG의 길이가 20kDa 이상인 것이 중요하다. 일 구현예에서는 특히 40kDa, 60kDa 또는 그 이상의 PEG가 사용된다.
본원에 따른 개질에서 페길화에 사용되는 PEG는 공지된 다양한 작용기 (functional group)을 이용하여 해당 잔기에 연결될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 PEG는 부위 특이적으로 시스테인과 같은 잔기에 존재하는 자유 -SH기를 통해 연결되며, 이 경우 예를 들면 thiol, orthopyridyl disulfide, acryloyl, sulfone 또는 maleimide기, 특히 maleimide기를 통해 연결될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 FVIII은 친수성 폴리머로의 개질을 위해 친수성 폴리머에 연결되는 잔기는 다른 잔기로 치환 또는 삽입 될 수 있으며, 치환 또는 삽입되는 잔기는 개질에 사용되는 물질에 따라 상이하며, 당업자라면 적절한 것을 선정할 수 있을 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서는 개질로서 페길화가 사용되며, 이 경우 개질되는 잔기는 시스테인으로 치환 또는 시스테인 잔기가 적절한 위치에 삽입될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 B 도메인의 782번 아이소루이신 잔기에서 개질되며, 특히 페길화되고, 페길화를 위해 상기 잔기가 시스테인으로 치환된다.
페길화 반응은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 자유 시스테인의 마스킹을 위해 사용된 시스테인이나 글루타치온은 페길화 반응 전에 제거되어 도입한 시스테인의 free thiol이 복원되어야 하며, 이를 위해 TCEP, DTT, beta-mercaptoethanol, 시스테인, 글루타티온(환원형) 등의 환원제를 처리하는 과정과 이 과정에서 FVIII 본연의 이황화 본드가 환원적으로 절단된 것을 복원하기 위한 산화 과정을 포함하여 수행할 수 있다. 개질을 위해 시스테인으로 치환된 단백질의 발현은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 페길화되는 단백질의 경우, 도입된 자유 시스테인은 발현 도중이나 세포 밖으로 배출 후 배양액의 free thiol을 포함하는 저분자 물질인 시스테인 또는 글루타치온과 이황화 결합을 형성하기 때문에, 자유 시스테인을 마스킹하여 페길화 전 까지 안정화 시켜 페길화 효율을 높이는 것이 필요하다.
본원에 따른 키메라 단백질은 vWF D’D3 도메인을 포함한다.
vWF(또는 F8vWF)는 바이벨펠라드 소체(Weibel-Palade body)에서 내피조직, 거핵세포(혈소판의 α-과립) 및 내피하(subendothelian) 결합조직에서 생성되고 혈장에 존재하는 대형 다합체 당단백질이다. 염기성 vWF 단량체는 2813개(시그널펩타이드 포함하는 경우)의 아미노산으로 구성되고, 모든 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, 즉 (FVIII 인자에 결합하는) D'/D3 도메인, (혈소판 GPIb-수용체, 헤파린 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합하는) A1 도메인, (콜라겐에 결합하는) A3 도메인, C1 도메인(RGD 도메인이 활성화될 때 이것은 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결합) 및 단백질의 C-말단의 "시스테인 매듭" 도메인을 포함하며, 시스테인 매듭은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자-β(TGFβ) 및 β-인간 융모성 고나도트로핀(βHCG)에서도 발견된다.
vWF 아미노산 서열 및 vWF 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예는 예컨대 GenBank NO: NP_000543, NM_000552, AAE20723, AAB59512, P04275, EAW88815, ACP57027, EAW88816, 및 AAD04919; 미국 특허번호 제5,260,274호; Titani etal., Biochemistry, 25:3171-84 (1986); 및 Sadler etal., PNAS, 82:6391-6398 (1985)로 공지되어 있다.
예를 들면 전장 인간 vWF의 아미노산 서열은 서열번호 02 (시그널펩타이드는 포함하지 않음)로 나타낸다. 서열번호 02를 기준으로 vWF의 "프로펩티드" 부분(D1-D2)은 아미노산 잔기 1 부터 Arg-741까지이고, 또 "성숙" vWF 단백질은 아미노산 잔기 742 내지 2791 까지이다. 개별 도메인은 D': 742 - 842; D3: 843 - 1248; A1: 1249 - 1457; A2: 1458 - 1650; A3: 1651 - 1850; D4: 1851 - 2232; C1: 2233 - 2311; C2: 2312 - 2380; C3: 2407 - 2474; C4: 2475 - 2555; C5: 2556 - 2624; C6: 2625 - 2700 및 CK: 2701 - 2791로 표시될 수 있다 (Lenting. P. J. BLOOD, 26 MARCH 2015. VOLUME 125, NUMBER 13). 또는 대안적인 vWF 도메인 맵핑 및 명명 시스템은 EXPASY 단백질 데이터베이스 명명법 (worldwideweb.uniprot.org/uniprot/P04275)에 의해 D1: 12 - 218; D2: 365 - 576; D': 754 - 805; D3: 844 - 1052; A1: 1255 - 1431; A2: 1476 - 1643; A3: 1669 - 1849; D4: 1927 - 2131; B: 2233 - 2306 (EXPASY에서는 C1으로 명명됨); C1: 2407 - 2473 (EXPASY에서는 C2로 명명됨); C2: 2558 - 2623 (EXPASY에서는 C3으로 명명됨); 및 CK: 2701 - 2790로 표시될 수 있다.
본원에 따른 키메라 단백질에 포함되는 vWF D'D3 도메인은 FVIII와 융합되어 본원에 따른 재조합 FVIII이 내인성 vWF (전장 vWF)에 결합하는 것을 억제한다.
본원에 따른 키메라 단백질에 포함되는 vWF D'D3 도메인은 이러한 활성을 보유하는 한 다양한 길이 또는 유래의 것이 사용되며, 이의 변이체, 유도체, 변형체, 돌연변이체, 복합체 또는 유사체를 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에 포함되는 vWF의 D'D3 도메인은 서열번호 02를 기준으로 742번 내지 1248번 아미노산 또는 이와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 나타내고, 본원에 따른 재조합 FVIII에 대한 내인성 vWF의 결합을 방지한다.
앞서 언급한 바와 같이 본원에 따른 키메라 단백질은 FVIII의 경쇄 및 중쇄를 하나의 폴리펩타이드로 발현하는 단일 폴리펩타이드 또는 경쇄 및 중쇄 각각을 별개의 폴리펩타이드로 발현하는 이중 폴리펩타이드로 구현될 수 있다.
도 2a를 참조하면 본원에 따른 키메라 단백질이 단쇄 또는 단일 폴리펩타이드로 구현되는 경우, vWF D’D3 도메인은 FVIII의 N- 또는 C- 말단 방향에 위치할 수 있으며, 체내에서 D’D3의 분리를 위해 효소절단 부위를 포함하는 아미노산 링커(또는 연결체)로 연결될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 키메라 단백질에 포함되는 FVIII과 D'D3 도메인은 연결체로서 [G4S]n 의 아미노산 서열로 표시되는(상기 식에서 G는 글라이신, S는 세린이고, n은 1 내지 100 사이 정수) 연결체와 연결될 수 있으며, 상기 연결체는 효소절단 부위를 포함한다. 연결체는 D’D3와 FVIII를 연결하며, D’D3가 FVIII의 vWF 결합 위치에 정확하게 결합할 수 있게 유연성을 부여해 주는 기능을 갖고 있다. 구체적으로 본원에서는 D’D3를 FVIII에 융합시킬 수 있는 위치는 FVIII 중쇄의 N-말단, C-말단, FVIII 경쇄의 N-말단 또는 C-말단 이고, D’D3 도메인에서 N-말단에 해당하는 D’도메인이 FVIII의 A3 도메인 쪽에 결합하고, D3 도메인이 FVIII의 C2 도메인 쪽에 결합하는 것을 고려하면, FVIII 경쇄의 C-말단에 D’D3를 융합시켰을 때가 D’도메인과 FVIII의 A3 도메인의 거리가 가장 멀 때인 것으로 분석되었다. 따라서 D’D3를 FVIII에 융합시킬 때 D’D3가 FVIII에 제대로 잘 결합하게 하기 위해서 유연성 있는 링커를 선택하였다. 그리고 기존에 발표된 FVIII의 결정구조를 근거로 C2 도메인의 C-말단부터 A3 도메인의 N-말단까지 직선 거리를 측정하고, 이 거리를 아미노산 개수로 환산하여 링커의 길이를 선별하였다. 그렇기 때문에 링커의 길이가 상기 직선 거리보다 짧게 되면, D’도메인이 FVIII의 A3 도메인까지 가지 못 하기 때문에 상기 연결체의 길이가 너무 짧으면 D’D3가 FVIII 결합 위치에 정확하게 결합할 수 없다. 그러므로 상술한 조건을 만족하는 충분한 길이의 연결체가 필요하다. D’D3를 융합 하는 위치에 따라 상기 연결체의 최적 길이는 변할 수 있다. 이러한 기능을 갖는 한 다양한 길이의 연결체가 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 n은 최소 6이다. 다른 구현예는 상기 식에서 n은 6, 8, 10, 12, 18, 24, 또는 60 일 수 있다.
또한, 상기 연결체는 효소절단 부위를 포함하고 있기 때문에 FVIII이 활성화 될 때, vWF D’D3, 또는 vWF D’D3 및 연결체가 FVIII으로부터 잘려 나갈 수 있게 해주는 기능도 갖고 있다.
본원에 따른 연결체에 포함되는 효소절단 부위는 연결체의 N- 또는 C-말단 방향에 연결될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 효소절단부위는 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 부위로, 이러한 부위는 DFLAEGGGVR (서열번호 36), TTKIKPR (서열번호 37), 또는 LVPRGS (서열번호 38)로 표시될 수 있다. 이 경우, 본원에 따른 키메라 단백질은 투여시 체내에서 트롬빈에 의해 절단되어 FVIIIa로 활성화되고 활성화 IX 인자(FIXa)와 함께 X 인자를 활성화하여 활성화 X 인자(FXa)로 전환시킨다.
또한, 본원에 따른 연결체에 포함될 수 있는 효소절단부위는 트롬빈 외에 coagulant cascade에 있는 FVIIa, FXa, 또는 FXIa에 의해 잘릴 수 있는 부위도 포함될 수 있으며, 이러한 부위는 ASKPQGRIVGG (서열번호 39), IDGR (서열번호 40), IEGR (서열번호 41), SKLTRAETVF (서열번호 42)로 표시될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 효소절단 부위는 링커의 N-말단 방향 쪽에 포함되며, 트롬빈과 같은 효소에 의해 이 부위가 잘리면 연결체와 D'D3 도메인이 FVIII으로부터 분리된다.
본원에 따른 다른 구현예에서는 효소절단 부위는 링커의 C-말단 방향에 포함되며, 트롬빈에 의해 이 부위가 잘리어 연결체와 D’D3 도메인이 FVIII으로부터 분리된다.
도 2b를 참조하면, 앞서 언급한 바와 같이 본원에 따른 키메라 단백질은 중쇄 및 경쇄 각각이 별개의 폴리펩타이드로 발현되는 이쇄 또는 제 1 및 제 2의 두 개의 폴리펩타이드의 형태로 구현되며, 이 경우, 경쇄와 중쇄는 금속 이온 매개 비공유 결합에 의해 회합될 수 있다.
본원에 따른 키메라 단백질이 이쇄로 구현되는 경우, 제 1 폴리펩타이드는 FVIII의 중쇄 A1, A2 및 B 도메인의 전부 또는 일부를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 FVIII의 경쇄 A3, C1, C2 및/또는 B 도메인의 일부를 포함한다.
본원에 따른 단백질이 이쇄로 구현되는 경우 제 1 폴리펩타이드에 포함되는 B 도메인은 앞서 언급한 바 및 후술하는 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 단백질이 이쇄로 구현되는 경우 제 2 폴리펩타이드에는 B 도메인이 포함되지 않을 수 있거나 또는 B 도메인의 일부가 사용될 수 있다. 후자의 경우, 예를 들면 B 도메인 C-말단 잔기부터 N-말단 방향으로 86개의 잔기를 포함한다. 제 2 폴리펩타이드로 발현된 B 도메인 일부는 세포외로 분비될 때 떨어져 나간다.
본원에 따른 키메라 단백질이 이쇄로 구현되는 경우, vWF D’D3 도메인은 제 1 폴리펩타이드의 C 말단 방향에 연결된다. 이 경우 B 도메인이 일종의 연결체로서 작용할 수 있다. 또한 본원에 따른 단백질이 이쇄로 구현되는 경우, 단쇄로 발현되는 경우와 비교하여 동일하거나 또는 긴 길이의 B 도메인이 사용될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 단쇄의 경우 서열번호 1의 서열을 기준으로 741-902 및 1654-1689 잔기의 B 도메인이 사용되고, 이쇄의 경우 서열번호 01을 기준으로 741-936의 196개 잔기 길이의 B 도메인이 사용된다. 이쇄로 발현되는 경우 B 도메인에 D’도메인이 연결될 수 있고, 본 이론으로 제한되는 것은 아니나, 융합되는 단백질간의 연결이 구조적으로 보다 자연스럽게 이어주기 위함이다. 구체적으로 일 구현예에서 본원에 채용된 196개 B 도메인의 C-말단의 아미노산 잔기 서열은 - SGGPLSLS이다. D’도메인의 N-말단의 아미노산 서열은 SLSCR PPMVKLVCPA- 로 시작한다. 따라서 상기 SLS의 3개의 아미노산 잔기가 겹쳐지도록 하기 위해 196개의 B 도메인이 사용되었다. 196개의 B 도메인은 -SGGPLSLS 중에 SGGPL 잔기까지만을 포함하여 계산한 것이다.
본원에 따른 키메라 단백질은 vWF D’D3를 하나 이상 포함할 수 있다.
D’D3는 vWF의 N-말단에 위치한 2개의 도메인으로, D3 도메인은 실제 다른 분자의 vWF와 D3 도메인을 통해 이량체를 형성한다. 따라서 본원에서는 D’D3를 단량체 또는 이량체 형태로 FVIII에 융합될 수 있다.
복수개의 vWF D’D3를 포함하는 경우, 예를 들면 두 개를 포함하는 경우, 제 1 D’D3는 FVIII에 연결되고, 제 2 D’D3는 제 1 D’D3에 연결되는 방식으로 구현될 수 있다.
복수개의 vWF D’D3를 포함하는 경우, 제 1 및 제 2 D’D3는 연결체를 통해서 연결될 수 있거나, 또는 제 2 D’D3는 별개로 발현되어, 키메라 단백질과 복합체(complex)를 형성하도록 할 수 있다. 예를 들면 scFVIII/D’D3/D’D3-120 키메라 단백질에서와 같이 연결체를 이용하여 연결되는 경우, 상기 연결체는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있으나 효소절단 부위는 포함하지 않는다.
또한 D’D3를 dimer 형태로 사용하는 경우 D’D3는 D3 도메인에 있는 S-S bond를 통해 이량체가 형성될 수 있다. 복수개의 D’D3를 예를 들면 이쇄의 경우와 같이 별개의 벡터에서 발현하는 경우, FVIII-D’D3의 DNA와 D’D3 DNA를 하나의 세포에서 동시 발현시켜, 세포내에서 D’D3끼리 이량체가 만들어 지고, 세포 밖으로 분비되게 한 후, 이를 분리 정제하여 사용할 수 있다.
나아가 본원에 따른 키메라 단백질은 하나 이상의 Fc 단백질을 추가로 포함할 수 있다. Fc를 추가로 D’D3와 함께 FVIII에 융합하게 되면, D’D3에 의해 혈중 vWF가 결합하지 못 하는 효과와 함께 Fc에 의해 FcRn 리사이클링을 통한 반감기 증가 효과를 추가로 기대 할 수 있다. 일 구현예에서는 특히 약 50 kDa 정도 되는 Fc가 융합되며, Fc에 의한 입체적 방해(steric hindrance)에 의해 혈중 vWF가 이 물질에 결합하는 것을 더욱 어렵게 할 수 있다.
따라서, 위와 같은 기능을 본원에 따른 목적을 달성하는 한 다양한 길이 및 유래의 Fc가 포함될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 서열번호 22로 표시되는 Fc, 인간 기원의 IgG 유래의 Fc가 사용된다.
본원에 따른 키메라 단백질이 단쇄로 구현되는 경우, Fc는 vWF D’D3에 연결될 수 있다. 이 경우 연결체를 이용하여 연결될 수 있으며, 상기 연결체는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있으나 효소절단 부위는 포함하지 않는다.
본원에 따른 키메라 단백질이 이쇄로 구현되는 경우, Fc는 중쇄의 일부로 발현되는 vWF D’D3에 및/또는 경쇄의 C 말단 방향에 연결될 수 있다. 이 경우 연결체를 이용하여 연결될 수 있으며, 상기 연결체는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있으며, 특히 경쇄에 연결되는 경우에는 효소절단 부위를 포함하며, D’D3에 연결되는 경우에는 효소절단 부위는 포함하지 않는다.
본원에 따른 키메라 단백질에 두 개 이상의 Fc가 포함될 수 있다.
복수개의 Fc를 포함하는 경우, 예를 들면 두 개를 포함하는 경우, 일 구현예에서 제 1 Fc는 키메라 FVIII에 연결되고, 제 2 Fc는 제 1 Fc에 연결되는 방식으로 구현될 수 있다. 다른 구현예에서 제 1 Fc는 이쇄로 발현되는 키메라 FVIII의 중쇄에 연결되고, 제 2 Fc는 경쇄에(그 역순도 가능) 연결되는 방식으로 구현될 수 있으며, 이 경우 복수의 Fc 간에 이량체와 같은 복합체가 형성될 수 있다.
복수개의 Fc를 포함하는 경우, 제 1 및 제 2 Fc는 연결체를 통해서 연결될 수 있거나, 또는 제 2 Fc는 하나의 세포에서 별개의 벡터로 발현되고, 세포 내에서 Fc 간에 이량체가 만들어지고, 이후 세포 외로 분비된 것을 정제하여 사용할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이 본원에 따른 키메라 단백질은 단쇄 또는 이쇄로 구현될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 단쇄의 키메라 단백질은 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 또는 25로 표시될 수 있다. 상기 단백질은 별개의 D’D3 및/또는 Fc와 복합체를 형성할 수 있으며, 일 구현예에서 서열번호 19의 키메라 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 하나 이상의 D’D3와 복합체를 형성할 수 있으며, 또는 서열번호 21의 키메라 단백질은 서열번호 22로 표시되는 하나 이상의 Fc와 복합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 이쇄의 키메라 단백질은 서열번호 4 및 5 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 23 및 24 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 26 및 27 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 28 및 29 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 30 및 31 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 32 및 33 (각각 중쇄 및 경쇄), 또는 서열번호 34 및 35 (각각 중쇄 및 경쇄)로 표시될 수 있다. 상기 단백질은 별개의 D’D3 및/또는 Fc와 복합체를 형성할 수 있으며, 일 구현예에서 서열번호 28 및 29 (각각 중쇄 및 경쇄) 또는 서열번호 32 및 33 (각각 중쇄 및 경쇄)의 키메라 단백질은 서열번호 22로 표시되는 하나 이상의 Fc와 복합체를 형성할 수 있다.
본원에는 상술한 서열번호 04 내지 35로 표시되는 아미노산 서열은 물론 이와 90% 이상 상동성 또는 실질적으로 동일한 서열의 단백질도 포함된다.
이러한 실질적 동일성 또는 상동성은 당업계에 공지된 서열비교 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 상동성, 특히 85% 이상, 더욱 특히 90%, 더더욱 특히 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본원에 따른 키메라 단백질은 반감기 측면에서 야생형의 FVIII와 비교하여 최소 1.5배, 최소 2배, 최소 3배 이상의 반감기가 향상된 것이다. 반감기를 측정하는 방법은 개시되어 있으며, 당업자라면 본원의 기재, 당업계의 기술 및 참고문헌의 기재를 고려하여 적절한 방법을 선택하여 반감기 및 활성을 측정하고 이에 기반하여 본원의 범위에 포함되는 키메라단백질을 결정할 수 있을 것이다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 키메라 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터로 형질전환된 세포(주)에 관한 것이다.
본원에 따른 핵산분자는, 본원에 따른 키메라 단백질이 발현되는 세포의 종류에 맞추어 코돈최적화(Codon optimized) 된 것을 포함하는 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 CHO 코돈에 최적화되며, 이러한 핵산 서열은 서열번호 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 또는 66의 서열로 표시될 수 있다.
본원에 따른 키메라 단백질을 코딩하는 핵산분자는 또한 상술한 바와 같이 실질적으로 동일한 생물학적 균등물에 해당하는 FVIII을 코딩하는 것을 또한 포함하는 것이다.
또한 본원에 따른 키메라단백질을 코딩하는 핵산분자는 다양한 목적을 위해 다양한 발현 벡터에 클로닝되어 사용될 수 있다. 발현 벡터의 구체적 구성은 본원에 따른 키메라단백질을 발현하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있으나, 본원에 따른 핵산분자의 mRNA로의 발현 또는 mRNA의 단백질로의 발현을 조절하는 서열, 예를 들면 프로모터 및/또는 인핸서 등과 같은 조절서열을 포함한다. 이러한 또는 다양한 다른 목적으로 사용될 수 있는 다양한 벡터 및 조절서열이 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 키메라 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 통하여 제조될 수 있으며, 예를 들면 본원에 따른 키메라 단백질을 코딩하는 핵산분자를 벡터의 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결한다. 일 구현예에서는 세포에서 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터에 삽입되며, 이러한 벡터의 예로는 pMSGneo, pcDNA3.1(+) 등 일반 단백질 발현 벡터를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. pMSGneo 벡터의 경우 핵 기질(nuclear matrix)에 결합하는 MAR(Matrix attachment region) 인자가 포함된 발현 벡터로서, 상기 MAR 인자는 발현 벡터에 사용되는 경우 위치-독립적 발현(position-independent expression)을 유도하여 유전자 발현을 증대시키는 역할을 한다. 따라서, pMSGneo 벡터를 이용하는 경우 안정적이고 높은 발현량을 얻을 수 있다. 또한, pcDNA3.1(+) 벡터는 강력한 CMV 프로모터가 함유되어 있어 단백질 발현에 널리 사용되고 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 도 3에 기재된 것이 사용된다. 본원에 따른 키메라단백질은 상술한 바와 같이 단일 폴리펩타이드 또는 두 개의 폴리펩타이드로 발현될 수 있다.
또한, 본원에 따른 키메라 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 상기 재조합 발현 벡터는 다양한 목적을 위해 적절한 숙주세포에 형질 전환될 수 있다. 숙주세포는 본원에 따른 벡터의 증폭 및/또는 벡터에 포함된 핵산분자가 발현될 수 있는, 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함하는 것이다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 세포가 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 대장균(E.coli), 포유동물 세포(Mammalian cell), 효모(Yeast), 식물 세포(Plant cell), 곤충 세포(Insect cell)를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 재조합 FVIII의 발현을 위해, 진핵세포, 특히 포유동물 세포주가 사용된다. 당업자라면 본원에 따른 재조합 FVIII의 특징을 고려하여 이러한 특징을 갖는 단백질을 발현할 수 있는 적절한 세포주를 선별할 수 있을 것이며, 예를 들면 이러한 포유동물 세포주로는 당업계에 공지된 CHO, BHK, COS7, HEK 세포주 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, CHO 세포주, 특히 CHO-S 세포주 또는 CHO-K1 세포주 또는 CHO-DG44 세포주, 또는 HEK 세포주 특히 HEK293 세포주가 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 벡터는 발현을 위해 상기와 같은 숙주세포로 전달된다. 이러한 숙주세포로의 벡터의 전달 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들면, 칼슘포스페이트 침전법, 샷건 방법, 리포좀을 이용한 방법, 나노니들 또는 전기천공법등 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 벡터를 진핵세포에 전달이입하는 단계; 상기 세포를 배양액 중에서 배양하는 단계; 상기 배양액을 수집하여 시스테인(cysteine) 도입된 키메라 단백질을 정제하는 단계; 및 상기 정제된 시스테인(cysteine) 도입된 단백질을 페길화 완충액으로 처리하는 단계; 도입된 시스테인(cysteine)의 자유 티올기를 환원 과정을 통해 복원하는 단계; 환원 과정 중 분리된 키메라 단백질 내부의 이황화 결합을 복원하기 위하여 산화시키는 단계; 환원형의 티올기로 복원된 키메라 단백질 시스테인(cysteine)에 특이적으로 페길화시키는 단계 및 페길화 키메라 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 키메라 단백질의 생산방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 구체적인 벡터, 세포 및 각 단계의 처리 과정은 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다.
본원에 따른 키메라 단백질은 혈액응고가 필요한 질환, 혈우병, 특히 혈우병 A 환자의 혈액응고 또는 혈우병 A의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이에 다른 양태에서 본원은 또한 상술한 바와 같은 본원에 따른 키메라 단백질, 이를 코딩하는 핵산 분자, 이를 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 세포, 또는 상기 구성에 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 혈우병 환자 특히 A형 환자 또는 혈액의 응고가 필요한 환자에게 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 혈우병, 특히 A형 혈우병의 치료 방법 또는 혈액응고 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 키메라 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 코딩하는 벡터는 약학적으로 허용 가능한 담체를 함께 포함하는 혈우병, 특히 A형 혈우병의 치료용 약학 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
또한 본원의 약학 조성물은 단독으로, 또는 기타 약물치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 담체란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비 이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.
필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
본원의 조성물은 목적하는 방법에 따라 특히 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내)가 바람직하다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 본원에서, "치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본원의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본원에 따른 방법이 사용되는 대상체는 인간을 포함하는 영장류이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 재조합 키메라 단백질은 그 자체 또는 상술한 바와 같은 조성물의 형태로 혈우병 또는 혈액응고가 필요한 대상체에게 치료적으로 유효한 양으로 투여되어, 혈액 응고 방법 또는 혈우병의 치료 방법의 형태로 제공될 수 있으며, 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 키메라 FVIII 구축
실시예 1-1. scFVIII (single-chain FVIII) 제작
단쇄 형태로 발현되는 FVIII의 구축을 위해, furin 절단 위치인 1648 잔기(전장 FVIII 아미노산 서열을 나타내는 서열번호 01의 아미노산 서열기준)를 포함하는 B 도메인의 일부가 결실된 FVIII를 구축하였다. 구축된 각각의 scFVIII은 B 도메인의 N-말단(서열번호 01의 741번째 아미노산 잔기)로부터 특정 길이의 B 도메인을 포함하고 포함된 B 도메인은 원래 보유하고 있는 당쇄를 그대로 포함하도록 제작되었으며, 위치 특이적 페길화(site-specific PEGylation)를 위해 B 도메인에 위치한 782번 아이소루이신 잔기를 시스테인으로 개질하였다.
제조 방법은 다음과 같다.
하기 표 1의 B 도메인이 결실된 각 scFVIII은 인간 FVIII 핵산서열 (NM000132)을 기준으로 합성하였다. 먼저 scFVIII 유전자 발현벡터를 제조하기 위하여 인간 FVIII 핵산서열(NM000132)을 기준으로 CSL 형태(Leader-중쇄-B 도메인 (741-764, 1653-1689)-경쇄)를 5’에 NotI-AsisI과 3’에 PacI-XhoI 효소절단 부위를 포함하도록 GeneArt 사를 통해 유전자 전체를 합성하였다. 합성된 유전자를 pcDSW 벡터의 NotI/XhoI site에 클로닝하여 pcDSW-CSL 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 AsisI/PacI 효소를 이용하여 절단 후 절단된 밴드 크기 비교를 통해 확인하였다. 이후 B 도메인이 결실된 각 scFVIII는 FVIII 중쇄의 A2 도메인 내에 존재하는 BamHI site (GGATCC) 부터 경쇄 3’에 PacI 효소절단 부위를 포함하도록 GeneArt 사를 통해 유전자를 합성한 후 기존에 완성된 pcDSW-CSL 발현벡터를 효소 BamHI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 BamHI/PacI site로 자르고 pcDSW-CSL 발현벡터의 BamHI/PacI site에 클로닝하여 pcDSW-scFVIII 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 BamHI/PacI 효소를 이용하여 절단 후 크기 비교를 통해 확인하였다.
[표 1] scFVIII constructed in the present disclosure
Figure PCTKR2017006655-appb-I000001
Cysteine이 도입된 scFVIII G4 (B3, 서열번호 3)은 cysteine 치환 부위 및 FVIII 중쇄 A2 도메인 내에 존재하는 BamHI site (GGATCC) 부터 경쇄 말단 3’에 PacI 효소절단 부위가 포함되도록 GeneArt 사를 통해 유전자를 합성한 후, 앞에서 제작한 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4에 효소 BamHI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후, 합성된 유전자를 BamHI/PacI site에 클로닝하여 cysteine이 치환된 pcDSW-scFVIII G4 (B3) 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 서열분석을 통해 확인하였다.
실시예 1-2. dcFVIII (dual-chain FVIII) 제작
D’D3를 포함하는 이량체 형태로 발현되는 FVIII 구축을 위해 D’D3를 포함하는 중쇄와 경쇄를 각각 다른 벡터를 이용하여 하나의 세포에서 발현시켰다. D’D3를 포함하는 중쇄에는 실시예 1-1에서 사용한 B3에 해당하는 B 도메인이 포함되어 있으며, 경쇄는 대한민국 특허 제251286호에 기재된 경쇄를 발현하는 벡터를 참고하여 만들었다.
실시예 1-3. 키메라 FVIII 제작
키메라 FVIII은 실시예 1-1과 1-2에서 만든 단쇄 FVIII과 이량체 FVIII을 기본으로 하여 D’D3를 1개 또는 2개를 융합 하였으며, 융합한 D’D3가 FVIII에 적절히 결합할 수 있게 링커를 사용하였다. 링커는 FVIII의 B 도메인 일부를 사용하거나 [G4S]n 를 이용하였다. 또한 일부는 상기에 명시한 구성에 Fc까지 포함하였다 (도 2, 도 3, 표 2).
[표 2] 본원에서 제작한 키메라 FVIII
Figure PCTKR2017006655-appb-I000002
키메라 FVIII의 클로닝은 특허 실시예 1-1에서 기술한 scFVIII G4 (B3)를 이용하여 진행하였다. 서열번호 04의 FVIII 중쇄는 FVIII의 A2 도메인에 존재하는 KpnI 효소절단 부위부터 말단 3’에 PacI 효소절단 부위가 포함하도록 GeneArt 사를 통해 유전자를 합성한 후, 실시예 1-1에서 제작한 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 KpnI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 KpnI/PacI에 클로닝하여 서열번호 04의 중쇄에 해당하는 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다. 서열번호 05 경쇄는 5’에 AsisI-Leader 서열과 FVIII 경쇄 C1 도메인에 존재하는 BspEI 효소절단 부위까지 포함하도록 GeneArt 사를 통해 유전자를 합성한 후 실시예 1-1에 제작한 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 AsiSI/BspEI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 AsiSI/BspEI site에 클로닝하여 서열번호 05의 경쇄에 해당하는 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다. 서열번호 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16은 FVIII 경쇄의 C1 도메인에 존재하는 BspEI 효소 부위 서열부터 말단 3’에 PacI 효소절단 부위가 포함되도록 GeneArt 사를 통해 유전자를 합성한 후 실시예 1-1에서 제작한 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 BspEI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 BspEI/PacI site에 클로닝하여 서열번호 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16에 해당하는 키메라 FVIII 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석 및 서열분석을 통해 확인하였다. 서열번호 14와 비교하여 서열번호 15로 표시되는 펩타이드는 링커에 있는 트롬빈 절단부위의 위치가 상이하고, 서열번호 16으로 표시되는 펩타이드는 트롬빈 절단부위의 위치 및 링커의 서열자체가 상이하며, 이를 각각 TH1 및 TH2로 표시하였다.
서열번호 17, 18, 21은 FVIII 경쇄 C1 도메인에 존재하는 BspEI 효소 부위 서열부터 말단 3’에 PacI 효소절단 부위가 포함되도록 코스모진텍사를 통해 CHO 코돈 최적화 및 유전자를 합성한 후 실시예 1-1에서 제작한 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 BspEI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 BspEI/PacI site에 클로닝하여 서열번호 17, 18, 21에 해당하는 키메라 FVIII 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다.
서열번호 19는 5’에 NotI-AsiSI 효소절단 부위를 추가하고 FVIII 중쇄 A1 도메인에 존재하는 AflII 효소절단 부위까지 포함되도록 코스모진텍사를 통해 CHO 코돈 최적화 및 유전자를 합성한 후, 실시예 1-1에서 제작한 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 AsiSI/AflII을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 AsiSI/AflII site에 클로닝하여 서열번호 19에 해당하는 키메라 FVIII 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다.
서열번호 20은 코스모진텍에서 합성된 서열번호 64로 표시되는 유전자를 효소 MfeI/XbaI을 이용하여 기존 해당 부위 유전자를 제거하고 합성된 서열번호 63으로 표시되는 유전자로부터 효소 MfeI/XbaI을 처리하고 인서트를 확보하여 MfeI/XbaI site에 일차 클로닝 하였다. 일차 클로닝 된 유전자를 발현 벡터로 옮기기 위하여 기 제작된 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 NotI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 일차 클로닝 된 유전자를 효소 NotI/PacI으로 인서트를 절단하고 발현 벡터의 NotI/PacI site에 클로닝하여 서열번호 20에 해당하는 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다.
서열번호 22는 5’에는 AsisI, 3’에는 PacI 효소절단 부위가 각 각 포함되도록 GeneArt 사를 통해 유전자를 합성한 후, 실시예 1-1에서 제작한 scFVIII G4 (B3) 발현벡터 pcDSW-scFVIII G4 (B3)에 효소 AsisI/PacI을 이용하여 기존 FVIII의 해당 부위를 제거한 후 합성된 유전자를 AsisI/PacI site에 클로닝하여 서열번호 22에 해당하는 발현 벡터를 구축하였고, 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다.
이외에 서열번호 15는 CHO 형질전환 세포주를 제작하기 위하여 추가로 CHO 발현벡터를 제작하였다. 서열번호 15의 5’에는 AatII-AscI, 3’에는 BsiWI-PacI 효소절단 부위가 각각 포함되도록 본 유전자를 합성하거나 Biobasics 사, GeneArt 사 그리고 Genscript 사를 통해 CHO 발현에 최적화되도록 유전자를 합성하였다. CHO 발현벡터 pMSID2의 AscI/PacI site에 합성된 유전자를 클로닝하여 서열번호 15에 해당하는 CHO 발현 벡터를 구축하였다. 발현 벡터 구축의 정확성은 효소 절단을 통한 길이 분석을 통해 확인하였다.
실시예 2. 키메라 FVIII 발현
실시예 1에서 구축한 키메라 FVIII을 세포에서 발현하였으며, 발현된 세포는 세포배양배지로 배양된다. 우선 발현을 위해 실시예 1에서 구축한 발현 벡터를 Expi293F™ 세포에 Expi293F™ Expression System Kit (Thermofisher 사, Catalog Number A14635)을 사용하여 전달 이입하였다. 형질전환 방법 및 배양은 30mL scale 기준으로 아래와 같이 실시하였으며, 단백 필요량에 따라 실제 배양 부피는 조절하였다. 형질전환 수행 24시간 전에 Expi293F™ 세포를 2.0 X 106 cells/mL로 Expi293 배양배지를 이용하여 예상 필요량에 맞추어 계대배양 하였다. 형질전환 수행 당일, 세포 수와 세포 생존율(viability)을 측정하여 세포 생존율이 95% 이상일 경우 형질전환을 진행하였다. 125mL 플라스크에 7.5 X 107 cell 되도록 Expi293 배양배지를 첨가하여 25.5mL로 맞춰주었다. 실시예 1에서 구축한 발현 벡터 30μg를 Opti-MEM을 이용하여 총 볼륨이 1.5mL이 되도록 섞어주었다. 80μL transfection reagent 를 Opti-MEM을 이용하여 총 볼륨이 1.5mL이 되도록 섞어주고 상온에서 5분간 incubation 해주었다. 5분 후 transfection reagent가 들어있는 Opti-MEM을 DNA가 들어있는 Opti-MEM에 넣어주고 부드럽게 섞어주었다. 그리고 20 ~ 30분간 상온에서 반응시켜 주었다. 3mL의 DNA: transfection reagent 복합체를 미리 준비해 놓은 125mL flask Expi293F™ 세포에 (Total volume: 28.5mL) 한 방울씩 떨어뜨려주고 37℃, 5% CO2 shaking incubator에서 125 rpm으로 배양하였다. 16 ~ 20시간 후에 Enhancer 1과 Enhancer 2를 각각 150μL, 1.5mL을 넣어주고 34℃, 5% CO2 shaking incubator에서 125 rpm으로 배양하였다. 배양 2일째 세포를 모두 원심분리하여 기존의 배양배지를 완전히 제거하고 30mL의 새로운 배양배지에 세포를 모두 풀어준 후 34℃, 5% CO2 shaking incubator에서 125 rpm으로 배양하였다. 도입 3일차에 키메라 FVIII을 발현하는 세포를 모두 원심 분리하여 배양액을 회수하였다. 배지 회수 후 남은 세포를 동일한 부피의 새로운 배양배지에 세포를 모두 풀어준 후 1일간 34℃에서 배양을 실시하였다. 본 과정을 배양 5일차까지 반복하여 3일, 4일, 5일 배양액을 회수하여 cysteine 도입된 키메라 FVIII의 활성 분석 및 정제를 진행하였다. 위와 유사한 방법으로 CHO-DG44 세포에서 FVIII 발현을 진행하였다.
이외에 CHO 형질전환 세포주를 제작 및 키메라 FVIII을 발현하였다. 형질전환 수행 24시간 전에 CHO DG44 세포를 CDM4CHO 배지 (Hyclone 사, Catalog Number, SH30557.02)에서 5~6 x 105 cells/mL의 양으로 필요량에 맞추어 계대하였다. 형질전환 당일 125mL 플라스크에 1 x 107 cells/mL로 OptiPro 배지 (Thermo fisher 사, Catalog Number 12309-019)를 이용하여 3mL로 분주하였다. 실시 예 1에서 구축한 30μg의 CHO 발현 벡터를 OptiPro을 이용하여 총 볼륨이 1.5mL이 되도록 섞어주었다. 90μL PEI MAX(1 μg/μL)와 OptiPro을 이용하여 총 볼륨이 1.5mL이 되도록 섞어주었다. 5분 뒤에 PEI MAX가 포함된 1.5mL OptiPro을 DNA가 들어있는 1.5mL OptiPro에 넣어주고 부드럽게 섞어주어 30분간 상온에서 반응시켰다. DNA:PEI 복합체 3mL을 미리 준비한 CHO DG44세포에 한 방울씩 떨어뜨려 주었다. 37℃, 5% CO2 shaking incubator에서 140 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 24mL의 CDM4CHO 배지를 첨가하여 140 rpm으로 배양하고 48시간 후에 세포 선별을 수행하였다.
형질전환된 CHO DG44 세포를 20nM MTX가 포함된 CDM4CHO 배양 배지를 이용하여 T-175 플라스크에 5 x 106 cells/mL로 50mL 되도록 현탁하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 7일간 정치 배양하였다. 만약, 세포수가 모자라면 총 볼륨을 줄이고 진행하였다. 선별 수행 7일 후 세포수를 측정하여 125mL 플라스크에 5 x 105 cells/mL로 20nM MTX가 포함된 배양 배지를 이용하여 계대하고 37℃, 5% CO2 shaking incubator에서 140 rpm으로 배양하였다. 3 ~ 4일 간격으로 125mL 플라스크에 계대 배양을 실시하고 세포 농도가 1 x 106 cells/mL, 생존율이 90% 이상일 경우 선별이 완료된 것으로 판단하였다.
키메라 FVIII 발현을 위하여 CHO 형질전환 세포주를 3 x 105 cells/mL로 접종하여 37℃, 5% CO2 shaking incubator에서 140 rpm으로 배양하였다. 배양 4일째 세포를 모두 원심 분리하여 기존의 배양 배지를 완전히 제거하고 동일 부피의 새로운 배양배지에 세포를 모두 풀어준 후 31℃, 5% CO2 shaking incubator에서 140 rpm 으로 1일간 배양하였다. 본 배지교환 및 배양과정을 배양 8일차까지 반복하고 6일, 7일 그리고 8일 배양액을 회수하여 키메라 FVIII의 활성 분석 및 정제를 진행하였다.
실시예 3. 키메라 FVIII 발현 확인
실시예 3-1. 키메라 FVIII 발현량 측정
많이 사용하는 FVIII 활성 측정 시험 방법은 one-stage clotting method와 chromogenic method 두 가지이다. 그 중 키메라 FVIII 발현량 측정은 chromogenic method를 이용하여 측정하였다. Chromogenic method는 FIXa, FX, thrombin, calcium, phospholipids와 FVIII 시료를 섞어 준 후, FVIII 시료에 의해 활성화 된 FXa의 양을 측정하기 위해 FXa에 의해 잘리면서 발색하는 chromogenic substrate를 넣어주고, chromogenic substrate의 발색 정도에 따라 FVIII의 활성을 측정하는 방법이다.
Chromogenic method의 실험 방법은 CHROMOGENIX(社)에서 판매하고 있는 chromogenic assay kit를 endpoint 방법으로 사용하였고, 제조사가 제공한 시험방법을 본 시험에 적합하게 변형하여 시험을 진행하였다. 시료를 1× 희석버퍼를 사용하여 standard range (0.25-1 IU/mL)에 들어 오도록 희석한다. 표준품 (calibration plasma)을 0, 0.25, 0.5, 1 IU/mL 농도가 되게 1× 희석버퍼를 이용하여 준비하였다. 이렇게 준비한 시료와 표준품 10μL를 1× 희석버퍼 790μL로 희석한 후, 96 well plate에 50μL씩 분주하고, 37℃에서 5분간 정치시켰다. Automatic dispenser pipette을 사용하여 factor reagent를 50μL씩 각 well에 분주한 후 2분간 37℃에서 2분간 반응 시켰다. 50μL substrate를 각 well에 분주한 후 2분간 37℃에서 2분간 정치하여 발색 시켰다. 발색된 시료에 50μL 2% citric acid를 넣어주어 반응을 정지 시켰다. 405nm 파장에서 흡광도를 측정하여 선형 calibration curve를 그린 후, 샘플의 흡광도를 calibration curve에 대입하여 시료의 활성을 측정하였다.
[표 3] 키메라 FVIII 발현량
Figure PCTKR2017006655-appb-I000003
D’D3를 융합 하기 전인 scFVIII-B3의 발현량은 1.6에서 8.0 IU/mL 사이로 측정되었었다. D’D3를 융합한 키메라 FVIII 중 단쇄 형태로 발현되는 경우 expression level이 D’D3를 융합하기 전인 scFVIII-B3와 유사한 것을 확인하였다. 하지만, 이량체로 발현되는 경우 expression level이 0.1 IU/mL로 기존 scFVIII-B3 보다 10배 이상 낮은 것을 확인하였으며, 측정된 결과는 표 3에 기재되었다.
실시예 3-2. 발현 패턴 분석
본원에 구축된 키메라 FVIII을 실시예 4에 따라 정제한 후, 정제 시료를 웨스턴블랏 분석을 통해 발현 패턴을 확인하였다.
배양액과 LDS sample buffer를 각각 3:1의 비율로 혼합하여 4-12% bis-tris (BT) 젤에 혼합한 시료 30μL를 로딩한 후 150 volt로 약 1시간 동안 러닝한다. 러닝이 완료된 젤을 nitrocellulose (NC) membrane에 transfer한 후, blocking 버퍼 (Thermo Scientific)에 한 시간 정치하였다. 제 8인자의 중쇄 (GMA-012, Green Mountain Antibodies), 경쇄 (ab41188, Abcam) 및 D’D3 (96340, Abcam)을 인식하는 primary 항체를 TBST 버퍼에 희석하여 제조한 후, blocking이 완료된 NC membrane과 1시간 반응시켰다. TBST 버퍼를 사용하여 5분 간격으로 3회 washing을 진행한다. Secondary 항체 (Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate)는 TBST 버퍼로 희석하여 제조한 후, NC membrane과 10분간 반응시킨다. TBST 버퍼를 사용하여 5분 간격으로 5회 세척하였다. ECL Prime Western Blotting Detection Reagent을 뿌려주어 NC membrane을 발색시킨 후, 암실에서 Hyperfilm ECL (GE healthcare)에 membrane을 노출하여 현상하였다.
그 결과 단쇄로 발현되는 키메라 FVIII은 모두 본원에서 디자인 한 형태로 발현되는 것을 확인하였고, 링커 길이에 따른 발현 패턴 변화는 없는 것으로 나타났다 (도 5).
실시예 4. 키메라 FVIII 생산
키메라 FVIII의 생산 공정은 크게 5단계로 구성되어 있으며, 실시예 2에서 배양한 배양액을 이용하여 정제를 진행하였다.
첫 번째 단계에서는 배양액에서 키메라 FVIII을 분리정제 하는 공정으로 FVIII 정제용으로 GE에서 개발한 VIIISelect resin을 이용하였다. VIIISelect resin을 컬럼에 패킹한 후, 2% citric acid로 컬럼을 세척하였다. 평형 버퍼 (20 mM Histidine, 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0)를 흘려주어 평형을 잡는다. 배양액에 최종 1 M NaCl 농도가 되도록 5 M NaCl 버퍼를 넣어주고, pH를 7.0으로 적정한 후, 컬럼에 로딩하였다. 배양액 로딩 후, 평형 버퍼를 UV가 baseline으로 떨어질 때까지 흘려주어 평형을 잡았다. 용출 버퍼 (20 mM Histidine, 5 mM CaCl2, 0.9 M Arginine, 45% propylene glycol, 0.02% Tween® 80, pH 6.5)를 흘려주어 키메라 FVIII을 용출하였다.
두 번째 단계에서는 첫 번째 단계의 용출액에 섞여 있는 propylene glycol을 제거해주고, 일부 섞여 있는 분순물을 제거해주는 공정으로 GE사의 Q fast flow resin을 이용하였다. Q fast flow resin을 컬럼에 패킹한 후, 세척 버퍼 (0.5 M NaOH, 1 M NaCl)를 흘려주어 컬럼을 세척하였다. 평형 버퍼 (20 mM Histidine, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween® 80, pH 7.0)를 흘려주어 평형을 잡았다. VIIISelect 공정의 용출액을 평형 버퍼로 10배 희석한 후, pH를 7.0으로 적정하고, 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 평형 버퍼를 UV가 baseline으로 떨어질 때까지 흘려주어 평형을 잡았다. 용출 버퍼 (20 mM Histidine, 5 mM CaCl2, 500 mM NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0)를 흘려주어 키메라 FVIII을 용출하였다.
세 번째 단계에서는 정제한 키메라 FVIII에 PEG를 접합시켜 주는 공정이다. 정제된 키메라 FVIII 용액에 최종농도가 0.1 mM이 되도록 TCEP를 첨가한 후 4℃에서 1시간 정치시켜 삽입한 cysteine을 환원시켰다. 페길화 버퍼 (20 mM Histidine, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0)로 평형이 잡힌 PD-10 컬럼 (GE healthcare)을 사용하여 잔존 TCEP를 제거하였다. 환원된 키메라 FVIII 자체의 이황화 결합을 산화시켜주기 위하여 4℃에서 2시간 정치 시켰다. PEG 접합은 DMSO에 녹인 PEG 용액(50 mg/mL)을 단백질 당 PEG 비율을 1:20이 되도록 넣어준 후 4℃에서 12-16시간 정치시켰다.
네 번째 단계에서는 PEGylation 과정 중에 생긴 impurity인 PEG가 붙지 않은 키메라 FVIII과 PEG가 2개 이상 붙은 키메라 FVIII을 제거하는 공정으로 GE사의 Superdex 200 resin을 이용하였다. Pre-packing 된 superdex 200 컬럼에 평형 버퍼 (20 mM Histidine, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 0.02% Tween® 80, pH 7.0)를 흘려주어 평형을 잡았다. PEGylation 공정 시료를 sample loop를 이용하여 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 평형 버퍼를 흘려주며 peak을 수집하고, SDS-PAGE로 분석하여 적절한 fraction을 풀링(pooling) 하였다.
다섯 번째 단계에서는 네 번째 단계에서 풀링한 페길화 키메라 FVIII을 농축하는 공정이다. 이를 위해 Millipore사의 amicon 30kDa를 이용하여 25 IU/mL 농도가 되게 농축을 하였다.
정제 정도와 페길화 정도를 분석하기 위하여 공정 중간 시료와 최종 시료에 대한 SDS-PAGE를 수행하였다 (도 4, 도 6). scFVIII/D’D3의 경우 linker 길이에 따른 정제 패턴은 거의 유사한 것을 확인할 수 있다. 첫 번째 공정인 VIIISelect 공정에서 대부분의 HCP가 제거 되는 것을 볼 수 있으며, 두 번째 공정인 Q FF 공정에서 monomer 형태인 scFVIII/D’D3만 정제 되는 것을 확인하였다. 그 후, PEGylation 공정을 진행 한 후, 정제한 결과 PEG-scFVIII/D’D3만 정제 된 것을 확인하였다.
실시예 5. 키메라 FVIII 물질 비역가(specific activity) 확인
키메라 FVIII의 비역가를 확인하기 위해 chromogenic method로 키메라 FVIII의 activity를 측정하였고, BSA를 standard로 사용하여 BCA 방법으로 키메라 FVIII의 단백정량을 측정하였다. 이렇게 측정한 activity 결과 값을 단백정량 값으로 나누어 주어 specific activity를 측정하였으며, 그 결과는 표 4와 같다.
[표 4] 키메라 FVIII 비역가(specific activity)
Figure PCTKR2017006655-appb-I000004
scFVIII/D’D3의 경우 linker 길이를 바꾸어 주어도 specific activity 값은 큰 차이가 없는 것을 확인하였으며, 본 실시예에서 측정한 specific activity는 다른 recombinant FVIII의 specific activity 값들과 유사한 것을 확인하였다.
실시예 6. 키메라 FVIII의 LRP, vWF binding affinity 측정 실험
키메라 FVIII과 LRP 또는 vWF와의 binding affinity를 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. vWF (HCVWF-0191, Haemtech, 200 μg/mL) 또는 LRP (#04-03, Biomac, 260 μg/mL)를 사용하여 96 well plate에 well 당 100μL씩 coating한 후, 상온에서 2시간 동안 정치한다. 2시간 incubation 후, PBS에 0.1% Tween® 20을 첨가한 washing buffer로 washing을 수행한다. PBS에 1% BSA를 첨가한 blocking buffer를 well 당 200μL씩 넣고, 상온에서 1시간 동안 incubation하여 blocking을 수행한다. 1시간 incubation 후, PBS에 0.1% Tween® 20을 첨가한 washing buffer로 washing을 수행한다. FVIII sample을 blocking buffer로 적절한 농도로 희석한 후, well 당 100μL씩 loading 후, 상온에서 1시간 동안 incubation 한다. PBS에 0.1% Tween® 20을 첨가한 washing buffer로 washing을 수행한다. Anti-Factor VIII biotin (SAF8C-APBIO, Affinity Biologicals, 100 μg/mL)을 blocking buffer로 1/2000 희석하여 well 당 100μL씩 loading 하고, 상온에서 1시간 동안 정치한다. PBS에 0.1% Tween® 20을 첨가한 washing buffer로 washing을 수행한다. Streptavidin-HRP (S2438, Sigma-Aldrich)를 blocking buffer로 1/3000 희석하여 well 당 100μL씩 loading 하고 상온에서 45분 동안 incubation 한다. PBS에 0.1% Tween® 20을 첨가한 washing buffer로 washing을 수행한다. TMB substrate (52-00-03, KPL)를 well 당 100μL씩 처리 후, 10분 동안 incubation 한다. Stop solution (1 N 황산)을 well 당 100μL씩 넣어주어 반응 정지시킨 후, 490 nm 흡광도를 측정한다.
실험 결과, 키메라 FVIII의 LRP, vWF에 대한 결합이 ADVATE® 보다 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 키메라 FVIII이 페길화 되면 LRP, vWF 결합은 더 감소되는 것을 확인하였다 (도 7, 도 8).
실시예 7. 동물 PK 시험: PEG-scFVIII/D’D3-120
페길화 키메라 FVIII의 체내 반감기를 측정하기 위해 혈우병 A형 마우스 모델 (HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화 하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII (본 실시예에서는 PEG-scFVIII/D’D3-120을 이용하였음)을 125 IU/kg 용량을 정맥으로 단 회 투여 하였다. PK 혈액 샘플은 Advate® 투여군에서는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, PEG-scFVIII/D’D3-120 투여군에서는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 PEG-scFVIII/D’D3-120의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다. PK 분석 결과(도 9) Advate®의 반감기는 약 7.86시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3-120의 반감기는 Advate® 보다 3.3배 긴 약 26.12시간으로 측정되었다. PEG-scFVIII/D’D3-120의 평균 머무름시간(MRT)도 Advate®에 비해 3.6배 증가하였다. 또한 PEG-scFVIII/D’D3-120의 소실속도(CL)는 Advate®보다 약 2배 감소하였고, 농도곡선하면적(AUC)은 약 2배 증가하는 것으로 나타났다.
[표 5] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000005
실제 예방적 요법으로 FVIII의 투여 시, 혈중 FVIII의 농도가 1% 또는 3% 이상으로 유지되도록 하기 때문에 반감기가 긴 지속형 FVIII을 사용할 경우 혈중 FVIII의 농도가 1% 또는 3% 이하로 떨어지는 시간을 지연시킬 수 있고 이는 투여 횟수의 감소로 이어질 수 있다. 지금까지 개발된 지속형 FVIII의 경우 HA mice에서 반감기의 증가폭은 대조군 대비 2배 이하 수준이었다. 이는 상기에서 언급한 것처럼 FVIII이 혈중에서 vWF와 강한 비공유 결합을 한 상태로 돌아다니기 때문에 vWF의 반감기보다 더 길어지지 못했던 것으로 판단된다. 본원에서 개발한 키메라 FVIII은 혈중 vWF와의 결합을 저해하는 것과 동시에 키메라 FVIII이 LRP에 의한 소실도 막아주기 때문에 지금까지 개발 된 지속형 FVIII이 넘지 못 했던 대조군 대비 반감기가 2배 이상 증가한 것으로 판단되며, 이는 매우 의미 있는 결과라고 판단한다.
실시예 8. 동물 PK 시험: 다양한 크기의PEG 접합된 scFVIII/D’D3-120
실시예 7과 유사하게 혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화하였다 (n = 3 / time point). 이 후 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량을 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 scFVIII/D’D3-120에 서로 다른 size의 PEG를 접합시켜 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 7.88시간으로 측정되었고, 40kDa PEG-scFVIII/D’D3-120의 반감기는 약 20.93시간으로 측정되었고, 60kDa PEG-scFVIII/D’D3-120의 반감기는 약 28.09시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 10 및 표 6과 같다.
[표 6] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000006
실시예 9. 동물 PK 시험: PEG-scFVIII/D’D3-60과 Fc가 융합된 scFVIII/D’D3-120에 PEG 접합
혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화 하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량을 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 PEG-scFVIII/D’D3-60과 Fc가 융합된 scFVIII/D’D3-120에 PEG를 접합시킨 물질을 이용하여 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 7.08시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3-60의 반감기는 약 16.53시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3/Fc-120, Fc의 반감기는 약 18.89시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 11 및 표 7과 같다.
[표 7] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000007
실시예 10. 동물 PK 시험: PEG-scFVIII/D’D3-300과 D’D3를 이량체 형태로 FVIII의 c-말단에 융합한 scFVIII/D’D3-120에 PEG 접합
혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량을 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 PEG-scFVIII/D’D3-300과 D’D3를 이량체 형태로 FVIII의 c-말단에 융합한 scFVIII/D’D3-120에 PEG를 접합시킨 물질을 이용하여 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 9.02시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3-300의 반감기는 약 15.76시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3/D’D3-120의 반감기는 약 18.00시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 12 및 표 8과 같다.
[표 8] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000008
실시예 11. 동물 PK 시험: PEG-scFVIII/D’D3-60, PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-300
혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량을 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 PEG-scFVIII/D’D3-60, PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-300을 이용하여 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 6.99시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3-60, PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-300의 반감기는 각각 약 20.07, 24.48, 17.13시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 13 및 표 9와 같다.
[표 9] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000009
실시예 12. 동물 PK 시험: PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH2
혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화 하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량을 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH2를 이용하여 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 6.26시간으로 측정되었고, PEG-scFVIII/D’D3-120, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, PEG-scFVIII/D’D3-120-TH2의 반감기는 각각 약 21.28, 24.19, 25.28시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 14 및 표 10과 같다.
[표 10] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000010
실시예 13. 동물 PK 시험: 다양한 크기 및 형태의 PEG 접합된 scFVIII/D’D3-120-TH1
혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화 하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량으로 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 scFVIII/D’D3-120-TH1에 여러 가지 PEG를 접합시킨 물질을 이용하여 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 7.66시간으로 측정되었고, 20kDa linear PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, 20kDa branch PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, 40kDa branch PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1의 반감기는 각각 약 22.98, 16.10, 27.33시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 15 및 표 11과 같다.
[표 11] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000011
실시예 14. Thrombin generation assay
페길화 키메라 FVIII의 thrombin generation profile을 확인하기 위해 thrombin generation assay를 진행하였다. Fluoroskan Ascent™ FL microplate fluorometer and luminometer (5210460, Thermofisher) 기기를 미리 37℃로 warming 해 놓고, 37℃ pre-warmed D.W로 기계의 line을 washing 하였다. FVIII deficient plasma (OTXW17, Siemens), Calibrator (TS20.00, Thrombinoscope), PPP-low-reagent (TS31.00, Thrombinoscope)를 상온에서 15분 이상 방치하여 warming 시킨 후, 37℃ pre-warmed D.W 1mL로 reconstitution 하였다. 96 well plate에 Calibrator와 PPP-low-reagent를 20μL씩 넣어주고, 앞에서 준비한 Fluoroskan 기기에 plate를 넣어 37℃로 가온해 놓았다. Sample dilution은 앞에서 준비한 FVIII deficient plasma를 이용하여 적절한 농도로 희석하였다. FluCa-Kit (TS50.00, Thrombinoscope)안의 Fluo-buffer를 37℃로 warming 해 놓았다. 준비한 sample을 Fluoroskan 기기 안에 들어있는 plate에 80μL씩 넣고, 37℃로 warming 된 Fluo-buffer 1 vial에 40μL의 Fluo-substrate를 넣어 준비하였다. 준비된 Flu-Ca를 기계에 넣은 후, 미리 짜놓은 software를 실행하면 각 well 당 20μL의 Flu-Ca가 분주 되고, thrombin generation을 진행하였다.
Thrombin generation assay 결과 FVIII deficient plasma에서는 thrombin generation profile이 현저히 낮은 반면, 키메라 FVIII에서는 thrombin generation profile이 농도 의존적으로 점차 높아지는 것을 확인하였다. 키메라 FVIII 1 IU/mL의 thrombin generation profile은 normal plasma의 thrombin generation profile과 유사한 것을 확인할 수 있었다 (도 16).
실시예 15. 동물 급성 효능(acute efficacy) 시험
키메라 FVIII의 효력을 확인하기 위해 혈우병 A형 마우스(HA mice)의 tail clip model에서 acute efficacy 시험을 진행하였다. Wild type mice (WT)는 19 - 25 g 중량의 수컷 C57BL/6 mouse를 오리엔트 바이오에서 공급받은 개체를 이용하였고, HA mice는 녹십자에서 breeding한 개체로 19 - 25 g 중량의 수컷 mouse를 선별하여 이용하였다. 시험 당일, 15mL conical tube (1개/마리)에 saline을 14mL까지 채운 후, 가열된 water bath에 담가서 saline의 온도가 37℃가 되도록 유지시켰고, 투여 전 mouse의 체중을 측정하였다. Pentobarbital sodium을 IP로 60 mg/kg dose로 투여하여 마취시킨 후, 음성 대조물질은 0.9% 생리 식염수를, 양성대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII은 100 IU/kg dose로 jugular vein으로 5 mL/kg의 볼륨으로 단 회 투여하였다. 5분 후, HA mice 꼬리의 말단에서 4mm 되는 지점을 절단하고, 꼬리를 saline buffer에 넣어 30분 동안 혈액을 모았다. 30분 동안 모은 혈액 시료를 1,500g 에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 후, 10mL pipet을 이용하여 conical tube에 3차 증류수를 10mL까지 넣고, vortex를 이용하여 혈액을 완전히 용혈 시켰다. Blood loss를 측정하기 위해 용혈 된 샘플을 hemoglobin assay kit (MAK115-1KT, Sigma-Aldrich)의 방법으로 분석하였다.
Wild type mice (WT)의 경우 hemoglobin의 농도가 약 100 nM 인 것을 확인하였고, HA mice (KO)에서 음성대조군인 경우 hemoglobin의 농도가 약 1,000 nM 인 것을 확인하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 경우 hemoglobin의 농도가 약 140 - 450 nM 인 것을 확인하였으며, 이는 음성대조군에 비해 약 55% 감소한 수치이다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII 간에는 통계적으로 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 17).
실시예 16. 동물 PK 시험: CHO 세포에서 발현한 scFVIII/D’D3-120-TH1에 다양한 크기 및 형태의 PEG 접합
혈우병 A형 마우스 모델(HA mice)을 이용한 PK 시험을 진행하였다. HA mice는 8주령의 쥐(20 ± 2 g)를 이용하였고, 투여 전 개체 별 무게 측정 후, 그룹화 하였다 (n = 3 / time point). 대조 물질인 Advate®와 페길화 키메라 FVIII을 125 IU/kg 용량으로 정맥으로 단 회 투여 하였다. 본 실시예에서는 CHO 세포에서 발현한 scFVIII/D’D3-120-TH1에 여러 가지 PEG를 접합시킨 물질을 이용하여 PK 시험을 진행하였다. 대조 물질인 Advate® 투여군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 9, 16, 22, 30 hr에, 시험군의 혈액 시료는 투여 후 0, 0.083, 2, 6, 16, 30, 40, 48, 64, 72, 96 hr에 200μL sampling 하였다. 채혈 직후 샘플을 항응고제 (sodium citrate 3.2% buffer)와 1:9 부피로 섞은 후 원심분리로 혈장을 분리하였다. Advate®와 페길화 키메라 FVIII의 역가는 Chromogenic method를 사용하여 측정하였고, 약동학적 파라미터는 WinNonLin software(version 6.4)의 non-compartmental (NCA) model을 적용하여 산출하였다.
PK 분석 결과 Advate®의 반감기는 약 8.22시간으로 측정되었고, 20kDa linear PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1, 40kDa linear PEG-scFVIII/D’D3-120-TH1의 반감기는 각각 약 25.01, 26.88시간으로 측정되었다. 약동학적 프로파일 및 약동학적 파라미터는 도 18 및 표 12와 같다.
[표 12] 페길화 키메라 FVIII 약동학적 파라미터
Figure PCTKR2017006655-appb-I000012
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (32)

  1. 경쇄 및 중쇄를 포함하는 B 도메인의 전장 또는 그 일부가 결실된 인간 혈액응고 8인자 (Factor VIII, FVIII); 및
    하나 이상의 vWF D’D3 도메인을 포함하는 키메라 단백질로,
    상기 경쇄 및 중쇄는 한 개 폴리펩타이드로 또는 두 개의 폴리펩타이드로 발현되며,
    상기 한 개의 폴리펩타이드로 발현되는 경우, 상기 FVIII 및 상기 vWF D’D3 도메인을 연결하며, 그 사이에 위치하는 효소절단부위 갖는 연결체를 포함하며, 상기 vWF D’D3 도메인 및 상기 FVIII는 각각 상기 연결체를 기준으로 그 N-말단 방향 또는 C- 말단 방향에 위치하고,
    상기 두 개의 폴리펩타이드로 발현되는 경우, 상기 vWF D’D3 도메인은 그 N-말단이 상기 중쇄에 포함된 상기 B 도메인의 C-말단에 연결되는 것인, 키메라 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 일부가 결실된 B 도메인은 서열번호 1의 1648 및 1649 잔기 위치를 기준으로 상기 잔기를 포함하여 N-말단 및/또는 C-말단 방향으로 각각 최소 5개의 아미노산이 결실된 것; 또는
    상기 B 도메인이 4개 내지 6개의 당화부위를 포함하도록 일부가 결실된 것인, 키메라 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 일부가 결실된 B 도메인은 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 741 내지 902 및 1654 내지 1689의 서열, 또는
    아미노산 잔기 741 내지 936로 표시되는 것인, 키메라 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 단백질은 두 개의 vWF D’D3 도메인을 포함하며, 상기 두 개의 vWF D’D3 도메인은 서로 효소절단부위를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연결체로 연결되거나 및/또는 서로 간에 공유결합을 통한 이량체를 형성하는 것인 키메라 단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 단백질은 하나 이상의 Fc를 추가로 포함하며, 상기 Fc는 상기 vWF D’D3 도메인 및/또는 상기 FVIII에 효소절단부위를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연결체로 연결되는 것인, 키메라 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 키메라 단백질은 두 개의 Fc를 포함하며, 상기 두 개의 Fc는 서로 효소절단부위를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연결체로 연결되거나 및/또는 서로 간에 공유결합을 통한 이량체를 형성하는 것인, 키메라 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소절단부위를 갖는 연결체에서, 상기 효소절단부위는 트롬빈, FVIIa, FXa 또는 FXIa에 의해 절단될 수 있는 서열이고, 그 외의 서열은 [G4S]n 의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 식에서 n = 0, 또는 1 내지 100 사이 정수인, 키메라 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 n은 6, 8, 10, 12, 18, 24 또는 60인, 키메라단백질.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 DFLAEGGGVR (서열번호 36), TTKIKPR (서열번호 37), 또는 LVPRGS (서열번호 38)이고, 상기 FVIIa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 ASKPQGRIVGG (서열번호 39), 상기 FXa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 IDGR (서열번호 40) 또는 IEGR (서열번호 41)이고, 상기 FXIa에 의해 절단될 수 있는 서열은 SKLTRAETVF (서열번호 42)인, 키메라 단백질.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 두 개의 폴리펩타이드는, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 이고,
    상기 제 1 폴리펩타이드는 상기 FVIII의 중쇄 및 B 도메인의 전부 또는 일부를 포함하고,
    상기 제2 폴리펩타이드는 상기 FVIII의 경쇄 또는 B 도메인의 일부를 포함하고,
    상기 vWF D’D3 도메인은 상기 제 1 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 방향, 또는 제 2 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 방향에 위치하며,
    선택적으로 상기 키메라 단백질은 하나 이상의 Fc를 추가로 포함하며, 상기 Fc는 상기 vWF D’D3 도메인 및/또는 상기 제 2 폴리펩타이드에 연결되는 것인, 키메라 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서
    상기 제 1 폴리펩타이드는 상기 FVIII의 중쇄 및 B 도메인의 일부를 포함하고, 상기 B 도메인의 일부는 서열번호 01을 기준으로 741 내지 936번의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메라 단백질.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 키메라 단백질은 두 개 이상의 vWF D’D3 도메인을 포함하며, 상기 두 개 이상의 vWF D’D3 도메인간에는 서로 효소절단부위를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연결체로 연결되거나 및/또는 상기 vWF D’D3 도메인간의 공유결합을 통해 복합체를 형성하는 것인, 키메라 단백질.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 또는 상기 vWF D’D3 도메인은 효소절단부위를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연결체로 연결된 것인, 키메라 단백질.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 한 개 폴리펩타이드로 발현되는 키메라 단백질은 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 또는 25로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 것인, 키메라 단백질.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 두 개의 폴리펩타이드로 발현되는 키메라 단백질은 서열번호 4 및 5 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 23 및 24 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 26 및 27 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 28 및 29 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 30 및 31 (각각 중쇄 및 경쇄), 서열번호 32 및 33 (각각 중쇄 및 경쇄), 또는 서열번호 34 및 35 (각각 중쇄 및 경쇄)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 것인, 키메라 단백질.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FVIII는 상기 A 도메인 및/또는 B 도메인 단편의 일부 아미노산 잔기에서 친수성 폴리머와 컨쥬게이션되고, 상기 컨쥬게이션되는 위치는 상기 B 도메인에서 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 754, 781, 782, 788, 789, 825, 및 897로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치이고;
    상기 A 도메인에서 서열번호 01의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 491, 495, 498 및 1806으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치이고,
    상기 컨쥬게이션되는 위치의 잔기는 친수성 폴리머와의 접합을 위해 시스테인으로 치환되는, 키메라 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드, 덱스트란이고, 상기 PEG는 상기 위치에서 acryloyl, sulfone 또는 maleimide를 통하여 연결된 것인, 키메라 단백질.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    상기 FVIII는 B 도메인 단편의 일부 아미노산 잔기에서 친수성 폴리머와 컨쥬게이션되고, 상기 잔기는 782번 잔기인, 키메라 단백질.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    상기 PEG는 평균 분자량이 20kDa 이상인 키메라 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 PEG는 평균 분자량이 40kDa 또는 60kDa인, 키메라 단백질.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 야생형 FVIII 단백질과 비교하여 최소 2배 반감기가 연장된 것인, 키메라 단백질.
  22. 제 14 항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
  23. 제 15 항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 48 내지 64, 66, 또는 70으로 표시되는 것인, 핵산분자.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 46, 47, 68, 69, 또는 71 내지 80으로 표시되는 것인, 핵산분자.
  26. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터.
  27. 제 26 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  28. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질, 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 26 항에 따른 벡터, 또는 제 27 항에 따른 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 A형 혈우병 치료용 약학적 조성물.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 조성물은 1일 또는 그 이상의 기간, 바람직하게는 주 일회, 특히 월 1회 투여가능한 반감기를 갖는 것인, A형 혈우병 치료용 약학적 조성물.
  30. 치료적으로 유효한 양의 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 조성물을 혈우병 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병 치료 방법.
  31. 유효한 양의 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 조성물을 혈우병 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈액 응고 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질, 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 26 항에 따른 벡터, 또는 제 27 항에 따른 세포의 혈우병 치료용 용도.
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