NO330048B1

NO330048B1 - Stabile faktor VIII-sammensetninger

Info

Publication number: NO330048B1
Application number: NO20020120A
Authority: NO
Inventors: Marianne Mikaelsson; Helena Sandberg
Original assignee: Biovitrum Ab
Priority date: 1999-07-13
Filing date: 2002-01-10
Publication date: 2011-02-07
Also published as: AR024735A1; US6599724B1; ES2252028T3; EP1194161B1; EP1194161A1; NO20020120L; NZ516400A; NO20020120D0; CY1104986T1; CA2378751C; JP4674021B2; JP2003504345A; AU780415B2; DE60024268T2; AU6193300A; DE60024268D1; ATE310533T1; CA2378751A1; DK1194161T3; WO2001003726A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytiske sammensetninger som omfatter koaguleringsfaktor VIII, hvor nevnte sammensetninger blir stabilisert uten tilsetting av albumin, ved divalente metallioner, spesielt Zn<2+>.

Klassisk hemofili eller hemofili A er den mest vanlige av nedarvede blødnings-sykdommer. Den er et resultat av en kromosom X-bundet mangel av blodkoagulerings-faktor VIII, og affiserer nesten eksklusivt menn med en hyppighet på mellom ett til to individer pr. 10.000. X-kromosomdefekten blir overført fra kvinnelige bærere som ikke selv har hemofili. Den kliniske manifesteringen av hemofili A er en unormal blødningstendens, og før behandling med Faktor Vlll-konsentrater ble introdusert var gjennomsnittlig livetid for en person med alvorlig hemofili mindre enn 20 år.

Anvendelsen av konsentrater av Faktor VIII fra plasma har i stor grad forbedret situasjonen for hemofilipasienter. Den gjennomsnittlige levetid har økt og gitt de fleste av dem muligheten til å leve et mer eller mindre normalt liv. Imidlertid har det vært visse problemer med plasma-avledede konsentrater og deres anvendelse, de mest alvorlige har vært at det overføres virus. Selv om forskjellige virusinaktiveringsmetoder er utviklet, ser det ut til at det vil være umulig å gjøre plasma-avledet Faktor VII fullstendig fritt for risiko for viral transmisjon.

Utviklingen av rekombinant Faktor Vlll-produkter, som i motsetning til plasma-avledet Faktor VIII ville tydelig involvere en lavere risiko for transmisjon av infeksiøse midler. Den molekylære kloningen av DNA som koder for human Faktor VIII, ble uavhengig rapportert av forskningsgrupper fra Genentech Inc. (Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312, 326-330; Wood, W.I. et al. (1984) Nature 312, 330-337; Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312, 337-342) og fra Genetics Institute Inc. (Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312, 342-347). Faktor VIII mRNA koder for et forløperprotein på 2351 aminosyrer som inkluderer et 10 aminosyresignalpeptid; derfor er det modne Faktor Vlll-proteinet 2332 aminosyrer langt. Aminosyresekvensen predikerte en domenestruktur bestående av et triplikert A-domene, et unikt B-domene og et duplisert C-domene arrangert i rekkefølgen A1:A2:B:A3:C1:C2.1 løpet av koagulering blir B-domenet fjernet av trombinaktivering av molekylet, og dets funksjon er ukjent.

Karakteriseirngsstudier av rekombinant human Faktor VIII (Eaton, D.L. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 3285-3290) viste at den er strukturelt og funksjonelt svært lik plasma-avledet Faktor VIII. I plasma fremstilt ved tilstedeværelse av proteaseinhibitorer, fremstod Faktor VIII som et kompleks av én tung kjede mellom 90-200 kDa (domener Al og A2, med forskjellige lengder av B-domenet), i kombinasjon med én 80 kDa lett-kjede (domener A3:C1:C2) (Andersson, L.O. et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83,2979-2983). Kjedene kunne dissosieres med EDTA, hvilket indikerer at de blir holdt sammen av metallioner. Den C-terminale delen av den tunge kjeden, inneholdende det tunge glykosylerte B-domenet, har vist seg å være svært sensitivt overfor proteolytisk angrep av serinprotease.

Selv i rekombinante Faktor VHI-produkter er det fortsatt en liten men definitivt en potensiell risiko for transmisjon av infeksiøse midler. Humant albumin er en potensiell kilde til infeksjon, da det blir brukt for å stabilisere de nåværende Faktor Vin-produktene Kogenat® og Recombinate® (for en gjennomgåelse, se Roddie, P.H. & Ludlam, CA. (1997) Blood Reviews 11, 169-177). Tilstedeværelsen av humant parbovirus Bl9 DNA i rekombinant albumin inneholdende Faktor VHI-produkter, er blitt rapportert (Eis-Hubinger, A.M. et al. (1996) Thrombosis og Haemostasis 76, s. 1120).

En rekombinant Faktor VIII som mangler B-domenet, (r-VIII SQ) blir produsert av Pharmacia & Upjohn (for en oversikt, se Berntorp, E. (1997) Thrombosis and Haemostasis 78, 256-260; se også EP-A-0506757). r-VIII SQ-proteinet som består av en 90 kDa tung kjede (domener Al :A2) og den 80 kDa lettkjeden (domene A3:C1 :C2) forbundet med et linkerpeptid, blir produsert i CHO-celler dyrket i medium som er serumfritt men inneholder humant serumalbumin. Albumin er ikke påkrevet for stabilisering av sluttproduktet, som i stedet inneholder Polysorbat 80, en ikke-ionisk detergent som er blitt vist å hindre aktivitetstap forårsaket av overflateadsorpsjon (cf. WO 94/07510).

Et divalent metallion er vesentlig for den strukturelle integriteten og kofaktorfunksjonen av Faktor VIII. Imidlertid er det lite informasjon tilgjengelig med hensyn til hvordan metallioner fullfører disse rollene. Forskjellige modeller for den metallavhengige assosiasjon av Faktor VIII-subenheter er blitt foreslått. Faktor VIII er blitt foreslått å sirkulere i normalt plasma som et kalsiumbundet proteinkompleks (Mikaelsson, M. et al. (1983) Blood 62, 1006-1015). Faktor Vlll-aktivitet er blitt rekonstituert ved å rekombinere subenheter med tilstedeværelse av Ca(II) eller Mn(II) (Fay, P.J. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 262,525-531). Andre forfattere har foreslått atkobberatom er lokalisert mellom Al- og A3-domenene og er en strukturell forutsetning for å opprettholde assosieringen mellom de tunge og lette kjedene (Bihoreau, N. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222, 41-48; Pan, Y. et al. (1995) Nature Structural Biology 2, 740-744; Pemberton, S. et al. (1997) Blood 89, 2413-2421).

US 5.804.420 (Chan et al./Bayer Corporation) beskriver en fremgangsmåte for produksjon av rekombinant Faktor VIII, omfattende å dyrke vertceller i medium fritt for plasma-avledet protein og supplert med polyoler og kobberioner.

Ved tilseting av Ca<2+->ioner og økning i den ioniske styrken ved formulering r-VIII SQ som en løsning, er det blitt mulig å nå en lagringsstabilitet på noen få måneder ved +7°C (Fatourus, A. et al. (1997) Int. J. Pharm. 155,121-131). Ytterligere forbedringer er blitt oppnådd ved tilseting av store mengder sukrose (Fatouros, A. et al. (1997) Pharm. Res. 14(12), 1679-1684). Imidlertid hadde ingen av formuleringene med en rimelig forhøyet osmolalitet en akseptabel langtids lagringsevne.

WO 95707713 Al beskriver en terapeutisk anvendelse av Faktor VIII i en konsentrert og stabilisert form samt at multivalente kationer kan forbedre stabiliteten til faktor VIII. Fra WO 98/16629 er det kjent et cellekulturmedium omfattende blant annet sinksalt, mangansalt, kalsiumsalt og kobbersalt.

WO 94/26286 beskriver sammensetning for stabilsering av Faktor VIII, omfattende faktor VIII og komponenter som Ca<2+>og Mn<2+>ioner, ikke-ionisk overflateaktivt, Nacl eller KC1, en aminosyre, en antioksidant, en mono- og eller di-sakkarider. Erstatningsterapi med intravenøs injeksjon av Faktor VIII blir vanligvis gitt i pasientens hjem av foreldre eller pasienten selv. Forut for administrering må det lyofiliserte Faktor Vlll-konsentratet bli rekonstituert under aseptiske betingelser som er besværlige og tid-krevende. Som et resultat blir det ofte en vesentlig forsinkelse mellom starten på blødningssymptomene og behandlingen. Denne forsinkelse kan øke risikoen for kronisk progressive leddskader.

En stabil "klar-til-bruk"-løsning av Faktor VIII, ville være en stor fordel for pasientene. En bekvem doseringsform forventes å forsterke terapioverholdelse, dvs. en behandling i rett tid, for derved å redusere sannsynligheten for å utvikle ledd-destruksjon. Ved siden av de tidligere fordelene for pasientene, ville eliminering av lyofiliseringstrinnet forenkle fremstillingsprosessen og redusere både produksjon og investeringskostnader. For tiden er det ingen "klar-til-anvendelse"-løsninger tilgjengelige av Faktor VIII. Stabiliteten til Faktor VIII i løsning er normalt svært dårlig. Det samme gjelder for B-domenedeletert Faktor VIII. Som en konsekvens er det et behov for en stabil, "klar-til-bruk"- sammensetning av Faktor VIII for å forsterke terapien og for å forenkle fremstillingsprosessen.

For plasma-avledet Faktor VIII reduserer nåværende anvendelse av sitratantikoagulant-nivåene av frie divalente ioner i kildeplasmaet. For rekombinant Faktor VIII kan utbyttet i cellekulturprosessen være avhengig av optimale konsentrasjoner av divalente metallioner i cellekulturmediumet. Følgelig er det også et behov for forbedringer i prosessen for rensing av Faktor VIII, som inkluderer celledyrkingstrinnet i produksjonen av rekombinant Faktor VIII.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter Faktor VIII og de divalente metallionene Zn<2+>, Cu<2+>og Ca<2+>"

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1: Bestemmelse av metallioninnhold (A) og Faktor Vlll-aktivitet (B) etter gelfiltrering av rekombinant Faktor VIII (r-VIII SQ). Figur 2: Bestemmelse av metallioninnhold (A) og Faktor Vlll-aktivitet (B) etter gelfiltrering av plasma-avledet Faktor VIII. Figur 3: Rekombinant Faktor VIII (r-VIII SQ) aktivitet (IU/ml) i cellekultur supplert med forskjellige mengder Zn<2+>. Figur 4: Rekombinant Faktor VIII (r-VIII SQ) aktivitet (IU/ml) i cellekultur supplert med forskjellige mengder CU<2+>. Figur 5: Rekombinant Faktor VIII (r-VIII SQ) aktivitet (IU/ml) i cellekultur supplert med kombinasjoner av Zn<2>+ og Cu<2+>. Figur 6: Rekonstitusjon av aktivitet (IU/ml) av EDTA-behandlet ren kombinant Faktor VIII (r-VIII SQ) ved anvendelse av kombinasjoner av Zn<2+>, Cu<2+>og Ca<2+>(eksempel 4). Figur 7: Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) av prøver fra rekonstitueringseksperimenter fra eksempel 4 som viser elueringsmønstrene av intakt r-VIII SQ, den isolerte 80 kDa-subenheten og den isolerte 90 kDa-subenheten. Figur 8: Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) av prøver fra rekonstitusjonseksperimenter fra eksempel 4, som viser elusjonsmønstrene etter blanding av frie 80 og 90 kDa-subenheter med Ca<2>" eller Ca<2+>kombinert med Cu<2+>eller Ca<2+>kombinert med Zn<2+>eller en kombinasjon av Ca<2+>, Cu<2+>og Zn<2+>.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Overraskende har Faktor VIII blitt funnet å inneholde tre forskjellige metallioner, nemlig Ca<2+>, Cu<2+>og Zn<2+>, ett mol av hver pr. mol Faktor VIII. Spesielt har ikke tilstedeværelsen av sinkioner i Faktor VIII tidligere blitt rapportert eller foreslått. Dette funnet muliggjør forbedringer i stabiliteten og utbyttet av Faktor VIII under fremstilling av både plasma-avledet og rekombinant Faktor VIII.

For både plasma-avledet og rekombinant Faktor VIII, har tilstedeværelsen av Sn<2+>og Cu<2+>, eventuelt i kombinasjon med Ca<2+>og/eller Mn<2+>ved optimale konsentrasjoner fordelaktige effekter på stabiliteten av utbyttet av Faktor VIII under både rensningen og sluttformuleringen. Til slutt blir langtidslagringsstabiliteten til Faktor VIII, spesielt i vandige løsninger, forbedret ved tilsetting av Zn<2+>og Cu<2+>og eventuelt i kombinasjon med Ca<2+>og/eller Mn<2+>og i vandige mengder.

Som en konsekvens tilveiebringer denne oppfinnelsen som et første aspekt en farma-søytisk sammensetning som omfatter Faktor VIII og divalente metallioner, hvor nevnte divalente metallioner inkluderer Zn -ioner, Cu -ioner og Ca2+ -ioner.

Nevnte divalente metallioner er tilstede i mengder som er tilstrekkelige for å konservere Faktor Vlll-aktivitet under lagring uten albumin i minst 6 måneder. Fortrinnsvis blir nevnte CA<2+->ioner inkludert i et kalsiumsalt, slik som kalsiumglykonat eller fortrinnsvis kalsiumklorid, tilstede i en konsentrasjon på minst 0,1 mM, slik som minst omtrent 0,5 mM. Hvis Mn<2+>er inkludert i sammensetningen av foreliggende oppfinnelse, kan konsentrasjonen derav være minst 0,1 mM, slik som minst omtrent 0,5 mM. Mengdene av Zn<2+->og Cu<2+->ioner som kreves når de tilsettes som klorider eller mulige andre salter, er avhengig av valget av eksipienter, spesielt buffersubstansen. Histidin, fosfat og andre buffere som normalt brukes i proteinformuleringer, har den ulempe at de er metallionechelatorer. Derfor har Zn<2+->og Cu<2+->ioner blitt tilsatt i mengder som er tilstrekkelige til å resultere i tilstedeværelse av frie metallioner i løsningen. Derfor varierer den totale konsentrasjonen av sink og kobbersalter som behøves mellom 0,1 uM og 1 mM.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen er en vandig løsning klar til bruk, eller alternativt, tørket og rekonstituert før anvendelse. I sammensetningene ifølge oppfinnelsen er Faktor VIII tilstede i en konsentrasjon på fra 50 til 50.000 IU/ml. Faktor VIII kan avledes fra humant plasma eller et full-lengde eller et delesjonsderivat av rekombinant Faktor VIII, spesielt delesjonsderivatet identifisert som r-VIII SQ. Rensningen av Faktor VIII fra humant plasma kan utføres ved fremgangsmåter som er velkjente innen fagfeltet, f.eks. som beskrevet av Andersson, L.O. et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83, 2979-2983. Produksjonen av rekombinant Faktor VIII kan utføres ved fremgangsmåter velkjente innen fagfeltet, se f.eks. Wood, W.I. et al. (1984) Nature 312, 330-337; eller Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312, 342-347. Faktor VIII cDNA satt sammen til en effektiv transkripsjonsenhet kan introdusere inn i en egnet vertsorganisme for ekspresjon av Faktor VHI-proteinet. Fortrinnsvis skulle denne organismen være en dyrecellelinje av vertebratopprinnelse for å sikre korrekt post-translasjonsmodifiseringer. Et foretrukket eksempel på cellelinjer som kan anvendes er kinesiske hamsterovarieceller (CHO). Det rekombinante Faktor Vlll-proteinet som akkumuleres i mediumet til de dyrkede cellene kan konsentreres og renses ved forskjellige biokjemiske metoder, som inkluderer fremgangsmåter som utnytter forskjeller i størrelse, ladning, løselighet, hydrofobisitet, spesifikk affinitet etc. mellom den rekombinante Faktor VIII og andre substanser i det kondisjonerte medium. Foreliggende oppfinnelse inkluderer forbedrede fremgangsmåter for rensing av Faktor VIII, enten plasma-avledet eller rekombinant, hvori en optimal konsentrasjon av divalente metallioner blir brukt.

Betegnelsen "delesjonsderivat av rekombinant Faktor VIII" er definert som én eller flere polypeptidkjeder som har Faktor Vlll-aktivitet avledet fra full-lengde Faktor VIII-polypeptid ved å deletere én eller flere aminosyrer. Fortrinnsvis er nevnte delesjonsderivat fri for det meste av B-domenet, men bibeholder deler av de aminoterminale og karboksyterminale sekvensene til B-domenet som er viktig for in vz'vo-proteolytisk prosessering av det primære translasjonsproduktet inn i to polypeptidkjeder. Produksjonene av et slikt Faktor Vlll-delesjonsderivat, identifisert som "r-VIII SQ" er beskrevet i WO 91/09122. Betegnelsen "r-VIII SQ" er definert som en polypeptidkjede avledet fra full-lengde-Faktor VIII og som mangler aminosyrene 743 til 1636.

Faktor Vlll-proteinet, enten rekombinant eller plasma-avledet, kan formuleres til farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremgangsmåter velkjente innen fagfeltet, se f.eks. WO 94/07510. Faktor Vlll-proteinet kan oppløses i konvensjonelle fysiologiske kompatible vandige bufferløsninger til hvilke det blir tilsatt, eventuelt farmasøytiske adjuvanter og/eller bærere.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan fortrinnsvis omfatte et ikke-ionisk overflateaktivt stoff. Sammensetningene som omfatter Faktor VIII og et ikke-ionisk overflateaktivt stoff som en stabilisator, er beskrevet i WO 94/07510. Det ikke-ioniske overflateaktive stoffet blir fortrinnsvis valgt fira "block"-kopolymerer slik som en polyoksamer eller polyoksyetylen (20) fettsyreester, slik som polysorbat 20 eller polysorbat 80. Det ikke-ioniske overflateaktive stoffet skulle være tilstede i en mengde over den kritiske micellekonsentrasjonen (CMC) (Se Wan & Lee (1974) J. Pharm. Sei. 63, 136). Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan ytterligere omfatte natrium eller kaliumklorid i en konsentrasjon over 0,1 M. Sammensetningen kan også ytterligere omfatte en aminosyre, f.eks. L-histidin, ved en konsentrasjon på minst 1 mM.

I en foretrukket form av oppfinnelsen, omfatter sammensetningen de følgende ingrediensene: (i) fra 5 0 til 50.0000 IU/ml av rekombinant Faktor VIII; (ii) minst 0,1 mM, fortrinnsvis minst omtren 0,5 mM av et kalsiumsalt; slik som kalsiumklorid; (iii) minst 1 mM L-histidin; (iv) minst 0,1 M natriumklorid; (v) minst 0,01 mg/ml av et polyoksyetylen (20) fettsyre-ester; (vi) et sinksalt, slik son sinkklorid, eventuelt i kombinasjon med et kobbersalt, slik

som kobberklorid, i en total konsentrasjon fra 0,1 uM til 1 mM.

Vandige sammensetninger ifølge oppfinnelsen inkluderer sammensetninger som har en redusert konsentrasjon av oksygen og/eller som omfatter antioksidanter. Eksempler på egnede antioksidanter er de som er valgt fra gruppen bestående av glutation, acetylcystein og metionin. Fremstillingen av oksygenreduserte vandige oppløsninger av Faktor VIII er velkjente fra WO 94/26286. Til sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan mono- eller disakkarider eller sukkeralkoholer, fortrinnsvis sukrose, fortrinnsvis i en mengde over 100 mg/ml, tilsettes. Vandig Faktor VIII-løsninger som har en redusert konsentrasjon av oksygen og/eller som omfatter antioksidanter og hvori løsningen i tillegg omfatter et karbohydrat i en konsentrasjon på minst 350 mg/ml, blir beskrevet i WO 96/30041.

Det er også mulig å anvende et cellekulturmedium for produksjonen av rekombinant Faktor VIII omfattende (i) et basalt medium fritt for plasma-avledet protein og (ii) divalente metallioner som inkluderer Cu<2+>og Zn<2+->ioner. Eventuelt inkluderer nevnte divalente metallioner ytterligere Ca<2+->ioner og/eller Mn<2+->ioner. Fortrinnsvis er mengden av Ca<2+>og/eller Mn<2+->ioner minst omtrent 0,1 mM. Det nevnte basale mediumet kan inneholde plasma-avledede proteiner eller, alternativt, være fritt for plasma-avledede proteiner.

Mengden av Zn<2+->ioner i det nevnte cellekulturmediumet er fortrinnsvis minst omtrent 0,2 uM. Cellekulturmediumet kan ha en mengde av Zn<2+->ioner som er minst omtrent 0,5fim eller 1 uM. Konsentrasjonsområdet av Zn<2+->ioner er fortrinnsvis fra omtrent 0,2 til omtrent 10 uM. Oppfinnelsen inkluderer også et cellekulturmedium hvori mengden av Sn<2+->ioner er fra omtrent 0,2 til 5 uM; fra 0,5 til 10 uM; fra 0,5 til 5 uM; fra 1 til 10 uM; og fra 1 til 5 uM.

Konsentrasjonsområdet av Cu<2+->ioner i nevnte cellekulturmedium er fortrinnsvis fra omtrent 0,05 til omtrent 5 uM. Oppfinnelsen inkluderer også et cellekulturmedium hvori mengden av Cu<2+->ioner er fra 0,05 til 2 uM; fra 0,1 til 5 uM; og fra 0,1 til 2 uM.

EKSEMPEL 1

Bestemmelse av metallinnhold i Faktor VIII

Et preparat (HIC-eluat) inneholdende r-VIII SQ ble oppnådd fra butyl-Sepharose-trinnet i rensingsprosessen som beskrevet av Smeds A-L. et al. (1995) Thrombosis og Haemostasis 73,1015. Et plasma-avledet Faktor VIII (pd-FVIII) preparat ble renset i det vesentlige som beskrevet av Andersson, L.O. et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83, 2979-2983, og inneholdt Faktor Vlll-molekyler av 185 til 280 kDa, med en beregnet gjennomsnittlig masse på 220 kDa. Begge preparatene ble lagret ved -70°C. Spesielle forbehold ble tatt for å minimalisere risikoen for metallionkontaminering av prøvene under preparering. Ekstra rene reagenser med kun spormengder av metallioner ble anvendt. Bare beholdere, tuber, topper etc. fremstilt av plast ble brukt og ble vasket med 10% HNO3og vann før anvendelse.

Bufferen til Faktor VHI-prøvene ble byttet til 20 mM Tris (pH 7,4), 0,3 M NaCl ved

gelfiltrering utført ved romtemperatur. På forhånd pakkede kolonner med Sephadex G-25®, medium grad (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige) ble brukt. Kolonnene ble vasket med 25 ml 0,1 M HC1 etterfulgt av 50 ml destillert vann forut for ekvilibrering med 25 ml buffer. Deretter ble 1 ml av en Faktor Vlll-prøve satt på kolonnen og fraksjonene ble samlet under eluering. Oppsamlede fraksjoner fra gelfiltrering av r-VIII SQ (fig. 1) eller pd-VIII (fig. 2) ble analysert for metallioner (paneler A) og Faktor Vlll-aktivitet (paneler B).

Faktor Vlll-aktivitet ble bestemt ved en to-trinnsmetode ved å bruke et kromogent sub-strat, vesentlig som beskrevet av Rosén (1984) j Haematol. Vol. 33, suppl. 40, 139-145; og ved Carlebjork et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14. Metallanalyse av Faktor VHI-prøver ble gjennomført ved Svensk Grundåmnesanalys AB (SGAB). Metodene som ble benyttet var Hig-Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy (HR-ICP-MS) og Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy (ICP-AES). Metallinnholdet i bufferen ble trukket fra ved beregning av metallinnholdet av Faktor VIII.

Prøver fra fraksjonene som viser høyest Faktor Vlll-aktivitet og metallinnhold ble analysert ved aminosyranalyse for bestemmelse av proteinkonsentrasjon. Molekylære masser på 165.305 Da for r-VIII SQ og 220.000 Da for pd-FVIII ble anvendt for beregning av molare konsentrasjoner. Molare ratioer av metallioner og Faktor VIII ble beregnet. Resultatene vist i tabell I, indikerer at både r-VIII SQ og pd-FVIII inneholder 1 mol kopper, kalsium og sink pr. mol Faktor VIII. Forholdene for kalsium kunne bli overestimert på grunn av en høy bakgrunnskonsentrasjon av kalsium i bufferen.

Fremgangsmåtene brukt for metallanalysen tillot også kvantifisering av magnesium, mangan, nikkel, jern, kobolt, strontium etc, men ingen av disse metallionene ble detektert i Faktor Vlll-prepareringene.

EKSEMPEL 2

Stabilitet av Faktor Vlll-sammensetninger med tilstedeværelse av divalente metallioner

Stabiliteten til Faktor VIII-sammensetninger ifølge oppfinnelsen blir testet ved fremstilling av sammensetninger som har forskjellige mengder av divalente ioner Ca 2+, Zn<2+>og Cu<2+>. Etter lagring i en egnet tidsperiode blir Faktor Vlll-aktiviteten bestemt ved fremgangsmåter kjent innen fagfeltet som beskrevet av Rosen (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40,139-145; og ved Carlebjork et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14. Resultatene indikerer at Faktor Vlll-sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse omfattende en optimal konsentrasjon av divalente metallioner, har fordelaktige egenskaper når det gjelder langtidsstabilitet.

EKSEMPEL 3

Effekt av divalente metallioner under dyrkingen av en cellelinje som uttrykker rekombinant Faktor VIII

3.1. Materialer og metoder.

En klonal variant av den kinesiske hamsterovariecelle (CHOTf677:16 SQ) konstruert for å uttrykke rFVIII (se Lind, P. et al. (1995) Eur. J. Biochem 232, 19-27) ble brukt i alle eksperimentene. Cellene ble dyrket som suspensjonskulturer i spinnerflasker ved å bruke et egnet, serumfritt kulturmedium inneholdende rekombinant insulin (Nucellin-Zn TIM eller Nucellin-Na TKÆ , Eli Lilly). Det skal bemerkes at konsentrasjonen av Zn "7 -I- i kulturmediumet var fra 0,3-0,9 uM, og at konsentrasjonen av Ca<2+>var 0,3 mM under hele eksperimentet (inklusive kontrollen).

En små-skala-testmetode ble etablert for screening av mediumkomponenttilsetninger. Et ristebord AgCell (BeLach Bioteknik AB) utstyrt med holdere for 50 ml Falconrør ble brukt for å holde cellene i suspensjon. Kulturvolumet i rørene var 5 ml og celletettheten 1,5 x IO<6>celler pr. ml. Mediumet ble byttet etter 3 dager ved sentrifugering, 950 rpm (182 x g) i 5 minutter.

Kulturene ble inkubert på ristebordet ved en hastighet på 130-140 ristinger pr. min. og målt i 5 dager. Celletetthet, viabilitet og r-VIII SQ-konsentrasjon ble bestemt på dagene 3,4 og 5. Celletettheten var typisk omtrent 1 x IO<6>celler pr. ml og viabiliteten høyere enn 90% på slutten av eksperimentene. Faktor Vlll-konsentrasjon ble kvantifisert ved en kromogen analyse, Coatest® (Chromogenix). Cf. Rosen (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145; og Carlebjork et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14.

3.2. RESULTATER

Kontroller

De positive kontrollene mottok 30 mg/L Nucellin-Zn. Det gjennomsnittlige akkumulerte utbyttet for de positive kontrollene var 56 IU/ml r-VIII SQ etter de 5 produksjonsdagene (Tabell II). Utelatelse av insuling resulterte i dårlig overlevelse og levedyktighet og som en konsekvens, dårlig produktivitet. Akkumulerte verdier nådd uten Nucellin-Zn var 8,5 IU/ml.

Alle konsentrasjoner som ble testet i et titreringseksperiment med Nucellin-Zn, (1, 5, 10,20 og 30 mg/l sluttkonsentrasjoner) resulterte i god overlevelse av cellene. Den laveste konsentrasjonen som ble testet (1 mg/ml) var klart ikke tilstrekkelig for å understøtte også god produktivitet. Titreringen viste en doseresponskorrelasjon; jo mer Nucellin-Zn, desto høyere totalt akkumulert utbytte. Den høyeste konsentrasjonen (30 mg/l) ga en 62% økning sammenlignet med 1 mg/l.

For å være i stand til å sammenligne metalltilsetninger til kulturmediumet, ble det brukt en insulinanalog (Nucellin-Na, Eli Lilly) inneholdende natrium i stedet for sink. Økning av konsentrasjoner av Nucellin-Na resulterte ikke i den klare doseresponseffekten sett med Nucellin-Zn. Forskjellen i akkumulert produkt mellom den laveste (1 mg/l) og den høyeste (30 mg/l) konsentrasjon som ble testet, var 22%.

Økende mengder av Zn<2+>

Økende mengder av Nucellin-Na (1,5 og 20 mg/l) ble kombinert med økende nivåer av ZnCl2(0,15, 0,75, 1,5, 3,0 og 4,5 uM) for å vurdere Zn<2+->effekten på produktivitet.

I alle Nucellin-Na-mengdene som ble testet ga tilsetning av ZnCb et bedre produktutbytte. Bruk av 5 (se Fig. 3) eller 20 mg/l Nucellin-Na i kombinasjon med ZnCh resulterte i et akkumulert produktutbytte på 57-58 IU/ml. Disse resultatene korresponderer med utbyttet oppnådd med den positive kontrollen (Nucellin-Zn ved 30 mg/l). Sammenlignet med kontroller som ikke mottok ZnCb men kun Nucellin-Na ved 5 mg/l, korresponderte de totale akkumulerte verdiene av 57 IU/ml med en økning på 14% (se Tabell II). Siden en økning over 5 mg/l Nucellin-Na ikke førte til høyre produkt-titere, ble denne konsentrasjonen målt for videre eksperimenter.

Økende mengder av Cu<2+>

Supplering av mediumet med økende mengder av CuCl2(0,02, 0,1, 0,5,2 og 5 uM) resulterte i et akkumulert produktutbytte på 61 IU/ml (fig. 4 og tabell II). Dette var en økning på 22% sammenlignet med den interne kontrollen.

Kombinasjoner av Zn<2+>og Cu<2+>

Med kombinasjoner av ZnC^ (0,75,1,5, 3,0 og 4,5 uM) og CuC^ (0,1 eller 0,5 uM) økte de totale akkumulerte nivåene av produktet med 28% (64 IU/ml) sammenlignet med den interne kontrollen (Tabell II). Som en konsekvens kunne en synergistisk effekt av Zn<2+>og Cu<2+>observeres. Fig. 5 viser resultatene ervervet med 0,5 uM CuCb.

EKSEMPEL 4

Innflytelse av kalsium, kobber og sink på reassosieringen av separerte, metallion-uttømte subeneheter og på rekonstitusjon av FVIII-aktivitet

MATERIALER OG METODER

(i) Dissosiering av subenheter av FVIII

r-VIII SQ-prepareringen var materiale fra butyl-Sepharose-trinnet i rensningsprosessen som beskrevet i Eksempel 1. Den tunge og lette kjeden av r-VIII SQ ble dissosiert ved inkubering av r-VIII SQ med det chelaterende midlet EDTA. Faktor-Vlll-aktiviteten ble tapt i parallell. Like volum av r-VIII SQ og 0,5 M EDTA, 100 mM Tris, pH 7,4, ble blandet og fikk stå i romtemperatur i 6 timer. EDTA-metallionkomplekser ble fjernet ved kromatografi på en Sepharose G-25-kolonne i 20 mM Tris, 0,3 M NaCl, 0,01% Tween 20, pH 7,5.

(ii) Rensning av separate subenheter fra FVIII

r-VIII SQ-prepareringen var materiale fra butyl-Sepharose-trinnet i rensningsprosessen som beskrevet i Eksempel 1. Like volum av r-VIII og 0,5 M EDTA, 100 mM Tris, pH 8,0 ble blandet og fikk stå overnatt ved 5°C. Blandingen ble deretter anvendt på en affinitetskolonne med monoklonale antistoffer rettet mot 80 kDa-kjeden til FVIII. Fri 80 kDa-kjede såvel som 170 kDa-kjeden ble bundet til kolonnen. Gjennomstrømningen, inneholdende fri 90 kDa-kjede ble samlet opp. Kolonnen ble deretter eluert med 20 mM Tris, 50 mM CaC12, 50% etylenglykol, 0,02% Tween 80, pH 6,8. Proteinet inneholdende fraksjoner ble samlet opp, fortynnet 1:5 med den samme buffer uten etylenglykol og satt på en annen affinitetskolonne med monoklonale antistoffer rettet mot 90 kDa-kjeden. Den 170 kDa-kjeden ble bundet til kolonnen. Gjennomstrømningen inneholdende 80 kDa-kjeden ble samlet opp. Del av gjennomstrømningsmaterialet ble konsentrert ved ultrafiltrering (PallFiltron-filter, 30k "cut off). Pro teinkonsentrasj onen ble bestemt enten ved aminosyreanalyser eller ved Lowry-metoden (Kit fra SIGMA) ved å bruke BSA som standard. (iii) Reassosiering av FVIII-subenheter og rekonstitusjon av aktivitet FVIII-subenheter ble reassosiert og FVIII-aktiviteten ble rekonstituert ved tilsetting av metallioner. I alle eksperimenter ble kalsiumklorid (c. 5 mM) initiert tilsatt. Etter inkubering overnatt ved romtemperatur ble deretter kobber(II)klorid og/eller sinkklorid tilsatt. Den endelige molare ratioen av Cu<2+>eller Zn<2+>/r-VIII SQ var 50-67. Blandingen ble ytterligere inkubert i 1-5 dager. Faktor Vlll-koagulantaktivitet ble målt ved en kromogen substratmetode som beskrevet i Eksempel 1.

RESULTATER

a) Rekonstituering av F Vlll-aktivitet etter inkubering av r-VIII SQ med EDTA. r-VIII SQ ble behandlet ifølge beskrivelsen (i) i materialer og metoder. På dag 0, etter 6

timers inkubering av r-VIII SQ med EDTA og fjerning av EDTA-metallionkomplekser,

ble kalsiumklorid (5 mM) tilsatt til dissosierte subenheter av r-VIII SQ. Etter inkubering ved 22°C i 1 dag ble blandingen delt i 4 deler og fortynnet likt med buffer eller løsnin-ger av kobber(II)klorid og/eller zinkklorid. Den endelige proteinkonsentrasjonen var 88 ug/ml. Den molare ratioen Cu<2+>og Zn<2+>/r-VIII SQ var 50. FVIII-koagulantaktiviteten (VIILC) ble deretter målt én gang pr. dag i 1 uke. Full faktor Vlll-aktivitet var mulig å oppnå i disse eksperimentene. Som vist i Figur 6 var den høyeste FVIII-aktiviteten oppnådd med en kombinasjon av kalsium, kobber og sink.

b) Rekonstituering av det F Vlll-aktive 80+90kDA-komplekset av r-VIII SQ fra separerte og isolerte subenheter

Separerte og 90 og 80 kDa-kjeder av r-VIII SQ, fremstilt i overensstemmelse med beskrivelsen (ii) i materiale og metoder, ble blandet (32 ug av hver) i en buffer inneholdende 5 mM kalsiumklorid (10 mM histidin, 10 mM Tris, 0,3 NaCl, 5 mM CaCl2, 0,02% Tween 80, pH 7,2). Etter inkubering i 5 timer ved 22°C ble blandingen delt i fire deler som ble fortynnet likt med buffer eller løsninger av kobber(II)klorid og/eller sinkklorid. Den endelige proteinkonsentrasjonen var 197 ug/ml. De molare forhold for Cu<2+>og Zn<2+>/r-VII SQ var 60. Etter 19 timers inkubering ved 22°C ble FVIII-koagulantaktiviteten (VIII:C) av hver prøve målt. Tabell III nedenfor viser resultatene ervervet i dette eksperimentet.

Prøver fra rekonstitusjonseksperimentet beskrevet i tabell III ovenfor ble også analysert ved SEC (størrelseseksklusjonskromatografi) på en Superdex-200-kolonne. Resultatene er vist i figur 7, hvor: (A) betegner referanse til r-VIII SQ, (80+90) kDa-form;

(B) betegner isolert 80 kDa-kjede; og

(C) betegner isolert 90 kDa-kjede.

Begge prepareringene av subenheter inneholder for det meste monomere kjeder, men

også noen aggregater. Retensjonstidene er indikert i figuren.

Prøver fra rekonstitueringseksperimentet beskrevet i Tabell III ovenfor ble også analysert ved SEQ (størrelseseksklusjonskromatografi) på en Superdex-200-kolonne. Resultatene er vist i figur 8, hvor: (A) betegner prøve inneholdende Ca<2+>; (B) betegner prøve inneholdende Ca<2+>og Cu<2+>;

(C) betegner prøve inneholdende Ca<2+>og Zn<2+>;og

(D) betegner prøve inneholdende Ca<2+>, Cu<2+>og Zn<2+>.

Posisjonen til den tunge kjeden, den lette kjeden såvel som aggregatene av disse er

indikert i (A). Posisjonen til (80+90) kDa-dimeren er indikert i (D). En prikket linje er satt inn for å lette sammenligning av de forskjellige kromatogrammene.

EKSEMPEL 5

Effekt av divalente metallioner på cellefri supernatant fra dyrking av en cellelinje som uttrykker rekombinant Faktor VIII

Cellefri supernatant ervervet fra en dyrkning av en klonal variant av den kinesiske ham-sterovariecellen (CHOTf677:16 SQ) fremstilt for å uttrykke rFVIII (se Lind, P. et al.

(1995) Eur. J. Biochem 232,19-27) ble brukt for disse eksperimentene. Cellenærings-mediumet fra denne dyrkningen inneholdt biologisk aktiv faktor VIII, kompleks av den lette 80 kDa-kjeden og den tunge 90 kDa-kjeden, og inneholdt frie lette 80 kDa-kjeder og frie tunge kDa-kjeder. Cellene ble dyrket som suspensjonskultur i en bioreaktor ved å bruke et ordinært serumfritt celleculturmedium inneholdende 0,2 til 0,8 uM sink inneholdt i 5 mg/l rekombinant insulin Nucellin-Zn TAÆ (Nucellin-Zn Tik*, Eli Lilly, som inneholder 0,3 til 1,08% sink), 0,07 uM ZnS04,7H20, 0,3 mM CaC12 og 0,2% humant serumalbumin.

Cellefri supernatant ble ervervet ved sentrifugering av cellenæringsmedium fra en suspensjonskultur ved 950 rpm (182 x g) i 5 minutter. Forskjellige kombinasjoner av MnC12 og CuC12 ble supplert til den cellefrie supernatanten distribuert i forskjellige alikvoter av 25 ml volumer i rør. 0 eller 2,5 mM MnC12 ble tilsatt til supernatanten og ristet. Én time senere ble 0,53,1,58 eller 9,5 uM CuC12 tilsatt til supernatanten og ristet. Deretter, etter 0, 1,2,5, 5 eller 23 timer, ble Faktor Vlll-konsentrasjon kvantifisert ved en kromogen analyse, Coatest® (Chromogenix) i rørene inneholdende metallsupplert supernatant. Jfr. Rosén (1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145; og Carlebjork et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47,5-14.

Kontroll

Kontrollene var alikvoter av cellefri supernatant med den samme risting og ventetidsmanipuleringene som de metallsupplerte supernatant-alikvotene, imidlertid uten metallsupplering.

Resultater

En økning på opp til 45% biologisk aktivt FVIII, F VIII-titer kunne erverves ved å tilsette MnC12 og CuC12 til den cellefrie supernatanten. Høyere FVIII-titere ble ervervet ved å tilsette en kombinasjon av MnC12 og CuC12 sammenlignet med å tilsette kun CuC12. Effekten av å tilsette metallioner ble observert raskt med en full effekt ervervet etter 5 timer, se tabell IV nedenfor. Det skal bemerkes at konsentrasjonen av Zn2+ i dyrkningsmediumet var fra 0,3-0,9 uM, og at konsentrasjonen av Ca 2+ var 0,3 mM gjen-nom hele eksperimentet (inklusive kontrollen).

Claims

1. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter Faktor VIII og de divalente metallionene Zn<2+>, Cu<2+>og Ca<2+>'

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter Mn<2+->ioner.

3. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat de nevnte Zn<2+->ionene er tilstede i en total konsentrasjon på fra 0,1 uM til 1 mM.

4. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat de nevnte Ca<2+->ionene er inkludert i et kalsiumsalt tilstede i en konsentrasjon på minst 0,1 mM.

5. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte divalente metallioner er tilstede i mengder tilstrekkelig for å konservere Faktor Vlll-aktivitet under lagring uten albumin i minst 6 måneder.

6. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat sammensetningen er en vandig løsning klar for anvendelse.

7. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat sammensetningen blir tørket og rekonstituert før anvendelse.

8. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat Faktor VIII er tilstede i en konsentrasjon på fra 50 til 50.000 IU/ml.

9. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte Faktor VIII er plasma-avledet.

10. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte Faktor VIII er full-lengde eller et delesjonderivat av rekombinant Faktor VIII.

11. Sammensetning ifølge krav 10,karakterisert vedat nevnte Faktor VIII er delesjonsderivatet identifisert som r-VIII SQ.

12. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter et ikke-ionisk surfaktant.

13. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat nevnte ikke-ioniske surfaktant er en polyoksyetylen (20) fettsyreester tilstede i en konsentrasjon på minst 0,01 mg/ml.

14. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter natrium eller kaliumklorid i en konsentrasjon over 0,1 M.

15. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en aminosyre ved en konsentrasjon på minst 1 mM.

16. Sammensetning ifølge krav 15,karakterisert vedat nevnte aminosyre er L-histidin.

17. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter: (i) fra 5 0 til 50.0000 IU/m rekombinant Faktor VIII; (ii) minst 0,1 mM av et kalsiumsalt; (iii) minst 1 mM L-histidin; (iv) minst 0,1 M natriumklorid; (v) minst 0,01 mg/ml av en polyoksyetylen (20) fettsyreester; (vi) et sinksalt, i kombinasjon med et kobbersalt, i en konsentrasjon fra 0,1 uM til 1 mM.

18. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte sammensetning har en redusert konsentrasjon av oksygen og/eller inneholder antioksidanter.

19. Sammensetning ifølge krav 18,karakterisert vedat nevnte antioksidant blir valgt fra gruppen bestående av glutation, acetylcystein og metionin.

20. Sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en mono- eller disakkarid i en konsentrasjon på minst 100 mg/ml.