DE2127142A1 - Analysiergerät - Google Patents

Description

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DR.IJSG. F. WUESTHOFF DIPL. TNG. G. PULS DR.E.v.PECHMANN DH. ING. D. BEHRENS PATENTANWAl/TJä

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Beschreibung
zu der Patentanmeldung

Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46514

betreffend

Analysiergerät

Während die klassische analytische Chemie dem Biochemiker hochspezifische'Testreagentien an die Hand gab» erlaubt die moderne Meßgeräteausrüstung eine rasche und j^aantitave Ablesung der Reaktion zwischen der zu bestimmenden Verbindung und dem hochspezifischen Testreagens. Die Kombination spezifischer Testreagentien und hochentwickelter Meßgeräte führte zur Entwicklung chemischer Routineanalysen, die genau, empfind

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lieh und äußerst rasch durchführbar sind. Ein Beispiel für · hochspezifische Testreagentien sind die Enzyme, die nur mit Jeweils spezifischen Substraten reagieren.

Vor kurzem wurde gefunden, daß spezifische Testreagentien, beispielsweise solche,die Enzyme oder Substrate dafür verwenden, in oder auf einer Matrix immobilisiert oder festgehalten werden können, derart, daß sobald die Matrix mit der zu testenden Flüssigkeit oder dem zu testenden Medium in Berührung kommt, charakteristische elektrische Leitungswerte und/oder Veränderungen der elektrischen Leitfähigkeit mit der Zeit (dK/dtj erzeugt werden, falls die Flüssigkeit oder das Medium die" zu ermittelnde spezifische Substanz enthält· Werden bei Verwendung eines Elektrodensystems derartige Veränderungen gemessen, so können die Meßwerte leicht in quantitative Säten der Konzentration eines Bestandteils der zu testenden Flüssigkeit umgewandelt werden· Bisherige Elektrodensystemeund Testvorrichtungen mit immobilisiertem oder fixiertem Enzym umfassen gewöhnlich zwei Drähte, die in odor auf einem nichtleitenden Träger festgehalten sind, wobei die Drahtenden in genauem Abstand voneinander angeordnet und in eine Matrix eingeschlossen sind, welche das Enzym, Substrat oder ein anderes spezifisches Testreagens enthält· Solche spezifischen ' Testvorrichtungen, sind schwierig herstellbar und reproduderbar. Sie Größe stellt einen kritischen Faktor· dar, da der. Abstand

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der Drahtenden bei der Konstruktion von besonderer Bedeutung ist. Die Vorrichtungen erwiesen sich ferner als äußerst strömungsempflindlich, d.h. die elektrischen Meßwerte hängen ab von der Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung, beispielsweise wenn die zu testende Flüssigkeit oder Lösung

kräftIg gerührt wird. "

Unter der Bezeichnung:"Elektrodensystem" werden in der folgenden Beschreibung ein oder mehrere elektrisch leitende Elemente verstanden, die elektrische Veränderungen wahrnehmen, während mit der Bezeichnung "Analysator" die Kombination aus Elektrodensystem und das spezifische Testreagens enthaltender Matrix, verstanden wird. j

Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung eines derartigen Analysators, der einfach und leicht herstellbar und reproduzierbar ist. Er soll ferner in extrem kleiner Form hergestellt werden können, beispielsweise zur Verwendung in vivo zur Feststellung der Konzentration einer bestimmten Substanz in einer Körperflüssigkeit wie beispielsweise Blut. Der analysierende Teil der Vorrichtung soll ferner billig -'·- sein. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen billigen, zur wiederholten Verwendung geeigneten Vorrichtung· /■ _■ · 7»" _-·.··' <?:v" / · .

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.Es wurde gefunden, daß überlegene Analysatoren hergestellt werden können unter Anwendung von Dünnschichten-Techniken. Vorrichtung und Verfahren gemäß vorliegender Erfindung umfassen die Verwendung eines Elektrodensystems aus einem Paar elektrisch leitender, in Abstand angeordneter Elemente aus dünnen Folien, die sich auf einer elektrisch isolierenden, starren oder halbstarren Basis .befinden und mit dieser verbunden sind, und in die ein immobilisiertes oder fixiertes Testreagens, P auf das Elektrodensystem überlagert, einverleibt ist. Die vorzugsweise aus Metall bestehenden Elektrodenelementen sind mit ein ganzes bildenden Elektrischen Kontaktschienen versehen, so daß leicht Verbindung mit einem Griff und mit der elektronischen Schaltung hergestellt werden kann. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Verwendung eines zweiten Paares von Elektroden, welches dem ersten Elektrodenpaar ähnlich ist, jedoch kein Testreagens enthält. Mit einem solchen System wird eine Differential-Testvorrichtung bereitgestellt.

In den beiliegenden Zeichnungen zeigt Figur 1 perspektivisch .^ ti auseinandergezogener Anordnung eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit ausbaubarem Analysator und · einem Griff dafür. · ■ .

Figur 2 zeigt diagrammatisch die verschiedenen^Stufen zur Herstellung eines Analysator^ gemäß Figur fl, und * ' Figur 3 zeigt ein Blockdiagramm eines elektronischen Ablese-

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systems, welcnes in Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen. Analysator verwendbar ist'.

Das erfindungsgemäße Elektrodensystem umfaßt grundsätzlich eine dünne Folie aus einem gut leitenden Material, welches sich auf einem starren Träger befindet und damit verbunden ist. Die dünne Metallfolie wird in ein definiertes Elektrodenmuster überführt derart, daß Träger und Folie als chemischer Analysator verwendet werden können· Nach Formgebung der Elektrodenelemente wird die Vorrichtung; dann mit einer Matrix oder Membran überschichtet, welche das immobilisierte Testreagens enthält· Streifen der Folie ragen aus den Elektrodenelementen und der Matrix hervor, so daß die Vorrichtung leicht mit einem Griff und/oder der Röhrenschaltung verbunden werden kann. ' ; ·

Figur 1 zeigt eine Ausführungsform der Vorrichtung mit einem Griff 21 und einem herausnehmbaren Analysator 2o· Der Analysator 2o besteht aus einem starren und flachen Träger 1o aus Isoliermaterial wie Keramik, welcher auf einer Seite das Elektrodensystem aus dünner Metallfolie trägt, das die aufgedruckten Elektrodenelemente 11 und 22 umfaßt.. Endstücke der Elemente 11 und 22 besitzen die bei 19 gezeigte Form, die einen Abstand zwischen benachbarten .,Enden der beiden Elektrodenelemente .11 und 22 vorsieht· Die Elemente 11 und 22

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erstrecken sich ferner longitudinal längs des Trägers 1o unter Bildung von Kontaktschienen 25 und 2Ja zur elektrischen Verbindung mit der Iblesevorrichtung über damit zusammenwirkende Kontakte im Griff 21* Eine fließfähige unlösliche_t halb» permeable Matrix oder Membran 12 mit einem.fixierten Testreagens befindet sich oberhalb der Elektrodenanordnung 19 und dichtet diese ab, so daß, wenn der Analysator 2o in die zu testend© Flüssigkeit eingetaucht wird, diese sitaächst die Membran ( und das Testreagens) berühren muß_}worauf ionische ade- andere chemische Veränderungen, deia Endteil dar Elemente 11 und bei 19 vermittelt werden, falls der zu bestimmende Bestandteil in der zu analysierenden Flüssigkeit vorhanden ist. Eine Isolierschicht 15 bedeckt die Seile der Elektrodenelemente und 22 zwischen der Membran 12 und den Kontakt schienen 25 und' 25a unter Abdichtung und verhindert falsche Meßergebnisse, falls der Analysator über die Membran 12 hinaus in die au

testende Flüssigkeit eingetaucht wird.

Mit einem Griff 21 wird der herausnehmbare Analysator 2o festgehalten. Der Griff besteht aus einem länglichen, blei«»' stiftartigen Stiel 14 mit rechteckiger Öffnung 15, in welch© das Endstück des Analysators 2o mit den hervorragenden Kon- ' taktschienen 25 und 25a hineinpaßt und von diesem festgehalten wird. Innerhalb der Öffnung 15 befinden sich an' einer Seite Metallfederkontakte, die mit den'.Koii'takten ^:25 und 25a

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in Einnpriff kommen können. Gegenüber den genannten Kontakten können in der Öffnung 15 Kontakte 16 und 16a vorgesehen sein, die mit einem zweiten Satz Elektrodenelementen, ahnlich den Elementen 11 und 22, zusammenwirken können, welche.sich gegebenenfalls auf der Unterseite des Trägers 1o bei einem .doppelseitig ausgestatteten Analysator 2o befinden können. Der Griff 21 ist ferner mit einem elektrischen Kabel 17 versehen, welches isolierte elektrische Drähte enthält, die. in geeigneter Weise mit den Kontakten in der Aussparung 15 einerseits und am anderen Ende mit einem Mehrfachkontaktstecker 13 verbunden sind. Der Stecker 18 wird verwendet, um die Verbindung mit einem elektronischen Ableseinstrument au erleichtern. - ·

Figur 2 zeigt diagraromatisch ein zur Herstellung des Analysatdrs 2o gemäß Figur 1 geeignetes Verfahren. In Stufe 1 wird ein Trägerteil, beispielsweise ein Stück Keramik, Glas oder

Kunststoff von etwa 5 cm Fläche und 1 mm Dicke sorgfältig gereinigt, in einen Vakuum-Metallverdampfer eingebracht, dann wird das System evakuiert.

Stufe 2 der Figur 2 zeigt den mit einer dünnen Schicht eines Metalles wie Silber, Platin oder Gold beschichteten Träger. Die Metallschicht kann, nach bekannten Verfahren, hergestellt worden sein, beispielsweise durch thermisches. Verdampfen

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mittels einer Widerstandsheizung oder durch Zerstäubung. Der keramische Träger wird auf diese Weise vollständig mit. einer Metallfolie bekannter Dicke von' etwa 1ooo S bis 1o 000 S oder mehr beschichtet.

Die in Stufe .3 der Figur 2 feezeigten Elektrodenelemente können wie folgt hergestellt seini

w 1. Der zuvor mit einer kontinuierlichen dünnen Metallfolie beschichtete Träger wird mit einem Photo-Abdecklack, 25.B. "Shipley Positive Resist" Mr. 135o beschichtet und bei Kaumtemperatur 2 biß 3 Minuten lang getrocknet _β

2. Eine Photo-Abdeckmaske (transparentes Positiv) mit dem Muster des Elektrodenelements gemäß Stufe 3 von Figur 2 wird in direkten Kontakt mit dem Abdecklack gebracht, und der abgedeckte Träger wird mit Ultraviolettlicht belichtet. '

Das so gebildete latente Bild wird in konventioneller Weise entwickelt und mit Wasser gespült.

4« Der Träger wird dann in eine zur Entfernung des Metalls geeignete Ätzlösung eingetaucht, z.B. im Fall von Gold in Aqua regia, um das Metall in den belichteten Bereichen zu

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entfernen, und nach beendeter Atzung wird der. Träger aus der Lösung entnommen und mit Wasser gespült.

5. Die geätzte Elektrode v/ird dann wieder mit Ultraviolettlicht, bestrahlt und entwickelt, um den Abdecklack von den zurückgebliebenen Metallelektroden zu entfernen, die die in Stufe 5 der Figur 2 bezeichnete Form aufweisen können· ·

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Die Elektroden werden dann in einzelne Einheiten getrennt. Eine Methode zur Trennung in einzelne Einheiten besteht darin, daß man das Trägerstück einritzt und zur Herstellung der Einzeleinheiten lediglich längs den Einreißlinien abbricht. . Das Ergebnis ist aus Stufe 4 der Figur 2 zu entnehmen.

Eine Isolierschicht, beispielsweise aus Epoxy- oder Silikonharz, wird über den Mittelbereich des Trägerglledes und die Elektrodenelemente darauf appliziert, wie in Stufe 5 der Figur 2 gezeigt. Die empfindlichen Enden der Elektrodenelemente werden vorzugsweise platinisiert, um die Elektrodenleistung zu verbessern, unter Verwendung einer o,3%igen Lösung von Platinchlorid in o,o125 η-Salzsäurelösung, wobei Wechselstrom 3

Minuten lang in einer Stärke von 1o Milliampere pro cm durch die Elektrode gel⁰**®* wird.

Das Endstück des Trägerglieds mit den platinisiörten Enden der

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Slektrodenelemonte wird dann mit einem in einer Matrix, beispielnweise einem semi-permeablen Membrangel immobilisiertea Testreagens beschichtet, siehe Stufe 6· Das nachfolgend beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Herstellung eines immobilisierten Sastreagenses zur Harnstoffbestimuiung in einer anisotropen Membran* Dieses Verfahren 1st lediglich als Beispiel au verstehen*

^ Eine Lösung eines Cellulosederivats mid des Testr^agenses in einem organischen Lösungsmittel wird hergestellt, indem man' 1oo mg lyophilisierte Eoh-Urease (Aktivität 5o Einheiten pro mg) zu 2o ml Aceton gibt und das Gemisch 1o Sekunden lang jait Ultraschall behandelt. Dann werden 1,o ml Formamid und 3_Äo ml Celluloseacetat (Acetylgehalt 39%5%) zugesetzt, und es wird sorgfältig gemischt. Das Endstück des Trägerglieds mit den Enden der Blektrodenelemsnte (siehe Stufe 5 gemäß Figur 2) wird dann in diese Lösung eingetaucht bis zum Bereich der das Mittelstück überdeckenden Isolierschicht und etwas 'dariibea?- hinaus, so daß die Isolierschicht etwas überlappt v/ird_s Dann wird das Elektrodenglied aus der Lösung entnommen und 1 Minute lang an der Luft getrocknet« Danach wird noch einmal in die Lösung eingetaucht und 1 Minute lang getrocknet, dann wird ein drittes Mal eingetaucht, danach v/ird die sionhaftende Membranschicht 5 Minuten lang getrocknet· Dann.erfolgt Phasenumkehr durch Eintauchen in o_l1m-tris-Sulfatpufferlösung bsi

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pH 7»4 während 3o Minuten. Man erhält eine anisotrope bzw· strukturell polarisierte Meiabranschicht auf den Elektrodengliedern aus dünner Metallfolie und dem Trägerglied.

Figur 5 zeigt ein Blockdiagraaun. mit einem besonders vorteilhaften Differential-Ablesesystem, das zusammen mit den erfindungsgemäßon Analysatören eingesetzt werden kann. Dieses System soll die Hintergrundsleitfälligkeit, die durch, das Testmedium selbst beigesteuert wird,ausschalten. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann leicht einem solchen Differen- . tialsystem angepaßt werden, indem man einen Analysator gemäß i'igur 1 verwendet, bei welchem das Elektrodensystem aus den Elementen 11 und 22 an der Gegenseite des Trägers 1o wiederholt wird, wobei das zweite Elektrodensystem mit einer Membranschicht gemäß Sticht 12 beschichtet ist, die jedoch kein Testreagens enthält. Bei Verwendung eines solchen Analysators nimmt das eine Elektrodensystem mit Elementen entsprechend den Elementen 11 und 22 des Analysators 2o, die mit einer das Testreagens enthaltenden Membran beschichtet sind, die elektrischen Charakteristika des Testmediums + eventuelle, aus der chemischen Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz und dem Testreagens resultierende Veränderungen wahr, während das zweite, nur mit dem Membranmaterial beschichtete El.ektrodensystem, die elektrischen Eigenschafton des .Testmediums selbst bestimmt· ' ·'. ■ "' ^x. ·. -

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Die in Figur 3 wiedergesehene Vorrichtung zeigt den Analysator 2oa mit einem Paar von Elektrodensystemen 39 und 39a. Die Elektrodensysteme 39 und 39a bestehen ihrerseits aus einem Paar in Abstand voneinander angeordneter Elektrodenelemente 11a, 22a und 11b,22b* Die meßenden Endteile der Elemente 11a und 22a sind mit einer ein Testreagens enthaltenden Membran beschichtet, während die meßenden Teile der Elemente 11b und 22b mit einer Membran ohne Testreagens beschichtet sind.

Ein Oscillator 3o ist mit einer 6 Volt-Energiequelle 4σ verbunden und liefert den Elektrodensystemen 39 und 39a des Analysators 2oa eine Spannung· Di© Vorstufen 26 und 28 nehmen über den Funktionsschalter 24 den Stromfluß durch die Elektrodenelemente 11a, 22a und 11b, 22b wahr und liefern gleichstromspannungen entgegengesetzter Polaritäten an den Summierverstärker 32, wobei diese Spannungen der Leitfähigkeit an den Elektrodensystemen 39 und 39a proportional sind. Der Summierverstärker 32 seinerseits gibt dem Meßkreis 34· einen Strom weiter, welcher der Differenz der Leitfähigkeiten an den Elektrodensystemen 39 und 39a proportional iet. Dieser Diffe_t. :a2wert wird vom Meßgerät 34· in 34- Mlcromhos wiedergegeben. Der Abgabestrom des Summierverstärkers 32 wird ferner einem Differentialkreis 36 zugeführt, welcher das.Ausmaß jeder Veränderung im Abgabestrom des Summierverstärkers 32 wahrnimmt, das ebenfalls der Differenzleitfähigkeit proportional ist und

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die Richtung Jeder Veränderung anzeigt. Das Meßgerät 38 gibt die Veränderungen der Leitfähigkeitsdifferonz in Micrombas pro Sekunde an.

Ein Differentialsystem der oben beBchriebenen Art eignet sich · ideal zur Bestimmung von Substanzen in Komplexen biologischen Flüssigkeiten, die merklich verschiedene' wie auch kontinuier·«- lich wechselnde elektrische Charakterista aufweisen. Diese letzteren werden durch ionische Bestandteile wie Salze, Metallionen und dgl. erzeugt. Eine zur Untersuchung geeignete biologische Flüssigkeit ist beispielsweise Blut, das klinisch auf Substanzen wie Glucose, Harnstoff, Enzyme und zahlreiche andere komplexe organische Bestandteile untersucht wird.

Verfahren und Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung können auch zur kontinuierlichen Überwachung in vivo eingesetzt werden. Ferner kann ein Satz aus mehreren Analysatoren der ber schriebenen Art zur Bestimmung verschiedener Substanzen" verwendet werden, in Verbindung mit einer automatisierten Ablesevorrichtung, und auf diese V/eise können mehrere Proben auf mehrere Bestandteile rasch^ und kontinuierlich geprüft werden. Größe von Vorrichtung und Analysator hängen lediglich vom Stand der Technik zu ihrer Herstellung ab und können noch merklich verkleinert werden zur in vlvo-überwachung-biologischer Flüssig-

keiten.

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Die oben erwähnten Materialien, Herstellweisen, strukturelle Einzelheiten, chemische Reaktionen, Mengenangaben und dglo sind lediglich beispielhaft zu verstehen und können vom Fachmann je nach Bedarf abgewandelt werden. Beispielsweise kann die Membran verschiedene Polymer sub st anz en enthalten,, die zur Herstellung immobilisierter !Destreagentien, z.B» enzymatischer Testsysteme, bekannt sind. Ferner können andere, von der Leitfähigkeit verschiedene elektrische Eigenschaften · " gemessen werden. Beispielsweise kömien Systeme κ:·% Messung der Voltametrie '(Beziohun-g zv/ischen Stromstärke und Spannung), der EMK und dgl. verwendet werden. Ferner kann die Metallfolie durch andere dünn© Folien, aus leitfähigen Materialien wie z.B« Kohlenstoff ersetzt sein«

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Claims (12)

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   Patentansprüche

   Analysator zur Bestimmung einer Substanz in einem Testmedium, gekennzeichnet durch ein elektrisch isolierendes Trägerglied, ein Paar im Abstand voneinander angeordneter, elektrisch leitender Elektrodenelemente aus dünner Polie, welche von dem Trägerglied getragen werden, und ein für die Substanz spezifisches Tostreagens, welches in fixierter 3?orm in Verbinr... dung mit den Eloktrodenelementen vorliegt· .
2. 2. Analysator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenelemente aus Metall bestehen·
3. 3· Analysator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das fixierte Testreagens in einer semi-permeablen Matrix

   in überlagerter iOrm vorliegt· * ·.
4. 4·. Analysator nach Anspruch 3f dadurch gekennzeichnet, daß .' die Matrix aus einem Polymermaterial besteht. · ■
5. 5· Analysator nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein zweites Paar in Abstand voneinander befindlicher Elektrodenelemente, welches von einer semi-permeablen Matrix überlagert wird.

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6. 6. Analysator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,'daß er mit einem entfernbaren Griff versehen ist·
7. 7. Analysator gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenelemente mit einem Leitfähigkeitsmesser verbunden sind.
8. 8. Analysator gemäß Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß erstes und zweites -Paar von Elektrodenelementen mit einem Differential-Leitfähigkeitsmesser verbunden sind.
9. 9· Verfahren zur Herstellung eines Analysators gemäß Anspruch· 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Elektrodensystem in Form einer elektrisch leitenden dünnen Folie auf einem elektrisch isolierenden Trägerglied anbringt und das Elektrodensystem mit einem fixierten Testreagens beschichtet.
10. 1o. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die dünne Folie aus Metall besteht.
11. 11· Verfahren $ach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Testreagens durch Einarbeitung in eine semi-permeable · Matrix fixiert wird. ; '.'-'·')',.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß

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    die Matrix aus einer polymeren Membran besteht·

    · Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet» daß man auf dem Trägerglied eine dünne Folie aus gut leitendem Metall ablagert, einen Photo-Abdecklack appliziert, diesen durch eine Lichtquelle über eine Abdeckmaske mit Elektrodenform belichtet, entwickelt, Teile des Photo-Abdecklacks entfernt, das belichtete Metall chemisch ausätzt und den Photo-Abdecklack von der zurückbleibenden Metallfolie entfernt.

    14» Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die elektrisch leitende Folie durch Niederschlagen aus· der Dampfphase applisiert wird· - . ·

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