JP2003504345A

JP2003504345A - 安定第ｖｉｉｉ因子組成物

Info

Publication number: JP2003504345A
Application number: JP2001509201A
Authority: JP
Inventors: マリアンネ・ミカエルソン; ヘレナ・サンドバリィ
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1999-07-13
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2003-02-04
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: EP1194161A1; ES2252028T3; AU780415B2; AR024735A1; ATE310533T1; DE60024268D1; NO330048B1; DE60024268T2; US6599724B1; NO20020120D0; AU6193300A; EP1194161B1; CA2378751A1; CY1104986T1; WO2001003726A1; CA2378751C; JP4674021B2; DK1194161T3; NZ516400A; NO20020120L

Abstract

(57)【要約】第VIII因子およ２価金属イオンＺｎ^２＋とＣｕ^２＋を、所望によりＣａ^２＋イオンおよび／またはＭｎ^２＋イオンの存在下で含み、該第VIII因子はアルブミンの添加なしでも安定である、医薬組成物に関する。本発明はまた組換え第VIII因子を、そのための遺伝子を担持する哺乳類細胞から産生する方法であり、血清由来タンパク質がなく、Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋を含む２価金属イオンを添加された培地で、所望によりＣａ^２＋およびＭｎ^２＋イオンの存在下で該哺乳類細胞を培養することを含む方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、血液凝固第VIII因子を含む医薬組成物に関し、該組成物はアルブミ
ンの添加なしに、２価金属イオン、特にＺｎ^２＋により安定化されている。本発
明はまた、血漿由来タンパク質を含まず、２価金属イオン、特にＺｎ^２＋を添加
された培地で哺乳類細胞を培養することを含む、組換え第VIII因子の製造法に関
する。

【０００２】背景技術古典的血友病または血友病Ａは、最も一般的な遺伝性の出血性疾患である。そ
れは血液凝固第VIII因子の染色体Ｘ関連欠損に由来し、１０,０００人当り１人
または２人の発生率で、殆ど排他的に雄に影響する。Ｘ染色体欠損は、血友病で
はない雌キャリアーにより伝達される。血友病Ａの臨床症状は、異常出血傾向で
あり、第VIII因子濃縮物での処置が導入される前、重症血友病の人の寿命は２０
年より短かった。

【０００３】血漿由来の第VIII因子の濃縮物の使用は、血友病患者の情況をかなり改善して
いる。平均寿命は非常に延び、彼等の殆どは、おおよそ通常の寿命まで生存する
可能性がある。しかし、血漿由来濃縮物およびその使用に関するある問題があり
、その最も重要なものはウイルスの伝播である。種々のウイルス不活性化法が開
発されているが、血漿由来第VIII因子でウイルス伝播の危険性を完全に無くすこ
とは不可能であるように思える。

【０００４】組換え第VIII因子製品の開発が、血漿由来第VIII因子に対して、感染病因の伝
播のより低い危険性に明らかに関与する。ヒト第VIII因子をコードするＤＮＡの
分子クローニングが、Genentech Inc. (Gitschier, J. et al. (1984) Nature 3
12, 326-330; Wood, W. I. et al. (1984) Nature 312, 330-337; Vehar, G. A.
et al. (1984) Nature 312, 337-342)におよびGenetics Institute Inc. (Tool
e, J.J. et al. (1984) Nature 312, 342-347)に独立して記載されている。第VI
II因子ｍＲＮＡは、１９アミノ酸シグナルペプチドを含む２３５１アミノ酸の前
駆体タンパク質をコードする；したがって、製造された第VIII因子タンパク質は
２３３２アミノ酸長である。アミノ酸配列は、Ａ１：Ａ２：Ｂ：Ａ３：Ｃ１：Ｃ
２で配置された３つのＡドメイン、唯１つのＢドメインおよび２つのＣドメイン
からなるドメイン構造と予測される。凝血中、Ｂドメインは分子トロンビン活性
化により除去され、その機能は未知である。

【０００５】組換えヒト第VIII因子の特徴付試験(Eaton, D.L. et al. (1987) J. Biol. Ch
em. 262, 3285-3290)は、血漿由来第VIII因子と構造的および機能的に非常に類
似することを示している。プロテアーゼ阻害剤の存在下で調製された血漿におい
て、第VIII因子は９０−２００ｋＤａ(ドメインＡ１およびＡ２、種々の長さの
Ｂドメインを伴う)の間の一つの重鎖が、８０ｋＤａ軽鎖(ドメインＡ３：Ｃ１：
Ｃ２)との組み合わさった複合体のように見える。鎖はＥＤＴＡにより解離され
、それらが金属イオンにより保持されることを示す。

【０００６】組換え第VIII因子製品においてさえ、感染性病因の伝達の、小さいが、しかし
確かな化膿性がまだ存在する。ヒトアルブミンは、現在の組換え第VIII因子製品
Kogenate(登録商標)およびRecombinate(登録商標)(レビューのために、Roddie,
P. H. & Ludlam, C. A. (1997) Blood Reviews 11, 169-177参照)を安定化する
ために使用されているため、感染源の可能性がある。組換え、アルブミン含有第
VIII因子製品におけるヒトパルボウイルスＢ１９ＤＮＡの存在が報告されてい
るEis-Huebinger, A. M. et al. (1996) Thrombosis and Haemostasis 76, p. 1
120)。

【０００７】Ｂドメインを欠く組換え第VIII因子(r-VIII SQ)がPharmacia & Upjohnにより
製造されている(レビューのために、Berntorp, E. (1997) Thrombosis and Haem
ostasis 78, 256-260参照；またEP-A-0506757参照)。リンカーペプチドにより接
続された９０ｋＤａ重鎖(ドメインＡ１：Ａ２)および８０ｋＤａ軽鎖(ドメイン
Ａ３：Ｃ１：Ｃ２)から成るr-VIII SQタンパク質は、無血清であるが、ヒト血清
アルブミンを含む培地中で培養されたＣＨＯ細胞中において産生される。アルブ
ミンは最終製品を安定化する必要はなく、代わりに、表面吸着によりもたらされ
る活性の損失をもたらすことが示されている非イオン界面活性剤であるPolysorb
ate 80を含む(ＷＯ９４／０７５１０参照)。

【０００８】２価金属イオンは、第VIII因子の構造完全性およびコファクター機能に必須で
ある。しかし、どのように金属イオンがこのような役割を満たすかに関して、利
用可能な情報はほとんどない。第VIII因子サブユニットの金属依存性結合に関す
る種々のモデルが提案されている。第VIII因子は、カルシウム結合タンパク質複
合体として正常血清中に循環すると示唆されている(Mikaelsson, M. et al. (19
83) Blood 62, 1006-1015)。第VIII因子活性は、Ｃａ(II)またはＭｎ(II)の存在
下、サブユニットの組換えにより再構築されている(Fay, P. J. (1988) Arch. B
iochem. Biophys. 262, 525-531)。他の著者らは、銅原子がＡ１とＡ３度メイン
の間に位置し、重および軽鎖の間の結合の維持の必要条件であると提案している
(Bihereau, N. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222, 41-84; Pan, Y. et al.
(1995) Nature Structural Biology 2, 740-744; Pemberton, S. et al. (1997) Blood 89, 2413-2421)。

【０００９】ＵＳ５,８０４,４２０(Chan et al./Bayer Corporatoin)は、血清由来タンパ
ク質がなく、ポリオールおよび銅イオンを添加された培地における宿主細胞の培
養を含む、組換え第VIII因子の製造法を記載する。

【００１０】溶液としてr-VIII SQを製造するためのＣａ^２＋イオンの添加およびイオン強
度の増加により、数ヶ月、７℃での貯蔵安定性を到達することが可能である(Fat
ourus, A. et al. (1997) Int. Pharm. 155, 121-131)。更なる改善が、大量の
源の添加により達成されている(Fatourus, A. et al. (1997) Pharm. Res. 14(1
2), 1679-1684)。しかし、理論的に上昇させたオスモル濃度の製剤で許容される
長時間貯蔵安定性を有するものはない。

【００１１】第VIII因子の静脈内注射による代償療法は、通常患者の家庭で、患者の親また
は患者自身が行っている。投与前に、凍結乾燥された第VIII因子濃縮物を、不便
で時間がかかる無菌条件下で再構築しなければならない。結果として、しばしば
出血症状の発症と処置の間の実質的な遅延がある。この遅延は、慢性進行性関節
損傷の危険性を増加し得る。

【００１２】安定な、すぐに使用できる(ready-to-use)溶液が患者に非常な利点であろう。
簡便な投与形は、治療コンプライアンス、すなわち、より時宜を得た処置を促進
すること予測され、それにより関節破壊の発症の徴候を減少させる。患者に対す
る明白な利点の他に、凍結乾燥段階の排除は製造工程を単純にし、製造および設
備投資の両方の費用を減少させる。現在まで、入手可能な第VIII因子のすぐに使
用できる溶液はない。溶液中の第VIII因子の安定性は非常に乏しい；Ｂドメイン
欠失第VIII因子でも同じことが当てはまる。結果として、治療コンプライアンス
を促進するため、および製造工程を単純にするための、第VIII因子の安定な、す
ぐに使用できる組成物の必要性がある。

【００１３】さらに、血漿由来第VIII因子に関して、クエン酸抗凝血剤の現在の使用は、血
漿源における遊離２価イオンのレベルを減少させる。組換え第VIII因子に関して
細胞培養法における収率は、細胞培養培地中の２価金属イオンの最適濃度に依存
し得る。したがって、また組換え第VIII因子の製造における細胞培養段階を含む
、第VIII因子の精製の方法の改善が必要である。

【００１４】図面の簡単な説明図１：組換え第VIII因子(r-VIII SQ)のゲル濾過後の金属含量(Ａ)および第VIII
因子活性(Ｂ)の測定。図２：血漿由来第VIII因子のゲル濾過後の金属含量(Ａ)および第VIII因子活性(
Ｂ)の測定。図３：種々の量のＺｎ^２＋を添加した細胞培養における組換え第VIII因子(r-VII
I SQ)活性(ＩＵ／ml)。図４：種々の量のＣｕ^２＋を添加した細胞培養における組換え第VIII因子(r-VII
I SQ)活性(ＩＵ／ml)。図５：種々の量のＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋を添加した細胞培養における組換え第
VIII因子(r-VIII SQ)活性(ＩＵ／ml)。図６：ＥＤＴＡ処理純粋組換え第VIII因子(r-VIII SQ)の、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋
およびＣａ^２＋の組み合わせの使用による、活性の再構成(実施例４)。図７：そのままのr-VIII SQ、単離８０ｋＤａサブユニットおよび単離９０ｋＤ
ａサブユニットの溶出パターンを示す、実施例４の再構成実験からのサンプルの
サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)。図８：遊離８０および９０ｋＤａサブユニットとＣａ^２＋またはＣｕ^２＋と組み
合わせたＣａ^２＋またはＺｎ^２＋と組み合わせたＣｕ^２＋またはＣａ^２＋、Ｃｕ ^２＋およびＺｎ^２＋の組み合わせと混合した後の溶出パターンを示す、実施例４
の再構成実験からのサンプルのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)。

【００１５】本発明の記載驚くべきことに、第VIII因子は３つの異なる金属イオン、すなわち、Ｃａ^２＋、Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋を、各々第VIII因子のモル当たり１モル含んでいるこ
とが判明した。特に、第VIII因子における亜鉛イオンの存在は、先に報告または
示唆もされていない。この発見は、血漿由来および組換え第VIII因子の両方の製
造中の安定性および収率における改善を可能にする。

【００１６】血漿由来および組換え第VIII因子の両方に関して、所望により最適な濃度でＣ
ａ^２＋および／またはＭ^２＋と組み合わさったＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋の存在は
、精製および最終製剤の両方の間の第VIII因子の安定性および収率における有利
な影響を有する。最終的に、特に水性溶液における第VIII因子の長期貯蔵安定性
は、適当な量でのＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋、および所望によりＣａ^２＋および／
またはＭｎ^２＋の組み合わせの添加により改善される。

【００１７】結果として、第１の態様において、本発明は第VIII因子および２価金属イオン
を含む医薬組成物を提供し、該２価金属イオンはＺｎ^２＋イオンおよびＣｕ^２＋イオン、および所望によりＣａ^２＋および／またはＭｎ^２＋との組み合わせを含
み、該第VIII因子はアルブミンの添加なしで安定である。

【００１８】該２価金属イオンは、少なくとも６ヶ月、アルブミンなしで貯蔵中に第VIII因
子活性の保存に充分な量で存在する。好ましくは、該Ｃａ^２＋イオンはグルコン
酸カルシウム、または好ましくは演歌カルシウムのようなカルシウム塩を含み、
少なくとも０.１ｍＭ、例えば少なくとも約０.５ｍＭの濃度で存在する。Ｍｎ^２ ^＋が本発明の組成物に包含される場合、その濃度は少なくとも０.１ｍＭ、例え
ば、少なくとも約０.５ｍＭであり得る。必要なＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋イオン
の量は、塩化物またはあるいは他の塩として添加した場合、賦形剤、特に緩衝性
物質の選択に依存する。ヒスチジン、ホスフェートおよび通常タンパク質製剤に
使用される他の緩衝剤は金属イオンキレート化剤である欠点を有する。したがっ
て、Ｚｎ^２＋およびＣｕ^２＋イオンは、溶液中の遊離金属イオンの存在をもたら
すのに充分高い量で添加すべきである。したがって、必要な亜鉛および銅塩の総
濃度は０.１μＭから１ｍＭの間で変化し得る。

【００１９】本発明の組成物は、すぐに使用できる、または、それと異なって乾燥され、使
用前に再構築される水性溶液である。本発明の組成物において、第VIII因子は５
０から５０,０００ＩＵ／mlの濃度で存在する。第VIII因子はヒト血漿に由来し
得、または第VIII因子の完全長または欠失誘導体、特にr-VIII SQとして同定さ
れる欠失誘導体であり得る。

【００２０】ヒト血漿由来の第VIII因子の精製は、当分野で既知の、例えば、Andersson, L
. O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2979-2983に記載のよ
うな方法により行うことができる。組換え第VIII因子の産生は、当分野で既知の
方法により行うことができる、例えば、Wood, W. I. et al. (1984) Nature 312
, 330-337；またはToole, J. J. et al. (1984) Nature 312, 342-347参照。有
効な転写ユニットに組み込まれている第VIII因子ｃＤＮＡは、第VIII因子タンパ
ク質の発現のため適当な宿主生物に挿入できる。好ましくは、この生物は、正確
な転写後修飾を確実にするために、脊椎動物の動物細胞系であるべきである。使
用できる細胞系の好ましい例は、チャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で
ある。培養細胞の培地に蓄積した組換え第VIII因子タンパク質は、条件培地中の
組換え第VIII因子と他の物質の間のサイズ、電荷、溶解性、疎水性、特異的親和
性の差異を利用した方法を含む、種々の生化学的方法により濃縮および精製でき
る。本発明は、最適濃度の２価金属イオンを使用する、血漿由来または組換えの
第VIII因子の精製の改善した方法を含む。

【００２１】 “組換え第VIII因子の欠失誘導体”なる用語は、完全長第VIII因子ポリペプチ
ドから、１個以上のアミノ酸の欠失により由来する、第VIII因子活性を有する１
個以上のポリペプチド鎖として定義される。好ましくは、該欠失誘導体はほとん
どのＢドメインを欠くが、一次翻訳産物から２つのポリペプチド鎖へのインビボ
タンパク質分解的処理に必須であるＢドメインのアミノ末端およびカルボキシ末
端配列の部分を保持する。“r-VIII SQ”として同定される、このような第VIII
因子誘導体の生産物がＷＯ９１／０９１２２に記載されている、“r-VIII SQ”
は、完全長第VIII因子に由来し、アミノ酸７４３から１６３６を欠くポリペプチ
ド鎖として同定される。

【００２２】組換えまたは血漿由来の第VIII因子タンパク質は、当分野で既知の方法により
本発明の医薬組成物に製剤できる、例えば、ＷＯ９４／０７５１０参照。第VIII
因子タンパク質は、所望により薬学的アジュバントおよび／または担体を添加し
得る生理学的に適合性の慣用の水性干渉溶液に溶解し得る。

【００２３】本発明の組成物は、好ましくは非イオン性界面活性剤を含み得る。第VIII因子
および安定化剤としての非イオン性界面活性剤を含む組成物は、ＷＯ９４／０７
５１０に記載されている。非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ポロキサマー
またはポリオキシエチレン(２０)脂肪酸エステル、例えばポリソルベート２０ま
たはポリソルベート８０のようなブロックコポリマーから選択する。非イオン性
界面活性剤は、臨界ミセル濃度(ＣＭＣ)より上の量で存在すべきである(Wan & L
ee (1974) J. Pharm. Sci. 63, 136参照)。本発明の組成物は、さらに０.１Ｍを
超える濃度の塩化ナトリウムまたはカリウムを含み得る。本組成物はまたさらに
少なくとも１ｍＭの濃度でアミノ酸、例えばＬ−ヒスチジンを含み得る。

【００２４】本発明の好ましい形において、組成物は以下の成分を含む： (ｉ)５０から５０,０００ＩＵ／mlの組換え第VIII因子； (ii)少なくとも０.１ｍＭ、好ましくは少なくとも約０.５ｍＭのカルシウム塩；
例えば塩化カルシウム； (iii)少なくとも１ｍＭのＬ−ヒスチジン； (iv)少なくとも０.１Ｍの塩化ナトリウム； (ｖ)少なくとも０.０１mg／mlのポリオキシエチレン(２０)脂肪酸エステル； (vi)総量０.１μＭから１ｍＭの、所望により塩化銅のような銅イオンと組み合
わせた、塩化亜鉛のような亜鉛塩。

【００２５】本発明の水性組成物は、減少した濃度の酸素を有するおよび／または抗酸化剤
を含む組成物を含む。適当な抗酸化剤の例は、グルタチオン、アセチルシステイ
ンおよびメチオニンからなる群から選択されるものである。第VIII因子の酸素減
少水性溶液の調製は、ＷＯ９４／２６２８６から既知である。本発明の組成物に
、好ましくは１００mg／mlを超える濃度のモノまたはジサッカライドまたは糖ア
ルコール、好ましくはスクロースを、添加できる。減少した濃度の酸素を有する
および／または抗酸化剤を含む水性第VIII因子溶液であり、更に少なくとも３５
０mg／mlの濃度の炭水化物を含む溶液が、ＷＯ９６／３００４１に記載されてい
る。

【００２６】他の重要な態様において、本発明は(ｉ)血漿由来タンパク質がない基礎培地お
よび(ii)Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋イオンを含む２価金属イオンを含む、組換え第
VIII因子の産生のための細胞培養培地を提供する。所望により、該２価金属イオ
ンは更にＣａ^２＋イオンおよび／またはＭｎ^２＋イオンを含む。好ましくは、Ｃ
ａ^２＋および／またはＭｎ^２＋イオンの濃度は少なくとも約０.１ｍＭである。
該基礎培地は血漿由来タンパク質を含み得、または血漿由来タンパク質がない。

【００２７】該細胞培養培地におけるＺｎ^２＋の量は、好ましくは少なくとも約０.２μＭ
である。本発明はまたＺｎ^２＋イオンの量が少なくとも約０.５μＭから１μＭ
である細胞培養培地を含む。Ｚｎ^２＋イオンの濃度範囲は好ましくは約０.２か
ら約１０μＭである。本発明はまたＺｎ^２＋イオンが約０.２から５μＭ；０.５
から１０μＭ；０.５から５μＭ；１から１０μＭ；および１から５μＭである
細胞培養培地も含む。

【００２８】該細胞培養培地におけるＣｕ^２＋イオンの濃度範囲は、好ましくは約０.０５
から約５μＭである。本発明はまたＣｕ^２＋イオンの量が０.０５から２μＭ；
０.１から５μＭ；および０.１から２μＭである細胞培養培地を含む。

【００２９】更なる態様において、本発明は、組換え第VIII因子を、そのための遺伝子を担
持する哺乳類細胞から産生する方法であり、上記で定義の本発明の細胞培養培地
で該哺乳類細胞を培養することを含む方法を含む。

【００３０】実施例本発明をここで更に、いかなる意味でも本発明を限定するものと解釈してはな
らない以下の実施例により記載する。

【００３１】実施例１第VIII因子における金属イオン含量の測定 r-VIII SQ含有調製物(ＨＩＣ−溶出液)を、Smeds A-L. et al. (1995) Thromb
osis and Haemostasis 73, 1015により記載の精製法におけるブチル−セファロ
ース段階から得た。血漿由来第VIII因子(pd-FVIII)調製物を本質的にAndersson,
L. O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2979-2983に記載の
ように精製し、計算平均質量値２２０ｋＤａの１８５から２８０ｋＤａの第VIII
因子分子を含んだ。両方の調製物を−７０℃で貯蔵した。調製中のサンプルの金
属イオン汚染を最小限にするために特に用心をした。痕跡量の金属イオンのみの
特別純粋な試薬を使用した。プラスチックで作られた容器、試験管、チップ等を
使用し、１０％ＨＮＯ_３および水で使用前に洗浄した。

【００３２】第VIII因子サンプルの緩衝液を、室温で行ったゲル濾過により２０ｍＭトリス
(ｐＨ７.４)、０.３ＭＮａＣｌに変えた。Sephadex G-25(登録商標)、中等品(
PD-10、Amersam Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)のプレパックカラムを使
用した。カラムを２５mlの０.１ＭＨＣｌ、続いて５０mlの蒸留水で洗浄し、
その後２５mlの緩衝液で平衡化した。その後、１mlの第VIII因子サンプルをカラ
ムに適用し、フラクションを溶出中に集めた。r-VIII SQ(図１)、またはpd――V
III(図２)のゲル濾過から集めたフラクションを金属イオン(パネルＡ)および第V
III因子活性(パネルＢ)に関して分析した。

【００３３】第VIII因子活性は、本質的にRosen (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40
, 139-145;およびCarlebjoerk et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5
-14により記載のような、色素生産性基質を使用した２段階法により測定した。
第VIII因子サンプルの金属分析は、Svensk Grundaemnesanalys AB (SGAB)により
行った。使用した方法は、高分解能誘導結合プラズマ質量分析法(ＨＲ−ＩＣＰ
−ＭＳ)および誘導結合プラズマ原子発光分光分析法(ＩＣＰ−ＡＥＳ)であった
。緩衝剤中の金属含量は、第VIII因子の金属含量を計算するときに引いた。

【００３４】最高第VIII因子活性および金属含量を示すフラクション由来のサンプルを、タ
ンパク質濃度の測定に関するアミノ酸分析により分析した。r-VIII SQに関して
１６５,３０５Ｄａおよびおよびpd-FVIIIに関して２２０,０００Ｄａの分子質量
をモル濃度の計算に使用した。金属イオン対第VIII因子の分子比率を計算した。
表Ｉに示す結果は、r-VIII SQおよびpd-FVIIIの両方とも、第VIII因子１モル当
たり１モルの銅、カルシウムおよび亜鉛を含むことを示す。カルシウムの比率は
、緩衝剤中の高いバックグラウンド濃度のために過大評価されているであろう。

【００３５】金属分析に使用した方法はまたマグネシウム、マンガン、ニッケル、鉄、コバ
ルト、ストロンチウム等の定量を可能にするが、これらの金属イオンは第VIII因
子調製物中に検出されなかった。

【００３６】

【表１】

【００３７】実施例２２価金属イオンの存在下での第VIII因子組成物の安定性本発明の第VIII因子組成物の安定性を、種々の量の２価金属イオンＣａ^２＋、
Ｚｎ^２＋およびＣｕ^２＋を有する組成物を調製することにより試験する。適当な
期間の貯蔵後、第VIII因子を、例えば、Rosen (1984) J. Haematl. Vol. 33, Su
ppl. 40, 139-145；およびCarlebjoark et al. (1987) Thrombosis Research Vo
l. 47, 5-14により記載のような、当分野で既知の方法により測定する。結果は
、最適な２価濃度を含む本発明の第VIII因子生産物が長期安定性に関して有利な
特性を有することを示す。

【００３８】実施例３細胞系発現組換え第VIII因子の培養中の２価金属イオンの効果３.１. 材料および方法 rFVIIIを発現するように操作したチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHOTf667:
16SQ)のクローン化変異株(clonal variant)(Lind, P. et al. (1995) Eur. J. B
iochem. 232, 19-27)を全実験に使用した。細胞を専有の、組換えインシュリン(
Nucellin-Zn(登録商標)またはNucellin-Na(登録商標), Eli Lilly)を含む無血清
培地を使用してスピナーフラスコで懸濁培養として培養した。(コントロールを
含む)全実験を通して、培養培地中のＺｎ^２＋の濃度は０.３−０.９μＭであり
、Ｃａ^２＋の濃度は０.３ｍＭであることは注目すべきである。

【００３９】小スケール試験法を、培地成分添加剤のスクリーニングのために確立した。５
０ml Falcon試験管を装着したシェーカーテーブルAgCell(BeLach Bioteknik AB)
を懸濁中に細胞を保持するために使用した。試験管の培養容量は５mlであり、細
胞密度は１.５×１０^６細胞／mlであった。培地を３日後に９５０rom(１８２×
ｇ)で５分の遠心により変えた。

【００４０】培養物をシェーカーテーブル上で、１３０−１４０振盪／分の速度でインキュ
ベートし、５日間追跡した。細胞密度、生存能およびr-VIII SQ濃度を３、４お
よび５日目に測定した。細胞密度は典型的に１×１０^６細胞／mlの付近であり、
生存能は試験の最後で９０％より高かった。第VIII因子濃度を色素生産性アッセ
イ、Coatest(登録商標)(Chromogenix)により定量した。参照：Rosen (1984) J.
Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145；およびCarlebjoark et al. (1987) T
hrombosis Research Vol. 47, 5-14。

【００４１】３.２. 結果コントロールポジティブコントロールは３０mg／Ｌ Nucellin-Znを投与された。ポジティ
ブコントロールの平均蓄積収率は５生産日後で５６ＩＵ/ml r-VIII SQであった
(表II)。インシュリンをすべて除くことは、乏しい生存および生存能をともにも
たらし、結果として乏しい生産性であった。Nucellin-Znなしの蓄積値は８.５Ｉ
Ｕ／mlに到達した。Nucellin-Zn(１、５、１０、２０および３０mg／Ｌ最終濃度
)で力価測定実験で試験したすべての濃度は、細胞の良好な生存をもたらした。
試験した最低濃度(１mg／Ｌ)は明らかにまた良好な生産性を支持するには十分で
なかった。力価測定は用量依存性相関を示す；Nucellin-Znが高いほど、産生さ
れる総蓄積が高い。最高濃度(３０mg／Ｌ)は、１mg／Ｌと比較して、６２％増加
をした。

【００４２】培養培地への金属添加物の比較を可能にするために、亜鉛の変わりにナトリウ
ムを含むインシュリンアナログ(Nucellin-Na, Eli Lilly)を使用した。Nucellin
-Naの増加した濃度はNucellin-Znで見られた明らかな用量依存的効果をもたらさ
なかった。最低(１mg／Ｌ)および最高(３０mg／Ｌ)濃度の間の蓄積生産物の差異
は２２％であった。

【００４３】Ｚｎ^２＋の増加した量 Nucellin-Na(１、５および２０mg／Ｌ)の増加した量を、生産性におけるＺｎ
^２＋の評価のために増加したレベルのＺｎＣｌ_２(０.１５、０.７５、１.５、３
.０および４.５μＭ)と組み合わせた。

【００４４】試験した全Nucellin-Na量において、ＺｎＣｌ_２の添加は良好な生産物収率と
なった。５(図３参照)または２０mg／Ｌ Nucellin-NaをＺｎＣｌ_２と組み合わ
せて使用して、５７−５８ＩＵ／mlの蓄積生産物収率をもたらした。これらの結
果はポジティブコントロール(３０mg／ＬのNucellin-Zn)で達成された収率と一
致する。ＺｎＣｌ_２がないが、５mg／ＬのNucellin-Naのみを投与されたコント
ロールと比較して、５７ＩＵ／mlの総蓄積量は１４％の増加に対応した(表II参
照)。５mg／Ｌ Nucellin-Naを超える増加が高い生産物力価を導かないため、こ
の濃度を更なる実験に選択した。

【００４５】Ｃｕ^２＋の増加した量培地への増加した量のＣｕＣｌ_２(０.０２、０.１、０.５、２および５μＭ)
の添加は、６１ＩＵ／mlの蓄積生産物収率をもたらした(図４および表II)。これ
は内部コントロールと比較して２２％の増加であった。

【００４６】Ｚｎ^２＋とＣｕ^２＋の組み合わせＺｎＣｌ_２(０.７５、１.５、３.０および４.５μＭ)およびＣｕＣｌ_２(０.１
または０.５μＭ)の組み合わせで、生産物の総蓄積レベルは内部コントロールと
比較して２８％(６４ＩＵ／ml)の増加であった(表II)。結果として、Ｚｎ^２＋お
よびＣｕ^２＋の相乗効果が観察された。図５は０.５μＭＣｕＣｌ_２で得た結
果を示す。

【００４７】

【表２】

【００４８】実施例４カルシウム、銅および亜鉛の、分離した金属イオン枯渇サブユニットの再会合(r
e-association)およびFVIII活性の再構築における影響材料および方法 (ｉ)FVIIIのサブユニットの分離 r-VIII SQ調製物は、実施例１に記載のような精製におけるブチル−セファロ
ース段階由来の物質であった。r-VIII SQの重および軽鎖をr-VIII SQとキレート
化剤ＥＤＴＡのインキュベーションにより分離させた。第VIII因子活性は平衡し
て消失した。等量のr-VIII SQおよび０.５ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス、ｐＨ
７.４を混合し、室温に６時間放置した。ＥＤＴＡ−金属イオン錯体をセファロ
ースG-25カラムで２０ｍＭトリス、０.３ＭＮａＣｌ、０.０１％ Tween 20、
ｐＨ７.５で除去した。

【００４９】 (ii)FVIIIの分離サブユニットの精製 r-VIII SQ調製物は実施例１に記載のような精製におけるブチル−セファロー
ス段階由来の物質であった。等量のr-VIIIおよび０.５ＭＥＤＴＡ、１００ｍ
Ｍトリス、ｐＨ８.０を混合し、一晩５℃で放置した。次いで混合物をFVIIIの８
０ｋＤａ鎖に向かうモノクローナル抗体を有する親和性カラムに適用した。遊離
８０ｋＤａ鎖ならびに１７０ｋＤａ鎖がカラムに結合した。遊離９０ｋＤａ鎖を
含むフロースルー貫流を回収した。カラムを次いで２０ｍＭトリス、５０ｍＭ
ＣａＣｌ_２、５０％エチレングリコール、０.０２％ Tween 80、ｐＨ６.８で溶
出した。タンパク質含有フラクションを回収し、エチレングリコールがない同じ
緩衝液で１：５に希釈し、９０ｋＤａ鎖に配向するモノクローナル抗体を有する
別の親和性カラムに適用した。１７０ｋＤａ鎖がカラムに結合した。８０ｋＤａ
鎖を含む貫流を回収した。貫流物質の一部を限外濾過(PallFiltronフィルター、
３０ｋカットオフ)により濃縮した。タンパク質濃度をアミノ酸分析またはLowry
法(SIGMAのキット)により、標準としてＢＳＡを使用して測定した。

【００５０】 (iii)FVIIIサブユニットの再会合および活性の再構築 FVIIIサブユニットを再会合させ、FVIII活性を金属イオンの添加により再構築
した。全実験において、塩化カルシウム(約５ｍＭ)を最初に添加した。次いで、
一晩室温でインキュベーション後、塩化銅(II)および／または塩化亜鉛を添加し
た。Ｃｕ^２＋またはＺｎ^２＋／r-VIII SQの最終モル比は５０−６７であった。
混合物を更に１−５日間インキュベートした。第VIII因子凝血活性を実施例１に
記載のような色素生産性基質法により測定した。

【００５１】結果ａ)r-VIII SQとＥＤＴＡのインキュベーション後のFVIII活性の再構築 r-VIII SQを材料および方法の記載(ｉ)にしたがって処理した。０日目に、r-V
III SQとＥＤＴＡの６時間インキュベーションおよびＥＤＴＡ−金属イオン錯体
の除去後、塩化カルシウム(５ｍＭ)をr-VIII SQの解離サブユニットに添加した
。２２℃で１日のインキュベーション後、混合物を４つに分け、等しく緩衝剤ま
たは塩化銅(II)および／または塩化亜鉛の溶液で希釈した。最終タンパク質濃度
は８８μg／mlであった。Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋／r-VIII SQのモル比は５０で
あった。FVIII凝血活性(VIII:C)を次いで１週間の間１日１回測定した。完全な
第VIII因子活性をこれらの実験で達成することが可能であった。図６に示すよう
に、最高FVIII活性をカルシウム、銅および亜鉛の組み合わせで得た。

【００５２】ｂ)分離および単離サブユニット由来のr-VIII SQのFVIII活性８０＋９０ｋＤａ
複合体の再構築材料および方法の記載(ii)にしたがって調製したr-VIII SQの分離したおよび
９０および８０ｋＤａ鎖を５ｍＭ塩化カルシウム(１０ｍＭヒスチジン、１０ｍ
Ｍトリス、０.３ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ_２、０.０２％ Tween 80、ｐ
Ｈ７.２)を含む緩衝液中(各々３２μg)で混合した。５時間、２２℃でインキュ
ベーション後、混合物を４部に分け、それらを等しく緩衝液または塩化銅(II)お
よび／または塩化亜鉛の溶液で希釈した。最終タンパク質濃度は１９７μg／ml
であった。Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋／r-VIII SQのモル比は６０であった。１９
時間、２２℃でインキュベーション後、各サンプルのFVIII凝血活性(VIII:C)を
測定した。以下の表IIIは本実験で得られた結果を示す。

【００５３】

【表３】＊再構築活性はそのままのｒ−VIII SQ(１４.３ＩＵ／μg)の特異的活性のパー
セントとして示す。

【００５４】上記表IIIに記載の再構築実験からのサンプルも、Superdex-200カラムのＳＥ
Ｃ(サイズ排除クロマトグラフィー)により分析した。結果を図７に示し、その中
で： (Ａ)r-VIII SQは、(８０＋９０)ｋＤａ形の参照を示す； (Ｂ)単離８０ｋＤａ鎖を示す；そして (Ｃ)単離９０ｋＤａ鎖を示す。

【００５５】両方のサブユニットの調製物はほとんどモノマーの鎖を含むが、またいくぶん
か凝集体を含む。保持指間は図に示す。

【００５６】上記表IIIに記載の再構築実験からのサンプルも、Superdex-200カラムのＳＥ
Ｃ(サイズ排除クロマトグラフィー)により分析した。結果を図８に示し、その中
で： (Ａ)Ｃａ^２＋含有サンプルを示す； (Ｂ)Ｃａ^２＋およびＣｕ^２＋含有サンプルを示す； (Ｃ)Ｃａ^２＋およびＺｎ^２＋含有サンプルを示す；そして (Ｄ)Ｃａ^２＋、Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋含有サンプルを示す。

【００５７】重鎖、軽鎖ならびにこれらの凝集体の位置が(Ａ)で示される。(８０＋９０)ｋ
Ｄａダイマーの位置は(Ｄ)で示される。点線は異なるクロマトグラムの比較を容
易にするために追加する。

【００５８】実施例５組換え第VIII因子を発現する細胞系の培養由来の無細胞上清における２価金属イ
オンの効果 rFVIIIを発現するように操作したチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHOTf667:
16SQ)のクローン化変異株(Lind, P. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232, 19-
27参照)をこれらの実験に使用した。この培養の細胞ブロスは、生理学的に活性
な第VIII因子、軽８０ｋ鎖および重９０ｋ鎖の複合体、および遊離軽８０ｋ鎖お
よび遊離重９０ｋ鎖を含んだ。細胞を、５mg／ｌ組換えインシュリンNucellin-Z
n(登録商標)(Nucellin-Zn(登録商標), Eli Lilly、０.３から１.０８％の亜鉛を
含む)に包含された０.２から０.８μＭ亜鉛、０.０７μＭＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
、０.３ｍＭＣａＣｌ_２および０.２％ヒト血清アルブミンを含む通常の無血清
細胞培養培地を使用してバイオリアクター中で懸濁培養として培養した。

【００５９】無細胞上清を懸濁培養からの細胞ブロスを９５０rpm(１８２×ｇ)で５分遠心
することにより得た。ＭｎＣｌ_２およびＣｕＣｌ_２の異なる組み合わせを、試験
管中の２５ml量として分配された無細胞上清に添加した。０または２.５ｍＭ
ＭｎＣｌ_２を上清に添加し、撹拌した。１時間後、０.５３、１.５８または９.
５μＭＣｕＣｌ_２を上清に添加し、撹拌した。次いで、０、１、２.５、５ま
たは２３時間後、第VIII因子濃縮物を、金属色素生産性アッセイ、Coatest(登録
商標)(Chromogenix)により定量した。参照：Rosen (1984) J. Haematol. Vol. 3
3, Suppl. 40, 139-145;およびCarlebjoerk et al. (1987) Thrombosis Researc
h Vol. 47, 5-14。

【００６０】コントロールコントロールは、金属添加上清アリコートと同じ撹拌および待ち時間操作であ
るが、金属添加がない無細胞上清であった。

【００６１】生物学的に活性なFVIII、FVIII力価の４５％までの増加が、ＭｎＣｌ_２および
ＣｕＣｌ_２の無細胞上清への添加により得られた。より高いFVIII力価は、Ｃｕ
Ｃｌ_２のみの添加と比較して、ＭｎＣｌ_２およびＣｕＣｌ_２の組み合わせの添加
により得られた。金属イオン添加の効果は、５時間後に得られた十分な効果とと
もに迅速に観察された、下記表IV参照。(コントロールを含む)全実験を通して、
培養培地中のＺｎ^２＋の濃度は０.３−０.９μＭであり、Ｃａ^２＋の濃度は０.
３ｍＭであることは注目すべきである。

【００６２】

【表４】＊FVIIIは色素生産性アッセイ、Coatest(登録商標)(Chromogenix)により定量し
た第VIII因子濃度である。

【図面の簡単な説明】

【図１】組換え第VIII因子(r-VIII SQ)のゲル濾過後の金属含量(Ａ)およ
び第VIII因子活性(Ｂ)の測定。

【図２】血漿由来第VIII因子のゲル濾過後の金属含量(Ａ)および第VIII因
子活性(Ｂ)の測定。

【図３】種々の量のＺｎ^２＋を添加した細胞培養における組換え第VIII因
子(r-VIII SQ)活性(ＩＵ／ml)。

【図４】種々の量のＣｕ^２＋を添加した細胞培養における組換え第VIII因
子(r-VIII SQ)活性(ＩＵ／ml)。

【図５】種々の量のＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋を添加した細胞培養における
組換え第VIII因子(r-VIII SQ)活性(ＩＵ／ml)。

【図６】ＥＤＴＡ処理純粋組換え第VIII因子(r-VIII SQ)の、Ｚｎ^２＋、
Ｃｕ^２＋およびＣａ^２＋の組み合わせの使用による、活性の再構成(実施例４)。

【図７】そのままのr-VIII SQ、単離８０ｋＤａサブユニットおよび単離
９０ｋＤａサブユニットの溶出パターンを示す、実施例４の再構成実験からのサ
ンプルのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)。

【図８】遊離８０および９０ｋＤａサブユニットとＣａ^２＋またはＣｕ^２ ^＋と組み合わせたＣａ^２＋またはＺｎ^２＋と組み合わせたＣｕ^２＋またはＣａ^２ ^＋、Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋の組み合わせと混合した後の溶出パターンを示す、
実施例４の再構成実験からのサンプルのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/20 Ａ６１Ｋ 47/34 47/34 Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/465 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０００１７４３−４ (32)優先日平成12年５月11日(2000．5．11) (33)優先権主張国スウェーデン（ＳＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AB01 AC14 BB02 BB25 BB31 4C076 AA12 BB11 CC14 DD07 DD23 DD51 DD52 EE23 FF11 FF36 FF65 4C084 AA02 BA01 BA08 BA23 CA36 CA53 DC15 MA05 MA17 MA66 NA03 ZA532

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第VIII因子と２価金属イオンＺｎ^２＋およびＣｕ^２＋を含む
、医薬組成物。
【請求項２】更にＣａ^２＋イオンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】更にＭｎ^２＋イオンを含む、請求項１または２に記載の組成
物。
【請求項４】請求項２および３に記載の組成物。
【請求項５】該Ｚｎ^２＋イオンが０.１μＭから１ｍＭの総濃度で存在す
る、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】該Ｃｕ^２＋イオンが少なくとも０.１ｍＭの濃度で存在する
カルシウム塩に含まれる、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】該２価金属イオンが、少なくとも６ヶ月、アルブミンなしで
貯蔵中に第VIII因子活性の保存に充分な量で存在する、請求項１から６のいずれ
かに記載の組成物。
【請求項８】組成物がすぐに使用できる水性溶液である、請求項１から７
のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】組成物を乾燥させ、使用前に再構築する、請求項１から８の
いずれかに記載の組成物。
【請求項１０】第VIII因子が５０から５０,０００ＩＵ／mlの濃度で存在
する、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】該第VIII因子が血漿由来である、請求項１から１０のいず
れかに記載の組成物。
【請求項１２】該第VIII因子が組換え第VIII因子の完全長または欠失誘導
体である、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】該第VIII因子がr-VIII SQとして同定されている欠失誘導
体である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】更に非イオン性界面活性剤を含む、請求項１から１３のい
ずれかに記載の組成物。
【請求項１５】該非イオン性界面活性剤が、少なくとも０.０１mg／mlの
濃度で存在するポリオキシエチレン(２０)脂肪酸エステルである、請求項１４に
記載の組成物。
【請求項１６】更に０.１Ｍを超える濃度の塩化ナトリウムまたはカリウ
ムを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】更に少なくとも１ｍＭの濃度のアミノ酸を含む、請求項１
から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】該アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、請求項１７に記載の
組成物。
【請求項１９】 (ｉ)５０から５０,０００ＩＵ／mlの組換え第VIII因子；
(ii)少なくとも０.１ｍＭのカルシウム塩； (iii)少なくとも１ｍＭのＬ−ヒスチジン； (iv)少なくとも０.１Ｍの塩化ナトリウム； (ｖ)少なくとも０.０１mg／mlのポリオキシエチレン(２０)脂肪酸エステル； (vi)０.１μＭから１ｍＭの濃度の、所望により銅イオンと組み合わせた亜鉛塩
を含む、請求項１から１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】減少した濃度の酸素を有するおよび／または抗酸化剤を含
む、請求項１から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】該抗酸化剤がグルタチオン、アセチルシステインおよびメ
チオニンからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】更に少なくとも１００mg／mlの濃度のモノまたはジサッカ
ライドを含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】 (ｉ)基礎培地；および(ii)Ｃｕ^２＋およびＺｎ^２＋イオン
を含む２価金属イオンを含む、組換え第VIII因子の産生用の細胞培養培地。
【請求項２４】基礎培地が血漿由来タンパク質がない、請求項２３に記載
の細胞培養培地。
【請求項２５】該基礎培地が血漿由来タンパク質を含む、請求項２３に記
載の細胞培養培地。
【請求項２６】Ｃａ^２＋イオンの量が少なくとも約０.１ｍＭである、請
求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項２７】Ｚｎ^２＋イオンの量が少なくとも約０.２μＭである、請
求項２３または２６に記載の細胞培養培地。
【請求項２８】Ｚｎ^２＋イオンの量が約０.２から約１０μＭである、請
求項２７に記載の細胞培養培地。
【請求項２９】該２価金属イオンが更にＣｕ^２＋イオンを含む、請求項２
３から２８のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項３０】Ｃｕ^２＋イオンの量が約０.０５から約５μＭである、請
求項２９に記載の細胞培養培地。
【請求項３１】組換え第VIII因子を、そのための遺伝子を担持する哺乳類
細胞から産生する方法であり、請求項２３から３０のいずれかに記載の細胞培養
培地で該哺乳類細胞を培養することを含む方法。