DE2030713A1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Testflussigkeit und Vorrichtung zu seiner Durchfuhrung - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Testflussigkeit und Vorrichtung zu seiner DurchfuhrungInfo
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Description
Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46514, USA
betreffend:
Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer
Testflüssigkeit und Vorrichtung zu seiner Durchführung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Testflüssigkeit,
wobei die Substanz, wenn sie mit einem für sie ■
spezifischen Testreagens in Berührung kommt, zu einem Ionenaustausch
und dadurch zu charakteristischen elektrischen Veränderungen
führt, wobei die Vorrichtung und das Verfahren dadurch gekennzeichnet sind, daß man die Testflüssigkeit mit
einer Matrix in Berührung bringt, auf der sich das Testreagens befindet und dann die elektrischen Werte in'oder auf dieser
Matrix, die sich in Berührung mit der Testflüssigkeit befindet, mijjt. Das Verfahren umfaßt vorzugsweise die Verwendung
einer Vorrichtung, die ein Elektrodensystem und eine Matrix enthält, auf der sich das Testreagens befindet, wobei die
Matrix in elektrischem Kontakt mit dem Elektrodensystem steht sowie Vorrichtungen zur Messung der Leitfähigkeit und/oder
der Ableitung der Leitfähigkeit nach der Zeit (dae/dt) des
Klektrodensystems. ■
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und oin Verfahren zur
quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Tesbflüscic-
009883/1909 - <- -
keit und besonders zur quantitativen Bestimmung eines Reaktipnsteilnehmers
bei einer Enzym-Substratreaktion sowie zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Körperflüssigkeiten,
die als Enzymsubstrate V7irken können sowie die Bestimmung von einzelnen Komponenten, wie Harnstoff, Glucose
und Harnsäure in Körperflüssigkeiten.
Die Apparatur und das Verfahren der vorliegenden Erfindung besitzen zahlreiche wichtige Vorteile gegenüber den bekannten
und zwar eine größere Geschwindigkeit, Bequemlichkeit, Flexibilität,
Einfachheit und Genauigkeit bei der Durchführung der Bestimmungen.
Obwohl es sich gezeigt hat, daß die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders,gut für die Bestimmung
einer Komponente eines Enzym-Substratsystems verwendet v/erden können, sind sie auch geeignet zur Bestimmung
irgend einer Komponente in einer Testfliissigkeit, die, wenn
sie mit einem für sie typischen Testreagens zusammenkommt, zu einem charakteristischen Ionenaustausch führt, der mit
Instrumenten, die auf diesen Ionenaustausch ansprechen, gemessen werden kann.
Bei einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden getrennte Elektroden, die sich in- innigem
Kontakt mit unbeweglich gemachtem oder fixiertem Testreagens befinden, mit einer Lösung in Berührung gebracht, die die
nachzuweisende Komponente enthält, wobei der angeschlossene Stromkreis jeden Ionenaustausch in der die Elektrode umgebenden
Testflüssigkeit anzeigt. Die.Verbindung von Elektroden und Testreagens sowie Meßvorrichtung stellt eine Einheit zur
ilessung der Konzentration der zu untersuchenden Substanz dar.
Dieses einzigartige Meßschema ist anwendbar'für Jede Testreaktion
bei der ein unbeweglich gemachtes öder fixiertes Testreagens
für eine Reaktion verwendet wird, bei der cliarakteristi'-
"■-""■■ — 3 —
Q0 98&3/1SÖS
. BADORlGlNAt
sehe elektrische Veränderungen auftreten. Die Messung derarti
ger elektrischer Werte wird dann direkt in einen Zusammenhang
gebracht mit der Konzentration der zu bestimmenden Substanz.
Weitere Aufgaben, Vorteile und Einzelheiten der Konstruktion
sowie Beispiele für die Anwendung der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den Zeichnungen
hervor, wobei:
Fig. 1 eine isometrische Ansicht einer ersten Ausführungsform einei? Meßsonde nach der Erfindung,
Pig. 2 eine isometrische Ansicht einer anderen Ausführuiigsforia
einer Meßsonde nach der Erfindung,
Fig. 3 ein Blockschaltbild einer Meßschaltung für die
Meßsonden,
Fig. 4· das Schaltbild der in der MeBschaltung verwendeten Differenzierschaltung der Figur 3 und
Fig. 5 &ie graphische Darstellung verschiedener Sondenkennlinien
für die erfiiidungsgeinäiSeii Sonden, welche
die Beziehung zwischen der anfänglichen llonzentrat
ion einer Probe und den Maximalwert en der
Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der erfindungagemäßen
Heßsonde sind durch eine flache 1,6 mn (1/16 inch) dicke Plexiglasplatte 11 zwei Löcher gebohrt, durch die
zwei QyG-mii {??: gauge): Platindrähte 1? und 13 hindurchgezogen
und so abgebogen sind, daß sie über die Überfläche der
Platte 11 verlaufen. Die freiliegenden Teile der Drähte
12 und 13 sind 1 cm lang und verlaufen im Abstand von d mm
parallel. Die■ürähte 1? und 13 sind an der -andoren Seite der
Platte mit'/Vulpitimgen-14 υηά 15 verbafiden, die axial durch
■-.-■■■■- 4 '-
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einen 1,27 cm χ 15,24 cm (1/2 inch χ 6 inch) großen PoIystyrolhandgriff
16 hindurchlaufen, der koaxial auf der Platte 11 befestigt ist. Eine Tygon-Hülse 17 umschließt mit Paßsitz
die Platte 11 und den Handgriff 16 und ragt über die Oberfläche der Platte 11 hinaus, wobei zusammen mit der Platte
eine Höhlung 18 entsteht, die eine scheibenförmige Schicht
19 aus einem enzymhaltigen Gel, die diese Höhlung ausfüllt,
mechanisch festhalten kann. Die Zusammensetzung und die Herstellung der Schicht 19 werden später beschrieben. Die Höhlung
18 besitzt bei dieser Ausführungsform einen Durchmesser von
1,27 cm und eine Tiefe von 1 mm. Die Zuleitungen'14 und 15
sind an einen Leitfähigkeitsmesser angeschlossen, der in
der I'ig. 1 nicht gezeigt wird-. ■
Die in Fig. 2 gezeigte Heßsonde enthält eine Polystyrolscheibe
20 mit einem Durchmesser von 1,27 cm und einer Dicke von 9,5 mm (3/8 inch). Zwei Bohrungen mit einem Durchmesser von
0,64 mm (0,025' inch) wurden im 'Winkel so dicht wie möglich
zusammen von der Oberfläche her durch die Scheibe gebohrt · und zwei jO^öf mm (22 gauge) Drahte 21 und 22 aus reinem
Platin mit einer Länge von 15,9 mm (5/8 inch) wurden durch
diese Bohrungen hindurchgeführt, so daß ihre Enden sich an
einem Punkt unmittelbar hinter der Oberfläche der Scheibe berührten. Eine Schicht aus einem Plastikmaterial (nicht
gezeigt) wurde auf die Oberfläche der Scheibe 20 und in Berührung mit den Drähten 21 und 22 aufgetragen und. getrocknet.
Die äußere Oberfläche der Scheibe 20, auf der sich die Plastikschicht
befand, wurde dann senkrecht zu der Achse der Platte 20 in einer Tiefe abgeschnitten, die ausreicht,um. den Teil
der Drähte 20 und 21 zu entfernen, der miteinander in Berührung
steht, so daß die off einliegenden Enden der Drähte keinen Kontakt
miteinander haben, wie durch elektrische Untersuchungen festgestellt wurde. Dann wurde ein Polystyrolring 23 mit einer"
Dicke von 1/6 mm, einem äußeren Durchmesser'von 12,7 mm. '■■'
(1/2 inch) und einem inneren Durchmesser von >,'2 mm (-.1/8" inch)
koaxial auf der Oberfläche der Scheibe 20berestigt; w'obei'öie: ~
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Enden der Drähte 21 und 22 in der Mitte der Höhlung 24,
die durch den Ring 2'3 und die Oberfläche der Scheibe 20 gebildet-wird, offenlagen und die Höhlung einen Durchmesser
von 2,8 mm und eine Tiefe von 1/6 mm besaß. Ein Kabel 25
mit zwei abgeschirmten Leitern, das in geeigneter Weise an diePlatindrähte 21 und 22 angeschlossen ist, geht 15>2 cm
durch einen Polystyrolstab 26 hindurch, der koaxial auf der Rückseite der Scheibe 20 befestigt ist und als
Griff dient.
Es wurde eine andere Meßsonde von der in Fig. 2 gezeigten Art hergestellt, bei der die Höhlung 24 einen -Durchmesser
von 2,8 mm und eine Tiefe von 1/2 mm besaß.
Die Herstellung eines Gels, das in der Höhlung 18 der Fig.
oder der Höhlung 24 der Fig. 2 verwendet werden kann, wird
im folgenden angegeben, wobei speziell die Herstellung eines ureasehaltigen Polyacrylamidgels beschrieben wird, das zur
Bestimmung von Harnstoff geeignet ist. Es können jedoch selbstverständlich
auch andere Gele und Membrane auf ähnliche Weise
hergestellt v/erden, die andere Testreagentien enthalten.
Ein ureaseh<iges Gel wurde unter Verwendung der folgenden
Substanzen und Mengen hergestellt:
1 ml einer Lösung von 400 g/l Acrylamid
4 ml einer Lösung von23 g/l H,IT-Methylen~bis~(acrylamid)
(als Vernetzungsmittel)
0,03 mg Riboflavin
0,03 mg Kaliumpersulfat
1,6 g rohe Urease (Worthirigton).
Das Gel wurde entsprechend der in dem Artikel von Hicks und Updike in Anal. Chem. 38, 726 (1966) angeeebenen Vorschrift
hergestellt mit der Ausnahme, daß die Losungen von dem Monomer und*dem Vernetzungsmittel in Wasser und nicht in Puffer-
. — 6 .— ■■■■
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lösung hergestellt wurden und das Enzym Urease in das Gel eingebaut wurde. Das Gemisch, das in die Höhlung 18 der in ·
Fig. 1 gezeigten Meßsonde gegeben wurde, enthielt 0,04 g Urease.
Zur Herstellung eines Gels, das in die Höhlung 24 der in
Fig. 2 gezeigten Meßsonde gegeben wurde, wurden die folgenden Mengen an Bestandteilen verwendet:
1 ml einer Lösung von 4QO g/l Acrylamid
4 ml einer Lösung von 23 g/l H,N-Methylen-bis-(acrylamid)
(als Vernetzungsmittel)
0,03 mg Riboflavin .
0,03 mg Kai lump er sulfat . . "'
0,64 g rohe Urease (Worthington)
Das in die Höhlung 24 der in Fig. 2 gezeigten Meßsonde mit einem Durchmesser von 2,8 mm und einer Tiefe von 1/6 mm
gegebene Gemisch enthielt 0,133 mg Urease, während das in die entsprechende Höhlung 24 mit einem Durchmesser von
2,8 mm und einer Tiefe von.1/2 mm einer ähnlichen Meßsonde
gegebene Gemisch 0,4 mg Urease enthielt. .
GemM.ß der vorliegenden Erfindung wird eine der oben beschriebenen
und in den Fig. 1 und 2 gezeigten Meßsonden, die ein Paar getrennt angeordneter Elektroden besitzen, die·mit dem
unbeweglich gemachten oder■fixierten Testreagens in Berührung
stehen und mit einer Vorrichtung verbunden sind, die die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit mit der Zeit :
wahrnimmt und mißt, über das unbeweglich gemachte oder fixierte Reagens mit der zu bestimmenden Substanz in Berührung
gebracht und eine quantitative Bestimmung dieser Substanz wird dadurch erreicht, daß man die auftretende elektrische
Leitfähigkeit und/oder die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit mit der Zeit an diesen Elektroden mißt.
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BAD ÖRiGiNAL
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Das Blockschaltbild.einer Meßschaltung für die Sonden zeigt
Fig. 3. Die Elektroden der Meßsonde^sind an einen Leitfähigkeitsmesser 50 angeschlossen. Dessen Ausgang steuert den
einen Kanal eines 2-Kanal-Diagramm-Schreibers 54 mit gleichen
Eingangsschaltungen in beiden Kanälen sowie eine Differenzierschaltung 51» Vielehe eine Spitzen-Klemm-Schaltung und ein
Differenzierglied umfaßt. Der Ausgang der Differenzierschaltung 51 ist zum zweiten Kanal des Diagramm-Schreibers 54 sowie
zu einen digitalen Voltmeter 52 geführte An den Ausgang des
digitalen Voltmeters 52 ist ein Drucker 53 angeschlossen. e geeicht und zwar, indem das Verhältnis inm3£/-rttS^ür eine zum
Anschluß eines Schreibers vorge^iteiTS^fusgangskleiame am •Leitfähigkeitsmesser bejp2ÄteTe"1f"und eine äquivalente zeitliche Änderung
in/uS/^^cauf der Grundlage einer linearen Auflaüege-·
Wie aus Pig. 4 hervorgeht, ist die erwähnte, nicht gezeigte Ausgangskleinme des Leitfähigkeitsmessers 50 über eine Diode
an den positiven Eingang 28 eines Verstärkers 29 in der Spitzenklemm sch al tungKlänge sch Io ssen. Zwischen dem Eingang 28 und
Masse liegt ein Kondensator 30a, aessen Kapazität beispielsweise
1,0/U]? betragen kann. Die beiden Anschlüsse des Verstärkers 29 für die Kompensation der Eingangsverzogerung sind,
mit einem Kondensator 31 von 0,1/uP überbrückt. Sine Rück-
kopplungβ schaltung 3! a verbindet den Ausgang 32 des Verstärkers
29 mit seinem negativen Eingang 33» Die Spitzen-Klemmschal
tun^cxient zur Reduzierung der normalerweise vorhandenen
"Helligkeit des Ausgangssignals des Leitfähigkeitsmessers 50.
Der Ausgang des Verstärkers 29 ist über eine. Seiisnschaltung
mit einem widerstand 34aj z.3, von 680vt, und einem Kondensator 34 von z.3. 600/aP an den negativen Eingang 35 eines
Verstärkers 36 im Differenz!erglieck'-g'efährt. Das Differenzier-.
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glieclM-iefert eine Ausganga^Dannung, die der zeitlichen Änderung des Ausgangssignales des leitfähigkeitsraessers 50
proportional ist. Zwischen dem Eingang 38 und Hasse liegt
ein Y/iaerstand 37 von z.B. 100 k-Ω- Die Anschlüsse des Verstärkers
36 für die Kompensation der Eingangsverzögerung sind mit eines Kondesator 41 in der Größenordnung von 0,1 /uF überbrückt.<
Eine einen widerstand 42 von "beispielsweise 100 k-Ω.
umfassende Rückkopplungsschaltung liegt zwischen den Ausgang
43 des Verstärkers 36 und dessen negativem Eingang-35·
Der Ausgang des Verstärkers 36 ist über einen "Widerstand 44,
dessen Y.'ert beispielsweise 0,5. LI-£Lbetragen kann, ar)den einen
festen Anschluß45 eines Potentiometers 46 von "beispielsweise
100 k !geführt. Der zweite feste Anschluß 47 des Potentio-'
meters 46 liegt an Masse. Der Schleifkontakt 49 des Potentiometers
ist, wie bereits erläutert, mit dem 2-Kanal-Diag7"amrii-Schreiber
54 und dem digitalen Voltneter 52 verbunden, welches
einen Ilehrbereichs-Eingsng für Gleichspannung besitzt.
Die Kurven der Pig. 5 zeigen gemessene Änderungsgeschwindig- ·
keiten "bzw. zeitliche Änderungen der Leitfähigkeit als Punktion
der anfänglichen liarns.toff-Konzentration.· Aus den -Kurven
geht klar hervor,- daß .man für die zur Untersuchung .von Harnstoff
vorbereiteten iüeßsonden eindeutige, auf der Anderungs—
geschwindigkeit beruhende Kenr.lii.ien aufnehmen kann. Der IJaxii;:alwert
von dtf/ut ist -offensichtlich einn Punktion der Dicke
bzw ο Stärke des 3-els, der iüenge aes Ln-zyrns im Gel und der
Harnstoff-Konzentration. Die Daten wurden nach einer anfanglichen
Eichung der Einheit für ds/dt unter Verwendung-der
oben erläuterter, Gleichstroiuschaltung aui'£;erior;i:::eri. üei Untersuchungen
mit der in Pig. 1 angegebenen iceissonie wurden die
Lösungen gerührt, während die Messungen iait der in der Pig...
gezeigten. Ließ ε ende an nicht gerührten Lösungen vorgeiio^imen
wurden» Prinzipiell dient nicht üie Lösung, sondern das Gel,,
das die jrähte btueckt, al« Leitfähir]:eitsir.ediur.:o . ·-- .
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BAD ORJQINAL -
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch eine äußere semipermeable Membran enthalten, die die Matrix, die das unbeweglich gemachte Enzym enthält, bedeckt. Eine derartige äußere
Membranhülle dient dazu» die Diffusion der £estfliissigkeit in
das Gel zu regeln und zu vermeiden, daß das !Pestreagens aus
dem Gel hinausdiffundiert. Die äußere Membran kann irgend eine
der verschiedenen semipermeabler Folien, wie z.B. Cellophan, Hylon usw., umfassen. Die Verwendung von derartigen äußeren
Folien verlängert die Lebensdauer der Meßsonde wesentlich.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es möglich, yiewi man
z.B. Urease verwendet, die in einem semipermeablen Polymer, einer Kembran oder ähnlichem unbeweglich gemacht oder fixiert
worden ist, zwischen verschiedenen Konzentrationen von Earnstoff
in wäßrigen Lösungen zu unterscheiden, die im Bereich von ca. 6bis 1 200 mg cfi (0,001 bis 0,2 molar, 60 bis 12 OOOppm)
liegen, wobei die elektrische Leitfähigkeit und/oder die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit mit üer Zeit gemessen
wird.
Typische andere Substanzen, deren Konzentration in wäßriger
Lösung gemessen werden kann, sind z.B. Glucose und Harnsäure,
wobei Meßsonden verwendet werden, die eine unbeweglich gemachte Form eines Enzyms oder Testreagenses enthalten, mit dem
die zu bestimmende Substanz unter Ionenaustausch reagiert.
Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
köiHien zur kontinuierlichen in vivo-tiberv/achung von Patienten
angewandt werden und eine Reihe eier hier beschriebenen Vorrichtungen
kann für eine Vielzahl von Substanzen in einer
automatischen Anordnung zur schnellen und kontinuierlichen
Messung einer Vielzahl von Proben, z.B. in Art eines Fließbandes,
angewandt werden. Die Größe der Vorrichtung hängt nur von den jeweiligen technischen HerstellungsEiöglicnkeiten ab
und kann aufs äußerste verkleinert werden zur in vivo-Untersuchung
von biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Blut» auf
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BAD ORIGINAL
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spezielle Substanzen, wie oben beschrieben ist. Außl^dem ■"'*■■■'■
können die erfindungsgemäße Vorrichtung und besonders die
Elektroden nach Wunsch in sehr vielen verschiedenen Formen hergestellt
werden. Die elektronische Gießvorrichtung der vorliegenden
Erfindung kann ebenfalls so modifiziert werden,,
daß sie die empfindlichsten und selektivsten Werte in Beziehung auf Störungen, Konzentration der zu untersuchenden
Substanz usw ergibt.
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Claims (18)
- ,1Δ-38 207St"Stm*:"behrbn8»β· PATENTANSPRÜCHEVerfahren zur quanititativen Bestimmung einer Substanz in einer Testflüssigkeit, die, wenn sie mit einem für sie spezifischen Testreagens zusammenkommt, zum Ionenaustausch führt, dadurch gekennzeichnet , daß man die Testflüssigkeit mit einer Matrix zusanmenbringt, in der ö.as Testreagens fixiert ist und dann den Ionenaustausch in oder auf dieser Matrix, die sich mit der Flüssigkeit in Kontakt "befindet, mißt.
- 2) .Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ. e ich net , daß nan zum I\achv.reis eines Substrates für ein Enzym eine Hatrix verwendet, in der dieses Enzym enthalten ist,
- 3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , -daii das Enzjmi Urease und das Substrat Harnstoff ist.•x-
- 4) Verfahren nach Anspruch 1/ dadurch* gekennzeichnet, da3 die Matrix semipermeaoel ist und ein.. Sn-ZjTC in ihr uiToeweglich gemacht vorden ist.
- 5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dp.durch g e k e η η zeichnet , daS die Matrix ein Polymeriaaterial ist.
- 6) Verfahren nach Anspruch 1 Ms 51 dadurch g e k e η η ζ e ic h η et , daß die Matrix ein Polyacr^lar.ic.gel ist.
- 7) Verfahren nach Anspruch t. bis 6, dadurch g e k e η η zeichnet , daß α er· loneiiaustausch mit Hilfe eines itfäMghcitsnie'ssers "besti:ii:-t v;ird.s 3009883/1909BAD1A-38 20712 -
- 8) Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß sie ein.Elektrodensystem und eine Matrix in oder auf der das Testreagens fixiert ist, enthält, wobei die Matrix mit dem Elektrodensystem in elektrischem Kontakt steht.
- 9) Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Elektrodensystem zwei Elektroden (12, 13; 21,22) umfaßt.
- 10) Vorrichtung nach Anspruch 9, daduj-c-l gekennzeichnet , daß die Elektroden (12, 13; 21,22) an eine Meßschaltung (50 bis 5^0 angeschlossen sind.
- 11) Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch g e k e η η zeichnet , daß die Meiischaltung (50 bis 54) einen Leitfähigkeitsmesser (50) für die Leitfähigkeit zwischen den Elektroden (12, 13; 21, 22) unfa.it.
- 12) Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Meßsch<mig eine Mf f erensierschaltung (51) umfaßt, deren Ausgangssignal der zeitlichen Ableitung der Leitfähigkeit entspricht.
- 13) Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet. , daß das in der Matrix fixierte Reagens ein Enzym ist.
- 14) Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß die Matrix semipermeabel und. das Reagens darin unbeweglich gemachtes Enzym ist.
- 15) Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t. , daß das Enzym Urease let.009883/1909BAD ORIGINAL. " · 1A-.38 207• - 13 -
- 16) Vorrichtung nach Anspruch 8 "bis 14,. dadurch gekennzeichnet , daß das in der Matrix fixierte Reagens ein Enzym ist und die Matrix mit einer semipermeable^ Membran "bedeckt ist.
- 17) Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß die semipermeable Membran Cellophan ist. ■■■■'■■'■
- 18) Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 17, dadurch g e -k e η η ze i c h η e t , ^daß die Matrix ein Polyacrylamidgel ist.6269XaIV000883/1909Leer seife
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