DE3788515T2

DE3788515T2 - Bestimmung von biomasse.

Info

Publication number: DE3788515T2
Application number: DE87905954T
Authority: DE
Inventors: Douglas Bruce Kell
Original assignee: Abertec Ltd
Current assignee: Abertec Ltd
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1987-09-16
Publication date: 1994-04-21
Anticipated expiration: 2007-09-17
Also published as: DE3788515T3; EP0282532A1; GB8622747D0; WO1988002114A1; AU609058B2; AU7881187A; US4965206A; EP0282532B2; NZ221877A; ZA876971B; CA1307824C; DE3788515D1; EP0282532B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Biomasse in einem Medium, auf einen Fermentierprozeß, bei dem das Verfahren als Steuerungsbestandteil verwendet wird, und auf ein Gerät zum Ausführen des Verfahrens und des Prozesses.
Es besteht zunehmendes Interesse an Biotechnologie, sowohl bei der herkömmlichen Fermentierindustrie als auch bei der Nutzung von lebenden Zellen bei neuen Prozessen zum Erzeugen von kommerziell nutzvollen Produkten wie Antibiotika, Vitaminen, Aminosäuren und einer Vielfalt von biologisch aktiven Proteinen.
Die Produktivität von Fermentierprozessen ist in einem beträchtlichen Ausmaß von den Beschaffenheiten der Kulturen abhängig. Es ist daher wünschenswert und nunmehr üblich geworden, diejenigen Variablen, wie den pH-Wert und den Druck von gelöstem Sauerstoff zu steuern, für die Sensoren erhältlich sind.
Eine der wichtigsten Variablen bei einem Fermentierprozeß ist die Biomassenkonzentration im Reaktionsgefäß, nämlich die Konzentration von mikrobiellen oder anderen Zellen in dem Fermentiergefäß, da die Produktivität bei einem gegebenen Satz von Prozeßbedingungen hierzu direkt proportional ist. Es wurde jedoch bisher keine genaue Vorrichtung zum Messen des Biomassengehalts einer Kultur in Echtzeit, d. h. zum Messen des gegenwärtigen Biomassengehalts statt des um einige Zeit zurückliegenden Biomassengehalts entwickelt.
Der Mangel an geeigneten Vorrichtungen zum Messen dieser wichtigen Prozeßvariablen wurde in den letzten Jahren von einigen Verfassern erläutert, siehe beispielsweise:
Pirt, "Principles of Microbe and Cell Cultivation", Blackwell, 1975, Seite 16; Carleysmith and Fox, "Fermenter Instrumentation and Control", Advanced Biotechnologic Processes 3, 1-51, 1984; und Harris and Kell; "The estimation of Microbial Biomass", Biosensors J.1, 17-84 (1985).
Aus dieser letzteren Literaturstelle ist vermerkt, (1) daß das für das Bestimmen von Biomasse in Echtzeit am besten geeignete Maß das Biovolumen, nämlich der durch die Zellplasmamembrane der mikrobiellen oder anderen Zellen eingeschlossene Volumensanteil einer Kultur ist, (2) daß der einzige Weg, auf dem die Biomasse in Echtzeit bestimmt werden könnte, das Bestimmen durch physikalische Messung im Gegensatz zur chemischen Messung sein wird und (3) daß alle gegenwärtig verfügbaren physikalischen Verfahren zur Biomassenbestimmung, wie die Streulichtmessung, unter den in einem Fermentiergefäß herrschenden schwierigen Bedingungen im wesentlichen unbrauchbar sind.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Messen der mikrobiellen oder anderen Biomassen in Fermentiergefäßen in Echtzeit und vorzugsweise an Ort und Stelle zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Bestimmen von Biomasse in einem Medium, das Suspensionsfluid und Zellen enthält, geschaffen, wobei ein von der Dielektrizitätskonstante von Material im Inneren des Mediums abhängiges Signal erzeugt wird, indem vom Messen der elektrischen Kapazität zwischen voneinander beabstandeten Elektroden in dem Medium bei einer vorbestimmten Frequenz Gebrauch gemacht wird, die so gewählt wird, daß die Dielektrizitätskonstante sich mit dem durch die Zellplasmamembrane der Zellen eingeschlossenen Volumenanteil des Mediums ändert, und der Volumenanteil aus dem von der Dielektrizitätskonstante abhängigen Signal bestimmt wird.
Erfindungsgemäß wird ferner auch ein Fermentierprozeß, bei dem eine Kultur benutzt wird, die eine Suspensionsflüssigkeit und Zellen enthält, geschaffen, wobei ein von der Dielektrizitätskonstante von Material im Inneren der Kultur abhängiges Signal erzeugt wird, indem vom Messen der elektrischen Kapazität zwischen voneinander beabstandeten Elektroden in der Kultur oder in einer Probe hiervon bei einer vorbestimmten Frequenz Gebrauch gemacht wird, und eine Anzeige abgegeben wird, falls das von der Dielektrizitätskonstante abhängige Signal von einem vorbestimmten Wert abweicht oder aus einem vorbestimmten Bereich fällt, und/oder der Wert eines Prozeßparameters für das Zurückführen des Signals zu dem vorbestimmten Wert oder zu dem vorbestimmten Bereich geändert wird, wobei die vorbestimmte Frequenz so gewählt wird, daß die Dielektrizitätskonstante sich mit dem durch die Zellplasmamembrane der Zellen eingeschlossenen Volumenanteil der Kultur ändert.
Erfindungsgemäß wird darüberhinaus ein Gerät für das Ausführen einer Fermentation unter Benutzung einer Kultur, die eine Suspensionsflüssigkeit und Zellen enthält, geschaffen, wobei das Gerät ein Fermentiergefäß zur Aufnahme der Kultur, Elektroden, die in dem Fermentiergefäß in gegenseitigem Abstand derart angeordnet sind, daß sie mit der Kultur in Kontakt sind, und eine Einrichtung zum Erzeugen eines Signals enthält, das von der Dielektrizitätskonstante im Inneren der Kultur abhängt, indem vom Messen der elektrischen Kapazität zwischen den Elektroden bei einer vorbestimmten Frequenz Gebrauch gemacht wird, die so gewählt ist, daß die Dielektrizitätskonstante sich mit dem durch die Zellplasmamembrane der Zellen eingeschlossenen Volumenanteil des Mediums ändert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Bestimmen von Biomasse in irgendeinem beliebigen Medium angewendet werden. Das Verfahren ist äußerst nutzvoll für das Bestimmen von Biomasse in einer Kultur und wird in dieser Beschreibung auf allgemeine Weise im Zusammenhang mit dieser Anwendung beschrieben. Es kann jedoch auch zum Bestimmen von Biomasse angewandt werden, die in wäßrigen und anderen Suspensionen und zum Beispiel in Emulsionen fein verteilt ist.
Das Gerät kann eine Einrichtung zum Bestimmen enthalten, ob das kapazitätsabhängige Signal von einem vorbestimmten Wert abweicht oder aus einem vorbestimmten Wertbereich fällt.
Das Gerät kann ferner eine auf die Einrichtung für das Bestimmen ansprechende Einrichtung zum Ändern von mindestens einem Prozeßparameter für das Zurückführen des kapazitätsabhängigen Signals zu dem vorbestimmten Wert oder dem vorbestimmten Bereich enthalten.
Es besteht ein wichtiger Zusammenhang zwischen der bei einer bestimmten Frequenz gemessenen scheinbaren relativen Dielektrizitätskonstante einer Suspension von sphärischen Zellen, dem Zellenradius und dem Zellenvolumen. Der Zusammenhang kann durch die Gleichung
ausgedrückt werden, wobei
&epsi;L die scheinbare relative Dielektrizitätskonstante der Kultur ist,
P der von den Zellen eingenommene Volumensanteil der Kultur ist,
r der Zellenradius ist,
Cm die Kapazität der Zellenmembrane je Flächeneinheit ist, m
&epsi;∞ Dielektrizitätskonstante der Kultur bei einer Frequenz ist, die in Bezug auf die Meßfrequenz hoch ist, und
&epsi;r die Freiraum-Dielektrizitätskonstante, ungefähr 8,85 · 10&supmin;¹² F/m ist.
Für nichtsphärische Zellen wird der Faktor 9/4 verändert.
Die Dielektrizitätskonstante wird mit der Kapazität, die gemessen werden kann, durch einen Faktor in Beziehung gesetzt, der als die Zellenkonstante bezeichnet wird, die von der Anzahl, der Größe und der Geometrie von Elektroden abhängt. Die Dielektrizitätskonstante einer Probe kann auf diese Weise durch das Messen der Kapazität zwischen den darin in gegenseitigem Abstand angeordneten Elektroden bestimmt werden. Die Dielektrizitätskonstante war früher als Dielektrizitätszahl bekannt.
Die relative Dielektrizitätskonstante einer wäßrigen Lösung ist dimensionslos und geringfügig von der Temperatur und dem elektrischen Leitwert der Probe abhängig, liegt aber immer in dem Bereich von 60 bis 85, wobei sie sehr häufig annähernd 78 ist. Die Dielektrizitätskonstante von wäßrigen Lösungen ist bei niedrigen Spannungen gemessen von der Frequenz bis zu annähernd 1 GHz unabhängig und unter den normalerweise in einem Fermentiergefäß herrschenden Bedingungen im wesentlichen unbeeinflußt durch das Vorhandensein von gelösten Gasen und nicht zellenförmiger Partikelsubstanz.
Die Dielektrizitätskonstante einer wäßrigen Lösung bildet eine Bezugs- oder Basislinie, gegenüber der der Zellengehalt einer Kultur bestimmt werden kann.
Die Dielektrizitätskonstante einer Zellensuspension ist stark frequenzabhängig. Beispielsweise könnte die Dielektrizitätskonstante einer Suspension von bakteriellen Zellen mit einem Radius von 0,5 um und einem Volumensanteil von 0,1 bei 100 kHz annähernd 250 sein. Sowie die Frequenz erhöht wird, nimmt dieser Wert zu einem Basislinienwert hin ab, der im wesentlichen demjenigen der Suspensionsflüssigkeit entspricht. Der für Zellensuspensionen zu findende frequenzabhängige Anstieg der Dielektrizitätskonstante über den Basislinienwert für eine wäßrige Lösung ist als Dispersion bekannt. Allgemein sind drei Haupt- Dispersionen (α, β und γ-Dispersion) zu erkennen, wobei die β-Dispersion für die Erfindung besonders wichtig ist. Die α-Dispersion tritt bei niedrigeren Frequenzen als die β-Dispersion auf und ist hauptsächlich durch das Vorhandensein von beweglichen Ionen an der Zellenoberfläche verursacht. Die γ-Dispersion tritt bei höheren Frequenzen als die β-Disperion auf und ist vorherrschend durch die Drehung von Dipol-Stoffarten wie Wasser verursacht. Die α-Dispersion ist stark von der Struktur der Zellenwandung abhängig, während die γ-Dispersion nicht für unversehrte Zellen spezifisch ist.
Die β-Dispersion der Dielektrizitätskonstante wurde von H.B. Schwan angeführt (Advances in Biological Medical Physics, Band 5, 147 bis 209, 1957). Sie ist hauptsächlich durch das Vorhandensein von für Ionen verhältnismäßig undurchlässigem Zellmembranen verursacht und hat die annähernde Form einer umgekehrten S-Kurve. Ihre Größe für sphärische Zellen kann bei gegebenem Cm als nur von dem Zellenradius und dem von den Zellen eingenommenen Volumensanteil abhängig angesetzt werden. Andere Einflüsse sind Konstanten oder können als solche angenommen werden. Ihre Lage auf der Frequenzachse hängt von dem Zellenradius und den internen und externen elektrischen Leitwerten ab. Die große Höhe der β-Dispersion ist auf Zellen mit einem leitenden Inneren Zurückzuführen, das von dem Äußeren durch eine schlecht leitende Membran getrennt ist, die eine große Kapazität von beispielsweise 1 uF/cm² ergibt. Ihre Größe ist daher direkt proportional zu dem von den Zellen eingenommenen Volumensanteil. Die Höhe der β-Dispersion ist in Bezug auf die Wirkungen von nichtzellenförmigen Partikeln, gelösten Gasen oder Öltröpfchen in der Suspension groß. Dies erlaubt das Messen des Biovolumens (das zu der Biomasse durch die Dichte des Zellenplasmas in Beziehung steht) ohne wesentliche Beeinträchtigung durch Teilchen oder Öltröpfchen in Zellensuspensionen. Die β-Dispersion ist eine Besonderheit von unversehrten Zellen (siehe Pethig "Dielectric and Electronic Properties of Biological materials", Wiley, 1979) und ihre Höhe ist bis zu sehr hohen Volumensanteilen direkt proportional zu dem Volumensanteil von Zellen in einer Suspension.
Geeignete Frequenzen für das Messen von Biomassen umfassen Frequenzen, bei denen die β-Dispension im wesentlichen vollständig ist, aber bei denen die α-Dispersion im wesentlichen unbedeutend ist. Es können Messungen bei der ganzen β-Dispersion vorgenommen werden, jedoch liegen optimale Meßfrequenzen in der Hälfte der β-Dispersion, die bei niedrigeren Frequenzen auftritt, bevor die α-Dispersion erreicht ist. Geeignete Frequenzen umfassen Hochfrequenzen von 0,1 bis 10 MHz, insbesondere 0,1 MHz bis 1 MHz, wobei ein bevorzugter Bereich 0,2 bis 0,3 MHz ist. Für große Zellen können Frequenzen unterhalb von 0,1 MHz als geeignet befunden werden, während für Kulturen mit einem hohen elektrischen Leitwert Frequenzen über 1 MHz als geeignet befunden werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Bestimmen eines Biomassengehalts eines großen Bereichs an Kulturen angewandt werden, der Kulturen mit pflanzlichen, tierischen und mikrobiellen Zellen umfaßt, und der Fermentierprozeß kann zum Herstellen einer großen Vielfalt von Produkten angewandt werden. An nutzvollsten ist jedoch das erfindungsgemäße Verfahren bei mikrobiellen Kulturen anwendbar, die bakterielle Zellen, Hefezellen oder Pilzzellen enthalten. Die Suspensionsflüssigkeit wird häufig ein wäßriges Kultursubstrat sein, das für die darin suspendierten Zeilen geeignete Nährstoffe enthält, z. B. Zusammensetzungen, die Kohlenstoff, Phosphor, Stickstoff und andere Bestandteile von wesentlichen Nährstoffen enthalten.
Der erfindungsgemäße Fermentierprozeß kann in einem Fermentiergefäß irgendeiner beliebigen Art ausgeführt werden. Die Dielektrizitätskonstante kann durch das Messen der Kapazität zwischen Elektroden bestimmt werden, die in einer Probe der Kultur in gegenseitigem Abstand angeordnet sind. Dies kann durch Verwendung einer Brückenschaltung oder einer anderen Schaltung ausgeführt werden. Vorzugsweise werden die Meßelektroden an dem bei dem erfindungsgemäßen Prozeß verwendeten Fermentiergefäß angebracht, um direkte on-line-Messungen zu ermöglichen. Alternativ können Proben aus dem Fermentiergefäß entnommen werden.
Beispiele für das Verfahren und den Prozeß sowie ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Geräts werden nun unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
Fig. 1 typische Änderungen der Kapazität gegen die Frequenz bei unterschiedlichen Konzentrationen von Zellen in einer Kultur zeigt,
Fig. 2 die zeitliche Änderung der Kapazität bei einer festgelegten Frequenz während des Wachsens einer Kultur in einem Gashub-Fermentiergefäß zeigt,
Fig. 3 die gegen die optische Dichte von dem Fermentiergefäß entnommenen Proben aufgetragene Kapazität zeigt, und
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Geräts als Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt.
Gemäß Fig. 4 ist in dem Sockel eines Gashub-Fermentiergefäßes 2 ein Paar von beabstandeten Drahtelektroden 4 eingesetzt. Die Elektroden 4 sind an entsprechende Anschlüsse eines Niederfrequenz-Impedanzanalysators 6, Typ Nr. 4192 A von Hewlett Packard angeschlossen. Zum Verringern der Auswirkungen der Eigenkapazität der Verbindungsleitungen wird der Impedanzanalysator 6 so nahe wie möglich an den Anschlüssen zu den Elektroden angeordnet. Tatsächlich kann der Impedanzanalysator unterhalb des Fermentiergefäßes sein. Zum Verringern der Auswirkungen einer Polarisation des Kultursubstrats an den Elektroden sind diese Platinschwarz. Der Kultur wird über einen Einlaß 8 Luft zugeführt.
In dem Gashub-Fermentiergefäß wird Saccharomyces cerevisiae gezüchtet. Das Kultursubstrat enthält 5% (Gewichtsteile) Malzextrakt und 0,5% (Gewichtsteile) Hefeextrakt. Der anfängliche pH-Wert wird auf 4,5 eingestellt und die Temperatur beträgt 30ºC. Der Leitwert dieses Substrats ist ungefähr 1,57 mS/cm. Die typische frequenzabhängige Kapazität ist in Fig. 1 für eine Anzahl von unterschiedlichen Zellenkonzentrationen gezeigt. Es ist ersichtlich, daß eine ziemlich große dielektrische Dispersion auftritt, die von der Zellenkonzentration abhängig ist. Die Dispersion entspricht hinsichtlich der Höhe und der Relaxationszeit der β-Dispersion. Für eine festgelegte Frequenz von 0,3 MHz zeigen die Fig. 2 und 3 jeweils die Kapazitätsänderung im Zeitablauf und gegen die optische Dichte von Proben aufgetragen, die dem Fermentiergefäß entnommen und auf geeignete Weise verdünnt sind.
Die Produktivität eines Fermentierprozesses ist von der Beschaffenheit der Kultur abhängig. Eine der wichtigen Variablen bei dem Fermentierprozeß, die vorteilhaft zu messen ist, ist die Biomassenkonzentration. Es ist auch vorteilhaft, die Fermentierung mit einer bestimmten Biomassenkonzentration oder mit der Konzentration innerhalb eines vorbestimmten Bereichs ablaufen zu lassen.
Die vorstehend beschriebene Gerätschaft kann zum Bestimmen der Kapazität bei einer festgelegten Frequenz, zum Beispiel von 0,3 MHz entsprechend den bestimmten Biomassenkonzentrationen geeicht werden. Das Gerät kann zur direkten Anzeige der Biomassen geeicht werden.
Die on-line-Messung der Kapazität oder Biomasse ergibt ein kapazitätsabhängiges Signal, das einer Prozeßsteuereinheit 10 zugeführt wird, in der es mit einem Bezugssignal verglichen wird. Alternativ kann die Prozeßsteuereinheit ermitteln, ob das kapazitätsabhängige Signal innerhalb eines vorbestimmten Bereichs liegt. Die Prozeßsteuereinheit ist für das Einstellen von mindestens einem Parameter des Fermentierprozesses zu einem Zurückführen des kapazitätsabhängigen Signals zu dem Bezugssignalwert oder dem vorbestimmten Bereich hin gestaltet. Zu einstellbaren Parametern zählen der Sauerstoffdurchsatz, nämlich der Luftzufuhrdurchsatz, der Verdünnungsgrad, der Grad des Zusetzens von Nährstoffen oder einer neuen Kultur bei einem kontinuierlichen Prozeß, die Temperatur usw.
Ein bestimmtes bevorzugtes Ausführungsbeispiel für ein Gerät zum Gebrauch im Zusammenhang mit der Erfindung ist in unserer parallelen GB-Anmeldung Nr. 8 622 748 (die der EP-0 281 602 entspricht, die unter dem Zeichen B 34038 von den Erfindern Kell und Todd am selben Tag wie diese Anmeldung eingereicht worden ist) beschrieben, auf deren Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird und die damit auch Gegenstand dieser Anmeldung ist.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen von Biomasse in einem Medium, das Suspensionsfluid und Zellen enthält, wobei ein von der Dielektrizitätskonstante von Material im Inneren des Mediums abhängiges Signal erzeugt wird, indem vom Messen der elektrischen Kapazität zwischen voneinander beabstandeten Elektroden (4) in dem Medium bei einer vorbestimmten Frequenz Gebrauch gemacht wird, die so gewählt wird, daß die Dielektrizitätskonstante sich mit dem durch die Zellplasmamembrane der Zellen eingeschlossenen Volumenanteil des Mediums ändert, und der Volumenanteil aus dem von der Dielektrizitätskonstante abhängigen Signal bestimmt wird.

2. Fermentierprozeß, bei dem eine Kultur benutzt wird, die eine Suspensionsflüssigkeit und Zellen enthält, wobei ein von der Dielektrizitätskonstante von Material im Inneren der Kultur abhängiges Signal erzeugt wird, indem vom Messen der elektrischen Kapazität zwischen voneinander beabstandeten Elektroden (4) in der Kultur oder in einer Probe hiervon bei einer vorbestimmten Frequenz Gebrauch gemacht wird, und eine Anzeige abgegeben wird, falls das von der Dielektrizitätskonstante abhängige Signal von einem vorbestimmten Wert abweicht oder aus einem vorbestimmten Bereich fällt, und/oder der Wert eines Prozeßparameters für das Zurückführen des Signals zu dem vorbestimmten Wert oder zu dem vorbestimmten Bereich geändert wird, wobei die vorbestimmte Frequenz so gewählt wird, daß die Dielektrizitätskonstante sich mit dem durch die Zellplasmamembrane der Zellen eingeschlossenen Volumenanteil der Kultur ändert.

3. Gerät für das Ausführen einer Fermentation unter Benutzung einer Kultur, die eine Suspensionsflüssigkeit und Zellen enthält, wobei das Gerät ein Fermentiergefaß (2) zur Aufnahme der Kultur, Elektroden (4), die in dem Fermentiergefäß (2) in gegenseitigem Abstand derart angeordnet sind, daß sie mit der Kultur in Kontakt sind, und eine Einrichtung (6) zum Erzeugen eines Signals enthält, das von der Dielektrizitätskonstante im Inneren der Kultur abhängt, indem vom Messen der elektrischen Kapazität zwischen den Elektroden (4) bei einer vorbestimmten Frequenz Gebrauch gemacht wird, die so gewählt ist, daß die Dielektrizitätskonstante sich mit dem durch die Zellplasmamembrane der Zellen eingeschlossenen Volumenanteil des Mediums ändert.

4. Gerät nach Anspruch 3, das eine Einrichtung (10) enthält, die bestimmt, ob das von der Kapazität abhängige Signal sich von einem vorbestimmten Wert unterscheidet oder aus einem vorbestimmten Bereich von Werten heraus fällt.

5. Gerät nach Anspruch 4, das eine auf die Bestimmungseinrichtung ansprechende Einrichtung enthält, die einen oder mehrere Prozeßparameter ändert, um das von der Kapazität abhängige Signal zu dem vorbestimmten Wert oder dem vorbestimmten Bereich hin zu ändern.

6. Gerät nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die vorbestimmte Frequenz in einem Bereich von 0,1 MHz bis 10 MHz liegt.