CN103917554A - 用于改善重构后纯化的因子viii的稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。本发明还涉及用于改善静脉内和非静脉内注射后因子VIII的生物利用率的方法。

Description

用于改善重构后纯化的因子VIII的稳定性的方法
本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。本发明还涉及用于改善静脉内和非静脉内注射后因子VIII的生物利用率的方法。
背景技术
经典的血友病或血友病A是一种遗传性出血障碍。它因染色体X连锁的凝血因子VIII缺陷所致，并且几乎排他地侵袭男性，发病率为每10,000人在一位和两位个体之间。X-染色体缺陷由本身不是血友病患者的女性携带者传递。血友病A的临床表现是增加的出血倾向性。在引入因子VIII浓缩物治疗之前，患有严重血友病的人的平均寿命短于20年。使用来自血浆的因子VIII的浓缩物已经明显地改善血友病患者的状况，广泛地增加平均寿命，给予大部分患者过上或多或少正常生活的可能性。然而，伴随血浆衍生的浓缩物和它们的使用，存在某些问题，其中最严重的问题是传播病毒。迄今，造成AIDS、乙型肝炎和非甲非乙肝炎的病毒已经严重袭击该群体。从那时起，已经新近开发了不同的病毒灭活方法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物，它们还对血浆衍生的因子VIII建立了极高的安全性标准。
几种重组和血浆衍生的治疗性多肽，例如凝血因子，可商业获得用于人类中的治疗性和预防性使用。FVIII是一种在哺乳动物肝脏中产生的分子量直到约280kDa的血浆糖蛋白。它是导致凝血的凝血反应级联的关键组分。在这个级联内部存在其中因子IXa(FIXa)连同激活的因子VIII(FVIIIa)一起使因子X(FX)转化成激活形式FXa的步骤。FVIIIa在这个步骤充当辅因子，与钙离子和磷脂是最大化FIXa活性所要求的。
治疗血友病A方面的一项重要进展是分离了编码2,351个氨基酸的人FVIII完整序列的cDNA克隆(美国专利号4,757,006)和提供人FVIII基因DNA序列及用于其生产的重组方法。
将因子VIII合成为具有分子量约280kDa的单条多肽链。当因子VIII转运入内质网时，移除氨基端信号肽，并且成熟(即切除信号肽后)天然因子VIII分子随后在其分泌过程中在第1313和1648位氨基酸残基后以蛋白酶解方式被切割。这导致释放异二聚体，所述异二聚体由按金属离子依赖性方式与约160-200kDa N端重链片段缔合的约80kDa C端轻链组成。(综述见Kaufman,Transfusion Med.Revs.6:235(1992))。
通过凝血酶对蛋白质链的蛋白酶切割，该异二聚体的生理激活发生。凝血酶将重链切割成90kDa蛋白质并随后切割成54kDa和44kDa片段。凝血酶还将80kDa轻链切割成72kDa蛋白质。正是后一种蛋白质和由钙离子结合在一起的两个重链片段(上文54kDa和44kDa片段)才构成活性FVIII。当44kDa A2重链片段从该分子解离或当72kDa和54kDa蛋白质由凝血酶、活化的蛋白C或FXa进一步切割时，失活发生。在血浆中，FVIII通过与50倍摩尔过量的VWF蛋白(“VWF”)缔合稳定，所述VWF蛋白似乎抑制蛋白酶解性破坏如上文所述的FVIII。
FVIII的氨基酸序列组织成三个结构域：330个氨基酸的三重A结构域、980个氨基酸的单个B结构域和150个氨基酸的重复C结构域。B结构域与其他蛋白质没有同源性并且提供这种蛋白质的25个潜在天冬酰胺(N)联糖基化位点中的18个。B结构域在凝血中明显没有功能并且可以缺失，而B-结构域缺失的FVIII分子仍具有促凝血活性。
市场上的因子VIII产品目前作为因子VIII冻干制剂提供或者通过重组技术产生或从汇集的血浆纯化。冻干产品在施用之前重构。一旦重构，因子VIII的货架期相对短暂。因子VIII是相对不稳定的蛋白质，特别在水溶液中。已经描述在制造和储存期间通过与其他血浆蛋白复合、特别与血管性血友病因子(vWF)和白蛋白复合的稳定化作用见，例如，美国专利号6,228,613。美国专利号5,565,427公开了包含一个氨基酸的因子VIII或其盐或同源物之一及去垢剂或有机聚合物如聚乙二醇的稳定化制剂。美国专利号5,605,884公开了在氯化钙和高浓度氯化钠或氯化钾存在的情况下因子VIII在基于组氨酸缓冲液的高离子强度介质中的稳定化制剂。这类组合物显示显著地改善重构后含水形式的因子VIII的稳定性。通常认可了钙离子在因子VIII制剂中的重要性。根据美国专利号6,599,724，其他二价阳离子即Cu2+和Zn2+的存在，任选地在Ca2+离子或Mn2+离子存在的情况下，改善因子VIII的稳定性。WO2011/027152A1还描述了包含各种添加物的稳定的含水因子VIII组合物。
考虑到冻干物重构后因子VIII的短货架期，需要增加重构的因子VIII在水溶液中稳定性的方法。出于不同原因，提供在液相具有增加的稳定性的纯化FVIII制备物是合乎需要的。首先，优点是在环境温度具有支持在环境温度制造纯化FVIII产物的足够时间跨度。具体而言，填充步骤需要储存某种液体散货以增加制造灵活性。其次，如果产品不能在重构后直接施加，液态的纯化FVIII的稳定性增加将对医师和患者而言是有优势的。并且最终，在连续输注条件下例如在住院患者中手术时使用FVIII取决于重构后优选高的产物稳定性(TakedaniH.,Haemophilia2010,16:740-746)。具有增加的稳定性的FVIII分子还将有利于开发适于液态条件下长期储存的FVIII制备物。
本申请的发明人令人惊讶地发现冻干物重构后纯化因子VIII的稳定性在单链因子VIII构建体中实质地增强。这类构建体可以通过阻止蛋白酶剪切获得，所述蛋白酶剪切一般在因子VIII分泌之前出现在高尔基体区室中。单链构建体在纯化后在溶液中显示更好的稳定性/或当皮下施用时显示更好的生物利用率。
发明简述
在第一方面，本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。
第一方面涵盖一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。
第一方面进一步涵盖一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在纯化因子VIII分子之前防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。
就本发明的这些方法而言，术语“在制造因子VIII分子期间自始至终”和“在纯化因子VIII分子之前”意指本发明的方法防止将因子VIII切割成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段，但是本发明的方法不阻止可以在施用重构的因子VIII分子后发生的因子VIII活化切割。通过本发明方法产生的因子VIII分子仍可以由凝血酶活化，所述凝血酶在Arg372、Arg740和Arg1689后切割因子VIII分子。
在第二方面，本发明涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括失活在表达因子VIII分子的宿主细胞分泌所述因子VIII分子期间被切割的蛋白酶剪切位点，例外是信号序列和成熟因子VIII之间的切割位点。一般，至少50%由宿主细胞表达并分泌的因子VIII分子是单链因子VIII分子。优选地，至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%由宿主细胞表达并分泌的因子VIII分子是单链因子VIII分子。
优选地，该方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点并且如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。可以通过缺失蛋白酶识别序列的一个或多个残基实现蛋白酶剪切位点的失活。例如，失活步骤可以包含从因子VIII序列缺失至少Arg1648。在一个实施方案中，失活步骤包括从因子VIII序列缺失至少从Arg1313至Arg1648的氨基酸序列。
在本发明第一方面的另一个实施方案中，通过置换形成蛋白酶识别序列的一个或多个氨基酸残基实现蛋白酶剪切位点的失活。
在又一个实施方案中(涉及保留包含Arg1313的B-结构域部分的那些FVIII变体)，该方法进一步包括通过缺失或置换形成蛋白酶识别序列的一个或多个残基失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。在一个特别优选的实施方案中，该方法包括缺失来自因子VIII氨基酸序列的在残基Arg1313和Arg1648后包含两个蛋白酶切割位点的至少部分。
进一步优选的是，选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点和如果存在于FVIII分子中，Arg1313和Ala1314之间的切割位点失活。
在另一个优选实施方案中，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示在水溶液中增加的稳定性。在水溶液中在25℃储存7日后，修饰的因子VIII分子的活性丧失优选地是小于15%。
在另一个优选实施方案中，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示重构后在水溶液中增加的稳定性。
在又一个优选的实施方案中，以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII的生物利用率相比或与其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子相比，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示非静脉内注射后增加的生物利用率。在又一个优选的实施方案中，以相同剂量和以相同方式施用时，与其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，根据本发明第一或第二方面稳定化的因子VIII分子显示非静脉内注射后增加的生物利用率。分别以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII的生物利用率或其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，修饰的FVIII的生物利用率优选地增加至少25%。在另一个优选实施方案中，非静脉内注射是皮下、经皮或肌内注射。
另一个优选实施方案是一种方法，其中(i)相对于人野生型因子VIII，该因子VIII显示出静脉内施用后改善的血浆半寿期；优选地其中相对于人野生型因子VIII，血浆半寿期改善至少40%，或(ii)其中相对于人野生型因子VIII，该因子VIII显示静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更长时间段；优选地其中相对于人野生型因子VIII，这个时间段延长至少10个小时，或(iii)其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，因子VIII在已经在37℃于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的更高活性；优选地其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII的活性，保留的因子VIII活性是至少10%更高。
该方法还可以包括步骤
(i)提供核酸，所述核酸编码其中Arg1648和Glu1649之间以及Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点失活的修饰的因子VIII分子，
(ii)用所述核酸转化宿主细胞，
(iii)在如此条件下培养转化的宿主细胞，从而表达修饰的因子VIII分子，并且
(iv)从宿主细胞或从培养基回收修饰的因子VIII分子。
在另一个方面，本发明涉及一种改善因子VIII分子在非静脉内施用后的生物利用率的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，和如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。优选地，非静脉内注射是皮下注射。分别以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII的生物利用率或其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的生物利用率相比，皮下注射后的生物利用率优选地增加至少25%。
在另一个方面，本发明涉及一种相对于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
在另一个方面，本发明涉及一种相对于人野生型因子VIII，延长静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，和如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
在另一个方面，本发明涉及一种相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，保留在已经在37℃于人血浆中温育4日后如通过一步FVIII:C测定法所测定的因子VIII分子更高活性的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
上文所述方法的一个优选实施方案是这些方法，其中选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点和如果存在于FVIII分子中，Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点失活。
已作必要修正的情况下，不同方面的优选实施方案是适用的。
在又一个方面，本发明涉及一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于通过以下方式治疗或预防出血障碍、优选地血友病A：(i)在一方面，非静脉内施用，其中以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII相比或与其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子相比，所述单链因子VIII分子的生物利用率增加至少25%，或(ii)在另一方面，静脉内施用，其中(a)以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII，所述单链因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期增加至少40%、或(b)以相同剂量和以相同方式施用，相对于人野生型因子VIII，单链因子VIII分子显示出静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段延长至少10小时。
在又一个方面，本发明涉及一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在已经在37℃于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的至少10%更高活性。
在又一个方面，本发明涉及一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于通过非静脉内施用治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中以相同剂量和以相同方式施用以实现血液中相同的止血活性时，与其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的剂量相比，所述FVIII分子的剂量可以降低至少25%。
在另一个方面，本发明涉及单链因子VIII分子用于实现重构后增加的稳定性或用于治疗出血障碍的药物制品的更长货架期的用途，其中(i)在重构并且重构后室温储存7日之后，包含单链因子VIII分子的药物制品的因子VIII活性高于包含相同量其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的药物制品至少10%，或(ii)其中相对于相同浓度的已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在37℃于人血浆中温育4日时保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的至少10%更高活性。
附图简述
图1描述实施例1的结果。各种因子VIII分子已经作为水溶液提供，并且已经在7日时间段范围内监测它们的稳定性。与异二聚(双链)全长因子VIII分子(和)并与B-结构域缺失的异二聚(双链)构建体()相比，对于单链因子VIII分子而言，储存7日后的活性丧失小得多。
图2描述实施例2的结果。将多种冻干的因子VIII制备物重构成水溶液，并且并且已经在7日时间段范围内监测它们的稳定性。与异二聚(双链)全长因子VIII分子()和B-结构域缺失的异二聚(双链)构建体()相比，对于单链因子VIII分子而言，储存7日后的活性丧失小得多。
图3描述实施例3的结果。三种不同的因子VIII分子已经在小鼠中皮下注射并且已经如实施例2中所述测定它们的生物利用率。单链因子VIII分子的生物利用率实质地高于双链和全长因子VIII()或B-结构域缺失的异二聚(双链)构建体()。
图4描述实施例4的结果。将本发明的因子VIII分子和二种商业可获得的FVIII制品在纯化、冻干和重构后在37℃温育。将FVIII-样品在37℃温育不同的时间段(0、0.25、1、2、4和8日)并且通过一步凝血测定法确定FVIII:C活性。显示的值代表两份样品的均值和标准偏差(例外是0.25日，仅一份样品)。
图5描述实施例5的部分结果。在以剂量250IU/kg单次静脉内注射至食蟹猴后，确定scFVIII和全长rFVIII(BaxterHealthcare)的药物代谢动力学(PK)曲线。
图6描述实施例5的部分结果。在以剂量100IU/kg单次静脉内注射至血友病A小鼠后，确定全长rFVIII(Baxter Healthcare)的药物代谢动力学(PK)曲线。
图7描述实施例6的部分结果。在scFVIII或全长rFVIII(Baxter Healthcare)以剂量250IU/kg施用至血友病A小鼠后确定从第1日-第8日的平均峰凝血酶水平。
图8描述实施例7的结果。以剂量100IU/kg单次静脉内注射至VWF缺陷小鼠后确定全长rFVIII(Baxter Healthcare)和B-结构域缺失的因子VIII(Pfizer)的药物代谢动力学(PK)曲线。
发明详述
本发明涉及用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。
本发明还涉及一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包含失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点和如果存在于因子VIII分子中，任选地失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
因子VIII
术语“凝血因子VIII)”、“因子VIII”和“FVIII”在本文中互换地使用。成熟人因子VIII由布置在以下结构域结构中的2332个氨基酸组成：
A1 a1 A2 a2 B a3 A3 C1 C2
A1：残基1-336，
A2：残基373-710，
B：残基741-1648，
A3：残基1690-2019，
C1：残基2020-2172，和
C2：残基2173-2332。
此外，存在三个酸性区域a1(337-372)、a2(711-740)和a3(1649-1689)。已知酸性区域a3参与因子VIII分子与凝血中发挥重要作用的血管性血友病因子(vWF)结合。在分泌期间，FVIII在B-结构域和a3酸性区域之间被切割，产生异二聚多肽。因子VIII异二聚体由一条轻链(包含A3、C1和C2)和一条大小可变的重链(包含A1、A2和B)组成。后者是不均一的，原因在于B-结构域内部受有限的蛋白酶解作用。在B-结构域缺失的异二聚构建体的情况下，“重链”包含A1和A2，但是缺少部分或全部的B-结构域。
在SEQ ID NO:2中显示成熟野生型形式的人凝血因子VIII的氨基酸序列。具体序列的氨基酸位置的指示意指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白质中的位置并且不排除在所指序列中其他位置处存在突变，例如缺失、插入和/或置换。例如，相对于SEQ ID NO:2提到的“Glu2004”中的突变不排除在修饰的同源物中，在SEQ ID NO:2的第1至2332位置处的一个或多个氨基酸丢失。在SEQ ID NO:1中显示编码SEQ ID NO:2的DNA序列。
“凝血因子VIII”包括野生型凝血因子VIII以及具有野生型凝血因子VIII促凝血活性的野生型凝血因子VIII衍生物。与野生型因子VIII的氨基酸序列相比，衍生物可以具有缺失、插入和/或添加。优选的衍生物是其中已经缺失全部或部分B-结构域的FVIII分子。本申请中自始至终所指的氨基酸位置总是指全长成熟(即在切除信号肽后)野生型FVIII中相应氨基酸的位置。
术语“因子VIII”包括具有至少10%、优选地至少25%、更优选地至少50%、最优选地至少75%的野生型因子VIII生物活性的任何因子VIII变体或突变体。确定因子VIII生物活性的合适试验是一步或两步凝血测定法(Rizza等人,1982.Coagulation assay of FVIII:C andFIXa in Bloom编著，The Hemophilias.NY Churchchill活的1992)或生色底物FVIII:C测定法(S.Rosen,1984.Scand J Haematol33:139-145,增刊)。这些文献中的内容通过引用的方式并入本文中。
作为非限制性例子，因子VIII分子包括阻止或减少APC切割的因子VIII突变体(Amano1998.Thromb.Haemost.79:557-563)、融合白蛋白的FVIII分子(WO2011/020866A2)、FVIII-Fc融合分子(WO04/101740A)、进一步稳定化A2结构域的因子VIII突变体(WO97/40145)、导致表达增加的FVIII突变体(Swaroop等人,1997.JBC272:24121-24124)、免疫原性降低的因子VIII突变体(Lollar1999.Thromb.Haemost.82:505-508)、从差异表达的重链和轻链重构的FVIII(Oh等人,1999.Exp.Mol.Med.31:95-100)、减少与受体结合从而导致FVIII样HSPG(硫酸类肝素蛋白聚糖)和/或LRP(低密度脂蛋白受体相关蛋白)分解代谢的FVIII突变体(Ananyeva等人,2001.TCM,11:251-257)、二硫键稳定化的FVIII变体(Gale等人,2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)、分泌特改善的FVIII突变体(Miao等人,2004.Blood103:3412-3419)、辅因子特异活性增加的FVIII突变体(Wakabayashi等人,2005.Biochemistry44:10298-304)、生物合成及分泌改善、ER伴侣蛋白相互作用降低、ER-高尔基体运输改善、活化或抗失活性增加和半寿期改善的FVIII突变体(Pipe2004年综述,Sem.Thromb.Hemost.30:227-237)和缺失全部或部分B-结构域的FVIII突变体(见，例如，WO2004/067566A1、WO02/102850A2、WO00/24759A1和美国专利号4868,112)。全部这些因子VIII突变体和变体均通过引用方式完整并入本文。
术语“单链因子VIII”指从表达所述FVIII分子的细胞分泌期间尚未以蛋白酶解方式切割成两条链(例如重链和轻链)并因此作为单条多肽链存在的因子VIII分子。
防止切割
本发明的方法包括防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。术语“防止蛋白酶剪切”包括部分防止蛋白酶剪切和彻底防止蛋白酶剪切。它进一步包括实施方案“减少蛋白酶剪切”。换而言之，“防止因子VIII分子的蛋白酶剪切”不需要彻底取消任何蛋白酶剪切，从而基本上100%由宿主细胞表达并分泌的因子VIII分子是单链分子(不过，这个实施方案由本发明的方法涵盖)。通常，以如此方式防止因子VIII分子的蛋白酶剪切，从而至少50%、优选地至少60%、更优选地至少70%、更优选地至少80%、更优选地至少90%、最优选地至少95%由宿主细胞表达并分泌的因子VIII分子是单链分子。不彻底地防止裂解可以至少部分地归因于以下事实：在B结构域内部可能存在一些次要切割位点，所述次要切割位点可以导致小部分因子VIII分子的蛋白酶剪切，即便主要切割位点(在R1313和R1648处)不存在。根据本发明可以防止或可以不防止这种次要裂解。
第一片段基本上包含因子VIII的A1结构域和A2结构域。第一片段可以包含A1结构域和A2结构域，每个结构域精确地具有上文所示的氨基酸序列。例如，第一片段可以至少包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第1至740位氨基酸。可选地，第一片段可以包含这种序列的变体，其具有基本上不影响因子VIII活性的氨基酸缺失、置换和/或插入。第一片段可以额外地包含因子VIII的B结构域的N端部分。
第二片段基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域。第二片段可以包含A3结构域、C1结构域和C2结构域，每个结构域精确地具有上文所示的氨基酸序列。例如，第二片段可以至少包含SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的第1690至2332位氨基酸。可选地，第二片段可以包含这种序列的变体，其具有基本上不影响因子VIII活性的氨基酸缺失、置换和/或插入。第二片段可以额外地包含酸性a3区域的C端部分。
本发明的方法包括在重组表达的FVIII分子分泌期间防止将导致异二聚(双链)多肽的蛋白酶剪切。即，该方法包括获得单链因子VIIII分子。这可以按多种方式实现，例如通过失活参与将成熟单链FVIII胞内加工成最终由宿主细胞分泌的异二聚FVIII的蛋白酶剪切位点。
在一个实施方案中，失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点的步骤包括缺失形成蛋白酶识别序列的一个或多个氨基酸。残基1648后的切割位点在是弗林蛋白酶型切割位点。因子VIII序列中该蛋白酶的识别序列是LKRHQR。优选地，失活步骤包括缺失形成该识别序列的这些氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸。优选地，失活步骤包括缺失识别序列内部的至少一个碱性氨基酸，更优选地，失活步骤包括缺失至少第1648位置处的精氨酸。仍更优选地，失活步骤包括缺失因子VIII序列的至少第1643至1648位氨基酸。如果相应的FVIII衍生物包含Arg1313，则失活步骤还包括缺失至少位置Arg1313处的精氨酸。仍优选地是缺失因子VIII序列的至少第1313至1648位氨基酸以分别失活第1313和1648位置后的两个切割位点。
最优选地，失活步骤包括缺失至少来自因子VIII序列的从第800至1648位残基的氨基酸序列，例如来自因子VIII序列的从第741至1648位残基的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，从而防止分泌期间的蛋白酶剪切。优选的缺失如下：
氨基酸740与氨基酸1650融合，因而氨基酸741至1649缺失；
氨基酸740与氨基酸1690融合，因而氨基酸741至1689缺失；
氨基酸740与氨基酸1669融合，因而氨基酸741至1668缺失；
氨基酸743与氨基酸1650融合，因而氨基酸744至1649缺失；
氨基酸764与氨基酸1650融合，因而氨基酸765至1649缺失；
氨基酸764与氨基酸1653融合，因而氨基酸765至1652缺失；
氨基酸764与氨基酸1656融合，因而氨基酸765至1655缺失；
氨基酸745与氨基酸1650融合，因而氨基酸746至1649缺失；
氨基酸745与氨基酸1653融合，因而氨基酸746至1652缺失；
氨基酸745与氨基酸1656融合，因而氨基酸746至1655缺失；
氨基酸757与氨基酸1650融合，因而氨基酸758至1649缺失；
氨基酸757与氨基酸1653融合，因而氨基酸758至1652缺失；
氨基酸757与氨基酸1656融合，因而氨基酸758至1655缺失；
氨基酸793与氨基酸1649融合，因而氨基酸794至1648缺失；
氨基酸793与氨基酸1690融合，因而氨基酸794至1689缺失；
氨基酸747与氨基酸1649融合，因而氨基酸748至1648缺失；
氨基酸751与氨基酸1649融合，因而氨基酸752至1648缺失；
氨基酸776与氨基酸1649融合，因而氨基酸777至1648缺失；
氨基酸770与氨基酸1667融合，因而氨基酸771至1666缺失。
因缺失产生的分子通常以单链因子VIII分子形式获得。
优选的单链FVIII分子具有全部或部分B-结构域的缺失和全部或部分酸性a3区域的缺失，从而在Arg1648的切割位点(通常在分泌期间被切除)缺失。单链FVIII分子在例如WO2004/067566A1；US2002/132306A1；Krishnan等人,(1991)European Journal ofBiochemistry第195卷,第3期,第637-644页；Herlitschka等人,(1998)Journal of Biotechnology,第61卷,第3期,第165-173页；Donath等人,(1995)Biochem.J.,第312卷,第49-55页中公开。这些参考文献中所述的这些单链因子VIII分子通过引用方式并入本文。
上文所提及的融合物可以是直接融合物或间接融合物。在后一种情况下，缺失的氨基酸由异源间隔序列替换。本文中更详细地描述这个实施方案。可能将缺失的个氨基酸替换为由约1个至约500个氨基酸，或约2个至250个氨基酸，或约3个至约100个氨基酸，或约4个至约50个氨基酸，或约5个至约10个氨基酸组成的肽接头。肽接头应当是柔性的并且没有免疫原性(Robinson等人,PNAS(1998),第95卷,第5929页)。肽接头可以由Gly组成，其中相对于所述Gly在N端前接由氨基酸序列多聚体GlyGlySer或GlyGlySerSer或其任意组合，在一个具体实施方案中，肽接头由80至120个氨基酸组成。
在一个备选实施方案中，在残基1313和1648处形成蛋白酶识别位点的一个或多个氨基酸可以用另一种氨基酸置换，从而切割不发生。例如，可以将碱性氨基酸替换为疏水性氨基酸。
单链因子VIII的制备
在纯化、冻干和重构因子VIII之前实施“防止蛋白酶剪切”或“失活蛋白酶剪切位点”的步骤。“防止蛋白酶剪切”或“失活蛋白酶剪切位点”的步骤一般在制备因子VIII分子期间实施。本发明的方法可以包括在(宿主细胞中)表达因子VIII分子期间防止蛋白酶剪切或在制备编码因子VIII分子的核酸期间失活Arg1313和/或Arg1648处的蛋白酶剪切位点。
根据上文描述的实施方案，这些“防止蛋白酶剪切”或“失活蛋白酶剪切位点”的步骤可以包括从编码因子VIII的核酸移除编码Arg1313和/或Arg1648处的蛋白酶剪切位点的部分。这一般导致编码单链因子VIII的核酸。通常，本发明的方法还可以包括提供编码单链因子VIII的核酸，例如在表达质粒或载体中。
随后可以将该核酸、表达载体或表达质粒引入宿主细胞、优选地哺乳动物宿主细胞中用于表达。本发明的方法还可以包括在合适条件下培养该宿主细胞，从而表达修饰的因子VIII分子，例如单链因子VIII分子；和任选地从该宿主细胞或从培养基回收(例如纯化)修饰的因子VIII分子。通常，操作编码因子VIII的核酸、培养哺乳动物细胞以允许因子VIII表达和从细胞培养基纯化因子VIII的技术是本领域已知的。
优选将单链因子VIII分子纯化至≥80%纯度，更优选地≥95%纯度并且特别优选是相对于掺杂性大分子，尤其其他蛋白质或/和核酸而言纯度大于99.9%的药用纯状态并且不含传染介质和致热物质。优选地，分离或纯化的修饰因子VIII分子基本上不含其他多肽。
本发明的方法还可以包括纯化、冻干和重构单链因子VIII的步骤。重构优选地通过使用水，例如“注射用水”实施。
稳定性
相对于全长因子VIII和/或相对于其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即B基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的-结构域缺失的因子VIII分子)，根据本发明制备的因子VIII分子显示出增强的稳定性。
如本文所用，术语“稳定性”指在水溶液中的稳定性，优选地指冻干的因子VIII制备物重构后水溶液中的稳定性，例如通过添加水至冻干的因子VIII制备物。一般，冻干的因子VIII制备物用“注射用水”重构。
水溶液中的稳定性可以通过提供水溶液中的因子VIII分子并将它温育某个时间段来确定。在一个优选实施方案中，用于确定因子VIII分子储存稳定性的条件如下：
在具有以下组成的水溶液中提供因子VIII分子：
这种溶液在下文称作“缓冲液A”。水溶液中的因子VIII初始活性优选地在100IU/ml和1,500IU/ml之间，优选地其是100IU/ml。
如此制备的因子VIII溶液随后可以在25℃温育至少24小时，优选地至少两日，更优选地至少五日，最优选地七日或八日。在温育时间后，通过测量溶液中的因子VIII活性，优选地通过使用生色底物测定法(例如Coamatic因子VIII,Chromogenix)确定稳定性。活性相对于初始活性丧失得越低，则因子VIII分子的稳定性越高。最优选地，如下文实施例1或2中那样确定稳定性。
根据本发明，在以上确定的条件下储存7日后单链因子VIII的因子VIII活性丧失小于15%、优选地小于12%、最优选地小于10%。
一般，将温育时间开始(t=0)处的因子VIII初始活性归一化至100%。在25℃在缓冲液A中储存24小时后的因子VIII残余活性优选地是因子VIII初始活性的至少95%。在25℃在缓冲液A中储存48小时后的因子VIII残余活性优选地是因子VIII初始活性的至少95%。在25℃在缓冲液A中储存4日后的因子VIII残余活性优选地是因子VIII初始活性的至少90%、更优选地至少95%。在25℃在缓冲液A中储存7日后的因子VIII残余活性优选地是因子VIII初始活性的至少85%、更优选地至少90%、最优选地至少95%。在25℃在缓冲液A中储存8日后的因子VIII残余活性优选地是因子VIII初始活性的至少85%、更优选地至少90%、最优选地至少95%。
单链因子VIII的因子VIII残余活性是通常高于双链因子VIII分子的因子VIII残余活性(假定两种分子已经在相同条件下温育相同时间段)。
术语“人全长双链因子VIII”在本文中可与术语“人野生型因子VIII”互换使用。
在一个实施方案中，单链因子VIII的因子VIII残余活性高于人全长双链因子VIII的因子VIII残余活性。在另一个实施方案中，单链因子VIII的因子VIII残余活性高于其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的B-结构域缺失的因子VIII分子)的因子VIII残余活性。
优选地，在25℃在缓冲液A中储存48小时后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过人全长双链因子VIII的因子VIII残余活性至少4个百分点。还优选，在25℃在缓冲液A中储存48小时后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的B-结构域缺失的因子VIII分子)的因子VIII残余活性至少4个百分点。
在另一个实施方案中，在25℃在缓冲液A中储存4日后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过人全长双链因子VIII的因子VIII残余活性至少5个百分点。还优选，在25℃在缓冲液A中储存4日后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的B-结构域缺失的因子VIII分子)的因子VIII残余活性至少5个百分点。
在另一个实施方案中，在25℃在缓冲液A中储存7日后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过人全长双链因子VIII的因子VIII残余活性至少5个百分点、优选地至少10个百分点。还优选，在25℃在缓冲液A中储存7日后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的B-结构域缺失的因子VIII分子)的因子VIII残余活性至少5个百分点、优选地至少10个百分点。
在另一个实施方案中，在25℃在缓冲液A中储存8日后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过人全长双链因子VIII的因子VIII残余活性至少5个百分点、优选地至少10个百分点。还优选，在25℃在缓冲液A中储存8日后单链因子VIII的因子VIII残余活性超过其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的B-结构域缺失的因子VIII分子)的因子VIII残余活性至少5个百分点、优选地至少10个百分点。
对于缓冲液A，可选地也可以使用其他缓冲液，例如在本发明的实施例2中使用的缓冲液。
本发明缓冲液的优选pH范围是从5.5至9.0的pH范围，优选地是从6.0至8.5的pH范围并特别优选是从6.5至8.0的pH范围。
可以通过生色性或凝血测定法或任何其他生物测定法确定因子VIII的活性。优选地，如下文实施例1中所显示那样确定因子VIII活性。
生物利用率
在另一个实施方案中，与双链人野生型因子VIII相比或与B-结构域缺失的双链人因子VIII相比，根据本发明稳定化的因子VIII分子显示在非静脉内注射后改善的生物利用率。非静脉内注射优选地是皮下、经皮或肌内注射。最优选地，非静脉内注射是皮下注射。
如本文所用，术语“生物利用率”指在皮下、静脉内或皮内施用后可以在血浆中在预定时间直至最终时间点检测到的因子VIII或FVIII相关制备物的所施用剂量的比例。一般，在试验动物中通过以下方式测量生物利用率：施用10IU/kg和1000IU/kg制备物之间的剂量(例如400IU/kg体重)；在施用后的预定时间点获得血浆样品；并且使用一种或多种生色或凝血测定法(或任何生物测定法)、免疫测定法或其等同物确定样品中因子VIII或因子VIII相关多肽的含量。生物利用率表述为y-轴上血浆中凝血因子浓度或活性的曲线下面积(AUC)和x-轴上施用后的时间直至施用后预定最终时间点。优选地，这个预定时间点是施用后72小时或48小时。最优选地，如下文实施例3中所显示那样确定生物利用率。试验制备物的相对生物利用率指试验制备物(这里，单链因子VIII)的AUC和按照与试验制备物相同的剂量和方式(例如静脉内、皮下或皮内)施用的参考制备物(例如全长重组双链因子VIII或B-结构域缺失的双链因子VIII)的AUC之间的比率。
根据本发明，皮下注射后单链因子VIII的生物利用率高于双链人野生型因子VIII或B-结构域缺失的双链人因子VIII的生物利用率。优选地，相对于野生型FVIII，生物利用率(皮下注射后72范围内的AUC)增加至少10%、更优选地至少25%、更优选地至少50%、最优选地至少75%。在另一个实施方案中，相对于其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子(即基本上由SEQ ID NO:2的第1-745位和第1640-2332位氨基酸组成的B-结构域缺失的因子VIII分子)，生物利用率(皮下注射后72范围内的AUC)增加至少10%、更优选地至少20%、更优选地至少至少30%、最优选地至少40%。
改善(体内)血浆半寿期
在另一个实施方案中，根据本发明稳定化的因子VIII分子显示出增加的药物代谢动力学(PK)参数。
可以通过例如分别以如生色测定法中所确定的剂量100IU/kg或250IU/kg静脉内注射至不同物种如血友病A小鼠或食蟹猴中测试本发明的因子VIII分子。在施用后的各个时间点例如在血友病A小鼠中直至72小时(hrs)和例如在食蟹猴中直至24小时抽取血液样品。立即制备柠檬酸盐血浆并且将其用于例如通过生色测定系统(FVIII:C)(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA，米兰，意大利)定量FVIII:C。
使用线性梯形法计算血浆中FVIII水平的AUC以计算AUC最后：从t=0至最后观察结果。使用通过调整的R2标准所选择的终末期的多个点，通过对数线性回归确定终末半寿期(t1/2β)。AUC:从自t=0至无限(通过使用终末期的回归模型外推)。
相比于以相同剂量和以相同方式施用的人野生型因子VIII的终末半寿期，本发明的单链FVIII分子显示至少40%、优选地至少50%、甚至更优选地至少60%增加的终末半寿期。
优选地如实施例5中所示那样确定血浆半寿期。
延长如凝血酶生成测定法中所测定的功效(体内)
在另一个实施方案中，根据本发明稳定化的因子VIII分子显示出相对于人野生型因子VIII，在静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更长时间段。这个试验显示FVIII的功能性也在本发明分子中稳定化。
可以通过首先以等摩尔剂量(例如以250IU/kg)静脉内施用本发明的FVIII分子至血友病A小鼠中，测试本发明的FVIII分子。在不同时间点(例如从第1日至第8日每天)，采集柠檬酸化血液并且进行凝血酶生成测定法(TGA)，例如在磷脂(例如Rossix，瑞典)/SL(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH,Marburg，德国)(1:30)存在下内在活化后通过校准的凝血酶记录法(thrombinography)(CAT)(Thrombinoscope，荷兰)进行。记录凝血酶峰水平。通过线性梯形法计算从第1-8日凝血酶峰水平的平均AUC。在每个时间点和治疗组存在变量方差的线性模型中使用近似F-检验针对AUC的差异比较两种因子VIII产品的AUC，产生估计的时间直至凝血酶峰水平降低范围50nM的限定限值以下。
优选地，如实施例6中所示那样确定凝血酶生成测定法中的功效。
在血友病A小鼠中，与人野生型因子VIII相比，scFVIII显示有利的止血活性。这转换成在凝血酶峰水平下降低于50nM水平之前，相对于全长rFVIII，scFVIII的平均化至少10小时更长、优选地至少15小时更长和甚至更优选地至少20小时更长的凝血酶生成活性值。
在血浆中保留更高FVIII:C活性(离体)
在另一个实施方案中，根据本发明稳定化的因子VIII分子保留相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，在已经在37℃于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的更高活性；优选地其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII的活性，保留的因子VIII活性是至少10%更高。
具有本发明因子VIII分子的样品可以通过将它们随缺乏FVIII的血浆(例如来自Siemens Healthcare Diagnostics)一起稀释成1IU/mLFVIII:C(基于通过生色底物测定法确定的值)来测试。随后将FVIII-样品在0.05%叠氮钠存在下在37℃温育不同的时间段(例如0、0.25、1、2、4和8日)。在每个温育时间后，FVIII:C随后由一步凝血测定法确定，例如通过使用Pathromtin-SL(Siemens HealthcareDiagnostics)作为激活物来确定，针对t=0(%FVIII:C)处的值归一化并且相对于温育时间作图。
在37℃温育4日后，本发明的因子VIII分子已经保留至少10%更高的FVIII:C活性、优选地至少15%更高的FVIII:C活性、优选地至少20%更高的FVIII:C活性、优选地至少25%更高的FVIII:C活性、优选地至少30%更高的FVIII:C活性。
优选地如实施例4中所示那样确定血浆中的活性。
治疗和预防
可以在治疗或预防出血障碍时施用重构后具有增加的稳定性的本发明单链因子VIII构建体。
如本文所用，术语“出血障碍”包括家族性和获得性血友病A和B，家族性或获得性von Willebrand病，家族性或获得性任何凝血因子缺乏症、导致从单个器官、骨折或从自多发伤严重出血的全部类型的创伤、钝器伤或穿刺伤、手术操作期间出血(包括手术前后或术后出血)、因心脏手术所致的出血(包括患者在儿科心脏手术中接受体外循环和血液稀释)、脑内出血、蛛网膜下出血，硬膜下或硬膜外出血、因失血和血液稀释所致、因导致受累患者凝血因子水平降低的非血浆容积置换所致的出血、因弥漫性血管内凝血(DIC)和消耗性凝血病、血小板功能障碍、耗尽和凝血病所致的出血、因肝硬化，肝功能障碍和暴发性肝衰竭，肝病患者中肝脏活组织检查所致的出血、肝脏和其他器官移植后出血、来自胃血管曲张的出血和消化性溃疡出血、妇科出血如功能障碍性子宫出血(DUB)、胎盘早剥、低出生体重儿童中脑室周围出血、产后出血、新生儿致死性呼吸窘迫、与相关的出血烧伤、与淀粉样变相关的出血、与血小板疾病相关的造血干细胞移植、与恶性肿瘤相关的出血、出血性病毒感染、与胰腺炎相关的出血。
药物制品的组分可以溶解于常规生理相容性缓冲水溶液中，其中可以向所述水溶液任选地添加药物赋形剂以提供该药物制品。药物制品的组分可以已经含有全部必需药物、生理相容性赋形剂并可以溶解于注射用水中以提供该药物制品。
这类药用载体和赋形剂以及适宜药物制剂的制备是本领域熟知的(见例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins”,Frokjaer等人,Taylor和Francis(2000)或“Handbook ofPharmaceutical Excipients”,第3版,Kibbe等人,PharmaceuticalPress(2000))。在某些实施方案中，药物组合物可以包含至少一种添加物如填充剂、缓冲剂或稳定剂。标准药物制剂技术是本领域技术人员熟知的(见，例如，2005Physicians'DeskThomsonHealthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,Gennaro等人,编著LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。合适的药物添加物包括例如糖，如甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖或其他、氨基酸，如组氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苯丙氨酸或其他、实现等渗条件的添加物，如氯化钠或其他盐、稳定剂，如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、聚乙二醇、丙二醇、氯化钙或其他、生理学pH缓冲剂，如三(羟甲基)氨基甲烷等。在某些实施方案中，药物组合物可以含有pH缓冲试剂和润湿剂或乳化剂。在其他实施方案中，组合物可以含有防腐剂或稳定剂。具体而言，包含凝血因子的药物制品可以按冻干或稳定可溶性形式配制。凝血因子可以通过本领域已知的多种方法冻干。在使用之前，通过添加一种或多种药学上可接受的稀释剂如无菌注射用水或无菌生理盐水溶液或合适的缓冲溶液使冻干制剂重构。
在本发明的药物制品中所含有的组合物可以通过任何药学上合适的手段递送至个体。各种递送系统是已知的并且可以用来通过任何便利途径施用组合物。优选地，通过非静脉内注射递送在本发明的药物制品中所含有的组合物至个体。更优选地，配制本发明的组合物用于皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内、皮内或经皮施用，最优选地根据常规方法用于皮下、肌内或透皮施用。可以通过输注或通过快速浓注连续地施用制剂。一些制剂可以包含缓释系统。
将本发明的药物制品的组合物以治疗有效剂量施用至患者，所述治疗有效剂量意指足以在没有达到产生不可忍受不良副作用的剂量的情况下，产生所需作用、防止或减轻正在治疗的病状或适应症的严重性或扩散的剂量。确切剂量取决于许多因素，例如适应症、制剂、施用模式并且不得不在临床前试验和临床试验中针对每种相应的适应症确定。
在本发明的一个实施方案中，凝血因子在治疗的受试者中的血浆水平在注射后5小时至非静脉内注射后8小时的时段期间连续地高于健康受试者中凝血因子的正常血浆水平2%、优选地高于5%、更优选地高于8%、最优选地高于10%。如下文实施例3中所示那样确定血浆水平。
在本发明的一个实施方案中，凝血因子在治疗的受试者中的血浆水平在注射后4小时至非静脉内注射后16小时的时段期间连续地高于健康受试者中凝血因子的正常血浆水平2%、优选地高于5%、更优选地高于8%、最优选地高于10%。
在本发明的另一个实施方案中，凝血因子在治疗的受试者中的血浆水平在注射后3小时至非静脉内注射后24小时的时段期间连续地高于健康受试者中凝血因子的正常血浆水平2%、优选地高于4%、更优选地高于6%、最优选地高于8%。
在本发明的另一个实施方案中，凝血因子在治疗的受试者中的血浆水平在注射后2小时至非静脉内注射后32小时的时段期间连续地高于健康受试者中凝血因子的正常血浆水平2%、优选地高于3%、更优选地高于4%、最优选地高于5%。
优选地，用于一次非静脉内注射的单链因子VIII剂量小于1,000IU/kg体重、或小于800IU/kg体重、或小于600IU/kg体重或小于400IU/kg体重，例如处于以下剂量：从约10IU/kg体重至约1,000IU/kg体重、或从约20IU/kg体重至约800IU/kg体重、或从约30IU/kg体重至约700IU/kg体重、或从约40IU/kg体重至约600IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约500IU/kg体重、或从约75IU/kg体重至约400IU/kg体重、或从约100IU/kg体重至约300IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约1,000IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约800IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约700IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约600IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约500IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约400IU/kg体重、或从约50IU/kg体重至约300IU/kg体重、或约50IU/kg体重至约200IU/kg体重。FVIII可以独自施用，或作为与VWF的复合物施用。
本发明的药物组合物可以单独施用或与其他治疗剂一起施用。这些药剂可以作为同一种药物的部分掺入。
实施例
实施例1：重构后纯化的因子VIII分子的稳定性
该实施例中使用以下因子VIII制备物：
(冻干的人凝血因子VIII)浓缩物)从CSL Behring GmbH获得。包含异二聚形式的血浆衍生的因子VIII。
(冻干的重组凝血因子VIII))从CSL Behring GmbH获得。含有重组产生的异二聚因子VIII。
是冻干的因子VIII制备物，其含有通过重组技术产生的B-结构域缺失的异二聚因子VIII。它可以从例如德国Pfizer PharmaGmbH获得。
和优势地是异二聚双链多肽。
称作“scFVIII”的构建体是通过在哺乳动物细胞培养物细胞中重组表达产生的单链因子VIII。该实施例中使用的单链因子VIII通过Asn764与Thr1653直接融合而获得并且在纯化后以冻干的形式提供。即，“scFVIII”是基本上由SEQ ID NO:2的第1-764和第1653-2332位氨基酸组成的单链多肽。
根据如包装物插页中给出的制造商的说明书，使 和重构。通过在注射用水中溶解纯化和冻干的FVIII制备物使“scFVIII”重构，从而产生导致含有25mM L-组氨酸，225mM NaCl、4mM CaCl2、0.03%Tween80、2%蔗糖、8%D-甘露醇、pH7.0的组合物。
在25℃温育重构的FVIII产物。通过生色底物测定法(因子VIII,Chromogenix)在以下时间点：0小时、6小时、1日、2日、4日、7日一式两份测定产物的FVIII活性。将活性值针对时间点0归一化。
在下表和图1中显示结果。
表1：因子VIII随时间推移的活性
如可以见到，“scFVIII”显示最低活性丧失并且因此是最稳定的因子VIII分子。
实施例2：重构后纯化的因子VIII分子的稳定性
该实施例中使用以下因子VIII制备物：
和“scFVIII”与实施例1中所用相同，差异在于由CSLBehring GmbH提供的“scFVIII”在含有不同赋形剂的制剂中应用。是以冻干形式从Baxter购买的全长异二聚重组因子VIII制备物。
根据如包装物插页中给出的制造商的说明书，使和重构。“scFVIII”在注射用水中重构，产生含有20mM L-组氨酸、280mM NaCl、3.4mM CaCl2、0.02%Tween80，0.6%蔗糖，pH7.0的组合物。样品“scFVIII001”具有100IU/ml的FVIII初始活性，样品“scFVIII0006”具有400IU/ml的FVIII初始活性。在25℃温育重构的FVIII产物。通过生色底物测定法(因子VIII,Chromogenix)在以下时间点：0小时、6小时、1日、2日、4日、8日一式两份测定产物的FVIII活性。将活性值针对时间点0归一化。
在下表和图2中显示结果。
表2：因子VIII随时间推移的活性
时间(日) 第0日 第0.25日 第1日 第2日 第4日 第8日
Advate 100.0 94.9 100.6 89.8 74.1 73.7
ReFacto 100.0 92.0 88.8 92.1 74.3 80.6
scFVIII001 100.0 99.2 95.6 99.2 89.0 95.1
scFVIII006 100.0 96.8 97.6 100.0 88.9 92.3
如可以见到，“scFVIII”显示最低活性丧失并且因此是最稳定的因子VIII分子。
实施例3：因子VIII分子的生物利用率
将和“scFVIII”与实施例2中所用相同并且如实施例2中所述那样重构。
使用因子VIII敲除小鼠作为血友病A动物模型。这些小鼠缺少外显子16和17并且因此不表达FVIII(Bi L.等人，Nature genetics,1995,第10卷(1),119-121；Bi L.等人，Blood,1996,第88卷(9),3446-3450)。这允许通过定量ko小鼠血浆中的FVIII活性分析治疗后的FVIII水平。
为了评估血管外注射是否可能是改善采用人FVIII治疗的选项，选择皮下注射。下表3中详述了所进行的非临床药物代谢动力学研究的设计。在单次皮下注射相应的FVIII制备物(表3中的详述治疗组)至血友病A模型后确定因子VIII活性的血浆水平。
相应的组用相同剂量的FVIII:chromogen活性治疗。对于单次施加，在皮下施加至体重约25g的FVIII敲除(ko)小鼠之前，将因子VIII以200μL体积(对于全部组，体积相同)提供。表3中总结治疗组。
在短期麻醉下，抽取血液样品，使用柠檬酸钠使其抗凝成10%柠檬酸盐血液，加工成血浆并储存在-70℃用于确定FVIII活性。在表4中详述采样时间点。通过基于aPTT的标准方案(Behring CoagulationTimer)进行血浆中FVIII活性的定量。将动物在标准居住条件维持。
表3：治疗组
结果
表4和图3中汇总结果。
表4：
与施用异二聚全长FVIII()或B-结构域缺失的异二聚FVIII()相比，皮下注射400IU/kg单链FVIII(“scFVIII”)至FVIII ko小鼠导致血浆水平中FVIII活性显著增加。即，在皮下注射入小鼠后，单链因子VIII分子显示最高体内生物利用率。双链全长构建体以及B-结构域缺失的双链制备物显示相当地更低的生物利用率。
实施例4：因子VIII分子在血浆中的(体外)稳定性
将不同FVIII产品(和如实施例2中使用的两个批号的scFVIII)用缺乏FVIII的血浆(Siemens HealthcareDiagnostics)稀释至1IU/mL FVIII:C(基于通过生色底物测定法确定的值)。将FVIII-样品在0.05%叠氮钠存在下在37℃温育不同的时间段(0、0.25、1、2、4和8日)。在每个温育时间后，随后使用Pathromtin-SL(Siemens Healthcare Diagnostics)作为激活物，通过一步凝血测定法确定FVIII:C，针对t=0(%FVIII:C)处的值归一化并且相对于温育时间作图。显示的值代表两份样品的均值和标准偏差(例外是0.25日，仅一份样品)。
表5：与时间0相比的平均%活性
第0日 第0.25日 第1日 第2日 第4日 第8日
Advate 100.00 90.63 81.25 79.69 70.31 59.38
ReFacto 100.00 92.31 86.15 83.08 70.77 58.46
scFVIII001 100.00 93.33 93.33 96.67 93.33 93.33
scFVIII006 100.00 96.88 96.88 93.75 93.75 90.63
实施例5：因子VIII分子在血浆中的(体内)稳定性
在分别以剂量250IU/kg和100IU/kg单次静脉内注射至食蟹猴猴(图5和表6)和血友病A小鼠(图6和表7)后确定scFVIII和全长rFVIII(Baxter Healthcare)的药物代谢动力学(PK)曲线。根据的标称活性和scFVIII的生色活性(FVIII:C)给予测试物。在给药前(仅猴)和在施用后的各个时间点直至血友病A小鼠中72小时(hrs)和直至食蟹猴中24小时抽取血液样品。立即制备柠檬酸盐血浆并且将其用于通过生色测定系统(FVIII:C)(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA，米兰，意大利)定量FVIII:C。
使用线性梯形法计算血浆中FVIII水平的AUC以计算AUC最后：从t=0至最后观察结果。使用通过调整的R2标准所选择的终末期的多个点，通过对数线性回归确定终末半寿期(t1/2β)。AUC:从自t=0至无限(通过使用终末期的回归模型外推)。
在食蟹猴中，scFVIII显示提高约1.6倍的AUC0-t最后或t1/2β，伴随相应地约2倍较低的清除率(CL)，同时相对于全长rFVIII，代表体内回收率(IVR)和稳态分布容积(Vss)的FVIII活性峰水平(Cmax)似乎更相似。在采用250IU/kg scFVIII的GLP-毒性研究期间给药时，在来自额外8只猴的毒代动力学数据后包括从n=10只动物获得的这些PK参数结果(表6和图5)。
在血友病A小鼠中，对于scFVIII，AUC0-t最后的提高、平均滞留时间(MRT)的提高、直至5%FVIII活性谷底水平时间、终末半寿期和相应较低的CL在1.6-2倍之间，而相比于全长rFVIII，代表IVR的Cmax和Vss显示相似。在rVIII-单链治疗后获得的AUC0-t最后和t1/2β结果显著地好于全长rFVIII，AUC0-t最后比率为1.97(90%置信区间(CI)：1.7-2.3；p-值(比率=1)：<0.0001)，并且t1/2β比率为1.65(90%CI：1.11-2.70；p-值(比率=1)：0.036(表7和图6)。
表6：食蟹猴中scFVIII和全长rFVIII的PK参数
表7：血友病A小鼠中scFVIII和全长rFVIII的PK参数
参数 scFVIII 全长rFVIII
AUC0-t最后(小时.IU/mL) 35 18
Cmax(IU/mL) 2.3 2.2
CL((mL/小时)/kg) 2.7 5.5
MRT(小时) 18 10
Vss(ml/kg) 50 57
t1/2β(小时) 15.9 9.7
直至0.05IU/mL的时间(小时) 73 39
两组PK参数均反映在施用至测试的两个动物物种后，纯化、冻干、血浆中体内重构后的scFVIII的稳定性增加。
实施例6：血友病A小鼠中的凝血酶生成测定法(离体)
当scFVIII或全长rFVIII()以250IU/kg的水平投予时，最终在深度麻醉下在不同时间点(第1-8日)采集柠檬酸盐-(10%v/v)血友病A小鼠血液。在磷脂(例如Rossix，瑞典)/SL(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH,Marburg，德国)(1:30)存在下内在活化后，通过校准的凝血酶记录法(thrombinography)(CAT)(Thrombinoscope，荷兰)进行TGA。记录凝血酶峰水平。通过线性梯形法计算从第1-8日凝血酶峰水平的平均AUC。在每个时间点和治疗组存在变量方差的线性模型中使用近似F-检验针对AUC的差异比较两种因子VIII产品的AUC，产生估计的时间直至凝血酶峰水平降低范围在50-250nM的限定限值以下。
在血友病A小鼠中，与全长rFVIII相比，scFVIII显示有利的止血活性，如通过直至凝血酶峰水平降低到范围从50-250nm峰水平的限定限值以下的估计时间所示(图8和表8)。相对于凝血酶峰水平间距在50和250nM之间的全长rFVIII，这转换成scFVIII的凝血酶生成活性值平均20小时更长。当评估第1-8日之间峰曲线下面积时，与全长FVIII相比，scFVIII的凝血酶生成活性显著更好，p(AUCTGA峰-比率=1)=0.0002(估计的比率1.26，90%CI：1.14-1.39)，或换而言之，scFVIII在施用后耗去比人野生型因子VIII显著更长的时间降至50nm凝血酶峰水平以下。
这些结果再次证实scFVIII在纯化、冻干和重构后的功能稳定性增加。
实施例6：因子VIII分子在缺乏vWF的血浆中的(体内)稳定性
scFVIII在2.5mL注射用水中重构。ReFacto和根据包装物插页中的描述重构。将全部供试品等分并立即在大约-70℃冷冻存储。在施用之前，将供试品用CSL627的配制缓冲液稀释以获得确保可靠施用的最小实用体积。
每组12只VWF ko小鼠(6只雌性/6只雄性)基于生色FVIII活性接受单次静脉内注射100IU/kg的scFVIII至外侧尾静脉中并且基于标称FVIII活性接受单次静脉内注射ReFacto或至外侧尾静脉中。在施用不同测试物后，在0.083、0.5、1、2、4、7、16和24小时从每个时间点n=2-3只小鼠抽取血液样品用于确定FVIII血浆水平。将血液样品加工成10%柠檬酸盐(3.13%w/v)血浆并随后使用生色测定系统进行FVIII血浆水平分析使用来自意大利Chromogenix的FVIII检验试剂盒确定生色FVIII活性。
使用线性梯形法计算血浆中FVIII水平的AUC以计算AUC最后：从t=0至最后观察结果。
与静脉内施用FVIII ko小鼠和正常猴以及皮下施用至FVIII ko小鼠分析后所获得的结果相似，和相比，对CSL627的暴露量更高。自从分析AUC用来，与和相比，在施用CSL627后，全身暴露量的最相关和最有代表性的PK参数产生30%更高的AUC值。再次，这些观察结果反映在施用至缺少全身性、循环性VWF的小鼠后，因此在不存在其针对全身性、循环性FVIII的屏蔽和保护作用情况下，scFVIII在纯化、冻干、血浆中体内重构后的内在稳定性增加。
表9：以剂量水平100IU/kg施用至缺乏VWF的小鼠后与和相比的血浆scFVIII水平

Claims (23)

1.一种用于增加因子VIII分子在纯化、冻干和重构后的稳定性的方法，所述方法包括在制造因子VIII分子期间自始至终防止将因子VIII分子经蛋白酶剪切成基本上包含A1结构域和A2结构域的第一片段和基本上包含A3结构域、C1结构域和C2结构域的第二片段。
2.根据权利要求1所述的方法，包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于所述FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
3.根据权利要求2所述的方法，其中失活步骤包括从因子VIII序列缺失至少Arg1648。
4.根据权利要求3所述的方法，其中失活步骤包括从因子VIII序列缺失至少从Arg1313至Arg1648的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点失活，并且，如果存在于所述FVIII分子中，Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点失活。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将缺失的氨基酸替换为具有1至50个氨基酸长度的肽间隔序列。
7.根据权利要求2所述的方法，其中失活步骤包括将Arg1648和如果存在于因子VIII分子中的Arg1313置换为不同的氨基酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在水溶液中重构并在25℃储存7日后，所述因子VIII分子的活性丧失小于15%。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中在水溶液中重构后，所述因子VIII的体外稳定性因所述切割位点的失活而增加。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII或相对于其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的人因子VIII分子，所述因子VIII显示出非静脉内注射后改善的生物利用率；优选地其中以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII或相对于其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的人因子VIII分子，非静脉内注射后的生物利用率增加至少25%。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述非静脉内注射是皮下、经皮或肌内注射。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中
(i)相对于人野生型因子VIII，所述因子VIII显示出静脉内施用后改善的血浆半寿期；优选地其中相对于人野生型因子VIII，血浆半寿期改善至少40%，
或
(ii)其中相对于人野生型因子VIII，所述因子VIII显示静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的更长时间段；优选地其中相对于人野生型因子VIII，这个时间段延长至少10个小时，
或
(iii)其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，所述因子VIII在已经在37℃于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的更高活性；优选地其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII的活性，所述因子VIII所保留的活性是至少10%更高。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括步骤
(i)提供核酸，所述核酸编码其中使Arg1648和Glu1649之间以及Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点失活的修饰的因子VIII分子，
(ii)用所述核酸转化宿主细胞，
(iii)在如此条件下培养转化的宿主细胞，从而表达修饰的因子VIII分子，并且
(iv)从宿主细胞或从细胞培养基回收修饰的因子VIII分子。
14.一种相对于人野生型因子VIII或相对于其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子，改善因子VIII分子在非静脉内施用后的生物利用率的方法，包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，和如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述非静脉内施用是皮下、经皮或肌内注射。
16.一种相对于人野生型因子VIII，改善因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
17.一种相对于人野生型因子VIII，延长静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
18.一种相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，保留在已经在37℃于人血浆中温育4日后如通过一步FVIII:C测定法所测定的因子VIII分子更高活性的方法，所述方法包括失活Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点，并且，如果存在于FVIII分子中，失活Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点。
19.根据权利要求14至18所述的方法，其中选自因子VIII序列第741至1647位置处氨基酸的第一氨基酸与选自因子VIII序列第1649至1690位置处氨基酸的第二氨基酸融合，因而Arg1648和Glu1649之间的蛋白酶剪切位点失活，并且，如果存在于FVIII分子中，Arg1313和Ala1314之间的蛋白酶剪切位点失活。
20.一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于通过以下方式治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，
(i)非静脉内施用，其中
以相同剂量和以相同方式施用时，与人野生型因子VIII相比或与其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的人因子VIII分子相比，所述单链因子VIII分子的生物利用率增加至少25%，
或
(ii)静脉内施用，其中
(a)以相同剂量和以相同方式施用时，相对于人野生型因子VIII，所述单链因子VIII分子在静脉内施用后的血浆半寿期增加至少40%，
或
(b)以相同剂量和以相同方式施用，相对于人野生型因子VIII，单链因子VIII分子显示出静脉内施用后在血友病A小鼠中随时间推移如凝血酶生成测定法中所测定的凝血酶峰水平降至50nM以下的时间段延长至少10小时。
21.一种包含单链因子VIII分子的药物制品，用于治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中相对于已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在已经在37℃于人血浆中温育4日后保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的至少10%更高活性。
22.一种包含单链因子VIII分子的药物溶液，用于通过非静脉内施用治疗或预防出血障碍、优选地血友病A，其中以相同剂量和以相同方式施用以实现血液中相同的止血活性时，与其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的剂量相比，所述FVIII分子的剂量可以降低至少25%。
23.单链因子VIII分子用于实现重构后增加的稳定性或用于治疗出血障碍的药物制品的更长货架期的用途，其中
(i)在重构并且重构后室温储存7日之后，包含单链因子VIII分子的药物制品的因子VIII活性高于包含相同量其中Asn745与Pro1640融合的B-结构域缺失的因子VIII分子的药物制品至少10%，或
(ii)其中相对于相同浓度的已经在37℃于人血浆中温育4日后的人野生型因子VIII，单链因子VIII分子在37℃于人血浆中温育4日时保留如通过一步FVIII:C测定法所测定的至少10%更高活性。
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