WO2011000572A1 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von biologischen langzeiteffekten in zellen - Google Patents

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Jens Poerksen
Wolf-Dieter Juelich
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Patenthandel Portfoliofonds I Gmbh & Co. Kg
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening

Definitions

  • the invention relates to a method for monitoring and regulating cell-based biological systems for the detection of biological effects.
  • Global acidification is therefore a very important factor for determining the metabolic activity of cells, as more or fewer protons are released in cellular energy production processes [I].
  • Information on the kinetics of drug effects on cultured cells can be obtained by continuous pH measurement in the culture medium [2, 3]
  • Oxygen uptake and nutrient consumption are also direct indicators of the metabolic activity of the cells, which are accessible via measurements of dissolved oxygen and glucose concentration.
  • Free radicals naturally arise in the context of cellular respiration or in processes of the immune defense. In order to prevent oxidation in the wrong place, eg lipid peroxidation, the radical concentration has to be limited. Mammals and plants produce antioxidants that act as "radical scavengers". However, the amount of radical scavengers that the body can form is limited, so that tissue and cell damage by radical action occurs again and again. Factors such as older age, Stress or disease increases the formation of free radicals while decreasing the ability of mammalian cells to self-protect.
  • optical sensors are preferably used. Such sensors for determining turbidity, absorption of light by solutes, bioluminescence, and metabolic activity of cells, pH, and other parameters are described in a variety of forms [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]. They work with UV or IR light or VIS.
  • the parameters pH value, oxygen glucose and lactate content and nitrogen monoxide can also be determined with an optical sensor array with a structure size of about 100 ⁇ m on the basis of a UV-curing hydrogel (polyethylene glycol) with the addition of appropriate fluorophores [23, 24, 25, 26 ].
  • an optical sensor array with a structure size of about 100 ⁇ m on the basis of a UV-curing hydrogel (polyethylene glycol) with the addition of appropriate fluorophores [23, 24, 25, 26 ].
  • Another possibility is provided by novel optical sensors based on enzyme-coated photopolymers [27, 28].
  • An example of an optical multi-parameter sensor e.g., pH and 02
  • the paratrend 7 [29] which allows automatic continuous monitoring of cell cultures.
  • the determination of the electrochemical oxygen demand (EOD) is an amperometric method which correlates with the determination of the COD.
  • This amperometric method uses different electrodes: Pb / PbO2 electrode [30, 31, 32, 33], superficially oxidized copper electrodes [34, 35], graphite electrodes with addition of catalysts [36], e.g. a mixture of copper and silver oxide [41].
  • Pb / PbO2 electrode [30, 31, 32, 33]
  • superficially oxidized copper electrodes [34, 35]
  • graphite electrodes with addition of catalysts [36] e.g. a mixture of copper and silver oxide [41].
  • Various methods u. A. Sample-based systems, flow-through systems with rotating electrodes, [30] or the FIA [43] are described.
  • Clark electrodes for determining the oxygen content is well known.
  • Enzymatic sensors for the determination of glucose, glutamine and glutamate are available in many types [26, 43, 44]. They are used in perfusion cell cultures or cell-based systems in conjunction with an FIA system [43, 44, 45] to determine the analytes.
  • Enzymatic immunosensors are also suitable for use in cell-based systems [117].
  • Gas sensors and so-called “electronic noses” [46, 47, 48] from an array of different metal oxide semiconductor sensors and a carbon dioxide sensor [116] are used to observe the growth of cell cultures via their emissions.
  • Sensor arrays for multi-parameter determination are produced inexpensively as microelectrode arrays using conventional printing technology [49, 50]. They are used as a combination of sputtered gold electrodes and printed graphite electrodes with subsequent immobilization of cytochrome c or NiTSPc for the determination of nitrogen oxides and oxygen radicals [51], arrays of gold electrodes [50] for the determination of electrical activity, combined enzymatic glucose and lactate sensors in thin-film technology [52], sensors of alternating layers of cation and metalloporphyrins on graphite substrates for the determination of nitrogen monoxide [53].
  • ISFETs electroselective field-effect transistors
  • sensor arrays can be used for the determination of electrochemical parameters in cell cultures or cell-based systems, even in sensor arrays, with appropriate modification of the membrane on the gate. [54, 55].
  • These sensors were previously brought close to cell culture [55] but are now well-developed to allow cells to grow on them [56, 57].
  • the pH value, the oxygen content, the electrical activity and the impedance can be observed as a criterion for the vitality of the cells in the immediate vicinity of the cells [118]. This is also possible in the flow-through method [57].
  • the structure size of these sensor arrays is partly in the ⁇ m range [119].
  • the perfusion cell culture places increased demands both on the monitoring and on ensuring the quality of the medium: Particular attention must be paid here to the parameters pH, oxygen content and sterility, since the medium in the perfusion cell culture is not hours or a few days but possibly several weeks is in use.
  • An autonomous chamber for perfusion cell cultures may also contain the electronics for temperature regulation and nutrient medium supply [65].
  • the cells can be optimally supplied with oxygen [66].
  • the cells can also be held on a layer system of oxygen-permeable biocompatible membranes [67, 68].
  • a further possibility is to keep the cells in a system of cell chamber with membrane for cell growth and pH measurement on the opposite side of the membrane and to monitor the metabolic activity of the cells via the pH value [69].
  • Dissolved oxygen and indirectly the consumption of oxygen can be measured with a set of different oxygen sensors (optical and enzymatic sensors) in a special chamber system of gas-permeable vessels [22].
  • These cell chambers are designed for stationary and perfusion cell cultures.
  • technical parameters such as the supply of nutrient medium or substrate and flow rate can be directly controlled [72] or the concentration of certain analytes and biological parameters can be measured and the control of the above mentioned. technical parameters as feedback.
  • IR spectroscopy and NIR spectroscopy are useful for observation and quasi-continuous data acquisition in cell-based systems [75,76]. Based on this data, non-linear calibrations can be made for the behavior of row-based systems.
  • mass spectroscopy [120] or NMR [77, 78] for the analysis and control of cell-based systems is also described.
  • Cell-based systems can be used with neurocontrollers [79, 80] (eg: SANE: symbiotic adaptive neuro-evolution algorithm, ANNSA: artificial neural network simulated algorithm), which are supported by adaptive programs or other computer-based systems [81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87] are observed and controlled to operate under optimum operating conditions.
  • SANE symbiotic adaptive neuro-evolution algorithm
  • ANNSA artificial neural network simulated algorithm
  • control over models for prediction (eg: MPC model predictive control) proved successful [88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 84, 97, 98].
  • dynamic optimization is e.g. : possible in fed-batch cell-based systems [99].
  • the object of avoiding the disadvantages of cell-based biological systems for the detection of biological effects mentioned in the prior art has been achieved according to the invention in that the flow of the reaction medium surrounding the cells is controlled by measuring signals. These signals are input at the input and / or output of the system and / or in the cell environment by means of sensors non-invasively continuously and / or quasi-continuously, i. at regular intervals, collected. Thereby, a) the reaction conditions starting from a stationary cell culture up to a pure flow cell culture (perfusion cell culture) can be varied steplessly and
  • the desired test conditions are accurately documented and adjusted by continuous or quasicontinuous measurement of the consumption of nutrients.
  • the invention thus relates to the method defined in claim 1.
  • the invention further relates to the device defined in claim 18 for carrying out the method according to the invention and the functional Nutritiva found by the method according to the invention according to claim 19.
  • the method based on the inventive principle can be used for the control of cell-based systems for the detection of biological effects.
  • the automatable control according to the invention of the flow into the compartment surrounding the cells as a central controlled variable requires signals which are ascertained by non-invasive continuous or quasi-continuous robust measuring methods.
  • sensors can be used, but in some cases a special adaptation of sensors is necessary.
  • Suitable sensors suitable for control are, for example:
  • Potentiometric pH sensors based on quinhydrone e.g. according to [38, 39, 40] mixtures of metals and metal oxides, metal oxides or other suitable pH-dependent redox systems.
  • Oxygen Clark electrodes in various designs.
  • a chemically or physically adhesive binder polymeric adhesives, polymers dissolved in solvents, polycondensates, melts of plastics and / or waxes, pressure-liquefied powders of thermoplastics (PE, PTFE), adhesives
  • PE thermoplastics
  • PTFE thermoplastics
  • the sensor surface of the sensors usable in the invention may be coated with a membrane.
  • These sensors can be manufactured according to the requirements in any shape and consistency. The consistency depends on the binder:
  • Ring electrodes can be made, either by introducing a thin layer of sensor material between two tubes of suitable diameter or by pressing the sensor material between two plastic plates and then drilling.
  • printable binders pastes, insulators and binders
  • printable sensors can be produced in a thick-film process on polymeric or ceramic substrates. The design of sensors with or without reference electrode is possible.
  • the sensors generate signals that are accessible to potentiometric and amperometric measurement methods according to the state of the art.
  • Various active components can be used to measure the various parameters.
  • Electrochemical Oxygen Demand Mixtures of metals and / or metal oxides of various oxidation states, hexacyanoferrates, metal carbides, bronzes or other suitable redox systems. These sensors are u. A. suitable to capture the total energy content of the medium.
  • the biological system is a cell culture with human or animal cells, with the active substances and pollutants, for.
  • active substances and pollutants for example: Food and feed and their ingredients, organic food supplements, feed additives, chemically defined substances, minerals, cosmetics, medical devices and pharmaceuticals can be tested for their impact on cell metabolism.
  • the conditions can continuously from almost stationary reaction conditions (with a strong accumulation of metabolites, which can thus be more easily detected) until to a strong flow (associated with a permanent removal of the metabolites, which are therefore present in lower analytical concentration).
  • the characterization of the metabolic situation is advantageously carried out by determination of the metabolome.
  • the metabolome summarizes all characteristic metabolic movements of a cell or a tissue.
  • the metabolites are represented at a specific time as a "snapshot.”
  • the flow can be adjusted in a measured manner in such a way that it is still possible to detect metabolic products which occur only in very low concentrations, using very sensitive measurement methods, which are typically used in metabolome analysis, preferably LC-MS-NMR composite technologies, but the metabolic situation in vivo is approximated as far as possible with a preponderance of respiration.
  • Controllable changes in the biological system are achieved by exposing the cells to the action of a physical, biological or chemical stimulus.
  • a physical stimulus can be generated by exposure to temperature or irradiation with particles or electromagnetic waves of appropriate energy.
  • Biological stimuli can be achieved by infecting the cells in the long-term culture with viruses. This makes it possible to investigate the influence of different drug candidates directly on the virus-infected cell.
  • a biological stimulus can also be produced by virus components and / or by bacterial toxins and / or by mycotoxins.
  • a chemical stimulus is produced by toxic, biologically active, pharmaceutically or cosmetically active substances.
  • a particular advantage of the long-term culture according to the invention is that the action of the stimuli and corresponding candidates for a prophylactic or therapeutic effect can take place chronologically consecutively or simultaneously.
  • the metabolic situation depends on many factors, therefore the optimal ratio can not be determined in general. It is therefore inventive to carry out the method in at least two steps, wherein in the first step, a flow is set, on the one hand optimal measurement of the metabolic parameter is possible, and on the other hand, the metabolic situation as far as possible approximates the in vivo conditions is carried out ("optimization of the flow") and in a second step the "generation of promoting or inhibiting reaction conditions".
  • the experimental conditions for optimal and / or user-specified setting including the setting promoting or inhibiting reaction conditions and including the concentration of the active ingredients are documented and / or stored on suitable storage media.
  • the conditions may be constant by continuous or quasi-continuous measurement with sensors and constant comparison with the documented and / or stored values optionally under the aspect of constant flow and / or metabolic situation and / or constant promoting / inhibiting conditions and / or constant drug concentration being held.
  • the control of the system according to the invention can be carried out manually by comparison with documented and / or desired values, partially automated via individual controllers or a controller system or other suitable feedback mechanisms or fully automated via a suitable, eg processor-based and possibly programmed or programmable or even adaptive system controller.
  • the test substances can be food and feed and their ingredients, biological food supplements, feed additives, chemically defined substances, minerals, cosmetics, medical products and pharmaceuticals .
  • the test can demonstrate both a promoting or inhibiting effect and also prove that damage inflicted on the cells by pollutants, for example by toxic substances, radiation or free radicals, are avoided and / or repaired faster under the influence of the test substances.
  • the substances to be tested can be supplied to the cells at a time dependent on the biological cell reaction. This makes it possible to test prophylactic effects.
  • the complex control according to the invention makes it possible to guide the test procedure so that the cell reaction proceeds as closely as possible to the natural conditions. Only under these conditions is it possible to test, according to natural conditions, the means and preparations which can influence the cell metabolism.
  • the method according to the invention therefore does not permit statements on the effectiveness of foodstuffs and animal feeds and their ingredients, biological dietary supplements, feed additives, chemically defined substances, minerals, cosmetics, medical products and pharmaceuticals on the one hand and of substances to be tested for toxicological risks on the other hand can be obtained with appropriate accuracy and safety.
  • Biological stress factors such as e.g. : Viruses and toxins
  • a coupling of drug candidates to be investigated and stress factors allows the detection and documentation of healing and prophylactic effects and the measurement dose-dependent effects, the gain in knowledge for optimal dosage.
  • a substance z. B. at intervals and / or periods, which correspond to real conditions.
  • a partial guidance of the reaction medium takes place in a circle.
  • This version reflects the conditions in the organism, as here also supplied via a circulation of medium nutrients and metabolic products are discharged.
  • the degree of nutrient supply and the removal of metabolism products can be precisely adjusted by dosing and partial circulation.
  • glucose in the phosphogluconate pathway part of the pentose phosphate cycle, is oxidatively degraded directly to a pentose by decarboxylation, generating two molecules of NADPH, H + .
  • NADPH NADPH
  • redox reactions take place only intermediately.
  • glucose can only be degraded to lactate - a process that predominates in stationary cell culture.
  • 2 moles of lactate are formed from 1 mole of glucose. The quotient of glucose used and lactate formed is therefore 2 for pure fermentation.
  • the determination of intracellular metabolites requires the lysis of the cells. The determinations can therefore only be carried out at a few selected times. If a quantitative data collection of metabolite concentrations and fluxes over a long period of time is to be observed, several experimental approaches must be carried out consecutively.
  • the perfusion cell culture ensures comparable conditions over a longer period of time. In a combination of LC-MS and perfusion cell culture, quasi-continuous non-invasive measurement of glucose consumption and lactate formation can ensure that the cells of the controls without active ingredient influence are in a comparable situation to the previous snapshots of the metabolome. Therefore, the determination of confidence limits for glucose consumption in a non-drug-influenced perfusion cell culture, which is described in this work, is of particular importance.
  • the perfusion cell culture allows the non-invasive determination of metabolic parameters that are released into the nutrient medium under the influence of active ingredients.
  • the effect of these active substances is recognizable at different times after administration of the active substance, depending on the type of active ingredients and the active ingredient concentration. eg only after drug accumulation. This requires a quasi-continuous determination of selected metabolic parameters over several days or weeks.
  • sirtuin activity for example, in various model organisms lead to the activation of central metabolism enzymes. This activation enables the cell to use other sources of energy in the absence of nutrients and to use them efficiently.
  • Sirt3 activates special forms of these enzymes, which simultaneously form NADPH, which is needed for the regeneration of cellular anti-stress systems (Schlicker C, Gertz M, Papatheodorou P, Kachholz B, Becker CF, Steegborn C: Substrates and Regulation mechanisms for the human mitochondrial sirtuins Sirt3 and Sirt5 J Mol Biol. 2008 Oct 10; 382 (3): 790-801).
  • NADPH therefore also allows a statement as to whether and how the metabolic path chosen by the cell for energy production contributes to stress resistance.
  • a device suitable for the implementation of the inventive principle comprising a system of a plurality of interconnected and matched components and / or components, arranged according to FIG. 1, consisting of:
  • reaction chamber or cell chamber or bioreactor or cell reactor which / is preferably tempered
  • a control and regulating technique that regulates the supply of reagents, active ingredients and substrates and the flow rate in coordinated proportions, wherein the control using the components f and / or g is optionally manual and / or automated and / or programmable j ) of a special possibly teachable software for controlling and optimizing the system is part of the invention.
  • the flow cells integrated in the device according to the invention are advantageously used in various designs suitable for receiving the sensors.
  • Rod-like sensors are placed in corresponding flow cells so that the sensor surfaces come into contact with the liquid flow, but minimally obstruct or fluidize the liquid flow.
  • Ring electrodes themselves serve as flow cells and are connected by suitable connections to the pipe system.
  • Another type of ring electrodes is realized by clamping a sensor membrane between 2 drilled plates and the subsequent or preparatory puncture of the membrane.
  • Flow cells for receiving printed sensors are designed so that the liquid flow is guided parallel to the sensor surface or at an angle to the sensor surface, and suitably positioned inflows and outflows produce a continuous flow of liquid.
  • flow cells consist of several parts that are assembled in such a way that the sensor surface is exposed to the liquid flow and seals prevent leakage. Contacts for connecting the sensor to the measuring system are also to be provided. hen. Depending on the requirements, the sensors can be positioned directly in the flow, in a bypass or behind a sampling point.
  • Heat shock response is therefore an evolutionarily very old and highly conserved process that occurs in all living things.
  • the expression of heat shock protein and the activation of heat shock factor are part of the resistance development of cells against the influence of external stress factors, which have far more importance beyond heat.
  • phase II serves to determine the effect of the active ingredient on cell metabolism at body temperature.
  • Phase III the heat stress is generated by increasing the temperature to 39.3-41.3 0 C.
  • R 2 C 12 H 14 NO 3 as a pure substance or contained in biomasses of microalgae or in the methanol / water extract from the biomass mentioned or in a purified after purification of the methanol / water extract on cellulose fraction and / or c) a triple-smectite mineral compound and or d) fungal biomass or fungal extracts with activity against fish pathogenic microorganisms and / or immunostimulating action in a particular manner preferred by Canoderma pfeifferi and / or Saccharomyces spec and / or Kluyveromyces spec and / or
  • biomass of Artemisia annua after separation of the peroxides are provided in a particularly advantageous manner.
  • phase feeding concepts can be realized for example in the fish farming, in which the composition is adapted to the individual phases of the fish rearing.
  • the metabolic stimulating effect which was detected with the cell biological system described above, by simultaneous supply of lipids, proteins, carbohydrates, vitamins and minerals from biomasses of aquatic origin, which improves the supply of omega-3 and omega-6 -Fatty acids with a stimulation of metabolism combine to strengthen.
  • the stimulation of the metabolism is a new characteristic feature for the selection of the microorganisms which are particularly suitable for use as a feed component.
  • biomasses of aquatic organisms contain valuable ingredients, in particular omega-3 and omega-6 fatty acids.
  • the metabolism of eukaryotic cells was also selected by biomass aquatic organisms is stimulated. It is therefore inventive, as admixture with the fish feed biomasses selected from aquatic organisms, the polyunsaturated C16-C22 fatty acids, eg linoleic acid (C18: 2), linolenic acid (C18: 3), arachidonic acid (C20: 4), eicosapentaenoic acid (EPA hold 6) ent ⁇ :, C20: 5) and docosahexaenoic acid (DHA, C22.
  • the polyunsaturated C16-C22 fatty acids eg linoleic acid (C18: 2), linolenic acid (C18: 3), arachidonic acid (C20: 4), eicosapentaenoic acid (EPA hold 6) ent ⁇ :, C20: 5)
  • microalgae of the genus Synechocystis containing 18: 0 and 18: 1 fatty acids and high concentrations of 16: 1 fatty acids, and the genera Lyngbya, Oscillatoria (Limnothrix and Planktothrix) are rich in 18: 0 to 18: 3 Fatty acids, in particular ⁇ -linolenic acid are and / or select mixtures of these microalgae.
  • cyclic peptides according to formula 1 show an antibacterial activity against fish-pathogenic microbes without adversely affecting the performance of biological filters in aquatic farms. Substance protection is requested for these cyclic peptides.
  • cyclic peptides are produced by microalgae strains selected from the genera Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria ⁇ Limnothrix and Planktothrix) and Nostoc. It is therefore inventive to achieve the antibacterial effect by
  • the embodiment mentioned under d) is considered to be particularly advantageous.
  • the biomass of microalgae strains selected from the genera Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix and Planktothrix) and Nostoc can be obtained in a commercial microalgae culture.
  • Ingredients of the tree fungus Ganoderma pfeifferi surprisingly show a strong activity against fish pathogenic bacteria.
  • the combination of activity against fish pathogens and metabolic stimulation, detected with a measuring arrangement according to claim 1 is a good condition for use in nutritive fish feed preparations.
  • the strong activity against fish pathogenic bacteria supplements the antibacterial effect of the microalgae.
  • Biomasses of Ganoderma species are known to act as radical scavengers. Free radical damage also occurs in fish. Therefore, the admixture of goa noderma pfeifferi can also be used to protect against the damaging effect of free radicals.
  • Ganoderma pfeifferi in the form of a micro- and nanoparticle suspension or in the form of extracts causes a stimulation of cell metabolism.
  • the combination of metabolic stimulation in eukaryotes and growth inhibition in prokaryotes is therefore a hallmark feature of G. pfeifferi and of particular importance to the present invention.
  • Examples I to XII are intended to underpin the importance of some important metrics. Examples A to E demonstrate the broad applicability of the system
  • Fig. 1 shows the basic structure of the experimental arrangement
  • the accumulation and depletion of active ingredients in the living organism can be adjusted by partial circulation of the drug-loaded medium.
  • the drug concentration and its course can be set exactly.
  • the active ingredient is present in a dilution of 2% sandalwood oil in culture medium in compartment 1 and is added to the system for a period of 5 h to 10 h at a flow rate of 3 ⁇ l / h.
  • the system with its essential components is shown in FIG.
  • the culture medium should flow through the cell chamber Z at a rate with a flow rate of 30 ⁇ l / h, which has proven to be optimal in preliminary experiments and should be kept.
  • Variant 1 describes a linear guidance of the medium without circulation component: From 0 h to 5 h, pure culture medium is added to the system at a flow rate of 30 ⁇ l / h and removed from the drain.
  • the active substance content is 0%.
  • drug-loaded medium is added to the system via feed 1 at a flow rate of 0.3 ⁇ l / h.
  • the flow rate of the basal medium is reduced to 27 ⁇ l / h. This results in a drug concentration of 0.02% in the medium flowing through the cell chamber.
  • Variant 2 describes a proportional (50%) guidance of the medium in the circulation:
  • the culture medium is added to the system from 5 h to 10 h at a flow rate of 15 ⁇ l / h.
  • 15 ⁇ l / h are circulated. This results in a flow rate of 15 ⁇ l / h in the drain and 30 ⁇ l / h in the cell chamber.
  • the drug concentration is again at 0%.
  • the feed is adjusted with drug-loaded medium as in Variant 1 and the flow rate in the feed to 15 ul / h set back. This results in a slow depletion of the drug concentration.
  • the course of the active substance concentration is shown in FIG. 13 as a solid line
  • Variant 3 Describes the guidance of the media in the system according to the invention with maximum circulation proportion: Up to 5 h, the entire medium is circulated at a flow rate of 30 ⁇ l / h. The drug concentration is also 0% here. From 5 h to 10 h in turn drug-loaded medium is added at a flow rate of 0.6 .mu.l / h via the feed 1 in the system. For this purpose, medium must be removed via the drain at the same flow rate, since the volume must remain constant. This results in an enrichment of the drug concentration to 0.024% to 10 h. After 10 hours the Flow rates are reset to the initial values, so that the drug concentration remains constant to the proportion absorbed by the cells. The course of the active ingredient concentration is shown in FIG. 13 as a broken line.
  • the metabolism of the cells leads to acidification.
  • the pH can be kept stable by a measured value-controlled gassing of the medium.
  • Graphite-quinhydrone composite electrodes for measuring the pH according to [40] can be produced in any shape and consistency. Therefore, they can be used as ring electrodes particularly well in the flow of the medium or bring in a bypass on the smallest volume. Further advantages are the outstanding long-term stability and the freedom from calibration of these electrodes. This allows the pH to be reliably and continuously recorded at almost every point in the system and used for control and documentation purposes.
  • FIG. 14 shows different courses of the pH in the culture medium during some experiments with the perfusion cell culture.
  • the dotted line Shows the course of the pH without regulation by gassing the medium.
  • the pH increases irreversibly after some time, as the medium becomes alkalized without fumigation.
  • the solid line shows a continuously regulated pH curve. Fluctuations in the pH were counteracted by an immediate adjustment of fumigation.
  • the pH can thus be well regulated or adjusted to a desired value by changing the fumigation regime or by acidification or alkalization.
  • a sensor-based titration according to the invention allows improved adjustment and regulation of the fumigation (eg: (particularly advantageous feedback to the flow, CO 2 content).
  • Suitable measuring sites are the storage vessel with medium and measuring cells directly in front of and behind the cell chambers.
  • the oxygen content of the medium should be constant and sufficient to supply the cells.
  • the oxygen content, similar to the pH, is adjusted by means of targeted gassing.
  • Suitable sensors can be used as a Clark electrode to determine the oxygen content or the oxygen consumption (via differential measurements) in order to record this important metabolic parameter.
  • Suitable enzymatic sensors [59, 61] which can be printed on supports allow the continuous determination of the important metabolic parameters of glucose consumption and lactate formation by measurements in front of and behind the cell chamber. These sensors can be accommodated in small volume flow cells at suitable measuring points, eg directly in front of and behind the cell chamber, in the system. If the cells are not exposed to stress or drugs, the quotient of lactate production and glucose consumption should be as small as possible. As desired value, quotients between 0.5 and 1.0 have been found in experiments carried out. This quotient can be set back based on the measured values for glucose and lactate concentration by suitable adjustment of the oxygen content and the proportions of continuous and recirculated medium. This is u. A. a deposit of various tax regimes in a software appropriate.
  • the biomass in the cell chamber can be determined by capacitive, non-invasive measurements. Similar to a capacitor, two or more graphite or metal electrodes are arranged around the cell chamber. The capacity of this arrangement is amenable to measurement by appropriate physical methods and depends on the concentration of biomass in the cell chambers. Thus, the cell count can be determined at any time during the ongoing experiment without further intervention and used as a control or evaluation parameter.
  • Electrochemical oxygen demand ESB electrochemical oxygen demand
  • the ESB allows conclusions to be drawn on the nutrient content of the medium and on the nutrient consumption of the cells (by comparison measurements). Since the determination of the ESB takes place in a NaOH-alkaline medium and how the flow injection analysis requires only small sample volumes, the measuring arrangement can be optimally arranged in a bypass to the system. The parameter ESB can be determined quasi-continuously with this arrangement.
  • the glucose concentration in the medium is defined by the basic medium and measurable.
  • the glucose content may be increased or decreased to a desired level by either adding glucose to the system (increasing the glucose concentration) or circulating a portion of the medium (depleting the glucose concentration due to the glucose consumption of the cells).
  • Heat shock response is therefore an evolutionarily very old and highly conserved process that occurs in all living things.
  • the expression of heat shock protein and the activation of heat shock factor are part of the resistance development of cells against the influence of external stress factors, which have far more importance beyond heat.
  • the above cell biological system is suitable for demonstrating efficacy in experimental heat shock.
  • a tempering block ensures a constant and above the cell chambers same temperature.
  • the heat stress is generated by raising the temperature to about 42 0 C.
  • the exposure time and the temperature can be variably regulated.
  • a good example of a measured value of the setting parameter based regulation temperature via the metabolic parameters glucose consumption delivers Figure 2: The temperature was here Arnold Böcklin at 42 0 C is increased (from 5 h). As soon as the glucose consumption of the cells due to the heat stress subsided, the temperature was raised 37 0 C back regulated (from 7.5 h). Based on the glucose consumption curve of the cells, a recovery of the cells after temperature re-regulation can be seen: the glucose consumption rose again to the level before the temperature increase.
  • Free radicals naturally arise in the context of cellular respiration or in processes of the immune defense. In principle, free radicals can react with all the molecules necessary for the living cell. As a result, metabolic and structural modifications may occur which may lead to cell death (from: Marquardt, Hans and Siegfried Shufer (ed.): Lehrbuch der Toxikologie 2., Auflage Stuttgart,ticianliche Verlagsgesellschaft, 2004). To avoid unpleasant reactions, e.g. To prevent lipid peroxidation, the radical concentration must be limited. Eucaryotes form antioxidants that act as "radical scavengers". However, the amount of radical scavengers that the body can form is limited, so that tissue and cell damage by radical action occurs again and again. Factors such as age, stress or disease increase the formation of free radicals, while at the same time decreasing the ability of mammalian cells, in particular, to form protective factors themselves.
  • radical production by means of enzymes such as xanthine oxidase is possible without any problems.
  • concentration of free radicals can be detected electrochemically as a sum parameter and used for the measurement-assisted adjustment of radical concentration.
  • Topic Maps (ISO / IEC 13250 2003) provides a standardized, graph-based data model (ISO / IEC 13250-2 2006) with a standardized XML syntax (ISO / IEC 13250-3 2007) that maps arbitrary relational structures combined with a high degree of self-descriptive semantics.
  • test system according to the invention can be demonstrated particularly clearly in the case of complex requirements such as the production of a fish food suitable for aquafarming.
  • the possible uses are therefore exemplified by the example of such a preparation. Of course, they are transferable to other complex developments.
  • Macroalgae and microalgae contain agents that can inhibit fish pathogenic bacteria.
  • the antimicrobially active ingredients of the genus Laurencia are listed. While macroalgae can be used directly as fish feed, microalgae are only accepted as feed by fish to a limited extent without proper processing.
  • microalgae unsaturated fatty acids can be supplied, which are also contained in fish oils.
  • Microalgae are predominantly used in aquaculture for the nutrition of fish larvae and as living food for fish (organisms like brine, crayfish, ruddy crabs).
  • Astaxanthin is a natural antioxidant and gives the fish it feeds a desirable intense red color.
  • the examinations are expediently processed in a coordinated graduated plan.
  • biomasses of aquatic organisms contain valuable ingredients, in particular omega-3 and omega-6 fatty acids. It is therefore appropriate, as admixture with the fish feed, to use biomass selected from aquatic organisms containing polyunsaturated C16-C22 fatty acids, e.g. Linoleic acid (C18: 3), arachidonic acid (C20: 4), eicosapentaenoic acid (EPA, C20: 5) and docosahexaenoic acid (DHA, C22: 6).
  • polyunsaturated C16-C22 fatty acids e.g. Linoleic acid (C18: 3), arachidonic acid (C20: 4), eicosapentaenoic acid (EPA, C20: 5) and docosahexaenoic acid (DHA, C22: 6).
  • microalgae of the genus Synechocystis containing 18: 0 and 18: 1 fatty acids and high concentrations of 16: 1 fatty acids, and the genera Lyngbya, Anabaena, Oscillatoria (Limnothrix and Planktothrix), rich in 18: 0 to 18: 3 fatty acids, especially ⁇ -linolenic acid are and / or select mixtures of these microalgae.
  • the stimulation of the metabolism detected by a test arrangement according to claim 1, is a new one characterizing feature for the selection of microorganisms that are particularly suitable for use as a feed component.
  • metabolically activating biomasses of aquatic origin for example green algae (Chlorophyta)
  • green algae Chorophyta
  • feed components see Example B: aquatic biomasses
  • feed components for aquaculture are natural biomasses which stimulate the metabolism and contain high concentrations of unsaturated fatty acids.
  • Metabolism-activating biomasses preferably selected from the genera Isochrysis, Clamydomonas, Haematococcus or Tetraselmis or calcareous algae (Haptophyta) are therefore tested in test stage 3 as individual substances or in combinations for activity against fish-pathogenic microorganisms (see Example B: aquatic biomasses).
  • microalgae strains selected from the genera Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix and Planktothrix) and Nostoc previously unknown cyclic peptides according to formula image 1 are formed.
  • cyclic peptides according to formula 1 show an antibacterial activity against fish-pathogenic microbes without adversely affecting the performance of biological filters in aquatic farms. Substance protection is requested for these cyclic peptides.
  • the method according to the invention is suitable for the search for stress-reducing components.
  • Biomass from Ganoderma pfeifferi has been found to be particularly advantageous in the investigation with this test method since it combines stress reduction with metabolic stimulation and antibacterial activity against fish-pathogenic microorganisms (see Example C: Ganoderma).
  • the biomass of the microalgae strains can be obtained in a commercial microalgae culture. In such a culture, the valuable substances accumulate as an aqueous to pulpy biomass.
  • the fungal biomasses used in the example "Ganoderma” also accumulate when culturing the mycelium as aqueous to pulpy flowing suspensions.
  • test method according to claim 1 is also suitable for investigating the finished formulations.
  • phase feeding concepts can be realized, for example, in fish farming, in which the composition is adapted to the individual phases of fish rearing.
  • the preparation of the invention can be mixed with conventional fish feed ingredients. Particular preference is given to cereals and / or soya and / or pea protein and / or alfalfa and / or yeasts, and / or calcium caseinate and / or fish meal and / or molluscs and crustaceans. While the plants used mainly contain lipids with relatively short-chain fatty acids (C12-C18) and a small number of double bonds (up to C18: 3), a balanced lipid spectrum is achieved in the combination.
  • a nutritive effect is associated with a prophylaxis or therapy of fish diseases.
  • biomasses of aquatic organisms contain valuable ingredients, in particular omega-3 and omega-6 fatty acids.
  • metabolism of eukaryotic cells is also stimulated by biomass of selected aquatic organisms.
  • Biomass selected from aquatic organisms containing polyunsaturated C16-C22 fatty acids, eg linoleic acid (C18: 2), linolenic acid (C18: 3), arachidonic acid (C20: 4), eicosapentaenoic acid (EPA, C20: 5) and docosaphaenoic acid (DHA, C22: 6) and at the same time have a stimulating effect on metabolism, therefore promise special advantages.
  • microalgae of the genus Synechocystis which contain 18: 0 and 18: 1 fatty acids and high concentrations of 16: 1 fatty acids, and of the genera Lyngbya, Anabaena, Oscil- latoria (limnothrix and planktothrix) rich in 18: 0 to 18: 3 fatty acids, especially ⁇ -linolenic acid, and / or mixtures of these microalgae.
  • Figures 4 and 5 show the glucose consumption% as a function of time after the beginning of the drug admixing.
  • metabolism-stimulating and / or stress-reducing microalgae having a high concentration of unsaturated fatty acids which additionally contain the cyclic peptides according to the invention and / or have activity against fish-pathogenic microbes while at the same time not damaging the biological filters.
  • cyclic peptides according to formula 1 show an antibacterial activity against fish-pathogenic microbes without adversely affecting the performance of biological filters in aquatic farms. Substance protection is requested for these cyclic peptides.
  • the platelets inoculated with the microalgae extracts (2 mg / plate) were applied to the surface of the agar, preincubated at 8 ° C for 4 hours and then incubated at 26 ° C for 24 hours.
  • 50 ⁇ g / plate of ampicillin, nystatin, OTC and gentamycin were used, which caused a significant inhibition of halo formation around the platelets.
  • the biomass When using biomasses from Ganoderma pfeifferi as nutritive feeding component, the biomass can be used only in relatively low concentrations due to the currently high price.
  • individual ingredients of the Ganoderma biomass act in only low concentrations, but over a long time.
  • an experimental model had to be created that ensured a stable metabolic situation over a long exposure time and thus enabled the examination of metabolic stimulating effects. This has been achieved with the test arrangement according to claim 1.
  • FIG. 6 shows the stimulation of the metabolism by G. pfeifferi.
  • the tempering block ensures a constant and above the cell chambers same temperature.
  • Phase II serves to determine the effect of the active ingredient on cell metabolism at body temperature.
  • phase III the heat stress was generated by increasing the temperature to 39.3-41.3 0 C.
  • microalgae strains selected from the genera Lyngbya, Anaabena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix and Planktothrix) and Nostoc can be obtained in a commercial microalgae culture
  • the fungal biomasses used in the example "Ganoderma” also accumulate when culturing the mycelium as aqueous to pulpy flowing suspensions, which can optionally be concentrated by separators.
  • mineral compounds are useful. It is inventive to select mineral composites that have caused a metabolic stimulation during the test in a test method according to claim 1.
  • a doping with thiocyanate surprisingly increases the cell metabolism, the optimum being achieved with 10 ⁇ mol / l.
  • FIG. 7 shows the glucose consumption in% as a function of the thiocyanate concentration.
  • a triple-smectite mineral compound has been formed by grinding the sedimentary rocks of limestone and bentonite or thiocyanate-doped mixed-layer clay minerals according to PCT / EP 2008 / by structurally and substance-sparing grinding of fossil diatom sludge. 055013 is produced.
  • the conditions must be chosen so that the montmorillonites receive their adsorption power as completely as possible or at least partially.
  • Decisive for the use according to the invention is a proportion of montmorillonites with a partially amorphous structure of 10 to 20%.
  • a mineral compound having an amorphous content of SiO 2 of 60% and a montmorillonite content of about 16% has proved to be particularly advantageous.
  • the structurally and substance-sparing painting results in a mineral compound with a particularly strong bond and produces aggregates with a particularly high adsorption power and high water absorption capacity.
  • a suspension of the biomass of individual microalgae or of microalgae combinations or the suspension of the fungal biomass is mixed with the triple-smectite mineral compound prepared as described above until a homogeneous, still moist mass (moisture content ⁇ 15%) is formed.
  • the mixing system achieves protein stabilization.
  • the preparation of a storage-stable intermediate at temperatures ⁇ 80 0 C can be done to obtain valuable ingredients of the biomass.
  • Silica in finely divided bioactive form. This results in a large adsorption area.
  • the preparation according to the invention produces a storable formulation under particularly mild conditions from microalgae and / or fungal biomass obtained as a dilute suspension.
  • the mixture of triple-smectite mineral compound and Ganoderma pfeifferi can be mixed with a suspension of the biomass of individual microalgae or microalgae combinations and further processed.
  • the algal biomass is first homogenized with the biomass of Ganoderma pfeifferi and then mixed with the triple-smectite mineral compound.
  • the silica contained in these preparations in finely divided form promotes the uptake of bioactive silicon.
  • the biomass from drug-producing plants contains carbohydrates, lipids and whiteheads, which can be used as feed after separation of the ingredients used as pharmaceuticals. By the use of the residues accumulating in large quantities, a special economic advantage is achieved.
  • FIG. 8 shows the glucose consumption in% as a function of the time after the active ingredient admixing.
  • the spice and bitter substances contained in Artemisia annua have an appetizing and digestive effect in low concentrations, and in higher amounts they become not tolerated by the fish.
  • the biomass derived from pharmaceutical production residues must therefore be combined with other biomass.
  • the test method according to claim 1 supports the selection process.
  • Biomass are selected which stimulate the metabolism in an assay according to claim 1. This can be aquatic biomasses (see example aquatic biomasses), fungal biomasses (see example Ganoderma) and / or mineral natural substances (see example mineral natural substances).
  • biomasses which combine metabolic stimulation and antimicrobial action against fish pathogenic microbes (see examples of aquatic biomasses and Ganoderma).
  • test method according to claim 1 can therefore be used to select from representatives of a genus - here in the example of the genus Ganoderma - the most suitable species.
  • FIG. 9 shows the glucose consumption in% as a function of the time after the active ingredient admixing.
  • FIG. 10 shows the glucose consumption in% as a function of the time after the active ingredient admixing.
  • FIG. 11 shows the glucose consumption in% as a function of the time after the active ingredient admixture.
  • a likewise completely surprising result of the test with the method according to claim 1 is that a stress-reducing effect is achieved with the combination of A. annua and G. pfeifferi.
  • This stress-reducing effect was demonstrated on a heat stress model.
  • Handling stress - such as heat - is a major challenge for all living beings.
  • the heat shock response is therefore an evolutionarily very old and highly conserved process that occurs in all living things.
  • the expression of heat shock protein and the activation of heat shock factor are part of the resistance development of cells against the influence of external stress factors, which have far more importance beyond heat.
  • the tempering block ensures a constant and above the cell chambers same temperature.
  • Phase II serves to determine the effect of the active ingredient on cell metabolism at body temperature.
  • phase III the heat stress was generated by increasing the temperature to 39.3-41.3 0 C.
  • Enzyme sensor-FIA system for on-line monitoring of glucose, lactate and glutamine in animal cell cultures.
  • VOCs volatile organic compounds
  • MAAs Microelectrodes arrays
  • ANNSA a hybrid artificial neural network / simulated annealing algorithm for optimal control problems. Sarkar, Debasi; Modak, Jayant M. Chemical Engineering Science (2003), 58 (14), 3131-3142.
  • a microbial sensor for detecting inhibitors of nitrification in wastewater [109] A microbial sensor for detecting inhibitors of nitrification in wastewater.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung und Regelung zellbasierter biologischer Systeme zum Nachweis von biologischen Langzeiteffekten. Untersuchen lassen sich damit unter anderem Stress- und Alterungsfaktoren sowie die Wirksamkeit von prophylaktischen Behandlungen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von
biologischen Langzeiteffekten in Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung und Regelung zeilbasierter biologischer Systeme zum Nachweis von biologischen Effekten.
Stand der Technik
In einer lebenden Zelle finden tausende biologische Reaktionen parallel statt, die zu einem komplexen Netzwerk zusammengefügt sind. Dieser komplexe Stoffwechsel führt in Zellkulturen und Zellbasierten Systemen zu einem dynamischen und nicht linearen Verhalten. Da die meisten Reaktionen Energie verbrauchen, sind Energie erzeugende (kata- bolische) Prozesse am stärksten gekoppelt. Katabolische Prozesse beginnen mit der Aufnahme von Nährstoffen und Sauerstoff und führen über den Abbau zu Zwischenprodukten zur Produktion von Energie und zur Ausscheidung von sauren Abfallprodukten.
Die globale Ansäuerung ist daher eine sehr wichtige Größe zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von Zellen, da bei zellulären Energiegewinnungsprozessen mehr oder weniger viele Protonen freigesetzt werden [I]. Informationen über die Kinetik von Wirkstoffeinflüssen auf kultivierte Zellen lassen sich durch kontinuierliche pH-Messung im Kulturmedium gewinnen [2, 3]
Die Sauerstoffaufnahme und der Nährstoffverbrauch (insbesondere Glucoseverbrauch) sind ebenfalls direkte Indikatoren für die Stoffwechselaktivität der Zellen, die über Messungen des gelösten Sauerstoffes und der Glucosekonzentration zugänglich sind.
Freie Radikale entstehen natürlicherweise im Rahmen der Zellatmung oder bei Prozessen der Immunabwehr. Um eine Oxydation an der falschen Stelle, z.B. eine Lipidperoxidation, zu verhindern, muss die Radikalkonzentration begrenzt werden. Die Säugetiere und Pflanzen bilden Antioxidantien, die als "Radikalenfänger" wirken. Die Menge der Radikalenfänger, die der Körper bilden kann, ist jedoch begrenzt, so dass immer wieder Gewebe- und Zellschäden durch Radikaleinwirkung auftreten. Faktoren wie höheres Alter, Stress oder Krankheiten erhöhen die Bildung von freien Radikalen, während gleichzeitig die Fähigkeit der Säugerzellen abnimmt, selbst Schutzfaktoren zu bilden.
Je höher die Radikalkonzentration im Verhältnis zur Konzentration der Radikalenfänger ist, desto mehr Schäden pro Zeiteinheit treten auf. Diese Schäden summieren sich im Laufe der Jahre und führen dann, Schritt für Schritt, zu immer stärker werdenden Leistungseinbußen und Funktionsverlusten, die unsere Alterung kennzeichnen. Ein hohes Radikalenaufkommen, das vom Organismus über längere Zeiträume nicht mehr kompensiert werden kann, kann zum Ausgangspunkt chronischer Erkrankungen werden. Dies gilt vor allem für Zivilisationskrankheiten wie die koronare Herzkrankheit. Durch freie Radikale oxidativ modifiziertes LDL-Cholesterin besitzt atherogene und thrombogene Eigenschaften, die für die Entstehung arteriosklerotischer Gefäßwandläsionen und Arterienverschlüssen von maßgeblicher Bedeutung sind. Da Freie Radikale für viele Stoffwechselvorgänge von grundlegender Bedeutung sind, wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem Untersuchungen zur Metabolisierung von Arzneistoffen in Anwesenheit freier Radikale, die mittels einer Plasmaquelle oder durch Zugabe Radikal bildender Enzyme erzeugt werden, durchgeführt werden können [62]. Dagegen stützt sich die Bewertung der antioxidativen Wirksamkeit von Nahrungsergänzungsmitteln und von Zusätzen zu Kosmetika bisher vorwiegend auf in-vitro-Versuche. Ein Verfahren, die prophylaktische Wirksamkeit solcher Zusatzstoffe bei der Vermeidung radikalbedingter Zellschädigungen zu untersuchen, ist bisher nicht bekannt, obwohl derartige Mittel vorwiegend prophylaktisch eingesetzt werden.
Sensoren zur Überwachung von Zellbasierten Systemen und Zellkulturen
Zur Überwachung von Zellbasierten Systemen und Zellkulturen werden bevorzugt optische Sensoren eingesetzt. Solche Sensoren zur Bestimmung der Trübung, der Absorption von Licht durch gelöste Stoffe, der Biolumineszenz und der Stoffwechselaktivität vonZel- len, des pH Wertes und anderer Parameter werden in vielfältiger Form beschrieben [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]. Sie arbeiten mit UV- oder IR-Licht oder VIS.
Die Parameter pH-Wert, Sauerstoff- Glucose und Lactatgehalt sowie Stickstoffmonoxid können auch mit einem optischen Sensorarray mit einer Strukturgröße von etwa lOOμm auf Basis eines UV-härtenden Hydrogels (Polyethylenglycol) mit dem Zusatz entsprechender Fluorophore bestimmt werden [23, 24, 25, 26]. Eine weitere Möglichkeit bieten neuartige optischer Sensoren auf Grundlage von Enzym beschichteten Photopolymeren [27, 28].
Ein Beispiel für einen optischen Mehrparamtersensor (z.B. pH und 02) ist der Paratrend 7 [29], der eine automatische kontinuierliche Überwachung von Zellkulturen erlaubt.
Die pH-Titration im Durchflussverfahren (Fliessinjektionsanalyse, FIA) und der Einsatz von photometrischen Sensoren wurden u. a. durch Ruzicka und Hansen umfassend untersucht und beschrieben [37]. Der Einsatz eines direktpotentiometrischen pH-Sensors (Graphit-Chinhydron-Kompositelektrode) wurde durch Scholz, Kahlert u. a. eingehend untersucht und beschrieben. [38, 39, 40].
Die Bestimmung des elektrochemischen Sauerstoffbedarfes (EOD) ist ein amperometri- sches Verfahren, das mit der Bestimmung des COD korrelliert. Dieses amperomtetrische Verfahren arbeitet mit verschiedenen Elektroden: Pb/PbO2 Elektrode [30, 31, 32, 33], oberflächlich oxidierten Kupferelektroden [34, 35], Graphitelektroden mit Zusatz von Katalysatoren [36], z.B. einem Gemisch aus Kupfer- und Silberoxid [41]. Verschiedene Verfahren, u. A. Probenweise arbeitende Systeme, Durchflusssysteme mit rotierenden Elektroden [30] oder die FIA [43] werden beschrieben.
Der Einsatz von Clarkelektroden zur Bestimmung des Sauerstoffgehaltes ist hinreichend bekannt.
Enzymatische Sensoren zur Bestimmung von Glucose, Glutamin und Glutamat gibt es in vielen Bauformen [26, 43, 44]. Sie werden in Perfusionszellkulturen oder Zellbasierten Systemen in Verbindung mit einem FIA-System [43, 44, 45] zur Bestimmung der Analy- ten eingesetzt.
Enzymatische Immunosensoren eignen sich ebenfalls zum Einsatz in Zeilbasierten Systemen [117].
Gassensoren und so genannte„Elektronische Nasen" [46, 47, 48] aus einem Array von verschiedenen Metalloxid-Halbleitersensoren und einem Kohlendioxoidsenor [116] werden eingesetzt, um das Wachstum von Zellkulturen über deren Emissionen zu beobachten.
Sensorarrays für Mehrparameterbestimmung werden kostengünstig als Mikroelektroden- arrays in konventioneller Drucktechnik hergestellt [49, 50]. Sie werden als Kombination von gesputterten Goldelektroden und gedruckten Graphitelektroden mit anschließender Immobilisierung von cytochrome c oder NiTSPc zur Bestimmung von Stickoxiden und Sauerstoffradikalen [51], Arrays aus Goldelektroden [50] zur Bestimmung der elektrischen Aktivität, Kombinierte enzymatische Glucose- und Lac- tatsensoren in Dünnschichttechnik [52], Sensoren aus abwechselnden Schichten von Na- fion und Metalloporphyrinen auf Graphitsubstrat zur Bestimmung von Stickstoffmonoxid [53] beschrieben. ISFETS (Ionen selektive Feldeffekttransistoren), auch in Sensorarrays, können bei entsprechender Modifikation der Membran auf dem Gate zur Bestimmung elektrochemischer Parameter in Zellkulturen oder Zellbasierten Systemen, auch in Sensorarrays, eingesetzt werden. [54, 55]. Diese Sensoren wurden früher in die Nähe der Zellkultur gebracht [55], sind jetzt aber soweit entwickelt, dass Zellen auf ihnen anwachsen können [56, 57]. Mit diesen Sensorarrays kann z.B. der pH Wert, der Sauerstoffgehalt, die elektrische Aktivität und die Impedanz als Kriterium für die Vitalität der Zellen in der unmittelbaren Umgebung der Zellen beobachtet werden [118]. Dies ist auch im Durchflussverfahren möglich [57], Die Strukturgröße dieser Sensorarrays liegt teilweise im μm Bereich [119].
Perfusionszellkultur (Durchflusszellkultur)
In einer statischen Kultur kann der Sauerstoff nur durch Diffusion zu den Zellen gelangen. Innerhalb kürzester Zeit ist deshalb der gelöste Sauerstoff durch die Zellen aufgebraucht und die Zellen müssen auf die im Vergleich zur Zellatmung„ineffizientere" Glyko- lyse zurückgreifen. Bei aus stationären Zellkulturen ermittelten experimentellen Daten ist die Übertragung auf die in vivo herrschenden Bedingungen jedoch problematisch, da die Energiegewinnung bei eukaryotischen Zellen in vivo hauptsächlich über die im Vergleich zur Glykolyse wesentlich effektivere Atmung erfolgt.
Die Verhältnisse in einer Perfusionszellkultur unterscheiden sich hingegen grundsätzlich von der Situation in einer stationären Kultur und sind den in vivo herrschenden Bedingungen wesentlich besser angepasst. Zum einen werden zelluläre Abfallprodukte ständig abtransportiert, zum anderen wird die Sauerstoffversorgung durch den ständigen Austausch des Kulturmediums drastisch verbessert. Der Energiestoffwechsel der Zellen kann sich in der Durchflusszellkultur also wieder auf die ausgiebige Nutzung der Atmung umstellen. Der Nutzen der Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen ist bekannt [58, 59, 60, 61].
Die Perfusionszellkultur stellt erhöhte Anforderungen sowohl an die Überwachung als auch an die Sicherstellung der Qualität des Mediums: Besonderes Augenmerk muss hier auf die Parameter pH, Sauerstoffgehalt und Sterilität gerichtet werden, da das Medium in der Perfusionszellkultur nicht Stunden oder wenige Tage sondern ggf. mehrere Wochen im Einsatz ist.
Ein ebenfalls beachtenswerter Punkt ist die Tendenz des durchfließenden Medium zur Gasblasenbildung, insbesondere wenn es vorher begast wurde.
In einem Computergestützten System werden Probennahme, Messung, Zufuhr von Medium und Auswertung durch ein Programm gesteuert [63]. In einem integrierten System aus einem Sensor, einem Probennehmer und einer Zellkulturkammer kann die Produktion von Cytogenerika in einem Zellreaktor beobachtet werden [22].
Zur Aufnahme der Zellen dienen Zellkammern verschiedener Bauart, u. a. mit steriler Umgebung, integriertem Sensorarray und einem Deckel zur Passage von Gasen [64], Zur Aufnahme von Trägern mit angewachsenen Zellen [Minuth]. Eine autonom arbeitende Kammer für Perfusionszellkulturen kann auch die Elektronik für Temperaturregelung und Versorgung mit Nährmedium enthalten [65]. In einem System mit einem Zellträger mit Mikroporen (EpiFlow) lassen sich die Zellen optimal mit Sauerstoff versorgen [66]. Die Zellen können dazu auch auf einem Schichtsystem aus sauerstoffdurchlässigen biokompatiblen Membranen gehalten werden [67, 68]. Eine weiterte Möglichkeit besteht darin die Zellen in einem System aus Zellkammer mit Membran zu Anwachsen der Zellen und zur pH-Messung auf der Gegenseite der Membran zu halten und die Stoffwechselaktivität der Zellen über den pH-Wert zu beobachten [69]. Gelöster Sauerstoff und indirekt der Sauerstoffverbrauch kann mit einer Anordnung aus verschiedenen Sauerstoffsensoren (optische und enzymatische Sensoren) in einem speziellen Kammersystem aus gasdurchlässigen Gefäßen gemessen werden [22]. Diese Zellkammern sind für stationäre und Perfusionszellkulturen ausgeführt.
Miniaturisierte Systeme mit Sensorarrays bestehend aus Zellkammern, Ventilen, Reagenzreservoirs und einem entsprechenden Leitungssystem auf einem Substrat wurden beschrieben [70,71]. Erfassung von Veränderungen in von zeilbasierten Systmen insbesondere in Perfusions- zellkulturen
Es gibt verschiedene Möglichkeiten zur Erfassung von Veränderungen in Perfusionszell- kulturen.. Zum einen können technische Parameter wie Zufuhr von Nährmedium oder Substrat und Fliessgeschwindikgeit direkt gesteuert werden [72] oder aber die Konzentration bestimmter Analyten und biologische Parameter gemessen werden und die Regelung der o.a. technischen Parameter als Feedback erfolgen.
Zur Messung werden verschiedene elektroanalytische photometrische und spektroskopische Systeme beschrieben [73]. Unter anderem eignen sich die IR-Spektroskopie und die NIR-Spektroskopie [74] zur Beobachtung und quasikontinuierlichen Datenerfassung in Zeilbasierten Systemen [75,76]. Auf Grundlage dieser Daten lassen sich nicht lineare Kalibrierungen für das Verhalten von zeilbasierten Systmen erstellen. Der Einsatz der Massenspektroskopie[120] oder der NMR [77, 78] zur Analyse und Kontrolle von von zellbasierten Systmen wird ebenfalls beschrieben.
Zeilbasierten Systemen können mit Neurocontrollern [79, 80] (z. B. : SANE: symbiotic adaptive neuro-evolution algorithm, ANNSA: artificial neuronal network simulated algo- rithm ),die durch lernfähige Programme unterstützt werden oder anderen computergestützten Systemen [81, 82, 83, 84, 85, 86, 87] so beobachtet und kontrolliert werden, dass sie unter optimalen Betriebsbedingungen arbeiten.
Auch die Kontrolle über Modelle zur Vorhersage (z. B.: MPC model predictive control) erwies sich als erfolgreich [88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 84, 97, 98]. Durch diese Vorhersagemodelle ist eine dynamische Optimierung z.B. : in fed-Batch Zeilbasierten Systemen möglich [99].
Es werden verschiedene Methoden beschrieben, die natürlichen Schwankungen im Wachstum relevanter Mikroorganismen zu analysieren und gegenüber chaotischen Schwankungen durch Unregelmäßigkeiten in der Zufuhr der Nährmedien abzuschirmen [79]
Kritik am Stand der Technik
Zellsysteme sowohl für den Nachweis biologischer Effekte können als stationäre Kultur oder als Perfusionszellkultur ausgeführt werden. Beide Kulturbedingungen haben Vor- und Nachteile. Eine Möglichkeit, die Zellkulturbedingungen kontinuierlich messwertgesteuert und automatisierbar von stationär auf Durchflussbedingungen zu ändern, wurde bisher nicht beschrieben. Aus den Anforderungen für eine Automatisierbarkeit ergibt sich die Notwendigkeit, zur Beobachtung der relevanten chemischen, biochemischen und biologischen Größen robuste Messsysteme einzusetzen. Trotz der zahlreichen im Stand der Technik beschriebenen Sensorsysteme bestand eine Lücke, die nur durch speziell angepasste Sensoren geschlossen werden konnte.
Darstellung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe, die im Stand der Technik genannten Nachteile zeilbasierter biologischer Systeme zum Nachweis von biologischen Effekten zu vermeiden, wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass der Fluss des die Zellen umgebenden Reaktionsmediums von Messsignalen gesteuert wird. Diese Signale werden am Eingang und/oder Ausgang des Systems und/oder in der Zellumgebung mittels Sensoren nicht invasiv kontinuierlich und/oder quasikontinuierlich, d.h. in regelmäßigen Abständen, erhoben. Dadurch können a) die Reaktionsbedingungen ausgehend einer stationären Zellkultur bis hin zu einer reinen Durchflusszeilkultur (Perfusionszellkultur) stufenlos variiert werden und
b) durch kontinuierliche oder quasikontinuierliche Messung des Verbrauchs von Nährstoffen die angestrebten Versuchsbedingungen genau dokumentiert und eingestellt werden.
Die Erfindung betrifft somit das in Anspruch 1 definierte Verfahren.
Die Erfindung betrifft ferner die in Anspruch 18 definierte Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen funktionalen Nutritiva nach Anspruch 19.
Vorteilhafte und/oder bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das auf dem erfinddungsgemäßen Prinzip beruhende Verfahren ist für die die Steuerung von zeilbasierten Systemen zum Nachweis von biologischen Effekten nutzbar.
Die erfindungsgemäße automatisierbare Steuerung des Flusses in das die Zellen umgebende Kompartiment als zentrale Regelgröße erfordert Signale, die durch nicht invasive kontinuierliche oder quasi-kontinuierliche robuste Messverfahren erhoben werden. Dabei können teilweise bekannte Sensoren eingesetzt werden, teilweise ist aber auch eine spezielle Anpassung von Sensoren notwendig.
Bekannte zur Steuerung geeignete Sensoren sind beispielsweise:
• potentiometrischen pH-sensoren auf Basis von Chinhydron, z.B. gemäß [38, 39, 40], Gemische aus Metallen und Metalloxiden, Metalloxide oder andere geeignete pH-abhängige Redoxsysteme.
• Glukose und Laktatsensoren gemäß [78].
• Sauerstoff: Clarkelektroden in verschiedenen Bauformen.
Speziell angepasste elektrochemische bzw biochemische Festkörpersensoren, für deren Einsatz im Verfahren und Vorrichtung zur automatisierbaren Überwachung und Regelung zeilbasierter biologischer Systeme zum Nachweis von biologischen Effekten bestehen:
• aus behandeltem oder unbehandeltem Graphit, einem chemisch oder physikalisch klebendem Bindemittel (polymere Kleber, in Lösungsmittel gelöste Polymere, Po- lykondensate, Schmelzen von Kunststoffen und/oder Wachsen, unter Druck verflüssigte Pulver von Thermoplasten (PE, PTFE), Klebstoffe) und einer chemisch, elektrochemisch oder biologisch aktiven Komponente oder
• aus einer chemisch, elektrochemisch oder biologisch aktiven Komponente, die direkt oder in einer geeigneten Matrix auf im Dickschichtverfahren gedruckte Sensoren aufgetragen ist
• aus einem Elektrodenarray in oder außerhalb der Zellkammer, mittels dessen über eine Kapazitätsbestimmung die enthaltene Biomasse und damit die Zellzahl oder - dichte bestimmt werden kann.
Die Sensoroberfläche der in der Erfindung einsetzbaren Sensoren kann mit einer Membran überzogen sein. Diese Sensoren lassen sich den Anforderungen entsprechend in jeder beliebigen Form und Konsistenz herstellen. Die Konsistenz ist vom Bindemittel abhängig:
• Die Verwendung von Silikonen oder anderen elastischen Materialien führt zu flexiblen, elastischen Sensoren. Diese können in Stab- oder Kegelform mit und ohne isolierende Ummantelung hergestellt werden und in das Meßsystem integriert werden.
• Gängige Polymerisate wie PS oder PMMA führen zu festen Sensoren in beliebiger Form. Es können Ringelektroden hergestellt werden, die entweder durch einbringen einer dünnen Schicht von Sensormaterial zwischen zwei Röhrchen mit geeignetem Durchmesser oder durch Pressen des Sensormaterials zwischen zwei Kunststoffplatten und anschließender Bohrung entstehen. • Durch Verwendung geeigneter druckfähiger Bindemittel (Lacke, Isolatoren und Binder) lassen sich druckfähige Sensoren im Dickschichtverfahren auf polymeren oder keramischen Trägern herstellen. Das Design von Sensoren mit oder ohne Referenzelektrode ist möglich.
Diese Sensoren zeichnen sich durch ihre Robustheit, ihr schnelles Ansprechverhalten und durch ihre Zuverlässigkeit aus. Das ist notwendig, um dem Einsatz im Verfahren und Vorrichtung zur automatisierbaren Überwachung und Regelung zeilbasierter biologischer Systeme zum Nachweis von biologischen Effekten gerecht zu werden.
Die Sensoren erzeugen Signale, die dem Stand der Technik entsprechenden potentiomet- rischen und amperometrischen Messverfahren zugänglich sind. Zur Messung der verschiedenen Parameter können verschiedene aktive Komponenten eingesetzt werden.
• Elektrochemischen Sauerstoffbedarf (ESB): Gemische aus Metallen und/oder Metalloxiden verschiedener Oxidationsstufen, Hexacyanoferraten, Metallcarbiden, Bronzen oder andere geeignete Redoxsysteme. Diese Sensoren sind u. A. geeignet, um den Gesamtenergiegehalt des Mediums zu erfassen.
• Da Zellkultursysteme in gepufferten Medien gehalten werden, ist es erfindungsgemäß zur Beurteilung der Ansäuerungsleistung nicht der pH-Wert zu bestimmen, sondern quasikontinuierlich eine sensorgestützte Titration in einem Bypas vorzunehmen. Die so bestimmte Pufferkapazität ist aussagefähiger und eignet sich erfindungsgemäß besser zur Steuerung des Systems als der pH-Wert.
• Da sich Zellen sich unter Einfluss eines elektrischen Feldes polarisieren lassen und die Anwesenheit von Zellen in einer entsprechenden Elektrodenanordnung die Kapazität verändert ist es möglich, die Biomasse über eine Kapazitätsmessung zu bestimmen und ebenfalls zur Steuerung des Systems heranzuziehen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das biologische System eine Zellkultur mit humanen oder tierischen Zellen, mit der Wirk- und Schadstoffe, z. B. : Nah- rungs- und Futtermittel und ihre Inhaltstoffe, biologischen Nahrungsergänzungsstoffe, Futterzusatzstoffe, chemisch definierte Stoffe, Mineralien, Kosmetika, Medizinprodukten und Arzneimitteln auf ihren Einfluss auf den Zellstoffwechsel untersucht werden können.
Mit der erfindungsgemäßen Kopplung von Messwerterfassung und Nutzung dieser Messwerte zur manuellen, automatisierbaren oder über Kontroller oder Software automatisierten Steuerung der Durchflussmenge in der Perfusionszellkultur können die Bedingungen kontinuierlich von fast stationären Reaktionsbedingungen (mit einer starken Ansammlung von Metaboliten, die damit leichter erfasst werden können) bis zu einem starken Durch- fluss (verbunden mit einem ständigen Abtransport der Metaboliten, die deshalb in geringerer analytischer Konzentration vorliegen) geändert werden.
Bei fast stationärer Kultur überwiegt im Zellstoffwechsel die Gärung, bei sehr starkem Durchfluss die Atmung. Es ist deshalb erfinderisch, die von Fluss abhängige Stoffwechselsituation der Zellen, insbesondere das Verhältnis von Atmung und Gärung, mit Sensoren vorzugsweise mit Glukose- und Laktatsensoren kontinuierlich oder quasikontinuierlich zu messen, um durch Rückkopplung eine angestrebte Stoffwechselsituation entweder durch Anpassung des Sauerstoffgehaltes, Einstellung des pH-Wertes, der Fliessrate oder des Verhältnisses des zirkulierenden und durchfließenden Mediums einzustellen.
Es ist darüber hinaus erfinderisch insbesondere das Verhältnis von Atmung und Gärung durch eine Druckerhöhung im System und der damit verbundenen Erhöhung des Sauerstoff partia Id ruckes zu Gunsten der Atmung zu verschieben und dabei die Druckerhöhung durch die Messwerterfassung zu steuern.
Die Charakterisierung der Stoffwechselsituation erfolgt vorteilhafterweise durch Bestimmung des Metaboloms. Das Metabolom fasst alle charakteristischen Stoffwechselbewegungen einer Zelle bzw. eines Gewebes zusammen. Dabei werden die Metaboliten jeweils zu einem konkreten Zeitpunkt als„Momentaufnahme" dargestellt. Metabolische Flüsse zur Charakterisierung einzelner Stoffwechselwege, zur Wechselwirkung dieser Stoffwechselwege und ihrer Abhängigkeit beispielsweise vom Nährstoffangebot oder von der Einwirkung von Wirksubstanzen ergeben sich aus der Aneinanderreihung solcher Momentaufnahmen. Voraussetzung dafür ist, dass sich die Zellen während der Analyse des Metaboloms über einen längeren Zeitraum von Tagen oder sogar Wochen möglichst wenig durch Anpassung an die Nahrungssituation, Zellproliferation, Differenzierung oder Apop- tose verändern.
Um die Zellzahl über lange Zeiten konstant zu halten, wird die Zellteilung in bekannterweise mit dem Mitosehemmstoff Mitomycin C gehemmt (Jülich et al., 2006). Unter Mito- mycinwirkung kommt es zu einer Quervernetzung zwischen den DNA-Strängen und damit zu einer Blockierung der Strangtrennung, die für die Replikation erforderlich ist, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen einzuschränken. Zusätzlich wird die Sauerstoffversorgung sensorgestützt gemessen und durch meßwertgesteuerte Begasung konstant gehalten. Durch die meßwertgesteuerte Begasung werden auch die CO2-Konzentration und damit auch der pH-Wert konstant gehalten. Damit ist es mit der erfindungsgemäßen Modifikation möglich, Zellen über mehr als 300 h in einem Gleichgewichtszustand zu halten. Die Aneinanderreihung von Momentaufnahmen des Metaboloms kann deshalb bei diesem Unter- suchungsmaterial die Abhängigkeit typischer Stoffwechselflüsse von den zu untersuchenden Parametern zeigen. Der Fluss kann erfindungsgemäß meßwertgesteuert so eingestellt wird, dass eine Erfassung von Stoffwechselprodukten, die nur in sehr geringer Konzentration vorkommen, mit bei der Metabolom-Analyse üblichen sehr empfindlichen Messverfahren vorzugsweise LC-MS-NMR-Verbundtechnologien noch möglich ist, die Stoffwechselsituation aber den Verhältnissen in vivo mit einem Überwiegen der Atmung so weit wie möglich angenähert wird..
Zellen verfügen über flexible Stoffwechselwege und reagieren damit auf Wirkstoffe in ihrer Umgebung. Durch die erfindungsgemäße Weiterentwicklung der Perfusionszellkultur in Kombination mit gezielten Metabolomanalysen wird ein vielseitig einsetzbares Meßsystem für eine Feincharakteristik solcher Wirkstoffeinflüsse geschaffen.
Aus der Analyse der beobachteten Flüsse ausgewählter Metaboliten ins Medium sind optimale Zeitpunkte abzuleiten, bei denen die wesentlich aufwendigere Bestimmung der intrazellulären Metabolite durchgeführt wird. Die Bestimmung der intrazellulären Stoffwechselparameter an diesen ausgewählten Zeitpunkten erlaubt tiefere Einblicke in die Stoffwechsel, die für die Interpretation der Wirkstoffeffekte notwendig sind.
Steuerbare Veränderungen im biologischen System werden erreicht, indem die Zellen der Einwirkung eines physikalischen, biologischen oder chemischen Reizes ausgesetzt werden.
Ein physikalische Reiz kann durch Temperatureinwirkung oder Bestrahlung mit Teilchen oder elektromagnetischer Wellen geeigneter Energie erzeugt werden.
Biologische Reizen können erreicht werden, indem die Zellen in der Langzeitkultur mit Viren infiziert werden. Dadurch wird es möglich, der Einfluss von verschiedenen Arzneimittelkandidaten direkt an der virusinfizierten Zelle zu untersuchen.
Ein biologischer Reiz kann aber auch durch Virusbestandteile und/oder durch Bakterientoxine und/oder durch Mykotoxine erzeugt werden.
Ein chemischer Reiz wird durch toxische, biologisch aktive, pharmazeutisch oder kosmetisch wirksame Stoffe erzeugt.
Von besonderem Interesse sind Versuchsanordnungen, bei denen der physikalische oder chemische Reiz auf der Bildung von freien Radikalen beruht. An besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Langzeitkultur ist, dass die Einwirkung der Reize und entsprechender Kandidaten für eine prophylaktische oder therapeutischen Wirkung zeitlich aufeinander folgend oder gleichzeitig erfolgen kann.
Die sich einstellende Stoffwechselsituation hängt von sehr vielen Faktoren ab, das optimale Verhältnis kann deshalb nicht generell festgelegt werden. Es ist deshalb erfinderisch, das Verfahren in mindestens zwei Schritten durchzuführen, wobei im ersten Schritt ein Fluss eingestellt wird, bei dem einerseits eine optimaler Messung des prüfenden Stoffwechselparameters möglich ist, und bei dem andererseits die Stoffwechselsituation soweit wie möglich den in-vivo-Verhältnissen angenähert wird („Optimierung des Flusses") und in einem zweiten Schritt die„Erzeugung von fördernden oder hemmendem Reaktionsbedingungen" vorgenommen wird.
Die Verfahrensschritte„Optimierung des Flusses" und„Erzeugung von fördernden oder hemmendem Reaktionsbedingungen" können auch alterierend durchgeführt werden.
Durch die erfindungsgemäße messwertabhängige Einstellung kann eine bestimmte Stoffwechselsituation dokumentiert, vom Nutzer gezielt verändert, im weiteren Versuchsablauf konstant gehalten und in späteren Untersuchungen reproduziert werden.
Es ist ein Merkmal des Verfahrens, dass die Versuchsbedingungen nach optimaler und/oder vom Nutzer vorgegebener Einstellung einschließlich der Einstellung fördernde oder hemmende Reaktionsbedingungen und einschließlich der Konzentration der Wirkstoffe dokumentiert und/oder auf geeigneten Speichermedien gespeichert werden. Während des weiteren Versuches können die Bedingungen durch kontinuierliche oder quasikontinuierliche Messung mit Sensoren und ständigem Abgleich mit den dokumentierten und/oder gespeicherten Werten wahlweise unter dem Gesichtspunkt konstanter Fluss und/oder konstanten Stoffwechselsituation und/oder konstante fördernde/hemmende Bedingungen und/oder konstante Wirkstoffkonzentration konstant gehalten werden.
Die erfindungsgemäße Steuerung des Systems kann manuell durch Abgleich mit dokumentierten und/oder angestrebten Werten, teilautomatisiert über einzelne Kontroller oder ein Kontrollersystem oder sonstige geeignete Rückkopplungsmechanismen oder vollautomatisiert über eine geeignete, z.B. Prozessor gestützte und unter Umständen programmierte oder programmierbare oder sogar lernfähige Systemsteuerung laufen. Mit der erfindungsgemäßen Messwert-gekoppelten Steuerung wird eine optimale Messung des Einflusses der zu prüfenden Substanzen möglich, wobei die Prϋfsubstanzen Nahrungs- und Futtermitteln und ihre Inhaltstoffe, biologische Nahrungsergänzungsstof- fe, Futterzusatzstoffe, chemisch definierten Stoffe, Mineralien, Kosmetika, Medizinprodukten und Arzneimitteln sein können. Die Prüfung kann sowohl einen fördernden oder hemmenden Effekt nachweisen als auch beweisen, dass Schäden, die den Zellen durch Noxen beispielsweise durch toxische Stoffe, Strahlung oder freie Radikale zugefügt werden, unter dem Einfluss der Prüfsubstanzen vermieden und/oder schneller repariert werden. Die zu prüfenden Stoffe können zu einem von der biologischen Zellreaktion abhängigen Zeitpunkt den Zellen zugeführt werden. Damit wird die Prüfung von prophylaktischen Wirkungen möglich.
Durch die erfindungsgemäße komplexe Steuerung ist es möglich, das Testverfahren so zu führen, dass die Zellreaktion den natürlichen Bedingungen möglichst ähnlich verläuft. Nur unter diesen Voraussetzungen ist eine den natürlichen Bedingungen entsprechende Prüfung von Mitteln und Zubereitungen, die den Zellstoffwechsel beeinflussen können, möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet daher Aussagen zur Wirksamkeit von Nahrungs- und Futtermitteln und ihren Inhaltstoffen, biologischen Nahrungsergänzungs- stoffen, Futterzusatzstoffen, chemisch definierte Stoffen, Mineralien, Kosmetika, Medizinprodukten und Arzneimitteln einerseits sowie von auf toxikologische Risiken zu prüfenden Stoffen andererseits, auf andere Weise nicht mit entsprechender Genauigkeit und Sicherheit gewonnen werden können.
Eine wichtige Voraussetzung dafür ist, dass erfindungsgemäß zur Erreichung reproduzierbarer Versuchsbedingungen vor jeder Messung durch kontinuierliche oder quasikontinuierliche Messung mit Sensoren und Abgleich mit den dokumentierten und/oder zum Beispiel auf dem Chip gespeicherten Werten sichergestellt wird, das gleiche Ausgangsbedingungen eingehalten werden.
Es können verschiedene, bezüglich der Dosierung und Konzentration der Realität sehr gut angenäherte Stressfaktoren in dem erfindungsgemäßen System simuliert werden. Einige Beispiele sind:
a) Belastung durch Umweltschadstoffe und/oder Umwelteinflüsse, die im Alltag und/oder am Arbeitsplatz auftreten, wie z.B. Gase und Stäube, Strahlung oder elektromagnetische Wellen,
b) Stress durch Nährstoffmangel
c) Belastung durch freie Radikale, die als wichtige Ursache für Alterungserscheinungen, organischen Stress und Krebserkrankungen erkannt wurden d) Sauerstoffstress
e) Biologische Stressfaktoren wie z.B. : Viren und Toxine
f) Thermischer Stresss als Simulation von Fieber.
Eine Kopplung von zu untersuchenden Wirkstoffkandidaten und stressenden Faktoren erlaubt die Erkennung und Dokumentation heilender und prophylaktischer Wirkungen und über die Messung dosierungsabhängige Wirkungen den Erkenntnisgewinn für eine optimale Dosierung. So kann eine Substanz z. B. in Intervallen und/oder Zeiträumen einwirken, die realen Gegebenheiten entsprechen.
Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine partielle Führung des Reaktionsmediums im Kreis. Diese Ausführung spiegelt die Bedingungen im Organismus, da hier ebenfalls über einen Kreislauf von Medium Nährstoffe zugeführt und Stoffwechselprodukte abgeführt werden. Der Grad der Zufuhr von Nährstoffen und der Abfuhr von Stoffwechsel Produkten kann durch Dosierung und partiellen Kreislauf genau eingestellt werden.
Es ist zweckmäßig, die Dosierung von chemische, biochemische oder biologische Faktoren, die in ihrer Kombination auf die Zelle einwirken und schädigende oder fördernde Wirkungen bewirken, auf Grund der sensorgestützten Messung der zellbiologischen Antwort mit kontinuierlichen oder quasi-kontinuierlichen Verfahren vorzunehmen.
Auswahl von Metaboliten des Energiestoffwechsels
Humane Zellen verfügen über flexible Stoffwechselwege, um den Energiebedarf zu decken. Bei der Atmung werden Elektronen einer reduzierten organischen Kohlenstoff- Verbindung wie der im Nährmedium vorhandenen Glucose auf das stark elektronegative Sauerstoffmolekül O2 übertragen. In der Summe werden ein Mol Glucose und 6 Mol O2 zu 6 Mol Kohlenstoffdioxid und 6 Mol Wasser umgesetzt. Glucose wird dabei zunächst durch Glykolyse oxidativ (NAD+) in zwei C-3-Körper (Glycerinaldehyd-3-phosphat, dann Pyru- vat) zerlegt, wobei die Energieäquivalente ATP und NADH, H+ gewonnen werden. Der End-Abbau von Pyruvat zu CO2 und H2O erzeugt über weitere Reduktionsäquivalente (NADH, H+) den Hauptteil an ATP. Zu zwei Dritteln wird Glucose über Pyruvat und Acetat in den Citratzyklus eingeführt und von dort aus dem Endabbau zugeleitet und zu einem Drittel über Pyruvat zu CO2 umgesetzt. Alternativ wird Glucose im Phosphogluconatweg, einem Teil des Pentosephosphatzyklus unter Decarboxylierung oxidativ direkt zu einer Pentose abgebaut, wobei zwei Moleküle NADPH, H+ generiert werden. Bei der Gärung werden kein Elektronendonor und kein Elektronenakzeptor verbraucht, Redoxreaktionen finden nur intermediär statt. Bei Gärungen wird bei quantitativ gleichem Stoffumsatz wesentlich weniger Energie frei als bei der Atmung. Wenn Sauerstoff als Elektronenakzeptor im System fehlt, kann Glucose nur zu Lactat abgebaut werden - ein Vorgang, der in der stationären Zellkultur überwiegt. Bei der Gärung entstehen aus 1 Mol Glucose 2 Mol Lactat. Der Quotient aus verbrauchter Glucose und gebildetem Lactat beträgt daher bei reiner Gärung 2.
Perfusionszellkultur und Metabolom-Analyse
Begrenzend ist jedoch die für eine Untersuchung zur Verfügung stehende Zellzahl. Pro Untersuchung können bei 5 parallelen Zellkammern nur etwa 25-50 x 105 Zellen eingesetzt werden. Für die Untersuchung müssen deshalb hochempfindliche analytische Methoden zur Verfügung stehen. Außerdem ist es notwendig, sich auf charakteristische, mit der LC-MS gut erfassbare Stoffwechselprozesse zu beschränken.
Die Bestimmung intrazellulärer Metaboliten erfordert die Lyse der Zellen. Die Bestimmungen können deshalb nur zu wenigen ausgewählten Zeitpunkten durchgeführt werden. Wenn eine quantitative Datenerhebung von Metabolit-Konzentrationen und -flüssen über einen langen Zeitraum beobachtet werden soll, müssen mehrere Versuchsansätze nacheinander durchgeführt werden. Die Perfusionszellkultur gewährleistet vergleichbare Bedingungen über einen längeren Zeitraum. Bei einer Kombination von LC-MS und Perfusionszellkultur kann durch quasikontinuierliche nicht invasive Messung von Glucose- verbrauch und Lactatbildung sicher gestellt werden, dass sich die Zellen der Kontrollen ohne Wirkstoffeinfluss in einer den vorangegangenen Momentaufnahmen des Metaboloms vergleichbaren Situation befinden. Deshalb kommt der Ermittlung von Vertrauensgrenzen für den Glucoseverbrauch in einer nicht durch Wirkstoffe beeinflussten Perfusionszellkultur, die in dieser Arbeit beschrieben wird, besondere Bedeutung zu.
Humane Zellen verfügen über flexible Stoffwechselwege und reagieren damit auf Wirkstoffe in ihrer Umgebung. Durch die Weiterentwicklung der Perfusionszellkultur in Kombination mit gezielten Metabolomanalysen wird ein vielseitig einsetzbares Meßsystem für eine Feincharakteristik solcher Wirkstoffeinflüsse geschaffen.
Die Perfusionszellkultur erlaubt die nicht invasive Bestimmung von Stoffwechselparame- tern, die unter dem Einfluss von Wirkstoffen ins Nährmedium abgegeben werden. Der Effekt dieser Wirkstoffe wird in Abhängigkeit von der Art der Wirkstoffe und der Wirkstoffkonzentration zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Wirkstoffgabe erkennbar, z.B. erst nach Wirkstoffakkumulation. Das erfordert eine quasikontinuierliche Bestimmung ausgewählter Stoffwechselparameter über mehrere Tage oder Wochen.
Aus der Analyse der beobachteten Flüsse ausgewählter Metaboliten ins Medium sind optimale Zeitpunkte abzuleiten, bei denen die wesentlich aufwendigere Bestimmung der intrazellulären Metabolite durchgeführt wird. Die Bestimmung der intrazellulären Stoffwechselparameter an diesen ausgewählten Zeitpunkten erlaubt tiefere Einblicke in die Stoffwechsel, die für die Interpretation der Wirkstoffeffekte notwendig sind.
Sirtuine als Beispiele für Metaboliten, die mit der Versuchsanordnung nach Lyse der Zellen bestimmt werden können
Eine Erhöhung der Sirtuinaktivität kann beispielsweise bei verschiedenen Modellorganismen zur Aktivierung von zentralen Stoffwechselenzymen führen. Diese Aktivierung ermöglicht es der Zelle, bei Mangel an Nährstoffen andere Energiequellen zu verwenden und diese effizient zu nutzen. Sirt3 aktiviert dabei spezielle Formen dieser Enzyme, die gleichzeitig NADPH bilden, welches für die Regeneration zellulärer Anti-Stress-Systeme benötigt wird (Schlicker C, Gertz M, Papatheodorou P, Kachholz B, Becker CF, Steegborn C : Substrates and regulation mechanisms for the human mitochondrial sirtuins Sirt3 and Sirt5. J Mol Biol. 2008 Oct 10;382(3):790-801). Die Bestimmung von NADPH erlaubt deshalb auch eine Aussage, ob und wie der von Zelle zur Energiegewinnung gewählte Stoffwechselpfad zur Stressresistenz beiträgt.
Unter dem Einfluss von Wirkstoffen oder bei Stresssituationen können alternative Stoffwechselpfade gewählt werden. Das Ausweichen auf einen von der Normalsituation abweichenden Stoffwechselweg ist ein sehr empfindlicher Indikator für solche Einflüsse.
Die Aktivierung des Sirtuins Sirt3 Schlicker, et al., 2008). ermöglicht es der Zelle, bei einem in dieser Situation nicht ausreichenden Glucoseangebot auch andere Energiequellen zu verwenden. Dabei wird auch mehr NADPH gebildet, welches für die Regeneration zellulärer Anti-Stress-Systeme benötigt wird.
Eine für die Umsetzung des erfindungsgemäßen Prinzips geeignete Vorrichtung, umfassend ein System aus mehreren miteinander verbundenen und aufeinander abgestimmten Komponenten und/oder Bestandteilen, angeordnet gemäß Fig. 1, bestehend aus:
a) einer Reaktionskammer oder Zellkammer oder Bioreaktor oder Zellreaktor, der/die vorzugsweise temperierbar ist
b) einem Zulauf für Reaktionsmedium
c) einem Ablauf für Medien und Reaktionsprodukte d) einem oder mehreren Zuläufen für Reagenzien und/oder Wirkstoffe und/oder Substrate und/oder andere Medien
e) Pumpen, Anschlüssen und Ventilen, die es gestatten, den Durchlauf des Reaktionsmediums zu steuern und vollständig, partiell oder nicht in einem Kreislauf zu führen
f) Durchflusszellen und Titrationssystemen mit Sensoren zur Bestimmung prozessrelevanter Messgrößen am Eingang und/oder Ausgang des Systems g) falls erforderlich weiteren Sensoren in der direkten Zellumgebung.
h) einer Steuer- und Regelungstechnik zur kontinuierlichen Änderung der Reaktionsbedingungen ausgehend von einer stationärer Kultur der Zellen zu einer Perfusionszellkultur, wobei die zentraler Regelgröße der von der biologischen Reaktion abhängige Fluss in die ist, wobei die Regelung unter Nutzung der Komponenten f und/oder g wahlweise manuell und/oder automatisierbar und/oder programmierbar erfolgt
i) einer Steuer- und Regelungstechnik, die die Zufuhr von Reagenzien, Wirkstoffen und Substraten und die Fließrate in aufeinander abgestimmten Verhältnissen regelt, wobei die Regelung unter Nutzung der Komponenten f und/oder g wahlweise manuell und/oder automatisierbar und/oder programmierbar erfolgt j) einer speziellen ggf. lernfähigen Software zur Steuerung und Optimierung des Systems ist Bestandteil der Erfindung.
Die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung integrierten Durchflusszellen werden vorteilhafterweise in verschiedenen zur Aufnahme der Sensoren geeigneten Bauformen eingesetzt. Stabförmige Sensoren werden in entsprechende Durchflusszellen eingebracht, so dass die Sensoroberflächen mit dem Flüssigkeitsstrom in Berührung kommt, jedoch den Flüssigkeitsstrom nur minimal behindert oder verwirbelt. Ringelektroden dienen selbst als Durchflusszellen und werden durch geeignete Anschlüsse mit dem Leitungssystem verbunden. Eine andere Bauform von Ringelektroden wird durch das Einspannen einer Sensormembran zwischen 2 gebohrten Platten und dem anschließendem oder vorbereitendem Durchstich der Membran realisiert. Durchflusszellen zur Aufnahme gedruckter Sensoren sind so konstruiert, dass der Flüssigkeitsstrom parallel zur Sensoroberfläche oder im Winkel zur Sensoroberfläche geführt wird und geeignet positionierte Zu- und Abflüsse einen kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom erzeugen. Diese Durchflusszellen bestehen aus mehreren Teilen, die so zusammengebaut werden, dass die Sensoroberfläche dem Flüssigkeitsstrom ausgesetzt wird und durch Dichtungen Sicherheit gegen Auslaufen gegeben ist. Kontakte zur Verbindung des Sensors mit dem Messsystem sind ebenfalls vorzuse- hen. Die Sensoren können, je nach Anforderung, direkt im Fluß, in einem Bypass oder hinter einer Entnahmestelle positioniert sein.
Mit Stress - wie zum Beispiel Hitze - umzugehen, ist für alle Lebewesen eine große Herausforderung. Die Hitzeschock-Antwort ist daher ein evolutionär sehr alter und hochkonservierter Prozess, der in allen Lebewesen vorkommt. Die Expression von Hitzeschockprotein und die Aktivierung von Hitzeschockfaktor sind Teil der Resistenzentwicklung von Zellen gegen die Einwirkung äußerer Stressfaktoren, die über Hitze weit hinaus Bedeutung haben.
Das oben genannte zellbiologische System ist zum Nachweis einer Wirksamkeit beim experimentellen Hitzeschock geeignet. Ein Temperierblock sichert eine gleich bleibende und über die Zellkammern gleiche Temperatur. Nach einer Einlaufperiode (Phase I) dient die Phase II zur Ermittlung des Wirkstoffeinflusses auf den Zellstoffwechsel bei Körpertemperatur. Bei Phase III wird der Hitzestress durch Temperaturerhöhung auf 39,3-41,3 0C erzeugt.
Die nachstehend genannten Entwicklungen, die auf dem Nachweis synergistischer Effekte mit dem oben geschilderten zellbiologischen System beruhen, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Bei der Entwicklung von nutritiven Fütterungskomponenten wirken einzelne Inhaltsstoffe in nur geringen Konzentrationen, dafür aber über eine lange Zeit ein. Um einen stoffwechselstimulierenden Effekt zu überprüfen, musste ein experimentelles Modell geschaffen werden, dass eine stabile Stoffwechselsituation über eine lange Einwirkungszeit gewährleistet und damit die Prüfung stoffwechselstimulierenden Effekte ermöglicht.
Das oben beschriebene zellbiologische System hat sich für diese Zwecke als geeignet erwiesen.
Eine Aufgabe, die mit Hilfe des oben geschilderten zellbiologischen Systems gelöst wurde, bestand darin, Futtermittel für die Aquakultur zu entwickeln, die folgende Probleme lösen:
• Nutritive Wirkung durch Aktivierung des Zellstoffwechsels bei gleichzeitiger Zuführung von ungesättigten Fettsäuren
• Hemmung fischpathogener Bakterien ohne die Abbauleistungen der biologischen Filter zu schädigen
• Vermeidung der Resistenzentwicklung humanpathogener Erreger • Herstellung bei Temperaturen < 80 0C, um wertvolle Inhaltsstoffe zu erhalten
• Verminderung von Stressreaktionen
Diese komplexe Aufgabe erfordert verschiedene Prüfverfahren. In-vitro-Untersuchungen können nur bestimmte Einzelfragen beantworten und berücksichtigen nicht Komplexität der biologischen Reaktion. Tierexperimentelle Prüfungen sind bei der Vielzahl der möglichen Kombinationen zu aufwändig und scheiden daher für Vorversuche aus. Untersuchungen an Zellen berücksichtigen einerseits die Komplexität der biologischen Antwort, sind aber andererseits noch relativ kostengünstig durchzuführen.
Um eine Optimierung der Zusammensetzung zu erreichen ist daher die Prüfung möglicher Komponenten auf stoffwechselfördende, stressmindernde und synergistische Effekte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein wertvolles Hilfsmittel. Im Ergebnis dieser Prüfungen kann eine Futterzubereitung, umfassend
a) Biomassen aquatischer Organismen mit einem hohen Anteil an Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren mit stoffwechselaktivierender Wirkung,
b) bisher unbekannte zyklische Peptide nach Formelbild 1 :
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R2=C12H14NO3 als Reinsubstanz oder enthalten in Biomassen von Mikroalgen oder im Methanol/Wasserextrakt aus den genannten Biomassen oder in einer nach Aufreinigung des Methanol/Wasserextraktes über Zellulose angereicherten Fraktion und/oder c) einen Tripel-Smectit-Mineralverbund und/oder d) pilzliche Biomassen oder Pilzextrakte mit Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime und/oder immunstimmulierender Wirkung in besonderer Weise bevorzugt von Canoderma pfeifferi und/ oder Saccharomyces spec und/oder Kluyveromyces spec und/oder
e) Biomasse aus arzneistoffliefernden Pflanzen nach Abtrennung der als Arzneimittel verwendeten Inhaltstoffe, in besonderer Weise vorteilhaft Biomasse von Artemisia annua nach Abtrennung der Peroxide bereit gestellt werden.
Es werden Formulierungen erhalten, bei denen ein nutritiver Effekt mit einer Prophylaxe gegen Fischkrankheiten verbunden wird.
In den Kombinationen sind praktisch alle Mischungsverhältnisse der Komponenten möglich, wobei vor die Auswahl der einzelnen Mikroalgen/Grün- bzw. Kalkalgen und/oder das Verhältnis aquatischer zur pilzlicher Biomasse und/oder das Verhältnis Biomasse zu natürlichem Mineralstoff variieren kann. Eine Auswahl der am besten geeigneten Mischungsverhältnisse ist mit dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren möglich.
Durch die Prüfung an der erfindungsgemäßen Langzeitzellkultur werden optimale Kombinationen für verschiedene Anwendungen erhalten. Durch die ermittelte optimale Kombination für spezielle Anwendungsziele können beispielsweise in der Fischzucht Phasenfütterungskonzepte verwirklicht werden, in dem die Zusammensetzung an die einzelnen Phasen der Fischaufzucht angepasst wird.
Eine Zuführung essentieller Nahrungsbestandteile ohne Stoffwechselstimulierung führt nicht zu einem ausreichenden nutritiven Effekt. Es ist erfindungsgemäß, den stoffwechselstimulierenden Effekt, der mit dem oben geschilderten zellbiologischen System nachgewiesen wurde, durch gleichzeitige Zuführung von Lipiden, Proteinen, Kohlehydraten, Vitaminen und Mineralstoffen aus Biomassen aquatischen Ursprungs, die eine Verbesserung der Versorgung mit Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren mit einer Stimulierung des Stoffwechsels verbinden, zu verstärken. Die Stimulierung des Stoffwechsels ist ein neues kennzeichnendes Merkmal für die Auswahl der Mikroorganismen, die für eine Verwendung als Futterkomponente besonders geeignet sind.
Es ist bekannt, dass Biomassen aquatischer Organismen wertvolle Inhaltstoffe, insbesondere Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren, enthalten. Es war aber bisher nicht bekannt, dass der Stoffwechsel von eukaryotischen Zellen auch durch Biomassen ausgewählter aquatischer Organismen angeregt wird. Es ist deshalb erfinderisch, als Zumischung zum Fischfutter Biomassen, ausgewählt aus aquatischen Organismen, die mehrfach ungesättigte C16-C22-Fettsäuren, z.B. Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3), Arachidonsäure (C20:4), Eicosapentaensäure (EPA, C20:5) und Docosahexaensäure (DHA, C22:6) ent¬ halten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Mikroalgen der Gattung Synechocystis, die 18:0 und 18: 1 Fettsäuren sowie hohe Konzentrationen an 16:1 Fettsäuren enthalten und der Gattungen Lyngbya, Oscillatoria (Limnothrix und Planktothrix), die reich an 18:0 bis 18:3 Fettsäuren, insbesondere α-Linolensäure sind und/oder Gemische dieser Mikroalgen auszuwählen.
Zyklische Peptide nach Formelbild 1 zeigen überraschenderweise eine antibakterielle Wirkung gegen fischpathogene Keime, ohne die Leistung biologischer Filter in Aquafarmen zu beeinträchtigen. Für diese zyklischen Peptide wird Substanzschutz beantragt.
Diese zyklischen Peptide werden von Mikroalgenstämmen, ausgewählt aus den Gattungen Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria {Limnothrix und Planktothrix) und Nostoc gebildet. Es ist deshalb erfinderisch, die antibakterielle Wirkung zu erreichen durch
a) Beimischung der gereinigten zyklischen Peptide nach Formelbild 1 oder b) Beimischung eines Methanol/Wasserextraktes von Biomassen , ausgewählt aus den Gattungen Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix und Planktothrix) und Nostoc, der zyklischen Peptide nach Formelbild 1 enthält, oder
c) Beimischung einer Fraktion, die durch Aufreinigung des Methänol/Wasser- Extraktes nach b) über Zellulose oder Kieselgel erhalten wurde, oder d) Verfütterung von Mikroalgen, die Inhaltstoffe nach Formelbild 1 enthalten, einzeln oder in Kombination.
Die unter d) genannte Ausführungsform wird als besonders vorteilhaft angesehen. Bei dieser Ausführungsform kann die Biomasse von Mikroalgen-Stämme, ausgewählt aus den Gattungen Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix und Planktothrix) und Nostoc in einer handelsüblichen Mikroalgenkultur gewonnen werden.
Inhaltsstoffe des Baumpilzes Ganoderma pfeifferi zeigen überraschenderweise eine starke Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime. Die Kombination von Wirksamkeit gegen fischpathogenen Keimen und Stoffwechselstimulierung, nachgewiesen mit einer Meßanordnung gemäß Anspruch 1 ist eine gute Voraussetzung für den Einsatz in nutritiven Fischfutterzubereitungen. Die starke Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime ergänzt die antibakterielle Wirkung der Mikroalgen.
Biomassen von Ganoderma-Arten wirken bekanntermaßen als Radikalfänger. Schäden durch freie Radikale treten auch bei Fischen auf. Daher können die Beimischung von Ga- noderma pfeifferi auch zum Schutz vor der schädigenden Wirkung von freien Radikalen genutzt werden.
Ein Zusatz von 2 % Ganoderma-pfeifferi in Form einer Mikro-und Nanopartikel- Suspension oder in Form von Extrakten bewirkt eine Stimulierung des Zellstoffwechsels. Die Kombination von Stoffwechselstimulierung bei Eukaryonten und Wachstumshemmung bei Prokaryonten ist deshalb ein kennzeichnendes Merkmal von G. pfeifferi und für die vorliegende Erfindung von besonderer Bedeutung.
Überraschenderweise kann bei einer Kombination von Ganoderma-pfeifferi-Mikro-und Nanopartikeln mit Montmorillonithaltigen Tonmineralen der Anteil von G. pfeifferi auf 0,6 % gesenkt werden.
Ebenfalls völlig überraschend ist die mit dem oben geschilderten zellbiologischen System nachgewiesene Streßminderung durch G. pfeifferi allein oder in Kombination von G. pfeifferi und Artemisia annua. Dieser Nachweis der erhöhten Streßresistenz mit dem oben geschilderten zellbiologischen System ist für die Erfindung von großer Bedeutung
Gruppe 1 : "100 % A. annua.", 2 %
Gruppe 2 : "75 % A. annua : 25 % G. pfeifferi." = 2,0 %
Gruppe 3 : "50 % A. annua. : 50 % G. pfeifferi." = 2,0 %
Gruppe 4: "25 % A.annua. : 75 % G. pfeifferi." = 2,0 %.
Gruppe 5: "100 % G. pfeifferi." = 2,0 %
Gruppe 6: -, Kontrollgruppe ohne Wirkstoff
Nur bei der Gruppe 4 "25 % A.annua. : 75 % G. pfeifferi." und bei G. pfeifferi allein wurde eine Stressminderung beobachtet. Das ist besonders überraschend, weil A. annua allein auch bei dieser Versuchsanordnung einen eher negativen Effekt hat.
Die Erfindung soll anschließend an einigen Beispielen erläutert werden. Beispiele
Beispiele I bis XII sollen die Bedeutung einiger wichtiger Messgrößen untersetzen. Die Beispiele A bis E demonstrieren die breite Anwendbarkeit des Systems
Beispiel I
Darstellung der partiellen Führung des Mediums im Kreislauf
Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau der Versuchsanordnung
Die erfindungsgemäße Regulierung und Abstimmung der Anteile von im Kreislauf geführtem Medium und durchfließendem Medium dienen zweierlei Zwecken:
1. Die Anreicherung sowie die Abreicherung von Wirkstoffen im lebenden Organismus kann durch teilweisen Kreislauf des Wirkstoffbeladenen Mediums nachgestellt werden.
2. Die Wirkstoffkonzentration und deren Verlauf kann exakt eingestellt werden.
Beispiel II
Variable Einstellung der zu prüfenden Wirkstoffkonzentration
Dadurch dass kontinuierlich Wirkstoffbeladenes Medium zugeführt wird, kommt es zu einer Anreicherung des die Zellkammer durchfließenden Mediums mit Wirkstoff, die von dem Verhältnis des im Kreislauf geführten Mediums zum durchfließenden Medium abhängig ist. Mittels Einstellung dieses Verhältnisses und Einstellung der Wirkstoffzufuhr können verschiedenste Verläufe der An- und Abreicherung dargestellt werden, wie im Folgenden anhand eines Kosmetischen Wirkstoffes (Sandelholzöl) verdeutlicht wird.
Der Wirkstoff liegt in einer Verdünnung von 2 % Sandelholzöl in Kulturmedium im Kom- partiment 1 vor und wird während der Zeit 5 h bis 10 h mit einer Fließrate von 3 μl / h dem System zugegeben. Das System mit seinen wesentlichen Komponenten ist in Figur 1 dargestellt.
Das Kulturmedium soll die Zellkammer Z mit einer Geschwindigkeit mit einer Fließrate von 30 μl/h durchfließen, die sich in Vorversuchen als Optimum erwiesen hat und gehalten werden soll.
Variante 1 beschreibt eine lineare Führung des Mediums ohne Kreislaufanteil: Von 0 h bis 5 h wird reines Kulturmedium mit einer Fließrate von 30 μl/h in das System gegeben und aus dem Ablauf entnommen. Der Wirkstofffanteil beträgt 0 %.
Von 5 h bis 10 h wird Wirkstoffbeladenes Medium mit einer Fließrate von 0,3 μl/h über den Zulauf 1 in das System gegeben. Gleichzeitig wird die Fließrate des Grundmediums auf 27 μl/h reduziert. Damit ergibt sich eine Wirkstoffkonzentration von 0,02 % in dem die Zellkammer durchfließenden Medium.
Ab 10 h werden wieder die Ausgangswerte eingestellt. Damit ergibt sich wiederum eine Wirkstoffkonzentration von 0 % in der Zellkammer, deren Einstellzeit nur von Verdünnungseffekten in der Zellkammer abhängt. Der Verlauf von Variante 1 ist in Figur 13 als gestrichelte Linie dargestellt
Variante 2 beschreibt eine anteilige (50 %) Führung des Mediums im Kreislauf:
Das Kulturmedium wird mit von 5 h bis 10 h mit einer Fließrate von 15 μl/h in das System gegeben. An der Weiche zwischen Ablauf und Kreislauf werden 15 μl/ h in den Kreislauf geführt. Damit ergibt sich eine Fließrate von 15 μl/h im Ablauf sowie von 30 μl/h in der Zellkammer. Die Wirkstoffkonzentration liegt wiederum bei 0 %.
Von 5 h bis 10 h wird wirkstoffbeladenes Medium mit einer Fließrate von 0,15 μl/h über den Zulauf 1 in das System gegeben. Gleichzeitig wird die Fließrate des Grundmediums im Zulauf auf 14,85 μl/h reduziert. Die Fließrate des wieder in den Kreislauf gebrachten Mediums bleibt erhalten. Damit ergibt sich eine Anreicherung der Wirkstoffkonzentration auf 0,02 % in dem die Zellkammer durchfließenden Medium zur Zeit 10 h.
Nach 10 h wird die Zufuhr mit Wirkstoffbeladenem Medium wie in Variante 1 eingestellt und die Fließrate im Zulauf auf 15 μl/h zurück gesetzt. Damit ergibt sich eine langsame Abreicherung der Wirkstoffkonzentration. Der Verlauf der Wirkstoffkonzentration ist in Figur 13 als durchgezogene Linie dargestellt
Variante 3 Beschreibt die Führung der Medien im erfindungsgemäßen System mit maximalem Kreislaufanteil: Bis 5 h wird das gesamte Medium im Kreislauf mit einer Fließrate von 30 μl/h geführt. Die Wirkstoffkonzentration liegt hier ebenfalls bei 0 %. Ab 5 h bis 10 h wird wiederum wirkstoffbeladenes Medium mit einer Fließrate von 0,6 μl/h über den Zulauf 1 in das System gegeben. Dazu muss mit der selben Fließrate Medium über den Ablauf entfernt werden, da das Volumen konstant bleiben muss. Damit ergibt sich eine Anreicherung der Wirkstoffkonzentration auf 0,024 % bis 10 h. Nach 10 h werden die Fließraten wieder auf die Ausgangswerte zurück gesetzt, so dass die Wirkstoffkonzentration bis auf den durch die Zellen aufgenommenen Anteil konstant bleibt. Der Verlauf der Wirkstoffkonzentration ist in Figur 13 als unterbrochene Linie dargestellt.
Beispiel III
Stabilisierung des pH-Wertes
In einer Zellkultur kommt es durch den Metabolismus der Zellen zu einer Ansäuerung. In der erfindungsgemäßen Anordnung kann der pH-Wert durch eine meßwertgesteuerte Begasung des Mediums stabil gehalten werden.
Graphit-Chinhydron-Kompositelektroden zur Messung des pH nach [40] sind in jeder beliebigen Form und Konsistenz herstellbar. Daher lassen sie sich als Ringelektroden besonders gut in den Fluss des Mediums oder in einen Bypass auf kleinstem Volumen einbringen. Weitere Vorteile sind die hervorragende Langzeitstabilität und die Kalibrierfreiheit dieser Elektroden. Damit lässt sich der pH an fast jeder stelle des Systems verlässlich und kontinuierlich erfassen und zu Regel- und Dokumentationszwecken verwenden.
In Figur 14 sind verschiedene Verläufe des pH im Kulturmedium während einiger Versuche mit der Perfusionszellkultur dargestellt.
Die gestrichelte Linie Zeigt den Verlauf des pH ohne Regulierung durch Begasung des Mediums. Der pH steigt nach einiger Zeit irreversibel an, da das Medium ohne Begasung alkalisiert.
Die unterbrochene Linie zeigt einen Anstieg des pH ab ca. h = 70. Um dem entgegenzuwirken wurde ab h = 180 mit erhöhter Begasung gegenreguliert. Der pH kehrte auf sein ursprüngliches Niveau zurück.
Die durchgezogene Linie zeigt einen kontinuierlich regulierten pH-Verlauf. Schwankungen des pH wurde durch eine sofortige Anpassung der Begasung entgegengewirkt.
In der erfindungsgemäßen Perfusionszellkultur kann der pH somit gut einreguliert bzw. durch Änderung des Begasungsregimes bzw. durch Ansäuern oder alkalisieren auf einen gewünschten Wert eingestellt werden. Beispiel IV
Verbesserung der Erfassung von pH-Schwankungen durch sensorgestützte Titration
Da das Medium gepuffert ist, wird eine Alkalisierung bzw. eine Ansäuerung des Mediums erst dann messbar, wenn die Pufferkapazität überschritten ist. Eine exakte Bestimmung der Veränderung der Pufferkapazität bietet die Titration des Mediums mittels Fliessinjek- tionsanalyse nach [39], die sich wegen der geringen Probenvolumina sehr gut in einem Bypass unterbringen lässt.
Eine erfindungsgemäß Sensor gestützte Titration erlaubt eine verbesserte Einstellung und Regulierung der Begasung (z.B. : (besonders vorteilhaft Rückkopplung zur Durchströmung, CO2-Anteil).Dazu geeignete Messorte sind das Vorratsgefäß mit Medium sowie Messzellen direkt vor und hinter den Zellkammern.
Beispiel V
Regelung des Sauerstoffgehaltes
Der Sauerstoffgehalt des Mediums sollte konstant und hinreichend zur Versorgung der Zellen sein. Der Sauerstoffgehalt wird, ähnlich dem pH, durch meßwertgestützte gezielte Begasung eingestellt.
Dafür geeignete Sensoren können als Clarkelektrode zur Bestimmung des Sauerstoffgehaltes bzw. des Sauerstoffverbrauches (über Differenzmessungen) verwendet werden, um diesen wichtigen Stoffwechselparameter zu erfassen.
Ein wichtiges Ziel ist der Vorrang der Zellatmung vor der Gärung bei dem Zellstoffwechsel. Ein Kriterium für die Art des Zellstoffwechsels ist der Quotient aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch. Geeignete enzymatische Sensoren [59, 61], die auf Träger gedruckt werden können erlauben die kontinuierliche Bestimmung der wichtigen Stoffwechselparameter Glukoseverbrauch und Laktatentstehung durch Messungen vor und hinter der Zellkammer. Diese Sensoren lassen sich in kleinvolumigen Durchflusszellen an geeigneten Messstellen, z.B. direkt vor und hinter der Zellkammer, im System unterbringen. Wenn die Zellen keinem Stress oder keinen Wirkstoffen ausgesetzt sind, sollte der Quotient aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch sollte möglichst klein sein. Als anzustrebender Wert haben sich in durchgeführten Versuchen Quotienten zwischen 0,5 und 1,0 erwiesen. Dieser Quotient lässt sich, basierend auf den Messwerten für Glukose- und Laktatkonzentration durch geeignete Einstellung des Sauerstoffgehaltes sowie der Anteile von durchlaufenden und im Kreislauf geführtem Medium rückgekoppelt einstellen. Dazu ist u. A. eine Hinterlegung von verschiedenen Steuerregimes in einer Software zweckmäßig.
Beispiel VI
Erfassung der Biomasse der Zellen
Die Biomasse in der Zellkammer ist über kapazitive, nicht invasive Messungen bestimmbar. Vergleichbar zu einem Kondensator werden 2 oder mehrere Graphit- oder Metallelektroden um die Zellkammer angeordnet. Die Kapazität dieser Anordnung ist einer Messung mit geeigneten physikalischen Methoden zugänglich und hängt von der Konzentration der Biomasse in den Zellkammern ab. Damit lässt sich die Zellzahl ohne weiteren Eingriff auch während des laufenden Versuches zu beliebiger Zeit bestimmen und als Regel- oder Auswerteparameter heranziehen.
Beispiel VII
Erfassung des elektrochemischen Sauerstoffbedarfs
Sensoren aus einer Kompositmasse aus Kupfer und Kupferoxid dienen zur amperometri- schen Bestimmung des Elektrochemischen Sauerstoffbedarfs ESB (elektrochemische Oxi- dation an einer katalytisch aktiven Oberfläche). Der ESB lässt Rückschlüsse auf den Nährstoffgehalt des Mediums sowie auf den Nährstoffverbrauch der Zellen (durch Vergleichsmessungen) zu. Da die Bestimmung des ESB in einem mit NaOH alkalisierten Medium abläuft und wie die Fließinjektionsanalyse mit geringen Probenvolumina auskommt, lässt sich die Messanordnung optimal in einem Bypass zum System anordnen. Der Parameter ESB lässt sich mit dieser Anordnung quasikontinuierlich bestimmen. Beispiel VIII
Regelung der Glucosekonzentration
Die Glukosekonzentration im Medium ist durch das Grundmedium definiert und messbar. Der Glukosegehalt kann auf einen gewünschten Wert an- oder abgereichert werden, indem dem System entweder Glukose zugeführt wird (Erhöhung der Glukosekonzentration) oder ein Teil des Mediums im Kreislauf geführt wird (Abreicherung der Glukosekonzentration aufgrund des Glukoseverbrauches der Zellen).
Beispiel IX
Simulation von Stresssituationen bei Leistungssportlern
Es wird durch Unterversorgung mit Sauerstoff eine Stresssituation simuliert, wie sie z.B. beim Leistungssport auftreten kann. Dazu wird wie im Beispiel V ausgeführt das Verhältnis von Atmung und Gärung bestimmt. Durch gezielte Veränderung des Quotienten lässt sich die gewünschte Stoffwechselsituation einstellen.
Beispiel X Hitzestress
Mit Stress - wie zum Beispiel Hitze - umzugehen, ist für alle Lebewesen eine große Herausforderung. Die Hitzeschock- Antwort ist daher ein evolutionär sehr alter und hochkonservierter Prozess, der in allen Lebewesen vorkommt. Die Expression von Hitzeschockprotein und die Aktivierung von Hitzeschockfaktor sind Teil der Resistenzentwicklung von Zellen gegen die Einwirkung äußerer Stressfaktoren, die über Hitze weit hinaus Bedeutung haben.
Das oben genannte zellbiologische System ist zum Nachweis einer Wirksamkeit beim experimentellen Hitzeschock geeignet. Ein Temperierblock sichert eine gleich bleibende und über die Zellkammern gleiche Temperatur. Der Hitzestress wird durch Temperaturerhöhung auf etwa 42 0C erzeugt. Die Einwirkzeit und die Temperatur können dabei variabel reguliert werden. Ein gutes Beispiel für eine messwertgestützte Regulierung des Einstellparameters Temperatur über den Stoffwechselparameter Glukoseverbrauch liefert Figur 2: Die Temperatur wurde hier kurzeitig auf 42 0C erhöht (ab 5 h). Sobald der Glukoseverbrauch der Zellen aufgrund des Hitzestresses nachließ wurde die Temperatur auf 37 0C zurück reguliert (ab 7,5 h). Anhand der Kurve für den Glukoseverbrauch der Zellen lässt sich eine Erholung der Zellen nach Rückregulierung der Temperatur erkennen: Der Glukoseverbrauch stieg wieder auf den Level vor der Temperaturerhöhung an.
Eine Dauerhafte Erhöhung der Temperatur auf 42 0C (ab 5 h) führte dagegen zum Absterben der Zellen (Figur 3).
Beispiel XI
Stress durch verstärkte Einwirkung freier Radikale
Freie Radikale entstehen natürlicherweise im Rahmen der Zellatmung oder bei Prozessen der Immunabwehr. Freie Radikale können prinzipiell mit allen für die lebende Zelle notwendigen Molekülen reagieren. Infolgedessen kann es zu metabolischen und strukturellen Modifikationen kommen, die unter Umständen zum Zelluntergang führen (aus: Mar- quardt, Hans und Siegfried Schäfer (Hrsg.): Lehrbuch der Toxikologie. 2., Auflage Stuttgart, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, 2004). Um unliebsame Reaktionen, z.B. eine Lipidperoxidation, zu verhindern, muss die Radikalkonzentration begrenzt werden. Euca- ryoten bilden Antioxidantien, die als "Radikalenfänger" wirken. Die Menge der Radikalenfänger, die der Körper bilden kann, ist jedoch begrenzt, so dass immer wieder Gewebe- und Zellschäden durch Radikaleinwirkung auftreten. Faktoren wie höheres Alter, Stress oder Krankheiten erhöhen die Bildung von freien Radikalen, während gleichzeitig die Fähigkeit insbesondere der Säugerzellen abnimmt, selbst Schutzfaktoren zu bilden.
Je höher die Radikalkonzentration im Verhältnis zur Konzentration der Radikalenfänger ist, desto mehr Schäden pro Zeiteinheit treten auf. Diese Schäden summieren sich im Laufe der Jahre und führen dann, Schritt für Schritt, zu immer stärker werdenden Leistungseinbußen und Funktionsverlusten, die unsere Alterung kennzeichnen. Ein hohes Radikalenaufkommen, das vom Organismus über längere Zeiträume nicht mehr kompensiert werden kann, kann zum Ausgangspunkt chronischer Erkrankungen werden. Dies gilt vor allem für Zivilisationskrankheiten wie die koronare Herzkrankheit. Durch Freie Radikale oxidativ modifiziertes LDL-Cholesterin besitzt atherogene und thrombogene Eigenschaften, die für die Entstehung arteriosklerotischer Gefäßwandläsionen und Arterienverschlüssen von maßgeblicher Bedeutung sind.
Für die Erfassung prophylaktischer Wirkungen ist daher die Untersuchung der Einflusses auf den Zellstoffwechsel, unter einer verstärkten Einwirkung von freien Radikalen von großer Bedeutung Im erfindungsgemäßen System ist die Radikalerzeugung mittels Enzymen wie Xanthinpe- roxidase problemlos möglich. Die Konzentration der freien Radikala kann als Summenparameter elektrochemisch erfasst und zur meßwertgestützten Einstellung von Radikalenkonzentration genutzt werden.
Bei vielen in der Kosmetik und als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzten Produkten beruht Auslobung einer Radikalfängerfunktion bisher auf In-vitro-Untersuchungen, die die Verhältnisse an der lebenden Zelle nur sehr begrenzt widerspiegeln. Es ist nach dem Stand der Technik nicht möglich, den Effekt einer Vorbehandlung unter den in-vivo- Verhältnissen ähnlichen Bedingen zu messen, obwohl die zu prüfenden Stoffe vorwiegend prophylaktisch eingesetzt werden sollen.
Mit dem erfindungsgemäßen System ist eine Aussage zur prophylaktischen Wirksamkeit möglich, durch a) Vorbehandlung und/oder Behandlung einer Zellkultur mit dem zu prüfenden Stoff, b) Erzeugung von freien Radikalen nach Abschluss der Vorbehandlung und/oder während der Behandlung und
c) Messung und Vergleich der Schäden, die durch die im Verfahrensschritt b) erzeugten Radikale bei vorbehandelten, behandelten und unbehandelten Zellen erzeugt werden.
Beispiel XII
Automatisierbare Regelungen
Die automatisierbare Regelung eines biologischen Systems erfordert eine Komponente zur Speicherung der von den Sensoren kontinuierlich oder quasikontinuierlich überwachten Parameter. Da für verschiedene biologische Systeme eine Vielzahl verschiedener Parameterfächer für die Regelung eingesetzt werden, ist für die Speicherung der Parameterwerte ein möglichst flexibles Datenmodell vorteilhaft. Mit Topic Maps (ISO/IEC 13250 2003) liegt ein standardisiertes, graphenbasiertes Datenmodell vor (ISO/IEC 13250-2 2006) mit einer standardisierten XML-Syntax vor, (ISO/IEC 13250-3 2007), das die Abbildung beliebiger relationaler Strukturen in Verbindung mit einem hohen Maß an selbstbeschreibender Semantik ermöglicht. Beispiel A Fischfutter
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Testsystems können bei komplexen Anforderungen wie der Herstellung eines für das Aquafarming geeigneten Fischfutters besonders deutlich demonstriert werden. Die Einsatzmöglichkeiten werden deshalb exemplarisch am Beispiel einer solchen Zubereitung demonstriert. Sie sind aber natürlich auf andere komplexen Entwicklungen übertragbar.
Komplexe Anforderungen
Vorteile von Aquakulturen gegenüber traditionellem Fischfang liegen einerseits in niedrigeren Preisen und in dem kontinuierlichen und planbaren Aufkommen. Der Ertrag aus Aquakulturen ist gleichmäßiger und leichter zu prognostizieren, was es Supermärkten erleichtert, die Fische in ihr Angebot zu integrieren. Deshalb ist die Aquakultur ein weltweit stark wachsender Markt; derzeit werden ca. 29 % der Gesamtfischanlandungen durch Produkte aus der Aquakultur gedeckt. Mit dem ständig wachsenden Anteil von Fischfarmen ergibt sich die Notwendigkeit der Entwicklung von neuen Futtermitteln. Die gegenwärtig starke Verwendung von Fischmehl muss schon aus ökologischen Gründen soweit wie möglich eingeschränkt werden. Für die Aquakultur müssen zurzeit etwa dreißig Millionen Tonnen Fisch/Jahr gefangen werden. Zunehmend ist man daran interessiert, den Anteil des Fischmehls im Futter zu senken. Unter anderem auch, weil viele der zu Fischmehl verarbeiteten Fische erhöhte Schwermetall-, PCB- und Dioxin-Werte aufweisen, die das Endprodukt der Nahrungskette belasten.
In unnatürlich großen und dichten Verbänden gehaltene und in Hinblick auf maximale Erträge gezüchtete Fische sind krankheitsanfällig. Die Verwendung von Antibiotika, die auch in der Humanmedizin zum Einsatz kommen, als Nutritiva wurde verboten, da sich humanpathogene Erreger an geringe Antibiotika-Reste, die im Nahrungsmittel Fisch enthalten sind, anpassen und resistent werden können.
Importe von Aquarienfischen sind oft mit Erregern von Fischkrankheiten infiziert bzw. kontaminiert. An die für die Sanierung eingesetzten keimwidrigen Substanzen sind besondere Anforderungen zu stellen, da die bakteriellen Prozesse in den Filteranlagen nicht beeinträchtigt werden dürfen. Makroalgen und Mikroalgen enthalten Wirkstoffe, die fischpathogene Bakterien hemmen können. Als Beispiel seien die antimikrobiell wirksamen Inhaltsstoffe der Gattung Laurencia angeführt. Während Makroalgen direkt als Fischfutter genutzt werden können, werden Mikroalgen ohne eine entsprechende Verarbeitung von den Fischen nur in beschränkten Maß als Futter angenommen.
Mit den Mikroalgen können ungesättigte Fettsäuren zugeführt werden, die auch in Fischölen enthalten sind. Überwiegend werden Mikroalgen in der Aquakultur zur Ernährung von Fischlarven und der als Lebendfutter für die Fische gehaltenen Organismen (Artemia- Nauplien, Rädertierchen, Ruderfußkrebse) genutzt.
Von besonderem Interesse ist Haematococcus pluvialis, eine einzellige Grünalge, die bis zu 5 % ihrer Biomasse das Ketocarotinoid Astaxanthin produzieren kann. Astaxanthin ist ein natürliches Antioxidans und verleiht den damit ernährten Fischen eine erwünschte intensive Rotfärbung.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass folgende Probleme zu lösen sind, um optimierte Futtermittel für die Aquakultur zu entwickeln:
• Bereitstellung von Eiweißen, Lipiden, Kohlehydraten, Vitaminen und Mineralstoffen
• Nutritive Wirkung durch Aktivierung des Zellstoffwechsels bei gleichzeitiger Zuführung von ungesättigten Fettsäuren
• Verminderung von Stressreaktionen
• Verminderung des Anteils von Fischmehl/Fischöl
• Kostengünstige Herstellung eines schwimmfähigen lagerstabilen Fischfutters
• Herstellung bei Temperaturen < 80 0C, um wertvolle Inhaltsstoffe zu erhalten
• Hemmung fischpathogener Bakterien ohne die Abbauleistungen der biologischen Filter zu schädigen
• Vermeidung der Resistenzentwicklung humanpathogener Erreger
Diese komplexe Aufgabe erfordert verschiedene Prüfverfahren. In vitro-Untersuchungen können nur bestimmte Einzelfragen beantworten und berücksichtigen nicht Komplexität der biologischen Reaktion. Tierexperimentelle Prüfungen sind bei der Vielzahl der möglichen Kombinationen zu aufwändig und scheiden daher für Vorversuche aus. Untersuchungen an Zellen berücksichtigen einerseits die Komplexität der biologischen Antwort, sind aber andererseits noch relativ kostengünstig durchzuführen. Um eine Optimierung der Zusammensetzung zu erreichen ist daher die Prüfung möglicher Komponenten auf stoffwechselfördende, stressmindernde und synergistische Effekte in einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bzw. 17 ein wertvolles Hilfsmittel.
Die Untersuchungen werden zweckmäßigerweise in einem abgestimmten Stufenplan bearbeitet.
Prüfstufe 1
Auswahl von Biomassen mit einem hohen Gehalt an Hauptnährstoffen
Es ist bekannt, dass Biomassen aquatischer Organismen wertvolle Inhaltstoffe, insbesondere Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren, enthalten. Es ist deshalb zweckmäßig, als Zumischung zum Fischfutter Biomassen, ausgewählt aus aquatischen Organismen, die mehrfach ungesättigte C16-C22-Fettsäuren, z.B. Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3), Arachidonsäure (C20:4), Eicosapentaensäure (EPA, C20:5) und Docosahexaen- säure (DHA, C22:6) enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Mikroalgen der Gattung Synechocystis, die 18:0 und 18: 1 Fettsäuren sowie hohe Konzentrationen an 16: 1 Fettsäuren enthalten und der Gattungen Lyngbya, Anabaena, Oscillatoria (Lim- nothrix und Planktothrix), die reich an 18:0 bis 18:3 Fettsäuren, insbesondere α- Linolensäure sind und/oder Gemische dieser Mikroalgen auszuwählen.
Prüfstufe 2
Prüfung möglicher Komponenten auf stoffwechselfördende Effekte in einem Verfahren gemäß Anspruch 1
Eine ausreichende Zuführung essentieller Nahrungsbestandteile ohne Stoffwechselstimulierung führt nicht zu einem optimalen nutritiven Effekt. Es war aber bisher nicht bekannt, dass der Stoffwechsel von eukaryotischen Zellen auch durch Biomassen ausgewählter aquatischer Organismen angeregt wird.
Es ist zweckmäßig, den nutritiven Effekt durch gleichzeitige Zuführung von Lipiden, Proteinen, Kohlehydraten, Vitaminen und Mineralstoffen aus Biomassen aquatischen Ursprungs, die eine Verbesserung der Versorgung mit Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren mit einer Stimulierung des Stoffwechsels verbinden, zu verstärken. Die Stimulierung des Stoffwechsels, nachgewiesen mit einer Prüfanordnung gemäß Anspruch 1, ist ein neues kennzeichnendes Merkmal für die Auswahl der Mikroorganismen, die für eine Verwendung als Futterkomponente besonders geeignet sind.
Aufgrund der Ergebnisse der Prüfstufe 2 können stoffwechselaktivierend wirkende Biomassen aquatischen Ursprungs beispielsweise Grünalgen (Chlorophyta) als Futtermittelkomponenten ausgewählt werden (s. Beispiel B: aquatische Biomassen)
Für die Entwicklung von Futterkomponenten für die Aquakultur sind insbesondere bevorzugt, natürliche Biomassen, die den Stoffwechsel stimulieren und hohe Konzentrationen ungesättigter Fettsäuren enthalten.
Prüfstufe 3
Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime
Ein starkes Fischwachstum ist nur möglich, wenn das Wachstum nicht durch Erkrankungen gestört wird. Stoffwechselaktivierend wirkende Biomassen, bevorzugt ausgewählt aus den Gattungen Isochrysis, Clamydomonas, Haematococcus oder Tetraselmis bzw. Kalkalgen (Haptophyta) werden daher in der Prüfstufe 3 als Einzelstoffe oder in Kombinationen auf Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime geprüft (s. Beispiel B: aquatische Biomassen).
Ganz besonders bevorzugt sind natürliche Biomassen, die den Stoffwechsel stimulieren und hohe Konzentrationen ungesättigter Fettsäuren enthalten und die die zusätzlich eine Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime bei gleichzeitiger NichtSchädigung der biologischen Filter aufweisen.
Von Mikroalgenstämmen, ausgewählt aus den Gattungen Lyngbya, Anabaena, Synecho- cystis, Oscillatoria (Limnothrix und Planktothrix) und Nostoc werden bisher unbekannte zyklische Peptide gemäß Formelbild 1 gebildet.
Zyklische Peptide nach Formelbild 1 zeigen überraschenderweise eine antibakterielle Wirkung gegen fischpathogene Keime, ohne die Leistung biologischer Filter in Aquafarmen zu beeinträchtigen. Für diese zyklischen Peptide wird Substanzschutz beantragt.
Es ist deshalb möglich die antibakterielle Wirkung zu erreichen durch
a) Beimischung der gereinigten zyklischen Peptide nach Formelbild 1 oder b) Beimischung eines Methanol/Wasserextraktes von Biomassen , ausgewählt aus den Gattungen Lyngbya, Anabaena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix und Planktothrix) und Nostoc, der zyklischen Peptide nach Formelbild 1 enthält, oder
c) Beimischung einer Fraktion, die durch Aufreinigung des Methanol/Wasser- Extraktes nach b) über Zellulose oder Kieselgel erhalten wurde, oder
d) Verwendung von Mikroalgen, die Inhaltstoffe nach Formelbild 1 enthalten, einzeln oder in Kombination.
Prüfstufe 4
Prüfung möglicher Komponenten auf stressmindernde Effekte in einem Verfahren gemäß Anspruch 1
In unnatürlich großen und dichten Verbänden gehaltene und in Hinblick auf maximale Erträge gezüchtete Fische sind stressanfällig. Es ist deshalb zweckmäßig, dem Futter eine stressmindernde Komponente zuzumischen.
Für die Suche nach stressmindernden Komponenten ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Bei der Untersuchung mit diesem Prüfverfahren sind Biomassen aus Ganoderma pfeifferi als besonders vorteilhaft aufgefallen, da sie Stressminderung mit Stoffwechselstimulierung und antibakterieller Aktivität gegen fischpathogene Keime verbinden (s. Beispiel C: Ganoderma)
Prüfstufe 5
Suche nach optimalen Verarbeitungsformen
Die Biomasse der Mikroalgen-Stämme kann in einer handelsüblichen Mikroalgenkultur gewonnen werden. In einer solchen Kultur fallen die Wertstoffe als eine wässrige bis breiig fließende Biomasse an.
Auch die im Beispiel„Ganoderma" verwendeten pilzlichen Biomassen fallen bei einer Kultivierung des Mycels als wässrige bis breiig fließende Suspensionen an.
Es hat sich als zweckmäßig herausgestellt, diese Suspension mit Hilfe einer speziellen Mineralstoffkombination in eine lagerfähige Form zu überführen (s. Beispiel D: Mineral- Stoffe). Auch bei der Auswahl der Mineralstoffe kann das Prüfverfahren nach Anspruch 1 herangezogen werden.
Schließlich ist das Prüfverfahren nach Anspruch 1 auch geeignet, die fertigen Formulierungen zu untersuchen.
Prüfstufe 6
Suche nach möglichst kostengünstigen Futterkomponenten
Rückstände von Arzneistoff liefernden Pflanzen fallen in größeren Mengen an und sind daher preiswert. Bei der Suche nach optimalen Verwertungsmöglichkeiten ist das Prüfverfahren nach Anspruch 1 eine große Hilfe (s. Beispiel E: pflanzliche Biomassen). Die beobachteten Effekte lassen sich ohne biologische Prüfungen an der Zelle nicht vorhersagen. Die Prüfung der Vielzahl der möglichen Kombinationen im Tierexperiment ist zu aufwändig.
Nachdem diese Prüfstufen durchlaufen wurden, wird die komplexe Aufgabenstellung durch eine Futterzubereitung, umfassend
a) Biomassen aquatischer Organismen mit einem hohen Anteil an Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren mit stoffwechselaktivierender Wirkung
b) bisher unbekannte zyklische Peptide nach Formelbild 1 als Reinsubstanz oder enthalten in Biomassen von Mikroalgen oder im Methanol/Wasserextrakt aus den genannten Biomassen oder in einer nach Aufreinigung des Methanol/Wasserextraktes über Zellulose angereicherten Fraktion und/oder
c) einen Tripel-Smectit-Mineralverbund und/oder
d) pilzliche Biomassen oder Pilzextrakte mit Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime und/oder immunstimmulierender Wirkung in besonderer Weise bevorzugt von Gano- derma pfeifferi und/ oder Saccharomyces spec und/oder Klυyveromyces spec und/oder e) Biomasse aus arzneistoffliefernden Pflanzen nach Abtrennung der als Arzneimittel verwendeten Inhaltstoffe, in besonderer Weise vorteilhaft Biomasse von Artemisia annua nach Abtrennung der Peroxide
gelöst.
Es werden Formulierungen erhalten, bei denen ein nutritiver Effekt mit einer Prophylaxe gegen Fischkrankheiten verbunden wird. In den Kombinationen sind praktisch alle Mischungsverhältnisse der Komponenten möglich, wobei vor die Auswahl der einzelnen Mikroalgen/Grün- bzw. Kalkalgen und/oder das Verhältnis aquatischer zur pilzlicher Biomasse und/oder das Verhältnis Biomasse zu natürlichem Mineralstoff variieren kann. Eine Auswahl der am besten geeigneten Mischungsverhältnisse ist mit einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 möglich.
Durch die Prüfung nach mit einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 werden optimale Kombinationen für verschiedene Anwendungen erhalten. Durch die für die in einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 ermittelte optimale Kombination für spezielle Anwendungsziele können beispielsweise in der Fischzucht Phasenfütterungskonzepte verwirklicht werden, in dem die Zusammensetzung an die einzelnen Phasen der Fischaufzucht angepasst wird.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann mit üblichen Fischfutterbestandteilen gemischt werden. Besonders bevorzugt sind Getreide und/oder Soja und/oder Erbsenprotein und/oder Luzerne und/oder Hefen, und/oder Calziumcaseinat und/oder Fischmehl und/oder Weich- und Krebstiere. Während die eingesetzten Pflanzen vorwiegend Lipide mit relativ kurzkettigen Fettsäuren (C12-C18) und einer geringen Anzahl von Doppelbindungen (bis C18:3) enthalten, wird in der Kombination ein ausgeglichenes Lipidspektrum erreicht.
Bei der Verfütterung der erfindungsgemäßen Zubereitung wird ein nutritiver Effekt mit einer Prophylaxe oder Therapie von Fischkrankheiten verbunden.
Beispiel B
Aquatische Biomassen und darin enthaltene bisher unbekannte Wirkstoffe
Es ist bekannt, dass Biomassen aquatischer Organismen wertvolle Inhaltstoffe, insbesondere Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren, enthalten. Es war aber bisher nicht bekannt, dass der Stoffwechsel von eukaryotischen Zellen auch durch Biomassen ausgewählter aquatischer Organismen angeregt wird. Biomassen, ausgewählt aus aquatischen Organismen, die mehrfach ungesättigte C16-C22-Fettsäuren, z.B. Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3), Arachidonsäure (C20:4), Eicosapentaensäure (EPA, C20:5) und Docosa- hexaensäure (DHA, C22:6) enthalten und gleichzeitig stoffwechselstimulierend wirken, versprechen daher besondere Vorteile. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Mikroalgen der Gattung Synechocystis, die 18:0 und 18:1 Fettsäuren sowie hohe Konzentrationen an 16: 1 Fettsäuren enthalten und der Gattungen Lyngbya, Anabaena, Oscil- latoria (Limnothrix und Planktothrix), die reich an 18:0 bis 18:3 Fettsäuren, insbesondere α-Linolensäure sind und/oder Gemische dieser Mikroalgen ausgewählt.
Figuren 4 und 5 zeigen den Glukoseverbrauch % als Funktion der Zeit nach Beginn der Wirkstoffzumischung.
Insbesondere bevorzugt sind den Stoffwechsel stimulierende und/oder stressmindernd wirkende Mikroalgen mit einer hohen Konzentrationen ungesättigter Fettsäuren, die zusätzlich die erfindungsgemäßen zyklischen Peptide enthalten und/oder Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime bei gleichzeitiger NichtSchädigung der biologischen Filter aufweisen.
Durch eine ausgewogene Mischung von Biomassen aquatischer Organismen wird eine breite Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime erreicht (Tab. 1)
Tab. 1
Wirksamkeit gegen Erreger von Fischkrankheiten (Methodik s. Beispiel Gano- derma)
(Doppelbestimmung, Angabe der Hemmhofdurchmesser nach Subtraktion des Plättchendurchmessers) + + kein klarer Hemmhof, aber reduziertes Wachstum
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Zyklische Peptide nach Formelbild 1 zeigen überraschenderweise eine antibakterielle Wirkung gegen fischpathogene Keime, ohne die Leistung biologischer Filter in Aquafarmen zu beeinträchtigen. Für diese zyklischen Peptide wird Substanzschutz beantragt.
Formelbild 1
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R2=C12H14NO3 Beispiel C Ganoderma pfeifferi
Inhaltsstoffe des Baumpilzes Ganoderma pfeifferi zeigen überraschenderweise eine starke Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime. Die starke Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime - die nicht mit einem jetzt verbotenem antibiotikum sonderm mit einem Naturstoff erreicht wird - ist für den Einsatz im Fischfutter von besonderer Bedeutung
Methodik der antimikrobiellen Untersuchungen:
Fischbakteriosen stellen ein besonderes wirtschaftliches und ökologisch relevantes Problem dar. Die Untersuchungen erfolgten mit gramnegativen Bakterien, die Fischkrankheiten wie Seewasser-Columnaris, chronische Bauchwassersucht, Furunkulose, Fleckenseuche, Flossenfäule, Rotmaulseuche oder die Rote Pest auslösen. Die Anzucht der vom Staatlichen Fischseuchenbekämfungsdienst Niedersachsen und Fischgesundheitsdienst zur Verfügung gestellten Bakterien erfolgte auf Trypticase-Soy-Agar (Sigma Chemical Co., St. Lois, USA). Die Prüfung der Extrakte aus der Biomasse, der aufgereinigten Fraktionen und der Wirkstoffe erfolgte im Agardiffusionstest unter Verwendung von mit 2 mg Extrakt beladenen Testblättchen. Die fischpathogenen Bakterien wurden in TSA-Agar eingearbeitet und dieser in Petrischalen ausgegossen. Die mit den Mikroalgenextrakten (2mg/Plättchen) beimpften Plättchen wurden auf die Oberfläche des Agars aufgebracht, 4h bei 8°C vorinkubiert und anschließend 24h bei 26°C bebrütet. Als Positivkontrollen wurden jeweifs 50μg/Plättchen Ampicillin, Nystatin, OTC und Gentamycin benutzt, die eine deutliche Hemmhofbildung um die Plättchen bewirkten.
Besonders gegen die Aeromonas-Arten zeigte sich eine antibakterielle Wirkung. (Tab. 2) . Da sich die antibakterielle Wirksamkeit bei verschiedenen Extrakten nachweisen lässt, ist die Verwendung der gesamten Biomasse besonders zweckmäßig.
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Beim Einsatz von Biomassen aus Ganoderma pfeifferi als nutritive Fütterungskomponente kann die Biomasse auf Grund des derzeit noch hohen Preises nur in relativ geringen Konzentrationen eingesetzt werden. Dabei wirken einzelne Inhaltsstoffe der Ganoderma- Biomasse in nur geringen Konzentrationen, dafür aber über eine lange Zeit ein. Um einen stoffwechselstimulierenden Effekt zu überprüfen, musste ein experimentelles Modell geschaffen werden, dass eine stabile Stoffwechselsituation über eine lange Einwirkungszeit gewährleistet und damit die Prüfung stoffwechselstimulierenden Effekte ermöglicht. Das ist mit der Prüfanordnung gemäß Anspruch 1 gelungen.
Figur 6 zeigt die Stimulierung des Stoffwechsels durch G. pfeifferi.
Ein Zusatz von Ganoderma-pfeifferi in Form einer Mikro-und Nanopartikel-Suspension (G.pfeiferi-Maresome) oder in Form von Extrakten bewirkt bei einer Prüfung mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 eine dosisabhängige Stimulierung des Zellstoffwechsels. Die Kombination von Stoffwechselstimulierung bei Eukaryonten und Wachstumshemmung bei Prokaryonten ist deshalb ein kennzeichnendes Merkmal von G. pfeifferi und für die Anwendung als Fischfutter-Komponente von besonderer Bedeutung. Von besonderem Interesse ist die stressmindernde Wirkung. Diese stressmindernde Wirkung wurde an einem Hitzestressmodell nach Anspruch 17 nachgewiesen. Mit Stress - wie zum Beispiel Hitze - umzugehen, ist für alle Lebewesen eine große Herausforderung. Die Hitzeschock- Antwort ist daher ein evolutionär sehr alter und hochkonservierter Pro- zess, der in allen Lebewesen vorkommt. Die Expression von Hitzeschockprotein und die Aktivierung von Hitzeschockfaktor sind Teil der Resistenzentwicklung von Zellen gegen die Einwirkung äußerer Stressfaktoren, die über Hitze weit hinaus Bedeutung haben. Zum Nachweis einer Wirksamkeit beim experimentellen Hitzeschock wurde die Methodik nach Anspruch 1 variiert.
Der Temperierblock sichert eine gleich bleibende und über die Zellkammern gleiche Temperatur.
Nach einer Einlaufperiode (Phase I) dient die Phase II zur Ermittlung des Wirkstoffeinflusses auf den Zellstoffwechsel bei Körpertemperatur. Bei Phase III wurde der Hitze- stress wurde durch Temperaturerhöhung auf 39,3-41,3 0C erzeugt.
Nach prophylaktischer Gabe von Ganoderma pfeifferi ist die Stoffwechselaktivität auch in der Stressphase um 10 % gegenüber der Kontrolle erhöht. Auch in Kombinationen von G. pfeifferi mit Artemisia annua (nach Entfernung des Arteminisins) ist dieser stressmindernde Effekt nachweisbar (s. Beispiel E).
Beispiel D Mineralstoffe
Die Biomasse von Mikroalgen-Stämme, ausgewählt aus den Gattungen Lyngbya, Ana- baena, Synechocystis, Oscillatoria (Limnothrix und Planktothrix) und Nostoc kann in einer handelsüblichen Mikroalgenkultur gewonnen werden
In einer solchen Kultur fallen die Wertstoffe als eine wässrige bis breiig fließende Biomasse an.
Auch die im Beispiel„Ganoderma" verwendeten pilzlichen Biomassen fallen bei einer Kultivierung des Mycels als wässrige bis breiig fließenden Suspensionen an, die gegebenenfalls durch Seperatoren konzentriert werden können. Um aus solchen verdünnten Biomassesuspensionen eine lagerfähige Zubereitung herzustellen, sind Mineralverbϋnde zweckmäßig. Es ist erfinderisch, Mineralverbünde auszuwählen, die bei der Prüfung in einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 eine Stoffwechselstimulierung bewirkt haben.
Das ist beispielsweise bei mit Thiocyanat dotierten Mixed-Layer-Tonmineralen nach PCT/EP 2008/055013 der Fall.
Eine Dotierung mit Thiocyanat steigert überraschenderweise den Zellstoffwechsel, wobei das Optimum mit 10μmol/l erreicht wird.
Figur 7 zeigt den Glucoseverbrauch in % als Funktion der Thiocyanatkonzentration.
Für die Überführung der aquatischen und pilzlichen Biomasse hat sich ein Tripel-Smectit- Mineralverbund, der durch struktur- und substanzschonendes Vermählen von aus fossilem Diatomeenschlamm entstandenem Sedimentgestein mit Kalk und Bentonit bzw. mit Thiocyanat dotierten Mixed-Layer-Tonmineralen nach PCT/EP 2008/055013 hergestellt wird. Die Bedingungen müssen so gewählt werden, dass die Montmorillonite ihre Adsorptionskraft möglichst ganz oder zumindest teilweise erhalten. Maßgebend für die erfindungsgemäße Verwendung ist ein Anteil an Montmorilloniten mit teilweise amorpher Struktur von 10 bis 20 %. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Mineralverbund mit einem amorphen Anteil von SiO2 von 60% und einem Montmorillonitanteil von etwa 16% erwiesen.
Durch das struktur- und substanzschonende Vermalen entsteht ein Mineralverbund mit besonders fester Bindung und es entstehen Aggregate mit einer besonders hohen Adsorptionskraft und hohem Wasseraufnahmevermögen.
Zur Herstellung eines lagerstabilen Zwischenproduktes wird eine Suspension der Biomasse von einzelnen Mikroalgen oder von Mikroalgenkombinationen bzw. die Suspension der pilzlichen Biomasse mit dem wie oben beschrieben hergestellten Tripel-Smectit- Mineralverbund versetzt, bis eine homogene noch feuchte Masse (Feuchtigkeitsgehalt < 15 %) entsteht. Durch das Mischsystem wird eine Eiweißstabilisierung erreicht. Durch die Vermischung mit dem stark wasseraufnehmenden Tripel-Smectit-Mineralverbund kann die Herstellung eines lagerstabilen Zwischenproduktes bei Temperaturen < 80 0C erfolgen, um wertvolle Inhaltsstoffe der Biomassen zu erhalten. In dieser Zubereitung befin- det sich Kieselsäure in feinstverteilter bioaktiver Form. Das hat eine große Adsorptionsfläche zur Folge.
Durch die erfindungsgemäße Zubereitung wird unter besonders schonenden Bedingungen aus als verdünnte Suspension anfallenden Mikroalgen und/oder pilzlicher Biomasse eine lagerfähige Formulierung hergestellt.
Die Mischung aus Tripel-Smectit-Mineralverbund und Ganoderma pfeifferi kann mit einer Suspension der Biomasse von einzelnen Mikroalgen oder von Mikroalgenkombinationen versetzt und weiter verarbeitet werden.
In einer anderen Ausführungsform wird die Algenbiomasse zuerst mit der Biomasse von Ganoderma pfeifferi homogenisiert und dann mit dem Tripel-Smectit-Mineralverbund vermischt.
Die in diesen Zubereitungen enthaltene Kieselsäure in feinstverteilter Form begünstigt die Aufnahme von bioaktivem Silizium.
Beispiel E
Suche nach synergistischen Kombinationen aus pflanzlichen Biomassen
Die Biomasse aus arzneistoffliefernden Pflanzen enthält nach Abtrennung der als Arzneimittel verwendeten Inhaltstoffe Kohlenhydrate, Lipide und Einweiße, die als Futtermittel genutzt werden können. Durch die Verwendung der in großen Mengen anfallenden Reststoffe wird ein besonderer ökonomischer Vorteil erzielt.
Beispielsweise fallen bei der pharmazeutischen Produktion von Artemisinin- Präparaten nach Abtrennung der Peroxide große Mengen der restlichen Biomasse von Artemisia an- nua als Zwischenprodukt an.
Inhaltsstoffe von Artemisia annua beeinflussen als Einzelstoff aber den Zellstoffwechsel von Eukaryonten eher negativ.
Figur 8 zeigt den Glucoseverbrauch in % als Funktion der Zeit nach der Wirkstoffzumi- schung.
Die in Artemisia annua enthaltenen Gewürz- und Bitterstoffe wirken in niedrigen Konzentrationen appetitanregend und verdauungsfördernd, in höheren Mengen werden sie von den Fischen nicht toleriert. Die aus Rückständen der Arzneimittelproduktion stammende pflanzliche Biomasse muss daher mit anderen Biomassen kombiniert werden. Das Prüfverfahren nach Anspruch 1 unterstützt dabei das Auswahlverfahren. Es werden Biomassen ausgewählt, die den Stoffwechsel bei einer Prüfung nach Anspruch 1 stimulieren. Das können aquatische Biomassen (s. Beispiel aquatische Biomassen), pilzliche Biomassen (s. Beispiel Ganoderma) und/oder mineralische Naturstoffe (siehe Beispiel Mineralische Naturstoffe) sein.
Von besonderem Vorteil ist es Biomassen auszuwählen, die Stoffwechselstimulierung und antimikrobielle Wirkung gegen fischpathogene Keime vereinigen (s. Beispiele aquatische Biomassen und Ganoderma).
Aus dem Fruchtkörper und dem Mycel von Ganoderma-Arten stammende Wirkstoffe ergänzen die Wirkung der Inhaltstoffe von Artemisia annua als Radikalfänger. Zusätze zum Fischfutter auf der Basis von Ganoderma pfeifferi, die gegen fischpathogene Bakterien wirksam sind und gleichzeitig den Zellstoffwechsel stimulieren, sind bisher nicht bekannt.
Völlig überraschend hat sich bei der Untersuchung mit einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 gezeigt, dass die üblicherweise in Nahrungsergänzungsmitteln eingesetzte Art Ganoderma lucidum sogar zu einer Verminderung des Glucoseverbrauchs und bei Stress zu einem vorzeitigen Absterben der Zellen führt. In Mischungen mit A. annua wird die Hemmung des Stoffwechsels durch A. annua durch G. lucidum noch verstärkt.
Das Prüfverfahren nach Anspruch 1 kann also dazu genutzt werden, aus Vertretern einer Gattung - hier im Beispiel der Gattung Ganoderma - die am besten geeignete Art auszusuchen.
Figur 9 zeigt den Glucoseverbrauch in % als Funktion der Zeit nach der Wirkstoffzumi- schung.
Überraschenderweise wurde gezeigt, dass bei der Kombination mit Artemisia annua (nach Entfernung des Arteminisins) mit Ganoderma pfeifferi ein synergistischer Effekt eintritt.
Es wird eine noch stärker stoffwechselfördende Wirkung als bei G. pfeifferi allein beobachtet. Das vorzeitige Absterben bei Stress wird verzögert. Figur 10 zeigt den Glucoseverbrauch in % als Funktion der Zeit nach der Wirkstoffzumi- schung.
Dieser Effekt wird auch erreicht, wenn die Biomasse von Ganoderma pfeifferi mit wässri- gen Extrakten von Artemisia annua (gewonnen nach Entfernung des Arteminisins) kombiniert wird.
Figuren 11 zeigt den Glucoseverbrauch in % als Funktion der Zeit nach der Wirkstoffzu- mischung.
Auf Grund dieser mit einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 erzielten Ergebnisse ist es erfinderisch Biomassen von Ganoderma pfeifferi mit Rückständen von arzneistoffliefern- den Pflanzen, die nach Entfernung des Arzneistoffes anfallen, zu kombinieren.
Ein ebenfalls völlig überraschendes Ergebnis der Prüfung mit dem Verfahren nach Anspruch 1 ist, dass mit der Kombination aus A. annua und G. pfeifferi eine stressmindernde Wirkung erreicht wird. Diese stressmindernde Wirkung wurde an einem Hitzestressmodell nachgewiesen. Mit Stress - wie zum Beispiel Hitze - umzugehen, ist für alle Lebewesen eine große Herausforderung. Die Hitzeschock-Antwort ist daher ein evolutionär sehr alter und hochkonservierter Prozess, der in allen Lebewesen vorkommt. Die Expression von Hitzeschockprotein und die Aktivierung von Hitzeschockfaktor sind Teil der Resistenzentwicklung von Zellen gegen die Einwirkung äußerer Stressfaktoren, die über Hitze weit hinaus Bedeutung haben.
Zum Nachweis einer Wirksamkeit beim experimentellen Hitzeschock wurde die Methodik nach Anspruch 1 variiert.
Der Temperierblock sichert eine gleich bleibende und über die Zellkammern gleiche Temperatur.
Nach einer Einlaufperiode (Phase I) dient die Phase II zur Ermittlung des Wirkstoffeinflusses auf den Zellstoffwechsel bei Körpertemperatur. Bei Phase III wurde der Hitze- stress wurde durch Temperaturerhöhung auf 39,3-41,3 0C erzeugt.
In Figur 12 ist der Glukoseverbrauch dargestellt: Gruppe 1 : "100 % A. annua.", 2 % Gruppe 2: "75 % A.annua : 25 % G.pfeifferi." = 2,0 %
Gruppe 3: "50 % A.annua. : 50 % G.pfeifferi." = 2,0 %
Gruppe 4: "25 % A.annua. : 75 % G.pfeifferi." = 2,0 %.
Gruppe 5: "100 % G.pfeifferi." = 2,0 %
Gruppe 6: -, Kontrollgruppe ohne Wirkstoff
Nur bei der Gruppe 4 "25 % A.annua. : 75 % G.pfeifferi." und bei G. pfeifferi allein wurde eine Stressminderung beobachtet. Das ist besonders überraschend, weil A. annua allein auch bei dieser Versuchsanordnung einen eher negativen Effekt hat.
In dieser Kombination wird zusätzlich die Wirksamkeit von G. pfeifferi gegen fischpatho- gene Keime genutzt (s. Beispiel Ganoderma)
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von biologischen Langzeiteffekten in Zellen, bei dem a) in einer Durchflusskultur der zu untersuchenden Zellen die Durchflussbedingungen so einstellt werden, dass über einen gewünschten Zeitraum die Stoffwechselaktivität der Zellen praktisch unter in-vivo-ähnlichen Bedingungen abläuft, so dass ein Quotient aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch von 0,3 bis 1,5 erreicht wird, und der pH-Wert durch ein Puffersystem und eine meßwertgesteuerte Begasung im Bereich von 7,4 bis 7,75 konstant gehalten wird,
b) die Zellen in der Durchflusskultur über einen gewünschten Zeitraum der Einwirkung mindestens eines Reizes aussetzt werden und der Einfluss des Reizes auf mindestens ein Indikator-Stoffwechselprodukt der Zellen und/oder auf den Nährstoffverbrauch der Zellen bestimmt wird,
c) bei einem in hoher Konzentration gebildeten Indikator-Stoffwechselprodukt die Durchflussbedingungen so einstellt werden, dass die in-vivo-ähnlichen Bedingungen mit einem Quotienten aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch von 0,3 bis 1,5 weitest- gehend beibehalten werden, oder
bei einem in geringer Konzentration gebildeten Indikator-Stoffwechselprodukt die Durchflussbedingungen so einstellt werden, dass das Indikator-Stoffwechselprodukt unter wei- testgehender Beibehaltung der in-vivo-ähnlichen-Bedingungen mit einem Quotienten aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch von 0,3 bis 1,5 auf eine messbare Konzentration angereichert wird,
und
d) das Konzentrationsprofil des gebildeten Indikator-Stoffwechselprodukts und/oder der Nährstoffverbrauch über einen geeigneten Zeitraum zum Nachweis eines biologischen Langzeiteffekts des Reizes bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eukaryotische Zellen verwendet werden.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Stufe a) ein Quotient aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch von 0,5 bis 1,0 erreicht wird.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Stufe a) eine Ausschüttung von ansäuernden oder alkalisierenden Stoffwechselprodukten durch die Zelle durch eine sensorgesteuerte Titration in einem Bypass erfasst wird, um in dem gepufferten System eine Gegenregulation einzuleiten, bevor die Pufferkapazität überschritten ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Einstellung der Durchflussbedingungen die Steuerung der Zufuhr von frischem Nährmedium mit einer geeigneten Konzentration an Nährstoffen und gelöstem Sauerstoff und der Abführung von verbrauchtem Nährmedium umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Stufe a) die Stoffwechselaktivität der Zellen regelmäßig in geeigneten Intervallen, quasikontinuierlich oder kontinuierlich bestimmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität der Zellen ein Parameter gemessen wird, der aus der aus dem folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Nährstoffverbrauch, Sauerstoffverbrauch, Metabolitenbildung, pH- Wert und/oder Pufferkapazität des Nährmediums.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Stufe b) die Zellen der Einwirkung eines physikalischen, biologischen oder chemischen Reizes ausgesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der physikalische Reiz durch Temperatureinwirkung oder Bestrahlung mit Teilchen oder elektromagnetischer Wellen geeigneter Energie erzeugt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der biologische Reiz durch Viren oder deren Bestandteile oder durch Bakterien- oder Mykotoxine erzeugt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der chemische Reiz durch toxische, biologisch aktive, pharmazeutisch oder kosmetisch wirksame Stoffe erzeugt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 11, wobei der physikalische oder chemische Reiz auf der Bildung von freien Radikalen beruht.
13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in Stufe b) die Zellen der Einwirkung von mindestens zwei Reizen ausgesetzt werden, die zeitlich aufeinander folgend oder gleichzeitig erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Stufe b) die Zellen zuerst über einen geeigneten Zeitraum der Einwirkung eines zu prüfenden prophylaktisch wirkenden Stoffes und dann über einen geeigneten Zeitraum der Einwirkung eines Reizes ausgesetzt werden, um die prophylaktische Wirkung und die Langzeitwirkung von Anti- Aging-Mitteln zu testen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Reiz durch einen Radikalbildner erzeugt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei:
a) die Stoffwechselparameter kontinuierlich überwacht und ausgewertet werden und entweder
b) zur manuellen Steuerung des Systems verwendet werden oder
c) zur Steuerung systemintegrierter, halbautomatischer oder automatischer Regelkreise dienen oder
d) zur vollautomatischen Steuerung des Systems genutzt werden und/oder e) die gewonnenen Daten und Bedingungen zwecks Reproduktion im System oder extern gespeichert werden und bei Bedarf abgerufen werden können und/oder
f) das System dabei durch eine gegebenenfalls lernfähige Software gesteuert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die vollautomatische Steuerung elektronisch oder prozessorgestützt erfolgt.
18. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1, aufweisend: a) eine temperierbare Durchflusszelle mit
b) einem Zulauf für frisches Nährmedium und einem Ablauf für verbrauchtes Nährmedium und Zellstoffwechselprodukte sowie einem oder mehreren Zuläufen für Reagenzien und/oder Wirkstoffe und/oder Substrate und/oder andere Medien,
c) Pumpen, Anschlüsse und Ventile, die es gestatten, den Durchfluss des Nährmediums zu steuern und vollständig, partiell oder nicht in einem Kreislauf zu führen, d) Durchflusszellen und Titrationssysteme mit Sensoren zur Bestimmung prozessrelevanter Messgrößen am Eingang und/oder Ausgang des Systems,
e) gegebenenfalls weitere Sensoren in der direkten Zellumgebung,
f) eine Steuer- und Regelungseinrichtung zur kontinuierlichen Änderung der Durchflussbedingungen, ausgehend von einer stationären Kultur der Zellen zu einer Durchflusskultur, wobei die zentrale Regelgröße der von der biologischen Reaktion abhängige Fluss in die Durchflusszelle ist und die Regelung wahlweise manuell und/oder automatisch und/oder programmgesteuert erfolgt,
g) eine Steuer- und Regelungseinrichtung, die die Zufuhr von Reagenzien, Wirkstoffen und Substraten und die Fließrate in aufeinander abgestimmten Verhältnissen regelt, wobei die Regelung wahlweise manuell und/oder automatisch und/oder programmgesteuert erfolgt.
19. Funktionale Nutritive, die unter Naturstoffen ausgewählt werden, die den Stoffwechsel von eukaryotischen Zellen in einem Verfahren nach Anspruch 1 fördern.
20. Funktionale Nutritiva nach Anspruch 19, wobei die optimale Zusammensetzung der Naturstoffe durch den Nachweis synergistischer Effekte durch ein Verfahren nach Anspruch 1 ermittelt wird.
21. Funktionale Nutritiva nach Anspruch 19, wobei die Naturstoffe in einem Verfahren nach Anspruch 1 Stressreize vermindern.
22. Funktionale Nutritiva nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Naturstoffe unter pflanzlichen, pilzlichen oder aquatischen Biomassen ausgewählt werden.
23. Funktionale Nutritiva nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei die Naturstoffe eine Kombination sind von:
a) Biomassen aquatischer Organismen mit einem hohen Anteil an Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren mit stoffwechselaktivierender Wirkung,
b) bisher unbekannten zyklischen Peptiden nach Formelbild 1
Figure imgf000061_0001
R2=C12H14NO3 als Reinsubstanz oder enthalten in Biomassen von Mikroalgen oder im Methanol/Wasserextrakt aus den genannten Biomassen oder in einer nach Aufreinigung des Methanol/Wasserextraktes über Zellulose angereicherten Fraktion und/oder c) pilzlichen Biomassen oder Pilzextrakte mit Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime und/oder immun- und stoffwechselstimmulierender Wirkung und/oder
d) Biomassen aus arzneistoffliefernden Pflanzen nach Abtrennung der als Arzneimittel verwendeten Inhaltstoffe sowie gegebenenfalls
e) einem Tripel-Smectit-Mineralverbund sowie gegebenenfalls weiteren Wirk- und Zusatzstoffen.
24. Funktionale Nutritiva nach Anspruch 23, wobei die Biomassen aquatischer Organismen mit einem hohen Anteil an Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren stressmindernd wirken.
25. Funktionale Nutritiva nach Anspruch 23, wobei die pilzlichen Extrakte oder Biomassen von Ganoderma pfeifferi stammen und Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime aufweisen.
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