AT520272A1 - Messmethode zur Bestimmung der Hefevitalität und der Zellzahl - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Messverfahren zur elektrischen spektroskopischen Impedanzmessung eines lebende Zellen enthaltenden Fluids, wobei zumindest zwei Elektroden (2) in dem Fluid angeordnet werden, und mehrere Messsignale in Form von Wechselspannungen nacheinander zwischen den Elektroden (2) angelegt und der Strom und die Spannung als Messwerte zwischen den Elektroden (2) gemessen werden, wobei dabei die Frequenzen der Wechselspannungen zumindest teilweise unterschiedlich sind. Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren der beschriebenen Art bereitzustellen, mit der die Zellzahl genauer bestimmt werden kann. Dies wird dadurch gelöst, dass die spektroskopische Impedanzmessung einen Frequenzbereich von 0,1 Hz bis 106 Hz umfasst.

Description

Artikel

Elektrochemische Niederfrequenz-

Impedanzspektroskopie als Werkzeug zur Überwachung des Hefewachstums in industriellen Brauverfahren

Christoph Slouka 1,*, Georg Christoph Brunauer 2 , Julian Kopp 1, Michael Strahammer 1,

Jens Fricke 1, Jürgen Fleig 3 und Christoph Herwig 1 q 1 Christian Doppler Laboratory for Mechanistic and Physiological Methodsfor Improved Bioprocesses [Labor für mechanistische und physiologische Methoden zur Verbesserung von Bio verfahren], Institut für Verfahrenstechnik, Umwelttechnik und Technische Biowissenschaften, TU Wien, 1060 Wien, Österreich; julian.kopp@aon.at (J.K.); michael.strahammer@stud.fh-campuswien.ac.at (M.S.);jens.fricke@tuwien.ac.at (J.F.); christoph.herwig@tuwien.ac.at (C.H.) 2 Institut für Energietechnik und Thermodynamik, TU Wien, 1060 Wien, Österreich; georg.brunauer@tuwien.ac.at 3 Forschungsbereich Elektrochemie, Institut für Chemische Technologien und Analytik, TU Wien, 1060 Wien, Österreich; juergen.fleig@tuwien.ac.at * Korrespondenz: christoph.slouka@tuwien.ac.at; Tel.: +43-699-1267-1472 Erhalten: 24. Mai 2017; Angenommen: 1. August 2017; Veröffentlicht: 3.

August 2017;

Zusammenfassung: Messungen der Gesamtbiomasse und Lebensfähigkeit von Hefe im Brauverfahren sind heutzutage abhängig von Offline-Methoden wie der Färbung mit Methylenblau oder Fluoreszenzfarbstoff bzw. der Verwendung von Durchflusszytometrie-Messungen. Zudem verlangsamen Zellzählungsmethoden mit dem Mikroskop eine schnelle und einfache Vorhersage der Lebensfähigkeit der Hefe. Diese zeitintensiven Verfahren bringen eine Verzögerung des Antwortsignals mit sich, was nicht nur zu weniger Wissen über die Leistung der Hefe führt, sondern auch Auswirkungen auf die Qualität des Endprodukts hat. Neue Ansätze zur Verfahrensüberwachung während der aeroben und anaeroben Gärung von Saccharomyces cerevisiae beschränken sich nicht nur auf die klassische pH-, dÜ2- und Abgasanalyse, sondern verwenden zur Bestimmung von Biomasse, Produktqualität und Zelltod auch unterschiedliche Sensoren in situ und online, die auf unterschiedlichen physikalischen Prinzipien beruhen. In diesem Beitrag wurde die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) genutzt, um die in aeroben und anaeroben Chargenkultivierungsansätzen erzeugte Biomasse zu überwachen, wobei der Betrieb von Vermehrungs- und Gärungseinheiten industrieller Brauverfahren simuliert wurde. Ein Anstieg in der Doppelschichtkapazität (Cdl), der bei Frequenzen unterhalb 1 kHz festgestellt wurde, war proportional zur Zunahme der Biomasse in der Charge, die im Online- und Inline-Modus überwacht wurde. Es wurde eine gute Korrelation von Cdl mit der Zelldichte festgestellt. Zum Nachweis der Robustheit und Flexibilität dieser neuen Methode wurden zum Vergleich andere Biomassenmessungen auf dem Stand der Technik (Zelltrockengewicht - ZTG und optische Dichte -OD) durchgeführt. Da Messungen in diesem Frequenzbereich zu großem Teil von der Doppelschichtregion zwischen Elektrode und Medium bestimmt werden, waren eher kleine wechselseitige Störungen mit den Verfahrensparametern (Luftanreicherung und Rühren) zu erwarten. Es wird nachgewiesen, dass die Niederfrequenz-Impedanzspektroskopie nicht nur ein leistungsstarkes Werkzeug zur Überwachung der lebensfähigen Hefezellenkonzentrationen während des Betriebs ist, sondern auch hervorragend für die Ermittlung des physiologischen Zellzustands geeignet ist und die Biomassenüberwachung in der Brau- und Hefezuchtwirtschaft drastisch vereinfachen kann.

Stichwörter: Bierbrauen; S. cerevisiae; elektrochemische Impedanzspektroskopie; Gärungstechnologie; Inline-Sensoren 1. Einleitung

Das Kultivieren von Mikroben spielt in vielen verschiedenen Bereichen eine Schlüsselrolle, etwa in der Nahrungs- und Arzneimittelherstellung und der chemischen Massenherstellung, ebenso wie in der Abfallverwertung [1], Die Verfahrensüberwachung, wie etwa die pH-, Gelöstsauerstoff-(dO2)-und Abgasanalyse, ist bei der heutigen industriellen Kultivierung Stand der Technik zur Sicherstellung der Produktqualität und -Sicherheit. Der wichtigste Parameter in Bioverfahren, die Biomasse, kann jedoch nur mit Offline-Methoden oder komplizierten Softsensor-Anwendungen ermittelt werden [2], Diese Kontrollsysteme sind oft von Inline-/Online-/Atline-Erkennungssystemen wie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für Metaboliten, Abgasausgleich und/oder Messungen mittels dielektrischer Spektroskopie abhängig. Die Verwendung präziser und verlässlicher Biomassenmesssysteme [3,4], insbesondere von Lebendzellkonzentrationen (LZKen), ermöglicht angemessene Verfahrenssteuerungstools, die hinterher zu stabileren und verlässlichen Bioverfahren führen. Die LZK wird mithilfe von Offline-Messprinzipien, darunter Markerproteine oder Fluoreszenzsonden wie Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie, gemessen [5,6]. Da diese Steuerungs- und Analysetools kostenintensiv sind, werden klassische Massennahrungsmittelprodukte - wie Hefe und Bier - in eher unkontrollierten Umgebungen hergestellt. Nicht nur der komplexe Rohstoff, sondern besonders auch die Wachstumsbedingungen der Hefe (Vermehrung und Vergärung) sind für die Qualität des Endprodukts von großer Wichtigkeit. Die Einführung von Online-Vitalitätsmessungen in der Brauwirtschaft wurde historisch durch das Fehlen erschwinglicher, einfacher, stabiler und reproduzierbarer Tests behindert [7],

Im Allgemeinen sind Online- und Inline-Biomassenmessansätze eher selten und basieren auf physikalischen Messprinzipien. Ein allgemein angewandtes Prinzip ist die Hochfrequenz-Wechselstrom-Impedanzspektroskopie mit hohen Feldamplituden, die auf der Grundlage der ß-Dispersion verwendet wird [8,9]. Zellen mit einer integren Zellmembran beeinflussen die relative Permittivität zwischen zwei Elektroden, und somit wird dieses Signal zur Schätzung von LZKen verwendet. Eine ausführliche Beschreibung der Messprinzipien findet man in [10-13].

Der Modellorganismus für die Anwendung von Wechselstrommessungen im ß-Dispersionsbereich ist Hefe, da sie ein sehr wichtiger Expressionswirt für rekombinante Proteine ist [14-16]. Zusätzlich werden bereits Ansätze zu komplexeren Expressionssystemen durchgeführt, wie etwa Fadenpilze und CHO-Zellen (Zellen aus Ovarien des Chinesischen Zwerghamsters) [17-19]. Diese Messungen zeigen eine hohe Abhängigkeit von physikalischen Verfahrensparametern (wie Sauerstoffanreicherung und Rühren - was zu Gasblasen, Temperaturschwankungen und pH-Gradienten führt) und werden außerdem stark von Veränderungen in der Zusammensetzung der Medien bei der Kultivierung beeinflusst.

Zur Ermittlung der Biomasse kann jedoch nicht nur Hochfrequenz-Impedanzspektroskopie verwendet werden, sondern Veränderungen in der elektrischen Doppelschicht durch die Adsorption/Desorption von Zellen an der Elektrodenoberfläche (feststellbar bei Niederfrequenzen im mHz-Bereich; Οί-Dispersion) können ebenfalls wertvolle Informationen liefern. Neben dem Zelltyp selbst (Zellwand-/Membranzusammensetzung, -große und -form) können viele physikalische Parameter insbesondere bei den Medien (pH und Ionenkonzentrationen) die Potentialverteilung in der Doppelschicht beeinflussen [20,21]. Außerdem ist die gegebene Methode über oi-Dispersions-Erkennung in der Lage, mittels Anordnungen von ineinander verschränkten Mikroelektroden selbst sehr kleine Mengen Bakterien im Boden, in Nahrungsmitteln und in mit Fäkalien verschmutztem Wasser nachzuweisen [22-27], Diese Studien wurden nur in sehr kleinem Umfang und mit einer niedrigen Zellkonzentration durchgeführt, im Allgemeinen war bei niedrigen Zellkonzentrationen eine Messschwelle vorhanden. Bei Überschreitung dieser Begrenzung wurden in diesen Studien mit der Zeit sehr stabile Signale erreicht. Neben direkten Messungen in der Nährlösung kann ein modifizierter Elektrodenaufbau mit verschränkter Anordnung verwendet werden [28-30]. Erste Ansätze in Richtung Verfahrensüberwachung zeigten Kim et al. [31], die mit einem Inline-Sensor im Niederfrequenzbereich zwischen 40 Hz und 10 kHz zur Echtzeitüberwachung von Biomasse arbeiteten. Kim et al. wiesen die Machbarkeit der Messung von Veränderungen in der Doppelschichtkapazität (Cdl) nach, es wurQy ^er keine Analyse der Cdl selbst durchgeführt; es wurden nur einzelne extrahierte Werte für verscniedene Frequenzwerte verwendet. Neuere Studien von Escherichia coli brachten angemessene Ergebnisse für die LZK-Erkennung nicht nur in der Chargenphase, sondern auch bei Fed-Batch-Ansätzen, was zu weit höheren Zelldichten führte [32],

In der vorliegenden Studie wurden Impedanzmessungen im Oi-Dispersions-Bereich während der chargenbasierten Kultivierung von für Brauereianwendungen bestimmter Saccharomyces cerevisiae durchgeführt. Verschiedene Methoden auf dem Stand der Technik wurden angewandt, um die entsprechende Gesamtbiomasse - Zelltrockengewicht (ZTG) und optische Dichte (OD6io) - offline zu ermitteln. Zu einer Bewertung der Zellphysiologie, um Veränderungen der Lebensfähigkeit während der Kultivierung zu erfassen, wurde die Durchflusszytometrie (DTZ) in Kombination mit dem Fluoreszenzfarbstoff (Bis-(l,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol) (DiBAC) verwendet. Mit diesem Wissen konnten wir die Gesamtbiomasse mit der extrahierten Cdl korrelieren.

Zur einfachen Einschubmessung der Biomasse wurde ein Prototyp einer Inline-Sonde entworfen und gebaut. Online- und neue Inline-Sonden wurden in definierten Medien mit Glucose und Maltose in verschiedener Konzentration und mit Malzextrakt als dem komplexen Grundstoff beim Bierbrauen getestet. 2. Materialien und Verfahren 2.2. Expressionswirt und Kultivierung

Alle Kultivierungen erfolgten mit dem Stamm S. cerevisiae, der von der Brauerei GUSSWERK (Salzburg/Österreich) geliefert wurde. Für die Vorkultur wurden 500 ml Delft-Medium aus gefrorenem Vorrat (1,5 ml; -80 °C) angestellt und in einem 2500 ml Hochleistungs-Schüttelkolben 20 h bebrütet (230 U/min; 28 °C). Die Chargenkultivierungen erfolgten in einem Sartorius-Bioreaktor vom Typ Biostat Cplus aus rostfreiem Stahl (Sartorius, Göttingen/Deutschland) mit einem Arbeitsvolumen von 101 sowie in einem Infors-Bioreaktor vom Typ Techfors-S (Infors HT; Bottmingen/ Schweiz) mit einem Arbeitsvolumen von 201. Aerobe Chargen wurden mit Rührgeschwindigkeiten von 1000 bis 1400 U/min und mit einer Luftanreicherung von 2 Volumen pro Volumen pro Minute kultiviert. Anaerobe Chargen wurden bei 600 U/min und mit einem N2-Durchfluss von 2 bis 4 1/min kultiviert. Die Zusammensetzung des verwendeten definierten Delft-Mediums war wie folgt: 7,5 g/1 (NH^SCU 14,4 g/1 KH2PO4, 0,5 g/1 MgSO4-7H2O, 2 ml Spurenmetallmischung, 1 ml Vitamine, 50 μΙ Polypropylenglycol (PPG) als Entschäumer sowie Maltose und Glucose in verschiedener Konzentration als Kohlenstoffquelle. Für die Vergärung auf Malzextraktbasis wurde eine Vorkultur mit Delft-Medien kultiviert, die danach in der Malzextraktlösung (150 g/1 Malzextrakt in entionisiertem Wasser; Weyermann, Bavarian Pilsner, Bamberg/Deutschland) angestellt wurde. 2.2. Analytische Verfahren Für die ZTG-Messungen wurde 1 ml der Nährlösung bei etwa 9000 g zentrifugiert, anschließend mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen und abermals zentrifugiert. Nach Trocknung der Zellen bei 105 °C für 48 h wurde das Pellet gravimetrisch ausgewogen. ZTG-Messungen wurden in fünf Wiederholungen durchgeführt, und der mittlere Fehler für das ZTG lag bei etwa 3 %. Offline ODöio-Messungen wurden doppelt in einem UV/VIS-Photometer vom Typ Genisys 20 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt.

Die Überprüfung der Lebensfähigkeit der Zellen in definierten Mediumproben erfolgte mit DZM-Messungen. Nach Hinzufügen von DiBAC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), wurde die verdünnte Nährlösung mit einem Durchflusszytometer vom Typ CyFlow Cube 8 (Sysmex-Partec, Bornbach/Deutschland) gemessen. DiBAC reagiert auf das Potential der Plasmamembran, daher kann eine Unterscheidbarkeit zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen erreicht werden. Ausführliche Informationen zum Lebensfähigkeitsversuch findet man an anderer Stelle [33]. Insgesamt lagen die Fehler bei dieser Methode im Bereich von 0,5 % bis 1 %.

Die Bestimmung der Zuckerkonzentrationen in der Fermentationsbrühe erfolgte mit einer Supelco C-610H HPLC-Säule (Supelco, Bellefonte, PA, USA) auf einem Ultimate 300 HPLC-System (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) unter Verwendung von 0,1% H3PO4 als Laufpuffer bei 0,5 ml/min. Die Bestimmung der Ethanolkonzentrationen erfolgte mit einer Aminex HPLC-Säule (Biorad, Hercules, CA, USA) auf einem Agilent 1100 System (Agilent Systems, Santa Clara, CA, USA) mit 40 mM H2SO4 als Laufpuffer bei 0,6 ml/min.

Das Kultivierungsabgas wurde mit Gassensoren analysiert: IR für CO2 und ZrCL-basiert für O2 (Blue Sens Gas analytics, Herten/Deutschläfl·2,.^ 2.3. Impedanzmessungen

Die physikalische Analyse der LZKen mit Kapazitätssonden auf dem Stand der Technik, die sich auf die ß-Dispersion (107-104 Hz) stützen, zeigen eine starke Abhängigkeit von Verfahrensparametern (z.B. Rühren, Temperatur, pH, Salz- und Substratkonzentration usw.) und der Kultivierungsphase (exponentielle Wachstumsphase, Hungerphase usw.) [12,33]. Wir konzentrierten die Messung auf ein anderes physikalisches Phänomen (θί-Dispersion), das wertvolle Informationen hauptsächlich im Hinblick auf die Biomassenkonzentration liefert. Für diese Messungen wurde der „Οί-Dispersionseffekt" bei Frequenzen unter 10 kHz herangezogen, der höchstwahrscheinlich eine Folge der Deformation von ionischen Spezies rund um die Zellmembranen ist. Die dielektrische Reaktion war daher proportional zu der Ionenladung rund um die Membranen der adsorbierten Zellen auf der Elektrode [20,21]. Impedanzmessungen wurden im Bereich von 106 bis 10-1 Hz mit Amplituden von 100 bis 250 mV aufgenommen, unter Verwendung des hochauflösenden Dielektrizitäts-Analysators Alpha-A (Novocontrol, Montabaur/Deutschland). Da Messungen in diesem Frequenzbereich größtenteils von der Doppelschichtregion zwischen Elektrode und Medium bestimmt sind, waren eher kleine wechselseitige Störungen mit den Verfahrensparametern (Luftanreicherung und Rühren) zu erwarten. Online-Durchflusszellen zeigten den Nutzen einer Laminarströmung durch die Zelle sowie geringe Turbulenz, hatten aber allgemein Probleme mit Unterschieden im Verfahrenszustand (Seitenstrom) und mit der Durchführung von Sterilisationsverfahren. Inline-Sonden dürften diese Probleme überwinden, können aber von den Verfahrensparametern stark beeinflusst werden. Einzelheiten zum Montageverfahren und zur Datenauswertung sind in [32] angegeben. 2.4. Bau der Inline-Sonde

Da Online-Sonden nicht direkt im Innern des Reaktors liegen, sondern oft Zufuhr von einem Seitenstrom der Fermentationsbrühe erhalten, sind in diesem Zeitraum Veränderungen im Metabolismus gut möglich; andererseits ist weniger Störung des Signals durch Rühren und Luftanreicherung des Systems zu beobachten. Außerdem bergen Online-Sonden stets die Gefahr der Kontaminierung des Systems, da die Sterilbarriere nicht innerhalb des Fermenters liegt. Für sterile Verfahren ohne anhaltende Brüheströme wurde daher bei der Montage eines Inline-Sonden-Prototyps ein üblicher 25-mm Sicherheitsport mit O-Ring (Ingold-Verbindung) von B. Braun verwendet. Es wurden Materialien gewählt, die bei 130 °C dauerhaft stabil bleiben und Autoklavierungsverfahren in situ leicht standhalten können. Die physikalische Analyse der LZKen wurde mit der in Abb. 1 skizzierten Inline-Sonde überwacht und untersucht.

Abb. 1. Skizze des Inline-Sonden-Prototyps mit Angabe der verwendeten Materialien und Verdrahtung.

Die Verbindung zum Impedanzanalysator erfolgte mit einem vierpoligen BNC (Bajonett-Neill-

Concelman)-Steckverbinder. 5/18

Gehäuse und Elektroden der Inline-^onue bestehen aus Edelstahl, d. h. austenitischem

rostfreiem Stahl, mit einer Länge von ungefähr 140 mm und einem Durchmesser von mindestens 12 mm. Jede Elektrode hat einen Durchmesser von 10 mm. Der Abstand zwischen den Elektroden beträgt circa 2 mm. 3. Ergebnisse und Diskussion 3.1. Aerobe und anaerobe Chargenkulturen in definierten Medien mit Überwachung im Online-Modus

Hefe, ein bekannter Wirt für Diauxie, wurde aerob und anaerob kultiviert unter Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen, die vornehmlich in Gerstenmalz und Weizenkörnern vorhanden sind. Für beide Kulturen wurde eine chargenbasierte Anordnung verwendet. Die Wachstumsraten der entsprechenden Kulturen in Abb. 1 sind in Tabelle 1 angegeben. Die spezifische Wachstumsrate beschreibt den Zuwachs der Biomasse in einem bestimmten Zeitraum, normalisiert auf die Biomasse im Innern des Reaktors (dx/dt*l/x(t), wobei x die Biomasse darstellt).

Tabelle 1. Spezifische Wachstumsrate μ der Chargenphasen, bestimmt nach Offline-

Zelltrockengewicht-(ZTG)-Messungen (in Abb. 1 angegeben).

3.1.1. Rohdaten und allgemeine Erwägungen

Die gemessenen Impedanz-Rohdaten wurden mit einem Widerstand Rdl parallel zu einer nichtidealen Kapazität (Konstantphasenelement) CPEdl (Parameter Q, n) analysiert. Diese Elemente stammen höchstwahrscheinlich aus der Doppelschichtregion nahe der Elektrode und können durch Gleichung (1) ausgedrückt werden:

(1) wobei ω die Lichtbogenfrequenz und i die imaginäre Zahl ist; n und Q werden durch Anpassung an experimentelle Daten erhalten. Im Prinzip können diese Parameter zur Berechnung der Cdl verwendet werden, gemäß Cdl = (RdlI-π x Qdl)i/ii.

Das aerobe Wachstum von Hefe führt teilweise zum aeroben Stoffwechsel und teilweise zur Gärung, was als Crabtree-Effekt bekannt ist. Während des aeroben Wachstums vergären Zucker allein zu Ethanol. Die entsprechenden ZTG und OD zweier Kulturen sind in Abb. 2a angegeben. Während des Wachstums bei einer hohen Glucosekonzentration lag die Atemkapazität allgemein zu niedrig, und Ethanol wurde gleichzeitig erzeugt. Zuckerabnahme und Ethanolerzeugung sind in Abb. 2b angegeben, die den Q-Wert der Online-Impedanzsonde enthält. Nach Aufzehrung des Zuckers in der Fermentationsbrühe bei t = 12 h ist eine starke Abnahme des Impedanzsignals zu beobachten, was dem Wachstum auf Ethanol entspricht. Anaerobes Wachstum auf Glucose ergab weit höhere Ethanolkonzentrationen (etwa 1,5 % vol. in dieser Messreihe), wie in Abb. 2c zu sehen. Das Impedanzsignal stieg mit der Zeit an und erreichte den Höchstwert nach vollständiger Aufzehrung der Glucose. Da Ethanol nicht anaerob metabolisiert werden kann und sich im Flüssigkeitsüberstand ansammelt, war keine Veränderung im Zellstoffwechsel, sondern eine Verschiebung von exponentiellem Wachstum zur stationären Phase zu erwarten. Daher war kein steiles Abfallen des Impedanzsignals, sondern ein glatter Rückgang über mehrere Stunden zu beobachten.

Abb. 2. (a) Zeitverlauf von Zelltrockengewicht (ZTG; g/1) und optischer Dichte (OD; AU) für die aerob und anaerob kultivierte S. cerevisiae. Entsprechende μ-Werte sind in Tabelle 1 angegeben. (b) Impedanzsignal (Konstantphasenelement-Q: CPE-Q) und Maltose/Ethanol-Konzentrationen im Zeitverlauf während der aeroben Kultivierung. Nach Aufzehrung der Maltose (Veränderung im Metabolismus) ist ein Abfallen des Impedanzsignals sichtbar. Ein weiterer kleiner Anstieg ist nach der Ethanolaufnahme zu beobachten, bis zur Aufzehrung der zweiten Kohlenstoffquelle, (c) Impedanzsignal (hier CPE-Q) und Glucose-/Ethanolkonzentrationen während der anaeroben Kultivierung. Nach Aufzehrung der Glucose in den Medien wurde kein plötzliches Abfallen des Impedanzsignals beobachtet; stattdessen ist ein konstantes Abfallen des Signals zu beobachten. 3.1.2. Aerobe Kulturen

Der Doppelschichtwiderstand (Rdl) konnte nicht präzise angepasst werden [32] (insbesondere für die Inline-Sonde), und zwar aufgrund des hohen Gesamtanpassungsfehlers, wie bereits bei E. coli-Kulturen beobachtet. Außerdem wiesen die n-Werte, die von Anpassungen mit CPE-Elementen stammen, Abweichungen auf, die von der Kultivierungsart (aerob/anaerob) und besonders von der Art der Sonde (Inline/Online) abhängig sind. Diese Veränderungen bei den n-Werten erschwerte den Vergleich von Messreihen. Zur besseren Beschreibung der verschiedenen Stoffwechsellagen wurde das Anpassungsverfahren modifiziert. Zur leichteren Vergleichbarkeit der durchgeführten Messreihen wurde n in der folgenden Datenanalyse auf 1 festgelegt, was die idealisierte Kapazität (Cideai) der Probe widerspiegelt.

Gemessene Werte zur Bestimmung der Biomasse (ODöio und ZTG) wurden mit dem als Cideai bezeichneten empfangenen idealisierten Impedanzsignal korreliert. Die entsprechenden Daten für aerobe Kulturen auf Glucose sowie auf Maltose sind in Abb. 3a für OD und in Abb. 3b für die ZTG-Messung angegeben.

Abb. 3. (a) OÜ610 gegenüber extrahierter Kapazität des Impedanzsignals in aeroben Kulturen mit Glucose und Maltose, (b) DCW gegenüber extrahierter Kapazität des Impedanzsignals in aeroben Kulturen. Sehr ähnliche Ergebnisse werden für beide Kulturen erzielt, ungeachtet der benutzten C-Quelle.

Die Spätphase am Ende der Chargenkultivierung wies Abweichungen im Impedanzsignal in Folge von Stoffwechselveränderungen im System auf (im Vergleich mit Abb. 2b). Abweichungen zwischen Glucose und Maltose sind möglicherweise eine Folge des unterschiedlichen Zuckertransports durch die Membran. Da die Aufnahme von Maltose durch einen protonvermittelten Symporter vermittelt wird, wäre eine Veränderung in der Gegenionenwolke und damit Veränderungen in der Gesamtimpedanz sehr wahrscheinlich [34], Außerdem können Veränderungen in der Gesamtmembranstruktur, welche Maltose transportierende Proteine (Maltose-Permease) erzeugen, die bei mit Glucose gewachsenen Zellen nicht vorhanden sind, die Höhe des Impedanzsignals bei diesen Kulturen verändert haben. Das Impedanzsignal lieferte jedoch besonders am Ende der aeroben Chargenphase wertvolle Informationen über den gegenwärtigen Stoffwechsel von S. cerevisiae. 3.1.3. Anaerobe Kulturen

Die Ethanolerzeugung hatte möglicherweise weitere Auswirkungen auf das Impedanzsignal mit Informationen über den physiologischen Zustand des Systems. Eine Zuckerkonzentration von bis zu 200 g/1 hatte keine Auswirkung auf die Höhe des Impedanzsignals [32], Jedoch haben die Wachstumsbedingungen von S. cerevisiae das Impedanzsignal möglicherweise beeinflusst. Zur Untersuchung des Einflusses der Wachstumsbedingungen wurden verschiedene anaerobe Kultivierungen (ANA) durchgeführt, wie in Tabelle 2 zu sehen. Sauerstoff aus der Luft wurde mittels eines Stickstoffdurchflusses von 4 1/min durch den Fermenter entfernt. Eine Gasanalyse des Abgases betätigte das Fehlen von Sauerstoff in der gesamten Charge.

Tabelle 2. Anfängliche Zuckerkonzentrationen in verschiedenen anaeroben Chargen-Messreihen (ANA), extrahiert durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Messungen.

Rohdaten für Kulturen mit einer anderen Zuckerkonzentration (verglichen mit Abb. 2c), darunter Maltose und Glucose für anaerobes Wachstum, zeigten eine hohe Ethanolkonzentration, die in diesen Kulturen (ANA2) einen Höchstwert von etwa 3 % vol. erreichte.

Das anaerobe Wachstum konnte gut beschrieben werden, ausgenommen an sehr frühen Zeitpunkten, als Zelldichten unter der Schwelle von etwa 0,3 g/1 lagen. Für Inline-OD-Messungen wurden sehr ähnliche Ergebnisse erzielt (nicht dargestellt). Im Allgemeinen werden die Anpassungen für aerobe und anaerobe Kulturen zur Echtzeitschätzung der Biomasse für die aeroben und anaeroben Messreihen verwendet. Da in anaeroben Messreihen eine sehr gute lineare Beschreibung

erhalten werden kann, ist die Echtzeitschätzung der Biomasse unkompliziert, wie in Abb. 4a,b zu sehen, nach Normalisierung zur Schwelle des Impedanzsignals.

Abb. 4. (a) Idealisierte Kapazitäten der anaeroben Messreihen zeigen Zuckerkonzentrationen von bis zu 100 g/1 in der Fermentationsbrühe (Mischung aus Maltose und Glucose). Ethanolkonzentrationen erreichten 3 % vol. Bei diesen Kulturen waren verschiedene absolute Werte anzutreffen, aber der Anstieg des Impendanzsignals mit dem ZTG ist sehr ähnlich, (b) ZTG gegenüber Delta des Impedanzsignals (ideale Kapazität) in den anaeroben Messreihen. Normalisierung zum Schwellenwert von etwa 0,3 g/1 ergab sehr reproduzierbare Signale für sehr unterschiedliche Gärungs-Messreihen.

Mit diesen Ergebnissen werden die ZTG-Werte (halbvolle Kreise) vom Impedanzsignal über die Verfahrensdauer gut beschrieben (Abb. 5a). Abb. 5b zeigt die allgemeine Qualität der Anpassung. Das berechnete ZTG verglichen mit dem gemessenen ZTG liegt dicht am ersten Median. Werte, die nicht entlang des ersten Medians liegen, zeigen den Gesamtfehler der Anpassungsroutine im Vergleich zu einer Residualanalyse. Da die Zelldichten während dieser Kultivierungen sehr niedrig lagen, betrugen die Fehler bei der ZTG-Messung etwa 10 % des tatsächlichen Mittelwerts (in Abb. 5b für ANA2 hervorgehoben). Wenn man Präzision und Schwelle mit denen von E. coli-Kulturen vergleicht, wiesen S. cerevisiae-Kulturen eine sehr gute Reproduzierbarkeit für aerobes und anaerobes Wachstum mit der Online-Impedanzsonde auf, selbst unter Bedingungen mit niedriger Biomassenkonzentration. Ein Schwellenwert von etwa 0,3 g/1 ZTG ist auch für die Überwachung von extrem dynamischen Systemen von großem Nutzen.

Abb. 5. (a) Biomasse, errechnet aus der in Abb. 4a extrahierten Impedanzsignalanpassung, einschließlich offline gemessene ZTG-Werte als Kreise. Durchflusszytometriemessungen bestätigen, dass keine tote Population sichtbar ist; somit kann das ZTG in diesen Messreihen mit der Lebendzellkonzentration (LZK) verglichen werden, (b) Residualanalyse der drei anaeroben Messreihen. Trotz niedriger Zelldichte ist in Kulturen eine sehr präzise Korrelation erkennbar. Fehlerbalken sind exemplarisch für die ΑΝγλ — ixullivierung dargestellt.

3.2. Aerobe und anaerobe Kulturen in definierten Medien mit Verwendung der neuen Inline-Sonde

Im Online-Modus konnte das Impedanzsignal zur Schätzung der Lebendzellkonzentration in den aeroben und anaeroben Kulturen verwendet werden. Die neu gebaute Inline-Sonde wurde abwechselnd mit der Online-Sonde in zwei Kultivierungsmessreihen (einer aeroben und einer anaeroben) gemessen. Impedanz-Rohdaten der aeroben Messreihe sind in Abb. 6a dargestellt. Zwei sehr deutliche Merkmale sind erkennbar. Bei höheren Frequenzen ist eine Verschiebung zu negativen Differentialwiderständen erkennbar. Ähnliche Phänomene wurden bereits bei E. coZz-Gärungen beobachtet, selbst vor der Beimpfung des Systems [32], Außerdem ist eine Reduzierung der Kapazität um eine Größenordnung zwischen der Online-Sonde und der Inline-Sonde zu beobachten, im Vergleich mit Abb. 6a.

Die Kapazität unserer fast-idealen Plattenkondensatoranordnung, wie sie in der Inline- und Online-Sonde verbaut wurde, ist proportional zu C = e-d/A (2) wobei C die Kapazität (F), d der Abstand zwischen den Platten, e die dielektrische Konstante (eR-eo) und A die Fläche der Elektrode darstellt. Bei einer Elektrode mit dem halben Durchmesser sollte das Kapazitätssignal um den Faktor 4 abnehmen. Rühren und Luftanreicherung des Systems haben möglicherweise Auswirkungen auf die verwendete Elektrodenfläche und können eventuell die gemessene Kapazität noch weiter verringern.

Die extrahierte idealisierte Kapazität einer mit der Inline-Sonde gemessenen aeroben Messreihe ist in Abb. 6b dargestellt, einschließlich Verfahrenswerte von Glucoseverzehr und Ethanolerzeugung. Lücken im Zeitverlauf beruhen auf abwechselnden Messungen mit Inline- und Online-Sonden während der Kultivierung. Nach 1 h trat bei der Kapazität ein höheres Signal auf, gemäß Messungen mit der Online-Sonde. Es waren jedoch höhere Schwankungen beim Signal sichtbar, was eine Glättung des Kapazitäts-Rohsignals vorteilhaft machte. Die Glättung erfolgte bei der aeroben Gärung mittels des Fünf-Punkte-Glättungsverfahrens mit schneller Fourier-Transformation (FFT) von OriginPro 9 (Northampton, MA, USA).

Abb. 6. (a) Impedanzrohdaten in Nyquist-Darstellung für aerobe Kultivierung. Schwarze Quadrate stellen das Signal von der Online-Sonde dar - im Nebenbild vergrößert - und rote Dreiecke die Inline-Sonde auf ähnlichen Zeitstufen. Die Kapazität der Inline-Sonde ist eine Größenordnung niedriger (aufgrund der kleineren Elektrodenflächen), (b) Die Abhängigkeit von Impedanzsignal (nicht geglättet), Glucoseverzehr und Ethanolerzeugung in aerober Kultivierung unter Verwendung der Inline-Sonde.

Die geglätteten Signale - insbesondere für die aerobe Messreihe - wurden dann für die Anpassung der Biomassendaten verwendet. Die entsprechenden Ergebnisse sind in Abb. 7a angegeben. Bei der Inline-Sonde lag eindeutig eine höhere Schwelle für die präzise Datenerfassung vor, mit einer Untergrenze von 1 g/1 ZTG Biomasse (verglichen mit etwa 0,3 g/1 bei der Online-Sonde). Oberhalb der Schwelle ist allgemein^ejne gute lineare Tendenz sowohl bei der aeroben als auch bei der anaeroben Gärung zu sehen.

Abb. 7. (a) Impedanzsignal gegenüber Offline-ZTG für aerobe (Kreise) und anaerobe (Quadrate)

Kulturen mit linearer Anpassung jenseits einer Schwelle von 1 g/1 ZTG. (b) Impedanzsignal der aeroben Messreihe (geglättet), mit linearer Anpassung in lebensfähige Biomasse umgerechnet. Dies korreliert mit dem Offline-ZTG. (c) Impedanzsignal gegenüber ZTG der anaeroben Messreihe.

Die Korrelationen der berechneten Biomasse im Vergleich zur Offline-Biomasse sind in Abb. 7b,c angegeben. Die Frühstadien ohne ausgeprägtes Wachstum konnten bei der Kultivierung nicht überwacht werden. Das exponentielle Wachstum konnte mit der Inline-Sonde trotz hoher Luftanreicherung und Rührgeschwindigkeit präzise beschrieben werden. Auch für die anaerobe Kultur wurden vielversprechende Ergebnisse erzielt, trotz der höheren Signalschwankungen. Für definierte Minimalmedien lieferte die Messung mit der Inline-Sonde reproduzierbare, stabile Ergebnisse in den verwendeten Systemen (Sartorius und Techfors mit 10 bis 201 Höchstvolumen des Fermenters).

Größere Systeme in der Brauwirtschaft, einschließlich längerer Restzeiten im Seitenstrom, können Auswirkungen auf das Online-Signal haben und das absolute Impedanzsignal und die Neigung der ZTG- gegenüber der Kapazitätskurve verändern. Außerdem können größere Kesselreaktoren Inhomogenitäten im System enthalten, die das Signal beeinflussen und berücksichtigt werden müssen. Da Restzeiten in den verschiedenen Umleitungen zu hohen Schwankungen führen können, sollten Online-Sonden daher innerhalb des Messsystems kalibriert werden. Die Signale der montierten Inline-Sonde werden durch Verfahrensbedingungen wie Rühren und Luftanreicherung beeinflusst, was allgemein zu höheren Signalschwankungen führt. Eine Vergrößerung der Elektrodenfläche kann für die Signalstabilität vorteilhaft sein, da absolute Kapazitätswerte verglichen mit der Online-Sonde eine Größenordnung tiefer liegen. 3.3. Aerobes Wachstum von Hefe auf komplexem Malzextraktmedium

Definierte Medien haben den Vorteil guter Reproduzierbarkeit und einfacher Analyse, wie OD für die Ermittlung der Biomasse und HPLC für die Zucker-/Ethanolanalyse, und sind somit für die ersten Entwicklungsschritte hervorragend geeignet. Da definierte Medien jedoch in industriellen Verfahren zur Hefeproduktion kaum in Gebrauch sind, wurde für diese Kultivierungsmessreihe Malzextrakt für die Herstellung von Pilsner Bier verwendet. Komplexe Medien wie Malzextrakt und Melasse haben oft den Nachteil, dass OD-Messungen allgemein eine hohe blinde Adsorption (vor allem im IR-Bereich) aufweisen und in d l 1 / 18ulturen nicht einfach online zu Bestimmung der Gesamtbiomasse eingesetzt werden können.

Die durchgeführte Kultivierung wurde mittels HPLC und Abgasanalyse analysiert, um das Ende der Chargenphase zu bestimmen. Die HPLC-Daten für Zucker und Ethanol sind in der ergänzenden Abb. Sl angegeben. Während der Gärung wurde eine Mischung aus Mono- und Polysacchariden verzehrt. Dies führte zu 10.6 g/1 ZTG und 3,2 % vol. Ethanol nach der Chargenphase, bei etwa t = 16 h. Online- und Inline-Impedanzmessungen wurden in abwechselndem Modus für eine Kultur durchgeführt. Rohdaten für das Online-Impedanzsignal sind in Abb. 8a angegeben, einschließlich Informationen zur Ethanolkonzentration während der Kultivierung. Auf einen starken Anstieg folgt nach etwa 13 h Kultivierungszeit ein Scheitelpunkt, was möglicherweise eine Veränderung im Zuckerstoffwechsel am Ende der Chargenphase anzeigt. Zu Verfahrenszeit t = 16 h ist eine Abnahme des Impedanzsignals sichtbar, wie allgemein für Wachstum auf Ethanol zu beobachten. Die Abnahme des Signals ist jedoch recht glatt im Vergleich zu dem deutlichen Abfall in definierten Medien (Abb. 2b). Zur Rauschminderung wurden eine Interpolierung des Signals und eine Fünf-Punkte-FFT-Glättung durchgeführt. Dasselbe Verfahren wurde für das Inline-Impedanzsignal durchgeführt, wie in Abb. 8b angegeben. Beim Inlinesignal ist am Ende der Chargenphase eine deutliche Abnahme der Kapazität zu erkennen, die zu einer späteren Verfahrenszeit mit einem Anstieg des Ethanolwachstums einhergeht.

Die erhaltenen geglätteten und interpolierten Daten werden mit dem ermittelten ZTG verglichen, das in Abb. 8c für die Online-Sonde und in Abb. 8d für die Inline-Sonde aufgetragen ist. Die Neigungen der Signale sind den extrahierten Werten für Proben mit definierten Medien (rote/blaue Punkte) sehr ähnlich. Es kann jedoch bei beiden Sonden eine deutliche Verschiebung in der Intensität des Signals beobachtet werden.

Abb. 8. (a) Impedanzsignal während der Kultivierungszeit für die Online-Sonde unter Verwendung von nur Malzextrakt als Nährmedium. Die Linie (orange) zeigt das Interpolationsverfahren. Was die verwandte aerobe Kultur angeht, so ist nach dem Verzehr von Zuckern ein Abfallen der Impedanz zu beobachten, (b) Rohdaten Impedanzsignal, interpoliert und geglättet für die Inline-Sonde, (c) Normalisiertes Impedanzsignal gegenüber ZTG für die Online-Sonde unter Verwendung von Malzextrakt verglichen mit definierten Medien, (d) Normalisiertes Impedanzsignal gegenüber ZTG für die Inline-Sonde unter Verwendung von Malzextrakt und definierten Medien mit Glucose. 12/18

Auf die Darstellung der Impedanz gegenüber ZTG in Abb. 8c wurde eine lineare Anpassung angewandt, und das ZTG wurde durch das Impedanzsignal berechnet und mit dem offline gemessenen Signal in Abb. 9 verglichen. Jenseits der gegebenen Schwelle von 1 g/1 konnte mit der Nutzung der Inline-Sonde eine gute Beschreibung des Verfahrens erzielt werden.

Abb. 9. Impedanzsignal gegenüber ZTG für die Inline-Sonde in komplexem Medium: Malzextrakt. Bei diesem Versuch ergibt sich eine gute Beschreibung jenseits von 1 g/1 ZTG.

Auf Grundlage dieser ersten Messungen in komplexen Medien scheint die Impedanzspektroskopie bei Frequenzen im kHz- bis mHz-Bereich ein vielversprechendes Werkzeug für die Online-Verfahrensüberwachung bei Hefeproduktionsverfahren und vielleicht sogar bei anaeroben Verfeinerungsverfahren in Brauereianwendungen. Die Vorgefundene Abnahme des Signals nach vollständigem Zuckerverzehr ist ein starkes Merkmal in Bezug auf ein Stopp-Kriterium bei diesen Kulturen. Für eine höhere Präzision der Biomassenschätzung wäre eine Optimierung des Rauschabstands von Nutzen, insbesondere für die Inline-Sonde. In Brauereianwendungen werden wegen der Aromaverbindungen jedoch allgemein turmartige Reaktoren statt Rührkesselreaktoren verwendet [35]. Daher waren Rührgeschwindigkeit und Luftanreicherung bei der Entwicklung deutlich härter als die in der Brauwirtschaft verwendeten, und deshalb ist ein wesentlich stabileres Signal zu erwarten. Die Kalibrierung der Sonde kann nach ihrer Einführung in das verwendete System und Nährmedium durchgeführt werden und dürfte dann für die nachfolgenden Messungen stabil bleiben. 4. Schlussbemerkungen

Es wurden neue Online- und Inline-Sonden auf Grundlage von Niederfrequenz-EIS für die

Messung von LZKen von 5. cerevisiae getestet. Zunächst wurden die Kulturen mittels einer früher für pharmazeutische Fed-Batch-Kultivierungen von E. coli entwickelten Online-Sonde überwacht. Chargenkultivierungen auf definierten Medien für aerobes und anaerobes Wachstum erbrachten stabile Ergebnisse ungeachtet der Kohlenstoffquelle oder -konzentration. Eine neu zusammengebaute Inline-Sonde wurde in aeroben und anaeroben Kulturen in definierten Medien getestet und mit der Online-Sonde verglichen. Es wurde eine gute Beschreibung des Biomassenwachstums während des Verfahrens erzielt. Neben der Feststellung der Biomasse während der Kultivierung konnte abhängig von den Atmungsbedingungen der Zellen auch deren physiologischer Zustand ermittelt werden. Die Messanordnung für Biomasse ist sehr vorteilhaft, insbesondere in komplexen Medien wie Malzextrakt oder Melasse, da optische Online-Verfahren in solch optisch dichten Medien nicht verwendet werden können. Das entwickelte System zeigt somit ein hohes Potenzial für die Überwachung von Zellwachstum und Erntezeitpunkten in der hefe- und bierherstellenden Industrie.

Ergänzende Materialien: Folgende Materialien sind online unter www.mdpi.com/2227-9040/5/3/24/sl erhältlich. Abb. Sl: HPLC-Daten des verwendeten Pilsner-Malzextrakts auf verschiedenen Zeitstufen. Der Anstieg von Ethanol liegt an der späten Retentionszeit im Chromatogramm. Glucose und Galactose kommen zuerst, danach verzehren die Zellen die Disaccl t ä / t ojach Verzehr aller leicht zugänglicher Zucker führt das Wachstum auf Ethanol über Nacht allmählich zu einer Abnahme der Ethanolkonzentration.

Dank: Die Autoren danken der Christian Doppler Gesellschaft (CDG) für ihre Finanzierung.

Beiträge der Autoren: C. Slouka, J. Kopp und M. Strahammer führten die Kultivierung durch. G. Brunauer montierte die Online- und Inline-Sonden und half bei der Kultivierung. J. Fricke, J. Fleig und C. Herwig halfen bei der Datenauswertung und lieferten wertvollen Input für das Manuskript. C. Slouka, G. Brunauer und J. Fricke fertigten das Manuskript an.

Interessenkonflikte: Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Abkürzungen dO2 gelöster Sauerstoff

Cdl Doppelschichtkapazität EIS elektrochemische Impedanzspektroskopie ZTG Zelltrockengewicht OD optische Dichte LZK Lebendzellkonzentration AC Wechselstrom CHO Chinese hamster ovary, (Zellen aus) Ovarien des Chinesischen Zwerghamsters

DiBAC (Bis-(l,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol) HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie BNC Bajonett-Neill-Concelman Z allgemeine Impedanz R Widerstand ω Lichtbogenfrequenz CPE Konstantphasenelement e dielektrische Konstante

Quellenangaben Ϊ. Gavrilescu, M.; Chisti, Y. Biotechnology — A sustainable alternative for Chemical industry. Biotechnol. Adv. 2005, 23, 471-499. [CrossRef] [PubMed] 2. Sagmeister, P.; Wechselberger, P.; Jazini, M.; Meitz, A.; Langemann, T.; Herwig, C. Soft sensor assisted dynamic bioprocess control: Efficient tools for bioprocess development. Chem. Eng. Sei. 2013, 96, 190-198. [CrossRef] 3. Clarke, D.; Blake-Coleman, B.; Carr, R.; Calder, M.; Atkinson, T. Monitoring reactor biomass. Trends Biotechnol. 1986, 4,173-178. [CrossRef] 4. Kiviharju, K.; Salonen, K; Moilanen, U.; Eerikäinen, T. Biomass measurement online: The performance of in situ measurements and Software sensors. ]. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008, 35, 657-665. [CrossRef] [PubMed] 5. Davey, H.M.; Keil, D.B. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: The importance of single-cell analyses. Microbiol. Rev. 1996, 60, 641-696. [PubMed] 6. Veal, D.; Deere, D.; Ferrari, B.; Piper, J.; Attfield, P. Fluorescence staining and flow cytometry for monitoring microbial cells. J. Immunol. Methods 2000, 243,191-210. [CrossRef] 7. Lodolo, E.J.; Kock, J.L.; Axcell, B.C.; Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS Yeast Res. 2008, 8,1018-1036. [CrossRef] [PubMed] 8. Schwan, H.P. Electrical and acoustic properties of biological materials and biomedical applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 1984, 31, 872-878. [CrossRef] [PubMed] 9. Schwan, H.P.; Foster, K.R. RF-field interactions with biological Systems: Electrical properties and biophysical mechanisms. Proc. IEEE 1980, 68,104-113. [CrossRef] 10. Yardley, J.E.; Keil, D.B.; Barrett, J.; Davey, C.L. On-line, real-time measurements of cellular biomass using dielectric spectroscopy. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2000, 17, 3-36. [CrossRef] [PubMed] 11. Dabros, M.; Dertnewald, D.; Currie, D.J.; Lee, M.H.; Todd, R.W.; Marison, I.W.; vonStockar, U. Cole-Cole, linear and multivariate modeling of capacitance data for on-line monitoring of biomass. Bioprocess Biosyst. Eng. 2009, 32,161-173. [CrossRef] [PubMed] 12. Soley, A.; Lecina, M.; Gämez, X.; Cairo, J.; Riu, P.; Rosell, X.; Bragos, R.; Godia, F. On-line monitoring of yeast cell growthby impedance spectroscopy. J. Biotechnol. 2005, 118, 398-405. [CrossRef] [PubMed] 13. Carveil, J.P.; Dowd, J.E. On-line measurements and control of viable cell density in cell culture manufacturing processes using radio-frequency impedance. Cytotechnology 2006, 50, 35-48. [CrossRef] [PubMed] 14. Gerngross, T.U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.

Nat. Biotechnol. 2004, 22,1409-1414. [CrossRef] [PubMed] 15. Buckholz, R.G.; Gleeson, M.A.G. Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins. Nat. Biotechol. 1991, 9,1067-1072. [CrossRef] 16. Cereghino, G.P.L.; Cregg, J.M. Applications of yeast in biotechnology: Protein production and genetic analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 1999,10,422-427. [CrossRef] 17. Konakovsky, V.; Yagtu, A.C.; Clemens, C.; Müller, M.M.; Berger, M.; Schlaffer, S.; Herwig, C. Universal Capacitance Model for Real-Time Biomass in Cell Culture. Sensors 2015, 15, 22128-22150. [CrossRef] [PubMed] 18. Ehgartner, D.; Sagmeister, P.; Herwig, C.; Wechselberger, P. A novel real-time method to estimate Volumetrie mass biodensity based on the combination of dielectric spectroscopy and soft-sensors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2015, 90, 262-272. [CrossRef] 19. Ferreira, A.P.; Vieira, L.M.; Cardoso, J.P.; Menezes, J.C. Evaluation of a new annular capacitance probe for biomass monitoring in industrial pilot-scale fermentations. J. Biotechnol. 2005, 116, 403-409. [CrossRef] [PubMed] 20. Poortinga, A.T.; Bos, R.; Norde, W.; Busscher, H.J. Electric double layer interactions in bacterial adbesion to surfaces. Surf. Sei. Rep. 2002, 47,1-32. [CrossRef] 21. Bot, C.; Prodan, C. Probing the membrane potential of living cells by dielectric spectroscopy. Eur. Biophys. J. 2009, 38,1049-1059. [CrossRef] [PubMed] 22. Radke, S.M.; Alocilja, E.C. Design and fabrication of a microimpedance biosensor for bacterial detection. IEEE Sens. J. 2004, 4,434-440. [CrossRef] 23. Yang, L.; Li, Y.; Griffis, C.L.; Johnson, M.G. Interdigitated microelectrode (IME) impedance sensor for the detection of viable Salmonella typhimurium. Biosens. Bioelectron. 2004,19,1139-1147. [CrossRef] [PubMed] 24. Liu, J.; Li, H.; Zhang, F.; Li, X.; Wang, L.; Chen, Y. Online impedance monitoring of yeast cell culture behaviors. Microelectron. Eng. 2011, 88,1711-1713. [CrossRef] 25. Lei, K.F. Review on impedance detection of cellular responses in micro/nano environment. Micromachines 2014, 5,1-12. [CrossRef] 26. Yang, L.; Ruan, C.; Li, Y. Detection of viable Salmonella typhimurium by impedance measurement of electrode capacitance and medium resistance. Biosens. Bioelectron. 2003, 19,495-502. [CrossRef] 27. Gonzalez, J.; Santana, A.F.; Mirza-Rosca, J. Effect of bacterial biofilm on 316 SS corrosion in natural seawater by EIS. Corros. Sei. 1998, 40, 2141-2154. [CrossRef] 28. Bayoudh, S.; Othmane, A.; Ponsonnet, L.; Ouada, H.B. Electrical detection and characterization of bacterial adhesion using electrochemical impedance spectroscopy-based flow chamber. Colloids Surf. A 2008, 318, 291-300. [CrossRef] 29. Wu, J.; Ben, Y.; Chang, H.-C. Particle detection by electrical impedance spectroscopy with asymmetric-polarization AC electroosmotic trapping. Microfluid. Nanofluid. 2005, 1,161-167. [CrossRef] 30. K'Owino, I.O.; Sadik, O.A. Impedance spectroscopy: A powerful tool for rapid biomolecular screening and cell culture monitoring. Electroanalysis 2005, 17, 2101-2113. [CrossRef] 31. Kim, Y.-H.; Park, J.-S.; Jung, H.-I. An impedimetric biosensor for real-time monitoring of bacterial growth in a microbial fermentor. Sens. Actuators B 2009, 138, 270-277. [CrossRef] 32. Slouka, C.; Wurm, D.J.; Brunauer, G.; Welzl-Wächter, A.; Spadiut, O.; Fleig, J.; Herwig, C. A Novel Application for Low Frequency Electrochemical Impedance Spectroscopy as an Online Process Monitoring Tool for Viable Cell Concentrations. Sensors 2016, 16,1900. [CrossRef] [PubMed] 33. Langemann, T.; Mayr, U.B.; Meitz, A.; Lubitz, W.; Herwig, C. Multi-parameter flow cytometry as a process analytical technology (PAT) approach for the assessment of bacterial ghost production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 409-418. [CrossRef] [PubMed] 34. Weusthuis, R.A.; Pronk, J.T.; Van Den Broek, P.; Van Dijken, J. Chemostat cultivation as a tool for studies on sugar transport in yeasts. Microbiol. Rev. 1994,58, 616-630. [PubMed] 35. Okabe, M.; Katoh, M.; Furugoori, F.; Yoshida, M.; Mitsui, S. Growth and fermentation characteristics of bottom brewer's yeast under mechanical stirring. J. Ferment. Bioeng. 1992, 73,148-152. [CrossRef]

Claims (11)

1. P A T E N T A N S P R Ü C H E

   1. Messverfahren zur elektrischen spektroskopischen Impedanzmessung eines lebende Zellen enthaltenden Fluids, wobei über zumindest zwei Elektroden (2) in dem Fluid angeordnet werden, und mehrere Messsignale in Form von Wechselspannungen nacheinander zwischen den Elektroden (2) angelegt und der Strom und die Spannung als Messwerte zwischen den Elektroden (2) gemessen werden, wobei dabei die Frequenzen der Wechselspannungen zumindest teilweise unterschiedlich sind, dadurch gekennzeichnet, dass die spektroskopische Impedanzmessung einen Frequenzbereich von 0,1 Hz bis 106 Hz umfasst.
2. 2. Messverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselspannungen im Bereich von 100 mV bis 250mV liegen.
3. 3. Messverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst aus den Messwerten ein ohmscher Doppelschichtwiderstand RDL und eine Ladung QDL aus einer gemessenen Doppelschichtimpedanz ZDL nach der Formel

   errechnet wird und danach eine Doppelschichtimpedanz CDL über die Multiplikation des ohmschen Doppelschichtwiderstandes RDL mit der Ladung QDL berechnet wird.
4. 4. Messverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass von der Doppelschichtimpedanz CDL eine Grenzwertkapazität Cthreshold abgezogen wird.
5. 5. Messverfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppelschichtimpedanz CDL geglättet wird, vorzugsweise über eine Fast Fourier Transformation-Glättung (FFT-Glättung), besonders vorzugsweise über eine 5-Punkt-FFT-Glättung.
6. 6. Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Frequenzbereich einen Bereich umfasst, in dem α-Dispersion auftritt.
7. 7. Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden (2) zur Messung als Inline-Elektroden in einem Hauptgefäß des Fluids angeordnet werden.
8. 8. Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden (2) zur Messung als Online-Elektrode in einem BypassKanal eines Hauptgefäßes des Fluids angeordnet werden.
9. 9. Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden (2) in einem Abstand von etwa 2 mm angeordnet werden.
10. 10. Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des Fluids im Bereich der Elektroden (2) zumindest während den Messungen eingestellt wird.
11. 11. Messverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst aus den Messwerten ein ohmscher Doppelschichtwiderstandes RDL und eine Ladung QDL aus einer gemessenen Doppelschichtimpedanz ZDL nach der Formel

    berechnet wird und danach nach der Formel

    eine nichtidealisierte Doppelschicht-Kapazität CDL(CPE) errechnet wird, die charakteristisch für den physiologischen Zustand der Zellen ist.