SE518174C2 - Detektionsförfarande av oönskad mikrobiell infektion i animaliecellodling - Google Patents

Description

25 30 35 ø n | ; nu n 513 174 2 komplicerad provtagning och utvärdering, trots de kost- samma arrangemangen.

Ett fàtal nyligen gjorda observationer tyder pà att elektroniska näsor skulle kunna vara attraktiva icke- invasiva alternativ för detektion av mikrobiell kont- amination i bioreaktorer för odling av mikroorganismer 1998). Principen för elektroniska näsor 1994) är välkänd fràn flera till- (Namdev et al, (Gardner och Bartlett, làmpningar för detektion av komponenter i olika typer av prover och medier genom detektion av avgivna gaser.

Detektionen är baserad pà registrering av den avgivna gasen frán odlingar med hjälp av uppsättningar av gas- sensorer som är känsliga för olika flyktiga föreningar, t ex kolväten, såsom aromatiska föreningar (t ex ergo- sterol), aldehyder (t ex acetaldehyd) och alkoholer (t ex etanol); svavelhaltiga föreningar, kvävehaltiga förening- ar, vätgas och koloxider, som är specifika för varje bak- teriestam. Genom att helt enkelt ta ut ett kontinuerligt provflöde av en fràn en bioreaktor avgiven gas, uppnås en icke-invasiv nästan realtidsövervakning av avgivningen.

Eftersom olika stammar av organismer ger upphov till specifika gassensorsignalmönster, kan elektroniska näsor nu utgöra en ny typ av instrument för tidig detektion av olika typer av mikrobiell kontaminering av odlingar (Craven et al, 1994; Holmberg et al, 1999). Det faktum att de elektroniska näsorna möjliggör mätning utanför bioreaktorsystemets sterila barriär står i överens- stämmelse med kraven pà industriell produktion och lätt- heten till anpassning för realtidsövervakning samt som operatorstöd.

I WO97/08337 (Unipath Ltd) beskrivs en elektronisk näsa för detektion av mikroorganismer i blododlingar som ympats med mikroorganismer.

I Gebrauchsmuster DF299 02 593 Ul beskrivs en gas- analysator för medicinsk diagnostik. 10 15 20 25 30 35 513 174 if? 3 Det har sedan länge funnits ett uttalat behov av en snabbare metod för detektion av mikrobiella infektioner i bioprocesser, särskilt i animaliecellodlingar.

Det har emellertid varit erkänt bland fackmän inom teknikomràdet att en elektronisk näsa inte skulle vara fördelaktig jämfört med konventionella tekniker för de- tektion av mikrobiella infektioner i animaliecellodling- ar, eftersom det förefaller vara osannolikt att detektion skulle kunna vara möjlig i ett sådant tidigt skede av den mikrobiella kontamineringen, d v s att den elektroniska näsan sannolikt inte skulle ge någon respons alls eller en mycket svag eller diffus respons.

Vad beträffar detektionen av produktkoncentrationen i animaliecellodlingar för framställning av biofarmaceut- ika, har användningen av sådana odlingar stadigt ökat under de senaste tre decennierna. Efter att inledningsvis ha varit baserad pà ascitisk produktion in vivo eller produktion med rullflaska sedan mitten av 80-talet, har tyngdpunkten nu lagts pà utveckling av högeffektiva ani- maliecellprocesser [16]. Enligt denna trend och under be- aktande av det faktum att direktmätningen i animaliecell- odling fortfarande är begränsad till ett fàtal miljöbe- tingade [l2], har utvecklingen av sofistikerade övervak- ningsmetoder blivit en nödvändighet för exakt process- styrning.

En av komplikationerna med effektiv produktion av rekombinant protein i ett biologiskt system är avsaknaden av snabba direktmetoder för detektion av den önskade pro- dukten. Dagens analytiska metoder är ofta alltför lång- samma för effektiv styrning i slutet system ("closed-loop control"), varför proteinproduktionen mäste styras via förutbestämda driftsprofiler.

Konventionell produktövervakning i animaliecell- odlingar förlitar sig ofta pà immunanalytiska metoder som oftast används endast off-line för dokumentationssyfte i stället för direkt Exempel på senare framsteg vid bioproduktanalys är den (on-line) för processtyrning [6] 10 15 20 25 30 35 o ø - . on 518174 4 framgångsrika användningen av kapillärelektrofores [6], en optisk biosensor PH och direkt immunanalys [l5]. Trots deras känslighet och exakthet måste dessa metoder emellertid fortfarande överbrygga problemet med steril och tillförlitlig provtagning in situ från bioreaktorn.

Problemet med aseptisk provtagning blir särskilt framträdande vid övervakning av utflödet från bioreak- torns gasutrymme.

Andamål med uppfinningen Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att eli- minera de ovannämnda problemen som involverar långsam detektion av mikrobiella infektioner i animaliecellkul- turer. Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för uppskattning av produktkoncentrationen i en cellodling.

Dessa ändamål har uppnåtts med hjälp av förfaranden av inledningsvis nämnt slag, vilka har de i patentkraven l och 6 angivna särdragen. Ytterligare särdrag är definierade i underkraven.

Beskrivning av ritninqarna I fig 1(a) visas tidsprofiler för utvalda sensor- responssignaler från den elektroniska näsan och odlings- parametrar för en rFVIII-odling i produktionsskala. En bakterieinfektion uppkom vid slutet av odlingen. MOSFET 3-responsen visas förstorat i sitt mätintervall av 20 min under infektionsperioden. pO2-sondens första reaktion på infektionen indikeras i kurvan. Odlingsparametrarna var normaliserade mellan O och 1. Sensorsignalerna är angivna i godtyckliga enheter.

I fig 1(b) visas tidsprofiler för utvalda sensor- responssignaler och odlingsparametrar för en framgångsrik rFVIII-odling i produktionsskala. Odlingsparametrarna var normaliserade. Sensorsignalerna är angivna i godtyckliga enheter.

I fig 2(a) visas tidsprofiler för utvalda sensor- responssignaler och odlingsparametrar för en rFVIII- odling i laboratorieskala. Odlingen kontaminerades med 10 15 20 25 30 35 . » a ~ u' n 518 174 5 Bacillus cereus. Fl, F2: introducerade processfel via en minskning av löst syre till 0% mättnad. M: den elektron- iska näsan kopplades bort från processen. MOSFET 3-re- sponsen visas förstorat i sitt mätintervall av 20 min under infektionsperioden. pO2-sondens första reaktion pà infektionen anges i kurvan. Odlingsparametrarna var nor- maliserade. Sensorsignalerna anges i godtyckliga enheter.

I fig 2(b) visas tidsprofiler för utvalda sensor- responssignaler och odlingsparametrar för en rFVIII- odling i laboratorieskala. Odlingen kontaminerades med Pseudomonas aeruginosa. MOSFET 3-responsen visas förstor- at i sitt mätintervall av 20 min under infektionsperiod- en. pO2-sondens första reaktion pà infektionen anges il kurvan. Odlingsparametrarna var normaliserade. Sensor- signalerna är angivna i godtyckliga enheter.

I fig 3(a) visas tidsprofiler för utvalda sensor- signaler och odlingsparametrar för en kontrollfermenta- tion i laboratorieskala. Pseudomonas aeruginosa sattes till ett referensodlingsmedium vid den angivna tidpunkt- en. Odlingsparametrarna var normaliserade. Sensorsignal- erna är uttryckta i godtyckliga enheter.

I fig 3(b) visas tidsprofiler för utvalda sensor- signaler och odlingsparametrar för en kontrollfermenta- tion i laboratorieskala. Bacillus subtilis sattes till ett referensodlingsmedium vid den angivna tidpunkten.

Odlingsparametrarna var normaliserade. Sensorsignalerna är angivna i godtyckliga enheter.

I fig 4(a) visas den ursprungliga och justerade gas- sensorsignalen från en rFVIII-odling i produktionsskala.

Sensorsignalerna är angivna i godtyckliga enheter.

I fib 4(b) visas tidsprofilerna för utvalda odlings- parametrar och gassensorsignaler för en rFVIII-odling i laboratorieskala. Kommersiella intressen kräver en norma- lisering av odlingsparametrarna mellan O och 1. Sensor- signalerna är uttryckta i godtyckliga enheter. 10 l5 20 25 30 35 ~ n a ~ av o 518174 »uu u 6 I fig 5 visas karaktäriseringen av gassensorbeteen- det vid processparameterändringar. Sensorsignalen är an- given i godtyckliga enheter.

I fig 6 visas tidsprofiler för utvalda sensorsignal- er från den elektroniska näsan och viktiga odlingspara- metrar för en rFVIII-odling i produktionsskala. Odlings- parametrarna är normaliserade mellan O och 1. Sensorsig- nalerna är angivna i godtyckliga enheter.

I fig 7 visas den uppskattade och uppmätta koncen- trationen av rekombinant faktor VIII i förhållande till odlingstiden vid en rFVIII-odling i produktionsskala. De uppskattade värdena erhölls fràn en neural nätverksmodell som tränats med data från en elektronisk näsa fràn 5 rFVIII-odlingar i produktionsskala. rFVIII-koncentra- tionen var normaliserad mellan O och 1.

I fig 8 visas det uppskattade och uppmätta antalet viabla celler i förhållande till odlingstiden frän en rFVIII-odling i laboratorieskala. De uppskattade värdena erhölls fràn en neural nätverksmodell som tränats med data fràn en elektronisk näsa från en rFVIII-odling i laboratorieskala. Antalet viabla celler var normaliserat mellan 0 och 1.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinnare har överraskande nog funnit ett förfarande för tidig detektion av mikrobiell infek- tion vid en animaliecellodlingsprocess genom användning av elektronisk näsa. Infektioner med definierade cell- koncentrationer har också àstadkommits för att karaktäri- sera den elektroniska näsans respons pà särskilt tre infekterande organismer som är vanliga vid bioprocesser.

Föreliggande uppfinnare har dessutom funnit ett för- farande för detektion av produktkoncentrationen i ani- maliecellodlingar med hjälp av en elektronisk näsa som inbegriper ett artificiellt neuralt nätverk och som har förmåga till mönsterigenkänning, vilket inte tidigare varit känt eller möjligt. 10 15 20 25 30 35 n - ø v oo 518174 .av nu 7 Dessutom kan bàda av de av uppfinnarna framtagna ovannämnda förfarandena utföras samtidigt vid samma cell- odlingsprocess med hjälp av samma elektroniska näsa.

De här använda uttrycken "mikrobiell" och "mikro- organism" hänför sig till vilka oönskade bakterier, jäst- arter och svampar som helst som skulle kunna infektera eller kontaminera bioreaktorinnehàllet.

Cellodlingen i vilken potentiell mikrobiell konta- minering eller infektion skall detekteras är företrädes- vis en animaliecellodling, t ex en human- eller djurcell- odling, t ex en fibroblastcellodling, en hamstercell- odling, en hybridomcellodling, en insektscellodling etc.

Cellodlingsmediet kan vara vilket konventionellt medium som helst som används på detta område. Volymen av cell- odlingsmediet kan också variera från laboratorieskala upp till stor skala (0,5 - 20 000 l).

Den från cellodlingen avgivna gasen ackumuleras i gasutrymmet ovanför cellodlingsytan i bioreaktorn och in- begriper flyktiga föreningar, t ex kolväten, som avges av och är specifika för vilken mikroorganism som helst i odlingen.

Vid en föredragen utföringsform av föreliggande upp- finning detekteras en odling av rekombinanta CHO-celler (ovarieceller från kinesisk hamster), som producerar human faktor VIII (rFVIII), med avseende på mikroorgan- ismer, och tester har utförts i ett lämpligt medium i 2- liters- resp 500-litersskala. Efter en initial satsvis utförd tillsatsfas genomspolas ("perfused") odlingen kontinuerligt med färskt medium genom användning av en extern cellretentionsanordning. Prover togs var 24 h, och cellkoncentrationen och -viabiliteten mättes genom ute- slutning med hjälp av färgämne.

Det här använda uttrycket "elektronisk näsa" avser en anordning innehållande en uppsättning av gassensorer som ger en karaktäristisk respons på ett gasformigt prov, varvid anordningen också möjliggör mönsterigenkänning. 10 15 20 25 30 35 ø o u | co 518174 8 Det här använda uttrycket "artificiellt neuralt nätverk" avser ett system som används vid en beräknings- metod baserad på teorin för artificiellt neuralt nätverk, vilken beskrivs av t ex C M Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Oxford Univ. tryckt 1995.

Det här använda uttrycket "mönsterigenkänning" avser identifiering av ett mönster av responser med kända variabler med hjälp av vilken beräknings- och/eller icke- beräkningsmetod som helst. Icke-beräkningsmetoden är t ex visuell observation av mönster av sensorsignaler.

Den föredragna elektroniska näsan som används i sam- band med föreliggande uppfinning är välkänd (NST3310) och är tillgänglig från Nordic Sensor Technologies AB, Teknikringen 8 , Mjärdevik Science Park, 583 30 Linköp- ing, Sverige. Den inbegriper också ett artificiellt neu- ralt nätverkssystem i den utföringsform som avser upp- skattning av produktkoncentrationen. Den elektroniska näsans sensoruppsättning som används vid rFVIII-odlingen av 500 l var i sin föredragna utföringsform försedd med 10 MOSFET-sensorer (metalloxidhalvledarbaserade fält- effekttransistorer, med katalytiska metallstyren av palladium, iridium eller platina, drivna vid olika tem- peraturer (140/170°C), 12 MOS-sensorer (halvledande metalloxidsensorer av Taguchi- eller FIS-typ; SnO2-sen- sorer drivna vid 400°C) och 1 C02-sensor baserad pà in- fraröd adsorption.

Vid ovannämnda rFVIII-odlingar av 2 l innehöll sensoruppsättningen 10 MOSFET-sensorer, 19 MOS-sensorer och 1 CO2~sensor baserad på infraröd adsorption. En mass- flödesreglerare upprätthöll ett stabilt flöde över sen- sorerna.

Sensorerna var arrangerade i ett gasflödesinjek- tionssystem där gasflödet först passerade MOSFET-sensor- erna och därefter MOS-sensorerna och C02-sensorn. Den elektroniska näsan var utanför den sterila barriären ansluten till bioreaktorns ledning för angiven gas. Prov- tagning utfördes kontinuerligt från den från reaktorn 10 15 20 25 30 35 518174 aus ua 9 avgivna gasen under vanligtvis 30 sek var 20 min genom- gående under hela processen.

Typerna och antalet av sensorer i den elektroniska näsan beror pà odlingsmediets sammansättning och organ- ismerna i mediet som skall detekteras. Sålunda kan ett varierande antal MOSFET-, MOS- och C02-sensorer och olika kombinationer därav användas för detektionen av mikro- organismer.

Andra sensorer som skulle kunna vara användbara är sensorer baserade på kvartskristall, ledande polymerer och/eller halvledare.

Gassensorresponserna fràn rFVIII-odlingarna uppvisa- de olika signalskiften. Skiftena avlägsnades genom an-I vändning av en algoritm som subtraherar/adderar den kvar- varande förskjutningen fràn ett sensorsignalskifte.

Kontrollfermentationer utfördes i ett bioreaktor- system av 3 l (Chemoferm AB, Sverige) som var försett med en processtyrningsenhet av typ KENT-B2® (Belach Bioteknik AB, Sverige). Odlingsparametrarna ställdes in så att de överensstämde med rFVIII-odlingsbetingelserna_ Gasflödet hölls genomgående under processen konstant vid 800 ml/min av komprimerad och filtrerad luft.

En kvadropolmasspektrometer anslöts till bioreak- torns ledning för avgiven gas (Multi-Gas, Leda-Mass Ltd, Cheshire, UK). Instrumentet försågs med ett dubbeldetek- torsystem (faraday- och elektronmultiplikatordetektor).

Den från bioreaktorn avgivna gasen screenades med avse- ende pà atomvikterna 1-300 vid maximal uppdaterings- hastighet (ca 5 min).

Den elektroniska näsan som var ansluten till bio- reaktorsystemet var samma instrument som användes för de ovan beskrivna rFVIII-odlingarna av 2 l.

Vilken mikroorganism som helst, t ex en bakterie- stam, som kontaminerar eller infekterar ett cellodlings- medium kan detekteras med hjälp av den elektroniska näsan vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning, men före- 10 15 20 25 30 35 n ø n v ao w 518 174 åïqb ¶ïHELESh" 10 trädesvis detekteras Bacillus cereus och Pseudomonas aeruginosa.

Bacillus cereus- och Pseudomonas aeruginosa- bakteriestammarna som användes för infektionsstudier vid rFVIII-odlingarna av 2 l isolerades av Pharmacia & Upjohn AB.

Stammarna som användes vid kontrollfermentationerna var Pseudomonas aeruginosa (isolerad pà Linköpings Uni- versitetssjukhus, Linköping, Sverige), Bacillus subtilis (CCUG l63B) och Micrococcus luteus (CCUG 5858). LB-medium (l% trypton, 0,5% jästextrakt och 1% NaCl) användes för upprätthållande av stammen. Kontrollfermentationer ut- fördes i ett definierat serumfritt Eagles MEM-liknande cellodlingsmedium (Shuler et al, 1992).

Antalet kolonibildande enheter (cfu) bestämdes genom koloniräkning efter inkubation av medieprover pà agar- plattor. Kopior av medieprover applicerades pà LB-aga- plattor och inkuberades vid 30°C under 24-48 h.

Med föreliggande uppfinning kan, oavsett mikroorgan- ism som skall detekteras, detektionen sålunda utföras flera timmar, d v s ca 50 h, vanligtvis ca 1-10 h, och helst 5 h, tidigare för varje mikroorganism än vid jäm- förande metoder, vilket är av särskilt intresse vid stor- skaliga bioprocesser. Olika mikroorganismer kan detekter- as vid olika tidpunkter i sin tillväxtfas, men i allmän- het är detektionen möjlig inom ovannämnda tidsintervaller tidigare än vad som är möjligt med konventionella metod- er. j Vad beträffar utföringsformen avseende uppskattning av produktkoncentration kan åtskilliga typer av produkter detekteras med hjälp av förfarandet enligt föreliggande uppfinning, företrädesvis proteiner, men även andra bio- polymerer, såsom polykolväten och polynukleotider.

Det är överraskande att gasformiga föreningar i av- gaserna avgivna fràn bioreaktorer och härrörande fràn vissa produkter i odlingsmediet kan detekteras. Denna utföringsform avseende uppskattning är inte begränsad 10 15 20 25 30 35 a n - q en 518174 ll till animaliecellodlingar, utan även till mikroorganism- cellodlingar och andra typer av medier. Företrädesvis möjliggör denna utföringsform av föreliggande uppfinning direkt uppskattning av faktor VIII-koncentrationen i odlingar i produktionsskala.

Försök och resultat för utförinqsformen avseende detek- tion av mikrobiell infektion I fig l(a) visas hur det är möjligt att spåra före- komsten av bakterieinfektion i en rekombinant faktor VIII-odling av 500 l med utgångspunkt från den elek- troniska näsans responssignaler. De tre sensorsignalerna i diagrammet visar övervakningen av odlingen under en period av 18 h parallellt med det uppmätta antalet viabla celler, rFVIII-koncentrationen och totala flödeshastig- heten genom bioreaktorn. Signalerna avspeglar de grund- läggande ändringarna i produkttitern och koncentrationen av viabla celler, såsom rapporterats i detalj på annat 1999b). På den sjuttonde odlingsdagen uppkom en teknisk defekt i anläggningen, vilket förmodades ha orsakat en bakteriell kontaminering ställe (Bachinger et al, i odlingen. Efter 16 h bekräftades kontamineringen genom en reduktion av koncentrationen av löst syre i mediet, vilket övervakades med DO-elektroden. Senare verifierades infektionen, och den infekterande organismen identifierades som Bacillus cereus.

Såsom framgår av fig l(a) indikerade responsen från den elektroniska näsan infektionen redan 6-8 h efter det att processdefekten hade uppkommit. I figuren visas också att antalet viabla celler och flödeshastigheten var stabila under denna period. En jämförelse med en rFVIII- odling av 500 l visar de tydliga skillnaderna mellan sensorsignalmönstrena från båda odlingarna (fig l(b)).

Den elektroniska näsan har sålunda förmåga att indikera bakterieinfektionen ca 10 h före DO-sensorn. Det bör emellertid noteras att sensorerna inte explicit avslöjar skälet till signalavvikelsen och infektionen. 10 15 20 25 30 35 _1 cfu/ml medium. 5, 8 1,4 = fr: ua 12 I syfte att ytterligare utvärdera potentialen för elektroniska näsor för snabb detektion av kontaminering i animaliecellodlingsprocesser, sattes tre ofta förekomm- ande bakteriestammar avsiktligt till testodlingar.

För det första sattes Bacillus cereus till en ned- skalad rFVIII-odling av 2 l i en koncentration av I fig 2(a) visas den elektroniska näsans responssignaler. 8 h före tillsättningen av bakterierna introducerades en processdefekt vid den tidpunkt som är markerad med F2 i diagrammet. Koncentrationen av löst syre minskades manuellt till 0% under 30 min, och sensor- signalerna indikerade omedelbart processavvikelsen (se_ fig 2(a)). Sensorsignalerna återhämtade sig emellertid inte, utan sjönk i stället gradvis efter denna incident.

När samma processdefekt introducerades under en period 10 h tidigare vid odlingen (Fl), uppnådde sensorerna omedelbart den ursprungliga signalnivàn efter det att pO2 àterställts. En förklaring av detta beteende kan vara att cellerna efter nästan tre veckors odling var mer sårbara än i början av odlingen. Gassensorerna övervakade den cellulära aktiviteten, som gradvis sjönk, vilket in- dikerade att cellerna inte återhämtade sig korrekt efter att ha exponerats för làga syrekoncentrationer. Sensor- signalerna stabiliserades plötsligt ca 1 h efter det att bakterierna sattes till cellodlingen. Detta ägde rum 9 h innan pO2-sensorn registrerade en minskning av koncentra- tionen av löst syre.

För det andra sattes Pseudomonas aeruginosa i en koncentration av 0,1 cfu/ml medium (fig 2(b)) till samma odlings- och reaktorsystem. Ingen signalresponsändring noterades efter tillsättning av bakterierna. En signal- avvikelse fràn den ursprungliga vägen kunde detekteras först 15 h efter infektionen. pO2-sensorn identifierade processavvikelsen 6 h därefter.

I syfte att ytterligare verifiera giltigheten av signalerna fràn den elektroniska näsan för Bacillus- och Pseudomonas-arterna inkuberades dessa i samma medium, men 10 15 20 25 30 35 13 utan CHO-kulturen. I fig 3(a) visas den elektroniska näsans respons pà en kontrollfermentation där 100 koloni- bildande enheter (cfu) av Pseudomonas aeruginosa per ml cellkulturmedium ympats. l h efter ympningen indikerades kontamineringen genom en responsändring i den utvalda MOSFET-sensorn. 14 h efter ympningen indikerade pO2- sensorn en minskning av halten löst syre. Parallellt användes en masspektrometer i direktanslutning vid denna odling för övervakning av den från bioreaktorn avgivna gasen. Det registrerade partialtrycket för C02 visar att masspektrometern inte indikerar infektionen tidigare än pO2-sensorn.

Den elektroniska näsans respons på en kontrollfer- mentation där 4000 cfu/ml av Bacillus subtilis ympats visas i fig 3(b). Detta stora cellantal orsakade en omedelbar signaländring hos en av sensorerna som plottats i fig 3(b). pO2-sensorn övervakade en minskande halt av löst syre 7 h efter ympning. Partialtrycket av C02 som registrerats av masspektrometern indikerade inte heller här infektionen tidigare än pO2-sensorn.

Genom upprepning av odlingarna i cellfria medier med P. aeruginosa och B. subtilis vid lägre koncentrationer (0,5 cfu/ml resp 20 cfu/ml) uppvisades förväntade längre responstider för den elektroniska näsan.

En infektion av cellfritt medium med Micrococcus luteus verifierade våra tidigare observationer i 500 l där den elektroniska näsan gav respons med en tydlig signalavvikelse för en kontaminering som senare iden- tifierades som Micrococcus sp. Där hade vi rapporterat identifieringen av bakterieinfektionen med hjälp av den elektroniska näsan ca 2 dagar innan pOš-signalen indiker- ade kontamineringen. Vid denna kontrollfermentation fram- gick det att pO2-sensorn indikerade tillväxt 39 h efter ympning. En signaländring fràn den elektroniska näsan kunde observeras 10 h efter ympningen.

I Tabell I är resultaten av kontamineringstesterna sammanfattade. 10 15 20 25 30 35 518174 o n uoovoc 14 Sálunda undersöktes särskilt responsen fràn en elek- tronisk näsa försedd med halvledande metalloxidsensorer på genomspolade CHO-odlingar som producerar rekombinant human faktor VIII. skala kunde bakterieinfektioner av rekombinant faktor I produktionsskala och laboratorie- VIII-odlingar identifieras tidigare än med hjälp av en konventionell metod, d v s en elektrod för löst syre.

Oavsiktlig och reglerad tillsättning av bakterie- kontaminanter till faktor VIII-odlingar resulterade i en tydlig sensorresponsmönsterändring ca 5-10 h tidigare än den förväntade minskningen av halten löst syre. Den elek- troniska näsan kommer emellertid inte att förklara orsak- en till den indikerade mönsterändringen. Det är därför mer realistiskt vid denna specifika tillämpning att instrumentet endast fungerar som ett stöd för operatören.

Den reglerade tillsättningen av ett litet cellantal av Pseudomonas- och Bacillus-stammar visade den elektron- iska näsans stora känslighet. Detta resultat bekräftar också att instrumentet är en känslig övervakningsenhet för biomassa.

Försök och resultat för utförinqsformen avseende uDD- skattning av produktkoncentration Försök avseende uppskattningen av produktkoncentra- tionen i en cellodling utfördes med samma utrustning för den elektroniska näsan som vid föregående utföringsform avseende detektion av mikrobiell infektion, men var kom- pletterad med ett neuralt nätverk samt var också i skalan 2 l resp 500 l.

Den genomsnittliga odlingstiden var ca 5 veckor.

Prover togs var 24 h, och cellkoncentrationen och -via- biliteten mättes genom uteslutning med hjälp av färgämne.

Laktatkoncentrationen analyserades genom användning av en YSI-analysator av modell 2700 (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH). Koncentrationen och den biologiska aktiviteteten för rFVIII bestämdes genom an- vändning av godkända metoder. 10 15 20 25 30 35 ¿._,.._.__. _, _ _: ____: 518 174 ="="-=- =: =-s s.'=- :en =' - u . - u n. u n ... .. 0 Z 15 Avståndet mellan den elektroniska näsan och bioreak- torns utlopp var 3 m.

Bioreaktorsystemet arrangerades på ett sådan sätt att det överensstämde sà mycket som möjligt med beting- elserna för produktionsskala. Prover togs i varierande tidsintervallet var 12 eller 24 hl Analyser utanför systemet utfördes såsom beskrivs i sektion 2.1.

Den elektroniska näsan var försedd med 10 MOSFET- sensorer, 19 MOS-sensorer och 1 C02-sensor. Dessutom var en massflödesstyrningsanordning introducerad i flödes- injektionssystemet för upprättande av ett stabilt gas- flöde över sensorerna. Provgränsytan som beskrivs under 2.1 var modifierad pá sà sätt att avståndet till bioreak- torutloppet var ytterligare reducerat till 0,7 m.

Den elektroniska näsa som användes vid odlingarna i produktionsskala var också införlivad i övervaknings- utrustningen.

Algoritmen för sensorskiftesexklusion och median- filtret utvecklades i Object Pascal (Delphi 4, Inprise Corp., CA, USA). Skiftesexklusionsalgoritmen subtra- herar/adderar den kvarvarande förskjutningen från en gas- sensorsignal när skiftet överstiger en viss procenthalt och signalnivà och fortskrider i endast en riktning.

Implementeringen av algoritmen för direkt omräkning bör vara okomplicerad. Medianfiltret applicerades pà data fràn en skiftesexklusionssensor med en fönsterstorlek täckande fem pà varandra följande mätpunkter.

Programmeringsspráket MATLABTM (The MathWork Inc., MA, USA), understött med MATLABTM-verktygslàdor för neurala nätverk och kemometri, användes för utförande av beräkningar med det artificiella neurala nätverket (ANN) och vid huvudkomponentanalys (PCA). PLS-verktygslådan för MATLABTM användes för komponentkorrektionsmetoden och den framàtverkande selektionsproceduren ("forward selection procedure")(Eigenvector Technologies, Manson, WA).

Huvudkomponentanalys (PCA) är en linjär oövervakad mönsterigenkänningsteknik som kan användas för reduktion 10 15 20 25 30 35 ø n | o v: o n 518 174 ä? 16 av dimensionaliteten av multivariata data BJJ. Beräkning- en resulterar i huvudkomponenter som beskriver riktningen av variationen i datauppsättningen. Resultaten presenter- as i diagram där de tvà viktigaste huvudkomponenterna är plottade mot varandra, antingen som en poängplot ("scorei plot"), som beskriver hur proverna är relaterade till varandra, eller såsom en "loadings plot", som beskriver förhållandena mellan variablerna.

Den i detta arbete använda neurala nätverksstruktur- en var en standardmässig àterpropagerande ANN med dolt skikt ("hidden layer backpropagation" ANN) [17] med en sigmoidal aktiverad funktion och Levenberg-Marquardt- uppdateringsalgoritmen [14] Nätverksstrukturen för uppskattningen av rFVIII- koncentrationen innehöll 11 noder i det dolda skiktet, 4 insignalvariabler och 1 utsignal. Den minimala felgrad- ienten var 0,000l, initialvärdet för Ä var 0,001 och multiplikatorerna för ökande och minskande Ä var 10 resp 0,1. Felmàlet var satt till 30, och 20 övningscykler krävdes för uppnàende av en optimal prestanda för modell- en.

För uppskattning av antalet viabla celler utgjordes ANN-utrustningen av 9 dolda noder, 6 insignaler och 1 utsignal. Den minimala felgradienten var 0,0001, det ini- tiala värdet för Ä var 0,001 och multiplikatorerna för ökande och minskande Ä var 10 resp 0,1. Felmàlet var 0,5, och 30 övningscykler utfördes.

I Vid komponentkorrektionsmetoden (CC, DJ) utnyttjas ett filter för reduktion av sensordriften i syfte att öka livstiden för mönsterigenkänningsmodeller. CC förutsätter att driften inte är slumpmässigt spridd, utan att den i stället har en föredragen riktning i mätutrymmet. En PCA- laddningsvektor ("loading vector") beräknas med utgångs- punkt fràn kalibreringsmâtningarna, som infángar rikt- ningen i responsutrymmet. Subtraktion av datauppsättning- en från den ursprungliga odlingen från projektionen av odlingsvärdena pà denna laddningsvektor resulterar i den 10 15 20 25 30 35 518 174 :--; f..= t» 1"* 17 önskade elimineringen av riktningen som beskriver drift- en. Därigenom bevaras samtliga andra riktningar och be- tydande varianser som àtskiljer anhopningar och koncen- treringar. 20 kalibreringsmätningar utfördes genom mätning av responsen pà odlingsmediet i den biologiska reaktorn före ympning. En trendlinje anpassades genom linjär regression till medelvärdet för kalibreringsmàtningarna för varje sensorsignal som täcker samtliga utförda odlingar.

Odlingsvärdena var medelvärdescentrerade vid utförande av komponentkorrektionsmetoden med anpassade kalibrerings- data.

Detaljer om det framätverkande selektionsförfarandet anges av Eklöv et al [5]. Syftet är att finna en under- uppsättning av ursprungliga sensorsignaler som minimerar ett selektionskriterium. Selektionskriteriet är det för- utsägbara felet fràn en modell av multipel linjär regres- sion i en riktning mot det önskade modellutbytet (pro- cessvariabel). En framàtverkande selektion adderar en variabel åt gången till modellen tills selektionskriter- iet uppnår ett minimum. De selekterade sensorsignalerna innehåller relevant information för variabeluppskattning, vilket sålunda representerar tillfredsställande paramet- rar för användning som insignaler till det artificiella neurala nätverket.

Odlingsdatauppsättningarna behandlades med skiftes- exklusionsalgoritmen, filtrerades och kalibrerades innan en sökning utfördes med avseende pà korrelation gentemot rFVIII-koncentration och antalet viabla celler.

Den elektroniska näsans multisignalrespons möjliggör direkt uppskattning av huvudparametrarna genom utnyttj- ande av mönsterigenkänningsmodeller. Teoretiskt sett bör en modell vara uppbyggd av ett maximalt antal av dataupp-' sättningar för säkerställande av att den täcker hela variationen vid processen. Detta och graden av korrela- tion av signalerna gentemot den uppskattade parametern 10 15 20 25 30 35 51 3 1 7 4 Ü ÃÃ-åi-.Ií- 18 bestämmer modellerna, flexibiliteten och tillförlitlig- heten.

Vid föreliggande studie övervakades 6 odlingar av faktor VIII (rFVIII) i produktionsskala med den elektron- iska näsan. Var och en av odlingarna ägde rum under 5 veckor, och den totala övervakningstiden förlängdes med' mer än 5 000 h av direktoperationen. Därför täcktes en betydande del av processens variation in, liksom instru- mentprestandan och -kalibreringen.

En representativ gassensorsignal från en av odling- arna visas i fig 4(a) (se MOSFET-respons). Plötsliga re- sponsskiften kan observeras i signalen. Användning av multivariata metoder för parameteruppskattning omöjlig- görs av detta fenomen.

I syfte att bättre förstå dessa skiften och validera gassensorernas responsegenskaper, skalades rFVIII-odling- arna ner till 2 l och övervakades parallellt med två elektroniska näsor.

En huvudfråga vid tolkning av dessa signaländringar var huruvida de var resultatet av CHO-cellmetabolismen, bioreaktoruppsättningen i produktionsskala eller själva instrumentet. Såsom kan observeras i fig 4(b) återkom liknande signalskiften i de nedskalade odlingarna (se MOSFET 2-respons). Detta utesluter utformningen och dimensionen av bioreaktorn i produktionsskala som orsak.

Instrumentdefekter kan också uteslutas eftersom båda de elektroniska näsorna uppvisade samma responsegenskaper.

Vi förmodade därför att den biologiska aktiviteten hos CHO-cellerna under produktionen av rFVIII orsakade signalskiftena. Vid långvarig odling av en VERO-cellinje med genomspolning noterades dessutom inte skiftena.

I syfte att mera fullständigt förstå gassensorns beteende är det viktigt att identifiera de icke-biolog- iska parametrar vid processen som har en direkt inverkan på gassensorernas respons. Mätningar på ett referens- odlingsmedium visade att ändringar i temperatur och kon- centration av löst syre resulterade i en permanent re- 10 15 20 25 30 35 518 174 ä? Iå-åß Iš. 19 sponsändring för metalloxidsensorer (fig 5). Det har tidigare visats att en ändring av luftningshastigheten inte har någon direkt inverkan pà sensorresponsen D3].

Driftsparameterändringar av denna typ förekommer ofta i rFVIII-odlingar, och resulterande signalskiften bör där- för elimineras fràn sensorsignalerna.

De ovan presenterade observationerna tyder också pà att det är ett korrekt tillvägagångssätt att avlägsna skiften som vi förmodar orsakas av cellerna. Sålunda ut- vecklades en algoritm som möjliggjorde reglerad eliminer- ing av signalförskjutningarna ("signal offsets"). En justerad sensorresponssignal från en rFVIII-odling i produktionsskala visas i fig 4 (se MOSFET-skiftes- eliminerad respons).

Driften av gassensorer i fast tillstànd är ett stort problem för tekniken med elektronisk näsa [8]. Etablerade mönsterigenkänningsmodeller skulle kräva konstant om- kalibrering i det fall då ingen driftsmotverkan används.

Särskilt för långvariga bioprocesser skulle detta vara tidskrävande och ineffektivt.

En möjlighet vore att upprepade gånger omkalibrera sensorerna med en lämplig referensgas eller -gasbland- ning. Referensgasblandningen bör inte endast vara korre- lerad till det uppmätta provet, utan även driften av bàdadera bör vara i hög grad korrelerad. Vid en biopro- cess mäste man emellertid teoretiskt sett först identifi- era de viktigaste flyktiga föreningarna som produceras under fermentationsförloppet och använda dessa som referens. Detta skulle emellertid vara opraktiskt, och det är därför bättre att hitta ett gemensamt ämne som är närvarande i höga koncentrationer genomgående under pro- cessen.

Kalibreringen av gassensorerna förverkligades genom registrering av deras respons på de flyktiga föreningarna frän odlingsmediet i bioreaktorn kort före ympningen. I detta skede innehåller gasutrymmet huvudsakligen vatten- ånga. Vattenånga har tidigare befunnits vara lämplig för 10 15 20 25 30 35 ø - | - .v 513 174 Ü -.I=' 'z 20 kalibreringssyften vid àtskilliga tillämpningar pài livsmedelsprover [9]. Vi har erfarit att detta kalibrer- ingsförfarande ger en korrekt representation av driften av gassensorer som exponeras för en bioprocess.

Tjugo kalibreringsmätningar utfördes kort före ymp- ningen av var och en av odlingarna. Responsen för varje sensor omräknades till ett medelvärde, och en trendlinje anpassades genom linjär regression täckande samtliga utförda odlingar. Driften över en tidsperiod av 1 år för utvalda sensorer anges i Tabell 2. Åtskilliga driftmotverkande metoder har utvecklats under senare år [10,9,1]. Vid denna studie applicerades komponentkorrigerings(CC)-metoden Ü] pà sensorsignalerna, såsom beskrivs i sektion 2.4. Sensordrift som för vissa sensorer uppgick till 30% under 1 år avlägsnades med stor framgång med hjälp av denna metod.

I fig 4(b) är àtskilliga sensorsignaler fràn den nedskalade rFVIII-odlingen plottade. Den högre signal- variationen jämfört med den i produktionsskalan var ett resultat av installation av instrumentet nära reaktor- utloppet. Signalerna behandlades med ett anslutet medel- värdesframtagande filter för reduktion av bruset och underlättande av visualisering.

Tillstàndsvariabler och selekterade sensorsignaler fràn en odling i produktionsskala visas i fig 6. De plottade signalerna behandlades med ovan beskrivna skiftesexklusionsalgoritm och representerar en selektion av signalvariationen bland de 110 olika signaler som härletts fràn gassensorarrangemanget.

Vissa av sensorresponssignalerna i fig 6 uppvisar korrelation med rFVIII-koncentrationen i bioreaktorn.

Avvikelsesignalen följer á andra sidan ökningen i speci- fik laktatbildning vid slutet av odlingen. Korrelationen med antalet viabla celler framgàr av vissa av.signal- responserna. Upplösningen av sensorsignalerna är emeller- tid inte tillräckligt hög i början av odlingen för en exakt direkt uppskattning av cellantalet. Detta berodde 10 15 20 25 30 35 ø ø u . av u n 513 174 É-*Éïïš Ü Én* = u u nu. u. 21 sannolikt pà det lànga avståndet mellan reaktorutloppet och den elektroniska näsan som var nödvändigt p g a prov- uppsättningen och instrumentdimensionen i produktions- skala. Vid de nedskalade rFVIII-odlingarna var det möj- ligt att upplösa små biomassaändringar även vid ympnings- celltätheter beroende på den reducerade provtagningsupp- sättningen (se fig 4(b)).

Gassensorsignalerna fràn samtliga sex odlingar i produktionsskala, som behandlats med signaleliminerings- algoritmen, där bruset av signalerna delvis avlägsnats genom användning av ett medianfilter, och med komponent- korrektionskalibreringen användes för uppskattning av rFVIII-koncentrationen.

Det framàtverkande selektionsförfarandet som be- skrivs i förfarandeavsnittet användes för selektion av signalparametrarna med den högsta korrelationen med rFVIII-koncentrationen. De utvalda signalerna från fem odlingar i produktionsskala kompilerades, och ett neuralt nätverk tränades med den utanför systemet uppmätta produktkoncentrationen. De utvalda sensorsignalerna var MOSFET 3-off-derivata, MOSFET 1-off-derivata, MOSFET 8- respons och MOSFET 3-respons. Topologin för det neurala nätverket identifierades med hjälp av "trial and error".

Modellen med bevarat neuralt nätverk validerades mot en odling som var okänd för modellen. Resultatet av vali- deringen visas i fig 7. Det totala uppskattningsfelet var ca 10% med en genomsnittlig avvikelse av 1,1 IU/ml. Med ett rFVIII-toppvärde som varierade med så mycket som 50% mellan de sex odlingarna, är detta fortfarande ett accep- tabelt resultat. Det tyder också pà att användning av ytterligare odlingsdatauppsättningar för ANN-modell- träningen skulle öka uppskattningens exakthet.

För möjliggörande av sofistikerad styrning av rekom- binantproteinproduktion är det viktigt att övervaka an- talet viabla celler. Trots att sensorsignalupplösningen vid odlingar i produktionsskala inte var tillräckligt hög för exakt direkt uppskattning av antalet viabla celler, 10 15 20 25 30 35 51 g 174 Ü 'E o.. u 22 möjliggjorde nedskalade rFVIII-odlingar detta. Värdena från endast tvà odlingar är inte tillräckliga för att täcka variationen av denna process. Den resulterande modellen kommer därför inte att ha samma genomslag som modellen som etablerats för uppskattning av produktkon- centrationen. V A Sensorresponserna behandlades med ovannämnda signal- uteslutningsalgoritm och filtrerades med ett median- filter. en befanns vara marginell (ca 2%). Sensorsignaler med Ingen sensorkalibrering utfördes, eftersom drift- korrelation med antalet viabla celler selekterades genom användning av det framàtverkande selektionsförfarandet.

MOSFET 1-respons, MOSFET 3-respons, Taguchi 2-respons, FIS 2-respons, FIS 5-off-derivata och MOSFET 2-"off- integral" identifierades med hjälp av selektionsmetoden.

De selekterade sensorsignalerna från båda odlingarna slogs samman, och 60% av värdena användes för träning av ett artificiellt neuralt nätverk mot antalet viabla celler. En lämplig neural nätverkstopologi identifierades med hjälp av "trial and error". Den slutliga ANN-modellen validerades mot resterande 40% av datauppsättningen. En medelavvikelse av 0,21 x 105 celler/ml visar att korrela- tionen mot antalet viabla celler finns i sensorsignaler- na.

För erhàllande av en representativ modell för upp- skattning av antalet viabla celler tränades ett neuralt nätverk med sensorresponser fràn en av odlingarna. Samma selekterade signaler användes i modellen som beskrivits ovan. I fig 8 visas valideringsresultatet av den tränade modellen mot den andra rFVIII-odlingen. Totalfelet vid uppskattning var ca 10% med en medelavvikelse av 0,41 x 106 celler/ml.

Användning av en elektronisk näsa för direkt upp- skattning av produktkoncentrationen i en genomspolad od- ling av rekombinanta animalieceller visades sålunda här.

Det visades att faktor VIII-koncentrationen i CHO-cell- kulturer i produktionsskala kunde uppskattas med till- 10 | . - Q n. 518174 nu vv 23 fredställande noggrannhet genom kombination av den elek- troniska näsan med artificiell neural nätverksteknologi.

Resultaten bekräftar att den elektroniska näsans multivariata respons innehåller avsevärd information om produktkoncentrationen i denna särskilda process. Det kan förmodas att detta är relaterat till cellpàfrestning or- sakad av överdrivet uttryck av det rekombinanta protein- et. Det bör därför vara möjligt att uppskatta produkt- koncentrationen vid vilken rekombinant process som helst.

Möjligheten att direkt uppskatta antalet viabla celler presenterades också. Vid faktor VIII-odlingar i laboratorieskala uppnådde vi en acceptabel noggrannhet för uppskattning av cellkoncentrationen. 10 l5 20 25 30 35 40 45 - nan nu 518174 24 REFERENSER Bachinger, Th., Riese, U., Eriksson, R., Mandenius, C.F. (1999a) Monitoring cellular state transitions in a production-scale CHO-cell process using a chemical multisensor array. To appear in J. Biotechnol.

Bachinger, Th., Riese, U., Eriksson, R.K., Mandenius, C.F. (1999b) Estimation of product concentration in a perfused animal cell cultivation using an electronic nose. (som manuskript).

Craven, M.A., Hines, E.L., Gardner, J.W., Horgan, P., Morgan, D., Ene, I.A. (1994) Bacteria detection and classification using artificial neural networks in conjunction with an electronic nose. Neural networks and expert systems in medicine and health care, Plymouth, UK, 1994, sid 226-234.

Elmroth, I., Valeur, A., Odham, G., Larsson, L (1990) Detection of microbial contamination in fermentation processes: Mass spectrometric determination of Leuconostoc mesenteroides cultures. Biotechnol. Bioeng. 35, 787-792.

Gardner, J.W. och Bartlett, P.N. (1994) A brief history of electronic noses. Sensors and Actuators B 18-19, 211- 220. (1999) Exploiting antibody-based technologies 290-296.

Harris, B. to manage environmental pollution. TIBTECH 17, Holmberg, M., Gustafsson F., Hornsten E. G., Winquist F., Nilsson L.E., Ljung L., Lundstrom I. (1998) Bacteria classification based on feature extraction from sensor data. Biotechnol. Techn. l2(4), 319-324.

Namdev, P.K., Alroy, Y., Singh, V. (1998) Sniffing out trouble: Use of an electronic nose in bioprocesses.

Biotechnol. Prog. 14, 75-78.

Shuler, M.L., Kargi, F. (1992) Bioprocess considerations in using animal cell culture. In: Shuler, M.L., Kargi. F. (utg), Bioprocess engineering: basic concepts. Prentice Hall PTR, New Jersey. 10 15 20 25 30 35 40 45 25 1) Artursson, T., Eklöv, T., Lndström, I., Sjöström, M., Mårtensson, P., Holmberg, M.. Drift correction for gas sensors using multivariate methods. Submitted (1999). 2) Bachinger, Th., Mårtensson, P., Mandenius, C.F.: On- line estimation of biomass and specific growth rate in a recombinant Escherichia coli batch cultivation process using a chemical multisensor array. J. Biotechnol. 60 (l998a) 55-66. 3) Bachinger, Th., Lidén, H., Mårtensson, P., Mandenius, C.F.: On-line estimation of state variables in baker's yeast fermentation using an electronic nose. Sem.

Food Anal. 3 (l998b) 85-91. 4) Bachinger, Th., Riese, U., Eriksson, R.K., Mandenius, C.F.: Monitoring cellular state transitions in a production-scale CHO-cell process using an electronic nose. To appear in J. Biotechnol. (1999). 5) Eklöv, T., Mårtensson, P., Lundström, I.: Selection of variables for interpreting multivariate gas sensor data. Anal. Chim. Acta 381 (1999) 221-232. 6) Freitag, R., Reif, O.-W., Weidmann, R., Kretzmer, G.: Production of recombinant h-ATIII with animal cell cultures using capillary electrophoresis for product monitoring. Cytotechnol. 21 (1996) 205-215. 7) Gill, A., Bracewell, D.G., Maule, C.H., Lowe, P.A., Hoare, M.: Bioprocess monitoring: An optical biosensor for rapid bioproduct analysis. J. Biotechnol. 65 (1998) 69-80. 8) Göpel, W., Schierbaum, K.D.: Definitions and typical examples. In Göpel, W., Jones, T.A., Kleitz, M., Lundström, I. and Seiyama, T. (ed.), Chemical and biochemical sensors, del I, 2, sid 1-28, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany (1992). 9) Haugen, J.E., Tomic, O., Kvaal, K.: A calibration method for handling the temporal drift of solid state gas sensors. Submitted (1999). 10) Holmberg, M., Davide, F.A.M., Natale, C.Di., D'Amico, A., Winquist, F., Lundström, I.: Drift counteraction in odour recognition applications: Lifelong 10 15 20 25 30 35 40 ø u - o nu 518174 26 calibration method. Sensors & Actuators B 42 (No. 3) (1997) 185-194. 11) Jackson, J.E.: Principal components and factor analysis: Part 1. Principal Components. J. Qual. Tech. 13 (1) (1981). 12) Konstantinov, K., Chuppa, S., Sajan, E., Tsai, Y., Yoon, S., Golini. F.: Real-time biomass-concentration monitoring in animal cell cultures. TIBTECH 12 (1994) 324-333. 13) Mandenius, C.F., Eklöv, T., Lundström, I. Sensor fusion with on-line gas emission multisensor arrays and standard process measuring devices in a Baker's yeast manufacturing process. Biotechnol. Bioeng. 55 (1997), 427-438.

An algorithm for least-squares Indust. 14) Marquardt, D.W.: estimation of non-linear parameters. J. Soc.

Appl. Math. 2 (No. 2) (1963) 431-441.

Schulze, B., Freitag, R., Scheper, On-line immunoanalysis 15) Middendorf, C., Th., Howaldt, M., Hoffmann, H.: for bioprocess control. J. Biotechnol. 31 (1993) 395-403. 16) Omstead, D.R., Frame, K.K., Tsao, E.I., Price, G.P., Glass, J.C., Bohn, M.A., McNamee, K.P., Reese, J.A., Munster, M.J., Jain, D.: Monitoring and control of animal cell cultures. IFAC Modelling and Control of Biotechnical Processes, Colorado, USA (1992) pp. 21-27. 17) Rumelhart, D.E., Hinton, G.E., Williams, R.J.: Learning internal representations by error propagation.

In: D.E. Rumelhart and J. McClelland (eds), Parallel data processing. M.I.T. Press: Cambridge, MA (1986). 27 TABELLER Tabell 1. Översikt över utförda infektionsstudier Respons O _ P 2 hes elek- sensor- - Odling Infekterande organism respgns åšïglsk [h efter [h efter infektion] infektion] 2 l rFVIII [O,l cfu/ml] Pseudomonas 21 15 CHO aeruginosa 2 l rFVIII [l cfu/ml] Bacillus 10 1 CHO cereus 2 1 [100 cfu/ml] Pseudomonas _ referens- 14 1 aeruginosa medium 2 1 " [O,5 cfu/ml] Pseudomonas referens- 12 5 aeruginosa medium 2 l [4000 cfu/ml] Bacillus referens- _ 7 O subtilis medium 2 1 [20 cfu/ml] Bacillus referens- 13 6 subtilis medium 2 l [O,l cfu/ml] Micrococcus referens- 39 10 luteus medium 5 28 Tabell 2. Kalibreringsvärden för utvalda kemiska sensorer Sensortyp Odling MF1 MF2 MF3 MF8 I 21,84 18,09 47,8 60,11 II 21,77 17,5 47,6 56,89 III 21,71 16,9 47,4 53,68 IV 21,65 16,31 47,2 50,46 V 21,59 15,71 47 47,25 VI 21,53 15,11 46,8 44,03 Total drift 2 % 16 % 2 % 27 5 Trendlinjeanpassade sensorresponser på bioreaktorbakgrund vid uppstartningsbetingelser. Sensorresponserna är angivna i godtyckliga enheter.

Claims (12)

10 15 20 25 30 35 518174 29 PATENTKRAV

1. Förfarande för tidig detektion av oönskad mikro- biell infektion i en cellodling med hjälp av en elektron- isk näsa med en uppsättning av gassensorer inbegripande metalloxidhalvledarbaserade fälteffekttransistor(MOSFET)- sensorer, halvledande metalloxid(MOS)-sensorer och C02- sensorer och förmåga till mönsterigenkänning, varvid för- farandet inbegriper stegen att ta ut ett prov av avgiven gas innehållande flyktiga föreningar från cellkulturen i en bioreaktor, transport av provet till den elektroniska näsans gassensorer och jämförelse av eventuella specifika gassensorsignalmönster med standardsignalmönster motsvar- ande olika mikroorganismer, varvid provet av avgiven gas tas ut fràn en animaliecellodling.

2. Förfarande enligt kravet 1, varvid närvaron av bakterier, företrädesvis Bacillus cereus och/eller Pseudomonas aeruginosa, detekteras. _

3.Förfarande enligt kravet l eller 2, varvid cell- odlingsmediet är en rekombinant CHO-cellkultur (ovarie- cellkultur fràn kinensisk hamster) för produktion av human blodkoagulationsfaktor VIII.

4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t att den elektroniska därav, näsans gassensoruppsättning inbegriper 10 MOSFET- sensorer, 12 eller 19 MOS~sensorer och en C02-sensor.

5.Förfarande enligt nàgot av de föregående kraven, varvid ett prov av avgiven gas tas ut fràn bioreaktorn under ca 30 sek och ca var 20 min.

6.Förfarande för uppskattning av produktkoncentra- tionen i en cellkultur med hjälp av en elektronisk näsa såsom definieras i kraven l och 4, varvid det inbegriper stegen att ta ut ett prov av avgiven gas innehållande flyktiga föreningar från cellkulturen i en bioreaktor, transport av cellprovet till den elektroniska näsans lO 15 20 25 518 174 30 gassensorer och beräkning av produktkoncentrationen med hjälp av ett artificiellt neuralt nätverk.

7.Förfarande enligt kravet 6, varvid koncentration- _en av proteiner, företrädesvis rekombinant human blodkoa- gulationsfaktor Vïll i en CHO-cellinjekultur,'uppskattas.

8.Förfarande enligt kravet 6 eller 7, varvid cell- kulturen är en animalie- eller mikroorganismcellkultur.

9.Förfarande enligt kravet 1, varvid detektionen av eventuell mikrobiell infektion fastställs ca l-10 h, företrädesvis ca Slh, tidigare för varje mikroorganism jämfört med vid kända tekniker.

10. Förfarande enligt något av de föregående ' kraven, varvid den elektroniska näsan också inbegriper kvartskristallbaserade sensorer och/eller ledande poly- mersensorer och/eller andra halvledarbaserade sensorer.

11. ll. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid förfarandena enligt kraven l och 6 utförs sam- tidigt vid samma cellodlingsprocess.

12. Användning av en elektronisk näsa sàsom'defini-5.' erats i kravet 1 för detektion av mikrobiell infektion, företrädesvis bakteriell infektion, helst infektion av Bacillus cereus och/eller Pseudomonas aeruginosa, i en animaliecellodling¿ f 13, Använding av en elektronisk näsa vid ett förfar- ande enligt kravet 6 för uppskattning av produktkoncen- trationen i en cellodling, företrädesvis koncentrationen av proteiner, helst koncentrationen av rekombinant human blodkoagulationsfaktor VIII i en CHO-celllinjekultur..