PT2574677T - Processos para cultura de células - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO " PROCESSOS PARA CULTURA DE CÉLULAS"

Este pedido de patente reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 61/009,328 entregue em 27 de Dezembro, 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção está relacionada com processos para a cultura de células de mamífero, particularmente células de mamífero que secretam proteínas heterólogas e/ou recombinantes e, mais particularmente, células de mamífero que secretam proteínas do sangue, tais como factor de coagulação VIII (daqui em diante "Factor VIII" ou apenas "FVIII"), ADAMTS-13, furina ou Factor de coagulação VII (daqui em diante "Factor VII" ou apenas "FVII").

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O factor de coagulação Factor VIII do sangue é uma glicoproteína presente no plasma, em quantidades vestigiais, que é encontrada em mamíferos e está envolvida como um cofactor de IXa na activação do Factor X. Uma deficiência hereditária do FVIII resulta num distúrbio hemorrágico, a hemofilia A, que pode ser tratado com êxito com Factor VIII purificado. 0 Factor VIII pode ser extraído a partir de plasma sanguíneo ou pode ser produzido por técnicas baseadas em DNA recombinante. No plasma, circula como um complexo com o Factor de von Willebrand (vWF). 0 Factor VIII recombinante (rFVIII) pode ser produzido por células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas com um vector portador de uma sequência de DNA codificadora da molécula do Facto VIII. Nalguns casos, o Factor VIII recombinante é co-produzido com o Factor de von Willebrand recombinante (rvWF), o qual estabiliza o Factor VIII. Tal co-produção pode envolver a co-cultura das respectivas linhas celulares que expressam FVIII e vWF ou a co-expressão das duas proteínas na mesma célula. Ver US 5 250 421 (Genetics Institute) e Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1233-1242.

Num processo típico para a preparação do Factor VIII recombinante, as células são cultivadas num meio e secretam Factor VIII para o meio. 0 Factor VIII pode então ser purificado a partir do meio, facultativamente como um complexo com vWF. 0 Factor VIII recombinante é de produção dispendiosa devido aos rendimentos relativamente baixos obtidos nos processos conhecidos na arte. O rendimento por célula tende a ser baixo comparativamente com o que pode ser obtido para outras proteínas recombinantes. Se o meio de cultura não for suplementado com produtos animais, como seja soro, o meio pode suportar apenas densidades celulares relativamente baixas. Isto reduz o rendimento por volume de meio. No entanto, é desejável não suplementar o meio de cultura com produtos de origem animal de forma a reduzir o risco de contaminação com virus e outros agentes transmissíveis. Os meios sem proteínas animais para a produção de FVIII são conhecidos, por exemplo, de US 6 936 441 (Baxter AG). A presente invenção proporciona processos para a produção de proteínas do sangue, incluindo rFVIII, em gue o rendimento é melhorado comparativamente com processos conhecidos na arte.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um primeiro aspecto da invenção como definido nas reivindicações proporciona um método de cultura de células de mamifero secretoras de proteínas heterólogas num sobrenadante de cultura celular em que o sobrenadante de cultura celular é mantido a uma temperatura que é fixada a 3 6±0,9°C.

Um segundo aspecto da invenção como definido nas reivindicações proporciona um método de cultura de células de mamífero secretoras de proteínas heterólogas num sobrenadante de cultura celular em que o sobrenadante de cultura celular é mantido a um pH que é fixado como X±0,05 em que X tem um valor entre 7,15 e 7,20, com a condição de ο ρΗ ser fixado como superior a 7,10.

Um terceiro aspecto da invenção como definido nas reivindicações proporciona um método de cultura de células de mamífero secretoras de proteínas heterólogas num sobrenadante de cultura celular em que o sobrenadante de cultura celular possui uma concentração de CO2 de 1-10%. É igualmente aqui divulgado um método de cultura continua de células de mamífero secretoras de FVIII num reservatório compreendendo um sobrenadante de cultura celular em que a densidade das células no sobrenadante de cultura celular é medida por um sensor em linha e o influxo de meio fresco para o recipiente é automaticamente controlado de modo a manter a densidade das células numa gama pretendida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS DA

INVENÇÃO

No processo do primeiro aspecto da invenção como definido nas reivindicações, o sobrenadante de cultura celular em que as células de mamífero são cultivadas é mantido a uma temperatura que é fixada a 36+0,9°C, de preferência 35±0,5°C, mais de preferência 36±0,2°C e ainda mais de preferência 36°C; ou 35,1°C; ou 36,5±0,2°C e mais de preferência 36,5°C. O "sobrenadante de cultura celular" é o meio em que as células de mamífero são cultivadas. Este meio não deve ser confundido com o meio de alimentação que possa ser adicionado à cultura, ainda que o meio de alimentação seja de preferência adicionado à cultura à temperatura estabelecida para o sobrenadante de cultura. Por "cultura" pretendemos significar o sobrenadante de cultura celular e as células de mamífero nele cultivadas. Convencionalmente, as células de mamífero são cultivadas a 37°C. Surpreendentemente, o requerente encontrou que a cultura das células de mamífero a uma temperatura inferior, como seja 36°C aumenta o rendimento da proteína recombinante.

Por "cultura a" ou "manutenção a" uma temperatura, referimo-nos à temperatura a que os sistemas de controlo do processo são configurados, por outras palavras a temperatura alvo pretendida. Claramente, haverá pequenas variações da temperatura de uma cultura ao longo do tempo e de localização para localização ao longo do reservatório de cultura. Quando nos referimos a "cultura a" ou "manutenção a" uma temperatura que está fixada para X±Y °C, pretendemos significar que o ponto de ajuste tem um valor entre X+Y °C e X-Y °C. Assim, por exemplo quando X é 36,010,9 °C, o ponto ajuste é fixado como um valor entre 35,1 e 36,9. Para cada um dos valores preferidos de X, o ponto de ajuste tem um valor dentro da gama de X±0,9 °C, ±0,8 °C, ±0,7 °C, ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C ou ±0,1 °C. São preferidas gamas mais estreitas. É mais preferido um ponto de ajuste para X.

Para qualquer ponto de ajuste, podem ocorrer ligeiras variações na temperatura. Tipicamente, tal variação pode ocorrer devido aos elementos de aquecimento e arrefecimento serem activados após a temperatura se ter desviado até certo ponto do ponto de ajuste. Nesse caso, o ponto de ajuste é X(±Y) e o elemento de aquecimento ou arrefecimento é activado quando a temperatura varia em ±Z °C, conforme apropriado. Tipicamente, o grau permissivel de desvio da temperatura relativamente ao ponto de ajuste antes dos elementos de aquecimento ou arrefecimento serem activados pode ser programado no sistema de controlo do processo. A temperatura pode ser controlada para o mais próximo de ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C ou mesmo ±0,1 °C pelos elementos de aquecimento e arrefecimento controlados pelo termostato. Podem ser igualmente programados diferenciais maiores na temperatura, como sejam ±0,9 °C, ±0,8 °C, ±0,7 °C ou ±0,6°C. A temperatura pode também ser controlada através da imersão do recipiente de cultura num banho de aquecimento a uma temperatura particular. Conceptualmente, não existe variação relativamente ao ponto de ajuste devido ao aquecimento ser aplicado continuamente. Uma outra fonte de variação é devida ao erro de medição na temperatura do sobrenadante da cultura celular. Tipicamente os termómetros usados no equipamento de cultura celular podem ter uma variabilidade de ±0,3 °C ou ±0,2 °C ou mesmo ±0,1 °C.

Quando o ponto de ajuste é configurado para um valor dentro da gama de X±Y °C, e a tolerância da temperatura é ±Z °C (i.e. um aquecedor ou refrigerador é activado quando a temperatura se desvia em ±Z °C, conforme adequado) esta também pode ser expressa como ponto de ajuste (X-Y a X+Y) ±Z °C. Para cada possível valor de X, todas as combinações de ±Y °C e ±Z °C, como acima indicado, estão contempladas, com a condição de a temperatura ser fixada como inferior a 37°C.

Nos métodos divulgados, a temperatura é fixada para 36±Y°C. Por exemplo, a temperatura é fixada a (35,4-36,6) ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0/ ou (35,5-36,5) ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0/ ou (35, 6-36, 4) ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (35,7- 36,3) ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (35, 8-36, 2) ±0,7 °C ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (35,9-36,1) ±0,8 °C, ±0,7 °C ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou 36 ±0,9 °C ±0,8 °C, ±0,7 °C ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0°C.

Nos métodos divulgados, a temperatura é fixada a 35,1±Y°C. Por exemplo, a temperatura é fixada a (34,5-35,7) ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (34,6-35,6) ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (34,7-35,5) ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (34,8-35,4) ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (34,9-35,3) ±0,7 °C ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (35, 0-35,2) ±0,8 °C, ±0,7 °C ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou 35,1±0,9 °C ±0,8 °C, ±0,7°C ±0,6 °C, ±0,5 °C, ±0,4 °C, ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0 °C.

Nos métodos divulgados, a temperatura é fixada a 36,5±Y°C. Por exemplo, a temperatura é fixada a (36,1-36,9) ±0; ou (36,2-36,8) ±0,1 °C ou ±0; ou (36,3-36,7) ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou (36,4-36,6) ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0; ou 36,5 ±0,4 °C. ±0,3 °C, ±0,2 °C, ±0,1 °C ou ±0.

No processo do segundo aspecto da invenção como definido nas reivindicações, o sobrenadante da cultura celular é mantido a um pH que é fixado a X±0,05, em que X tem um valor entre 7,15 e 7,20, com a condição de o pH ser fixado como superior a 7,10. Em realizações preferidas, o pH é fixado a 7,2010,05, de preferência a 7,2010,03, mais de preferência 7,2010,01 e mais de preferência a 7,20; ou 7,1510,05, de preferência 7,1510,03, mais de preferência 7,1510,01 e mais de preferência a 7,15. Num processo convencional para produção de uma proteína recombinante, o sobrenadante da cultura celular é mantido a pH 7,1. Surpreendentemente, o requerente encontrou que a cultura de células de mamífero a um pH superior, como seja pH 7,2, aumenta o rendimento da proteína recombinante.

Por "cultura a" ou "manutenção a" um pH, referimo-nos ao pH para o qual os sistemas de controlo do processo são fixados, por outras palavras o pH alvo pretendido. Quando nos referimos a "cultura a" ou "manutenção a" um pH que está programado para X±Y, pretendemos dizer que o ponto de ajuste é um valor entre X+Y e X-Y. Para cada um dos valores preferidos de X, o ponto de ajuste está num valor dentro da gama X+0,05, ±0,04, ±0,03, ±0,02 ou ±0,01. São preferidas gamas mais estreitas. Um ponto de ajuste de X é preferido.

Para qualquer ponto de ajuste, podem ocorrer ligeiras variações no pH. Tipicamente, tal variação pode ocorrer porque os meios de controlo do pH, por exemplo através da adição de um ácido ou de uma base, ou alteração da velocidade de borbulhamento, serem apenas activados após o pH se ter desviado até certo ponto do ponto de ajuste. Tipicamente, o pH é controlado para o mais próximo de ±0,05, ±0,04, ±0,03, ±0,02 ou ±0,01 unidades de pH.

Quando o ponto de ajuste do pH é configurado para um valor dentro da gama de X±Y, e a tolerância é ±Z, este pode também ser expresso como um ponto de ajuste de (X-Y a X+Y) ±Z. Para cada valor possivel de X, todas as combinações de ±Y e ±Z, como indicado acima, estão englobadas, com a condição de o pH ser programado como superior a 7,10.

Numa realização preferida, o pH é fixado a 7,20±Y. De preferência, o pH é fixado a (7,15-7,25) ±0; ou (7,16-7,24) ±0,1 ou ±0/ ou (7,17-7,23) ±0,2, ±0,1 ou ±0; ou (7,18-7,22) ±0,3, ±0,2, ±0,1 ou ±0; ou (7,19-7,21) ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 ou ±0/ ou 7,20 ±0,5, ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 ou ±0.

Numa outra realização preferida, o pH é programado para 7,15+Y. De preferência, o pH é programado para (7,11-7,19) ±0; ou (7,12-7,18) ±0,1 ou ±0; ou (7,13-7,17) ±0,2, ±0,1 ou ±0; ou (7,14-7,16) ±0,3, ±0,2, ±0,1 ou ±0; ou 7,15 ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 ou ±0.

No processo do terceiro aspecto da invenção, como definido nas reivindicações, o sobrenadante da cultura celular possui uma concentração de CO2 de 1 a 10%, por exemplo 4,0-9,0%, 5,5-8,5% ou cerca de 6-8%. Convencionalmente, a concentração de CO2 é superior a este valor devido ao CO2 produzido pelas células que não está a ser removido do sobrenadante da cultura celular. Surpreendentemente, o requerente encontrou que a manutenção da concentração de CO2 a 10% ou menos aumenta o rendimento da proteína recombinante. Ajuda o dCC>2 a ser mantido baixo se o meio de alimentação for desgaseado (por exemplo fazendo borbulhar ar através dele) assim como se ocorrer agitação do sobrenadante da cultura celular no biorrector.

De preferência, o processo de cada um dos três primeiros aspectos da invenção, como definido nas reivindicações, é operado de modo a incluir a característica particular especificada relativamente ao processo de um ou mais dos outros aspectos da invenção. Por outras palavras, quando a concentração de CO2 é mantida a 10% ou menos, é vantajoso também manter o pH a X±0,05, em que X tem um valor de 7,15 a 7,20, e/ou a temperatura a X±0,9°C, em que X tem um valor entre 35,1 e 36,5°C.

Formas de monitorização dos três parâmetros definidos (temperatura, pH e concentração de CO2) são bem conhecidas na arte e, de um modo geral, baseiam-se em sondas que são inseridas no biorreactor, ou incluídas em ansas periféricas através das quais o meio de cultura circula, ou inseridas em amostras colhidas do meio de cultura. Um sensor em linha adequado para dCC>2 e o seu uso estão descritos em Pattison et al (2000) Biotechnol. Prog. 16:769-774. Um sensor de pH em linha adequado é o Mettler Toledo InPro 3100/125/Ptl00 (Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA). Um sistema fora de linha adequado para medir dCC>2, para além do pH e p02, é o BioProfile pHOx (Nova

Biomedical Corporation, Waltham MA). Neste sistema, dCCh é medido através de eléctrodos potenciométricos dentro da gama de 3-200 mmHg com uma resolução de imprecisão de 5%. O pH pode ser medido neste sistema a uma temperatura de 37 °C, que se aproxima da temperatura do sobrenadante da cultura celular no biorreactor. Formas de alteração do parâmetro especificado de modo a mantê-lo no nível pré-definido são também bem conhecidas. Por exemplo, manter a temperatura constante geralmente envolve aquecimento ou arrefecimento do biorreactor ou do meio de alimentação (se for alimentado por um processo descontínuo ou contínuo); manter o pH constante geralmente envolve a escolha e fornecimento de tampão adequado (tipicamente bicarbonato) suficiente e adição de ácido, como seja ácido clorídrico, ou base, como seja hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio ou uma mistura dos mesmos, ao meio de alimentação conforme necessário; e manter a concentração de CO2 constante geralmente envolve o ajustamento da velocidade de borbulhamento (ver mais abaixo), ou regulação do fluxo de CO2 no espaço livre acima da superfície. É possível que a calibração de uma sonda de pH em linha possa sofrer desvios ao longo do tempo, como seja ao longo de períodos de dias ou semanas, durante os quais as células são cultivadas. Nesse caso, pode ser benéfico redefinir a sonda em linha usando medições obtidas a partir de uma sonda fora de linha recentemente calibrada. Uma sonda fora de linha adequada é a BioProfile pHOx (Nova Biomedical Corporation, Waltham MA) .

Os inventores encontraram que o aumento do pH (e.g. através da adição de NaOH) não é suficiente por si só para se conseguir o benefício máximo em termos da produção de proteína activa. Em vez disso, é desejável reduzir a concentração de CO2. Normalmente, serão mantidos constantes os outros parâmetros do processo. No entanto, os inventores encontraram que é vantajoso reduzir a concentração de CO2 mas permitir que o pH suba acima de 7,1, por exemplo, para 7,15 ou 7,2, de preferência sem adição de NaOH.

As culturas de células de mamífero necessitam de oxigénio para as células crescerem. Normalmente, este é fornecido introduzindo oxigénio na cultura através de portas de injecção. É também necessário remover o CO2 acumulado devido à respiração das células. Isto é conseguido através de "borbulhamento", i.e. passagem de um gás através do biorreactor de modo a arrastar e libertar o CO2. Convencionalmente, isto pode também ser feito usando oxigénio. No entanto, os inventores encontraram que é vantajoso usar ar em vez de oxigénio. Encontrou-se que geralmente um gás inerte convencional, como seja azoto, é menos eficaz na libertação do CO2 que a utilização de ar. Considerando que o ar é cerca de 20% de oxigénio, poder-se-ia pensar que deveria ser usado cinco vezes a quantidade de ar. No entanto, verificou-se ser inadequado em culturas em larga escala, particularmente em culturas à escala de 2500 1. Num biorreactor de 2500 1, é usada 7 a 10 vezes a quantidade de ar, de preferência cerca de 9 vezes. Por exemplo, em condições padrão, no biorreactor de 2500 1 borbulha-se O2 como bolhas de 10 pm a uma velocidade de 0,02 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora) . 0 mesmo biorreactor de 2500 1 usado de acordo com o método da invenção seria aspergido com bolhas de ar de 10 pm a uma velocidade de 0,18 WH.

Assim, encontrou-se que o uso de volumes surpreendentemente elevados de ar proporciona uma fonte adequada de oxigénio e remove o CO2 indesejável.

Durante a fase de produção, prefere-se remover CO2 através do borbulhamento de ar, como descrito acima. Este é especialmente o caso quando se usa biorreactores de grande capacidade, em que o sobrenadante de cultura celular de outra forma acumularia CO2 para niveis elevados prejudiciais. No entanto, no começo da cultura, ou na cultura em pequena escala, como seja à escala de 1 1 ou 2,5 1, o espaço livre acima da superfície pode ter uma camada de CO2. Nestas condições, níveis baixos de dCC>2 podem ainda ser conseguidos. Colocando uma camada de CO2 no espaço livre acima da superfície pode também ser usado para reduzir o pH até ao ponto de ajuste, se o pH for demasiado básico.

As células podem ser quaisquer células de mamífero que possam ser cultivadas, de preferência num processo de produção (i.e. pelo menos 1 litro), para produzir uma proteína pretendida como seja FVIII. Exemplos incluem a linha celular CV1 de rim de macaco transformada pelo SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR, como seja o subclone DUKX-B11 (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 [1980]); células de sertoli de murganho (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) ; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células do fígado de ratazana-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de fígado humano (Hep G2, HB 8 0 65) ; tumores mamários de murganho (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383:44-68 [1982])/ células MRC 5/ células FS4; e a linha celular de hepatoma humano (Hep G2) . De preferência, a linha celular é uma linha celular de roedor, especialmente uma linha celular de hamster como seja CHO ou BHK.

Um método preferido de preparação de clones estáveis de células CHO expressando uma proteina recombinante é como se segue. Uma linha de células CHO DUKX-BII, deficiente em DHFR, é transfectada com um vector de expressão de DHFR para permitir a expressão da proteina recombinante relevante, essencialmente como descrito em US 5,250,421 (Kaufman et al, Genetics Institute, Inc.) A transfecção é seleccionada com metotrexato. A amplificação da região relevante codificadora da expressão da proteina recombinante e do gene DHFR é conseguida através da propagação das células em concentrações crescentes de metotrexato. Quando apropriado, as linhas celulares CHO podem ser adaptadas ao crescimento em meio sem soro e/ou proteina, essencialmente como descrito em US 6,100,061 (Reiter et al, Immuno Aktiengesellschaft) O meio basal escolhido para a cultura da linha celular hospedeira não é critico para a presente invenção e pode ser qualquer um dos conhecidos na arte por serem adequados para a cultura de células de mamifero, ou combinação dos mesmos. Meios tais como Meio de Eagle modificação de Dulbecco, meio F-12 de Ham, meio minimo essencial de Eagle e meio RPMI-1640 e similares são comercializados. A adição de factores de crescimento, como seja insulina recombinante, é facultativa.

Historicamente, as células animais foram cultivadas em meios contendo soro animal. No entanto, tais meios são incompletamente definidos e possuem o risco de infecção. Consequentemente, os familiarizados com a arte projectaram meios "sem proteínas" que são completamente livres de qualquer proteína que não seja a produzida por via recombinante. Devido à natureza frágil do Factor VIII, a produtividade das células hospedeiras manipuladas é gravemente reduzida em condições de ausência de proteína. A albumina sérica humana é frequentemente usada como suplemento de culturas sem soro para a produção de proteínas recombinantes. A albumina por si só estabiliza o FVIII e as impurezas presentes nas preparações de albumina derivadas do soro podem também contribuir para o efeito estabilizador da albumina. Factores tais como lipoproteína foram identificados como substitutos da albumina sérica humana para a produção do Factor VIII recombinante.

Os meios preferidos incluem os divulgados em US 6 171 825 (Bayer, Inc) e US 6 936 441 (Baxter AG). 0 meio de US 6 171 825 consiste em meio mínimo essencial de Dulbecco e meio F-12 de Ham (50:50, por peso) suplementado com insulina recombinante, ferro, um poliol, cobre e, facultativamente, outros metais vestigiais. A insulina deverá ser recombinante e pode ser obtida como insulina 'Nucellin' da Eli Lilly) . Pode ser adicionada entre 0,1 e 20 pg/ml (de preferência 5-15 yg/ml, ou cerca de 10 yg/ml). O ferro é de preferência na forma de iões Fe2+, por exemplo proporcionados como FeSCy -EDTA, e podem estar presentes a 5-100μΜ (de preferência cerca de 50 μΜ) . Polióis adequados incluem copolimeros não iónicos de de poli(oxietileno) e poli(oxipropileno) tendo massas moleculares variando entre cerca de 1000 e cerca de 16000. Um poliol particularmente preferido é Pluronic F-68 (BASF Wyandotte), o qual possui uma massa molecular média de 8400 e consiste num bloco central de poli(oxipropileno) (20% por peso) e blocos de poli(oxietileno) em ambos os extremos. Pode ser comprado como Synperonic F-68 à Unichema Chemie BV. Outros incluem Pluronics F-61, F-71 e F-108. Pode-se adicionar cobre (Cu2+) numa quantidade equivalente a 50-800nM de CuS04, de preferência 100-400 nM, convenientemente cerca de 250 nM. A inclusão de um painel de metais vestigiais tais como manganês, molibdénio, silício, lítio e crómio pode levar a aumentos adicionais na produção do Factor VIII. As células BHK crescem bem neste meio basal sem proteína. O meio de US 6 936 441 baseia-se também numa mistura de 50/50 de DMEM e F12 de Ham mas inclui peptona de soja ou extracto de levedura entre 0,1 e 100 g/1, de preferência entre 1 e 5 g/1. Como uma realização particularmente preferida, pode ser usado o extracto, e.g., de peptona de soja. A massa molecular da peptona de soja pode ser inferior a 50 kD, de preferência inferior a 10 kD. A adição de peptona de soja ultrafiltrada tendo uma massa molecular média de 350 Dalton mostrou-se particularmente vantajosa para a produtividade das linhas celulares recombinantes. É um isolado de soja com um teor total de azoto de aproximadamente 9,5% e um teor de aminoácidos livres de cerca de 13% ou cerca de 7-10%.

Um meio particularmente preferido tem a seguinte composição: meio minimo sintético (e.g. 50/50 DMEM/F12 de Ham) 1 a 25 g/1; peptona de soja 0,5 a 50 g/1; L-glutamina 0,05 a 1 g/1; NaHCCh 0,1 a 10 g/1; ácido ascórbico 0,0005 a 0,05 g/1; etanolamina 0,0005 a 0,05; e selenite sódica 1 a 15 pg/l. Facultativamente, um agente tensioactivo não iónico como seja polipropilenoglicol (e.g. Pluronic F-61, Pluronic F-68, Pluronic F-71 ou Pluronic F-108) pode ser adicionado ao meio como agente anti-espumante. Este agente é geralmente aplicado para proteger as células dos efeitos negativos do arejamento ("borbulhamento") , uma vez que sem a adição de um agente tensioactivo a formação e rebentamento de bolhas de ar pode ser prejudicial para as células que estejam na superfície das bolhas de ar. A quantidade de agente tensioactivo não iónico pode variar entre 0,05 e 10 g/1, de preferência entre 0,1 e 5 g/1. Ainda, o meio pode igualmente conter ciclodextrina ou um seu derivado. De preferência, o meio sem soro e sem proteína contém um inibidor de proteases, como seja um inibidor de proteases serina, que é adequado para cultura de tecidos e que é de origem sintética ou vegetal.

Numa outra realização preferida a mistura de aminoácidos que se segue é ainda adicionada ao meio acima referido: L-asparagina (0,001 a 1 g/1; de preferência 0,01 a 0,05 g/1; particularmente de preferência 0,015 a 0,03 g/1), L-cisteina (0,001 a 1 g/1; de preferência 0,005 a 0,05 g/1; em particular, de preferência, 0,01 a 0,03 g/1), L-cistina (0,001 a 1 g/1; de preferência 0,01 a 0,05 g/1; particularmente de preferência 0,015 a 0,03 g/1), L-prolina (0,001 a 1,5 g/1; de preferência 0,01 a 0,07 g/1; particularmente de preferência 0,02 a 0,05 g/1), L-triptofano (0,001 a 1 g/1; de preferência 0,01 a 0,05 g/1; particularmente de preferência 0,015 a 0,03 g/1) e L-glutamina (0,05 a 10 g/1; de preferência 0,1 a 1 g/1). Estes aminoácidos podem ser adicionados ao meio individualmente ou em combinação. A adição combinada da mistura de aminoácidos contendo todos os aminoácidos acima referidos é particularmente preferida.

Numa realização particular, um meio sem soro e sem proteina é usado contendo adicionalmente uma combinação das misturas de aminoácidos acima referidas e peptona de soja purificada e ultrafiltrada. O meio de US 6 936 441 é particularmente bem adequado à cultura de células CHO mas pode ser igualmente usado com outras células.

Um outro meio adequado é o meio sem oligopéptidos divulgado em US 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

De preferência, o meio de cultura é tamponado através da utilização de iões bicarbonato, tipicamente fornecido como bicarbonato de sódio.

Adequadamente, o meio de cultura tem uma osmolalidade entre 210 e 650 mOsm, de preferência 270 a 450 mOsm, mais de preferência 310 a 350 mOsm e mais de preferência 320 mOsm.

De preferência, a osmolalidade do sobrenadante é mantida dentro de uma destas gamas ao longo do método da invenção. A cultura é uma cultura continua. Culturas continuas adequadas incluem cultura de lotes repetidos, com quimiostato, com turbidostato ou de perfusão.

Uma cultura de lotes começa com todos os nutrientes e células que são necessários e a cultura prossegue até estar completa, i.e. até todos os nutrientes terem sido consumidos ou a cultura ser parada por algum motivo.

Uma cultura de lotes com alimentação é um processo de lotes no sentido de se iniciar com as células e nutrientes mas é depois alimentada com mais nutrientes de forma controlada de modo a limitar o crescimento das células. A estratégia de lotes com alimentação é tipicamente usada em processos bio-industriais para atingir uma densidade celular elevada no biorreactor. A solução de alimentação é geralmente altamente concentrada para evitar diluição do biorreactor. A adição controlada do nutriente afecta directamente a taxa de crescimento da cultura e permite evitar metabolismo excessivo (formação de produtos metabólicos secundários) e limitação do oxigénio (anaerobiose). Na maioria dos casos, o nutriente limitante do crescimento é a glucose gue é fornecida à cultura como um xarope de glucose altamente concentrado (por exemplo 600-850 g/1).

Podem ser usadas diferentes estratégias para controlar o crescimento num processo de lotes com alimentação. Por exemplo, gualguer um de entre tensão do oxigénio dissolvido (DOT, p02), taxa de consumo de oxigénio (OUR), concentração de glucose, concentração de lactato, pH e concentração de amónia pode ser usado para monitorizar e controlar o crescimento da cultura através da manutenção desse parâmetro constante. Numa cultura contínua, os nutrientes são adicionados e, tipicamente, o meio é extraído de forma a remover produtos secundários indesejáveis e a manter um estado estacionário. Os métodos de cultura contínua adeguados são cultura de lotes repetidos, com guimiostato, com turbidostato ou de perfusão.

As células CHO, por exemplo, podem ser cultivadas num tanque com agitação ou num tanque com circulação de ar que é perfundido com um meio adequado a uma velocidade de perfusão entre 2 e 10 trocas de volume por dia e uma concentração de oxigénio entre 40% e 60%, de preferência cerca de 50%. Ainda, as células podem ser cultivadas por meio do método com quimiostato, usando o valor de pH preferido dado acima, uma concentração de oxigénio entre 10% e 60% (de preferência cerca de 20%) e uma taxa de diluição D de 0,25 a 1,0, de preferência cerca de 0,5.

Num processo de cultura em lotes repetidos, também conhecido como subcultura em série, as células são colocadas num meio de cultura e crescidas até uma densidade celular pretendida. Para evitar o estabelecimento de uma fase de declínio e morte celular, a cultura é diluída com meio de crescimento completo antes das células atingirem a sua concentração máxima. A quantidade e frequência da diluição varia largamente e depende das características do crescimento da linha celular e conveniência do processo de cultura. O processo pode ser repetido tantas vezes quantas necessário e, a menos que as células e o meio sejam rejeitados na subcultura, o volume de cultura aumentará gradualmente de cada vez que é feita uma diluição. O volume crescente pode ser gerido tendo um reactor de tamanho suficientemente grande para permitir diluições dentro do reservatório ou dividindo a cultura diluída por vários reservatórios. A lógica deste tipo de cultura é manter as células numa fase de crescimento exponencial. A subcultura em série caracteriza-se por o volume de cultura estar sempre a crescer de forma gradual, podendo haver múltiplas colheitas, as células continuam a crescer e o processo pode continuar enquanto se pretender.

Nos métodos com quimiostato e turbidostato, o meio extraido contem células. Assim, as células que permanecem no reservatório de cultura celular devem crescer para manter um estado de equilíbrio. No método com quimiostato, a velocidade de crescimento é tipicamente controlada através do controlo da taxa de diluição, i.e. a taxa a que é adicionado meio fresco. As células são cultivadas a uma taxa de crescimento sub-máxima, a qual é conseguida através da restrição da taxa de diluição. A taxa de crescimento é tipicamente elevada. Pelo contrário, no método do turbidostato a taxa de diluição é estabelecida de modo a permitir a taxa de crescimento máxima que as células consigam atingir em determinadas condições operacionais, tais como pH e temperatura.

Numa cultura de perfusão, são removidas as células do meio colhido uma vez que a maioria das células é mantida no reservatório de cultura, por exemplo ao serem retidas numa membrana através da qual flui o meio colhido. No entanto, tipicamente tal membrana não retém 100% das células e portanto uma proporção é removida quando o meio é colhido. Pode não ser crucial fazer culturas de perfusão a taxas de crescimento muito altas, uma vez que a maioria das células é retida no reservatório de cultura.

As culturas contínuas, particularmente as culturas de lotes repetidos, com quimiostato e turbi-dostato, são tipicamente operadas em taxas de crescimento elevadas. De acordo com a prática comum, é típico tentar manter as taxas de crescimento no seu máximo ou perto do máximo, num esforço para obter produtividade volumétrica máxima. A produtividade volumétrica é medida em unidades de quantidade ou actividade de proteína por volume de cultura por intervalo de tempo. Crescimento celular elevado corresponde a um volume maior de cultura a ser produzido por dia e portanto é convencionalmente considerado como reflectindo uma produtividade volumétrica mais elevada. Os presentes inventores inesperadamente encontraram que, em determinadas realizações, a produtividade volumétrica máxima não é atingida na taxa de crescimento máxima da célula. Como descrito nos Exemplos, uma taxa de crescimento máxima de um clone de células CHO expressando furina, em cultura com quimiostato, foi observada a uma temperatura de 36,5°C, mas a produtividade volumétrica máxima foi observada a 35,1°C. Apesar de serem obtidos volumes de colheita menores, devido a uma taxa de crescimento inferior à temperatura mais baixa, a quantidade de proteína recombinante produzida foi tanto maior quanto menor a temperatura da cultura, globalmente a mais produtiva.

Adequadamente, em qualquer um dos primeiros, segundo ou terceiro aspectos da invenção como definidos nas reivindicações, o sobrenadante de cultura celular é mantido a uma temperatura que é fixada a uma temperatura que é inferior à temperatura a que se observa taxa de crescimento máximo em pelo menos 0,5°C, de preferência pelo menos 1,0°C. Nesta realização, prefere-se que a cultura seja uma cultura continua, particularmente uma cultura de lotes repetidos, com quimiostato ou com turbidostato.

As células de mamifero, tais como células CHO e BHK são, de um modo geral, cultivadas como culturas em suspensão. Ou seja, as células são suspensas no meio, em vez de aderentes a um suporte sólido. As células podem, alternativamente, ser imobilizadas um veiculo, em particular um microveiculo. Veículos porosos, tais como Cytoline®, Cytopore® ou Cytodex®, podem ser particularmente adequadas. A densidade celular é frequentemente monitorizada nas culturas celulares. Em princípio, uma densidade celular elevada será considerada como desejável uma vez que, desde que a produtividade por célula seja mantida, esta deverá conduzir a uma produtividade mais elevada por volume de biorreactor. No entanto, a densidade celular pode, de facto, ser prejudicial para as células, e a produtividade por célula ser reduzida. Existe portanto a necessidade de monitorizar a densidade celular. Até agora, nos processos de cultura de células de mamífero, isto foi feito através da colheita de amostras da cultura e sua análise ao microscópio ou usando um dispositivo de contagem de células como seja o dispositivo CASY TT vendido por Schárfe System

GmbH, Reutlingen, Germany. Encontrámos agora que é vantajoso analisar a densidade celular por meio de uma sonda adequada introduzida no próprio biorreactor (ou numa ansa através da qual o meio e as células suspensas são passadas e depois restituídas ao biorreactor). Tais sondas estão disponíveis comercialmente na Aber Instruments, por exemplo o Biomass Monitor 220, 210 220 ou 230. As células em cultura actuam como pequenos condensadores sob a influência de um campo eléctrico, uma vez que a membrana celular não condutora permite a criação de carga. A capacitância resultante pode ser medida, está dependente do tipo celular e é directamente proporcional à concentração de células viáveis. Uma sonda de 10 a 25 mm de diâmetro usa dois eléctrodos para aplicar um campo de frequência de rádio à biomassa e um segundo par de eléctrodos para medir a capacitância resultante das células polarizadas. O processamento electrónico do sinal resultante produz um resultado que é uma medição precisa da concentração de células viáveis. O sistema é insensível a células com membranas com fugas, ao meio, às bolhas e aos detritos.

Tipicamente, a densidade celular varia entre 1,0x10® a 5,0xl06 células/ml, adequadamente 1,0x10® a 3,5x10® células/ml, adequadamente 1,4x10® a 2,8x10® células/ml, de preferência 1,6x10® a 2,6x10® células/ml, mais de preferência 1,8x10® a 2,4x10® células/ml. O aumento da concentração de células no sentido do extremo mais elevado das gamas preferidas pode melhorar a produtividade volumétrica. No entanto, gamas de densidade celular incluindo qualquer um dos valores acima tanto nos extremos inferiores como superiores de uma gama são considerados. A cultura é tipicamente realizada num biorreactor, o qual é geralmente um reservatório de aço inoxidável, vidro ou plástico de 1 (um) a 10000 (dez mil) litros de capacidade, por exemplo 5, 10, 50, 100, 1000, 2500, 5000 ou 8000 litros. O reservatório é geralmente sacos de plástico rigido mas flexível, particularmente para volumes pequenos. Estes são geralmente do tipo "descartável". A proteína heteróloga ou recombinante produzida pelo método de qualquer um dos três primeiros aspectos da invenção, como definido nas reivindicações, é, de preferência, uma proteína do sangue. Em "proteína do sangue" incluímos qualquer proteína que está ou possa estar presente no sangue de um ser humano ou animal, incluindo proteínas que são manipuladas para uso intravenoso. Proteínas do sangue adequadas incluem albumina sérica, factores de coagulação I, II, III, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII e XIII, furina, factor de von Willebrand, activador do plasminogénio tecidular, interleucinas, interferões, metaloproteases como sejam proteases ADAMTS (e.g. ADAMTS-13), imunoglobulinas tais como IgG, IgM, IgA ou IgE e fragmentos de imunoglobulina. Anticorpos ou fragmentos de imunoglobulina adequados incluem moléculas do tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de cadeia simples (ScFv) em que os domínios parceiros Vh e Vl estão ligados através de um oligopéptido flexível (Bird et al (1988) Science 242, 423/ Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio simples (dAbs) compreendendo domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544) . As imunoglobulinas e seus fragmentos podem ser "humanizados". Por outras palavras, domínios variáveis com origem em roedores podem ser fundidos com domínios constantes de origem humana, de modo que o anticorpo resultante mantenha a especificidade antigénica do anticorpo parental de roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855).

Numa realização preferida, a cultura celular é usada para produzir o Factor VIII, facultativamente em conjunto com o Factor de Willebrand (vWF) . 0 vWF pode ser adicionado separadamente ao meio de cultura e é, de preferência, recombinante. Como alternativa, o vWF pode ser coproduzido através da inclusão de células secretoras de vWF na cultura, assim como as células secretoras de FVIII. De preferência, no entanto, o FVIII e o vWF são co-expressos, i.e. cada uma das células secreta FVIII e vWF. vWF recombinante pode ser obtido como em Schlokat, et al. (1995), "Large Scale Production of Recombinant von Willebrand Factor", Thrombosis and Haemostasis 78, 1160 ou US 6 114 146 (Baxter AG) . A última patente também divulga células que podem ser usadas para co-produzir vWF com células secretoras de FVIII. As células que co-expressam ambas as proteínas estão divulgadas em US 5 250 421 (Genetics Institute) e Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1233-1242. 0 termo Factor VIII é usado para significar qualquer polipéptido ou complexo de polipéptidos que possua actividade do factor de coagulação VIII. 0 Factor VIII activado funciona como um cofactor na conversão do Factor X para Factor Xa pelo Factor IXa activado na presença de fosfolipidos e iões cálcio. Convenientemente, a quantidade do Factor VIII activo pode ser estimada a partir do grau em que promove a conversão do Factor X no Factor Xa num ensaio adequado. Num ensaio tipico, o Factor Xa hidrolisa um substrato cromogénico especifico, libertando assim um cromóforo, a quantidade do qual é determinada espec-trofotometricamente. Kits de ensaios comerciais incluem o kit Factor VIII Chromogenic Assay (Dade Behring, Switzerland; US 6,100,050); e o kit Coatest Factor VIII (Chromogenix, Sweden). A concentração do Factor VIII nos seres humanos é definida como 1 Ul/ml de sangue. 0 kit Coatest Factor VIII pode determinar a actividade de FVIII equivalente a pelo menos 0,01 Ul/ml de sangue. Para ser considerado como um Factor VIII como definido acima, um polipéptido ou complexo de polipéptidos deve ter pelo menos 1% da actividade do Factor VIII nativo de modo que, quando presente no sangue na mesma concentração nanomolar que o Factor VIII nativo, a sua actividade seja detectável pelo ensaio Coatest Factor VIII.

Um FVIII adequado para produção através do método da invenção é o FVIII nativo de tamanho completo. FVIII porcino pode ser produzido de acordo com a invenção mas o FVIII é de preferência humano. Como alternativa ao FVIII nativo, podem ser produzidos variantes e análogos. Muitos são conhecidos na arte, por exemplo as variantes e derivados por deleção descritos nas Patentes US Nos. 5 422 260, 4 749 780, 4 868 112, 4 877 614 e 5 171 844. O termo "derivado por deleção do Factor VIII recombinante" é definido como uma ou mais cadeias polipeptídicas tendo actividade de Factor VIII, derivado do polipéptido Factor VIII de tamanho completo através da deleção de um ou mais aminoácidos. De preferência, o referido derivado por deleção não possui a maior parte do dominio B, mas mantém partes das sequências amino-terminal e carboxi-terminal do dominio B que são essenciais para o processamento proteolitico in vivo do produto primário da tradução nas duas cadeias polipeptídicas. A produção de tal derivado por deleção do Factor VIII, identificado como "r-VIII SQ" está descrita em WO 91/09122. O termo "r-VIII SQ" é definido como uma cadeia polipeptídica derivada do Factor VIII de tamanho completo e sem os aminoácidos 743 a 1636. Outras variantes de FVIII sem a totalidade ou parte do domínio B estão descritos em US 6 358 703.

Vectores adequados para a transformação de células CHO e 293S estão divulgados em US 5 854 021. Células BHK expressando FVIII podem ser preparadas como divulgado em Wood et al (1984) Nature 312, 330-337 ou obtidos a partir da ATCC como cultura CRL-8544. As células CHO que expressam variantes de FVIII com o domínio B deletado estão descritas em Lind et al (1995) Eur. J. Biochem. 232, 19-27 e em US 5 661 008. Três desses tipos de células foram depositados no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen como DSM 6415, DSM 6417, e DSM 6416.

Quando FVIII e vWF são co-produzidos o complexo entre eles pode ser purificado por centrifugação do meio para remover as células e depois exposição do líquido resultante a um suporte sólido imobilizado contendo um anticorpo para FVIII ou vWF ou um péptido que se ligará especificamente a FVIII ou vWF, em condições que não causarão a dissociação do complexo. Métodos adequados são ensinados em US 6 307 032 (Baxter AG) e US 5 200 510 (ZymoGenetics) . O FVIII (facultativamente complexado com vWF) pode então ser formulado e usado de maneiras conhecidas. Por exemplo, FVIII, tendo sido produzido numa cultura sem proteínas animais, é, de preferência, formulado numa composição sem proteínas, como divulgado, por exemplo, em US 6 586 573 (Baxter International), WO 94/07510 ou US 6 599 724, e usado para tratar doentes com hemofilia A.

Quando o método da invenção como definido nas reivindicações é usado para produzir FVIII, prefere-se que o sobrenadante de cultura celular seja mantido a uma temperatura que é fixada a 36±0,9°C, de preferência a 36+0,5°C, mais de preferência 36±0,2°C e mais de preferência 36°C e/ou o pH é configurado para 7,20±0,05, de preferência 7,20+0,03, mais de preferência 7,20+0,01, mais de preferência 7,20/ e/ou o sobrenadante de cultura celular possui uma concentração de CO2 dissolvido de 1 a 10%, de preferência 4,0 a 9,0%, mais de preferência 5,5 a 8,5%. De preferência, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, nomeadamente temperatura e pH, temperatura e dCC>2 ou pH e dCC>2. Mais de preferência, os três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

Como se mostra nos Exemplos, é vantajoso incluir cobre no sobrenadante de cultura celular quando a invenção é usada para produzir FVIII. Tipicamente, as células são cultivadas num sobrenadante de cultura celular compreendendo 4 ppb de Cu2+. Vantajosamente, a concentração de Cu2+ no sobrenadante de cultura celular é pelo menos 5 ppb, e de preferência pelo menos 7, 10, 15 ou 25 ppb.

Numa realização alternativa preferida, a cultura celular é usada para produzir ADAMTS-13. ADAMTS-13, também conhecido como protease que corta o factor de von Willebrand (VWF-cp) é um membro da família das metaloproteases. Possui a capacidade para metabolizar grandes multímeros de VWF em formas mais pequenas, através do corte da ligação peptídica entre os resíduos Tyr-842 e Met-843 de VWF. Esta metaloprotease é activada por Ca2/Ba2, e não é inibida por inibidores de proteases serina ou cisteína. A degradação deficiente do factor de von Willebrand factor (VWF) foi associada a púrpura trombocitopénica trombótica (TTP). Em TTP hereditário, ADAMTS-13 está ausente ou é funcionalmente defectivo, enquanto na forma adquirida não familiar de TTP, um auto-anticorpo inibidor da actividade de ADAMTS-13 é encontrado transitoriamente na maioria dos doentes. A clonagem e expressão do gene ADAMTS-13 humano estão descritas em Plaimauer et al, 2002, Blood. 15;100(10):3626-32. A clonagem e expressão do gene ADAMTS-13 humano, juntamente com a sequência completa do cDNA estão também divulgados em US 2005/0266528 Al (Laemmle et al). Um ADAMTS-13 adequado para produção pelo método da invenção é ADAMTS-13 nativo de tamanho completo, de preferência ADAMTS-13 humano. Como alternativa ao FVIII nativo, podem ser produzidas variantes e análogos deste. 0 termo ADAMTS-13 é aqui usado para significar qualquer polipéptido ou complexo de polipéptidos que possua actividade de ADAMTS-13, particularmente a capacidade de cortar a ligação peptidica entre os residuos Tyr-842 e Met-843 de vWF. Convenientemente, a quantidade do ADAMTS-13 activo pode ser determinada através de ensaios funcionais, como sejam os ensaios funcionais que empregam péptidos modificados do factor de von Willebrand como substrato para ADAMTS-13 (Tripodi et al J Thromb Haemost. 2008 Sep; 6 (9) :1534-41) . Um método preferido de determinação da actividade de r-hu ADAMTS13 está divulgado em Gerritsen et al. Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombo- cytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82:1386-1389. Neste ensaio, 1 U corresponde ao nível de actividade de ADAMTS-13 num conjunto de plasmas de soro humano normal. Para ser considerado como ADAMTS-13 como acima definido, um polipéptido ou complexo de polipéptidos deve ter pelo menos 1% da actividade de ADAMTS-13 nativo. A quantidade de ADAMTS-13 pode também ser determinada através da medição do antigénio ADAMTS-13, por exemplo usando o método de ELISA divulgado em Rieger et al, 2006, Thromb Haemost. 2006 95 (2) :212-20. ADAMTS-13 recombinante proteoliticamente activo pode ser preparado através da expressão em culturas de células de mamífero, como descrita em Plaimauer et al, 2002, supra e US 2005/0266528 Al. Os métodos de cultura para células que expressam ADAMTS-13 recombinante estão divulgados em Plaimauer B, Scheiflinger F.Semin Hematol. 2004 Jan;41 (1) :24-33. Tipos de células preferidas para a expressão de ADAMTS-13 incluem células HEK-293 e células CHO. US 2005/0266528 Al e Zheng et al, 2001, Blood, 98:1662-1666 divulgam métodos de purificação de ADAMTS-13. ADAMTS-13 purificado pode ser formulado de acordo com métodos convencionais e usado para fins terapêuticos, por exemplo para tratar TTP.

Quando o método da invenção, como definido nas reivindicações, é usado para produzir ADAMTS-13, prefere-se que o sobrenadante de cultura celular seja mantido a uma temperatura fixada a 36,0±0,9°C, de preferência a 36,0±0,5°C, mais de preferência 36,0±0,2°C e ainda mais de preferência 36,0°C e/ou o pH é fixado a 7,15±0,05, de preferência 7,15±0,03, mais de preferência 7,15±0,01, ainda mais de preferência 7,15; e/ou o sobrenadante de cultura celular possui uma concentração de CO2 dissolvido de 1 a 10%, de preferência 4,0 a 9,0%, mais de preferência 5,5 a 8,5%. De preferência, pelo menos dois destes parâmetros ou os três parâmetros estão dentro dos limites preferidos, nomeadamente temperatura e pH, temperatura e dCC>2 ou pH e dCC>2 · Mais de preferência, os três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

Numa realização alternativa, a cultura celular é usada para produzir furina. A furina, também designada PACE (enzima de corte de pares de aminoácidos básico, "paired basic amino acid cleaving enzyme"), pertence ao grupo das proteases do tipo subtilisina, as quais desempenham um papel importante no corte de pro-proteínas, especialmente na síntese secretória (Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen., 4:115-136, 1993). É uma endoprotease serina, dependente de cálcio, estruturalmente arranjada em vários domínios, nomeadamente um péptido sinal, pro-péptido, domínio catalítico, domínio homo-B ou P, o domínio de cisteínas localizado no extremo C, domínio transmembranar e cauda citoplasmática. O local de corte da protease compreende uma sequência de reconhecimento que se caracteriza pela sequência de aminoácidos Arg-X-Lys/Arg-Arg. A protease furina corta pro-proteínas especificamente após esta sequência de consenso (Hosaka et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:12127-12130). A furina intacta é incorporada no sistema membranar do aparelho de Golgi e ai fica funcionalmente activa (Bresnahan et al, J Cell Biol. 1990;111:2851-9). Quando do trânsito do precursor da furina acabado de sintetizar do retículo endoplasmático para o compartimento de Golgi, o pro-péptido é removido de forma autocatalítica num evento de processamento em dois passos (Anderson et al, EMBO J. 1997; 16: 1508-18). A furina também transita entre a rede do trans-Golgi e a superfície celular via vesículas endossómicas, processando assim ambas as proteínas precursoras durante o seu transporte através das vias secretórias constitutivas assim como moléculas que entram na via de endocitose. A distribuição celular da furina nos compartimentos de processamento é dirigida por caracte-rísticas estruturais definidas dentro da sua cauda citoplasmática (Teuchert et al, J Biol Chem. 1999;274:8199-07) .

Uma vez que a expressão excessiva da protease furina nativa afecta negativamente o crescimento de culturas celulares em crescimento contínuo, têm de ser encontradas soluções para reduzir a influência tóxica da furina nestas células. Encontrou-se que os domínios C- terminais são dispensáveis para a actividade funcional da furina e uma forma truncada da furina nativa expressa em excesso de 75-80 kD poderá ser detectada no sobrenadante celular como proteina secretada (Wise et al, PNAS. 1990;87:9378-82). Esta furina truncada naturalmente secretada é também conhecida como "furina perdida" (Vidricaire et al, Biochem Biophys Res Comm. 1993;195:1011-8; Plaimauer et al, Biochem J. 2001;354:689-95) e está cortada no extremo N da porção transmembranar (Vey et al, J Cell Biol. 1994; 127: 1829-42).

Proteínas furina truncadas por engenharia genética, em que a parte codificadora dos dominios transmembranar e citoplasmático foi eliminada foram descritas, por exemplo, para os aminoácidos Δ714-7 94 (Leduc et al, J Biol Chem. 1992,-267: 14304-8; Molloy et al, J Biol Chem. 1992;267:16396-402) e para os aminoácidos A716-794 ("Sol-PACE", Wasley et al., J Biol Chem. 1993;268:8458-65; Rehemtulla and Kaufman, Blood. 1992; 79:2349-55) e para os aminoácidos Δ705-794 (Hatsuzawa et al, J Biol Chem. 1992;267:16094-9). Mutantes de furina compreendendo ainda uma deleção da região rica em cisternas foram igualmente descritos (Hatsuzawa et al, J Biochem. 1992;101:296-301; Creemers et al, J Biol Chem. 1993;268:21826-34). WO 2008/141824 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.) divulga uma furina humana truncada sem os aminoácidos 578 a 794, i.e. Δ578-794. O termo "furina" é aqui usado para significar qualquer polipéptido ou complexo de polipéptidos que possui actividade proteolítica da furina. A avaliação da actividade proteolítica de uma furina, furina truncada ou derivado de furina pode ser realizada através de qualquer teste adequado, por exemplo usando substratos fluoroqénicos que são constituídos por um local de corte dibásico para o qual a furina é específica (Schlokat et al, Biotechnol Appl Biochem. 1996;24:257-67). Com o referido ensaio, 1 Unidade é definida como a quantidade de furina que libertará 1 pmol de 7-amino-4-metilcoumarina (AMC) do substrato fluoroqénico Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC em 1 minuto a 30°C. O limite de quantificação para este teste é tipicamente 0,625 U/ml. Como alternativa, a actividade proteolítica pode também ser medida através da incubação de furina com pro-proteínas, por exemplo pro-rvWF, durante um tempo suficiente. O grau de processamento de pro-rvWF pode ser analisado por exemplo por transferência Western. A quantidade do antigénio furina pode ser medida através de um teste de ELISA. Um teste de ELISA adequado é o DuoSet para furina humana comercializado por R&D Systems, MN (cat. no. DY1503) em que anticorpos de murganho anti-furina humana são usados como anticorpo de captura, e anticorpos de cabra biotinilados anti-furina humana são usados como anticorpos de detecção.

Uma furina adequada para a produção pelo método da invenção é a furina nativa de tamanho completo, de preferência furina humana. Como uma alternativa à furina nativa, as variantes e análogos podem ser produzidos, incluindo os acima descritos.

Vectores adequados para a transformação de células de mamífero, particularmente células CHO, com furina ou variantes de furina estão descritos em WO 2008/141824 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.), juntamente com métodos para purificação da furina assim produzida. WO 91/06314 (Holland Biotechnology) descreve vectores para a expressão de furina, um método de expressão de furina em células de mamífero, particularmente células COS-1, e a purificação da purina produzida por via recombinante. WO 92/09698 (Genetics Institute and Chiron Corp) descreve a expressão de furina em células CHO, sozinha ou em combinação com vWF ou com o Factor IX.

Pro-rVWF é processado para a sua forma madura durante a cultura celular pela furina produzida endoge-namente, a qual é expressa em níveis relativamente baixos em muitos tipos celulares (Wise et al, 1990, PNAS 87:9378-9382) . O processamento de pro-rVWF pode ser tornado mais eficiente através da co-expressão de furina heteróloga com o pro-rVWF. Como alternativa, WO 2008/141824 sugere que uma furina purificada possa ser adequada para usar como reagente para promover o processamento de rVWF.

Quando o método da invenção, como definido nas reivindicações, é usado para produzir furina, prefere-se que o sobrenadante da cultura celular seja mantido a uma temperatura fixada a 35,1±0,9°C, de preferência 35,1±0,5°C, mais de preferência 35,1±0,2°C e ainda mais de preferência 35,1°C e/ou o pH fixado a 7,15±0,05, de preferência 7,15+0,03, mais de preferência 7,15+0,01, mais de preferência 7,15/ e/ou o sobrenadante da cultura celular tenha uma concentração de CO2 dissolvido de 1 a 10%, de preferência 4,0 a 9,0%, mais de preferência 5,5 a 8,5%. De preferência, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, nomeadamente temperatura e pH, temperatura e dCCh ou pH e dCCh. Mais de preferência, os três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

Numa realização alternativa preferida, a cultura celular é usada para produzir o Factor VII. "O polipéptido Factor VII " inclui Factor VII selvagem (i.e. um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos divulgada na Pat. U.S. No. 4,784,950), assim como variantes do Factor VII apresentando substancialmente a mesma actividade biológica ou actividade biológica melhorada relativamente ao Factor VII selvagem, e variantes do Factor VII tendo actividade biológica substancialmente modificada ou reduzida relativamente ao Factor VII selvagem. O termo "Factor VII" pretende incluir polipép-tidos do Factor VII na sua forma não cortada (zimogénio) , assim como os que foram processados proteoliticamente para dar as respectivas formas bioactivas, as quais podem ser designadas Factor Vila. Tipicamente, o Factor VII é cortado entre os residuos 152 e 153 para dar o Factor Vila. O termo "polipéptido Factor VII" também inclui polipéptidos, incluindo variantes, em que a actividade biológica do Factor Vila foi substancialmente modificada ou até mesmo reduzida relativamente à actividade do Factor Vila selvagem. Estes polipéptidos incluem, sem limites, o Factor VII ou o Factor Vila nos quais foram introduzidas alterações especificas na sequência de aminoácidos que modificam ou destroem a bioactividade do polipéptido. A actividade biológica do Factor Vila na coagulação do sangue deriva da sua capacidade para (i) se ligar ao Factor Tecidular (TF) e (ii) catalisar o corte proteolitico do Factor IX ou Factor X para produzir Factor IX ou X activado (Factor IXa ou Xa, respectivamente) . A actividade biológica dos polipéptidos Factor VII ("actividade biológico do Factor VII ") pode ser quantificada através da medição da capacidade de uma preparação para promover a coagulação do sangue usando plasma deficiente em Factor VII e tromboplastina, como descrito, e.g., na Pat. U.S. 5,997,864 ou WO 92/15686. Neste ensaio, a actividade biológica é expressa como a redução no tempo de coagulação relativamente a uma amostra controlo e é convertida em "unidades de Factor VII " por comparação com um padrão de um conjunto de soros humanos contendo 1 unidade/ml de actividade do Factor VII. Como alternativa, a actividade biológica do Factor Vila pode ser quantificada através de (i) medição da capacidade do Factor Vila (ou do polipéptido Factor VII) para produzir Factor X activado (Factor Xa) num sistema compreendendo TF embebido numa membrana lipidica e Factor X (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) medição da hidrólise do Factor X num sistema aquoso; (iii) medição da ligação física do Factor Vila (ou do polipéptido Factor VII) a TF usando um instrumento baseado na ressonância de plasmões de superfície (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (iv) medição da hidrólise in vitro de um substrato sintético pelo Factor Vila (ou um polipéptido Factor VII); ou (v) medição da geração de trombina num sistema in vitro independente de TF. Como alternativa, o antigénio FVII pode ser determinado por ELISA. Um ELISA adequado é o kit de AssayMax Human Factor VII (FVII) ELISA comercializado por Assay Pro (St Charles, MO) Cat. no EF1007-1, que usa um monoclonal anti-FVII humano como anticorpo de captura, e um policlonal biotinilado anti-FVII humano como anticorpo de detecção.

Um ensaio de proteólise in vitro preferido para o Factor Vila nativo selvagem e/ou variante do Factor Vila foi realizado numa placa de microtitulação (MaxiSorp, Nunc, Denmark), como descrito em US 2007/0219135 (Novo Nordisk Healthcare A/G) . O Factor Vila (10 nM) e o Factor X (0,8 microM) em 100 microL de Hepes 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM e 1 mg/ml de albumina sérica bovina, foram incubados durante 15 min. O corte do Factor X foi então parado pela adição de 50 microL de Hepes 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM e 1 mg/ml de albumina sérica bovina. A quantidade de Factor Xa gerada é medida pela adição do substrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Sweden), concentração final 0,5 mM. A absorvância a 405 nm foi medida conti- nuamente numa placa SpectraMax™ 340. A absorvância lida ao longo de 10 minutos, após subtracção da absorvância num alvéolo branco sem FVIIa, pode ser usada para calcular a razão entre as actividades proteoliticas do factor Vila variante e selvagem:

Razão= (A405nm factor Vila variante)/ (A405nm factor Vila selvagem)

Numa variação deste ensaio, determinou-se FVII. Uma tromboplastina é incluída. FVII na amostra forma um complexo com iões Ca2+ e factor tecidular que gera pequenas quantidades de FXa. FXa activa FVII para FVIIa.

Um ensaio comercial para a actividade de FVII é o kit de reagentes HEMOCLOT FVII, vendido por Aniara (Mason, OH) Cat. no. ACK081K em que é medida a coagulação induzida por cálcio tromboplastina.

As variantes do Factor VII tendo substancialmente a mesma actividade biológica ou actividade biológica melhorada relativamente ao Factor Vila selvagem incluem as que apresentam pelo menos cerca de 25%, de preferência pelo menos cerca de 50%, mais de preferência pelo menos cerca de 75% e ainda mais de preferência pelo menos cerca de 90% da actividade especifica do Factor Vila que foi produzido no mesmo tipo de célula, quando testada num ou mais de um ensaio de coagulação, ensaio de proteólise ou ensaio de ligação a TF como descrito acima. As variantes do Factor VII tendo actividade biológica substancialmente reduzida relativamente ao Factor Vila selvagem são aquelas que apresentam menos de cerca de 25%, de preferência menos de cerca de 10%, mais de preferência menos de cerca de 5% e ainda mais de preferência inferior a cerca de 1% da actividade especifica do Factor Vila selvagem que foi produzido no mesmo tipo celular quando testado num ou mais de um ensaio de coagulação, ensaio de proteólise ou ensaio de ligação a TF como descrito acima. As variantes do Factor VII tendo actividade biológica substancialmente modificada relativamente ao Factor VII selvagem incluem, sem limitação, variantes do Factor VII que apresentam actividade proteolítica do Factor X independente de TF e as que se ligam a TF mas não cortam o Factor X. Variantes do Factor VII, que apresentem substancialmente a mesma bioactividade ou melhor bioactividade que o Factor VII selvagem, ou, como alternativa, apresentam bioactividade substancialmente modificada ou bioactividade reduzida relativamente ao Factor VII selvagem, incluem, sem limitação, polipéptidos tendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência do Factor VII selvagem através da inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos .

Exemplos não limitantes de variantes do Factor VII tendo substancialmente a mesma actividade biológica do Factor VII selvagem incluem S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes do Factor Vila que apresentam maior estabilidade proteolítica como divulgado em Pat. U.S. No. 5,580,560; o

Factor Vila que tenha sido cortado proteoliticamente entre os resíduos 290 e 291 ou entre os resíduos 315 e 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); formas oxidadas do Factor Vila (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); variantes do Factor VII como divulgado em PCT/DK02/00189; e variantes do Factor VII apresentando estabilidade proteolítica aumentada como divulgado em WO 02/38162 (Scripps Research Institute); as variantes do Factor VII tendo um domínio Gla modificado e apresentando uma maior ligação a membranas como divulgado em WO 99/20767 (University of Minnesota); e variantes do Factor VII como divulgado em WO 01/58935 (Maxygen ApS).

Exemplos não limitantes de variantes do Factor VII tendo maior actividade biológica comparativamente com o Factor Vila selvagem incluem variantes do Factor VII como divulgado em WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); e variantes do Factor Vila com maior actividade como divulgado em JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)· Exemplos não limitantes de variantes do Factor VII tendo actividade biológica substancialmente reduzida ou modificada relativamente Factor VII selvagem incluem RI 52E-FVIIa (Wild-goose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Hoist et al., Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) e o Factor Vila sem o domínio Gla, (Nicolaisen et al, FEBS Letts. 317:245-249, 1993).

Após produção de FVII, o polipéptido pode ser purificado a partir do meio. A purificação dos polipéptidos Factor VII pode envolver, e.g., cromatografia de afinidade numa coluna de anticorpos anti-Factor VII (ver, e.g., Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; e Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988) e activação por corte proteolitico, usando o Factor Xlla ou outras proteases tendo especificidade do tipo tripsina, como seja, e.g., Factor IXa, calicreina, Factor Xa e trombina. Ver, e.g., Osterud et ai., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Pat. U.S. No. 4,456,591; e Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Como alternativa, o Factor VII pode ser activado através da sua passagem por uma coluna de cromatografia de permuta iónica, como seja Mono Q® (Pharmacia) ou similares. O Factor VII ou o Factor VII activado pode ser formulado e usado de modo conhecido. Por exemplo, pode ser usado no tratamento de hemorragias em hemofílicos.

Quando o método da invenção como definida nas reivindicações é usado para produzir Factor VII, é preferido que o sobrenadante da cultura celular seja mantido a uma temperatura fixada a 36,5±0,9°C, de preferência 36,5±0,5°C, mais de preferência 36,5±0,2°C e ainda mais de preferência 36,5°C e/ou o pH é fixado a 7,20±0,05, de preferência 7,2010,03, mais de preferência 7,2910,01, mais de preferência 7,29; e/ou o sobrenadante da cultura celular tem uma concentração de CO2 dissolvido de 1 a 10%, de preferência 4,0 a 9,0%, mais de preferência 5,5 a 8,5%. De preferência, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, nomeadamente temperatura e pH, temperatura e dCCg ou pH e dC02. Mais de preferência, os três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos. A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos que se seguem, sem qualquer limitação da mesma.

Exemplo 1: cultura de células básica Produção de FVIII

Culturas tipicas foram estabelecidas em biorreactores, usando um subclone da linha celular 10A1C6 CHO transformado para co-expressar o Factor VIII e o Factor de von Willebrand descrito em Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1233-1242 e US 5 250 421. O subclone particular foi obtido através de adaptação a um meio convencional que não contém produtos de origem animal, e subclonagem numa microplaca. O meio de cultura padronizado é:

0 meio basal DMEM/F12 de Ham 50/50 contém 1,3 mg/kg de Cu2+ suficiente para o meio completo possuir 4,3 ppb de Cu2+.

Produção de ADAMTS-13 Células CHO DUKX-B11 foram transfectadas usando o método de co-precipitação com fosfato de cálcio, para introduzir o gene de ADAMTS-13. As células foram cultivadas sob condições de selecção com neomicina e foram seleccionadas após tratamento com metotrexato e G418. Após adaptação a meio sem soro, as células foram subclonadas e o subclone 640-2 foi escolhido como clone para produção. O meio de cultura padronizado é um meio sem soro, sem insulina e sem oligopéptidos baseado no meio divulgado em US 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

Produção de furina Células CHO DUKX-B11 foram transfectadas usando o método de co-precipitação com fosfato de cálcio, para introduzir o gene da furina. As células foram seleccionadas em meio DHFR sem hipoxantina, timidina e glicina. 0 clone de produção 488-3 foi identificado por subclonagem e selecção em meio contendo 100 nM metotrexato, seguido de adaptação a meio sem soro. 0 meio de cultura padronizado é um meio sem soro, sem insulina e sem oligopéptidos baseado no meio divulgado em (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

Produção de FVII Células CHO DUKX-B11 foram transfectadas com um vector bicistrónico para permitir a co-expressão de FVII e VKORC (complexo de vitamina K epóxido redutase). A expressão do gene é conduzida pelo promotor CMV e um local interno de entrada do ribossoma (IRES) está situado entre o gene FVII e o gene VKORC. As células foram transfectadas usando o método de precipitação com fosfato de cálcio. O meio de selecção continha 200 yg/ml de higromicina B. As células foram subclonadas em condições de meio sem soro e um subclone com expressão elevada, 1E9, foi escolhido como clone de produção. 1E9 foi seleccionado como tendo as propriedades mais vantajosas relativamente ao crescimento, produtividade e estabilidade em condições de cultura únicas. A estabilidade foi avaliada durante um periodo de dois meses em modo quimiostato. 0 meio de cultura padronizado baseia-se no meio de cultura divulgado em US 6,936,441 (Baxter AG), e contém, inter alia, 2,5 g/1 de peptona de soja e 5 mg/1 de insulina (Nucellin®; Eli Lilly ou Novolin®, Novo Nordisk).

Processos padronizados usados para a produção de FVIII

Cultura contínua de 5 1 0 meio é pré-condicionado durante várias horas numa incubadora de CO2 (5-15% CO2) a 37 °C. Para estabelecer a cultura, pelo menos uma ampola de 1 ml (107 CHO células/ml) foi descongelada e as células diluídas em 60 ml de meio pré-condicionado em frascos Roux (200 ml), e cultivadas numa incubadora de CO2 a 37 °C. Após cerca de 3 dias, os 60 ml de cultura foram adicionados a 140 ml de meio fresco num frasco rolante (1,8 1). O frasco rolante foi gaseado com 15% CO2 e cultivado a 37 °C com rotação. Após dois dias, as células foram passadas a 1/3 e cultivadas em 2 frascos rolantes em meio fresco (200 ml de meio + 100 ml de cultura = 300 ml por frasco rolante). Após mais dois ou três dias, as células foram novamente passadas a 1/3 e cultivadas num total de 6 frascos rolantes em meio fresco como descrito acima. Uma vez atingida a densidade celular necessária de aproximadamente 1 x 106 células/ml, o inoculo de 1800 ml é usado para inocular 3,2 1 de meio que tinha sido pré-condicionado como descrito acima, e cultivado no biorreactor de 5 1. Em condições padronizadas, 0 biorreactor de 5 1 foi configurado para pH 7,2, uma densidade celular de 1,4 xlO6 células/ml e uma temperatura de 37°C. Em condições padronizadas, a cultura foi aspergida com O2 tendo as bolhas um tamanho de 10 ym a um fluxo de 0. 25 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora) .

Preparação de inoculo no biorreactor de 40 1

Um lote de inoculo foi obtido essencialmente como acima descrito relativamente à cultura contínua de 5 1. No entanto, o lote é de aproximadamente 5 1, e é obtido a partir de 18 em vez de 6 frascos rolantes. O biorreactor BR-40 foi limpo e esterilizado antes da operação, e aproximadamente 8 1 de meio foram transferidos para BR-40 antes da inoculação. O lote do inoculo de aproximadamente 5 1 é transferido do reservatório de mistura para o biorreac tor através de uma linha de transferência para atingir um volume de cultura total de aproximadamente 13 1. Uma vez atingida uma densidade celular > 9xl05 células/ml, a cultura é diluída (1:3) com meio. Após mais 1 a 3 dias, a concentração celular novamente atinge h 9xl05 células/ml, e fez-se a transferência do inoculo para o biorreactor de 320 1.

Expansão no biorreactor de 320 1 O biorreactor BR-320 foi limpo e esterilizado antes da operação, e aproximadamente 80 1 de meio foi transferido para BR-320 antes da inoculação. 0 inoculo de aproximadamente 40 1 é transferido do biorreactor BR-40 para o biorreactor BR-320 através de uma linha de transferência para conseguir um volume de cultura inicial de aproximadamente 120 1. Uma vez atingida uma densidade celular de ^ 9xl05 células/ml, a cultura foi diluida (1:3) com meio. Após 3 a 6 dias (tempo total), a concentração celular novamente atingiu b 9xl05 células/ml, e procedeu-se à transferência do inoculo para o biorreactor de 2500 1.

Biorreactor de 2500 1

Aumento de escala O inoculo de aproximadamente 320 1 foi transferido do BR-320 para o biorreactor BR1 através de uma linha de transferência que já continha aproximadamente 630 1 de meio para atingir um volume de cultura inicial de aproximadamente 950 1. Uma vez atingida uma densidade celular ^ 9xl05 células/ml, A cultura foi diluida (~1:3) com meio para um volume final de aproximadamente 2500 1. Após 4 a 7 dias (tempo total) , a concentração celular atingiu novamente > 9xl05 células/ml, e aproximadamente 1150 1 do inoculo foi transferido do BRl para o biorreactor BR2 que continha aproximadamente 1350 1 de meio. Após transferência, adicionou-se aproximadamente 1150 1 de meio ao biorreactor BRl, para atingir um volume de cultura final de aproximadamente 2500 1.

Quimiostato 0 modo de cultura com 'quimiostato' foi iniciado logo que a concentração celular em cada biorreactor atingiu > l,2xl06 células/ml. Aproximadamente 1250 1 de meio por dia foi adicionado de modo continuo a cada biorreactor. A concentração celular era de entre 9xl05 - l,6xl06 célu las/ml em cada biorreactor de 2500 1. Múltiplas colheitas de aproximadamente 1250 1/dia/biorreactor foram guardadas em sacos estéreis a 2 - 8°C. A cultura foi mantida durante cerca de 50-57 dias no modo quimiostato. Nas condições padronizadas, o pH foi fixado a 7,2, a temperatura foi fixada a 37 °C e a cultura foi aspergida com O2 tendo um tamanho de bolhas de 10 ym a um fluxo de 0,02 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora). Métodos de cultura similares são também aplicáveis à cultura de células CHO expressando ADAMTS-13, furina ou FVII.

Exemplo 2: Efeitos da alteração de vários parâmetros na produtividade de FVIII A produtividade de FVIII do clone celular CHO que expressa FVIII e vWF descrito no Exemplo 1 foi determinada em várias condições de cultura.

Em experiências separadas, o pH, a densidade celular e a temperatura variaram na cultura continua numa escala de 5 1. Em cada um dos casos, o controlo da experiência usou pH 7,1, uma densidade celular de 1,4 xlO6 células/ml e 37°C.

Quando a densidade celular foi aumentada, a produtividade volumétrica de FVIII (UI por litro por dia) , relativamente ao valor para uma densidade celular de 1,2 xlO6 células/ml, aumentou como se segue:

Assim, um aumento substancial na produtividade poderá ser conseguido através do aumento da densidade celular. Esta não podia ter sido prevista, uma vez que o aumento da densidade celular pode reduzir a produtividade por célula. Ainda, encontrou-se que em determinadas densidades celulares, o aumento da produtividade era superior ao aumento da densidade celular, o que é ainda mais surpreendente. Ο ρΗ foi aumentado para 7,2 através da alteração dos parâmetros de borbulhamento de gás. No reservatório controlo a pH 7,1, a cultura foi gaseada com O2 tendo 10 ym de tamanho das bolhas a um fluxo de 0,25 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora). No reservatório teste a pH 7,2 a cultura foi gaseada com ar tendo um tamanho de bolhas de 10 ym a um fluxo de 1,25 WH (volume de ar por volume de cultura por hora). Através do aumento do pH entre 7,1 e 7,2, a produtividade poderá ser aumentada em cerca de 16%.

Ao baixar-se a temperatura de 37°C para 36°C, a produtividade aumentou em cerca de 22%.

Exemplo 3: Influência da densidade celular e concentração de cobre na produtividade de FVIII A produtividade de FVIII do clone das células CHO expressando FVIII e vWF CHO descrito no Exemplo 1 foi determinado em várias condições de cultura.

Uma cultura controlo foi operada a pH 7,1, 37°C, 4ppb Cu2+ e uma densidade celular de l,4xl06 células/ml.

Culturas comparativas decorreram a pH 7,2 e 36°C. Numa cultura a densidade celular foi aumentada para Ι,βχΙΟ6 células/ml e numa outra foi aumentada para 2,0xl06 células/ml. Numa terceira cultura, a densidade celular foi de 2,0xl06 células/ml e a concentração de cobre foi aumentada de 4ppb para 6ppb.

Resultados: através da redução da temperatura, o aumento do pH e o aumento da densidade celular para 1,6 xlO6 células/ml (um aumento de 14%), a produtividade de FVIII aumentou em 41-50%. Um aumento adicional na densidade celular para 2,0xl06 células/ml (43%) deu um aumento na produtividade (comparativamente com a cultura controlo) de 39-77%. Quando o cobre numa cultura de 2,0xl06 células/ml foi aumentado para 6ppb, a produtividade (comparativamente com a cultura controlo) foi aumentada em 48-98%.

Assim, através do aumento ligeiro do pH, redução ligeira da temperatura, aumento da densidade celular em apenas 43% e aumento da concentração de cobre em 50%, a produtividade de FVIII pode ser quase duplicada.

Exemplo 4: Influência da densidade celular e

concentração de cobre na produtividade de vWF O Exemplo 3 foi repetido mas foi medida a produtividade volumétrica de vWF. Com 1,6 xlO6 células/ml e 4ppb de cobre (36°C, pH7,2) a produtividade foi de 124% do controlo. Com 2,0 xlO6 células/ml e 6ppb de cobre a produtividade foi de 182%.

Assim, podem ser conseguidos novamente aumentos substanciais na produtividade fazendo pequenas alterações nos parâmetros do processo.

Exemplo 5: Influência da densidade celular, pH e dC02 A produtividade de FVIII do clone das células CHO expressando FVIII e vWF CHO descrito no Exemplo 1 foi determinada em várias condições de cultura.

Nesta experiência, a densidade celular foi aumentada de l,41xl06 células/ml para 2,03xl06 células/ml, o pH foi aumentado de 7,1 para 7,2 e a concentração de dC02 foi reduzida de 9,5% para 6,2%. A produtividade volumétrica de FVIII (UI por litro por dia) aumentou em 98% e a produtividade especifica de FVIII (UI por milhão de células por dia) aumentou em 36%.

Exemplo 6: Influência do pH e temperatura na produção de furina

As células CHO que expressam furina foram cultivadas em biorreactores de 2,5 1 no modo quimiostato. A densidade celular fi mantida numa média entre 1,52 xlO6 e l,78xl06 células/ml para culturas individuais durante 5 dias de cultura. 0 oxigénio dissolvido foi controlado em todas as experiências com um ponto de ajuste de 20% de saturação de ar. A concentração de C02 dissolvida foi mantida entre 5%-6% cobrindo uma camada do espaço livre acima da superfície do biorreactor com C02.

Através de "programação do método das experiências", diferentes temperaturas foram combinadas com diferentes valores de pH para determinar as condições que resultam na produtividade volumétrica máxima de furina. Cinco temperaturas foram combinadas com três valores de pH de acordo com a "Matriz de Doehlert ", resultando em sete combinações de temperatura e pH como se segue:

A combinação de 36,5°C e pH 7,20 foi escolhida como o ponto de ajuste, o qual foi aplicado a dois lotes de fermentação (4 e 5 na tabela acima).

Os dados, incluindo a produtividade volumétrica e especifica e a taxa de crescimento, foram analisados estatisticamente com a Metodologia de Superfície de

Resposta (RSM), usando o programa informático "Minitab". A temperatura, mas não o pH, influenciaram significativamente a taxa de crescimento, com um máximo para a taxa de crescimento ocorrendo a 36,5°C. Ao reduzir a temperatura de 37°C para 35,1°C, a produtividade volumétrica pode ser aumentada em aproximadamente 2,7 vezes. Uma tendência semelhante foi observada para a produtividade especifica. Este é um resultado surpreendente, uma vez que se esperava que a produtividade volumétrica máxima fosse observada à temperatura a que a taxa de crescimento era máxima. A influência do pH na produtividade especifica e volumétrica foi pouco significativa na gama investigada de 7,20 +/- 0,1. Uma produtividade ligeiramente superior foi observada na gama de pH mais baixa de 7,15 +/-0,05 (ou entre 7,10 e 7,20), portanto foi seleccionado o pH 7,15 como ponto de ajuste para a produção de furina.

Exemplo 7: Influência de dCCh na produção de furina

Duas fermentações foram realizadas em paralelo no modo de quimiostato em biorreactores de 2,5 1, uma fermentação com uma concentração de CO2 de aproximadamente 7,5% e a outra com uma concentração de CO2 de aproximadamente 12%. A concentração de CO2 foi ajustada variando a fracção de CO2 no espaço livre acima da superfície. As fermentações foram realizadas a 37 °C, a um pH de 7,15 e com um pC>2 de 20%. A contagem de células foi de aproximadamente l,07xl06 células/ml durante 12 dias na cultura com CO2 elevado, e l,49xl06 células/ml na cultura com CO2 baixo. A redução da concentração de CO2 de 12% para 7,5% teve o efeito de aumentar a produtividade volumétrica em aproximadamente 2,78 vezes e a produtividade especifica em 2 vezes. A taxa de crescimento celular foi também superior na cultura de CO2 baixo.

Exemplo 8: Influência do pH e temperatura na produção de FVII Células CHO expressando FVII foram cultivadas em biorreactores de 2,5 1 no modo quimiostático, em que a densidade celular foi mantida a uma média de aproximadamente 2,5xl06 células/ml (entre 2xl06 e 3><106 células/ml) para culturas individuais ao longo de 4 semanas de cultura. 0 oxigénio dissolvido foi controlado em todas as experiência num ponto de ajuste de 20% de saturação de ar. A concentração de CO2 dissolvida foi mantida entre 4%-7% cobrindo uma camada do espaço livre acima da superfície do biorreactor com CO2.

Através de "programação do método das experiências", diferentes temperaturas foram combinadas com diferentes valores de pH para determinar as condições que resultam na produtividade volumétrica máxima de FVII. Três temperaturas foram combinadas com três valores de pH de acordo com a "Matriz de Doehlert ", resultando em cinco combinações de temperatura e pH como se segue:

A média da produtividade cinética volumétrica máxima foi conseguida a 36,5 °C e um ponto de ajuste do pH de 7,20. Houve uma interacção positiva dos parâmetros, de modo que o resultado da optimização de ambos os parâmetros foi superior aos efeitos combinados da optimização de cada parâmetro individualmente.

Exemplo 9: Influência do dC02 na produção de FVII O efeito de quatro concentrações diferentes de CO2 (5,0, 6,3, 7,6 e 8,9%) na produtividade de FVII foi testado em culturas continuas em pequena escala.

As células foram cultivadas até ao dia oito do quimiostato e depois transferidas para biorrectores Rushton de 2,5 1 e cultivadas em condições continuas, a pH 7,20 e 36,5°C, durante quase quatro semanas. Foram analisados apenas os dados das três últimas semanas devido à necessidade de equilíbrio das diferentes concentrações de C02 durante a primeira semana. Os niveis de CO2 foram controlados através de medição externa e adição de CO2 ao espaço livre acima da superfície dos biorreactores.

As densidades celulares registadas variaram entre 2,36xl06 células/ml num nível de CO2 de 8,9% e 2,87xl06 células/ml a 5,0%. As taxas de crescimento para a mesma gama são 0,42 d-1 e 0,4 9 d-1. O aumento das taxas de crescimento específicas no nível baixo de C02 está correlacionado com aumentos da produtividade específica. Os efeitos compostos de C02 na taxa de crescimento e produtividade específica resultaram num efeito substancial na produtividade volumétrica.

Uma redução na concentração de C02 de 8,9% para 5 % aumenta a taxa de crescimento específica em 17%, a produtividade específica em 10% e a produtividade cinética volumétrica em 35%.

Exemplo 10; Influência da temperatura e pH na produção de ADAMTS-13 Células CHO transfectadas expressando ADAMTS-13 recombinante foram cultivadas em culturas quimiostáticas em biorreactores de 1,5 1.

Numa primeira experiência, o pH e a temperatura foram configurados para diferentes pontos de ajuste na gama de 36°C a 38°C e pH 7,10 a 7,30. Amostras da fase estacio nária foram analisadas relativamente à contagem de células e expressão de ADAMTS-13 por ELISA, e taxas de diluição das culturas quimiostáticas foram medidas para calcular a taxa de crescimento e volumétrica da expressão de ADAMTS-13. Uma vez o valor óptimo encontrado fora da gama dos limites externos do espaço, foi estabelecida uma segunda experiência com uma gama de temperaturas de 35° a 37°C e pH 7,05 a 7,15, e os dados forma analisados a partir do estado estacionário. As densidades celulares variaram de 1,17-1,71 xlO6 células/ml. O CO2 foi controlado cobrindo o espaço livre acima da superfície com uma camada de CO2 para atingir uma concentração de CO2 dissolvido de 4-6%.

Os dados de ambas as experiências foram normalizados e analisados usando o programa estatístico Minitab.

Encontrou-se que a taxa de crescimento específica tem o seu óptimo a pH 7,13 e 36,0 °C usando um modelo quadrático para pH e temperatura. 0 efeito da temperatura na taxa de crescimento foi fraco.

Encontrou-se que a produtividade volumétrica possui o seu óptimo a pH 7,15 e 36,0°C. Apesar do efeito fraco da temperatura na taxa de crescimento, houve um efeito relativamente forte da temperatura na produtividade volumétrica.

Assumindo uma temperatura constante de 37°C, o efeito do aumento do pH de 7,10 para 7,15 foi aumentar a produtividade volumétrica em 10%. Assumindo um pH constante de 7,10, o efeito da redução da temperatura de 37°C para 36°C foi aumentar a produtividade volumétrica em 14%. O efeito global da alteração das condições de pH 7,10 e temperatura de 37°C para pH 7,15 e temperatura de 36°C foi o aumento da produtividade volumétrica em 24%.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método de cultura de células de mamífero secretoras de proteína heteróloga num sobrenadante de cultura celular, em que o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração de CO2 dissolvido de 1 a 10%, em que a cultura celular é uma cultura contínua mantida a uma densidade de l,4xl06 a 2,8xl06 células/ml.

2. O método de acordo com a reivindicação 1 em que a concentração de CO2 é 4,0 a 9,0% ou 5,5 a 8,5%.

3. O método de acordo com a reivindicação 1 em que o sobrenadante da cultura celular é mantido a uma temperatura fixada a 36±0,9°C.

4. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 3 em que o pH é fixado em X±0,05, em que X tem um valor entre 7,15 e 7,20, com a condição de o pH ser configurado como superior a 7,10.

5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o sobrenadante de cultura celular é tamponado com bicarbonato.

6. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o sobrenadante é aspergido com ar.

7. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a proteina heteróloga é uma proteina do sangue.

8. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que a proteina heteróloga é o Factor VIII.

9. 0 método de acordo com a reivindicação 8 em que o Factor VIII é co-expresso com o Factor de von Willebrand.

10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a concentração de Cu2+ no sobrenadante de cultura celular é pelo menos 5, 7, 10, 15 ou 25 ppb.

11. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que a proteina heteróloga é ADAMTS-13, furina ou Factor VII.

12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a célula de mamifero é uma célula de roedor, como seja uma célula CHO ou uma célula BHK.

13. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a cultura continua é uma cultura com quimiostato ou com turbidostato. Lisboa, 9 de Outubro de 2017 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * OS 61008328A * USS5S9724B » US 5258421 A * 0S2SS5S2Se528A1tLaemmía * 0868364418 « WO 2008141824 A * US 8180981 A * WO 8106314 A * US 6171825 :B * WO 9208688 A * US 20078212770 A. * 0S 4784858 A * OS 6114146 A * USS897864A » US €100050 A * WO 8215686 A * US 5422260 A * US 20070219135 A * US 4748780 A * US §588868  * US 4888112 A. * DK 0200188 W * OS 4877614 A * WO 0238182 A « OS 8171844 A * WO §82076? A * WO 8108122 A * WO01S8935A * US 8358703 S * WO01S3725A * US 5854021 A * WO 0222776 A * USB6810D8À · WO 02877218 A . * US 8307032 B « WO 032? 147 A « OS 8208518 A . · WO0337S32A * OS 68868738 * JP 20010514788 * WO 9407510 A ♦ US 4456581 A, Thoreas Literatura que não é de patentes citada na Descrição * KAUFMAR ei ai. MoL CeS 0id., 1889. vot 9. * LIND et ai. Eur. JL £fecftemv 1895, vd. 232.19-27 1233-1242 * PÂTTISOU et at B&amp;teditKl Pre&amp;, 2000, vof. 16, ‘ PLAI8SAUER et aí. Stoerf, 2092, wi. 15::1S8 (10), 769-774 3626-32 * GRAHAMetaf. J. S&amp;nVYsL 1877,v®i.38, 59 » TRÍPQOt et a!. J Tfmsmh HaemosL, Sepfember * URLAUB; CHASSI*, te Nsti. Acad. Sei. USA. £086. vd. 6 f9), 1534-41 1SS0. vd. 77,4216 * GERR1TSE1* st aí. Assa? dí w* WMxand festor * MATHER. Bhi Repnod., 1980. vd. 23, £43-251 (s1AF}-de3VÍBgprde3S3h3seeicndec,?sasede®§3- gerj fciridiag af&amp;s% oí degraded vWF; a toai íor lhe * UATHER et et. Awisfe M.Y. Acad. Sei, 1982, vd. dssgaosis ci ibrornfcdtG Shíofabocstopenic purpura 333,44-88 i.TTP}, Thmmb Haemost, 1999, vd. 82, 1386-1389 » BETTER et af. Sde*c®, 1988, vd. 248,1041 » SKERRAetaí. Sc»b»,1988, vd. 249,1938 - RÍEGER et ai. T&amp;emfe Haammi, 2998, vtíL 95 (2), * BiRD e1 aí. Sem*», 1988, vd, 242,423 £12-28 » HUSTÔN«t»l. Proc.NatLAcaà.ScÍmA, 1988,*eL * PLAI55AIJER B; SCHEÍFLSMGER E. Semin tíema- 85,5879 íd„ Jasiuar/2984, voi.41 (1),24-33. » WARD «t af. mútua, 1989, «4.341,544 * ZHEHGeteLBSsKxí, 2801. vd.88,18S2-Í886 * MORRÍSON et et. Pmc. Na%. Acad. Seà. USA, 1984, ·♦ VAS: DE VEtt eí et Cnl Rw. Onoogea., 1393, vd. vd. 81,8851-6855 4,115-136 * SCHLOKATet aí, Lapge Soate Pfoditdibnaf Recora- ·♦ H0SAKA st ai. d mi. Chem., 1991, vd. 286, btoarú yen WSfefejaBd Fador, Thmnibesis and 121.27-12133 moetesís, 1995. vd. ?S, 1160 * BRESBAHAJ* «t et J Csii Sfefc, 1880, vd, 111, * WGODetai. Naíisre. 1884, vd. 312.339-337 2851-9 * ANDERSOtí «S: si EMBQ J.s 1897, voi 16, 1508-18 * WiS£ si *L PMAS:. 189*3, mí, 87. 8378-93-82 |ββ8δ] « PERSSON ®í: ai J, SW. Gfmm„ 1987« voí 272, * TESUCHERT si «f. J 8M Cfmm., 1S98, vai. 274« 1S91t*18924 | 818«? ' * FERSSON. FEBS isffs,. 1397, vdL 413. 389*363 * WiSE ei ai PmSy 1890, vai, 87. 8378-82 » VJDRSCAiRE et aí. S&amp;aáwn fias Coem, * LfNO etai.Arcf}, fitarem. Sjop&amp;ys·., 1898, voi 3S2, 1993. voi 185.1811*8 182-1921 - PLAfRíÂUEK ei et Bhchsm J.< 2001, voi 3S4, * MOLLERUPeÍ3f.8fefetí5í*3Í. a«®íg,.199S.v^4S, 089-85 581-SOS * Y£r&amp;tal.4Cs#£^VÍS94,voi 127,1829-42 " KORRFELT et ai. Arcfc. Bíoch&amp;m. Biophys.. 1999, » LEOUC et ai. J Bis? atem., 1982. vol. 287,14384-8 voi 3S3,43*54 j P083j ♦ VWLD-SOOSE «t ai. Bkxthem, 1990« vof. 29, * «OLLOY et ai. J Biai Cfcem.. 1892, vol. 287, 3413-3429 18398-402 * KAZAttAet ai. J, Sfci Cisem.» 1995, voi, 270,88-72 * WASLEY atei. jeisfOíam, 1833, ¥ca..2S6,S458-«S P883] ♦ HOiST et ai Sm J. Vese. £f>tfcvasc, Swg.» 1998, * REHEMTULLA; KAUFfclAN. W, 1992, wt 79, voi 15,515-529 2349-55 ♦ ««COLASSE» «S ai. FEBS ie«s.. 1933, soi 357, * HATSUZAWA «f ai J Btal CÍísbi., 1992, voi 287, 24S-24S 46894*® * WAKABAYASHt et ai J. SM €hem.s 1886. voi 281, « HATSOZAWA et af. J BkMiem,, 1892. vel 181, 11087 236-391 " ♦ THSSetaLfiMiem, 135¾ voi 27,77SS |810¾ » CREE&amp;fSERS et aí, J SM Chsm1883, voi. 268, * OSTERUD st ai. Sfcefcei».. 1972, voi 11, 2853 21628-34 * SCHLOKAT ai aí. BMsc&amp;fíeii AppíBio&amp;sm., 1996, * HEDNER et ai J CS*, hsmsi., 1963. voi. 71, 1836 voi. 24,257417