KR20140084208A - 정제된 인자 ｖｉｉｉ의 재구성 후의 안정성을 향상시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인자(Factor) VIII 분자의 제조 과정 전반에서, 인자 VIII 분자가 단백질분해 절단에 의해 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 절단되는 것을 방지하는 것을 포함하는, 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 인자 VIII의 정맥내 및 비정맥내 주사 후의 생체이용률을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

정제된 인자 ＶＩＩＩ의 재구성 후의 안정성을 향상시키는 방법{METHOD FOR IMPROVING THE STABILITY OF PURIFIED FACTOR VIII AFTER RECONSTITUTION}

본 발명은, 인자(Factor) VIII 분자의 제조 과정 전반에서, 인자 VIII 분자가 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편(fragment)과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해 절단(proteolytic cleavage)되는 것을 방지하는 것을 포함하는, 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 정맥내 및 비정맥내 주사 후의 인자 VIII 분자의 생체이용률을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

고전적 혈우병 또는 A형 혈우병은 선천적 출혈성 장애이다. 이 질환은 X 염색체와 연관된 혈액 응고 인자 VIII의 결손에 원인이 있으며 거의 남성에게만 10,000명당 한 두명 정도로 발생하고 있다. X 염색체 결손은 자신은 혈우병 환자가 아닌 여성 보인자(carrier)에 의해 전이된다. A형 혈우병의 임상적 증상은 출혈 소인의 증가로 나타난다. 중증의 혈우병 사람을 위한 인자 VIII 농축제의 치료법이 도입되기 전까지 그러한 환자들의 평균 수명은 20년에도 미치지 못했다. 혈장의 인자 VIII 농축제의 사용은 혈우병 환자들의 상태를 상당히 호전시켰고 이에 평균 수명이 크게 늘어나면서 대부분의 환자들은 거의 정상적인 생활이 가능하기에 이르렀다. 그러나, 혈장 유래의 농축제 및 이들의 사용에는 특정 문제가 있는데 이 가운데 가장 심각한 것은 바이러스 감염이다. 과거로부터 오늘날까지 개체는 AIDS, B형 간염 및 비A형 비B형 간염 원인 바이러스들로부터 치명적인 위협을 받고 있다. 이에 따라, 최근에 혈장 유래 인자 VIII에 대한 고도의 안전성 표준을 확립시킨 여러 바이러스 불활성화 방법 및 새로운 고도의 정제된 인자 VIII 농축제가 개발되고 있다.

몇 가지 재조합 혈장 유래 치료학적 폴리펩타이드(예: 혈액응고인자)가 사람의 치료 및 예방 용도로 시판되고 있다. FVIII은 포유동물의 간에서 생성되는 분자량 약 280 kDa 이하의 혈장 당단백질이다. 이 물질은 혈액 응고를 유도하는 연속 단계(cascade)의 응고 반응에서 중요한 성분이다. 이러한 연속 단계에는 인자 IXa(FIXa)가 활성화 인자 VIII(FVIIIa)와 공동으로 인자 X(FX)를 활성화 형태 FXa로 전환시키는 단계가 있다. 이 단계에서 FVIIIa는 보조인자로서 작용하며 FIXa의 활성을 최대로 높이는데 칼슘 이온 및 인지질과 함께 반드시 필요하다.

A형 혈우병의 치료에서 중요한 진보는 사람 FVIII의 전체 2,351개 아미노산 서열을 암호화한 cDNA 클론의 분리(미국 특허 제4,757,006호) 및 사람 FVIII 유전자(DNA 서열 및 이의 생산을 위한 재조합 방법)의 제공이었다.

인자 VIII은 분자량이 약 280 kDa인 단일 폴리펩타이드 쇄로서 합성된다. 인자 VIII의 아미노 말단 신호 펩타이드는 인자 VIII이 소포체로 전위될 때 제거되고 이어서 성숙 천연 인자 VIII 분자(즉, 신호 펩타이드의 절단 후)는 이의 분비과정에서 아미노산 잔기 1313과 1648 다음에서 단백질분해 절단된다. 그 결과 약 160 내지 200 kDa의 N-말단 중쇄 절편이 금속 이온-의존성 결합되어 약 80 kDa의 C-말단 경쇄로 이루어진 헤테로이량체가 방출된다[참조: Kaufman, Transfusion Med. Revs. 6:235 (1992)].

상기 헤테로이량체는 단백질쇄가 트롬빈에 의해 단백질분해 절단되어 생리적으로 활성화된다. 트롬빈은 중쇄를 90 kDa 단백질로 절단한 다음 54 kDa와 44 kDa 절편으로 절단한다. 또한, 트롬빈은 80 kDa 경쇄를 72 kDa 단백질로 절단한다. 72 kDa 단백질과 두 개의 중쇄 절편(상기 54 kDa 및 44 kDa)은 칼슘 이온에 의해 함께 결합되어 활성 FVIII을 구성한다. FVIII 분자는 이로부터 44 kDa A2 중쇄 절편이 분리되거나 72 kDa 및 54 kDa 단백질이 또한 트롬빈, 활성화 단백질 C 또는 FXa에 의해 절단될 때 불활성화된다. 혈장에서 FVIII은 상기한 바와 같은 FVIII의 단백질분해적 파괴(proteolytic destruction)를 억제하는 것으로 보이는 VWF 단백질("VWF") 50배 몰 과량과 결합되어 안정화된다.

FVIII의 아미노산 서열은 3종의 도메인 구조로 구성된다: 330개 아미노산의 삼중 A 도메인, 980개 아미노산의 단일 B 도메인 및 150개 아미노산의 이중 C 도메인. B 도메인은 다른 단백질과 상동성을 보이지 않으며 이러한 단백질의 25개 잠재적 아스파라긴(N)-연결된 당화 부위중 18개를 제공한다. B 도메인은 응고과정에서 뚜렷한 기능은 없으며 결실될 수 있고, B-도메인 결실된 FVIII 분자는 여전히 응고촉진활성을 나타낸다.

현재 인자 VIII 시판 제품들은 재조합 기술에 의해 생산되거나 혼주혈장(pooled plasma)에서 정제된 인자 VIII 동결건조 제형으로서 공급되고 있다. 동결건조 제품은 투여전에 재구성된다. 일단 재구성된 인자 VIII은 보존기간이 비교적 짧다. 인자 VIII은 비교적 안정하지 못한 단백질이며, 특히 수용액 중에서 그러하다. 제조 및 저장 과정에서 안정화는 다른 혈장 단백질, 특히 폰빌레브란트인자(vWF) 및 알부민과 복합체를 형성하는 방법이 공개되었다. 예를 들면, 미국 특허 제6,228,613호 참조. 미국 특허 제5,565,427호에는 아미노산 또는 이의 염 또는 상동체 중 하나 및 세정제 또는 유기 고분자(예: 폴리에틸렌글리콜)를 포함하는 인자 VIII의 안정화 제형이 기술되어 있다. 미국 특허 제5,605,884호에는 염화칼슘 및 고농도의 염화나트륨 또는 염화칼륨의 존재하에 히스티딘 완충제 기반의 고이온 세기(strength) 매질중에 안정화된 인자 VIII 제형이 기술되어 있다. 이와 같은 조성물들은 재구성 후 수성 형태에서 인자 VIII의 안정성을 상당히 향상시키는 것으로 나타났다. 인자 VIII의 제형에서 칼슘 이온의 중요성은 일반적으로 잘 알려져 있다. 미국 특허 제6,599,724호에 따르면, 임의로 Ca²⁺ 이온 또는 Mn²⁺ 이온의 존재하에 다른 이가 양이온, 즉 Cu²⁺ 및 Zn²⁺의 존재가 인자 VIII의 안정성을 향상시킨다. 또한, WO 2011/027152 A1은 여러 가지 첨가제를 포함하는 안정한 수성 인자 VIII 조성물을 기술하고 있다.

인자 VIII 동결건조 제제의 재구성 후 보관 기간이 짧다는 측면에서 수용액 중에 재구성된 인자 VIII의 안정성을 증가시킬 방법이 필요하다. 수성상에서 안정성이 증가된 FVIII 정제 제제를 제공하는 것은 다른 이유때문에도 필요하다. 무엇보다도, 주변온도에서의 FVIII 정제 제품 제조 과정을 뒷받침하기 위해 주변온도에서 충분한 기간을 가질 수 있는 것이 유리하다. 특히, 충전 단계는 일부 액체 벌크를 저장하여 제조 유연성을 높이는 것이 반드시 필요하다. 두 번째로, 제품을 재구성 후에 직접 투여할 수 없는 경우 정제된 FVIII 액체의 안정성 증가는 의사와 환자에게 유익할 수 있다. 마지막으로, 입원 환자의 수술 직후와 같이 연속 주입 조건 하에서의 FVIII의 사용은 재구성 후의 바람직하게 높은 제품 안정성에 의존할 것이다[참조: Takedani H., Haemophilia 2010, 16: 740-746]. 또한, 안정성이 증가된 FVIII 분자는 액상으로의 장기간 저장에 적합한 FVIII 제제를 개발하는데 유리할 수 있다.

본 출원의 발명자들은 놀랍게도, 정제된 인자 VIII 동결건조 제제의 재구성 후의 인자 VIII의 안정성이, 단일쇄 인자 VIII 작제물에서 상당히 증가된다는 것을 발견하였다. 이러한 작제물은 전형적으로, 인자 VIII의 분비전에 골지(Golgi) 구획에서 일어나는 단백질분해 절단을 방지함으로써 수득할 수 있다. 단일쇄 작제물은, 정제 후의 용액 중에서의 보다 양호한 안정성 및/또는 피하 투여시의 보다 양호한 생체이용률을 나타낸다.

발명의 요지

첫 번째 측면에서, 본 발명은 인자 VIII 분자가 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해 절단되는 것을 방지하는 것을 포함하는, 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

첫 번째 측면은 인자 VIII 분자의 제조 과정 전반에서, 인자 VIII 분자가 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해 절단되는 것을 방지하는 것을 포함하는, 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법을 포함한다.

추가로, 첫 번째 측면은 인자 VIII 분자의 정제 전에 인자 VIII 분자가 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해 절단되는 것을 방지하는 것을 포함하는, 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 방법과 관련하여 사용된 용어 "인자 VIII 분자의 제조 과정 전반에서" 및 "인자 VIII 분자의 정제 전에"는, 본 발명의 방법이 인자 VIII이 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 절단되는 것을 방지하지만, 본 발명의 방법이 재구성된 인자 VIII 분자의 투여 후에 일어날 수 있는 인자 VIII의 활성화 절단을 방지하지 않음을 의미한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 인자 VIII 분자는 인자 VIII 분자를 Arg372, Arg740 및 Arg1689 이후에 절단하는 트롬빈에 의해 여전히 활성화될 수 있다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 신호 서열과 성숙 인자 VIII 사이의 절단 부위를 제외하고 인자 VIII 분자를 발현하는 숙주 세포에 의해 인자 VIII 분자가 분비되는 동안 절단되는 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 숙주 세포에 의해 발현되고 분비되는 인자 VIII 분자중 50% 이상은 단일쇄 인자 VIII 분자이다. 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 발현되고 분비되는 인자 VIII 분자중 60% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상은 단일쇄 인자 VIII 분자이다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 단백질분해 절단 부위의 불활성화는 프로테아제 인식 서열 중 한 개 이상의 잔기를 결실시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 불활성화 단계는 인자 VIII 서열로부터 적어도 Arg1648을 결실시킴을 포함할 수 있다. 한 가지 양태에서, 불활성화 단계는 인자 VIII 서열로부터 최소한 Arg1313 내지 Arg1648의 아미노산 서열을 결실시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 첫 번째 측면의 다른 양태에서, 단백질분해 절단 부위의 불활성화는 프로테아제 인식 서열을 형성하는 아미노산 잔기 한 개 이상을 치환시킴으로써 달성한다.

또다른 양태에서(Arg1313을 포함하는 B-도메인의 일부를 보존하는 FVIII 변이체에 관한 양태), 본 발명의 방법은 또한 프로테아제 인식 서열을 형성하는 잔기 한 개 이상을 결실 또는 치환시킴으로써 Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 잔기 Arg1313 및 Arg1648의 둘 다의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열 중에서 적어도 일부를 결실시키는 것을 포함한다.

추가로 바람직하게는, 인자 VIII 서열의 위치 741 내지 1647에 있는 아미노산들로부터 선택되는 제1 아미노산을 인자 VIII 서열의 위치 1649 내지 1690에 있는 아미노산들로부터 선택되는 제2 아미노산과 융합시키고, 이에 따라, Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314사이의 절단 부위가 불활성화된다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 측면에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 수용액에서 증가된 안정성을 나타낸다. 25℃에서 7일간 저장한 후 수용액에 존재하는 변형된 인자 VIII 분자의 활성 손실은 바람직하게는 15% 미만이다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 측면에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 재구성 후 수용액 중에서 증가된 안정성을 나타낸다.

또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 측면에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 비정맥내 주사 후, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII의 생체이용률 또는 Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자와 비교하여, 증가된 생체이용률을 나타낸다. 또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 측면에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 비정맥내 주사 후, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 Asn 745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자의 생체이용률에 비하여, 증가된 생체이용률을 나타낸다. 변형된 FVIII의 생체이용률은, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII 또는 Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자의 생체이용률에 비하여, 바람직하게는 25% 이상 증가한다. 다른 바람직한 양태에서, 비정맥내 주사는 피하, 경피 또는 근육내 주사이다.

또다른 바람직한 양태는 (i) 인자 VIII이 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 정맥내 투여 후의 향상된 혈장 반감기(plasma half-life)를 나타내며, 바람직하게는 혈장 반감기가 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 40% 이상 증가하는 방법; (ii) 인자 VIII이 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서, 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 경시적인 트롬빈 생성 분석으로 측정한 트롬빈 피크 농도가 50 nM 이하로 떨어지는데 보다 더 긴 시간을 나타내며, 바람직하게는 이 시간이 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 10시간 이상 더 연장되는 방법; 또는 (iii) 인자 VIII이 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정된 활성을, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 보다 더 높게 보존하며, 바람직하게는 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후 인자 VIII의 보존 활성이, 사람 야생형 인자 VIII의 보존 활성에 비하여, 10% 이상 높은 방법이다.

본 발명에 따른 방법은 추가로 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(i) Arg1648과 Glu1649 사이 및 Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위가 불활성화된 변형된 인자 VIII 분자를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계,

(ii) 상기 핵산으로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,

(iii) 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 변형된 인자 VIII 분자의 발현을 유도하는 조건하에서 배양하는 단계 및

(iv) 상기 숙주 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 변형된 인자 VIII 분자를 회수하는 단계.

다른 측면에서, 본 발명은 Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 인자 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 인자 VIII 분자의 비정맥내 투여 후 생체이용률을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 비정맥내 주사는 피하 주사이다. 피하 주사 후의 생체이용률은, 각각 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII 또는 Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자의 생체이용률에 비하여, 25% 이상 증가한 것이 바람직하다.

다른 측면에서, 본 발명은 Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 인자 VIII 분자의 정맥내 투여 후의 혈장 반감기를 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 향상시키는 방법에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 인자 VIII 분자를 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서 경시적으로 트롬빈 생성 분석으로 측정한 트롬빈 피크 농도가 50 nM 이하로 떨어지는 시간을, 사람 야생형 인자 VIII이 비해서, 연장시키는 방법에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 인자 VIII 분자를 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정된 활성을, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후의 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 더 높게 보존하는 방법에 관한 것이다.

상기된 방법의 바람직한 양태는 인자 VIII 서열의 위치 741 내지 1647에 있는 아미노산으로부터 선택된 제1 아미노산을 인자 VIII 서열의 위치 1649 내지 1690에 있는 아미노산들로부터 선택된 제2 아미노산과 융합시키고, 이에 따라, Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 방법이다.

여러 측면들의 바람직한 양태들은 필요한 변경을 가하여 적용할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 출혈성 장애, 바람직하게는 A형 혈우병의 치료 또는 예방에 사용되는 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것으로서,

(i) 한편으로는 비정맥내 투여하였을 때, 단일쇄 인자 VIII 분자의 생체이용률이, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII 또는 Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 사람 인자 VIII 분자의 생체이용률에 비하여, 25% 이상 증가되거나,

(ii) 다른 한편으로는 정맥내 투여하였을 때, (a) 단일쇄 인자 VIII 분자의, 정맥내 투여 후의 혈장 반감기가, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 40% 이상 증가되거나, (b) 단일쇄 인자 VIII 분자의 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서 경시적인 트롬빈 생성 분석으로 측정한 트롬빈 피크 농도가 50 nM 이하로 떨어지는 시간이, 사람 야생형 인자 VIII을 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여한 경우보다, 10시간 이상 연장된다.

또한 또다른 측면에서, 본 발명은 출혈성 장애, 바람직하게는 A형 혈우병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것으로서, 단일쇄 인자 VIII 분자가, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정한 활성이, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 10% 이상 더 높은 활성을 보존한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 출혈성 장애, 바람직하게는 A형 혈우병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것으로서, 단일쇄 인자 VIII 분자의 용량이 동일한 지혈 활성을 달성하기 위해, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자보다, 25% 이상 감소될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 출혈성 장애 치료용 약제학적 제제의, 재구성 후의 증가된 안정성 또는 더 긴 저장 수명을 달성하기 위한, 단일쇄 인자 VIII 분자의 용도에 관한 것으로서, (i) 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 제제의 인자 VIII 활성이, 재구성 후 및 재구성 후 7일간 실온에서 저장 후, Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자의 동일량을 포함하는 약제의 활성보다, 10% 이상 높거나, (ii) 단일쇄 인자 VIII 분자가, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 배양되었을 때 한 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정된 활성이, 동일한 농도로 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 10% 이상 높게 보존되어, 상기

도 1은 실시예 1의 결과를 보여준다. 여러 가지 인자 VIII 분자가 수용액으로서 제공되었으며 이들의 안정성이 7일간 모니터링되었다. 단일쇄 인자 VIII 분자는 헤테로이량체(2개-쇄) 전장(full-length) 인자 VIII 분자(Beriate^® 및 Helixate^®) 및 헤테로이량체(2개-쇄) 및 B-도메인 결실된 작제물(ReFacto^®)에 비하여 7일간 저장 후의 활성 손실이 훨씬 적다.
도 2는 실시예 2의 결과를 보여준다. 여러 가지 인자 VIII 동결건조 제제가 수용액으로 재구성되었고 이들의 안정성이 7일간 모니터링되었다. 단일쇄 인자 VIII 분자는 헤테로이량체(2개-쇄) 전장 인자 VIII 분자(Advate^®) 및 헤테로이량체(2개-쇄) 및 B-도메인 결실된 작제물(ReFacto^®)에 비하여 7일간 저장 후의 활성 손실이 훨씬 적다.
도 3은 실시예 3의 결과를 보여준다. 상이한 3종 인자 VIII 분자가 마우스에 피하 주사되었고 이들의 생체이용률이 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정되었다. 단일쇄 인자 VIII 분자의 생체이용률은 2개-쇄 전장 인자 VIII (Advate^®) 또는 헤테로이량체(2개-쇄) B-도메인 결실된 작제물(ReFacto^®)에 비하여 실질적으로 더 높다.
도 4는 실시예 4의 결과를 보여준다. 본 발명의 인자 VIII 분자 및 2종의 시제품 FVIII 제제가 정제, 동결건조 및 재구성 후 37℃에서 항온배양되었다. FVIII 시료는 37℃에서 다양한 시간(0, 0.25, 1, 2, 4 및 8일) 동안 항온배양되었고 FVIII:C 활성이 1 단계 응고 분석에 의해 측정되었다. 제시된 수치들은 2개 시료의 평균과 표준편차를 나타낸다(단, 0.25일은 단지 1개 시료).
도 5는 실시예 5의 결과중 일부를 보여준다. scFVIII 및 전장 rFVIII(Advate^®, Baxter Healthcare)의 약동학적(PK) 프로파일이 250 IU/kg의 용량으로 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에 정맥내 단일 주사 후 측정되었다.
도 6은 실시예 5의 결과중 일부를 보여준다. 전장 rFVIII(Advate^®, Baxter Healthcare)의 약동학적(PK) 프로파일이 100 IU/kg의 용량으로 A형 혈우병 마우스에 정맥내 단일 주사 후 측정되었다.
도 7은 실시예 6의 결과중 일부를 보여준다. scFVIII 또는 전장 rFVIII(Advate^®, Baxter Healthcare)가 250 IU/kg의 용량으로 A형 혈우병 마우스에 투여된 후 투여일 1 내지 8의 트롬빈 평균 피크 농도가 측정되었다.
도 8은 실시예 7의 결과를 보여준다. 전장 rFVIII(Advate^®, Baxter Healthcare) 및 B-도메인 결실된 인자 VIII(ReFacto^®, Pfizer)의 약동학적(PK) 프로파일이 100 IU/kg의 용량으로 VWF 결손 마우스에 정맥내 단일 주사 후 측정되었다.

본 발명은, 인자 VII 분자를 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해적 절단하는 것을 방지하는 것을 포함하는, 인자 VIII 분자의 정제, 동결건조 및 재구성(reconstitution) 후의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키고, 임의로, 인자 VIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는 인자 VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

인자 VIII

용어 "혈액 응고 인자 VIII", "인자 VIII" 및 "FVIII"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 성숙 사람 인자 VIII은 2332개의 아미노산이 아래의 도메인 구조로 배열되어 구성된다:

A1: 잔기들 1-336,

A2: 잔기들 373-710,

B: 잔기들 741-1648

A3: 잔기들 1690-2019,

C1: 잔기들 2020-2172 및

C2: 잔기들 2173-2332.

이외에 3개의 산성 영역 a1(337-372), a2(711-740) 및 a3(1649-1689)이 있다. 산성 영역 a3은 혈액 응고에 중요한 역할을 하는 폰빌레브란트인자(vWF)로의 인자 VIII 분자의 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. 분비 동안 FVIII은 B-도메인과 a3 산성 영역 사이에서 절단되며, 그 결과 헤테로이량체 폴리펩타이드가 생성된다. 인자 VIII 헤테로이량체는 경쇄(A3, C1 및 C2를 포함)와 크기가 가변적인 중쇄(A1, A2와 B를 포함)로 이루어진다. 중쇄는 B-도메인내에서의 제한적인 단백질분해로 인해 이질성이다. 헤테로이량체 B-도메인 결실된 작제물의 경우에 "중쇄"는 A1과 A2를 포함하지만 B-도메인이 일부 또는 전부 결실된다.

사람 혈액 응고 인자 VIII의 성숙 야생형 형태의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸다. 특정 서열의 아미노산 위치에 대한 참조 번호는 FVIII 야생형 단백질내에서의 해당 아미노산 위치를 의미하며 언급되는 서열내의 다른 위치에서 돌연변이(예: 결실, 삽입 및/또는 치환)의 존재를 배제하지 않는다. 예를 들면, 서열번호 2에 관한 "Glu2004"에서의 돌연변이는 변형 동족체에서 서열번호 2의 위치 1 내지 2332에 있는 1개 이상의 아미노산이 결실됨을 배제하지 않는다. 서열번호 2의 암호화 DNA 서열은 서열번호 1에 해당한다.

"혈액 응고 인자 VIII"은 야생형 혈액 응고 인자 VIII 뿐만 아니라 야생형 혈액 응고 인자 VIII의 응고촉진 활성을 갖는 야생형 혈액 응고 인자 VIII의 유도체를 포함한다. 유도체는 야생형 인자 VIII의 아미노산 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 부가를 가질 수 있다. 바람직한 유도체는 B-도메인의 전부 또는 일부가 결실된 FVIII 분자이다. 본원 전반에 표기된 아미노산 위치는 항상 전장 성숙(즉, 시그날 펩타이드 절단 후) 야생형 FVIII에서의 개개 아미노산의 위치를 가리킨다.

용어 "인자 VIII"은 야생형 인자 VIII의 생물학적 활성을 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상 나타내는 모든 인자 VIII 변이체 또는 돌연변이체를 포함한다. 인자 VIII의 생물학적 활성을 측정하는데 적합한 검사는 1 단계 또는 2 단계 응고 분석[참조: Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992] 또는 발색 기질 FVIII:C 분석[참조: S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, suppl.]이다. 이들 문헌의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다.

비제한적인 예로서, 인자 VIII 분자는 APC 절단을 방지 또는 감소시키는 인자 VIII 돌연변이체[참조: Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563], 알부민-융합된 FVIII 분자(WO 2011/020866 A2), FVIII-Fc 융합 분자(WO 04/101740 A), A2 도메인을 추가로 안정화하는 인자 VIII 돌연변이체(WO 97/40145), 발현 증가를 제공하는 FVIII 돌연변이체[참조: Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124], 면역원성이 감소된 인자 VIII 돌연변이체[참조: Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508], 상이하게 발현된 중쇄와 경쇄로부터 재구성된 FVIII[참조: Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100], HSPG(헤파란 설페이트 프로테오글리칸) 및/또는 LRP(저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질)와 같은 FVIII의 이화작용을 유도하는 수용체와의 결합을 감소시키는 FVIII 돌연변이체[참조: Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257], 디설파이드 결합-안정화된 FVIII 변이체[참조: Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322], 분비 특성이 향상된 FVIII 돌연변이체[참조: Miao et al., 2004. Blood 103:3412-3419], 보조인자 특이 활성이 증가된 FVIII 돌연변이체[참조: Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298-304], 향상된 생합성 및 분비, 감소된 ER 차페론(chaperon) 상호작용, 향상된 ER-골지 수송, 증가된 활성화 또는 불활성화에 대한 저항성(resistance to inactivation) 및 향상된 반감기를 갖는 FVIII 돌연변이체[참조 문헌에 요약됨: Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237] 및 B-도메인의 전부 또는 일부가 결실된 FVIII 돌연변이체[참조: WO　2004/067566　A1, WO　02/102850　A2, WO　00/24759　A1 및 미국 특허 제4,868,112호]를 포함한다. 이들 인자 VIII 돌연변이체 및 변이체에 관한 모든 문헌은 이의 전체 내용이 본원에 인용에 의해 포함된다.

용어 "단일쇄 인자 VIII"은 상기 FVIII 분자를 발현하는 세포로부터 분비되는 동안 단백질분해에 의해 두 쇄(예: 중쇄와 경쇄)로 절단되지 않고, 이에 따라, 단일 폴리펩타이드 쇄로 존재하는 인자 VIII 분자를 의미한다.

절단 방지

본 발명의 방법은 인자 VIII 분자가 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해 절단되는 것을 방지하는 것을 포함한다. 용어 "단백질분해 절단되는 것을 방지하는"은 단백질분해 절단을 부분적으로 방지하는 것 및 단백질분해 절단을 완전히 방지하는 것을 포함한다. 또한, 이 용어는 "단백질분해 절단을 감소시키는"의 양태를 포함한다. 다시 말해서, "인자 VIII 분자의 단백질분해 절단을 방지하는"은 숙주 세포에 의해 발현되고 분비되는 인자 VIII 분자 거의 100%가 단일쇄 분자가 되도록 하는 모든 단백질분해적 절단의 완전한 폐지를 요구하는 것은 아니다(그러나, 이러한 양태도 본 발명의 방법에 속한다). 보통, 인자 VIII 분자의 단백질분해 절단은 숙주 세포에 의해 발현되고 분비되는 인자 VIII 분자중 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 단일쇄 분자가 되도록 하는 방식으로 방지된다. 절단의 불완전한 방지는 적어도 부분적으로는, 주요한(major) 절단 부위(R1313 및 R1648에서)가 존재하지 않더라도 인자 VIII 분자의 작은 부위의 단백질분해적 절단을 야기할 수 있는 B 도메인내 일부 부수적인(minor) 절단 부위가 있을 수 있다는 사실에 기인할 수 있다. 이와 같은 부수적인 절단은 본 발명에 따라 방지될 수도 있고 방지되지 않을 수도 있다.

제1 절편은 필수적으로 인자 VIII의 A1 도메인과 A2 도메인을 포함한다. 제1 절편은, 각 도메인이 상기된 아미노산 서열을 정확하게 갖는, A1 도메인과 A2 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제1 절편은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 최소한 아미노산 1 내지 740을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 절편은 인자 VIII 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 결실, 치환 및/또는 삽입을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 제1 절편은 추가로 인자 VIII의 B 도메인의 N-말단 부분을 포함할 수 있다.

제2 절편은 필수적으로 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 포함한다. 제2 절편은, 각 도메인이 상기된 아미노산 서열을 정확하게 갖는, A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제2 절편은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 중 최소한 아미노산 1690 내지 2332를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 절편은 인자 VIII 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 결실, 치환 및/또는 삽입을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 제2 절편은 추가로 산성 a3 영역의 C-말단 부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 재조합에 의해 발현된 FVIII 분자의 분비 동안 헤테로이량체(2개-쇄) 폴리펩타이드를 생성하는 단백질분해 절단을 방지하는 것을 포함한다. 즉, 상기 방법은 단일쇄 인자 VIII 분자를 수득하는 것을 포함한다. 이것은 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들면, 성숙 1개 쇄 FVIII가 숙주 세포에 의해 궁극적으로 분비되는 헤테로이량체 FVIII로의 세포내 프로세싱에 연관된 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 방법이다.

한 가지 양태에서, Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계는 프로테아제에 대한 인식 서열을 형성하는 한 개 이상의 아미노산을 결실시키는 것을 포함한다. 잔기 1648 다음에서의 절단 부위는 퓨린형 절단 부위이다. 인자 VIII 서열에서의 프로테아제 인식 서열은 LKRHQR이다. 바람직하게는, 불활성화 단계는 인식 서열을 형성하는 상기 아미노산 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상을 결실시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 불활성화 단계는 인식 서열내에서 최소한 한 개의 염기성 아미노산을 결실시키는 것을 포함하고, 보다 바람직하게는, 불활성화 단계는 최소한 위치 1648의 아르기닌을 결실시키는 것을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 불활성화 단계는 인자 VIII 서열에서 최소한 아미노산 1643 내지 1648을 결실시키는 것을 포함한다. 만일 각각의 FVIII 유도체가 Arg1313을 포함하는 경우, 불활성화 단계는 또한 최소한 위치 Arg1313의 아르기닌을 결실시키는 것을 포함한다. 또한 바람직한 것은 인자 VIII 서열에서 최소한 아미노산 1313 내지 1648을 결실시켜 각각 1313과 1648 다음에서의 절단 부위를 모두 불활성화시키는 것이다.

가장 바람직하게는, 불활성화 단계는 인자 VIII 서열로부터 최소한 잔기 800 내지 1648의 아미노산 서열, 예를 들면, 인자 VIII 서열로부터 잔기 741 내지 1648의 아미노산 서열을 결실시키는 것을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 인자 VIII 서열의 위치 741 내지 1647에 있는 아미노산들로부터 선택된 제1 아미노산이, 인자 VIII 서열의 위치 1649 내지 1690에 있는 아미노산들로부터 선택된 제2 아미노산과 융합되며, 이에 따라, 분비 동안 단백질분해 절단이 방지된다. 바람직한 결실은 아래와 같다:

- 아미노산 740이 아미노산 1650과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 741 내지 1649가 결실된다;

- 아미노산 740이 아미노산 1690과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 741 내지 1689가 결실된다;

- 아미노산 740이 아미노산 1669와 융합되고, 이에 따라, 아미노산 741 내지 1668이 결실된다;

- 아미노산 743이 아미노산 1650과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 744 내지 1649가 결실된다;

- 아미노산 764가 아미노산 1650과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 765 내지 1649가 결실된다;

- 아미노산 764가 아미노산 1653과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 765 내지 1652가 결실된다;

- 아미노산 764가 아미노산 1656과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 765 내지 1655가 결실된다;

- 아미노산 745가 아미노산 1650과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 746 내지 1649가 결실된다;

- 아미노산 745이 아미노산 1653과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 746 내지 1652가 결실된다;

- 아미노산 745가 아미노산 1656과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 746 내지 1655가 결실된다;

- 아미노산 757이 아미노산 1650과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 758 내지 1649가 결실된다;

- 아미노산 757이 아미노산 1653과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 758 내지 1652가 결실된다;

- 아미노산 757이 아미노산 1656과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 758 내지 1655가 결실된다;

- 아미노산 793이 아미노산 1649와 융합되고, 이에 따라, 아미노산 794 내지 1648이 결실된다;

- 아미노산 793이 아미노산 1690과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 794 내지 1689가 결실된다;

- 아미노산 747이 아미노산 1649와 융합되고, 이에 따라, 아미노산 748 내지 1648이 결실된다;

- 아미노산 751이 아미노산 1649와 융합되고, 이에 따라, 아미노산 752 내지 1648이 결실된다;

- 아미노산 776이 아미노산 1649와 융합되고, 이에 따라, 아미노산 777 내지 1648이 결실된다;

- 아미노산 770이 아미노산 1667과 융합되고, 이에 따라, 아미노산 771 내지 1666이 결실된다.

결실에 의해 생성된 분자들은 보통 단일쇄 인자 VIII 분자의 형태로 수득된다.

바람직한 단일쇄 FVIII 분자는 B-도메인의 전부 또는 일부 및 산성 a3 영역의 전부 또는 일부가 결실된 것으로, 그 결과 보통 분비 동안 절단되는 Arg1648의 절단 부위가 결실된다. 단일쇄 FVIII 분자는, 예를 들면, 문헌[참조: WO　2004/067566　A1; US　2002/132306 A1; Krishnan et al. (1991) European Journal of Biochemistry vol. 195, no. 3, pages 637-644; Herlitschka et al. (1998) Journal of Biotechnology, vol. 61, no. 3, pages 165-173; 및 Donath et al. (1995) Biochem. J., vol. 312, pages 49-55]에 기술되어 있다. 이들 문헌에 기술된 단일쇄 인자 VIII 분자들은 본원에 인용에 의해 포함된다.

상기된 융합체들은 직접 융합체 또는 간접 융합체일 수 있다. 간접 융합체의 경우, 결실된 아미노산은 이종 스페이서로 대체된다. 이 양태는 아래에서 좀 더 자세히 설명된다. 결실된 아미노산은 약 1개 내지 약 500개의 아미노산 또는 약 2개 내지 250개의 아미노산 또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산 또는 약 4개 내지 약 50개의 아미노산 또는 약 5개 내지 약 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커로 대체시키는 것이 가능하다. 펩타이드 링커는 유연성이고 비면역원성이어야 한다[참조: Robinson et al.; PNAS (1998), Vol 95, p5929]. 펩타이드 링커는 아미노산 서열 GlyGlySer 또는 GlyGlySerSer 또는 이의 임의의 조합의 다량체를 통해 Gly의 N-말단에 결합된 Gly으로 이루어질 수 있으며, 특정 양태에서, 펩타이드 링커는 80 내지 120개의 아미노산으로 이루어진다.

대안적으로, 잔기 1313 및 1648에서 프로테아제 인식 부위를 형성하는 한 개 이상의 아미노산은 절단이 일어나지 않도록 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들면, 염기성 아미노산은 소수성 아미노산으로 대체될 수 있다.

단일쇄 인자 VIII의 제조

"단백질분해 절단을 방지하는" 또는 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는" 단계는 인자 VIII의 정제, 동결건조 및 재구성 전에 수행한다. "단백질분해 절단을 방지하는" 또는 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는" 단계는 전형적으로 인자 VIII 분자의 제조 동안 수행한다. 본 발명의 방법은 인자 VIII 분자의 발현(숙주 세포내에서) 동안 단백질분해 절단을 방지하는 것 또는 인자 VIII 분자를 암호화하는 핵산의 제조 동안 Arg1313 및/또는 Arg1648의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 것을 포함할 수 있다.

이러한 "단백질분해 절단을 방지하는" 또는 "단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는" 단계는 상기된 양태에 따라 인자 VIII을 암호화하는 핵산으로부터 Arg1313 및/또는 Arg1648의 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 부위를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 이 결과 전형적으로 단일쇄 인자 VIII을 암호화하는 핵산이 생성된다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 추가로 단일쇄 인자 VIII을 암호화하는 핵산을 예를 들면, 발현 플라스미드 또는 벡터에 제공하는 단계를 포함할 수 있다.

이어서, 핵산, 발현 벡터 또는 발현 플라스미드는 발현을 위해 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 추가로 변형 인자 VIII 분자(예: 단일쇄 인자 VIII 분자)가 발현되도록 하기에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 임의로 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 변형 인자 VIII 분자를 회수하는(예: 정제하는) 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인자 VIII을 암호화하는 핵산을 조작하고, 포유동물 세포를 배양하여 인자 VIII을 발현시키며, 세포 배양 배지로부터 인자 VIII을 정제하는 기술은 당해 기술 분야에 공지된 것이다.

단일쇄 인자 VIII 분자는 80% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하고, 보다 바람직한 순도는 95% 이상이며, 특히 바람직한 것은 거대분자, 특히 다른 단백질 및/또는 핵산 오염에 대해 순도 99.9% 이상이고 감염성 및 발열성 물질이 없는 약제학적 순수 상태이다. 바람직하게는, 분리된 또는 정제된 변형된 인자 VIII 분자는 다른 폴리펩타이드가 실질적으로 존재하지 않는다.

본 발명의 방법은 추가로 단일쇄 인자 VIII을 정제, 동결건조 및 재구성하는 단계를 포함할 수 있다. 재구성은 바람직하게는 물(예: 주사용수)을 사용하여 수행한다.

안정성

본 발명에 따라 제조된 인자 VIII 분자는 전장 인자 VIII 및/또는 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어지는 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)에 비하여 증가된 안정성을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "안정성"은 수용액 중에서의 안정성을 가리키며, 바람직하게는 인자 VIII 동결건조 제제의 재구성 후, 예를 들면, 물을 인자 VIII 동결건조 제제에 첨가하여 재구성한 후 수용액 중에서의 안정성을 가리킨다. 전형적으로, 인자 VIII 동결건조 제제는 "주사용수"로 재구성한다.

수용액 중에서의 안정성은 인자 VIII 분자를 수용액에 제공하고 이를 특정 시간동안 항온배양함으로써 측정할 수 있다. 바람직한 양태에서, 인자 VIII 분자의 저장 안정성을 측정하는 조건은 다음과 같다:

인자 VIII 분자는 아래의 조성을 갖는 수용액 중에 제공된다:

L-히스티딘 25 mM

NaCl 225 mM

염화칼슘 4 mM

Tween^® 80 0.03%(w/w)

수크로즈 2%(w/w)

D-만니톨 8%(w/w)

pH 7.0

상기 용액은 이하에서 "완충액 A"라고 한다. 수용액 중에서의 인자 VIII 초기 활성은 바람직하게는 100 IU/ml 내지 1,500 IU/ml이고, 바람직하게는 100 IU/ml이다.

이어서, 앞서 제조된 인자 VIII 용액은 25℃에서 24시간 이상, 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 5일 이상, 가장 바람직하게는 7일 또는 8일간 항온배양할 수 있다. 항온배양 기간 후 안정성은 용액 중의 인자 VIII 활성을 측정함으로써, 바람직하게는 발색 기질 분석(예: Coamatic® Factor VIII, Chromogenix)을 사용함으로써 측정한다. 초기 활성에 비해 활성 손실이 적으면 적을 수록 인자 VIII 분자의 안정성은 더 높은 것이다. 가장 바람직하게는, 안정성은 아래 실시예 1 또는 2에서와 같이 측정한다.

본 발명에 따르면, 상기된 조건하에서 7일간의 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 활성 손실은 15% 미만, 바람직하게는 12% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만이다.

전형적으로, 항온배양 시작 시점(t=0)의 인자 VIII 초기 활성은 100%로 정규화된다. 25℃에서 완충액 A중에서 24시간 저장 후 인자 VIII의 잔여 활성은 바람직하게는 인자 VIII 초기 활성의 95% 이상이다. 25℃에서 완충액 A중에서 48시간 저장 후 인자 VIII의 잔여 활성은 바람직하게는 인자 VIII 초기 활성의 95% 이상이다. 25℃에서 완충액 A중에서 4일간 저장 후 인자 VIII의 잔여 활성은 바람직하게는 인자 VIII 초기 활성의 90% 이상이고, 보다 바람직하게는 인자 VIII 초기 활성의 95% 이상이다. 25℃에서 완충액 A중에서 7일간 저장 후 인자 VIII의 잔여 활성은 바람직하게는 인자 VIII 초기 활성의 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 25℃에서 완충액 A중에서 8일간 저장 후 인자 VIII의 잔여 활성은 바람직하게는 인자 VIII 초기 활성의 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.

단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 보통 2개-쇄 인자 VIII 분자의 잔여 활성보다 더 높다(두 분자가 동일한 조건하에 동일한 시간동안 항온배양되었다는 가정하에).

용어 "사람 전장 2개-쇄 인자 VIII"은 본원에서 용어 "사람 야생형 인자 VIII"과 상호교환적으로 사용된다.

한 가지 양태에서, 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 사람 전장 2개-쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성보다 더 높다. 또다른 양태에서, 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어진 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)의 인자 VIII 잔여 활성보다 더 높다.

바람직하게는, 25℃에서 완충액 A중에서 48시간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 사람 전장 2개-쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성보다 4% 포인트 이상 더 높다. 또한, 바람직하게는 25℃에서 완충액 A중에서 48시간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어진 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)의 인자 VIII 잔여 활성보다 4% 포인트 이상 더 높다.

또다른 양태에서, 25℃에서 완충액 A중에서 4일간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 사람 전장 2개-쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성보다 5% 포인트 이상 더 높다. 또한, 바람직하게는 25℃에서 완충액 A중에서 4일간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어진 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)의 인자 VIII 잔여 활성보다 5% 포인트 이상 더 높다.

또다른 양태에서, 25℃에서 완충액 A중에서 7일간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 사람 전장 2개-쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성보다 5% 포인트 이상, 바람직하게는 10% 포인트 이상 더 높다. 또한, 바람직하게는 25℃에서 완충액 A중에서 7일간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어진 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)의 인자 VIII 잔여 활성보다 5% 포인트 이상, 바람직하게는 10% 포인트 이상 더 높다.

또다른 양태에서, 25℃에서 완충액 A중에서 8일간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 사람 전장 2개-쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성보다 5% 포인트 이상, 바람직하게는 10% 포인트 이상 더 높다. 또한, 바람직하게는 25℃에서 완충액 A중에서 8일간 저장 후 단일쇄 인자 VIII의 인자 VIII 잔여 활성은 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어진 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)의 인자 VIII 잔여 활성보다 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상 더 높다.

완충액 A를 대신하여 다른 완충액이 또한 사용될 수 있으며, 이러한 예로는 본 발명의 실시예 2에서 사용된 완충액을 들 수 있다.

본 발명의 완충액이 갖는 바람직한 pH 범위는 5.5 내지 9.09이고, 보다 바람직한 pH 범위는 6.0 내지 8.5이며, 특히 바람직한 pH 범위는 6.5 내지 8.0이다.

인자 VIII의 활성은 발색 또는 응고 분석이나 임의의 다른 생물학적 분석으로 측정할 수 있다. 바람직하게는, 인자 VIII 활성은 아래 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정한다.

생체이용률

다른 양태에서, 본 발명에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는, 2개-쇄 사람 야생형 인자 VIII 또는 2개-쇄 사람 B-도메인 결실된 인자 VIII에 비하여, 비정맥내 주사 후 향상된 생체이용률을 나타낸다. 비정맥내 주사는 바람직하게는 피하, 경피 또는 근육내 주사이다. 가장 바람직한 비정맥내 주사는 피하 주사이다.

본원에 사용된 용어 "생체이용률"은 인자 VIII 또는 FVIII-관련 제제의 피하, 정맥내 또는 피내 투여 후 최종 시점까지 소정의 시점에서 혈장 중에서 검출할 수 있는 상기 투여 용량의 비율을 가리킨다. 전형적으로, 생체이용률은 시험 동물에 10 IU/kg 내지 1000 IU/kg 용량의 제제(예: 체중 kg 당 400 IU)를 투여하고; 투여 후 소정의 시점에서 혈장 시료를 획득하며; 발색 분석 또는 응고 분석(또는 이의 생물학적 분석), 면역분석 또는 이의 균등분석중 하나 이상을 이용하여 상기 혈장 시료 중의 인자 VIII 또는 인자 VIII-관련 폴리펩타이드의 함량을 결정하여 측정한다. 생체이용률은 혈장 중의 응고 인자 농도 또는 활성인 y축과 투여 후 소정의 최종 시점까지의 투여 후 경과 시간인 x축에 의한 곡선하면적(AUC)으로 산출된다. 상기 소정의 시점은 투여 후 72시간 또는 48시간이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 생체이용률은 아래 실시예 3에 기술된 바와 같이 측정한다. 시험 제제의 상대적 생체이용률은 시험 제제(즉, 단일쇄 인자 VIII)의 AUC와 이 시험 제제와 동일한 용량과 방식(예: 정맥내, 피하 또는 피내)으로 투여된 기준 제제(예: 전장 재조합 2개-쇄 인자 VIII 또는 2개-쇄 B-도메인 결실된 인자 VIII)의 AUC간의 비율을 가리킨다.

본 발명에 따르면, 피하 주사 후 단일쇄 인자 VIII의 생체이용률은 2개-쇄 사람 야생형 인자 VIII 또는 2개-쇄 사람 B-도메인 결실된 인자 VIII의 생체이용률보다 더 높다. 바람직하게는, 생체이용률(피하 주사 후 72시간 동안의 AUC)은 야생형 FVIII에 비하여, 10% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 보다 더 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상 증가한다. 다른 양태에서, 생체이용률(피하 주사 후 72시간 동안의 AUC)은 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자(즉, 필수적으로 서열번호 2의 아미노산 1-745와 1640-2332로 이루어진 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자)에 비하여 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 더 바람직하게는 30% 이상, 가장 바람직하게는 40% 이상 증가한다.

혈장 반감기(생체내)의 향상

다른 양태에서, 본 발명에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 증가된 약동학적(PK) 파라미터를 나타낸다.

본 발명의 인자 VIII 분자는, 예를 들면, 발색 분석으로 측정하는 것과 같이, 예를 들면, 각각 100 IU/kg 또는 250 IU/kg의 용량을 A형 혈우병 마우스 또는 시노몰구스 원숭이와 같은 다른 종에 정맥내 주사하여 시험할 수 있다. 채혈은 투여 후 여러 시점에서 실시하며, 예를 들면, A형 혈우병 마우스의 경우 72시간까지, 시노몰구스 원숭이의 경우 24시간까지 실시한다. 채혈 즉시 시트레이트 혈장을 준비하고 예를 들면, 발색 분석 시스템(FVIII:C)(Chromogenix - Instrumentation Laboratory SpA, Milan, Italy)으로 FVIII:C를 정량화하는데 사용한다.

FVIII 혈장 농도의 AUC는 선형 사다리꼴 공식으로 계산하여 AUC_last값(t=0부터 최종시점까지의 관찰)을 산출한다. 최종반감기(t_1/2β)는 수정 R2 기준에 의해 선정된 최종 단계의 시점을 사용하여 로그선형회귀 분석으로 측정한다(최종 단계의 회귀 모델을 사용하여 외삽한 t=0부터 무한대까지의 AUC).

본 발명에 따른 단일쇄 FVIII 분자는 동일한 용량과 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 60% 이상 증가된 최종반감기를 나타낸다.

바람직하게는 혈장 반감기는 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정한다.

트롬빈 생성 검정에 의해 측정된 효능 연장(생체내)

또다른 양태에서, 본 발명에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서 트롬빈 생성 분석에 의해 산출된 결과로서 트롬빈 피크 농도가 50 nM 이하로 감소하는데 걸리는 시간이, 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 더 긴 것으로 나타난다. 이 시험은 또한 FVIII의 작용성이 본 발명에 따른 분자내에서 안정화된다는 것을 보여준다.

본 발명에 따른 FVIII 분자는 먼저 이 분자를 A형 혈우병 마우스에 등몰 용량(예: 250 IU/kg)으로 정맥내 투여하여 시험할 수 있다. 여러 다른 시점(예: 1일부터 8일까지 매일)에서 채혈하여 시트레이트를 첨가하고 트롬빈 생성 검정(TGA)을 예컨대 인지질(예: Rossix, Molndal, Sweden)/Pathromtin^®SL(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)(1:30)의 존재하에 고유 활성화 후 보정 트롬빈분석(CAT)(Thrombinoscope, Netherlands)으로 실시한다. 트롬빈 피크 농도가 기록된다. 1일부터 8일까지의 트롬빈 피크 농도의 평균 AUC값은 선형 사다리꼴 공식으로 계산한다. 두 인자 VIII 산물의 AUC는 시점과 처치 그룹마다 가변분산을 갖는 선형 모델에서 AUC 차이를 근사 F-검정으로 비교하여 트롬빈 피크 농도가 50 nM의 정의된 허용 범위 이하로 감소할 때까지의 예정시간을 수득한다.

바람직하게는, 트롬빈 생성 검정에서의 효능은 실시예 6에 기술된 바와 같이 측정한다.

A형 혈우병 마우스에서 scFVIII은 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 보다 양호한 지혈 활성을 나타낸다. 이는 트롬빈 피크 농도가 50 nM이하로 감소하기 전에 트롬빈 생성 활성 값이 전장 rFVIII에 비하여 scFVIII이 평균 10시간 이상, 바람직하게는 15시간 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20시간 이상 더 긴 것으로 해석된다.

혈장 중에서 보다 높은 FVIII:C 활성의 보존(생체외)

다른 양태에서, 본 발명에 따라 안정화된 인자 VIII 분자는 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 1-단계 FVIII:C 분석에 의해 측정하여, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 보다 높은 활성을 보존하며; 바람직하게는, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 인자 VIII의 보존된 활성이, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 사람 야생형 인자 VIII의 보존된 활성에 비하여, 10% 이상 더 높은 것이다.

본 발명에 따른 인자 VIII 분자를 포함한 시료는 이를 FVIII 결핍 혈장(예: Siemens Healthcare Diagnostics의 제품)으로 1 IU/mL FVIII:C(발색 기질 검정에 의해 측정된 값을 기준으로)으로 희석시켜 시험할 수 있다. 이어서, FVIII-시료는 0.05% Na-아지드의 존재하에 다양한 시간 동안(예: 0, 0.25, 1, 2, 4 및 8일) 37℃에서 항온배양한다. 각각의 항온배양 시간 후에, FVIII:C는 1-단계 응고 분석에 의해, 예를 들면, 활성화제로서 Pathromtin-SL(Siemens Healthcare Diagnostics)을 사용하여 측정하고, t=0에서의 값(FVIII:C의 %)으로 정규화한 다음, 항온배양 시간에 대해 플로팅한다.

37℃에서 4일간 항온배양 후 본 발명의 인자 VIII 분자는 10% 이상 더 높은 FVIII:C 활성, 바람직하게는 15% 이상 더 높은 FVIII:C 활성, 바람직하게는 20% 이상 더 높은 FVIII:C 활성, 바람직하게는 25% 이상 더 높은 FVIII:C 활성, 바람직하게는 30% 이상 더 높은 FVIII:C 활성을 보존하였다.

바람직하게는, 혈장 중의 활성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정한다.

치료 및 예방

재구성 후 안정성이 증가된 본 발명의 단일쇄 인자 VIII 작제물은 출혈성 장애의 치료 또는 예방을 위해 투여할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "출혈성 장애"는 가족성 또는 후천성 A형 또는 B형 혈우병, 가족성 또는 후천성 폰빌레브란트병, 가족성 또는 후천성 임의의 응고인자 결핍증; 단일 기관, 골조각 또는 다중외상에 의한 대출혈을 일으키는 모든 유형의 외상, 둔상 또는 관통성 외상; 수술중출혈 또는 수술후출혈을 포함한 외과수술시 출혈; 소아심장수술시 체외순환 및 혈액희석중인 환자를 포함한 심장수술 원인성 출혈; 뇌내출혈, 지주막하출혈, 경막하 또는 경막상 출혈; 환자체내 응고인자 농도의 감소를 유발하는 비-혈장량 대체에 의한 실혈 및 혈액희석 원인성 출혈; 파종성혈관내응고증(DIC) 및 소모응고병증, 혈소판 기능장애, 결손 및 응고장애 원인성 출혈; 간경변증, 간기능장애 및 전격성간부전, 간 질환 환자의 간생검 원인성 출혈; 간 및 다른 기관 이식 후 출혈; 위정맥류 출혈 및 소화성궤양 원인성 출혈; 기능이상성자궁출혈(DUB) 및 태반조숙박리와 같은 부인과출혈; 저체중출생아의 뇌실주위출혈, 분만후출혈, 신생아의 치명적 고통, 화상 연관성 출혈; 아밀로이드증 연관성 출혈, 혈소판 질환 연관성 조혈모세포 이식, 악성 종양 연관성 출혈, 출혈성 바이러스 감염증, 췌장염 연관성 출혈을 포함한다.

약제학적 제제의 성분은 통상적인 생리학적으로 적합한 완충수용액 중에 용해시키고 여기에 임의로 약제학적 부형제를 첨가하여 약제학적 제제를 제공할 수 있다. 약제학적 제제의 성분은 사전에 모든 필요한 생리학적으로 적합한 약제학적 부형제를 함유할 수 있고, 주사용수에 용해시켜 약제학적 제제를 제공할 수 있다.

이와 같은 약제학적 담체 및 부형제 뿐만 아니라 적합한 약제학적 제형의 제법은 당업계에 잘 알려져 있다[참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3^rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)]. 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 증량제, 완충제 또는 안정화제와 같은 첨가제를 한 가지 이상 포함할 수 있다. 표준 약제학적 제형화 기술은 당해 기술 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다[참조: 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000]. 적합한 약제학적 첨가제로는, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨, 락토즈, 수크로즈, 트레할로즈 등과 같은 당, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 트레오닌, 글루탐산, 아스파트산, 글루타민, 아스파라긴, 페닐알라닌 등과 같은 아미노산, 염화나트륨 또는 다른 염과 같은 등장조건 부여 첨가제, 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 염화칼슘 등과 같은 안정화제, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 등과 같은 생리학적 pH 완충제가 포함된다. 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 pH 완충제 및 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다. 추가의 양태에서, 조성물은 보존제 또는 안정화제를 함유할 수 있다. 특히, 혈액 응고 인자를 함유한 약제학적 제제는 동결건조 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 혈액 응고 인자는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조 제형은 사용전에 멸균주사용수 또는 멸균생리식염수 또는 적합한 완충액과 같은 한 가지 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제의 첨가에 의해 재구성된다.

본 발명의 약제학적 제제에 함유된 조성물(들)은 임의의 약제학적으로 적합한 수단에 의해 개체에게 전달될 수 있다. 여러 가지 전달 시스템이 알려져 있고 편리한 임의의 경로에 의해 조성물을 투여하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 제제에 함유된 조성물(들)은 비정맥내 주사에 의해 개체에게 전달된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물(들)은 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비내, 피내 또는 경피 투여용으로 제형화되고, 가장 바람직하게는 통상적인 방법에 따른 피하, 근육내 또는 경피 투여용으로 제형된다. 제제는 연속적으로 주입에 의해 또는 볼러스(bolus) 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방출 시스템을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 제제의 조성물(들)은 치료학적 유효 용량, 즉 목적하는 효과를 제공하기에 충분한 용량으로서 견딜수 없는 유해한 부작용을 유발하는 용량에 이르지 않고 치료되는 상태 또는 징후의 중증 또는 확산을 예방 또는 경감시키는 용량으로 환자에게 투여된다. 정확한 용량은 징후, 제형, 투여방식 등과 같은 많은 요소에 의해 좌우되며 각 개별 징후에 따라 임상전 실험 및 임상 실험에서 측정되어야 한다.

본 발명의 한 가지 양태에서, 처치된 대상자의 응고인자의 혈장 농도는 주사 후 5시간부터 비정맥내 주사 후 8시간의 기간 동안 건강한 대상자의 정상적인 응고인자 혈장 농도보다 2% 이상 더 높게, 바람직하게는 5% 이상 더 높게, 보다 바람직하게는 8% 이상 더 높게, 가장 바람직하게는 10% 이상 더 높게 지속된다. 혈장 농도는 아래 실시예 3에 기술된 바와 같이 측정된다.

본 발명의 한 가지 양태에서, 처치된 대상자의 응고인자 혈장 농도는 주사 후 4시간부터 비정맥내 주사 후 16시간의 기간 동안 건강한 대상자의 정상적인 응고인자 혈장 농도보다 2% 이상 더 높게, 바람직하게는 5% 이상 더 높게, 보다 바람직하게는 8% 이상 더 높게, 가장 바람직하게는 10% 이상 더 높게 지속된다

본 발명의 다른 양태에서, 처치된 대상자의 응고인자 혈장 농도는 주사 후 3시간부터 비정맥내 주사 후 24시간의 기간 동안 건강한 대상자의 정상적인 응고인자 혈장 농도보다 2% 이상 더 높게, 바람직하게는 4% 이상 더 높게, 보다 바람직하게는 6% 이상 더 높게, 가장 바람직하게는 8% 이상 더 높게 지속된다

본 발명의 다른 양태에서, 처치된 대상자의 응고인자 혈장 농도는 주사 후 2시간부터 비정맥내 주사 후 32시간의 기간 동안 건강한 대상자의 정상적인 응고인자 혈장 농도보다 2% 이상 더 높게, 바람직하게는 3% 이상 더 높게, 보다 바람직하게는 4% 이상 더 높게, 가장 바람직하게는 5% 이상 더 높게 지속된다

바람직하게는, 단일쇄 인자 VIII의 1회 비정맥내 주사 용량은 체중 kg당 1,000 IU 미만이거나, 체중 kg당 800 IU 미만이거나, 체중 kg당 600 IU 미만이거나, 체중 kg당 400 IU 미만이고, 예를 들면, 체중 kg당 약 10 IU 내지 체중 kg당 약 1,000 IU, 체중 kg당 약 20 IU 내지 체중 kg당 약 800 IU, 체중 kg당 약 30 IU 내지 체중 kg당 약 700 IU, 체중 kg당 약 40 IU 내지 체중 kg당 약 600 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 500 IU, 체중 kg당 약 75 IU 내지 체중 kg당 약 400 IU, 체중 kg당 약 100 IU 내지 체중 kg당 약 300 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 1,000 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 800 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 700 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 600 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 500 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 400 IU, 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 300 IU 또는 체중 kg당 약 50 IU 내지 체중 kg당 약 200 IU이다. FVIII은 그 자체로 투여되거나 VWF와의 복합체로서 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물(들)은 단독으로 투여되거나 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 다른 치료제들은 동일 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.

실시예

실시예 1 : 정제된 인자 VIII 분자의 재구성 후의 안정성

본 실시예에서는 다음과 같은 인자 VIII 제제가 사용되었다:

베리에이트^®(Beriate)(사람 응고 인자 VIII 동결건조 농축제)는 CSL Behring GmbH로부터 입수하였다. 베리에이트^®는 헤테로이량체 형태의 혈장 유래 인자 VIII을 포함한다.

헬릭세이트^®(Helixate)(재조합 응고 인자 VIII 동결건조 제제)는 CSL Behring GmbH로부터 입수하였다. 헬릭세이트^®는 재조합 기술에 의해 생성된 헤테로이량체 인자 VIII을 함유한다.

레팍토^®(ReFacto)는 재조합 기술에 의해 생성된 헤테로이량체 B-도메인 결실된 인자 VIII을 함유한 인자 VIII 동결건조 제제이다. 이는, 예를 들면, Pfizer Pharma GmbH(독일)로부터 입수할 수 있다.

베리에이트®, 헬릭세이트® 및 레팍토®는 대부분 헤테로이량체 2개-쇄 폴리펩타이드이다.

"scFVIII"으로 명명된 작제물은 포유동물 세포 배양물에서 재조합 발현에 의해 생성된 단일쇄 인자 VIII이다. 본 실시예에서 사용된 단일쇄 인자 VIII은 Asn764를 Thr1653과 직접 융합시킴으로써 수득되었고 정제 후 동결건조 형태로 제공되었다. 즉, "scFVIII"은 실질적으로 서열번호 2의 아미노산 1-764와 1653-2332로 구성된 단일쇄 폴리펩타이드이다.

베리에이트^®, 헬릭세이트^® 및 레팍토^®는 제조사의 사용설명서(package insert)에 포함된 지침에 따라 재구성하였다. "scFVIII"은 정제되고 동결건조된 FVIII 제제를 25 mM L-히스티딘, 225 mM NaCl, 4 mM CaCl₂, 0.03% 트윈(Tween) 80, 2% 수크로즈, 8% D-만니톨, pH 7.0이 함유된 주사용수중에 용해시켜 조성물로 재구성하였다.

FVIII 재구성된 산물을 25℃에서 항온배양하였다. 이의 FVIII 활성은 발색 기질 분석(Coamatic® Factor VIII, Chromogenix)에 의해 0시, 6시, 1일, 2일, 4일 및 7일의 시점에서 중복 측정하였다. 활성값은 시점 0에 대해 정규화하였다.

아래 표 1 및 도 1은 결과를 보여준다.

표 1: 경과 시간에 따른 인자 VIII 활성

상기 결과에서 확인할 수 있듯이, "scFVIII"은 가장 낮은 활성 손실을 나타내며, 결과적으로 가장 안정한 인자 VIII 분자이다.

실시예 2 : 정제된 인자 VIII 분자의 재구성 후의 안정성

본 실시예에서는 다음의 인자 VIII 제제를 사용하였다:

레팍토^® 및 "scFVIII"은 실시예 1에서 사용된 것과 동일하였으나, CSL Behring GmbH에서 입수한 "scFVIII"은 다른 부형제를 함유하는 제형으로 적용되었다. 애드베이트^®(Advate)는 전장 헤테로이량체 재조합 인자 VIII 제제로서 Baxter로부터 동결건조 형태로 구입한 것이다.

애드베이트^®와 레팍토^®는 제조사의 사용설명서에 포함된 지침에 따라 재구성되었다. "scFVIII"은 pH 7.0의 주사용수중에 재구성하여 20 mM L-히스티딘, 280 mM NaCl, 3.4 mM CaCl₂, 0.02% 트윈 80, 0.6% 수크로즈를 함유한 조성물로 만들었다. 시료 "scFVIII 001"은 FVIII 초기 활성이 100 IU/ml이었고, 시료 "scFVIII 006"은 FVIII 초기 활성이 400 IU/ml이었다. FVIII 재구성된 산물을 25℃에서 항온배양하였다. 이의 FVIII 활성은 발색 기질 분석(Coamatic^® Factor VIII, Chromogenix)에 의해 0시, 6시, 1일, 2일, 4일 및 8일의 시점에서 중복 측정하였다. 활성값은 시점 0에 대해 정규화하였다.

아래 표 2 및 도 2는 결과를 보여준다.

표 2: 경과 시간에 따른 인자 VIII 활성

상기 결과에서 확인할 수 있듯이, "scFVIII"은 가장 낮은 활성 손실을 나타내며, 그 결과 가장 안정한 인자 VIII 분자이다.

실시예 3 : 인자 VIII 분자의 생체이용률

애드베이트^®, 레팍토^® 및 "scFVIII"은 실시예 2에서 사용된 것과 동일하였고 실시예 2에 기술한 바와 같이 재구성하였다.

인자 VIII 넉아웃(knockout) 마우스가 A형 혈우병 동물 모델로서 사용되었다. 이들 마우스는 엑손 16 및 17이 결손된 것으로 FVIII을 발현하지 못한다[참조: Bi L. et al, Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121; Bi L. et al, Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450]. 이는 치료 후 FVIII 농도를 ko 마우스의 FVIII 혈장 중 활성을 정량화하여 분석할 수 있도록 한다.

사람 FVIII의 혈관외 주사가 치료법을 개선할 수 있는 대안이 될 수 있는 지를 평가하기 위해 피하 주사를 선택하였다. 실시된 비임상적 약동학 연구에 대한 설계는 아래 표 3에 상세히 기술되어 있다. A형 혈우병 모델에 각각의 FVIII 제제(표 3에 기술된 처치 그룹)의 피하 단일 주사 후 인자 VIII 혈장 중 활성 농도를 측정하였다.

상응하는 그룹들은 FVIII:발색체 활성이 동일한 용량으로 처치되었다. 체중이 약 25 g인 FVIII 넉아웃(ko) 마우스에 피하 적용하기 전에 단일 적용을 위한 인자 VIII은 200 μL의 용적(모든 그룹에 대해 동일한 용량)으로 제공되었다. 처치 그룹들은 표 3에 요약되어 있다.

단기간 마취하에 채혈하고 나트륨 시트레이트로 항응고처치하여 10% 시트레이트 혈액을 수득하고 이로부터 혈장 처리하여 FVIII 활성 측정을 위해 -70℃에 저장하였다. 시료추출 시점은 표 4에 기술되어 있다. FVIII 혈장 중 활성의 정량화는 표준 aPTT 기반 접근법(Behring Coagulation Timer)로 수행하였다. 동물들은 표준 사육 환경에서 관리되었다.

표 3: 처치 그룹

결과

표 4 및 도 3은 결과를 요약한 것이다.

표 4:

FVIII ko 마우스에 400 IU/kg 단일쇄 FVIII("scFVIII")의 피하 주사는 헤테로이량체 전장 FVIII(애드베이트^®) 또는 헤테로이량체 B-도메인-결실된 FVIII(레팍토^®)의 투여와 비교하여, FVIII의 혈장 중 활성 수준에서 유의적인 증가 결과를 나타냈다. 즉, 단일쇄 인자 VIII 분자는 마우스에 피하 주사 후 최고의 생체이용률을 보여준다. 2개-쇄 전장 작제물 애드베이트^® 뿐만 아니라 2개-쇄 B-도메인 결실된 제제 레팍토^®는 실질적으로 보다 낮은 생체이용률을 나타냈다.

실시예 4 : 인자 VIII 분자의 혈중 안정성(시험관내)

상이한 FVIII 제품(애드베이트^®, 레팍토AF^® 및 실시예 2에서 사용된 2가지 로트의 scFVIII)을 FVIII 결핍 혈장(Siemens Healthcare Diagnostics)으로 1 IU/mL FVIII:C(발색체 기질 분석에 의해 측정된 값을 기준으로)로 희석하였다. FVIII-시료를 0.05% Na-아지드의 존재하에 다양한 시간(0, 0.25, 1, 2, 4 및 8일) 동안 37℃에서 항온배양하였다. 각 항온배양 시간 후에 활성화제로서 Pathromtin-SL(Siemens Healthcare Diagnostics)를 사용한 한 단계 응고 분석에 의해 FVIII:C를 측정하고, t=0의 값(FVIII:C %)에 대해 정규화한 다음, 항온배양 시간에 대해 플로팅하였다. 표기된 값들은 2개 시료의 평균과 표준편차를 나타낸다(단, 0.25일의 경우 1개 시료).

표 5: 시간 0 대비 평균 활성 %

실시예 5 : 인자 VIII 분자의 혈중 안정성(생체내)

시노몰구스 원숭이(도 5 및 표 6) 및 A형 혈우병 마우스(도 6 및 표 7)에 250 IU/kg 및 100 IU/kg의 용량으로 각각 정맥내 단일 주사 후 scFVIII 및 전장 rFVIII(애드베이트^®, Baxter Healthcare)의 약동학(PK) 프로필을 측정하였다. 애드베이트®의 표지된 활성 및 scFVIII의 발색 활성(FVIII:C)에 따라 피검물의 용량을 정했다. 시노몰구스 원숭이의 경우는 투여전 및 투여 후 24시간까지의 여러 시점에서 채혈하였고 A형 혈우병 마우스의 경우는 투여 후 72시간까지의 여러 시점에서 채혈하였다. 채혈 후 즉시 시트레이트 혈장을 준비하고 발색 검정 시스템(FVIII:C)(Chromogenix - Instrumentation Laboratory SpA, Milan, Italy)으로 FVIII:C를 정량화하는데 사용하였다.

FVIII 혈장 농도의 AUC는 선형 사다리꼴 공식으로 계산하여 AUC_last값(t=0부터 최종시점까지의 관찰)을 산출하였다. 수정 R2 기준에 의해 선정된 최종 단계의 시점을 사용하여 로그선형회귀 분석으로 최종반감기(t_1/2β)를 산출하였다(최종 단계의 회귀 모델을 사용하여 외삽한 t=0부터 무한대까지의 AUC).

시노몰구스 원숭이에서 scFVIII은 약 1.6배 증가된 AUC_0-tlast 또는 t_1/2β와 함께 상응하는 약 2배 낮은 청소율(CL)을 나타낸 한편, 생체내 회복(IVR)을 대표하는 FVIII 활성 피크 수준(C_max) 및 항정상태(steady state) 분포용적(V_ss)은 전장 rFVIII 대비 매우 유사한 것으로 나타났다. 이들 PK 파라미터 결과들은 GLP-독성 연구에서 250 IU/kg의 scFVIII을 8마리 추가 원숭이에 투여하여 획득한 독성동태 데이터를 포함한 후 10마리 원숭이로부터 획득하였다(표 6 및 도 5).

A형 혈우병 마우스에서 AUC_0-tlast, 평균잔류시간(MRT), 5% FVIII 활성 최저 농도까지의 시간, 최종반감기의 증가 및 이에 대응하는 CL의 감소는 scFVIII의 경우 1.6 내지 2배 사이였고, 반면 IVR을 대표하는 C_max 및 V_ss는 전장 rFVIII 대비 비슷한 것으로 나타났다. rVIII-단일 쇄 처치 후 얻은 AUC_0-tlast 및 t_1/2β 결과는 전장 rFVIII보다 1.97의 AUC_0-tlast 비율(90% 신뢰구간 (CI): 1.7-2.3; p-값(비율=1):<0.0001) 및 1.65의 t_1/2β 비율(90% CI: 1.11-2.70; p-값(비율=1): 0.036)만큼 유의적으로 양호하였다(표 7 및 도 6).

표 6: 시노몰구스 원숭이에서의 scFVIII 및 전장 rFVIII의 PK 파라미터

표 7: A형 혈우병 마우스에서의 scFVIII 및 전장 rFVIII의 PK 파라미터

두 세트의 PK 파라미터는 정제, 동결건조 및 재구성 후의 scFVIII를 2마리 시험 동물 종에 투여 후 생체내 혈장 중에서 안정성이 증가되었음을 반영한다.

실시예 6 : A형 혈우병 마우스에서의 트롬빈 생성 분석(생체외)

scFVIII 또는 전장 rFVIII(애드베이트^®)을 250 IU/kg의 용량으로 투여한 후 다른 시점(1일 내지 8일)에서 심부 마취하여 시트레이트-(10% v/v) A형 혈우병 마우스 혈액을 준비하였다. 인지질(예: Rossix, Molndal, Sweden)/Pathromtin^®SL(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)(1:30)의 존재하에 고유 활성화 후 보정 트롬빈분석(CAT)(Thrombinoscope, Netherlands)으로 TGA를 실시하였다. 트롬빈 피크 농도를 기록했다. 1일부터 8일까지의 트롬빈 피크 농도의 평균 AUC값을 선형 사다리꼴 공식으로 산출하였다. 시점과 처치 그룹마다 가변분산을 갖는 선형 모델에서 2개의 인자 VIII 제품 간에 AUC 차이를 근사 F-검정으로 비교하여 결과적으로 트롬빈 피크 농도가 50 nM-250 nM의 한정된 허용 범위 이하로 감소할 때까지의 예정시간을 얻었다.

A형 혈우병 마우스에서 scVIII은 트롬빈 피크 농도가 50-250 nM의 한정된 허용 범위이하로 감소하기까지의 예정 시간으로 표시된 바와 같이 지혈 활성에서 전장 rFVIII에 비하여 양호한 것으로 나타났다(도 8 및 표 8). 이것은 50 내지 250 nM사이의 트롬빈 피크 농도 간격에서 scFVIII이 전장 rFVIII보다 평균 20시간 더 긴 트롬빈 생성 활성값을 나타내는 것으로 해석된다. 1일 내지 8일사이의 피크곡선하면적을 평가했을 때 scFVIII의 트롬빈 생성 활성이 전장 FVIII에 비하여 p(AUG_{TGA Peak}-비율=1)=0.0002(산정 비율 1.26, 90% CI: 1.14-1.39)로 유의적으로 양호하였고, 다시 말해서, scFVIII은 사람 야생형 인자 VIII 애드베이트^®보다 투여 후 50 nM의 트롬빈 피크 농도 이하로 감소하는 데까지 유의적으로 더 많은 시간이 걸렸다.

이들 결과는 다시 scFVIII의 기능상 안정성이 정제, 동결건조 및 재구성 후에 증가되었음을 확인시켜 주었다.

표 8: 피크 트롬빈(nm)

실시예 6 : vWF 결핍 혈장 중에서의 인자 VIII 분자의 안정성(생체내)

scFVIII을 2.5 mL의 주사용수중에 재구성하였다. 레팍토^® AF 및 애드베이트^®는 사용설명서에 기술된 바에 따라 재구성하였다. 모든 시험 제제를 분취하고 즉시 약 -70℃에서 동결 저장하였다. 투여 전에 시험 제제를 CSL 627용 제형화 완충액으로 희석시켜 투여의 신뢰성을 보장하는 최소 실질 용적을 준비하였다.

그룹당 12마리 VWF ko 마우스(암컷 6마리/수컷 6마리)의 외측미정맥에 발색체 FVIII 활성을 기준으로 100 IU/kg의 scFVIII 및 표지된 FVIII 활성을 기준으로 100 IU/kg의 레팍토 AF^® 또는 애드베이트^®를 정맥내 단일 주사하였다. 다양한 시험 제제의 투여 후 0.083, 0.5, 1, 2, 4, 7, 16 및 24시간 경과한 시점에서 시점당 2 또는 3마리 마우스로부터 FVIII 혈장 농도를 측정하기 위하여 채혈하였다. 혈액 시료로부터 10% 시트레이트(3.13 %w/v) 처리된 혈장을 준비한 후 발색 분석 시스템으로 FVIII 혈장 농도를 분석하였다. COAMATIC^® FVIII 분석 키트(Chromogenix, Italy)를 사용하여 발색체 FVIII 활성을 측정하였다.

선형 사다리꼴 공식으로 FVIII 혈장 농도의 AUC를 계산하여 t=0부터 최종 시점 관찰까지의 AUC_last를 산출하였다.

FVIII ko 마우스 및 정상적인 원숭이에 정맥내 투여뿐만 아니라 FVIII ko 마우스에 피하 투여 후에 수득한 결과와 마찬가지로 CSL627에 대한 노출은 레팍토AF^® 및 애드베이트^®에 비하여 더 높은 것으로 분석되었다. 전신 노출에 대해 가장 연관성있고 대표적인 PK 파라미터인 AUC의 분석 결과, CSL627의 투여후 AUC 값은 레팍토AF^® 및 애드베이트^®보다 30% 더 높았다. 이러한 관찰 결과들은 전신 순환 VWF가 결손되어 전신 순환 FVIII에 대해 차단 및 방어 효과가 없는 마우스에 투여한 후에 scFVIII을 정제, 동결건조 및 재구성한 후 scFVIII의 증가된 고유 안정성을 또 다시 반영한다.

표 9: VWF 결손 마우스에 100 IU/kg의 용량 수준으로 투여한 후 애드베이트^® 및 레팍토 AF^® 대비 scFVIII의 혈장 농도

SEQUENCE LISTING <110> CSL LIMITED <120> METHOD FOR IMPROVING THE STABILITY OF PURIFIED FACTOR VIII AFTER RECONSTITUTION <130> A186 <150> EP 11185651.4 <151> 2011-10-18 <150> US 61/548601 <151> 2011-10-18 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6996 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(6996) <400> 1 gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca gtg gaa ctg tca tgg gac tat 48 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 atg caa agt gat ctc ggt gag ctg cct gtg gac gca aga ttt cct cct 96 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 aga gtg cca aaa tct ttt cca ttc aac acc tca gtc gtg tac aaa aag 144 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 act ctg ttt gta gaa ttc acg gat cac ctt ttc aac atc gct aag cca 192 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 agg cca ccc tgg atg ggt ctg cta ggt cct acc atc cag gct gag gtt 240 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr 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Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta ttt gat gaa ggg aaa agt tgg 624 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 cac tca gaa aca aag aac tcc ttg atg cag gat agg gat gct gca tct 672 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 gct cgg gcc tgg cct aaa atg cac aca gtc aat ggt tat gta aac agg 720 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 tct ctg cca ggt ctg att gga tgc cac agg aaa tca gtc tat tgg cat 768 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 gtg att gga atg ggc acc act cct gaa gtg cac tca ata ttc ctc gaa 816 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat cgc cag gcg tcc ttg gaa atc 864 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 tcg cca ata act ttc ctt act gct caa aca ctc ttg atg gac ctt gga 912 Ser Pro Ile Thr Phe Leu 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cat gag gtg gca tac tgg tac att cta 1920 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 agc att gga gca cag act gac ttc ctt tct gtc ttc ttc tct gga tat 1968 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa gac aca ctc acc cta ttc cca 2016 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 ttc tca gga gaa act gtc ttc atg tcg atg gaa aac cca ggt cta tgg 2064 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 att ctg ggg tgc cac aac tca gac ttt cgg aac aga ggc atg acc gcc 2112 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 tta ctg aag gtt tct agt tgt gac aag aac act ggt gat tat tac gag 2160 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 gac agt tat gaa gat att tca gca tac ttg ctg agt aaa aac aat gcc 2208 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 att 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Ser Gln Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 gga aaa aat gta tcg tca aca gag agt ggt agg tta ttt aaa ggg aaa 2928 Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 aga gct cat gga cct gct ttg ttg act aaa gat aat gcc tta ttc aaa 2976 Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990 gtt agc atc tct ttg tta aag aca aac aaa act tcc aat aat tca gca 3024 Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005 act aat aga aag act cac att gat ggc cca tca tta tta att gag 3069 Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu 1010 1015 1020 aat agt cca tca gtc tgg caa aat ata tta gaa agt gac act gag 3114 Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu 1025 1030 1035 ttt aaa aaa gtg aca cct ttg att cat gac aga atg ctt atg gac 3159 Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp 1040 1045 1050 aaa aat gct aca gct ttg agg cta aat cat atg tca aat aaa act 3204 Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn 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ggc ttg gga aat caa acc aag caa att gta gag aaa tat gca tgc 3879 Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys 1280 1285 1290 acc aca agg ata tct cct aat aca agc cag cag aat ttt gtc acg 3924 Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr 1295 1300 1305 caa cgt agt aag aga gct ttg aaa caa ttc aga ctc cca cta gaa 3969 Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu 1310 1315 1320 gaa aca gaa ctt gaa aaa agg ata att gtg gat gac acc tca acc 4014 Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr 1325 1330 1335 cag tgg tcc aaa aac atg aaa cat ttg acc ccg agc acc ctc aca 4059 Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr 1340 1345 1350 cag ata gac tac aat gag aag gag aaa ggg gcc att act cag tct 4104 Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser 1355 1360 1365 ccc tta tca gat tgc ctt acg agg agt cat agc atc cct caa gca 4149 Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala 1370 1375 1380 aat aga tct cca tta ccc att gca aag gta tca tca ttt cca tct 4194 Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser 1385 1390 1395 att aga cct ata tat ctg acc agg gtc cta ttc caa gac aac tct 4239 Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser 1400 1405 1410 tct cat ctt cca gca gca tct tat aga aag aaa gat tct ggg gtc 4284 Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val 1415 1420 1425 caa gaa agc agt cat ttc tta caa gga gcc aaa aaa aat aac ctt 4329 Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu 1430 1435 1440 tct tta gcc att cta acc ttg gag atg act ggt gat caa aga gag 4374 Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu 1445 1450 1455 gtt ggc tcc ctg ggg aca agt gcc aca aat tca gtc aca tac aag 4419 Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys 1460 1465 1470 aaa gtt gag aac act gtt ctc ccg aaa cca gac ttg ccc aaa aca 4464 Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 tct ggc aaa gtt gaa ttg ctt cca aaa gtt cac att tat cag aag 4509 Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys 1490 1495 1500 gac cta ttc cct acg gaa act agc aat ggg tct cct ggc cat ctg 4554 Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515 gat ctc gtg gaa ggg agc ctt ctt cag gga aca gag gga gcg att 4599 Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1520 1525 1530 aag tgg aat gaa gca aac aga cct gga aaa gtt ccc ttt ctg aga 4644 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 1545 gta gca aca gaa agc tct gca aag act ccc tcc aag cta ttg gat 4689 Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560 cct ctt gct tgg gat aac cac tat ggt act cag ata cca aaa gaa 4734 Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu 1565 1570 1575 gag tgg aaa tcc caa gag aag tca cca gaa aaa aca gct ttt aag 4779 Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 1590 aaa aag gat acc att ttg tcc ctg aac gct tgt gaa agc aat cat 4824 Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His 1595 1600 1605 gca ata gca gca ata aat gag gga caa aat aag ccc gaa ata gaa 4869 Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu 1610 1615 1620 gtc acc tgg gca aag caa ggt agg act gaa agg ctg tgc tct caa 4914 Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln 1625 1630 1635 aac cca cca gtc ttg aaa cgc cat caa cgg gaa ata act cgt act 4959 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 1640 1645 1650 act ctt cag tca gat caa gag gaa att gac tat gat gat acc ata 5004 Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile 1655 1660 1665 tca gtt gaa atg aag aag gaa gat ttt gac att tat gat gag gat 5049 Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp 1670 1675 1680 gaa aat cag agc ccc cgc agc ttt caa aag aaa aca cga cac tat 5094 Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr 1685 1690 1695 ttt att gct gca gtg gag agg ctc tgg gat tat ggg atg agt agc 5139 Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser 1700 1705 1710 tcc cca cat gtt cta aga aac agg gct cag agt ggc agt gtc cct 5184 Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 cag ttc aag aaa gtt gtt ttc cag gaa ttt act gat ggc tcc ttt 5229 Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe 1730 1735 1740 act cag ccc tta tac cgt gga gaa cta aat gaa cat ttg gga ctc 5274 Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 1745 1750 1755 ctg ggg cca tat ata aga gca gaa gtt gaa gat aat atc atg gta 5319 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1760 1765 1770 act ttc aga aat cag gcc tct cgt ccc tat tcc ttc tat tct agc 5364 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1775 1780 1785 ctt att tct tat gag gaa gat cag agg caa gga gca gaa cct aga 5409 Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 1790 1795 1800 aaa aac ttt gtc aag cct aat gaa acc aaa act tac ttt tgg aaa 5454 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys 1805 1810 1815 gtg caa cat cat atg gca ccc act aaa gat gag ttt gac tgc aaa 5499 Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 gcc tgg gct tat ttc tct gat gtt gac ctg gaa aaa gat gtg cac 5544 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 1835 1840 1845 tca ggc ctg att gga ccc ctt ctg gtc tgc cac act aac aca ctg 5589 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860 aac cct gct cat ggg aga caa gtg aca gta cag gaa ttt gct ctg 5634 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 1865 1870 1875 ttt ttc acc atc ttt gat gag acc aaa agc tgg tac ttc act gaa 5679 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890 aat atg gaa aga aac tgc agg gct ccc tgc aat atc cag atg gaa 5724 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1895 1900 1905 gat ccc act ttt aaa gag aat tat cgc ttc cat gca atc aat ggc 5769 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn 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tct gga cac att aga gat ttt cag att aca gct tca gga caa tat 6129 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt cat tat tcc gga tca 6174 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 atc aat gcc tgg agc acc aag gag ccc ttt tct tgg atc aag gtg 6219 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 gat ctg ttg gca cca atg att att cac ggc atc aag acc cag ggt 6264 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 gcc cgt cag aag ttc tcc agc ctc tac atc tct cag ttt atc atc 6309 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg cag act tat cga gga aat 6354 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gat tca tct 6399 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 ggg ata aaa cac aat 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Thr 1055 1060 1065 Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly 1070 1075 1080 Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys 1085 1090 1095 Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His 1100 1105 1110 Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln 1115 1120 1125 Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe 1130 1135 1140 Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr 1145 1150 1155 Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn 1160 1165 1170 Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His 1175 1180 1185 Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr 1190 1195 1200 Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr 1205 1210 1215 Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg 1220 1225 1230 Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1235 1240 1245 Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys 1250 1255 1260 His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu 1265 1270 1275 Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys 1280 1285 1290 Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr 1295 1300 1305 Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu 1310 1315 1320 Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr 1325 1330 1335 Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr 1340 1345 1350 Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser 1355 1360 1365 Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala 1370 1375 1380 Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser 1385 1390 1395 Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser 1400 1405 1410 Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val 1415 1420 1425 Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu 1430 1435 1440 Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu 1445 1450 1455 Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys 1460 1465 1470 Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys 1490 1495 1500 Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515 Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1520 1525 1530 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 1545 Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560 Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu 1565 1570 1575 Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 1590 Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His 1595 1600 1605 Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu 1610 1615 1620 Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln 1625 1630 1635 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 1640 1645 1650 Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile 1655 1660 1665 Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp 1670 1675 1680 Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr 1685 1690 1695 Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser 1700 1705 1710 Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe 1730 1735 1740 Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 1745 1750 1755 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1760 1765 1770 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1775 1780 1785 Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 1790 1795 1800 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys 1805 1810 1815 Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 1835 1840 1845 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 1865 1870 1875 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1895 1900 1905 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly 1910 1915 1920 Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln 1925 1930 1935 Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile 1940 1945 1950 His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1970 1975 1980 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1985 1990 1995 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 2015 2020 2025 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2255 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330

Claims (23)

1. 인자(Factor) VIII 분자의, 정제, 동결건조 및 재구성 후의 안정성을 증가시키는 방법으로서,
   상기 인자 VIII 분자의 제조 과정 전반에서, 상기 인자 VIII 분자가 A1 도메인과 A2 도메인을 필수적으로 포함하는 제1 절편(fragment)과 A3 도메인과 C1 도메인과 C2 도메인을 필수적으로 포함하는 제2 절편으로 단백질분해 절단(proteolytic cleavage)되는 것을 방지하는 것을 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 불활성화 단계가 상기 인자 VIII 서열로부터 최소한 Arg1648을 결실시키는 것을 포함하는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 불활성화 단계가 상기 인자 VIII 서열로부터 최소한 Arg1313 내지 Arg1648의 아미노산 서열을 결실시키는 것을 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 VIII 서열의 위치 741 내지 1647에 있는 아미노산들로부터 선택된 제1 아미노산이, 상기 인자 VIII 서열의 위치 1649 내지 1690에 있는 아미노산들로부터 선택된 제2 아미노산과 융합되고, 이에 따라, Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위가 불활성화되는, 방법.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실된 아미노산들이 아미노산 1개 내지 50개의 길이를 갖는 펩타이드 스페이서로 치환되는, 방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 불활성화 단계가, Arg1648 및, 상기 인자 VIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313을 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 포함하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 VIII 분자를 수용액 중에 재구성하고 25℃에서 7일간 저장한 후의 상기 인자 VIII 분자의 활성 손실이 15% 미만인, 방법.
9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 VIII 분자를 수용액 중에 재구성한 후의 상기 인자 VIII의 시험관내 안정성이 상기 절단 부위(들)의 불활성화에 의해 증가되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비정맥내 주사 후, 상기 인자 VIII이, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 또는 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 사람 인자 VIII 분자에 비하여, 향상된 생체이용률을 나타내고; 바람직하게는, 상기 비정맥내 주사 후의 생체이용률이, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 또는 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 사람 인자 VIII 분자에 비하여, 25% 이상 증가되는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 비정맥내 주사가, 피하, 경피 또는 근육내 주사인, 방법.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 인자 VIII이, 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 정맥내 투여 후의 향상된 혈장 반감기를 나타내고; 바람직하게는, 상기 혈장 반감기가, 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 40% 이상 향상되거나,
    (ii) 상기 인자 VIII의 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서 경시적 트롬빈 생성 분석으로 측정 시, 트롬빈 피크 농도가 50 nM 이하로 떨어지는데 있어서, 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 보다 더 긴 시간을 나타내며; 바람직하게는, 이 시간이 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 10시간 이상 더 연장되거나,
    (iii) 상기 인자 VIII이 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정 시, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후의 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 상기 인자 VIII이 활성을 보다 더 높게 보존하며; 바람직하게는, 상기 인자 VIII의 보존 활성이, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후의 사람 야생형 인자 VIII의 보존 활성에 비하여, 10% 이상 높은, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Arg1648과 Glu1649 사이 및 Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위들이 불활성화된 변형된 인자 VIII 분자를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계,
    (ii) 상기 핵산으로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,
    (iii) 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 변형된 인자 VIII 분자의 발현을 유도하는 조건하에서 배양하는 단계 및
    (iv) 상기 변형된 인자 VIII 분자를 상기 숙주 세포 또는 상기 세포 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 또는 Asn745가 Pro1640과 융합된 B-도메인 결실된 사람 인자 VIII 분자에 비하여, 비정맥내 투여 후의 인자 VIII 분자의 생체이용률을 향상시키는 방법으로서,
    Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 인자 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 것을 포함하는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 비정맥내 투여가 피하, 경피 또는 근육내 주사인, 방법.
16. 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 정맥내 투여 후의 인자 VIII 분자의 혈장 반감기를 향상시키는 방법으로서,
    Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 인자 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 것을 포함하는, 방법.
17. 인자 VIII 분자의 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서 경시적 트롬빈 생성 분석으로 측정 시, 트롬빈 피크 농도가 50 nM 이하로 떨어지는 시간을, 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 연장시키는 방법으로서,
    Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 인자 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 것을 포함하는, 방법.
18. 인자 VIII 분자가 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정 시, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양된 후의 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 인자 VIII 분자가 더 높은 활성을 보존하는 방법으로서,
    Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위를 불활성화시키는 것을 포함하는, 방법.
19. 제14항 내지 제18항에 있어서, 상기 인자 VIII 서열의 위치 741 내지 1647에 있는 아미노산들로부터 선택된 제1 아미노산이, 상기 인자 VIII 서열의 위치 1649 내지 1690에 있는 아미노산들로부터 선택된 제2 아미노산과 융합되고, 이에 따라, Arg1648과 Glu1649 사이의 단백질분해 절단 부위 및, 상기 FVIII 분자에 존재하는 경우, Arg1313과 Ala1314 사이의 단백질분해 절단 부위가 불활성화되는, 방법.
20. 출혈성 장애, 바람직하게는 A형 혈우병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 제제로서,
    (i) 비정맥내 투여에 의해, 상기 단일쇄 인자 VIII 분자의 생체이용률이, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여 또는 Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 사람 인자 VIII 분자에 비하여, 25% 이상 증가되거나;
    (ii) 정맥내 투여에 의해,
    (a) 상기 단일쇄 인자 VIII 분자의, 정맥내 투여 후의 혈장 반감기가, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 40% 이상 증가되거나,
    (b) 상기 단일쇄 인자 VIII 분자가, 정맥내 투여 후 A형 혈우병 마우스에서 경시적 트롬빈 생성 분석으로 측정 시, 트롬빈 피크농도가 50 nM 이하로 떨어지는데 걸리는 시간이, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여된 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 10시간 이상 연장된 시간을 나타내는, 약제학적 제제.
21. 출혈성 장애, 바람직하게는 A형 혈우병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 단일쇄 인자 VIII을 포함하는 약제학적 제제로서,
    상기 단일쇄 인자 VIII 분자가, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정 시, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후의 사람 야생형 인자 VIII보다, 10% 이상 더 높은 활성을 보존하는, 약제학적 제제.
22. 비정맥내 투여에 의한, 출혈성 장애, 바람직하게는 A형 혈우병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 용액으로서,
    상기 VIII 분자의 용량이, 동일한 지혈 활성을 성취하기 위해, 동일한 용량 및 동일한 방식으로 투여한, Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자의 용량보다, 25% 이상 감소되는, 약제학적 용액.
23. 출혈성 장애 치료용 약제학적 제제의, 재구성 후의 증가된 안정성을 또는 더 긴 저장수명을 달성하기 위한, 단일쇄 인자 VIII 분자의 용도로서,
    (i) 상기 단일쇄 인자 VIII 분자를 포함하는 약제학적 제제의 인자 VIII 활성이, 재구성 후 및 재구성 후 7일간 실온에서 저장 후, Asn745가 Pro1640에 융합된 B-도메인 결실된 인자 VIII 분자를 동일량 포함하는 약제학적 제제의 활성보다, 10% 이상 높거나,
    (ii) 상기 단일쇄 인자 VIII 분자가, 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 배양되었을 때 1 단계 FVIII:C 분석에 의해 측정 시, 동일한 농도로 37℃에서 사람 혈장 중에서 4일간 항온배양한 후의 사람 야생형 인자 VIII에 비하여, 10% 이상 높은 활성을 보존하는, 용도.
    

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