ES2252028T3

ES2252028T3 - Composiciones estables del factor viii.

Info

Publication number: ES2252028T3
Application number: ES00948452T
Authority: ES
Inventors: Marianne Mikaelsson; Helena Sandberg
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1999-07-13
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: NO20020120L; JP2003504345A; DE60024268T2; CY1104986T1; WO2001003726A1; DE60024268D1; CA2378751C; AU780415B2; NO330048B1; DK1194161T3; EP1194161B1; JP4674021B2; EP1194161A1; NO20020120D0; AR024735A1; NZ516400A; CA2378751A1; AU6193300A; US6599724B1; ATE310533T1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende el Factor VIII y los iones metálicos divalentes Zn2+, Cu2+ y Ca2+.

Description

Composiciones estables del factor VIII.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden el factor VIII de coagulación, siendo ellas estabilizadas, sin la adición de albúmina, por iones metálicos divalentes de Zn^{2+}, Cu^{2+}, y Ca^{2+}. La invención también describe un método para la producción del factor VIII recombinante, que comprende el citado cultivo de células de mamífero en medio libre de proteína derivada de plasma y complementado con iones metálicos divalentes, en particular con Zn^{2+}.

Antecedentes

La hemofilia clásica o hemofilia A es el más común de los desórdenes de sangrado hereditarios. Esta resulta a partir de una deficiencia del cromosoma X- ligado de coagulación de la sangre del Factor VIII, y afecta casi exclusivamente al sexo masculino con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. El defecto en el cromosoma X es transmitido por hembras portadoras que no son por si mismas hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es una tendencia anormal al sangrado y antes de que fuera introducido el tratamiento con concentrados del factor VIII, la vida media de una persona con hemofilia severa era inferior a 20 años.

El uso de concentrados del factor VIII provenientes del plasma ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes con hemofilia. La vida media se ha aumentado ampliamente, dando a muchos de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos normal. No obstante, se han presentado ciertos problemas con los concentrados derivados de plasma y su uso, de los cuales los más serios han sido la transmisión de virus. Aunque se han desarrollado varios métodos de inactivación de virus, parecería imposible obtener un derivado plasmático del factor VIII completamente libre del riesgo de transmisión viral.

El desarrollo de productos del factor VIII recombinante, en oposición al factor VIII derivado de plasma, puede aparentemente involucrar un riesgo bajo de transmisión de agentes infecciosos. La clonación molecular de ADN codificado del factor VIII humano fue reportado independiente por grupos de investigación de Genentech Inc. (Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312, 326-330; Wood, W.I. et al. (1984) Nature 312, 330-337; Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312, 337-342) y del Genetics Institute Inc. (Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312, 342-347). El factor VIII mRNA decodifica una proteína precursora de 2351 aminoácidos que incluyen un péptido marcado de 19 aminoácidos; de esta manera la proteína del Factor VIII maduro tiene 2332 aminoácidos de largo. La secuencia de aminoácidos predijo una estructura dominante que consiste en un A dominante triplicado, un B dominante único y un C dominante duplicado colocados en el orden A1:A2:B:A3:C1:C2. Durante la coagulación, el B dominante se remueve por la activación de la trombina de la molécula y su función se desconoce.

Estudios de caracterización del Factor VIII humano recombinante (Eaton, D.L. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 3285-3290) mostraron que este es estructural y funcionalmente muy similar al Factor VIII de plasma-derivado. En el plasma preparado en la presencia de inhibidores de proteasa, el Factor VIII aparece como un complejo de una cadena pesada entre 90-200 kDa (dominantes A1 y A2, con extensiones variables de el B dominante), en combinación con una cadena ligera de 80 kDa (dominantes A3:C1:C2) (Andersson, L.O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2979-2983). Las cadenas pueden ser disociadas con EDTA, indicando que ellas están sostenidas juntas por iones metálicos. La parte C-terminal de la cadena pesada, que contiene el B-dominante glicosilado fuertemente, mostró ser muy sensible al ataque proteolítico por proteasas de serina.

Aún en productos del Factor VIII recombinante existe un pequeño pero definido riesgo de transmisión de agentes infecciosos. La albúmina humana es una fuente potencial de infección como cuando es usada para estabilizar los productos Kogenate® y Recombinate® del Factor VIII recombinante presente. (Para una revisión, ver Roddie, P.H. & Ludlam, C.A. (1997) Blood Reviews 11, 169-177). La presencia del parvovirus humanos ADN B19 en el recombinante, la albúmina que contiene productos del Factor VIII ha sido reportada en (Eis-Hübinger, A.M. et al. (1996) Thrombosis and Haemostasis 76, p. 1120).

Un factor VIII recombinante que carece del B dominante, (r-VIII SQ0), se produjo por Pharmacia & Upjohn (para una revisión, ver Berntorp, E. (1997) Thrombosis and Haemostasis 78, 256-260; ver también EP-A-0506757). La proteína r-VIII SQ, que consiste en una cadena pesada de 90 kDa (dominante A1:A2) y una cadena ligera de 80 kDa (dominante A3:C1:C2), conectadas por un péptido conector es producida en células CHO cultivadas en un medio que está libre de suero pero que contiene albúmina de suero humano. La albúmina no se requiere para la estabilización del producto final, el cual en cambio contiene Polisorbato 80, un detergente no iónico que ha mostrado ser útil para prevenir pérdidas de actividad causadas por adsorción en la superficie (cf. WO 94/07510).

Un ión metálico divalente es esencial para la integridad estructural y la función cofactor del Factor VIII. Sin embargo se dispone de poca información de cómo los iones metálicos cumplen este papel. Varios modelos han sido propuestos para la asociación metal-dependiente de las subunidades del Factor VIII. El Factor VIII ha sido sugerido para circular en el plasma normal como un complejo proteínico calcio ligado (Mikaelsson, M. et al. (1983) Blood 62, 1006-1015). La actividad de el Factor VIII ha sido reconstituida recombinando las subunidades en presencia de
Ca(II) o Mn(II) (Fay, P.J. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 262, 525-531). Otros autores han propuesto que un átomo de cobre está localizado entre los dominantes A 1 y A3 y es un prerrequisito estructural para mantener la asociación entre las cadenas pesadas y ligeras (Bihoreau, N. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222, 41-48; Pan, Y. et al. (1995) Nature Structural Biology 2, 740-744; Pemberton, S. et al. (1997) Blood 89, 2413-2421).

El documento US 5,804,420 (Chan et al./Bayer Corporation) expone un método para la producción del Factor VIII recombinante, que comprende el cultivo de células huésped en medio libre de proteína de plasma-derivado y complementado con polioles e iones de cobre.

Mediante la adición de iones de Ca^{2+} y el incremento en la fuerza iónica cuando se formula r-VIII SQ como una solución ha sido posible alcanzar una estabilidad de almacenamiento de unos pocos meses a +70ºC (Fatourus, A. et al. (1997) Int. J. Pharm. 155, 121-131). Posteriores mejoras se han logrado por la adición de grandes cantidades de sacarosa (Fatouros, A. et al. (1997) Pharm. Res. 14(12), 1679-1684). Sin embargo, ninguna de las formulaciones con una osmolalidad razonablemente elevada tuvo una aceptable estabilidad de almacenamiento por un largo periodo.

Una terapia sustituta con inyecciones intravenosas del Factor VIII se da usualmente en la casa del paciente por un padre o por el paciente mismo. Antes de la administración el concentrado del Factor VIII liofilizado debe ser reconstituido bajo condiciones asépticas, lo cual es un inconveniente y demanda tiempo. Como resultado hay con frecuencia un retraso sustancial entre el principio de los síntomas de sangrado y el tratamiento. Este retraso puede incrementar el riesgo de un daño progresivo y crónico.

Una solución del Factor VIII estable y lista para usar podría ser de gran beneficio para los pacientes. Una forma de administración conveniente se espera para aumentar el cumplimiento de la terapia, es decir, un tratamiento más oportuno, reduciendo de este modo la probabilidad de que se desarrolle un daño coyuntural. Además de las ventajas obvias para los pacientes, la eliminación del paso de la liofilización podría simplificar el proceso de manufactura y reducir los costes de producción y de inversión. En el momento actual no hay disponibles soluciones del Factor VIII listas para usar. La estabilidad del Factor VIII en solución es normalmente muy pobre; lo mismo es válido para el Factor VIII suprimido B-dominante. En consecuencia, hay una necesidad de obtener una composición del Factor VIII lista para usar y estable, con el objeto de que la terapia se cumpla y para simplificar el proceso de manufactura.

Además, para el Factor VIII derivado de plasma, el uso corriente de anticoagulante de citrato reduce los niveles de iones divalentes libres en el plasma de origen. Para el Factor recombinante la producción en el proceso del cultivo de células puede depender de las concentraciones óptimas de iones metálicos divalentes en el medio del cultivo celular. De esta manera hay también una necesidad de mejoras en el proceso de purificación del Factor VIII, que incluye la etapa del cultivo celular en la producción del Factor VIII recombinante.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: (A) Determinación del contenido del ión metálico y (B) Actividad del Factor VIII después de la filtración por gel del Factor VIII recombinante (r-VIII SQ).

Figura 2: (A) Determinación del contenido del ión metálico y (B) Actividad del Factor VIII después de la filtración por gel del Factor VIII de plasma-derivado.

Figura 3: Actividad (IU/ml) del Factor VIII recombinante (r-VIII SQ) en el cultivo celular complementado con varias cantidades de Zn^{2+}.

Figura 4: Actividad (IU/ml) del Factor VIII recombinante (r-VIII SQ) en el cultivo celular complementado con varias cantidades de Cu^{2+}.

Figura 5: Actividad (IU/ml) del Factor VIII recombinante (r-VIII SQ) en el cultivo celular complementado con combinaciones de Zn^{2+} y Cu^{2+}.

Figura 6: Reconstitución de la actividad (IU/ml) del Factor VIII recombinante puro (r-VIII SQ) tratado con EDTA mediante el uso de combinaciones de Zn^{2+}, Cu^{2+} y Ca^{2+} (Ejemplo 4).

Figura 7: Cromatografía de Exclusión Molecular (CEM) de muestras de los experimentos de reconstitución del Ejemplo 4, que muestran los patrones de elusión del r-VIII SQ intacto, el aislamiento de la subunidad de 80 kDa y el aislamiento de la subunidad de 90 kDa.

Figura 8: Cromatografía de Exclusión Molecular (CEM) de muestras de los experimentos de reconstitución del Ejemplo 4, que muestra los patrones de elusión después de una mezcla libre de las subunidades de 80 y 90 kDa con Ca^{2+} o Ca^{2+} combinado con Cu^{2+} o Ca^{2+} combinado con Zn^{2+} o una combinación de Ca^{2+}, Cu^{2+} y Zn^{2+}.

Revelaciones de la invención

Sorprendentemente, se ha encontrado que el Factor VIII contiene tres iones metálicos diferentes, concretamente Ca^{2+}, Cu^{2+} y Zn^{2+}, una mol de cada uno por una mol del Factor VIII. En particular, la presencia de iones zinc en el Factor VIII no se ha reportado o sugerido antes. Este hallazgo permite mejoras en la estabilidad y en la producción del Factor VIII durante la manufactura del Factor VIII recombinante y el derivado de plasma.

Para el Factor VIII recombinante y el derivado de plasma, la presencia de Zn^{2+} y Cu^{2+}, opcionalmente en combinación con Ca^{2+} y/o Mn^{2+} a concentraciones óptimas, tiene efectos ventajosos en la estabilidad y producción del Factor VIII durante la purificación y la formulación final. Finalmente, la estabilidad de almacenamiento por un largo período del Factor VIII, especialmente en soluciones acuosas, es mejorada por la adición de Zn^{2+} y Cu^{2+} y opcionalmente en combinación con Ca^{2+} y/o Mn^{2+} y en cantidades adecuadas.

Consecuentemente, en un primer aspecto esta invención suministra una composición farmacéutica que comprende el Factor VIII y los iones metálicos divalentes, los citados iones metálicos divalentes incluyen los iones Zn^{2+}, Cu^{2+} y Ca^{2+}, y opcionalmente en combinación con Mn^{2+}, en donde dicho Factor VIII es estable sin la adición de albúmina.

Los citados iones metálicos divalentes están presentes en cantidades suficientes para la preservación de la actividad del Factor VIII durante el almacenamiento sin albúmina por lo menos 6 meses. Preferiblemente, los citados iones de Ca^{2+} están incluidos en una sal de calcio, tal como el gluconato de calcio o preferiblemente el cloruro de calcio, presente en una concentración de al menos 0.1 mM, tal como al menos 0.5 mM aproximadamente. Si en la composición de la presente invención está incluido el Mn^{2+}, la concentración de este puede ser por lo menos de 0.1 mM, tal como aproximadamente 0.5 mM por lo menos. Las cantidades requeridas de iones de Zn^{2+} y Cu^{2+}, cuando se adicionan como cloruros u otras posibles sales, dependen de la elección de excipientes, especialmente las sustancias tampón. La Histidina, el fosfato y otros reactivos tampón, normalmente usados en formulaciones de proteínas, tienen la desventaja de ser quelantes de iones metálicos. Por lo tanto los iones de Zn^{2+} y Cu^{2+} tienen que ser adicionados en altas cantidades suficientes que conduzcan a la presencia de iones metálicos libres en la solución. De aquí que, la concentración total de sales de zinc y cobre requeridas, puedan variar entre 0.1 \muM y 1 mM.

La composición de acuerdo con la invención es una solución acuosa lista para el uso, o alternativamente, seca y reconstituida antes del uso. En las composiciones de acuerdo con la invención, el Factor VIII está presente en una concentración de 50 a 50,000 IU/ml. El Factor VIII puede ser derivado de plasma humano, o del Factor VIII de longitud total, o una deleción derivada del Factor VIII recombinante, en particular la deleción derivada identificada como r-VIII SQ.

La purificación del Factor VIII proveniente de plasma humano puede ser llevada a cabo por métodos conocidos en el oficio, por ejemplo como lo describe Andersson, L.O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2979-2983. La producción del Factor VIII recombinante puede ser llevada a cabo por métodos conocidos en el arte, ver por ejemplo Wood, W.I. et al. (1984) Nature 312, 330-337; o Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312, 342-347. El Factor VIII cADN ensamblado dentro de una unidad de trascripción eficiente puede ser introducida dentro de un organismo huésped adecuado para la expresión de la proteína del Factor VIII. Preferiblemente este organismo debería ser un animal de línea celular de origen vertebrado con el fin de asegurar correctas modificaciones post-translacionales. Un ejemplo preferido de líneas celulares que pueden ser usadas son las células de Ovarios de Hámster Chino (COH). La proteína del Factor VIII recombinante, la cual se acumula en el medio los cultivos celulares, pueden ser concentrada y purificada por una variedad de métodos bioquímicos, incluyendo los métodos que utilizan diferencias en tamaño, carga, solubilidad, hidrofobicidad, afinidad específica, etc. Entre el Factor VIII recombinante y las otras sustancias en el medio acondicionado. La presente invención incluye procesos mejorados para la purificación del Factor VIII, tanto derivado de plasma como recombinante, donde se usa una óptima concentración de iones metálicos divalentes.

El término "deleción derivado del Factor VIII recombinante" es definido como una o más cadenas polipéptídicas que tienen la actividad del Factor VIII, derivada de un polipéptido del Factor VIII de longitud total, suprimiendo uno o más aminoácidos. Preferiblemente, la citada deleción derivada está desprovista de la mayoría de los B-dominante, pero retiene parte de las secuencias de el amino terminal y el carboxilo terminal del B-dominante que son esenciales para el proceso proteolítico in vivo del producto de translación primario entre dos cadenas de polipéptidos. La producción de una deleción derivada del Factor VIII, identificada como "r-VIII SQ" se describe en WO 91/09122. El término "r-VIII SQ" se define como una cadena de polipéptidos derivada de un Factor VIII de longitud total y con carencia de 743 aminoácidos por 1636.

La proteína del Factor VIII, ya sea la recombinante o la derivada de plasma puede ser formulada en composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención por métodos conocidos en el arte, ver por ejemplo WO 94/07510. La proteína del Factor VIII puede ser disuelta en soluciones reguladoras acuosas convencionales, compatibles fisiológicamente a las cuales se les puede adicionar, opcionalmente, coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticos.

De acuerdo con la invención la composición puede comprender de preferencia un tensioactivo no-iónico. Las composiciones que comprenden el Factor VIII y un tensioactivo no-iónico como un estabilizador son revelados en el documento WO94/07510. El tensioactivo no-iónico es preferiblemente elegido de un bloque de copolímeros tales como un poloxámero o polioxietileno (20) éster del ácido graso, tal como polisorbato 20 o polisorbato 80. El tensioactivo no-iónico debe estar presente en una cantidad superior a la concentración crítica de la micela (CCM) (Ver Wan & Lee (1974) J. Pharm. Sci. 63,136). De acuerdo con la presente invención la composición puede comprender adicionalmente cloruro de sodio o de potasio en una concentración mayor a 0.1 M. La composición también puede comprender un aminoácido, por ejemplo La L-histidina, a una concentración de por lo menos 1 mM.

En una forma preferida de la invención, la composición comprende los siguientes ingredientes:

(i): De 50 a 50,0000 IU/ml del Factor VIII recombinante;

(ii): al menos 0.1 mM, preferiblemente al menos unos 0.5 mM, de una sal de calcio; tal como cloruro de calcio;

(iii): al menos 1 mM de L-histidina;

(iv): al menos 0.1 M de cloruro de sodio;

(v): al menos 0.01 mg/ml del éster de ácido graso polioxietileno (20);

(vi): Una sal de zinc, tal como cloruro de zinc, en combinación con una sal de cobre, tal como cloruro de cobre, en una concentración total de 0.1 \muM a 1 mM.

Las composiciones acuosas de acuerdo con la invención incluyen composiciones que tienen una concentración reducida de oxígeno y/o antioxidantes. Ejemplos de antioxidantes adecuados son los seleccionados del grupo que consiste en glutatión, acetilcisteína, y metionina. La preparación de soluciones acuosas oxígeno-reducidas del Factor VIII es conocida de WO 94/26286. Para la composición de acuerdo con la invención, se pueden adicionar, mono o disacáridos o alcoholes de azúcar, preferiblemente sacarosa, más preferible en una cantidad superior a 100 mg/ml. Las soluciones acuosas del Factor VIII que tienen una concentración reducida de oxígeno y/o antioxidantes, y donde la solución en adición comprende un carbohidrato en una concentración de al menos 350 mg/ml, son expuestas en WO 96/30041.

En otro aspecto importante, la invención provee un caldo de cultivo celular para la producción del Factor VIII recombinante que comprende (i) un medio basal libre de proteína de plasma derivado y (ii) iones metálicos divalentes incluyendo iones Cu^{2+} y Zn^{2+}. Opcionalmente, los citados iones metálicos divalentes incluyen iones Ca^{2+} y/o Mn^{2+}. Preferiblemente, la cantidad de iones de Ca^{2+} y/o Mn^{2+} es al menos 0.1 mM aproximadamente. El citado medio basal puede contener proteínas derivadas de plasma o, alternativamente, estar libre de proteínas derivadas de plasma.

La cantidad de iones de Zn^{2+} en el citado medio de cultivo celular es preferiblemente de al menos 0.2 \muM aproximadamente. La invención también incluye un medio de cultivo celular en donde la cantidad de iones de Zn^{2+} es al menos 0.5 \muM o 1 \muM aproximadamente. El rango de concentración de los iones de Zn^{2+} es preferiblemente de unos 0.2 a unos 10 \muM. La invención también incluye un medio de cultivo celular en donde la cantidad de iones de Zn^{2+} es de unos 0.2 a 5 \muM; de 0.5 a 10 \muM; de 0.5 a 5 \muM; de 1 a 10 \muM; y de 1 a 5 \muM.

El rango de concentración de iones Cu^{2+} en el citado medio de cultivo celular es preferiblemente de unos 0.05 a unos 5 \muM. La invención también incluye un medio de cultivo celular donde la cantidad de iones de Cu^{2+} es de 0.05 a 2 \muM; de 0. 1 a 5 \muM; y de 0.1 a 2 \muM.

En un aspecto posterior, la invención incluye un método para la producción del Factor VIII recombinante a partir de células de mamíferos transportando el gen y por lo tanto comprende el cultivo de dichas células de mamíferos en un medio de cultivo celular de acuerdo con la invención como se ha definido anteriormente.

Ejemplos

La invención será descrita ahora por los siguientes ejemplos, que no están diseñados de ninguna manera como limitante de la invención.

Ejemplo 1 Determinación del contenido metálico en el Factor VIII

Una preparación (HIC-eluato) que contiene r-VIII SQ fue obtenida a partir del paso de butil-Sepharose en el proceso de purificación como se describió por Smeds A-L. et al. (1995) Thrombosis and Haemostasis 73, 1015. Una preparación de el Factor VIII derivado de plasma (pd-FVIII) fue purificada esencialmente como se describe por Andersson, L.O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2979-2983, y contenía moléculas del Factor VIII de 185 a 280 kDa, con una masa media calculada de 220 kDa. Ambas preparaciones fueron almacenadas a -70ºC. Se tomaron precauciones especiales con el fin de minimizar el riesgo de contaminación de los iones metálicos de las muestras durante la preparación. Se usaron reactivos extra puros, con cantidades de trazas de iones metálicos únicamente. Se usaron únicamente vasos, tubos, puntas capilares, etc. hechos de plástico y antes de emplearlos se lavaron con HNO_{3} al 10% y agua.

La solución tampón de las muestras del Factor VIII se cambió a Tris 20 mM (pH 7.4), NaCl 0.3 M mediante filtración por gel, realizada a temperatura ambiente. Se usaron columnas pre-empacadas con Sephadex G-25®, grado medio (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las columnas se lavaron con 25 ml de HCl 0.1 M, seguidos por 50 ml de agua destilada y antes se equilibraron con 25 ml de solución tampón. Posteriormente, 1 ml de una muestra del Factor VIII fue aplicada a la columna y durante la elusión se colectaron las fracciones. Las fracciones colectadas de la filtración por gel de r-VIII SQ (Fig. 1) o pd-VIII (Fig. 2) se analizaron para iones metálicos (paneles A) y la actividad del Factor VIII (paneles B).

La actividad del Factor VIII se determinó por un método de dos-etapas y usó un sustrato cromogénico, esencialmente como se describe por Rosén (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145; y por Carlebjörk et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14. Los análisis de metales de muestras del Factor VIII se realizaron por Svensk Grundämnesanalys AB (SGAB). Los métodos usados fueron un Espectrómetro de Masas de Alta Resolución con Plasma Acoplado por inducción (EM-AR-PCI) y un Espectroscopio de Emisión Atómica con Plasma Acoplado por Inducción (EEA-PAI). Cuando se calculó el contenido de metales del Factor VIII, se resto el contenido de metales de la solución tampón.

Las muestras a partir de las fracciones que muestran la más alta actividad del Factor VIII y contenido de metales se analizaron por análisis de aminoácidos para la determinación de la concentración de proteína. Para calcular las concentraciones molares, se usaron las masas moleculares de 165,305 Da para r-VIII SQ y 220,000 Da para pd-FVIII. Se calcularon las relaciones molares de los iones metálicos y del Factor VIII. Los resultados, mostrados en la Tabla 1, indican que tanto el r-VIII SQ y el pd-FVIII contienen 1 mol de cobre, calcio y zinc por mol del Factor VIII. La relación para el calcio podría estar sobrestimada debido a la alta concentración base de calcio en la solución tampón.

TABLA I

Relación Molar (mol de ión metálico por mol del Factor VIII)
Ión Metálico	r-VIII SQ	Pd-fVIII
Ca^{2+}	1.3	1.4
Cu^{2+}	0.8	1.0
Zn^{2+}	0.9	1.0

Los métodos usados para análisis de metales también permiten la cuantificación de magnesio, manganeso, níquel, hierro, cobalto, estroncio, etc., pero ninguno de estos iones metálicos fue detectado en las preparaciones del Factor VIII.

Ejemplo 2 La estabilidad de las composiciones del Factor VIII en la presencia de iones metálicos divalentes

La estabilidad de las composiciones del Factor VIII de acuerdo con la invención es probada mediante la preparación de composiciones que tienen varias cantidades de iones metálicos divalentes de Ca^{2+}, Zn^{2+} y Cu^{2+}. Después de un almacenamiento por un periodo de tiempo adecuado, la actividad del Factor VIII es determinada por métodos conocidos en el arte, por ejemplo como está descrito por Rosén (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145; y por Carlebjörk et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14. De acuerdo con la invención, los resultados indican que las composiciones del Factor VIII, que comprenden una concentración óptima de iones metálicos divalentes tienen unas propiedades ventajosas en lo que se refiere a la estabilidad a largo plazo.

Ejemplo 3 El efecto de iones metálicos divalentes durante el cultivo de una línea celular expresando el Factor VIII recombinante 3.1. Materiales y métodos

Una variante clonal de la célula de ovario de hámster chino (COHTf677:16 SQ) manipulada para expresar el rFVIII (ver Lind, P. et al. (1995) Eur. J. Biochem 232, 19-27) se usó en todos los experimentos. Las células fueron cultivadas como cultivos en suspensión en frascos de centrífuga usando un medio de cultivo libre de suero de manufactura propia, que contiene una insulina recombinante (Nucellin-Zn™ o Nucellin-Na™, Eli Lilly). Debería advertirse que la concentración de Zn^{2+} en el medio de cultivo fue de 0.3- 0.9 \muM, y que la concentración de Ca^{2+} fue de 0.3 mM a lo largo de todo el experimento (incluido el control).

Un método de prueba a pequeña escala fue establecido para la revisión de los aditivos del componente del medio. Para mantener las células en suspensión se empleó, una mesa de agitación AgCell (BeLach Bioteknik AB) equipada con recipientes para tubos Falcon de 50 ml.

El volumen del cultivo en los tubos fue de 5 ml y la densidad de las células 1.5 x 106 células por ml. El medio fue cambiado después de 3 días por centrifugación, 950 rpm (182 x g) durante 5 minutos.

Los cultivos fueron incubados en la mesa de agitación, a una velocidad de 130-140 agitaciones por minuto y monitoreadas por 5 días. La densidad de la célula, la viabilidad y la concentración de r-VIII SQ fueron determinadas al 3, 4, y 5 día. Al final de los experimentos, las densidades de la célula fueron típicamente alrededor de 1 x 106 células por ml y la viabilidad mayor que el 90%. La concentración del Factor VIII fue cuantificada por un ensayo cromogénico, Coatest® (Chromogenix). Cf. Rosén (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145; y Carlebjörk et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14.

3.2. Resultados Controles

Los controles positivos recibieron 30 mg/L de Nucellin-Zn. La producción media acumulada para los controles positivos fue de 56 IU/ml r-VIII SQ después de los 5 días de producción (Tabla II). Omitiendo toda la insulina junta resulta en una pobre supervivencia y viabilidad y como consecuencia una productividad pobre. Los valores acumulados alcanzados sin Nucellin-Zn fueron de 8.5 IU/ml.

Todas las concentraciones probadas en un experimento de titulación con Nucellin-Zn, (concentraciones finales de 1, 5, 10, 20 y 30 mg/L) llevaron a una buena supervivencia de las células. La concentración más baja probada (1 mg/L) no fue claramente suficiente para soportar también una buena productividad. La titulación mostró una correlación dosis-respuesta; cuanto más Nucellin-Zn, mayor la producción del total acumulado. La concentración más alta (30 mg/L) dio un incremento del 62% comparado al 1 mg/L.

Para poder comparar adiciones de metales al medio de cultivo, fue empleado un análogo de insulina (Nucellin-Na, Eli Lilly) que contiene sodio en lugar de zinc. Concentraciones en incremento de Nucellin-Na no mostraron un claro efecto en la respuesta a la dosis como el visto con el Nucellin-Zn. La diferencia en el producto acumulado entre las concentraciones probadas, la más baja (1 mg/L) y la más alta (30 mg/L), fue del 22%.

Incrementando las cantidades de Zn^{2+}

Cantidades en incremento de Nucellin-Na (1, 5 y 20 mg/L) se combinaron con niveles en incremento de ZnCl_{2} (0.15, 0.75, 1.5, 3.0 y 4.5 \muM) para evaluar el efecto del Zn^{2+} sobre la productividad.

En todas las cantidades de Nucellin-Na probadas, la adición de ZnCl_{2} dio una mejor producción del producto. Usando 5 o 20 mg/L de Nucellin-Na (ver Fig. 3) en combinación con ZnCl_{2} se llegó a una producción del producto acumulada de 57-58 IU/ml. Estos resultados corresponden a la producción alcanzada con el control positivo (30 mg/L de Nucellin-Zn). Comparado con el control que no recibió ZnCl_{2} pero solamente Nucellin-Na a 5 mg/L, los valores totales acumulados de 57 IU/ml corresponden a un incremento del 14% (ver Tabla II). Ya que un incremento por encima de 5 mg/L de Nucellin-Na no permite unos títulos del producto más altos, esta concentración se escogió para próximos experimentos.

Incremento de las cantidades de Cu^{2+}

Complementando el medio con incrementos de las cantidades de CuCl_{2} (0.02, 0.1, 0.5, y 2 \muM) se llego a una producción del producto acumulada de 61 IU/ml (Fig. 4 y Tabla II). Este fue in incremento del 22% comparado con el control interno.

Combinaciones de Zn^{2+} y Cu^{2+}

Con las combinaciones de ZnCl_{2} (0.75, 1.5, 3.0 y 4.5 \muM) y CuCl_{2} (0.1 o 0.5 \muM), los niveles totales acumulados del producto incrementaron en un 28% (64 IU/ml) comparados con el control interno (Tabla II). Consecuentemente, se pudo observar un efecto sinérgico de Zn^{2+} y Cu^{2+}. La Fig. 5 muestra el resultado obtenido con 0.5 \muM de CuCl_{2}.

TABLA II

Actividad del Factor VIII (IU/ml); título acumulado al día 5
	IU/ml	% del control interno
Control positivo: Nucellin-Zn (30 mg/L)	56	113
Control interno: Nucellin-Na (5 mg/L)	50	100
Nucellin-Na (5 mg/L)+ ZnCl_{2} (0.75 a 4.5 \muM)	57	114
Nucellin-Na (5 mg/L)+ CuCl_{2} (0.5 a 5 \muM)	61	122
Nucellin-Na (5 mg/L)+ CuCl_{2} (0.1 o 0.5 \muM)+ ZnCl_{2} (0.75 a 4.5 \muM)	64	128

Ejemplo 4 Influencia del calcio, cobre y zinc sobre la re-asociación de subunidades reducidas separadas de metal-ión y sobre la reconstitución de la actividad del FVIII Materiales y Métodos (i) Disociación de la subunidades del FVIII

Como se describe en el Ejemplo 1, La preparación del r-VIII SQ fue material de la etapa de butil-Sepharose en el proceso de purificación. Las cadenas pesadas y ligeras del r-VIII SQ fueron disociadas por la incubación del r-VIII SQ con el EDTA agente quelante. La actividad del Factor VIII se perdió en paralelo. Se mezclaron volúmenes iguales de r-VIII SQ y EDTA 0.5 M, Tris 100 mM, pH 7.4 y se dejaron a temperatura ambiente durante 6 h. Los complejos iónicos metal-EDTA fueron removidos mediante una cromatografía sobre una columna de Sepharose G-25 con Tris 20 mM, NaCl O.3 M, Tween 20 al 0.01%, pH 7.5.

(ii) Purificación de subunidades separadas del FVIII

Como se describe en el Ejemplo 1, la preparación del r-VIII SQ fue material de la etapa de butil-Sepharosa en el proceso de purificación. Se mezclaron volúmenes iguales del r-VIII y EDTA 0.5 M, Tris100 mM, pH 8.0 y se dejaron toda la noche a 5ºC. Luego la mezcla fue aplicada sobre una columna de afinidad, con anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la cadena de 80 kDa del FVIII. La cadena libre de 80 kDa así como la cadena de 170 kDa fue unida a la columna. Se colectó el fluido, que contenía la cadena libre de 90 kDa. Luego se eluyó la columna con Tris 20 mM, CaCl_{2} 50 mM, etilen glicol al 50%, Tween 80 al 0.02%, pH 6.8. Se colectaron las fracciones que contenían las proteínas, se diluyeron 1:5 con la misma solución tampón sin etilen glicol y se aplicó sobre otra columna de afinidad, con anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la cadena de 90 kDa. Se unió a la columna la cadena de 170 kDa. Se colectó el fluido que contenía la cadena de 80 kDa. Parte de la sustancia del fluido se concentró por ultrafiltración (PallFiltron filter, 30k de recorte). La concentración de la Proteína se determinó o por análisis de aminoácidos o por el método Lowry (Kit de SIGMA) usando BSA como el patrón.

(iii) Reasociación de las subunidades del FVIII y reconstitución de la actividad

La subunidades del FVIII se reasociaron y se reconstituyó la actividad del FVIII por adición de iones metálicos. En todos los experimentos, inicialmente se adicionó cloruro de calcio(c. 5 mM). Posteriormente después de la incubación, durante la noche a temperatura ambiente, se adicionó cloruro de cobre(II) y/o cloruro de zinc. La relación molar final de Cu^{2+} o Zn^{2+} / r-VIII SQ fue de 50-67. Posteriormente la mezcla se incubo por 1-5 días. La actividad coagulante del Factor VIII se midió por el método de sustrato cromogénico como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados a) Reconstitución de la actividad del F VIII después de la incubación del r-VIII SQ con EDTA

El r-VIII SQ se trató de acuerdo con la descripción (i) en Materiales y Métodos. En el día 0, después de 6h de incubación del r-VIII SQ con EDTA y la separación de los complejos iónicos metal-EDTA, se adicionó cloruro de calcio (5 mM) para disociar las subunidades del r-VIII SQ. Después de la incubación a 22ºC por 1 día, la mezcla se dividió en 4 partes se diluyó igualmente con solución tampón o con soluciones de cloruro de cobre(II) y/o cloruro de zinc. La concentración final de proteína fue de 88 \mug/ml. La relación molar de Cu^{2+} y Zn^{2+} / r-VIII SQ fue de 50. Luego se midió cada día durante 1 semana la actividad coagulante (VIII:C) del FVIII. En este experimento fue posible alcanzar la actividad total del factor VIII. Como se muestra en la Figura 6, la actividad más alta del FVIII se obtuvo con una combinación de calcio, cobre y zinc.

b) Reconstitución del complejo 80+90 kDa del F VIII activo de r-VIII SQ a partir de las subunidades separadas y aisladas

Las cadenas separadas, de 90 y 80 kDa del r-VIII SQ, preparadas de acuerdo a la descripción (ii) en Materiales y Métodos, se mezclaron (32 \mug de cada una) en una solución tampón que contenía cloruro de calcio 5 mM (histidina 10 mM, Tris10 mM, NaCl 0.3 M, CaCl_{2} 5 mM, Tween 80 0.02%, pH 7.2). Después se incubó durante 5 h a 22ºC, La mezcla se dividió en cuatro partes y se diluyó igualmente con la solución tampón o con soluciones de cloruro de cobre (II) y/o cloruro de zinc. La concentración final de proteína fue de 197 \mug/ml. La relación molar de Cu^{2+} y Zn^{2+} /
r-VIII SQ fue de 60. Después de 19 h de incubación a 22ºC, se midió la actividad coagulante (VIII:C) del FVIII de cada muestra. Abajo la tabla III muestra los resultados obtenidos en este experimento.

TABLA III

Muestra No	Iones metálicos adicionados	VIII:C(IU/ml)	Actividad Específica	Actividad
			(IU/\mug)	reconstituida*(%)
1	Calcio	12	0.1	1
2	Calcio, Cobre	120	0.6	6.4
3	Calcio, Zinc	280	0.9	6
4	Calcio, Cobre, Zinc	732	3.7	26
* La actividad reconstituida es expresada en el porcentaje de la actividad específica del r-VIII SQ intacto (14.3
IU/\mug).

Las muestras a partir del experimento de reconstitución descrito en la tabla III de arriba fueron también analizadas por CEM (cromatografía de exclusión molecular) con una columna Superdex-200. Los resultados se muestran en la Figura 7, donde:

(A) Indica la referencia del r-VIII SQ, forma (80+90) kDa;

(B) Indica la cadena aislada 80 kDa; y

(C) Indica la cadena aislada 90 kDa.

Ambas preparaciones de subunidades contienen principalmente cadenas monoméricas, pero también algunos agregados. En la figura se indican los tiempos de retención.

Las muestras a partir del experimento de reconstitución descritas arriba en la Tabla III, fueron también analizadas por CEM (cromatografía de exclusión molecular) con una columna Superdex-200. Los resultados se muestran en la Figura 8, donde:

(A) Indica la muestra que contiene Ca^{2+};

(B) Indica la muestra que contiene Ca^{2+} y Cu^{2+};

(C) Indica la muestra que contiene Ca^{2+} y Zn^{2}+; y

(D) Indica la muestra que contiene Ca^{2+}, Cu^{2+} y Zn^{2+}.

En (A) están indicadas las posiciones de la cadena pesada, la cadena ligera así como los agregados de estas. En (D) está indicada la posición del dímero de (80+90) kDa. Una línea punteada se adiciona para facilitar la comparación de los diferentes cromatogramas.

Ejemplo 5 El efecto de los iones metálicos divalentes sobre el sobrenadante de célula-libre a partir de un cultivo de una línea celular expresado en el Factor VIII recombinante

El sobrenadante de Célula-libre, obtenido a partir de un cultivo de una variante clonal de la célula de ovario del hámster Chino (COHTf677:16 SQ) manipulada para expresar rFVIII (ver Lind, P. et al. (1995) Eur. J. Biochem 232, 19-27), fue empleado para este experimento. El caldo celular de este cultivo que contiene el Factor VIII biológicamente activo, complejo de la cadena ligera de 80 k y la cadena pesada de 90 k, y que contiene cadenas ligeras libres de 80 k y cadenas pesadas libres de 90 k. Las células fueron cultivadas en un cultivo en suspensión dentro de un birreactor usando un medio de cultivo celular ordinario libre de suero que contiene zinc 0.2 a 0.8 \muM contenido en 5 mg/l de la insulina recombinante Nucellin-Zn™ (Nucellin-Zn™, Eli Lilly, el cual contiene de 0.3 a 1.08% de zinc), ZnSO_{4}.7H_{2}O 0.07 \muM, CaCl_{2} 0.3 mM y albúmina de suero humano al 0.2%.

El sobrenadante de célula-libre fue obtenido por centrifugación del caldo celular a partir de unos cultivos de suspensión a 950 rpm (182 x g) durante 5 minutos. Diferentes combinaciones de MnCl_{2} y CuCl_{2} fueron complementadas con el sobrenadante de célula-libre distribuido en diferentes alícuotas de 25 ml en tubos. Se adicionó al sobrenadante MnCl_{2} 0 ó 2.5 mM y se agitó. Una hora después, se adiciona al sobrenadante CuCl_{2} 0.53, 1.58 o 9.5 \muM y se agita. Luego, se cuantifica la concentración del factor VIII después de 0, 1, 2.5, 5 o 23 horas por un ensayo cromogénico, Coatest® (Chromogenix) en los tubos que contienen el sobrenadante de metal-complementado. Cf. Rosén (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145; and Carlebjörk et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14.

Control

Los controles fueron alícuotas del sobrenadante de célula libre con la misma agitación y el tiempo de espera en las manipulaciones como con las alícuotas del sobrenadante de metal-complementado pero sin la complementación con el metal.

Resultados

Un incremento por arriba del 45% del FVIII biológicamente activo, del título de FVIII, podría obtenerse mediante la adición de MnCl_{2} y CuCl_{2} al sobrenadante de célula libre. Títulos más alto se obtuvieron por la adición de una combinación de MnCl_{2} y CuCl_{2} comparado únicamente con al adición de CuCl_{2}. El efecto de la adición de iones metálicos fue observado rápidamente con un efecto completo obtenido después de 5 horas, ver abajo la Tabla IV. Debería notarse que la concentración de Zn^{2+} en el medio de cultivo fue de 0.3-0.9 \muM, y que la concentración de Ca^{2+} fue de 0.3 mM a lo largo de todo el experimento (incluyendo el control).

TABLA IV

Efecto de la adición de CuCl_{2} y MnCl_{2} después de 5 días y 23 horas
Condiciones	Mn^{2+} [mM]	Cu^{2+} [\muM]	FVIIIC*después	FVIIIC después	FVIIIC* después	FVIIIC después
			de 5h [IU/ml]	de 5h [%]	de 23 h [IU/ml]	de 23h [%]
Control	0	0	5.8	100	5.7	100
A	0	0.53	6.6	114	6.5	114
B	0	1.58	6.9	119	6.8	119
C	0	9.5	7.1	122	7.4	130
D	2.5	0.53	8.4	145	8.6	151
E	2.5	1.58	8.4	145	8.0	140
F	2.5	9.5	8.3	143	8.3	146
*FVIIIC es la concentración del Factor VIII cuantificada por un ensayo cromogénico, Coatest® (Chromogenix);

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende el Factor VIII y los iones metálicos divalentes Zn^{2+}, Cu^{2+} y Ca^{2+}.

2. La composición de acuerdo a la reivindicación 1, que además comprende iones Mn^{2+}.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los citados iones de Zn^{2+} están presentes en una concentración total desde 0.1 \muM a 1 mM.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los citados iones de Ca^{2+} están incluidos en una sal de calcio presente en una concentración de al menos 0.1 mM.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los citados iones divalentes están presentes en cantidades suficientes para la preservación de la actividad del Factor VIII durante el almacenamiento sin albúmina por lo menos 6 meses.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, composición que es una solución acuosa lista para usar.

7. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, composición que es secada y reconstituida antes de usar.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el Factor VIII está presente en una concentración de 50 a 50,000 IU/ml.

9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el citado Factor VIII es derivado de plasma.

10. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el citado Factor VIII es de longitud total o una deleción derivada del Factor VIII recombinante.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el citado Factor VIII es la deleción derivada identificada como r-VIII SQ.

12. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende un tensioactivo no-iónico.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el citado tensioactivo no-iónico es un éster de ácido graso de polioxietileno (20) presente en una concentración de al menos 0.01 mg/ml.

14. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente cloruro de sodio o de potasio en una concentración por encima de 0.1 M.

15. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende un aminoácido a una concentración de al menos 1 mM.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el citado aminoácido es la L-histidina.

17. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende

(i) De 50 a 50,0000 IU/ml del Factor VIII recombinante;

(ii) al menos 0.1 mM de una sal de calcio;

(iii) al menos 1 mM de L-histidina;

(iv) al menos 0.1 M de cloruro de sodio;

(v) al menos 0.01 mg/ml de un éster de ácido graso de polioxietileno (20);

(vi) una sal de zinc, en combinación con una sal de cobre, en una concentración de 0.1 \muM a 1 mM.

18. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la citada composición tiene una concentración reducida de oxígeno y/o contiene antioxidantes.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el citado antioxidante es seleccionado del grupo que consiste de glutatión, acetilcisteína y metionina.

20. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende un monosacárido o un disacárido en una concentración de al menos 100 mg/ml.