DE102005003911B4

DE102005003911B4 - Verfahren zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung einer redoxaktiven Substanz und zugehörige Vorrichtung

Info

Publication number: DE102005003911B4
Application number: DE102005003911.1A
Authority: DE
Inventors: Dr. Barlag Heike; Dr. Gumbrecht Walter; Dr. Mund Konrad
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2004-01-29
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2018-11-15
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: WO2005073708A2; GB2428484A; WO2005073708A3; DE102005003911A1; GB0617003D0; GB2428484B; US20080099347A1; US8105478B2

Abstract

Verfahren zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung einer redoxaktiven Substanz als Mediator in einem molekularbiologischen Detektionssystem, bei dem durch Anlegen geeigneter Potenziale an einer Arbeitselektrode ein Reduktionsvorgang oder ein Oxidationsvorgang als Redoxreaktion erfolgt, mit folgenden Maßnahmen:
das Potenzial der Arbeitselektrode wird gepulst und es werden abwechselnd Messphasen sowie Relaxationsphasen gebildet,
dabei werden die Messphasen-Pulslängen so gewählt, dass gegen Ende des Pulses der kapazitive Strom klein gegenüber dem Faraday'schen Strom ist,
es werden die Relaxationsphasen-Pulslängen so gewählt, dass gegen Ende des Pulses der Konzentrationsgradient relaxiert ist, so dass zu Beginn der folgenden Messphase die Konzentrationsänderung des Mediators, verursacht durch den Verbrauch des Mediators durch die Messung selbst, weitestgehend rückgängig gemacht wird, und
der am Ende der Messphase gemessene Strom bildet das Messsignal.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein elektrochemisches Messverfahren zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung einer redoxaktiven Substanz. Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf eine zugehörige Vorrichtung zur Durchführung des Messverfahrens mit einem elektrochemischen Transducer-Array.
Amperometrische Sensoren basieren auf dem einfachen Prinzip, dass reduzierbare oder oxidierbare Substanzen durch Anlegen eines entsprechenden Potenzials an einer Elektrode umgesetzt werden können. Der dabei fließende so genannte Faraday'sche Strom ist ein Maß für die Konzentration dieser Substanz. Dieser Strom kann jedoch nicht direkt nach Anlegen des Potenzials gemessen werden, da zunächst vor allem ein hoher kapazitiver Strom fließt. Dieser wird durch die Umladung der Doppelschicht der Elektrode verursacht. Er klingt exponentiell mit der Zeit ab.
Der Faraday'sche Strom verringert sich ebenfalls mit der Zeit, da durch den Umsatz von Substanz eine Verarmung vor der Elektrode stattfindet. Die Nachlieferung von Substanz aus der Lösung zur Elektrode findet bei nicht gerührten, also nicht konvektiven Systemen, allein durch die Diffusion statt. Es stellen sich in der Lösung Konzentrationsprofile ein. Bei genügend positiven (Oxidation) bzw. negativen (Reduktion) Potenzialen gilt für die Zeitabhängigkeit des Stromes die Cotrell-Gleichung. $I=nFA \frac{\sqrt{D}}{\sqrt{π t}} c_{\infty}, s \to \infty$
Dabei bedeuten:

n:: Zahl der Elektronen pro Formelumsatz
F:: Faraday-Konstante
A:: Fläche der Elektrode
D:: Diffusionskoeffizient
c_∞:: Konzentration der umzusetzenden Substanz in der Lösung
s:: Ausdehnung des Elektrolytraums vor der Elektrode

Gleichung (1) beinhaltet, dass der Faradaysche Strom mit der reziproken Quadratwurzel aus der Zeit abnimmt, also langsamer als der kapazitive Strom. Einige Zeit nach der Veränderung des Potenzials wird der Strom daher hauptsächlich vom Faradayschen Strom bestimmt. Für jedes System gilt es, einen Zeitpunkt zu finden, bei dem der kapazitive Strom gering ist, der Faradaysche Strom jedoch noch möglichst hoch.
Eine Möglichkeit zur Bestimmung sehr kleiner Konzentrationen (10^-10 mol/l) ist die voltammetrische Stripping-Analyse. Dabei wird durch Anlegen eines geeigneten Potenzials die zu bestimmende Substanz zunächst an der Elektrode angereichert. In einem zweiten Schritt wird dann die Substanzmenge auf der Elektrode bestimmt [W. Buchberger, Elektrochemische Analyseverfahren, Heidelberg Berlin: Spektrum Akademischer Verlag 1998 und DE 44 24 355 A1 ]. Dieses Verfahren ermöglicht auf Grund der zwei Verfahrensschritte keine zeitliche Auflösung. Konzentrationsänderungen können damit nicht oder nur sehr langsam verfolgt werden.
Ein weiteres analytisches Standardverfahren zur Bestimmung sehr kleiner Konzentrationen ist die Polarographie [Rach u. Seiler, Polarographie u. Voltametrie in der Spurenanalytik, Heidelberg: Hüthig 1984]. Hier werden mit geeigneten Pulsverfahren und unter Verwendung einer sog. „Dropping Mercury Elektrode“(DME) Konzentrationen in der Größenordnung 10^-9 mol/l messbar. Bei der DME macht man sich u. a. zunutze, dass jeder Quecksilbertropfen neu in die Lösung eintaucht und dort wieder die Konzentration c_∞ vorfindet. Bei einer statischen Elektrode ist dies jedoch nicht der Fall. Nach jeder Messung müsste man so lange warten bis das Konzentrationsprofil durch den Diffusionsprozess relaxiert ist. Je nach Größe des Diffusionskoeffizienten kann dieser Vorgang, wenn nicht gerührt wird, etliche Sekunden in Anspruch nehmen. Ist die Wartezeit nicht lang genug, so wird der Strom von Messung zu Messung abnehmen, da die Anfangskonzentration vor der Elektrode sinkt.
Bei einigen Anwendungen kann es aber erforderlich sein, in schneller Abfolge die Konzentration zu bestimmen, wenn zum Beispiel eine Konzentrationsänderung beobachtet werden soll. Ein mögliches Einsatzgebiet ist die Verfolgung der enzymatischen Bildung eines Mediators in molekularbiologischen Detektionssystemen.
Bei biochemischen Sensoren werden molekulare Erkennungssysteme, z. B. Haptene, Antigene oder Antikörper, auf oder in der Nähe der Elektroden platzieren. Das Zielmolekül bindet daran und wird entweder direkt oder über Zwischenschritte mit einem Enzymlabel versehen. Wird nun das entsprechende Enzymsubstrat zugegeben, setzt das Enzym eine Substanz frei, die detektiert werden kann. Dies geschieht entweder optisch oder elektrochemisch. Es handelt sich hier um den so genannten ELISA-Test (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Auf ähnlichem Weg lassen sich auch DNA-Analyseverfahren durchführen.
Bei der elektrochemischen Detektion ist es vorteilhaft nicht nur die absolute Konzentration der als „Mediators“ bezeichneten Messgröße für die vorstehend angegebenen elektrochemischen Umsetzungen zu erfassen, sondern die Änderung, insbesondere die Zunahme der Konzentration während weniger Sekunden zu bestimmen. Dadurch wird der Einfluss unterschiedlicher Zustände des biochemischen Systems zu Beginn der Messung eliminiert. Die zeitliche Auflösung einer solchen Messung muss dabei 1 bis 2 Hz betragen, um technisch und wirtschaftlich sinnvoll zu sein.
Speziell bei redoxaktiven Substanzen kann bisher unter Verwendung von Interdigitalelektroden das so genannte Redoxcycling eingesetzt werden. Dabei wird ausgenutzt, dass die an einer Elektrode oxidierte Substanz an der zweiten Elektrode wieder reduziert werden kann. Die Elektroden werden dabei konstant auf das Oxidations- bzw. Reduktionspotenzial eingestellt. Dazu werden die beiden Interdigitalelektroden mit kammerartig ineinandergreifenden Elektrodenfingern zusammen mit der Referenzelektrode und einer Gegenelektrode an einen Bipotentiostaten angeschlossen. [O. Niwa, M. Morita H. Tabei, Anal. Chem. 62 (1991), 447-452 und DE 43 18 519 A1 ].
Eine Voraussetzung für das Redoxcycling ist, dass der Ab- stand zwischen den Elektroden, d.h. der einander zugeordneten Elektrodenfinger der Interdigitalelektroden, in der Größenordnung der Diffusionsschichtdicke, also im Bereich weniger µm, liegt. Auf Grund der Konzentrationsprofile geht in den gemessenen Strom neben der Konzentration und dem Diffusionskoeffizienten die Zahl der Elektrodenfinger und deren Länge ein [K. Aoki, J. Electroanal. Chem, 270 (1989), 35]. Daraus ergibt sich, dass die erforderlichen Strukturen sehr fein und aufwändig in der Herstellung sein müssen.
Die DE 199 17 052 A1 zeigt ein Verfahren zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Analyten. Ein Redoxmediator wird mit einer spezifischen Erkennungsstruktur modifiziert, dessen Umsatz an einer Mikroelektrode bestimmt wird. Anschließend erfolgt die Zugabe der Probe zur Lösung des Redoxmediators, der im wesentlichen von der Bindungskonstante der komplementären Erkennungsstruktur bestimmt wird. Anschließend erfolgt die Bestimmung des Umsatzes des Komplexes zwischen der Erkennungsstruktur und der komplementären Probe an der Mikroelektrode. Zur Signalamplifizierung ist zusätzlich eine leitende Oberfläche vorgesehen, an die die Mikroelektrode während der Messung angenähert wird, sodass eine Regeneration des Redoxmediators an dieser Oberfläche in Abstand zur Mikroelektrode erzwungen wird.
Die DE 43 35 241 A1 betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Analyse von Bestandteilen einer Flüssigkeit mittels eines Biosensors, der in ständigem Kontakt mit der zu bestimmenden Flüssigkeit steht. Der Biosensor wird mit Hilfe einer Pulsfolge betrieben, wobei ein Puls der Pulsfolge als Messpuls verwendet wird, bei welchem die Reaktion nach Abklingen des kapazitiven Stroms gemessen wird. Ein weiterer Puls in entgegengesetzter Richtung wird zur Regenration der Messelektrode verwendet.
Die WO 2004/001 404 A1 betrifft Sensoren zur Analyse von kleinen Volumen flüssiger Proben mit einer ersten Elektrode und wenigstens einer Arbeitselektrode. Darüber hinaus ist eine optische Öffnung zur Aufnahme von Licht aus der Probe vorgesehen.
Die WO 91/08 474 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Mikroelektroden mit einer Schicht aus einem elektrisch isolierenden Material, wobei diese Schicht einen Array aus Öffnungen aufweist. Darüber hinaus ist ein elektrisch leitfähiges Material vorgesehen, das durch die Öffnungen sichtbar ist.
Ferner ist es bekannt, zur Messung einer nachzuweisenden Substanz die Rechteck-Voltammetrie (SWV) als pulsvoltammetrische Messmethode einzusetzen (BARD, FAULKNER: Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, John Wiley & Sons, 2001, S. 293-299, 287, 648).
Darüber hinaus ist ein Flusssystem bzw. ein automatisiertes Fließinjektionssystem zum Messen von Glukose bekannt. Die enzymgekoppelte Reaktion der Glukose mit Glukoseoxydase wird detektiert, wobei die Glukoseoxydase über Tetrathiafulvalen (TTF) als Mediator an der Oberfläche einer Arbeitselektrode gebunden wird (GUNASINGHAM et al., „Pulsed amperometric detection of glucose using a mediated enzyme electrode", in J. Electroanal Chem., 287 (1990) 349-362).
Die US 6 391 558 B1 offenbart ein Verfahren zur Detektion von Zielmolekülen, die wenigstens eine ausgewählte Nukleinsäure oder ein Proteinsegment aufweisen. Hierzu werden zur Bildung eines Komplexes mit einer Zielsequenz korrespondierende Fängermoleküle auf einer Arbeitselektrode verankert. Ein Reportermolekül wird durch chemische Wechselwirkung mit dem Komplex reduziert oder oxidiert.
Darüber hinaus ist ein nicht enzymatischer Glukosesensor bekannt, bei dem unterschiedliche Membranen verwendet werden, um in ausgewählten biologischen Flüssigkeiten Glukose nachzuweisen (Bindrah et al.: „Pulsed amperometric detection of glucose in biological fluids at surface modified gold electrode“, in Anal. Chem 61 (1989) 2566-2570).
Die Monographie „Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications“, John Wiley & Sons, 1980 liefert einen allgemeinen Überblick über die elektrochemische Messtechnik. Weitere Hinweise zur Messung speziell an Flüssigkeiten oder auch für biochemische Messungen werden in der DE 43 35 241 A1 , in der DE 41 31 731 A1 , in der DE 297 17 809 U1 und in der DE 199 17 052 A1 gegeben. Ein Verfahren zur elektrochemischen Messung des Redoxcyclings mit einer praxisgerechten Elektrodenanordnung ist im Einzelnen in der WO 01/67587 A1 beschrieben.
Ausgehend von letzterem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren vorzuschlagen, bei dem die Bestimmung von Konzentrationen einer redoxaktiven Substanz in µM-Konzentrationen an flächigen Elektroden mit Durchmessern 30 µm, vorzugsweise 50 µm, möglich ist. Dabei soll das System nicht konvektiv sein, also weder Elektrode noch Lösung gerührt bzw. bewegt werden und die Messfrequenz 1 Hz betragen. Daneben soll eine zugehörige Messvorrichtung geschaffen werden.
Die Aufgabe ist erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Art durch die Maßnahmen des Patentanspruchs 1 gelöst. Eine zugehörige Messvorrichtung ist im Patentanspruch 9 angegeben. Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der zugehörigen Messvorrichtung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Es wird vorgeschlagen, das Potential der Arbeitselektrode in an sich unbekannter Weise zu pulsen. Bei der Erfindung werden aber nun abwechselnd Messphasen sowie Relaxationsphasen gebildet, wobei die Messphasen-Pulslängen so gewählt werden, dass gegen Ende des Pulses der kapazitive Strom klein gegenüber dem Faraday'schen Strom ist und wobei die Relaxationsphasen-Pulslängen so gewählt werden, dass gegen Ende des Pulses der Konzentrationsgradient relaxiert ist, so dass zu Beginn der folgenden Messphase die Konzentrationsänderung des Mediators, verursacht durch den Verbrauch des Mediators durch die Messung selbst, weitestgehend rückgängig gemacht wird. Damit bildet der am Ende der Messphase gemessene Strom ein signifikantes Messsignal.
Gemäß der Erfindung erfolgt die schnelle Messung der Konzentration und insbesondere der Konzentrationsänderung eines Mediators in molekularbiologischen Detektionssystemen mittels der elektrochemischen Redoxreaktion der enzymatisch gebildeten Redoxaktiven Substanz bei den auf einem Chipband in Kavernen verankerten Arbeitselektroden durch eine zyklische Pulsbelastung, wobei der nach Abklingen der Umladung der Doppelschicht gemessene Strom das Messsignal bildet.
Grundlage der Erfindung ist die Erkenntnis, dass durch Verwendung einer neuen Variante des Redoxcyclings vorteilhafterweise an Elektroden mit Durchmessern in der Größenordnung einiger 100 µm bis zu 1 cm gemessen werden kann. Komplex aufgebaute Interdigitalelektroden sind nicht mehr notwendig. Nunmehr können preisgünstige Transducer-Arrays verwendet werden, wie sie insbesondere in der Patentanmeldung Akt.Z. 10 2004 004 654.9-52 der Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität im Einzelnen beschrieben sind.
Bei der zugehörigen Messvorrichtung vereinfacht sich der Messaufbau gegenüber dem Redoxcycling dahingehend, dass kein Bipotentiostat benötigt wird. Ein einfacher Potentiostat in Kombination mit einem Pulsgenerator reicht aus.
Bei der Erfindung wird nicht - wie beim „normalen“ Redoxcycling - ein stationärer Zustand eingestellt, sondern eine schnelle Relaxation des Konzentrationsgradienten elektrochemisch erzwungen. Dazu wird das Potenzial der Arbeitselektrode gepulst. Es bildet sich eine Diffusionsschicht aus, deren Dicke am Ende der Messperiode einen Maximalwert erreicht, der von der Länge der Messphase abhängt. Bei einer Messung von Oxidationsströmen wird während der Relaxationsphase ein hinreichendes Reduktionspotenzial eingestellt. Die während der Messphase oxidierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies werden so wieder reduziert. Der Konzentrationsgradient und damit die Diffusionsschicht werden abgebaut. Statt also wie beim Redoxcycling konstante Diffusionsschichtdicken zu etablieren, wird beim erfindungsgemäßen gepulsten Redoxcycling die Diffusionsschicht zeitlich auf- und wieder abgebaut. In beiden Fällen wird dadurch eine zumindest in ihrem Maximalwert begrenzte Diffusionsschichtdicke eingestellt. Soll eine Reduktion beobachtet werden, so muss während der Messphase das Reduktionspotenzial und während der Relaxationsphase das entsprechende Oxidationspotenzial eingestellt werden.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen. Es zeigen

1 eine graphische Darstellung des gepulsten Redoxcyclings mit Kennlinien für Pulslängen und zugehörigen Konzentrations- und Signalkurven,
2 eine graphische Darstellung der Abhängigkeit der relativen Konzentration vom Abstand der Elektroden,
3 eine graphische Darstellung des Stromes von der Konzentration und
4 eine graphische Darstellung der Steigung in Abhängigkeit vom Potenzial während der Relaxationsphase,
5 eine graphische Darstellung der Abhängigkeit der Stromdichte von der Zeit,
6 eine Darstellung entsprechend 5 für die Relaxationsphase,
7 eine Darstellung entsprechend 5 mit Vergleich von experimentellen und berechneten Werten,
8 eine graphische Darstellung der Abhängigkeit der Konzentration vom Elektrodenabstand
9 eine Messvorrichtung für das gepulste RedoxCycling mit einem zugehörigen Transducer-Array,
10/11 das Transducer-Array für die Messvorrichtung gemäß 9 in der Sicht von oben und unten, und
12 den Verlauf einer typischen Messung mit einer Messstromkurve.

In den 1 bis 4 wird zunächst die Methodik des gepulsten Redox-Cyclings beschrieben. Dabei wird davon ausgegangen, dass die Methodik des Redox-Cyclings an sich vom Stand der Technik bekannt ist. Anschließend sind anhand der 5 bis 8 Betrachtungen zur Genauigkeit wiedergegeben und ist schließlich in 9 eine Messvorrichtung mit einem exemplarischen Transducer-Array, dessen Struktur in den 10 und 11 gezeigt ist, angegeben. 12 gibt schließlich die Verfahrensführung bei der Anwendung der Anordnung als DNA-Sensor wieder.
In 1 sind die unterschiedlichen Phasen währen der Messung gekennzeichnet. Welche die Mess- und welche die Relaxationsphase ist, hängt davon ab, ob ein Oxidations- oder Reduktionsstrom gemessen werden soll. Die Pulslängen für Oxidation und Reduktion müssen nicht gleich sein, d.h. die Zeiten Δt_Ox und Δt_Red können sich unterscheiden. Auch die Potenziale φ_Ox und φ_Red müssen nicht symmetrisch zum Redoxpotenzial φ₀ der Spezies sein.
Die Darstellung der 1 zeigt den möglichen Potenzialverlauf unter Verwendung von Rechteckpulsen. Dabei sind die Potenziale φ_Ox φ_RED und die Zeiten Δt_ox und Δt_RED mit der Pulsform 11 in willkürlichen Einheiten aufgetragen. Die Pulsform 11 mit den Pulslängen zur Oxidation und Reduktion muss nicht symmetrisch sein. Es ist ebenso möglich, das gepulste Redoxcycling mit Dreiecksspannungskurven oder Sinuskurven zu realisieren.
Im Einzelnen ist in 1 die Messphase mit A und die Relaxationsphase mit B bezeichnet. Neben der Potenzialkurve 11 sind weiterhin eine Kurve 12 für die Konzentration des Mediators der Elektrode und zusätzlich der elektrische Strom 13 als Messsignal dargestellt. Der für den Prozess maßgebliche Stromwert liegt also jeweils am Ende des Relaxationsintervalls vor und ist ein Maß für die relaxierte Kronzentrationsänderung.
Bei den weiteren Betrachtungen wird davon ausgegangen, dass die Konzentration eines in seiner reduzierten Form vorliegenden Moleküls gemessen werden soll. In diesem Fall ist während der Messphase das Potenzial positiv bezogen auf das Redoxpotenzial der Spezies. Die höchsten Messströme werden erreicht, wenn das Potenzial so weit im Positiven liegt, dass sich ein Diffusionsgrenzstrom einstellt. Der Strom ist dann nicht von der Kinetik der Redoxreaktion, sondern nur von der Diffusion begrenzt. Die zeitliche Entwicklung des Konzentrationsprofils der reduzierten Spezies ergibt sich aus der entsprechenden Lösung der Fickschen Gesetze für die Diffusion in den einfach unendlichen Halbraum. $c (t,x) = c_{\infty} \cdot erf (\frac{x}{2 \sqrt{Dt}}), s \to \infty$
Dabei bedeuten:

c: Konzentration als Funktion von Zeit und Ort
c_∞ : Konzentration in der Lösung (x → ∞)
erf: Fehlerfunktion
D: Diffusionskoeffizient
s: Ausdehnung des Elektrolytraums vor der Elektrode

In 2 sind zwei Konzentrationsprofile 21 und 22 für eine Substanz mit dem Diffusionskoeffizienten D = 3,6E-6 cm²/s gezeigt. Dies entspricht dem Diffusionskoeffizienten des Paraaminophenols (pAP), an dessen Beispiel die Funktionsweise des gepulsten Redoxcyclings im Weiteren demonstriert werden soll.
Nach 0,1 s hat die Diffusionsschicht eine Dicke von ca. 25 µm. Nach 0,25 s beträgt die Ausdehnung der an pAP verarmten Schicht schon 40 µm. Je dicker diese Schicht ist, desto länger dauert die Relaxation durch Diffusion.
Die 3 zeigt die Stromdichte als Funktion der pAP-Konzentration in der Lösung für verschiedene Pulsfolgen, die durch Kennlinien 31 bis 34 gekennzeichnet sind. Die Messphase beträgt immer 0,25 s, die Relaxationsphase 0,75 s. Die Strommessung erfolgt 0,24 s nach Beginn der Messphase. Das Oxidationspotenzial während der Messphase beträgt bezogen auf das Redoxpotenzial +200 mV. Variiert wurde das Potenzial während der Relaxationsphase. Es nimmt Werte zwischen -300 mV und 0 mV bezogen auf das Redoxpotenzial ein. Im Einzelnen ist

φ_red/φ_ox und bei Kennlinie 31 -300 mV/200 mV,

bei Kennlinie 32 -200 mV/200 mV,

bei Kennlinie 33 -100 mV/200 mV

bei Kennlinie 34 0 mV/200 mV.
Es ergeben sich bei diesen Parametern unterschiedliche Steigungen der Stromdichte 5 in ihrer funktionalen Abhängigkeit von der Konzentration pAP.
Die Steigung der Stromdichte mit der pAP-Konzentration, also die Empfindlichkeit der Messung, nimmt stetig mit negativer werdendem Potenzial während der Relaxationsphase zu. Eine Auftragung der Steigung gegen das Relaxationspotenzial entsprechend 4 zeigt mit der Kennlinie 41 deutlich die vorteilhafte Wirkung des gepulsten Redoxcyclings.
Während bei einem Relaxationspotenzial von 0 V vs. φ₀ die Steigung nur 462 Acm/mol beträgt, erhöht sich dieser Wert auf 864 Acm/mol bei -300 mV vs. φ₀. Diese Verdopplung beruht auf der verbesserten Wirkung des Redoxcyclings, weil bei einem Relaxationspotenzial von -300 mV vs. φ₀ das Chinonimin vor der Elektrode vollständig zu Paraaminophenol (pAP) reduziert wird. Bei einem Relaxationspotenzial von 0 V vs. φ₀ wird hingegen gemäß der Nernstschen Gleichung direkt vor der Elektrode ein Konzentrationsverhältnis Paraaminophenol:Chinonimin = 1:1 eingestellt. Das Chinonimin wird also nur teilweise wieder reduziert.
Die Steigerung der Empfindlichkeit ist nur ein Vorteil des gepulsten Redoxcyclings. Die Konstanz des Stromsignals schon während der ersten Sekunden der Messung ist ein weiterer wesentlicher Vorteil.
Für die Bestimmung der Empfindlichkeit wurde die sich nach längerer Messzeit eingestellte Stromdichte eingesetzt. Bei der Messung von Enzymaktivitäten z.B. erfolgt die Messung aber so, dass die Lösung zunächst noch gerührt bzw. gepumpt wird. Das vom Enzym gebildete pAP wird dadurch weggespült und es stellt sich ein konstanter Grundstrom ein. Dann wird die Pumpe gestoppt und die ansteigende Konzentration während der ersten Sekunden gemessen. Typische Steigungen liegen dabei in der Größenordnung von 2 µA/cm²s. Führt nun die Messung selbst zu einem Absinken des Signals, so überlagern sich beide Effekte und es wird eine zu geringe Steigung des Stromes und damit Enzymaktivität gemessen. Da dieses Absinken des Stromes durch den Verbrauch der Substanz außerdem von dessen Konzentration abhängt, lässt sich dieser Effekt nicht durch Normierungen eliminieren.
Experimente mit konstanter Konzentration geben Aufschluss über die zeitliche Signalkonstanz. Die Konzentration betrug 50 µM pAP, das Potenzial während der Messphase +200 mV. Die Dauer der Messphase Betrug 250 ms, wobei die Strommessung nach 240 ms erfolgte. Das Potenzial während der Relaxationsphase betrug im ersten Experiment 0V vs. φ₀, im zweiten -300 mV vs. φ₀. Die Dauer der Relaxationsphase wurde zwischen 250 ms und 4,75 s variiert.
In 5 ist in einer graphischen Darstellung die Abhängigkeit der Stromdichte j von der Zeit wiedergegeben: Es ergeben sich Kennlinien 51 bis 54 für unterschiedliche Relaxationsphasendauern Δt_Red, und zwar im Einzelnen zwischen 0,255 und 4,755. Die Ströme fallen innerhalb der ersten 10 s der Messung stark ab. Bei einer Länge der Relaxationsphase von 0,25 s beträgt die Abnahme 14 µA/cm² in 10 s. Wird die Dauer der Relaxationsphase auf 4,75 s erhöht, so erniedrigt sich die Abnahme des Signals auf 9 µA/cm² in 10 s. Je kürzer also die Dauer der Relaxationsphase ist, desto stärker ist diese Abnahme des Signals mit der Zeit. Aber selbst bei langen Relaxationszeiten ist die Abnahme von 0,9 µA/cm²s noch erheblich verglichen mit den Steigungen, die in der Größenordnung 2 µA/cm²s in der Anwendung gemessen werden sollen.
Wird nun das Potenzial während der Relaxationsphase auf -300 mV heruntergesetzt, verbessert sich die Signalkonstanz signifikant. Die ergibt sich insbesondere aus 6, die eine 5 entsprechende Darstellung mit Kennlinien 61 bis 64 für die gleichen Parameter der Relaxationsphasen Δt_Red zeigt:
Bei einer Relaxationszeit von 0,25s beträgt der Signalabfall noch 8 µA/cm² in 10 s. Mit einer Relaxationszeit von 0,75 s beträgt dieser Wert noch 2 µA/cm² in 10 s, bei 1,75 noch 1 µA/cm² in 10 s und für 4,75 s nur noch 0,5 µA/cm² in 10 s. Schon bei einer Relaxationszeit von 0,75 s, also einer Messfrequenz von 1 Hz, und einem Relaxationspotenzial von -300 mV beträgt der Signalabfall und damit auch der Fehler nur noch ca. 1 % vom erwarteten Messwert.
Die Experimente zeigen den Einfluss von Dauer und Potenzial der Relaxationsphase auf das Messsignal. Weiteren Aufschluss über die Wirkung des gepulsten Redoxcyclings können Simulationsrechnungen geben. Dabei wird zum einen die Stromdichte beim Redoxcycling berechnet zum anderen wird zum Vergleich die Stromdichte ohne Redoxcycling bestimmt.
Für die Simulationen mit Redoxcycling wurde angenommen, dass der Elektrolytraum eine Dicke von 100 µm hat. Sowohl Oxidations- als auch Reduktionspotenzial sind so gewählt, dass die Reaktion im Diffusionsgrenzstrombereich abläuft, die Ströme also maximal sind. Die Pulslängen sind 250 ms beim Oxidationspotenzial und 750 ms beim Reduktionspotenzial. Bei den Berechnungen ohne Redoxcycling waren die Parameter gleich, bis auf die Tatsache, dass während der Relaxationsphase kein Potenzial vorgegeben wird und über den Potentiostaten kein Strom fließen kann. In dieser Zeit ist das System also elektrochemisch entkoppelt.
Der Vergleich der Simulationsdaten erfolgt mit den experimentellen Ergebnissen für die entsprechenden Pulslängen und die Potenziale φ_Ox = +200 mV und φ_Red = -300 mV. Diese Potenzialgrenzen entsprechen am ehesten den Vorgaben für die Simulation. Die y-Achsenabschnitte der Simulationsdaten wurden den experimentellen Ergebnissen angepasst.
Die 7 zeigt eine gute Übereinstimmung von Experiment und Simulation für das gepulste Redoxcycling, wobei 71 die gemessenen Werte und 72 die gerechneten Kennlinien darstellen. Der Abfall der Stromdichte ist unter diesen Bedingungen mit 2 µA/cm² in 4 s gering. Ohne Redoxcycling hingegen beträgt der Stromdichteabfall während der ersten 4 s schon 12 µA/cm², was durch die Kennlinie 73 verdeutlicht ist Dazwischen liegen die Ergebnisse für ein gepulstes Redoxcycling mit Potentiostatierung während der Relaxationsphase beim Redoxpotenzial, was durch Kennlinie 74 wiedergegeben ist.
Die Verbesserung der Signalkonstanz um den Faktor 6 lässt sich direkt auf die Konzentrationsprofile zurückführen. Die folgende Abbildung zeigt die berechneten Konzentrationsprofile von pAP als Funktion des Abstandes von der Elektrode wie sie sich am Ende der 5. Relaxationsphase darstellen.
Beim gepulsten Redoxcycling wird während der Relaxationsphase das vorher gebildete Oxidationsprodukt wieder reduziert. In Folge ist die Konzentration an pAP direkt vor der Elektrode am Ende der Relaxationsphase wieder auf den ursprünglichen Wert c_∞ angestiegen. Weiter von der Elektrode entfernt ist die Konzentration nur leicht erniedrigt. Ohne Redoxcycling hingegen beträgt die Konzentration vor der Elektrode unmittelbar vor der nächsten Messphase nur noch 38 %. Auch weiter entfernt von der Elektrode ist die Konzentration deutlich abgesenkt.
Letzteres ergibt sich im Einzelnen aus 8 mit Kennlinien 81 und 82: Dabei entspricht das Beispiel entsprechend Kennlinie 82 für eine Messung ohne Redoxcycling in der Praxis der Messung der Konzentration einer Substanz, die zwar oxidiert werden kann, deren Oxidationsprodukte aber nicht wieder reduzierbar sind. Analoges wäre auch der Fall bei einer Substanz, die reduziert, deren Reduktionsprodukte aber nicht wieder oxidiert werden könne. Im Fall eines biochemischen Sensors könnte das z. B. Naphthol sein, das wie auch das pAP bei einer enzymatischen Reaktion freigesetzt werden kann.
Aus der 9 ist die Messvorrichtung im Einzelnen ersichtlich: Außer durch ein Transducerarray 100, das anhand der 10 und 11 noch im Einzelnen beschrieben wird, wird die Messvorrichtung im Wesentlichen durch einen geeigneten Potentiostaten 5 in Kombination mit einem Pulsgenerator 6 realisiert, der optional Rechteck-, Dreieck- oder Sinuspulse liefert. Durch zwei Operationsverstärker 7 bzw. 7' von denen einer mit Groundpotenzial verbunden ist und einem definierten Messwiderstand 8 wird der Potentiostat 5 derart konzipiert, dass geeignete Potenziale bereitgestellt werden. Dabei können die Pulslänge, die Wiederholrate und die Höhe des Potenzials vorgegeben werden. Insbesondere die Pulslängen der Messphasen und die Relaxationsphasen können separat eingestellt werden und unterschiedlich lang sein. Auch die Potenziale können unterschiedlich groß sein.
Dem Transducerarray 100 sind einzelne Elektroden zugeordnet, die bestimmungsgemäß eine Referenzelektrode RE (= reference electrode), eine Gegenelektrode CE (= counter electrode) und wenigstens eine Messelektrode WE (= working electrode) realisieren. Diese Elektroden sind als Drei-Elektrodenanordnung mit dem Potentiostaten 5 verbunden. Das Signal des Potentiostaten 5 wird an eine in 9 nicht im Einzelnen dargestellte Signalverarbeitungseinheit angeschlossen, mit welcher eine Auswertung unter Berücksichtigung obiger Ausführungen zur Messmethodik und Genauigkeit erfolgt. Im Allgemeinen ergibt sich der in 9 als I_out dargestellte Signalverlauf zur Auswertung.
In den 10/11 ist das Transducerarray 100 als Teil der Messvorrichtung wiedergegeben, das planar und flexibel ist sowie insbesondere kostengünstig herzustellen ist. Wesentlich ist dabei, dass nunmehr für das gepulste Redoxcycling mit einem vereinfachten Transducer-Array 100 gemessen werden kann. Die 10 und 11 zeigen die Ober- und Unterseite des Transducerarrays 100 - bestehend aus einem Metallsubstrat 1 und einer Isolatorschicht 2. Auf der Oberseite sind beispielsweise kreisförmige Vertiefungen 3_i , die als Kavitäten bezeichnet werden, dargestellt. Die Kavitäten 3_i entstehen durch die Strukturierung des Isolators 2. Auf dem Grund der Vertiefungen 3_i liegt die Oberseite des Metallsubstrats frei und bildet einen Messpunkt, sofern ein Analyt aufgebracht ist.
Die Darstellung der Rückseite zeigt durch Striche eine Strukturierung und damit eine Auftrennung des Metallsubstrats 1 in voneinander isolierte Teile. Jede Metallinsel korrespondiert mit einer Vertiefung 31 auf der Vorderseite. Durch Punkte sind die möglichen Kontaktstellen für eine sog. Nadelkarte zur vereinfachten elektrischen Kontaktierung der Metallflächen angedeutet. Wesentlich ist dabei, dass mehrere Metallinseln, vorzugsweise drei, mit einem Analyten einen Sensor definieren und mit den zugehörigen Elektroden 15, d.h. eine Messelektrode WE, eine Gegenelektrode GE und eine Referenzelektrode RE zur Durchführung von elektrochemischen Messungen geeignet sind.
Weitere spezifische Elektrodenanordnungen sind in einer parallelen Anmeldung der Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität und der Bezeichnung „Elektrochemisches Transducer-Array und dessen Verwendung“ beschrieben.
Mit einer Anordnung gemäß 9 und einem Transducer-Array 100 gemäß 10/11 wird beispielhaft ein biochemischer Sensor zur DNA-Analyse realisiert: Es wird das anhand der 10/11 beschriebene Transducer-Array 100 aus einer Metallschicht und einer damit verbundenen Isolatorschicht mit Kavitäten 3i eingesetzt. Der Durchmesser der Kavitäten 3i beträgt 0,8 mm, die Tiefe 90 µm und der Abstand zwischen zwei benachbarten Elektroden 1mm. Die Elektrodenoberflächen sind mit einer 2,3 µm dicken Goldschicht bedeckt.
Insgesamt besteht für diesen Anwendungszweck die Sensoranordnung aus vier Elektroden. Eine der Elektroden ist als Referenzelektrode mit einer Silber/Silberchlorid(Ag/AgCl)-Schicht belegt, eine andere Elektrode wird als Gegenelektrode CE verwendet und die zwei weiteren Elektroden dienen als Messelektroden WE.
Auf einer der Messelektroden wird eine synthetische Oligonukleotidsequenz der Länge 25 mittels einer endständigen Thiolgruppe an der Goldoberfläche als Positivprobe verankert. Die zweite Messelektrode bleibt als Negativprobe frei. Dann wurden beide Oberflächen mit einer Lösung von 1 mg Rinderserumalbumin pro ml 15 Minuten inkubiert und anschließend das Sensorarray in einen 100 µm tiefen Durchflusskanal eingesetzt. Zunächst werden 10 µl einer 10 µM biotinilierten Zielsequenz innerhalb von ca. 5 Minuten über die Elektroden gepumpt. Dann wird nach einem Waschschritt eine Lösung von Streptavidin markierter alkalischer Phosphatase darüber gegeben. Das Waschen erfolgt mit einer Pufferlösung von 100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan titriert auf pH 8 mit Salzsäure, 130 mM NaCl. Nach abermaligem Waschen wird eine 2 mM Lösung des Enzymsubstrats Paraaminophenylphosphat (pAPP) in der Pufferlösung über das Sensorarray gepumpt. Bei Anwesenheit des Enzyms alkalische Phosphatase wird das Enzymsubstrat pAPP zu Paraaminophenol (pAP) umgesetzt.
Referenzelektrode RE, Gegenelektrode CE und jeweils eine der beiden Messelektroden WE sind jeweils in einer Dreielektrodenanordnung an einen Potentiostaten angeschlossen. Die Messung erfolgt mittels gepulstem Redoxcycling. Während der Messphase wird das vom Enzym gebildete Paraaminophenol zu Chinonimin oxidiert. Das Oxidationspotenzial φ_Ox beträgt +200 mV vs. φ⁰. In der Relaxationsphase wird das gebildete Chinonimin wieder zu Paraaminophenol reduziert bei φ_Red = -200 mV. Die Pulslänge der Messphase beträgt 250 ms, die der Relaxationsphase 750 ms. Die Strommessung erfolgt 240 ms nach Beginn der Messphase.
Zu Beginn des Experiments ist die Positivprobe, also die Elektrode mit der Fängersequenz angeschlossen. Die Lösung mit dem Enzymsubstrat fließt - durch eine Pumpe gefördert - zunächst über die Negativprobe und dann über die Positivprobe. Durch die Fließbewegung wird von dem Enzym gebildetes pAP von den Elektroden weggespült, so dass bei eingeschalteter Pumpe der Strom konstant und gering ist. Wird nun die Pumpe gestoppt steigt die pAP-Konzentration durch die Enzymaktivität mit der Zeit an. In der Messung zeigt sich dies durch einen starken Anstieg des Stromsignals mit 20 nA/s. Wird die Pumpe wieder eingeschaltet, so sinkt das Signal wieder auf den ursprünglichen Wert. Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden.
Die 12 zeigt den zeitlichen Stromverlauf bei Pumpe „on“/„stopp“ an der beschriebenen Sensoranordnung mit positiver und negativer Probe: Die Kennlinie 121 zeigt den Verlauf des Pumpenstroms. Es ergibt sich für das Experiment ein spezifischer Verlauf mit einzelnen Peaks, wobei Parameter die Aktivierung der Pumpe einerseits („stopp“/„on“) und das Umschalten der Messelektroden andererseits ist. Der interessierende Messbereich ist jeweils strichliert unterlegt. Bei t = 400 s wurde auf die Negativprobe umgeschaltet. Hier sinkt der Strom beim Stoppen der Pumpe zunächst, bleibt dann kurze Zeit konstant und steigt dann langsam an. Dieser Anstieg wird durch die Diffusion von pAP von der positiven zur negativen Probe hin verursacht. Bei Pumpe „on“ kommt ein Peakstrom hinzu, da der Elektrolyt zunächst von der positiven zur negativen Probe fließt und damit eine erhöhte pAP-Konzentration zur benachbarten Elektrode transportiert. Insgesamt ist die Diskriminierung von positiver und negativer Probe sehr gut.
In einer alternativen Messanordnung wird statt des freitragenden und flexiblen Transducer-Arrays entsprechend den 9 bis 11 ein Transducer-Array in Dünnfilmtechnologie auf einem starren Substrat verwendet. Dabei sind flächige Elektroden vorhanden, die eine Ausdehnung haben, die größer als die Diffusionslänge ist. Eine typische Diffusionslänge beträgt für das oben angegebene Beispiel 25 µm, so dass die flächigen Elektroden eine Ausdehnung ≥ 30 µm, vorzugsweise ≥ 50 µm, haben.
Das starre Substrat ist insbesondere Silizium, das vorzugsweise mit einer Isolatorschicht versehen ist.
Auch mit derartigen Transducern, welche den Zugang zur CMOS-Technologie bei der Signalverarbeitung ermöglichen, ist das erfindungsgemäße Redoxcycling durchführbar.

Claims

Verfahren zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung einer redoxaktiven Substanz als Mediator in einem molekularbiologischen Detektionssystem, bei dem durch Anlegen geeigneter Potenziale an einer Arbeitselektrode ein Reduktionsvorgang oder ein Oxidationsvorgang als Redoxreaktion erfolgt, mit folgenden Maßnahmen: das Potenzial der Arbeitselektrode wird gepulst und es werden abwechselnd Messphasen sowie Relaxationsphasen gebildet, dabei werden die Messphasen-Pulslängen so gewählt, dass gegen Ende des Pulses der kapazitive Strom klein gegenüber dem Faraday'schen Strom ist, es werden die Relaxationsphasen-Pulslängen so gewählt, dass gegen Ende des Pulses der Konzentrationsgradient relaxiert ist, so dass zu Beginn der folgenden Messphase die Konzentrationsänderung des Mediators, verursacht durch den Verbrauch des Mediators durch die Messung selbst, weitestgehend rückgängig gemacht wird, und der am Ende der Messphase gemessene Strom bildet das Messsignal.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei Messung von Oxidationsströmen während der Relaxationsphase ein hinreichendes Reduktionspotenzial eingestellt wird und die während der Messphase oxidierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies wieder reduziert werden (so genanntes gepulstes Redoxcycling).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Messung von Reduktionsströmen während der Relaxationsphase ein hinreichendes Oxidationspotenzial eingestellt wird und die während der Messphase reduzierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies wieder oxidiert werden (so genanntes gepulstes Redoxcycling).
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Wiederholrate für das gepulste Redoxcycling wenigstens 1/10 Hz beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das gepulste Redoxcycling mit vorgebbaren Impulsformen, vorzugsweise mit einem Rechteck-, Dreieck- oder Sinus-Verlauf, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Relaxationsphase wenigstens so lang ist wie die Messphase.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Wiederholrate von 1 Hz die Puls- längen der Messphasen 100 bis 300 ms, vorzugsweise 250 ms, und die Relaxationsphase zwischen 700 und 900 ms, vorzugsweise 750 ms, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Potenziale derart gewählt werden, dass die Reaktionen im Diffusionsgrenzstrombereich ablaufen.
Vorrichtung zur Durchführung des Messverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, mit einer Einrichtung zum Erzeugen von zeitlich vorgebbaren und veränderbaren elektrischen Potenzialen und mit einem Transducer-Array (100), wobei das Transducer-Array (100) aus wenigstens einem flexiblen planaren Metallsubstrat (1) besteht, auf dem mindestens ein flexibler Isolator (2) mit fester Verbindung von Metalloberfläche und Isolatoroberfläche angeordnet ist, wobei das Metallsubstrat derart strukturiert ist, dass elektrisch gegeneinander isolierte Metallbereiche (10_i) vorliegen, wobei der auf dem Metallsubstrat (1) befindliche Isolator (2) derart strukturiert ist, dass im Isolator (2) Kavitäten (3_i) mit offenen Metalloberflächen (10_i) definiert sind, und wobei die Metallbereiche (10_i) von der der Sensorfläche (11_i) abgewandten bzw. gegenüberliegenden Seite (12_i) kontaktierbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zum Erzeugen von vorgebbaren elektrischen Potenzialen ein Potentiostat (5) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass dem Potentiostaten (5) zum Erzeugen von gepulsten elektrischen Potenzialen ein Pulsgenerator (6) zugeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass im Potentiostaten (5) Operationsverstärker (7, 7') und ein definierter Messwiderstand (8) vorhanden sind.