WO2011000572A4 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von biologischen langzeiteffekten in zellen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung und Regelung zellbasierter biologischer Systeme zum Nachweis von biologischen Langzeiteffekten. Untersuchen lassen sich damit unter anderem Stress- und Alterungsfaktoren sowie die Wirksamkeit von prophylaktischen Behandlungen.
Claims
1. Verfahren zum Nachweis von biologischen Langzeiteffekten in Zellen, bei dem
a) die Bedingungen in einer Zellkammer ausgehend von einer stationären Zellkultur bis hin zu einer reinen Durchflusszellkultur (Perfusionszellkultur) stufenlos variiert werden,
b) die Perfusionsbedingungen (Grad der Perfusion) dadurch variiert werden, dass entweder das gesamte Nährmedium im Kreislauf (Stationäre Kultur) oder einTeil des Nährmediums im Kreislauf und ein Teil im linearen Durchlauf (Zwischenstufe) oder das Nährmedium nur im linearen Durchlauf (Perfusion) geführt wird
c) die Perfusionsbedingungen durch Variation der Fließrate sowohl im Kreislauf als auch im linearen Durchlauf angepasst werden können
d) der Übergang von einer stationären Kultur zu einer Perfusionszellkultur bzw. der Grad der Perfusion von Messsignalen gesteuert wird, die am Eingang und/oder Ausgang* der Zellkammer und/oder in der Zellumgebung und/oder in geeignet platzierten Bypässen mittels Sensoren nicht invasiv kontinuierlich und/oder quasikontinuierlich, d.h. in regelmäßigen Abständen, erhoben werden
e) die mittels Sensoren kontinuierlich oder quasikontinuierlich erhobenen Daten zur manuellen Steuerung des Systems verwendet werden oder zur Steuerung systemintegrierter, halbautomatischer und automatischer Regelkreise dienen oder zur vollautomatischen, z. B. elektronischen oder Prozessor gestützten Steuerung des Systems genutzt werden,
f) durch kontinuierliche oder quasikontinuierliche Messung des Verbrauchs von Nährstoffen und der Entstehung von Metaboliten die Versuchsbedingungen so eingestellt werden, dass über einen gewünschten Zeitraum die Stoffwechselaktivität der Zellen praktisch unter in-vivo-ähnlichen Bedingungen abläuft, so dass z.B.: ein Quotient aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch von 0,3 bis 1,5 erreicht wird oder der pH-Wert auch beim Übergang von einer stationären Kultur zu einer Perfusionszellkultur und umgekehrt durch ein Puffersystem und eine meßwertgesteuerte Begasung im Bereich von 7,4 bis 7,75 konstant gehalten wird, oder ein Glukoseverbrauch von um 1,0 μmol/h eingestellt wird
g) die Zellen in der Zellkultur über einen gewünschten Zeitraum der Einwirkung eines den Zellstoffwechsel fördernden oder hemmenden chemischen Stoffes, insbesondere toxischen, biologisch aktiven, pharmazeutisch oder kosmetisch wirksamen Stoffen, ausgesetzt werden und die biologische Aktivität dieses Stoffes durch Bestimmung von mindestens einem Indikator-Stoffwechselprodukt der Zellen und/oder durch den Nährstoffverbrauch der Zellen charakterisiert wird,
h) die den Übergang von einer stationären zu einer Perfusionszellkultur bedingenden Durchflussbedingungen so verändert werden, so dass entweder bei einem in hoher Konzentration gebildeten Indikator-Stoffwechselprodukt die in-vivo-ähnlichen Bedingungen (Charakterisiert z.B.: durch einen Quotienten aus Laktatentstehung und Glukoseverbrauch von 0,3 bis 1 ,5, einen pH zwischen 7,4 und 7,75 und/oder durch einen Glukoseverbrauch von etwa 1,0 μmol/h) weitestgehend beibehalten werden, oder bei einem in geringer Konzentration gebildeten Indikator- Stoffwechselprodukt die Durchflussbedingungen so einstellt werden, dass das Indikator-Stoffwechselprodukt auf eine messbare Konzentration angereichert wird, i) das Konzentrationsprofil des gebildeten Indikator-Stoffwechselprodukts und/oder der Nährstoffverbrauch über einen geeigneten Zeitraum zum Nachweis eines biologischen Langzeiteffekts des Reizes bestimmt wird.
j) die Zellen in der Zellkultur über einen gewünschten Zeitraum der Einwirkung von physikalischen Stressoren ausgesetzt werden, um eine Stresssituation zu simulieren, und die biologische Wirksamkeit dieser Stressoren durch Bestimmung von mindestens einen Indikator-Stoffwechselprodukt der Zellen und/oder durch den Nährstoffverbrauch der Zellen charakterisiert wird, wobei als physikalische Stressoren vorwiegend Temperaturen < 42 0C (Hitzestreß) oder Strahlung mit Teilchen oder elektromagnetischer Wellen geeigneter Energie (Stress durch verstärkte Radikalbildung) genutzt werden,
k) die Einwirkung chemischer Stoffe und die Erzeugung der Stresssituation zeitgleich oder zeitlich aufeinander folgen, so dass entweder der direkte Einfluss auf die Stresssituation oder eine prophylaktische Wirksamkeit der chemischen Stoffe erfasst werden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei eukaryotische Zellen verwendet werden.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Ausschüttung von ansäuernden oder alkalisierenden Stoffwechselprodukten durch die Zelle durch eine sensorgesteuerte Titration in einem Bypass erfasst wird, um in dem gepufferten System eine Gegenregulation einzuleiten, bevor die Pufferkapazität überschritten ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität der Zellen ein Parameter gemessen wird, der aus der aus dem folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Nährstoffverbrauch, Sauerstoffverbrauch, Metabolitenbildung, pH- Wert und/oder Pufferkapazität des Nährmediums.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Stresssituation durch einen biologischen Reiz, durch radikalbildende Enzyme, durch Viren oder deren Bestandteile oder durch Bakterien- oder Mykotoxine erzeugt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem erhobene Daten dazu genutzt werden, einen bestimmten metabolischen Zustand oder bestimmte metabolische Zustände in Abfolge der Zellen zu reproduzieren.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem erhobene Daten dazu genutzt werden, einen bestimmten Wirkstoff- oder Stressoreinfluß oder eine bestimmte Abfolge dieser Einflüsse zu realisieren.
8. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1 , aufweisend:
a) eine temperierbare Durchflusszelle mit
b) einem Zulauf für frisches Nährmedium und einem Ablauf für verbrauchtes Nährmedium und Zellstoffwechselprodukte sowie einem oder mehreren Zuläufen für Reagenzien und/oder Wirkstoffe und/oder Substrate und/oder andere Medien, c) Pumpen, Anschlüsse und Ventile, die es gestatten, den Durchfluss des Nährmediums zu steuern und vollständig, partiell oder nicht in einem Kreislauf zu führen,
d) Durchflusszellen und Titrationssysteme mit Sensoren zur Bestimmung prozessrelevanter Messgrößen am Eingang und/oder Ausgang des Systems bzw. in geeignet platzierten Bypässen,
e) gegebenenfalls weitere Sensoren in der direkten Zellumgebung,
f) eine Steuer- und Regelungseinrichtung zur kontinuierlichen Änderung der Durchflussbedingungen, ausgehend von einer stationären Kultur der Zellen zu einer Durchflusskultur, wobei die zentrale Regelgröße der von der biologischen Reaktion abhängige Fluss in die Durchflusszelle ist und die Regelung wahlweise manuell und/oder automatisch und/oder programmgesteuert erfolgt, g) eine Steuer- und Regelungseinrichtung, die die Zufuhr von Reagenzien, Wirkstoffen und Substraten und die Fließrate in aufeinander abgestimmten Verhältnissen regelt, wobei die Regelung wahlweise manuell und/oder automatisch und/oder programmgesteuert erfolgt.
9. Funktionale Nutritiva in einer auf Grund der Prüfungen mit einem Verfahren nach Anspruch 1 festgelegten speziellen Zusammensetzung, wobei Naturstoffe aus pflanzlichen, pilzlichen oder aquatischen Biomassen ausgewählt werden, die in einem Prüfverfahren nach Anspruch 1
a) den Zellstoffwechsel fördern und/oder
b) eine Stresssituation vermindern und/oder
c) prophylaktisch wirken.
10. Funktionale Nutritiva nach Anspruch 9, wobei Naturstoffe aus pflanzlichen, pilzlichen oder aquatischen Biomassen ausgewählt werden, die erst bei einem synergistischen Zusammenwirken, dass in einem Prüfverfahren nach Anspruch 1 nachgewiesen wird, a) den Zellstoffwechsel fördern und/oder
b) eine Stresssituation vermindern und/oder
c) prophylaktisch wirken.
11. Funktionale Nutritiva nach Anspruch 10, wobei die synergistisch wirksamen Naturstoffe und deren optimalen Zusammensetzung mit einem Verfahren nach Anspruch 1 ausgewählt wurden und eine Kombination von:
a) Biomassen aquatischer Organismen mit einem hohen Anteil an Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren mit stoffwechselaktivierender Wirkung,
b) bisher unbekannten zyklischen Peptiden nach Formelbild 1
L-Pro-4
R2=C12H14NO3 als Reinsubstanz oder enthalten in Biomassen von Mikroalgen oder im Methanol/Wasserextrakt aus den genannten Biomassen oder in einer nach Aufreinigung des Methanol/Wasserextraktes über Zellulose angereicherten Fraktion und/oder
c) pilzlichen Biomassen oder Pilzextrakte mit Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime und/oder immun- und stoffwechselstimmulierender Wirkung und/oder d) Biomassen aus arzneistoffliefernden Pflanzen nach Abtrennung der als Arzneimittel verwendeten Inhaltstoffe sowie gegebenenfalls
e) einem Tripel-Smectit-Mineralverbund sowie gegebenenfalls weiteren Wirk- und Zusatzstoffen umfassen.
12. Funktionelle Nutritiva nach Anspruch 11 , wobei die pilzlichen Extrakte oder Biomassen von Gandoderma pfeifferi stammen und Wirksamkeit gegen fischpathogene Keime aufweisen.
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